JPH032262B2

JPH032262B2 -

Info

Publication number: JPH032262B2
Application number: JP57035315A
Authority: JP
Inventors: Koichi Kondo; Susumu Iwasa; Eiji Ishikawa
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1982-03-05
Filing date: 1982-03-05
Publication date: 1991-01-14
Also published as: CA1196280A; JPS58151559A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はヒト絨毛性ゴナドトロピン（以下、
「hCG」と略称することもある）の酵素免疫測定
法（以下、「EIA」と略称することもある）に関
するものである。従来、hCGのEIAについては次の２法が提案さ
れている。１競合法：酵素で標識した一定量のhCGを含有する物質
と、未知量のhCGを含有する物質とを抗hCG抗体
に対して競合的に結合させ、抗体と結合した酵素
の酵素活性もしくは抗体と結合しなかつた酵素の
酵素活性を測定し、その測定結果を、予め既知量
のhCGにおいて同様にして得られた結果と対比す
ることにより定量を行う方法。２サンドイツチ法：未知量のhCGを含有する物質を、抗hCG抗体を
用いて固定し、これに酵素で標識した抗体を結合
させて、その酵素活性を測定し定量する方法。本発明者らは、上記１）の競合法においては特
定のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識体と特定の抗
体とを用いると高感度で高特異性の微量定量が可
能であることを見出した（特開昭56−138248号公
報参照）。また上記２）のサンドイツチ法におい
ては、担体上に保時された抗体、抗原および標識
剤を結合させた抗体を用いるEIAにおいて、担体
上に保持される抗体と標識剤を結合する抗体とが
互いに抗原決定部位を重複しない２種の抗体であ
り、該抗体のうち一方がhCGに特異的に反応する
抗体であることを特徴とするhCGのEIAが高感
度、高精度、高特異性であることを見出した（特
願昭55−144689（特開昭57−67858））。しかしながらこれらの方法においてもなお、約
0.1−2mIU以下の微量hCGを精度よく測定するこ
とは難しく、悪性腫瘍のより確かな診断と経過観
察あるいは正常人におけるその生理学的意義を決
定する上では、更に感度の高い測定法が必要とさ
れた。本発明者らは上記の事情に鑑み、更に検討を重
ねたところ、上記特異抗体を用いるサンドイツチ
法によるEIAにおいて、抗hCG抗体を用いてβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼと結合させることにより得
られる抗体−酵素標識体が高感度、高精度の微量
定量を可能にすることを見出した。これに基づい
てさらに研究をした結果、本発明を完成した。本発明は、(1)担体上に保持された抗体、抗原お
よび標識剤を結合させた抗体を用いる免疫化学的
測定方法において、担体上に保持される抗体と標
識剤を結合させる抗体とが互いに抗原決定部位を
重複しない２種の抗体であり、担体上に保持され
る抗体が一般式〔〕Ｈ−Ｒ−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−
Leu−Pro−Gln−OH 〔〕〔式中、Ｒは Ala １− Pro ２− Pro ３− Pro ４− Ser ５ − Leu ６− Pro ７− Ser ８− Pro ９− Ser 10 − Arg 11− Leu 12− Pro 13− Gly 14 で示されるペプチド鎖を表わす。〕で表わされる
ペプチドに対するヒト絨毛性ゴナドトロピンに特
異的に反応する抗体であり、標識別としてβ−Ｄ
−ガラクトシダーゼを用いこれと抗体とをＮ，
N′−Ｏ−フエニレンジマレイミドで結合させた
ものを用いることを特徴とするヒト絨毛性ゴナド
トロピンの免疫化学的測定法である。本発明において用いられる担体上に保持された
抗体における担体としては、たとえば、ゲル粒子
（例、アガロースゲル〔例、セフアロース4B、セ
フアロース6B（フアルマシア・フアインケミカル
社（スエーデン）製〕、デキストランゲル〔例、
セフアデツクスG75、セフアデツクスG100、セ
フアデツクスG200（フアルマシア・フアインケミ
カル社製）〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、バイ
