JPS62276461A - サブユニツト含有四次構造タンパク質の存在下におけるポリペプチドサブユニツトの検出方法 - Google Patents
サブユニツト含有四次構造タンパク質の存在下におけるポリペプチドサブユニツトの検出方法Info
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- C07K—PEPTIDES
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
３、発明の詳細な説明
発明の分野
本発明は、その四次構造の一部分としてサブユニットを
有するタンパク質の存在下において遊離ポリペプチドサ
ブユニットの存在を検出する方法に関する。
有するタンパク質の存在下において遊離ポリペプチドサ
ブユニットの存在を検出する方法に関する。
背景技術の簡単な説明
タンパク質の構造はいくつかの段階の複雑性に特徴があ
る。タンパク質の一次構造とは、ポリペプチド鎖の共有
結合中心鎖を構成するアミノ酸残基の配列に関するもの
である。ポリペプチド鎖の二次構造とはそのヘリックス
らせん構造をいう。
る。タンパク質の一次構造とは、ポリペプチド鎖の共有
結合中心鎖を構成するアミノ酸残基の配列に関するもの
である。ポリペプチド鎖の二次構造とはそのヘリックス
らせん構造をいう。
タンパク質の三次構造とは、ポリペプチド鎖が折り重な
って高度に過密化した構造をいう。タンパク質の四次構
造は別個に合成されたポリペプチドサブユニットが会合
することにより形成される。
って高度に過密化した構造をいう。タンパク質の四次構
造は別個に合成されたポリペプチドサブユニットが会合
することにより形成される。
２以上のポリペプチドサブユニットから構成されるタン
パク質はオリゴマータンパク質として知られる。オリゴ
マータンパク質の例としては、例えば、ヒト絨毛性性腺
刺激ホルモン等の糖タンパク質ホルモン；ヘモグロビン
等の酵素輸送タンパク質；及び乳酸デヒドロゲナーゼ等
の酵素がある。
パク質はオリゴマータンパク質として知られる。オリゴ
マータンパク質の例としては、例えば、ヒト絨毛性性腺
刺激ホルモン等の糖タンパク質ホルモン；ヘモグロビン
等の酵素輸送タンパク質；及び乳酸デヒドロゲナーゼ等
の酵素がある。
主に医学的に重要なヒトの糖タンパク質ホルモンとして
は、絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣに）、黄体形成ホル
モン（ｈＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）及び甲
状腺刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）がある。ｈＣＧは妊娠期
間中に胎盤で合成されるが、他のホルモンは下垂体前葉
で合成される。これら子種すべてのホルモンは構造的に
類似している。これらのホルモンは二量体であって、α
及びβの２種の非共有結合的に会合したサブユニットか
ら構成される。α−サブユニットのアミノ酸構造は４種
すべてのホルモンに共通しているが、生物学的特異性の
あるβ−サブユニットは構造的に独自性を有する。これ
らすべてのβ−サブユニットはある程度のアミノ酸配列
相同性を有する。ヒトの場合、β−ｈＣＧ及びβ−ｈＬ
Ｈは最も返書な関係があって、アミノ酸配列の相同性は
８２％である。他の糖タンパク質ホルモンのβ−サブユ
ニットのアミノ酸配列相同性は２５〜４０％である。β
−ｈＣＧとβ−ｈＬＨとの構造を比較した場合に興味が
あることは、β−ｈＬＨには存在しない２４個のアミノ
酸カルボキシ末端ポリペプチドの延長部分（ＣＴＰ）が
β−ｈＣＧには存在していることである。
は、絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣに）、黄体形成ホル
モン（ｈＬＨ）、卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）及び甲
状腺刺激ホルモン（ｈＴＳＨ）がある。ｈＣＧは妊娠期
間中に胎盤で合成されるが、他のホルモンは下垂体前葉
で合成される。これら子種すべてのホルモンは構造的に
類似している。これらのホルモンは二量体であって、α
及びβの２種の非共有結合的に会合したサブユニットか
ら構成される。α−サブユニットのアミノ酸構造は４種
すべてのホルモンに共通しているが、生物学的特異性の
あるβ−サブユニットは構造的に独自性を有する。これ
らすべてのβ−サブユニットはある程度のアミノ酸配列
相同性を有する。ヒトの場合、β−ｈＣＧ及びβ−ｈＬ
Ｈは最も返書な関係があって、アミノ酸配列の相同性は
８２％である。他の糖タンパク質ホルモンのβ−サブユ
ニットのアミノ酸配列相同性は２５〜４０％である。β
−ｈＣＧとβ−ｈＬＨとの構造を比較した場合に興味が
あることは、β−ｈＬＨには存在しない２４個のアミノ
酸カルボキシ末端ポリペプチドの延長部分（ＣＴＰ）が
β−ｈＣＧには存在していることである。
ｈＣＧの分子不均一性と正常及び悪性双方の組織中にお
けるｈＣＧ関連糖タンパク質の存在とは、妊娠期間中に
おけるｈＣＧ合成の調節と正常及び悪性の非絨毛性細胞
でのｈＣＧゲノム脱抑制に関して推定されるメカニズム
との研究に際し大きな障害を引き起こした。妊娠期間中
での生物学的活性ｈＣＧの測定と腫瘍増殖の生化学マー
カーたるその腫瘍特異的変異型の検出とに際しては、完
全なホルモン、そのサブユニット又は類似型に対して高
度に特異的な抗体を産生じておくことが必要である。特
徴的なこととして、ｈＣＧに対する大半の多価抗血清は
他の糖タンパク質ホルモンと交差反応し、ｈＣＧとその
サブユニット又は類似型とを免疫学的に識別することが
できない。免疫原として高度に精製されたβ−ｈＣＧ
（パイッカイティスら、アメリカン・ジャーナル・オブ
・オブステトリクス・アンド・ギネコロジー、第１１３
巻、第７５１頁、１９７２年（Ｖａｌｔｕｋａｉｔｉｓ
ｅｔａｌ、、Ａｍｅｒｌｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｒＯｂｓｔｅｔｒｌｃｓ ａｎｄＧｙｎｅｃｏ１０ｇｙ
、 １１３ゴ５１（１９７２）） ） 、β−ｈＣＧの
化学的類似体〔パンディアンら、エンドクリノロジー、
第１０７巻、第１５６４頁、１９８０年（Ｐａｎｄｉａ
ｎ ｅＬ ａｌ、、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ１０ｇｙ、 １
０７．１５８４（１９８０）） ］又はカルボキシ末端
ペプチド〔マシウラら、エンドクリノロジー、第１０４
巻、第３９６頁、１９７９年（Ｍａｔｓｕｕｒａ ａｔ
ａｔ、。
けるｈＣＧ関連糖タンパク質の存在とは、妊娠期間中に
おけるｈＣＧ合成の調節と正常及び悪性の非絨毛性細胞
でのｈＣＧゲノム脱抑制に関して推定されるメカニズム
との研究に際し大きな障害を引き起こした。妊娠期間中
での生物学的活性ｈＣＧの測定と腫瘍増殖の生化学マー
カーたるその腫瘍特異的変異型の検出とに際しては、完
全なホルモン、そのサブユニット又は類似型に対して高
度に特異的な抗体を産生じておくことが必要である。特
徴的なこととして、ｈＣＧに対する大半の多価抗血清は
他の糖タンパク質ホルモンと交差反応し、ｈＣＧとその
サブユニット又は類似型とを免疫学的に識別することが
できない。免疫原として高度に精製されたβ−ｈＣＧ
（パイッカイティスら、アメリカン・ジャーナル・オブ
・オブステトリクス・アンド・ギネコロジー、第１１３
巻、第７５１頁、１９７２年（Ｖａｌｔｕｋａｉｔｉｓ
ｅｔａｌ、、Ａｍｅｒｌｃａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏ
ｒＯｂｓｔｅｔｒｌｃｓ ａｎｄＧｙｎｅｃｏ１０ｇｙ
、 １１３ゴ５１（１９７２）） ） 、β−ｈＣＧの
化学的類似体〔パンディアンら、エンドクリノロジー、
第１０７巻、第１５６４頁、１９８０年（Ｐａｎｄｉａ
ｎ ｅＬ ａｌ、、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ１０ｇｙ、 １
０７．１５８４（１９８０）） ］又はカルボキシ末端
ペプチド〔マシウラら、エンドクリノロジー、第１０４
巻、第３９６頁、１９７９年（Ｍａｔｓｕｕｒａ ａｔ
ａｔ、。
Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ１０ｇｙ、１０４ ：３９Ｂ（１９
７９）） ；バーケンら、エンドクリノロジー、第１
１０巻、第１５５５頁、１９８２年（Ｂｉｒｋｅｎ ｅ
ｔ ａｌ、、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ１０ｇｙ、ｌｌＯ：１
５５５（１９８２）） ］を用いることにより、ｈＬＨ
の存在下で選択的にｈＣＧを検出する抗血清を産生ずる
ことができるが、このような抗血清では今まで遊離β−
ｈＣＧサブユニットを完全な天然ｈＣＧ〔アームストロ
ングら、ジャーナル・オブψクリニカル・エンドクリノ
ロジー・アンド・メタボリズム、第５９巻、第８６７頁
、１９８４年（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ、、Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ’ ＣｌＣ１１ｎｉｃａｌＥｎｄｏ
ｃｒｉｎｏ１０ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、５９
，８６７（１９８４） ） ）から区別することができ
なかった。したがって、免疫学的診断試験系において多
価抗体を用いても、構造的相同性の程度に差異がある類
似タンパク質・属もしくは族が存在しているｈＣＧのよ
うなタンパク質の場合にあっては限界がある。
７９）） ；バーケンら、エンドクリノロジー、第１
１０巻、第１５５５頁、１９８２年（Ｂｉｒｋｅｎ ｅ
ｔ ａｌ、、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ１０ｇｙ、ｌｌＯ：１
５５５（１９８２）） ］を用いることにより、ｈＬＨ
の存在下で選択的にｈＣＧを検出する抗血清を産生ずる
ことができるが、このような抗血清では今まで遊離β−
ｈＣＧサブユニットを完全な天然ｈＣＧ〔アームストロ
ングら、ジャーナル・オブψクリニカル・エンドクリノ
ロジー・アンド・メタボリズム、第５９巻、第８６７頁
、１９８４年（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ｅｔ ａｌ、、Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ’ ＣｌＣ１１ｎｉｃａｌＥｎｄｏ
ｃｒｉｎｏ１０ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ、５９
，８６７（１９８４） ） ）から区別することができ
なかった。したがって、免疫学的診断試験系において多
価抗体を用いても、構造的相同性の程度に差異がある類
似タンパク質・属もしくは族が存在しているｈＣＧのよ
うなタンパク質の場合にあっては限界がある。
近年、多くの研究は、所望の特異性を獲得するために、
ハイブリドーマ融合技術により開発されたモノクローナ
ル抗体を使用することに焦点が向けられている。例えば
、カゼーリ（Ｋｈａｚａｅｌ ｉ）ら〔エンドクリノロ
ジー、第１０９巻、第１２９０頁、１９８１年（Ｅｎｄ
ｏｃｒｊｎｏ１０ｇｙ、１０９ ：１２９０（１９８１
）） ）は、ｈＣＧとの交差反応性の程度に差異がみら
れる、β−ｈＣＧサブユニットに対し特異的なモノクロ
ーナル抗体の産生法について報告した。交差反応性が固
定されたｈＣＧを用いるＥＬＩＳＡ試験により調べられ
た際に、著者はｈＣＧとの最小交差反応性が約２％であ
ることを見出した。交差反応性が、放射性ヨウ素で標識
□されたβ−ｈＣＧがｈｃｃａ度の増加とともに競合す
る二重抗体放射免疫試験により調べられた場合には、著
者はモノクローナル抗体のｈＣＧとの交差反応性が０．
２３％であったと述べている。
ハイブリドーマ融合技術により開発されたモノクローナ
ル抗体を使用することに焦点が向けられている。例えば
、カゼーリ（Ｋｈａｚａｅｌ ｉ）ら〔エンドクリノロ
ジー、第１０９巻、第１２９０頁、１９８１年（Ｅｎｄ
ｏｃｒｊｎｏ１０ｇｙ、１０９ ：１２９０（１９８１
）） ）は、ｈＣＧとの交差反応性の程度に差異がみら
れる、β−ｈＣＧサブユニットに対し特異的なモノクロ
ーナル抗体の産生法について報告した。交差反応性が固
定されたｈＣＧを用いるＥＬＩＳＡ試験により調べられ
た際に、著者はｈＣＧとの最小交差反応性が約２％であ
ることを見出した。交差反応性が、放射性ヨウ素で標識
□されたβ−ｈＣＧがｈｃｃａ度の増加とともに競合す
る二重抗体放射免疫試験により調べられた場合には、著
者はモノクローナル抗体のｈＣＧとの交差反応性が０．
２３％であったと述べている。
スチュワートら、ジャーナル・オブ・エンドクリノロジ
ー、第９８巻、第３２３頁、１９８３年（Ｓｔｅｗａｒ
ｔ ｅｔ ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ’ Ｅｎｄｏ
ｃｒｌｎｏ１０ｇｙ、９８ ：３２３（１９８３） ）
において、著者はｈＣＧ及びそのサブユニットに対する
モノクローナル抗体の産生法について研究していた。著
者により特徴づけられたモノクローナル抗体に関して、
１種の抗体は完全なｈＣＧとのみ反応し、他の抗体はｈ