オゲルP30、バイオゲルP60、バイオゲルP100
（バイオラツド・ラボラトリーズ社（米国））〕、セ
ルロース粒子〔例、アビセル（旭化成製）、イオ
ン交換セルロース（例、ジエチルアミノエチルセ
ルロース、カルボキシメチルセルロース）〕、物理
的吸着剤〔例、ガラス（例、ガラス球、ガラスロ
ツド、アミノアルキルガラス球、アミノアルキル
ガラスロツド）、シリコン片、スチレン系樹脂
（例、ポリスチレン球、ポリスチレン粒子）〕、イ
オン交換樹脂｛例、弱酸性陽イオン交換樹脂
〔例、アンバーライトIRC−50（ローム・ハース社
（米国）製）、ゼオカープ226（パームチツト社（西
ドイツ）製）〕、弱塩基性陰イオン交換樹脂〔例、
アンバーライトIR−4B、ダウエツクス３（ダウケ
ミカル社（米国）製）〕｝などが挙げられる。本発明における担体上に保持された担体におけ
る抗体は、標識剤を結合させた抗体における抗体
と互いに抗原決定部位を重複しない２種の抗体で
あり、担体上に保持される抗体における抗体およ
び標識剤を結合させる抗体における抗体として
は、その前者がhCGに特異的に反応する抗体であ
ればよい。該hCGに特異的に反応する抗体としては、たと
えば特開昭56−138248に記載されたhCGに特異
的に反応する抗hCG抗体、すなわち担体上に不溶
化した一般式〔〕Ｈ−Ｒ−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−
Leu−Pro−Gln−OH 〔〕〔式中、Ｒは Ala １− Pro ２− Pro ３− Pro ４− Ser ５ − Leu ６− Pro ７− Ser ８− Pro ９− Ser 10 − Arg 11− Leu 12− Pro 13− Gly 14 で示されるペプチドの14位のGlyを含む１〜14個
の部分ペプチド鎖を表わす。〕で表わされるペプ
チドに抗hCG抗体を含有する体液を接触させ、つ
いで特異的に吸収された抗hCG抗体を溶出するこ
とにより得られた抗hCG抗体が挙げられる。該hCGに特異的に反応する抗体としては、さら
に、前記一般式〔〕で表わされるペプチドと
キヤリア用タンパクとをグルタルアルデヒド
（「GLA」と略称することもある。）の存在下に縮
合せしめた縮合生成物を人以外の温血動物に接種
して抗体を形成せしめ、これを採取することによ
り得られた抗体が挙げられる。ここにおいてキヤリア用タンパクとは、単独で
は抗体産性を誘導することができないペプタイド
などハプテン（低分子量物質）に対する抗体を産
生させるためにハプテンと結合させて用いられる
ものをいい、その例としてはたとえば牛血清アル
ブミン、牛ガンマグロブリン、牛チログロブリ
ン、破傷風トキソイド、ヘモシアニンおよびポリ
アミノ酸などが挙げられる。一般式〔〕で表わされるペプチドとキヤリア
用タンパクとをGLAの存在下に結合させるには、
公知の方法〔例、ホルモン・アンド・メタボリツ
ク・リサーチ（Hormone、and、Metabolic
Research）、第８巻（1976年）、第241頁〕によつ
て実施し得る。一般式〔〕で表わされるベプチ
ドとキヤリア用タンパクの使用量比は１対１ない
し２対１が適当であり、反応PHは7.3前後が良好
な結果を与える場合が多い。また反応に要する時
間は２〜６時間がよい場合が多いが、特に３時間
が適当である。この様にして作成した縮合生成物
は常套手段で４℃前後で水に対して遠析し、凍結
乾燥して保存することができる。以上の様にして製造した縮合生成物は人以外の
温血動物に接種される。上記hCGに特異的に反応する抗体の製造に用い
られる人以外の温血動物としては、たとえば哺乳
温血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ラツト、マウ
ス、モルモツト、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、
ニワトリ、ハト、アヒル、ガチヨウ、ウズラ）な
どが挙げられる。該縮合生成物を人以外の温血動物に接種する方
法としては、動物に接種する縮合生成物は抗体産
生するに有効な量でよく、たとえばウサギに１回
２mgを等容量（１ml）の生理食塩水およびフロイ
ンドの完全アジユバンドで乳化して、背部ならび
に後肢掌皮下に４週間おきに５回接種すると抗体
を産生させ得る場合が多い。このようにして、温血動物中に形成された抗体
を採取する方法としては、たとえばウサギでは、
通常最終接種後７日から12日の間に耳静脈から採
血し、遠心分離して血清として得られる。 hCGの特異抗体の製造に用いられる担体上に保
持された抗原における担体としては、前記した担
体と同様のものが挙げられる。担体に抗原もしくは抗体を保持させるには、公
知の常套手段を応用し得るが、たとえば“代謝”、