ＣＧの遊離β−サブユニットのみを識別した。
ー、第９８巻、第３２３頁、１９８３年（Ｓｔｅｗａｒ
ｔ ｅｔ ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ’ Ｅｎｄｏ
ｃｒｌｎｏ１０ｇｙ、９８ ：３２３（１９８３） ）
において、著者はｈＣＧ及びそのサブユニットに対する
モノクローナル抗体の産生法について研究していた。著
者により特徴づけられたモノクローナル抗体に関して、
１種の抗体は完全なｈＣＧとのみ反応し、他の抗体はｈ
ＣＧの遊離β−サブユニットのみを識別した。
ワンら、ハイブリドーマ、第１巻、第２９３頁、１９８
２年（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ、、Ｈｙｂｒｌｄｏｍａ、
ｌ ：２９３（１９８２））において、著者はβ−ｈＣ
Ｇ及びα−ｈＣＧに対し特異的なモノクローナル抗体を
分泌する２種の別個のハイブリドーマの産生法について
記載している。
２年（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ、、Ｈｙｂｒｌｄｏｍａ、
ｌ ：２９３（１９８２））において、著者はβ−ｈＣ
Ｇ及びα−ｈＣＧに対し特異的なモノクローナル抗体を
分泌する２種の別個のハイブリドーマの産生法について
記載している。
デビット（Ｄａｖｉｄ ）ら（米国特許第４．３７６．
１１０号明細書）は、２種の別個のクローン由来のモノ
クローナル抗体を用いる２部位免疫測定試験について開
示しており、これらのクローンから得られるモノクロー
ナル抗体は抗原上の異なるニブトープに対して特異性を
有している。
１１０号明細書）は、２種の別個のクローン由来のモノ
クローナル抗体を用いる２部位免疫測定試験について開
示しており、これらのクローンから得られるモノクロー
ナル抗体は抗原上の異なるニブトープに対して特異性を
有している。
ギブナー（Ｇｉｖｎｅｒ） （米国特許第４．１３８
．２１４号明細書）の場合は、妊娠を検知するための方
法及び装置について開示している。装置は体液を濃縮し
、ｈＣＧのβ−サブユニットに対し特異的なモノクロー
ナル抗体の使用により検知が行なわれる。
．２１４号明細書）の場合は、妊娠を検知するための方
法及び装置について開示している。装置は体液を濃縮し
、ｈＣＧのβ−サブユニットに対し特異的なモノクロー
ナル抗体の使用により検知が行なわれる。
これら文献のいずれも、臨床試料においては一般的であ
る、μｇＥ１のｈＣＧの存在下でｎｇＪｉの遊離β−ｈ
ＣＧサブユニットを検出するための方法について開示し
ていない。
る、μｇＥ１のｈＣＧの存在下でｎｇＪｉの遊離β−ｈ
ＣＧサブユニットを検出するための方法について開示し
ていない。
発明の要約
モノクローナル抗体は、ポリペプチドサブユニット含有
四次構造タンパク質の存在下において四次構造タンパク
質の遊離ポリペプチドサブユニットを検出するために使
用される。遊離サブユニット対四次構造タンパク質の比
を測定することにより、一定の腫瘍に関する患者の状態
を調べることが可能になる。
四次構造タンパク質の存在下において四次構造タンパク
質の遊離ポリペプチドサブユニットを検出するために使
用される。遊離サブユニット対四次構造タンパク質の比
を測定することにより、一定の腫瘍に関する患者の状態
を調べることが可能になる。
試料中での遊離サブユニットの濃度、遊離サブユニット
上でのみ接近可能なエピトープに対して特異的な第１の
モノクローナル抗体、更に遊離タンパク質サブユニット
及び四次構造タンパク質双方のエピトープと結合する第
゛２のモノクローナル抗体に試料を接触させることによ
って測定する。
上でのみ接近可能なエピトープに対して特異的な第１の
モノクローナル抗体、更に遊離タンパク質サブユニット
及び四次構造タンパク質双方のエピトープと結合する第
゛２のモノクローナル抗体に試料を接触させることによ
って測定する。
四次構造タンパク質の濃度は、完全な四次構造タンパク
質分子上にのみ存在するエピトープに対して特異的な第
３のモノクローナル抗体、更に遊離タンパク質サブユニ
ット及び四次構造タンパク質双方のエピトープと結合す
る上記第２のモノクローナル抗体に同一の又は分離した
一部の試料を接触させることによって測定することがで
きる。
質分子上にのみ存在するエピトープに対して特異的な第
３のモノクローナル抗体、更に遊離タンパク質サブユニ
ット及び四次構造タンパク質双方のエピトープと結合す
る上記第２のモノクローナル抗体に同一の又は分離した
一部の試料を接触させることによって測定することがで
きる。
このように、本発明は、試料中における四次構造タンパ
ク質の遊離タンパク質サブユニットの測定方法を提供す
ることが、この方法は下記のとおりである： （ａ） 上記試料を担体と結合しているか又は結合す
るであろう第１の免疫学的結合相手と接触させ（上記第
１の免疫学的結合相手は上記遊離タンパク質サブユニッ
ト上でのみ結合可能なエピトープ抗原決定基と結合する
）； （ｂ） 上記遊離タンパク質サブユニット、上記第１
の免疫学的結合相手及び上記担体間で免疫複合体を形成
させるために十分な時間及び条件において工程（ａ）の
成分をインキュベートし；（Ｃ） 上記試料から工程
（ｂ）の上記担体を分離し； （ｄ） 工程（ｃ）の上記担体に、検出可能に標識さ
れた第２の免疫学的結合相手を加え（上記第２の免疫学
的結合相手は上記遊離タンパク質サブユニット及び上記
四次構造タンパク質双方上の結合可能なエピトープ抗原
決定基と結合する）；及び （ｅ） 上記担体中の又は液体中に残留する検出可能
に標識された第２の免疫学的結合相手を測定する。
ク質の遊離タンパク質サブユニットの測定方法を提供す
ることが、この方法は下記のとおりである： （ａ） 上記試料を担体と結合しているか又は結合す
るであろう第１の免疫学的結合相手と接触させ（上記第
１の免疫学的結合相手は上記遊離タンパク質サブユニッ
ト上でのみ結合可能なエピトープ抗原決定基と結合する
）； （ｂ） 上記遊離タンパク質サブユニット、上記第１
の免疫学的結合相手及び上記担体間で免疫複合体を形成
させるために十分な時間及び条件において工程（ａ）の
成分をインキュベートし；（Ｃ） 上記試料から工程
（ｂ）の上記担体を分離し； （ｄ） 工程（ｃ）の上記担体に、検出可能に標識さ
れた第２の免疫学的結合相手を加え（上記第２の免疫学
的結合相手は上記遊離タンパク質サブユニット及び上記
四次構造タンパク質双方上の結合可能なエピトープ抗原
決定基と結合する）；及び （ｅ） 上記担体中の又は液体中に残留する検出可能
に標識された第２の免疫学的結合相手を測定する。
好ましい態様の簡単な説明
本発明の方法において、四次構造タンパク質の遊離タン
パクサブユニット及びタンパク質サブユニットＡく一部