第８巻（1971年）、第696頁に記載されているブロ
ムシアン法、GLA法などが挙げられる。また、
より簡易な方法として物理的に担体表面に吸着さ
せてもよい。前記一般式〔〕で表わされるベプチドの具体
例としてはたとえばhCG−βのＣ末端ベプチド
（）（123−145）〔Ｈ−Ala−Pro−Pro−Pro−
Ser−Leu−Pro−Ser−Pro−Ser−Arg−Leu−
Pro−Gly−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−
Leu−Pro−Gln−OH〕が挙げられ、これはたと
えば特開昭56−138248号公報に記載の方法により
製造することができる。本明細書において、アミノ酸、ベプチド、保護
基、活性基、その他に関し略号で表示する場合、
それらはIUPAC−IUB Commission on
Biological Nomenclatureによる略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、そ
の例を次に挙げる。また、アミノ酸などに関し光
学異性体がありうる場合は、特に明示しなければ
Ｌ体を示すものとする。 Ala：アラニン Pro：プロリン Ser：セリン Leu：ロイシン Arg：アルギニン Gly：グリシン Asp：アスパラギン酸 Thr：スレオニン Ile：イソロイシン Gln：グルタミン本発明で用いられる種々のベプチドは、ベプチ
ド合成の公知の常套手段で製造しうる。固相合成
法、液相合成法のいずれによつてもよいが、液相
合成法が有利な場合が多い。そのようなベプチド
合成の手段としては、たとえば“The
Peptides”、第１巻（1966）、Schro¨der and
Lubke著、Academic press，New York，U.S.
A.あるいは“ペプチド合成”、泉屋ら著、丸善株
式会社（1975年）に記載された方法、たとえばア
ジド法、クロライド法、酸無水物法、混合無水物
法、DCC法、活性エステル法、ウツドワード試
薬Ｋを用いる方法、カルボジイミダゾール法、酸
化還元法、DCC／アデイテイブ（例、HONB，
HOBt，HOSu）法などがあげられる。本発明で用いられる標識剤を結合させた抗体に
おける抗体は、hCGに非特異的に反応するもので
あつて、前記担体上に保持された抗体と互いに抗
原決定部位を重複しないものが用いられる。該hCGに非特異的に反応する抗体の例として
は、たとえば、人尿より公知の方法で精製した
hCGを、人以外の温血動物に接種してhCGに対す
る抗体を形成せしめ、さらに塩析により得たγ−
グロブリン画分をhCG−βのＣ末端ベプチドを結
合させた固相を充てんしたカラムを用いるアフイ
ニテイークロマトグラフイーにかけて素通り画分
を得、さらにhCGを結合させた固相を充てんした
カラムを用いるアフイニテイークロマトグラフイ
ーで精製して得られた、hLHなど類似の構造を
有する蛋白ホルモンとも交叉反応を示す抗体など
が挙げられる。標識剤であるβ−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗体
との結合においては、Ｎ，N′−Ｏ−フエニレン
ジマレイミド（以下、PDMと略称することもあ
る。）を用いて結合させる。結合させる方法としては、たとえば加藤らの方
法〔ザ・ジヤーナル・オブ・イムノロジ（The
Journal of Immunology）第116巻（1976年）、
1554頁〕により得られた抗体Fab′フラグメント
とPDMとをPH約５ないし８の緩衝液中で約０℃
ないし40℃の温度で約10分ないし24時間反応させ
る。該緩衝液としては0.1M酢酸ナトリウム緩衝
液（PH5.0）、0.1Mリン酸緩衝液（PH5.8）などが
挙げられる。このようにして得られたマレイミド
化抗体Fab′にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを反応
させるには両者を緩衝液中で約０℃ないし40℃の
温度で約10分ないし48時間反応させることによつ
て行なうことができる。該緩衝液としてPH6.5の
1mMエチレンジアミン四酢酸ナトリウム塩を含
む0.1Mリン酸緩衝液などが挙げられる。 β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗体とをＮ，
N′−Ｏ−フエニレンジマレイミドを用いて結合
させる具体例を以下に述べる。抗hCG抗体IgGあるいはペプシン分解後、得ら
れたＦ（ab′）₂画分をメルカプトエチルアミン類の
存在下で還元し、ゲル過によつて未反応物質を
除去する。こうして得られた抗hCG抗体IgGもし
くはFab′にＮ，N′−Ｏ−フエニレンジマレイミ
ドを反応させ、次いでゲル過によつて低分子量
物質を除去したのち、得られたマレイミド型抗体
にβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを反応させる。こう
して得られた反応生成物をゲル過によつて精製
し、β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗hCG抗体IgG
もしくはFab′の結合物を得る。本発明の測定方法を以下に具体的に説明する。まず、：担体に保持された抗体に、測定すべきhCG
含有の分析対象物を加えて抗原抗体反応を行つ
た後これに前記で得られたβ−Ｄ−ガラクトシ
ダーゼと抗hCG抗体IgGもしくはFab′との結合
物を加えて反応させる。本発明の酵素免疫測定法において測定対象と
なるhCGを含む被検試料としては、尿、血清、
血漿、髄液あるいは各種臓器抽出物等が挙げら
れ、とりわけ尿、血清および血漿が繁用され
る。：で得られた反応生成物にβ−Ｄ−ガラク
トシダーゼの基質として４−メチルウンベリフ
エリル−β−Ｄ−ガラクトシドなどを加えて、
遊離した４−メチルウンベリフエロンなどを蛍
光光度計で測定することにより上記の反応生成
物の酵素活性を知る。：上記−の操作を既知量のhCGの標準溶
液に対し予め行い、hCG量と上記の蛍光強度と
の関係を標準曲線として作成しておく。：未知量のhCGを含む分析対象物について得
られた蛍光強度を標準曲線にあてはめ、分析対
象物中のhCG含量を測定する。本発明のサンドイツチ法によるhCGの免疫化学
的測定法に用いられる定量用キツトとしては、主
として (1) 担体上に保持された抗体 (2) β−Ｄ−ガラクトシダーゼ標識された抗体 (3) 約０ないし10IUの標準hCG (4) 上記(2)〜(3)の試薬および被検試料の希釈に用
いる緩衝液（該試薬および該被検試料の希釈に
用いることができる緩衝剤であればいずれでも
よいが、その一例としてはPH約６ないし９のリ
ン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げられ
る。） (5) インキユベーシヨン後、担体の洗浄に用いる
緩衝液（該担体の洗浄に用いることができる緩
衝剤であればいずれでもよいが、その一例とし
てはリン酸緩衝液またはグリシン緩衝液が挙げ
られる。） (6) 酵素基質（好ましくは４−メチルウンベリフ
エリル−β−Ｄ−ガラクトシドまたはオルトニ
トロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシド、パラニ
トロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシド）、酵素
基質の溶解に用いる緩衝液（好ましくはリン酸
緩衝液）および酵素反応停止に用いる緩衝液
（好ましくは炭素緩衝液またはグリシン緩衝液）
が挙げられる。上記のキツトはたとえば下記の方法により使用
するのが好ましい。標準hCGもしくは被検液約10ないし200μに
試薬(4)を加えて希釈し、一定量の試薬(1)を加えて
約０ないし40℃で約１ないし24時間反応させる。
試薬(5)で担体の洗浄後、試薬(2)の約10ないし
300μを加えたのち、約０ないし40℃で反応さ
せる。約１ないし24時間反応後、試薬(5)で洗浄し
担体上に結合しているβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
の活性を測定する。すなわち酵素基質液約10ない
し1000μを加えて約20ないし40℃で約0.5ないし
24時間反応させたのち、酵素反応を停止させ、反
応液中の吸光度もしくは蛍光強度を測定する。本発明の測定法によると、高感度でhCGを特異
的に測定することができる。本発明により、他の類似したホルモン（たとえ
ばヒト黄体形成ホルモン）からの妨害を受けるこ
となく高感度かつ正確に測定できるので、絨毛性
腫瘍やその他のhCG産生腫瘍などの診断、予後管
理に極めて有用な手段を提供するものである。以下に、参考例および実施例を挙げて、本発明
をさらに具体的に説明する。参考例１抗体の製造人尿より公知の方法で精製した約10000IU／mg
のhCG1mgを生理食塩水１mlに溶解し、これにフ
ロインドの完全アジユバント（Freund′s
complete adjuvant、“免疫の生化学”、橘ら著、
共立出版株式会社（1967年））１mlを加えてよく
混和し乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉
内および背部皮下数箇所に注射する。以上の操作
を３週毎に５回行ない最終免疫後１週間で採血し
パイロツトアツセイを実施する。その結果、hCG
−βのＣ末端ベプチド（）にも親和性をもつ抗