分をなす完全な四次構造タンパク質−の双方を含有した
試料は、第１の免疫学的結合相手、第２の免疫学的結合
相手及び第３の免疫学的結合相手と接触せしめられる。
パクサブユニット及びタンパク質サブユニットＡく一部
分をなす完全な四次構造タンパク質−の双方を含有した
試料は、第１の免疫学的結合相手、第２の免疫学的結合
相手及び第３の免疫学的結合相手と接触せしめられる。
第１及び第２の結合相手は、両相子がタンパク質サブユ
ニットと結合できるようなタンパク質サブユニットの異
なる領域と反応する。第１の結合相手は通常抗体である
。第２の結合相手も通常検出可能に標識された抗体であ
る。第３の結合相手は通常抗体であるが、適用される本
発明の態様に応じて標識されても標識されていなくても
よい。
ニットと結合できるようなタンパク質サブユニットの異
なる領域と反応する。第１の結合相手は通常抗体である
。第２の結合相手も通常検出可能に標識された抗体であ
る。第３の結合相手は通常抗体であるが、適用される本
発明の態様に応じて標識されても標識されていなくても
よい。
図１は、本発明で検出される四次構造タンパク質のエピ
トープの配置を示した概略図である。簡略化のために、
図では２種のサブユニット（α及びβ）のみからなる四
次構造タンパク質を示しているが、更に多くのサブユニ
ットを有する四次構造タンパク質も本発明の方法により
検出することができる。
トープの配置を示した概略図である。簡略化のために、
図では２種のサブユニット（α及びβ）のみからなる四
次構造タンパク質を示しているが、更に多くのサブユニ
ットを有する四次構造タンパク質も本発明の方法により
検出することができる。
図示したように、四次構造タンパク質の特異的エピトー
プ（小円）は、α及びβ−サブユニットが会合中である
場合にのみ存在する。したがって、このエピトープに対
する抗体は遊離α及びβ−サブユニットのいずれとも結
合することができない。
プ（小円）は、α及びβ−サブユニットが会合中である
場合にのみ存在する。したがって、このエピトープに対
する抗体は遊離α及びβ−サブユニットのいずれとも結
合することができない。
遊離β−サブユニット特異的エピトープ（小四角）は、
β−サブユニットが四次構造タンパク質の一部分でない
場合に、このエピトープに対し特異的な抗体にのみ接近
することができる。
β−サブユニットが四次構造タンパク質の一部分でない
場合に、このエピトープに対し特異的な抗体にのみ接近
することができる。
遊離β−サブユニット及び四次構造タンパク質の双方に
共通したエピトープの存在も示されていル（小三角）。
共通したエピトープの存在も示されていル（小三角）。
このエピトープは接近可能性を有しているため、β−サ
ブユニットが遊離しているか又は四次構造タンパク質の
一部分をなしているかにかかわらず、抗体と結合するこ
とができる。
ブユニットが遊離しているか又は四次構造タンパク質の
一部分をなしているかにかかわらず、抗体と結合するこ
とができる。
遊離α−サブユニットエピトープ（半穴角）は、α−サ
ブユニットが四次構造タンパク質の一部分をなしていな
い場合に、このエピトープに対し特異的な抗体にのみ接
近することができる。
ブユニットが四次構造タンパク質の一部分をなしていな
い場合に、このエピトープに対し特異的な抗体にのみ接
近することができる。
遊離しているか又は完全な四次構造タンパク質の一部分
をなしているα−サブユニットに共通したエピトープも
示されている（十字）。このエピトープは、α−サブユ
ニットが遊離しているか又は四次構造タンパク質の一部
分をなしているかにかかわらず、抗体と結合することが
できる。
をなしているα−サブユニットに共通したエピトープも
示されている（十字）。このエピトープは、α−サブユ
ニットが遊離しているか又は四次構造タンパク質の一部
分をなしているかにかかわらず、抗体と結合することが
できる。
第１の態様において、試料は、タンパク質サブユニット
が完全な四次構造タンパク質の一部分をなしている場合
には接近不可能であるタンパク質サブユニット上のエピ
トープ抗原決定基に対して特異的な第１の結合相手と一
緒にインキュベートされる。インキュベートは、タンパ
ク質サブユニットと第１の結合相手とが反応するために
十分な時間にわたり続けられる。１回目のインキュベー
ト後、第１の結合相手を含有した複合体は試料から除去
され、検出可能に標識された第２の結合相手と接触せし
められる。第２の結合相手は、タンパク質サブユニット
が遊離しているか又は完全な四次構造タンパク質の一部
分をなしている場合に、タンパク質サブユニット上に存
在するエピトープ抗原決定基と反応する。インキュベー
トは、タンパク質サブユニット（現時点では複合化して
いる）及び第２の結合相手が結合するために十分な時間
にわたり続けられる。２回目のインキュベート後、反応
混合物は洗浄されて、非特異的に結合した第２の標識結
合相手は除去せしめられ、遊離タンパク質サブユニット
と結合しているか又は液相中に残留する第２の標識結合
相手の量が次いで測定される。
が完全な四次構造タンパク質の一部分をなしている場合
には接近不可能であるタンパク質サブユニット上のエピ
トープ抗原決定基に対して特異的な第１の結合相手と一
緒にインキュベートされる。インキュベートは、タンパ
ク質サブユニットと第１の結合相手とが反応するために
十分な時間にわたり続けられる。１回目のインキュベー
ト後、第１の結合相手を含有した複合体は試料から除去
され、検出可能に標識された第２の結合相手と接触せし
められる。第２の結合相手は、タンパク質サブユニット
が遊離しているか又は完全な四次構造タンパク質の一部
分をなしている場合に、タンパク質サブユニット上に存
在するエピトープ抗原決定基と反応する。インキュベー
トは、タンパク質サブユニット（現時点では複合化して
いる）及び第２の結合相手が結合するために十分な時間
にわたり続けられる。２回目のインキュベート後、反応
混合物は洗浄されて、非特異的に結合した第２の標識結
合相手は除去せしめられ、遊離タンパク質サブユニット
と結合しているか又は液相中に残留する第２の標識結合
相手の量が次いで測定される。
第２の態様において、試料はまず、完全な四次構造タン
パク質上に存在するエピトープに対し特異的な第３の免
疫学的結合相手と一緒にインキュベートされる。インキ
ュベートは、試料中のタンパク質サブユニットを含有し
た完全な四次構造タンパク質と第３の結合相手を含有し
た複合体とが反応するために十分な時間にわたり続けら
れる。
パク質上に存在するエピトープに対し特異的な第３の免
疫学的結合相手と一緒にインキュベートされる。インキ
ュベートは、試料中のタンパク質サブユニットを含有し
た完全な四次構造タンパク質と第３の結合相手を含有し
た複合体とが反応するために十分な時間にわたり続けら