血清N305Bを得た。参考例２特異抗hCG抗体の製造 hCG−βのＣ末端ベプチド（）５mgを
0.5MNaClを含む0.1MNaHCO₃8mlに溶解し、予
めＮ／1000HCIで洗浄したブロムシアン活性化セ
フアロース4B（フアルマシア・フアイン・ケミカ
ルズ社製）１ｇに加え、５℃で一夜撹拌した。反
応終了後同じ0.5MNaClを含む0.1MNaHCO₃で
十分に洗浄し、次いでHClでPH８に調整した
0.5Mエタノールアミン10mlを添加して室温で１
時間反応させた後、(1)1MNaClを含む0.1M酢酸
緩衝液（PH4.0）、(2)1MNaClを含む0.1Mホウ酸緩
衝液（PH3.0）および(3)0.15MNaClを含む0.02M
ホウ酸緩衝液（PH8.0）で順次洗浄しカラムに充
填した。参考例１で得られた抗血清N305B8mlを1.5ｇの
無水硫酸ナトリウムを用いて塩析沈澱させ、得ら
れたγ−グロブリン画分を上記のベプチド（）
結合セフアロース4Bカラム（0.9×４cm）に付し
た。 0.15MNaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（PH8.0）
でカラムを洗浄し、hLH，hFSH（卵胞刺激ホル
モン）およびhTSH（甲状腺刺激ホルモン）と交
差反応する抗hCG抗体を除去した。次いで0.17M
グリシン−塩酸緩衝液（PH2.3）で溶出すること
によつてhCG−βのＣ末端ベプチド（）と強い
親和性をもつ特異抗体N305BSを得た（蛋白量
1.2mg）。参考例３抗hCG−βのＣ末端ベプチド（）抗体の製造 hCG−βのＣ末端ベプチド（）25mgおよび牛
チログロブリン（BTGと略称する）50mgを0.2M
リン酸緩衝液（PH7.3）４mlに溶解し、５％GLA
水溶液４mlを加えて室温で３時間撹拌後、４℃で
透析（水２×４）し凍結乾燥して免疫原を得
た。このhCG−βのＣ末端ベプチド（）−BTG
縮合物1.5mgを生理食塩水0.75mlに溶解し、これ
にフロインドの完全アジユバント（Freund′s
complete adjuvant）0.75mlを加えてよく混和
し、乳剤を作り、これをウサギの両大腿部筋肉内
および背部皮下数ケ所に注射した。以上の操作を
４週おきに４回行ない最終免疫後１週間で採血
し、遠心分離して抗血清を採取し抗hCG−βのＣ
末端ベプチド（）に対する抗血清N313Bを得
た。次いで抗血清N313Bを常法により硫酸アンモ
ニウムで塩析させて得たγ−グロブリン画分を２
mgのhCGを結合させたセフアロース4Bカラム
（直径0.9cm、長さ４cm）に付した。 0.15MNaClを含む0.02Mホウ酸緩衝液（PH8.0）
でカラムを洗浄し、次いで0.17Mグリシン−塩酸
緩衝液（PH2.3）で溶出することによつて、hCG
に親和性の高い特異抗体N313BSを調製した。参考例４非特異抗hCG抗体の製造参考例１で得られた抗血清N305Bについて硫
酸アンモニウム塩析し、５mgのhCG−βのＣ末端
ベプチド（）を結合させたセフアロース4Bカ
ラム（直径0.9cm、長さ４cm）のアフイニテイー
クロマトグラフイーで素通りする抗体画分を調製
した。次いでこの抗体画分を２mgのhCGを結合さ
せたセフアロース4Bカラム（直径0.9cm、長さ４
cm）に付した。0.15MNaClを含む0.02Mホウ酸緩
衝液（PH8.0）でカラムを洗浄し、次いで
5MMgCl₂で溶出することによつてhCGに親和性
の高い非特異抗体N305BGを調製した。参考例５抗体結合固相の調製ポリスチレンポール（直径3.2mm、Precision
Plastics Ball Co.，Chicago，U.S.A.）1500個
に、参考例２ないし４に記載の抗体N305BG、
N313BSあるいはN305BGの30μｇ／ml
0.01MNACl−0.01Mリン酸緩衝液（PH8.0）30ml
を加え５℃で一夜インキユベートした。0.1％
BSAを含む0.05Mリン酸緩衝液（PH7.0）で洗浄
したのち、用時まで冷所保存した。実施例１ β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗hCGウサギ抗体
N305BG（Fab′）との結合物によるhCGの測定 (1) β−Ｄ−ガラクトシダーゼー抗hCGウサギ抗
体N305BG（Fab′）結合物の製造参考例４で得られた抗体N305BG5mgに0.1mgの
ペプシンを加え30℃で一夜反応後、セフアデツク
スＧ−150カラム（直径2.5cm、長さ55cm）で精製
した。得られた抗体Ｆ（ab′）₂画分をβ−メルカプ
トエチルアミンで還元後、セフアデツクスＧ−25
カラム（直径0.9cm、長さ55cm）に供し過剰の試
薬を除去した。次にPDM飽和溶液２mlを添加し