れる。
インキュベート後、第３の結合相手は試料から除去され
、結合した完全な四次構造タンパク質は検出可能に標識
された第２の免疫学的結合相手と接触せしめられる。第
２の免疫学的結合相手を完全な（複合化した）四次構造
タンパク質に結合させるために２回目のインキュベート
を行なった後、四次構造タンパク質に結合しているか又
は液相中に残留している第２の標識結合相手の量が次い
で測定される。
、結合した完全な四次構造タンパク質は検出可能に標識
された第２の免疫学的結合相手と接触せしめられる。第
２の免疫学的結合相手を完全な（複合化した）四次構造
タンパク質に結合させるために２回目のインキュベート
を行なった後、四次構造タンパク質に結合しているか又
は液相中に残留している第２の標識結合相手の量が次い
で測定される。
完全な四次構造タンパク質は数種の免疫学的結合相手の
別の組合せによっても検出することができる、とい′う
ように理解すべきである。例えば、完全な四次構造タン
パク質は、サブユニットが完全な四次構造タンパク質の
一部分をなす場合に、サブユニットの１つ上の接近可能
なエピトープ抗原決定基と結合する免疫学的結合相手と
一緒に試料をまずインキュベートすることにより検出す
ることができる。インキュベートは、試料中のサブユニ
ットを含有した完全な四次構造タンパク質と免疫学的結
合相手を含有した複合体とが反応するために十分な時間
にわたり続けられる。インキュベート後、免疫学的結合
相手は試料から除去され、結合したタンパク質は完全な
四次構造タンパク質の別のサブユニット上の接近可能な
エピトープと反応する検出可能に標識された免疫学的結
合相手と接触せしめられる。検出可能に標識された免疫
学的結合相手を完全な（複合化した）四次構造タンパク
質の別のサブユニットと反応させるために２回目のイン
キュベートを行なった後、四次構造タンパク質に結合し
ているか又は液相中に残留している標識結合相手の量が
測定される。この方法で完全ｈＣＧを測定するための市
販キットの例としては、ハイブリチック（Ｈｙｂｒｌｔ
ｅｅｈ ） （サンジエゴ、カリフォルニア州）が販
売するタンデム−ｈＣＧ （Ｔａｎｄｅａ＋−ｈＣＧＲ
）キットがある。
別の組合せによっても検出することができる、とい′う
ように理解すべきである。例えば、完全な四次構造タン
パク質は、サブユニットが完全な四次構造タンパク質の
一部分をなす場合に、サブユニットの１つ上の接近可能
なエピトープ抗原決定基と結合する免疫学的結合相手と
一緒に試料をまずインキュベートすることにより検出す
ることができる。インキュベートは、試料中のサブユニ
ットを含有した完全な四次構造タンパク質と免疫学的結
合相手を含有した複合体とが反応するために十分な時間
にわたり続けられる。インキュベート後、免疫学的結合
相手は試料から除去され、結合したタンパク質は完全な
四次構造タンパク質の別のサブユニット上の接近可能な
エピトープと反応する検出可能に標識された免疫学的結
合相手と接触せしめられる。検出可能に標識された免疫
学的結合相手を完全な（複合化した）四次構造タンパク
質の別のサブユニットと反応させるために２回目のイン
キュベートを行なった後、四次構造タンパク質に結合し
ているか又は液相中に残留している標識結合相手の量が
測定される。この方法で完全ｈＣＧを測定するための市
販キットの例としては、ハイブリチック（Ｈｙｂｒｌｔ
ｅｅｈ ） （サンジエゴ、カリフォルニア州）が販
売するタンデム−ｈＣＧ （Ｔａｎｄｅａ＋−ｈＣＧＲ
）キットがある。
“結合するであろう″という語は、第１の免疫学的結合
相手が最初に担体とは結合していないことを意味する。
相手が最初に担体とは結合していないことを意味する。
代わりに、第１の免疫学的結合相手は、担体と結合する
前に、この相手に対し特異的なエピトープと反応する。
前に、この相手に対し特異的なエピトープと反応する。
担体に結合する前に免疫複合体が形成される免疫学的試
験の例としては、チュー（Ｃｈｕ）（米国特許第 ４．２８９．７４７号明細書）、ウォルターズ（νｏＨ
ｅｒｓ ）ら（米国特許第４，３４３，８９６号明細書
）、パリク（Ｐａｒｉｋｈ）ら（米国特許第４．２９８
．６８５号明細書）及びガラナ（Ｇａｌｌａｔｉ ）ら
（英国特許出願節２．０７４，７２７Ａ号明細書）があ
る。
験の例としては、チュー（Ｃｈｕ）（米国特許第 ４．２８９．７４７号明細書）、ウォルターズ（νｏＨ
ｅｒｓ ）ら（米国特許第４，３４３，８９６号明細書
）、パリク（Ｐａｒｉｋｈ）ら（米国特許第４．２９８
．６８５号明細書）及びガラナ（Ｇａｌｌａｔｉ ）ら
（英国特許出願節２．０７４，７２７Ａ号明細書）があ
る。
第１の態様で測定された遊離タンパク質サブユニットの
存在量を第２又は第３の態様の方法で測定された試料中
におけるタンパク質サブユニット含有の完全な四次構造
タンパク質の存在量と比較することにより、完全な四次
構造タンパク質の総存在量に対する遊離サブユニットの
存在比率を調べることができる。
存在量を第２又は第３の態様の方法で測定された試料中
におけるタンパク質サブユニット含有の完全な四次構造
タンパク質の存在量と比較することにより、完全な四次
構造タンパク質の総存在量に対する遊離サブユニットの
存在比率を調べることができる。
第１、第２及び第３の免疫学的結合相手の具体的濃度、
インキュベートの温度及び時間、並びに他の分析条件は
、試料中の抗原濃度、試料の性質その他の如きファクタ
ーに応じて変更することができる。当業者であれば、日
常的実験法を採択して、各測定のために機能的かつ最適
の分析条件を設定することができるであろう。例えば、
免疫試験は４〜４５℃、好ましくは２６℃で行なうこと
ができ、各インキュベート工程は７２時間にもわたる長
時間であってもよい。
インキュベートの温度及び時間、並びに他の分析条件は
、試料中の抗原濃度、試料の性質その他の如きファクタ
ーに応じて変更することができる。当業者であれば、日
常的実験法を採択して、各測定のために機能的かつ最適
の分析条件を設定することができるであろう。例えば、
免疫試験は４〜４５℃、好ましくは２６℃で行なうこと
ができ、各インキュベート工程は７２時間にもわたる長
時間であってもよい。
タンパク質サブユニット又は四次構造タンパク質その他
の洗浄、撹拌、振盪、ン濾過又は分析前抽出のような他
の工程は、具体的状況において望ましく又は必要である
ならば、勿論分析に際し加えることができる。免疫学的
結合相手が結合することができ、しかも本発明において
使用することができる多くの担体が存在する。周知の担
体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、
ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、
天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロ
ース及び磁鉄鉱がある。担体の性質は、本発明の目的か
らみて、ある程度可溶性でも又は不溶性であってもよい
。当業者であれば、免疫学的結合相手と結合する他の多
くの適切な担体を知っており、そうでないとしても、日
常的実験によりそのようなものを確かめることができる
であろう。
の洗浄、撹拌、振盪、ン濾過又は分析前抽出のような他
の工程は、具体的状況において望ましく又は必要である
ならば、勿論分析に際し加えることができる。免疫学的
結合相手が結合することができ、しかも本発明において
使用することができる多くの担体が存在する。周知の担
体としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、
ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、
天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロ
ース及び磁鉄鉱がある。担体の性質は、本発明の目的か
らみて、ある程度可溶性でも又は不溶性であってもよい
。当業者であれば、免疫学的結合相手と結合する他の多
くの適切な担体を知っており、そうでないとしても、日
常的実験によりそのようなものを確かめることができる
であろう。
本発明の具体的態様に応じ、１柾以上の免疫学的結合相
手が酵素、放射性同位体、蛍光化合物、化学ルミネセン
ス化合物又は生物ルミネセンス化合物のような検出可能
な標識に結合せしめられることになる。
手が酵素、放射性同位体、蛍光化合物、化学ルミネセン
ス化合物又は生物ルミネセンス化合物のような検出可能
な標識に結合せしめられることになる。
通常の当業者であれば第２の相手と結合する他の適切な
標識について知っており、そうでないとしても、実験に
よりそのようなものを確かめることができるであろう。
標識について知っており、そうでないとしても、実験に
よりそのようなものを確かめることができるであろう。
更には、免疫学的結合相手にこれら標識を結合させるに
は、通常の当業者にとって一般的な標準的技術を用いて
行なうことができる。免疫試験において免疫学的結合相
手を検出可能に標識することができる１つの方法は、酵
素にこの結合相手を結合させることである。この酵素は
、次いでその基質と接触させた場合に検出可能な化学的
部分を生じるような方法（例えば分光測定法又は蛍光測
定法）で基質と反応する。検出可能な標識として使用可
能な酵素の例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ス
タフィロコッカスヌクレアーゼ、４−５−ステロイドイ
ソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グ
リセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸
イソメラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ
、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ
及びアセチルコリンエステラーゼがある。
は、通常の当業者にとって一般的な標準的技術を用いて
行なうことができる。免疫試験において免疫学的結合相
手を検出可能に標識することができる１つの方法は、酵
素にこの結合相手を結合させることである。この酵素は
、次いでその基質と接触させた場合に検出可能な化学的
部分を生じるような方法（例えば分光測定法又は蛍光測
定法）で基質と反応する。検出可能な標識として使用可
能な酵素の例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ス
タフィロコッカスヌクレアーゼ、４−５−ステロイドイ
ソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グ
リセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸
イソメラーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナ
ーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ
、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコ
ース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ
及びアセチルコリンエステラーゼがある。
免疫学的結合相手の存在は、免疫学的結合相手を放射性
同位体で標識することによっても検出することができる
。放射性同位体の存在は次いで、ガンマ−カウンター又
はシンチレーションカウンターを使用する等の手段によ
って調べることができる。特に有用な同位体は、 Ｈ，
Ｉ、１３１ ３２ ３５ １４ ５１
３Ｂ■、 ＰＳ ＳＳ Ｃ，、Ｃｒｚ
Ｃ１、ＣＯｌ ＣＯｌ Ｆｅ、 Ｓｅ及び１５
２Ｅｕである。
同位体で標識することによっても検出することができる
。放射性同位体の存在は次いで、ガンマ−カウンター又
はシンチレーションカウンターを使用する等の手段によ
って調べることができる。特に有用な同位体は、 Ｈ，
Ｉ、１３１ ３２ ３５ １４ ５１
３Ｂ■、 ＰＳ ＳＳ Ｃ，、Ｃｒｚ
Ｃ１、ＣＯｌ ＣＯｌ Ｆｅ、 Ｓｅ及び１５
２Ｅｕである。
結合相手を蛍光化合物で標識することにより免疫学的結
合相手の存在を検出することも可能である。蛍光標識結
合相手が適切な波長光で照射されると、その存在は次い
で、色素による蛍光から検出することができる。最も重
要な蛍光標識化合物としては、インチオシアン酸フルオ
レセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシア
ニン、アロフィコシアニン、０−フタルアルデヒド及び
フルオレセインがある。
合相手の存在を検出することも可能である。蛍光標識結
合相手が適切な波長光で照射されると、その存在は次い
で、色素による蛍光から検出することができる。最も重
要な蛍光標識化合物としては、インチオシアン酸フルオ
レセイン、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシア
ニン、アロフィコシアニン、０−フタルアルデヒド及び
フルオレセインがある。
免疫学的結合相手を検出可能に標識することができるも
う１つの方法は、それを化学ルミネセンス化合物に結合
させることである。化学ルミネセンス標識免疫学的結合