30℃で30分反応させたのち、反応混合液をセフア
デツクスＧ−25カラム（直径2.5cm、長さ55cm）
で精製した。得られたマレイミド化Fab′にβ−
Ｄ−ガラクトシダーゼ溶液（５mg／ml）50μを
添加し５℃で一夜反応させた。反応終了後、0.1
％牛血清（以下、BSAと略称することもある。）、
0.1％NaN₃，1mMMgCl₂および0.1MNaClを含む
0.02Mリン酸緩衝液（PH6.5）を用いるセフアロ
ース6Bのカラムクロマトグラフイーで精製し、
酵素活性ならびに抗体活性を有するフラクシヨン
を分取し、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ抗hCG抗体
N305BG（Fab′）結合物を得た。以下、本結合物の物性について述べる。本結合物はEIAで用いる合成基質４−メチル
ウンベリフエリル−β−Ｄ−ガラクトシドやオ
ルトニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシド、
パラニトロフエニル−β−Ｄ−ガラクトシドを
分解し、それぞれ４−メチルウンベリフエロン
やオルトニトロフエノール、パラニトロフエノ
ールを遊離する。合成基質４−メチルウンベリフエリル−β−
Ｄ−ガラクトシドを用いる時、本結合物のミカ
エリス定数はもとのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
と同じ値を示す。酵素活性の至適PHは6.5〜7.3である。酵素活性を有する本結合物の約90％以上が
hCGとの反応性を有し、その抗体活性は酵素活
性と共に冷蔵保存で６ケ月以上安定である。分子量は約65万で抗体Fab′／酵素のモル比
は約2.0である。 PH５−９の水性溶媒に易溶である。紫外吸収スペクトルを第１図に示す。アミノ酸分析値を第１表に示す。

【表】のモル数
(2) β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗hCGウサギ抗
体N305BG（Fab′）結合物を用いたhCGの定量緩衝液Ａ〔0.1MNaCl，1mMMgCl₂，0.1％牛血
清アルブミン（BSAと略称することもある。）、
0.1％NaN₃を含む0.02Mリン酸ナトリウム緩衝液
（PH7.0）〕150μにhCG含有液50μを加え、更に
ポリスチレンボール−hCG特異抗体N305BS結合
物を１個加えて室温で一夜反応させた。反応終了
後、0.01Mリン酸食塩緩衝液（PH7.0）でポリス
チレンボールをよく洗浄し、次に緩衝液Ａで希釈
したβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗hCGウサギ抗
体N305BG（Fab′）結合物200μを加えて37℃で
３時間反応させた。反応終了後、再び0.01Mリン
酸食塩緩衝液（PH7.0）でポリスチレンボールを
よく洗浄し、ポリスチレンボールに結合している
β−Ｄ−ガラクトシダーゼ活性を測定した。結果
は、第２図の−〇−で示される。参考例６ β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗hCGウサギ抗体
N305BS（IgG）との結合物によるhCGの測定 (1) β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗hCGウサギ抗
体N305BS（IgG）結合物の製造参考例２で得られた特異抗体N305BS2mgを
15mMのβ−メルカプトエチルアミンで還元後、
セフアデツクスＧ−25カラム（直径0.9cm、長さ
55cm）に供し、過剰のβ−メルカプトエチルアミ
ンを除去した。次にPDM飽和溶液1.5mlを添加し
30℃で30分反応させたのち、反応混合液をセフア
デツクスＧ−25カラム（直径0.9cm、長さ55cm）
に供し、過剰のPDMを除去した。得られたマレ
イミド化抗体IgGにβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ溶
液（５mg／ml）30μを添加し、５℃で36時間反
応させた。反応終了後、0.1％BSA、0.1％NaN₃、
1mMMgCl₂および0.1MNaClを含む0.02Mリン酸
緩衝液（PH6.5）を用いるセフアロース6Bのカラ
ムクロマトグラフイーで精製し、酵素活性ならび
に抗体活性を有するフラクシヨンを分散し、β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗hCG抗体N305BS
（IgG）結合物を得た。本結合物の物性は次の項目（および）を除
き、実施例１で得られた結合物の物性（，，
，，および）と同一である。分子量は約80万で抗体IgG／酵素のモル比は
約1.9である。アミノ酸分析値を第２表に示す。

【表】のモル数
(2) β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗hCGウサギ抗
体N305BS（IgG）結合物を用いたhCGの定量実施例１−(2)記載のポリスチレンボール−hCG
特異抗体N305BS結合物およびβ−Ｄ−ガラクト
シダーゼ−抗hCGウサギ抗体N305BG（Fab′）結
合物の代りに、それぞれポリスチレンボール−
hCG非特異抗体N305BG結合物およびβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ−抗hCGウサギ抗体N305BS
（IgG）結合物を用いて、実施例１−(2)と同様に
処理して測定した。結果は第２図の−▽−で示さ
れる。参考例７ β−Ｄ−ガラクトシダーゼと抗hCGウサギ抗体
N313BS（IgG）との結合物によるhCGの測定 (1) β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗hCGウサギ抗
体N313BS（IgG）結合物の製造参考例６−(1)におけるN305BSの代りに、参考
例３で得られたN313BSを用いて、参考例６−(1)
と同様に処理してβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗
hCGウサギ抗体N313BS（IgG）結合物を得た。本結合物の物性は次の項目（および）を除
き、実施例１で得られた結合物の物性（，，
，，および）と同一である。分子量は約80万で抗体IgG／酵素のモル比は
約1.6である。アミノ酸分析値は第３表に示される。

【表】

【表】のモル数
(2) β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗hCGウサギ抗
体N313BS（IgG）結合物を用いたhCGの定量参考例６−(2)記載のβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ
−抗hCGウサギ抗体N305BS（IgG）結合物の代り
に、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ−抗hCGウサギ抗
体N313BS（IgG）結合物を用いて、参考例６−(2)
と同様に処理して第２図の結果を得た（−●−）
で示される）。

【図面の簡単な説明】

第１図および第３図はそれぞれ抗hCG抗体
Fab′−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ結合物および
抗hCG抗体IgG−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ結合
物の紫外吸収スペクトルを表わす。第２図はhCG
の標準曲線を表わし、−〇−は抗hCG抗体
N305BG（Fab′）−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ結合
物を用いた実施例１の結果を、−▽−は抗hCG抗
体N305BS（IgG）−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ結
合物を用いた参考例６の結果を、−●−は抗hCG
抗体N313BS（IgG）−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
結合物を用いた参考例７の結果をそれぞれ表わ
す。

Claims

【特許請求の範囲】１担体上に保持された抗体、抗原および標識剤
を結合させた抗体を用いる免疫化学的測定方法に
おいて、担体上に保持される抗体と標識剤を結合
させる抗体とが互いに抗原決定部位を重複しない
２種の抗体であり、担体上に保持される抗体が一
般式Ｈ−Ｒ−Pro−Ser−Asp−Thr−Pro−Ile−
Leu−Pro−Gln−OH 〔式中、Ｒは Ala １− Pro ２− Pro ３− Pro ４− Ser ５ − Leu ６− Pro ７− Ser ８− Pro ９− Ser 10 − Arg 11− Leu 12− Pro 13− Gly 14 で示されるペプチドの14位のGlyを含む１〜14個
の部分ペプチド鎖を表わす。〕で表わされるペプ
チドに対するヒト絨毛性ゴナドトロピンに特異的
に反応する抗体であり、標識剤としてβ−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼを用い、これと抗体とをＮ，
N′−Ｏ−フエニレンジマレイミドで結合させた
ものを用いることを特徴とするヒト絨毛性ゴナド
トロピンの免疫化学的測定法。