相手の存在は次いで、化学反応中に発生する発光の存在
を検出することによって測定される。特に有用な化学ル
ミネセンス標識化合物の例としては、ルミノール、イソ
ルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾ
ール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルである。
う１つの方法は、それを化学ルミネセンス化合物に結合
させることである。化学ルミネセンス標識免疫学的結合
相手の存在は次いで、化学反応中に発生する発光の存在
を検出することによって測定される。特に有用な化学ル
ミネセンス標識化合物の例としては、ルミノール、イソ
ルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾ
ール、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルである。
同様に、生物ルミネセンス化合物が免疫学的結合相手を
標識するために使用することもできる。
標識するために使用することもできる。
生物ルミネセンスは化学ルミネセンスの特殊型であって
、生物系において発見されたものであり、そこでは触媒
タンパク質が化学ルミネセンス反応の効率を高めている
。生物ルミネセンス結合相手の存在は発光の存在を検出
することによって測定される。標識目的のために重要な
生物ルミネセンス化合物としては、ルシフェリン、ルシ
フェラーゼ及びエクオリンがある。
、生物系において発見されたものであり、そこでは触媒
タンパク質が化学ルミネセンス反応の効率を高めている
。生物ルミネセンス結合相手の存在は発光の存在を検出
することによって測定される。標識目的のために重要な
生物ルミネセンス化合物としては、ルシフェリン、ルシ
フェラーゼ及びエクオリンがある。
本発明の目的のためには、免疫試験により検出される物
質は、生物学的液体及び組織、並びに環境的及び生態学
的供給源から得られる試料中に存在している。
質は、生物学的液体及び組織、並びに環境的及び生態学
的供給源から得られる試料中に存在している。
検出可能ではあるが未知量の四次構造タンパク質の遊離
タンパク質サブユニットを含をするものであれば、いか
なる試料であっても使用可能である。通常、試料は液体
（例えば、尿、唾液、脳を髄液、血液、血清その他）又
は固体もしくは半固体（例えば、組織、糞その他）であ
る。
タンパク質サブユニットを含をするものであれば、いか
なる試料であっても使用可能である。通常、試料は液体
（例えば、尿、唾液、脳を髄液、血液、血清その他）又
は固体もしくは半固体（例えば、組織、糞その他）であ
る。
本発明において用いられる“エピトープという語は、抗
体分子との特異的相互作用に対して応答可能なすべての
抗原決定基を含む意味である。
体分子との特異的相互作用に対して応答可能なすべての
抗原決定基を含む意味である。
エピトープ抗原決定基は通常アミノ酸又は糖側鎖のよう
な分子中の化学的活性表面基からなっており、特殊な三
次元構造特性とともに特殊な荷電特性を有している。
な分子中の化学的活性表面基からなっており、特殊な三
次元構造特性とともに特殊な荷電特性を有している。
本発明において使用されるモノクローナル抗体は、通常
の当業者であれば十分に理解している技術を利用して様
々な方法により産生ずることができるため、ここでは再
度繰返さない。これらの技術の詳細については、ロジャ
ー・エッチ・ケネット（Ｒｏｇｃｒ Ｈ，Ｋｅｎｎｅｔ
ｔ ）らが編集し、プレナムプレス社により発行（１９
８０年）されたモノクローナル抗体・ハイブリドーマ：
生物学的分析における新しい次元（Ｍｏｎｏｃ１０ｎａ
ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ
Ｎｅｗ Ｄｌｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏ１０ｇｉ
ｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ）等の本に記載されている
。
の当業者であれば十分に理解している技術を利用して様
々な方法により産生ずることができるため、ここでは再
度繰返さない。これらの技術の詳細については、ロジャ
ー・エッチ・ケネット（Ｒｏｇｃｒ Ｈ，Ｋｅｎｎｅｔ
ｔ ）らが編集し、プレナムプレス社により発行（１９
８０年）されたモノクローナル抗体・ハイブリドーマ：
生物学的分析における新しい次元（Ｍｏｎｏｃ１０ｎａ
ｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ：Ａ
Ｎｅｗ Ｄｌｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏ１０ｇｉ
ｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ）等の本に記載されている
。
例えば、本発明で特に開示されたちの以外であって、ｈ
ＣＧの存在下において遊離β−ｈＣＧサブユニットの検
出が可能なモノクローナル抗体を産生ずる他のハイブリ
ドーマは、最小限のスクリーニングにより容易に産生じ
かつ単離することができる。
ＣＧの存在下において遊離β−ｈＣＧサブユニットの検
出が可能なモノクローナル抗体を産生ずる他のハイブリ
ドーマは、最小限のスクリーニングにより容易に産生じ
かつ単離することができる。
遊離β−ｈＣＧサブユニット上では見られるがｈＣＧ上
には見られないエピトープに対し特異的なモノクローナ
ル抗体を産生ずるハイブリドーマは、例えばＢａ１ｂ／
ｃマウスのようなハイブリドーマ産生が可能な動物をフ
ロインドアジュバント中の遊離β−ｈＣＧサブユニット
及び／又はカルボキシ末端ペプチド／破傷風菌毒素によ
る１回目の皮下注射でまず免疫し、しかる後β−ｈＣＧ
サブユニットの追加免疫注射により免疫し、数日間細胞
融合させることにより最も効果的に産生される。融合は
通常の当業者にとって一般的に知られている技術を利用
して行なうことができる。
には見られないエピトープに対し特異的なモノクローナ
ル抗体を産生ずるハイブリドーマは、例えばＢａ１ｂ／
ｃマウスのようなハイブリドーマ産生が可能な動物をフ
ロインドアジュバント中の遊離β−ｈＣＧサブユニット
及び／又はカルボキシ末端ペプチド／破傷風菌毒素によ
る１回目の皮下注射でまず免疫し、しかる後β−ｈＣＧ
サブユニットの追加免疫注射により免疫し、数日間細胞
融合させることにより最も効果的に産生される。融合は
通常の当業者にとって一般的に知られている技術を利用
して行なうことができる。
ｈＣＧの遊離β−サブユニットに対し特異的なモノクロ
ーナル抗体を産生じているか否かについて調べるための
ハイブリドーマのスクリーニングは簡単であって、標準
的ＥＬ Ｉ ＳＡ又はＲＩＡのいずれかで行なうことが
できる。例えば、ＲＩＡスクリーニングの場合に、モノ
クローナル抗体を産生ずるハイブリドーマの培養上澄又
は腹水は、１２５ト（β−ｈｃＧ３、 Ｉ （ｈＣＧ
）及び１２５１−１：α−ｈｃＧ’ｌ と別々に反応せ
しめられる。モノクローナル抗体が１２５．〔β−ｈＣ
Ｇ）とは反応するが、”Ｉ −（ｈＣＧ）又は１２５Ｉ
−（α−ｈｃＧ） とは反応しない場合には、モノクロ
ーナル抗体は遊離β−ｈＣＧサブユニットに対し特異的
である。
ーナル抗体を産生じているか否かについて調べるための
ハイブリドーマのスクリーニングは簡単であって、標準
的ＥＬ Ｉ ＳＡ又はＲＩＡのいずれかで行なうことが
できる。例えば、ＲＩＡスクリーニングの場合に、モノ
クローナル抗体を産生ずるハイブリドーマの培養上澄又
は腹水は、１２５ト（β−ｈｃＧ３、 Ｉ （ｈＣＧ
）及び１２５１−１：α−ｈｃＧ’ｌ と別々に反応せ
しめられる。モノクローナル抗体が１２５．〔β−ｈＣ
Ｇ）とは反応するが、”Ｉ −（ｈＣＧ）又は１２５Ｉ
−（α−ｈｃＧ） とは反応しない場合には、モノクロ
ーナル抗体は遊離β−ｈＣＧサブユニットに対し特異的
である。
ｈＣＧ上には存在するがｈＣＧの遊離サブユニット上に
は存在しないエピトープと反応するモノクーロ−ナル抗
体を分泌するハイブリドーマは、免疫原が天然の完全な
ｈＣＧであること以外は上記と同様にして条件に合致し
た動物を免疫することにより産生される。この場合にお
いて、いずれのハイブリドーマが所望の特異性をもつモ
ノクローナル抗体を産生じているかにつき調べるには上
記と同様にして行なわれるが゛、但し所望のモノクロー
ナル抗体はＲＩＡにより””Ｊ −１’ｈｃＧ］ とは
反応するが１２５．〔β−ｈｃＧ］又は１２５Ｉ−（α
−ｈｃＧ’ｌ とは反応しないものである。
は存在しないエピトープと反応するモノクーロ−ナル抗
体を分泌するハイブリドーマは、免疫原が天然の完全な
ｈＣＧであること以外は上記と同様にして条件に合致し
た動物を免疫することにより産生される。この場合にお
いて、いずれのハイブリドーマが所望の特異性をもつモ
ノクローナル抗体を産生じているかにつき調べるには上
記と同様にして行なわれるが゛、但し所望のモノクロー
ナル抗体はＲＩＡにより””Ｊ −１’ｈｃＧ］ とは
反応するが１２５．〔β−ｈｃＧ］又は１２５Ｉ−（α
−ｈｃＧ’ｌ とは反応しないものである。
遊離サブユニットとしての又は完全な四次構造ｈＣＧの
一部分としてのα及びβ−ｈＣＧ上に存在するエピトー
プと反応するモノクローナル抗体を分泌するハイブリド
ーマも、条件に合致した動物を天然の完全なｈＣＧで免
疫することによって産生される。いずれのハイブリドー
マが所望の特異性をもつモノクローナル抗体を産生じて
いるかについて調べるためには、スクリーニングは上記
と同様にして行なうことができる。所望のモノクローナ
ル抗体は＋２５Ｉ−〔α−ｈＣＧ）、 １２５■−〔β
−ｈＣＧ）及び１２５１− ［ｈＣＧ）と反応する。
一部分としてのα及びβ−ｈＣＧ上に存在するエピトー
プと反応するモノクローナル抗体を分泌するハイブリド
ーマも、条件に合致した動物を天然の完全なｈＣＧで免
疫することによって産生される。いずれのハイブリドー
マが所望の特異性をもつモノクローナル抗体を産生じて
いるかについて調べるためには、スクリーニングは上記
と同様にして行なうことができる。所望のモノクローナ
ル抗体は＋２５Ｉ−〔α−ｈＣＧ）、 １２５■−〔β
−ｈＣＧ）及び１２５１− ［ｈＣＧ）と反応する。
遊離α−ｈＣＧサブユニット上には存在するがｈＣＧ上
には存在しないエピトープに対し特異的なモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマの産生は」−２と同様
にして行なうことができるが、但し使用される免疫原は
遊離α−ｈＣＧサブユニットである。いずれのハイブリ
ドーマが所望の特異性をもつモノクローナル抗体を産生
じているかについて調べるためには上記と同様にして行
なわれるが、但し所望のモノクローナル抗体は１２５■
−〔α−ｈＣＧ）とは反応するが、１２５゜（ｈ ＣＧ
）又は１２５Ｉ−〔β−ｈＣＧ）とは反応しない。
には存在しないエピトープに対し特異的なモノクローナ
ル抗体を分泌するハイブリドーマの産生は」−２と同様
にして行なうことができるが、但し使用される免疫原は
遊離α−ｈＣＧサブユニットである。いずれのハイブリ
ドーマが所望の特異性をもつモノクローナル抗体を産生
じているかについて調べるためには上記と同様にして行
なわれるが、但し所望のモノクローナル抗体は１２５■
−〔α−ｈＣＧ）とは反応するが、１２５゜（ｈ ＣＧ
）又は１２５Ｉ−〔β−ｈＣＧ）とは反応しない。
遊離β−ｈＣＧサブユニット及びｈＣＧに共通したエピ
トープと反応するモノクローナル抗体を分泌するハイブ
リドーマは、免疫プロトコール又は上記の免疫原のいず
れかを用いて産生ずることができる。遊離β−ｈＣＧサ
ブユニットに対し特異的なモノクローナル抗体を分泌す
るハイブリドーマの産生法について記載された方法が好
ましいが、その理由は、これらの免疫原は遊離α−ｈＣ
Ｇサブユニットと反応するモノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドーマを生じることがないからである。この
場合において、所望の特異性をもつモノクローナル抗体
は １２５１−［α−ｈｃＧ］とではなく １（β
−ｈＣＧ）及び１２５１− ［ｈＣＧ］に対するそれ
らの反応性によって調べられる。
トープと反応するモノクローナル抗体を分泌するハイブ
リドーマは、免疫プロトコール又は上記の免疫原のいず
れかを用いて産生ずることができる。遊離β−ｈＣＧサ
ブユニットに対し特異的なモノクローナル抗体を分泌す
るハイブリドーマの産生法について記載された方法が好
ましいが、その理由は、これらの免疫原は遊離α−ｈＣ
Ｇサブユニットと反応するモノクローナル抗体を産生ず
るハイブリドーマを生じることがないからである。この
場合において、所望の特異性をもつモノクローナル抗体
は １２５１−［α−ｈｃＧ］とではなく １（β
−ｈＣＧ）及び１２５１− ［ｈＣＧ］に対するそれ
らの反応性によって調べられる。
遊離α−ｈＣＧサブユニット及びｈＣＧに共通したエピ
トープに対し特異的なモノクローナル抗体を産生ずるハ
イブリドーマは、遊離α−ｈＣＧサブユニット又はｈＣ
Ｇで免疫することにより産生ずることができる。所望の
特異性をもつモノクローナル抗体は、上記ＲＩＡにより
スクリーニングした場合に、１２５Ｉ−（β−ｈＣＧ）
とではなく１２５Ｉ−〔α−ｈＣＧ）及び１２５１−
（ｈｃＧ］と反応する。
トープに対し特異的なモノクローナル抗体を産生ずるハ
イブリドーマは、遊離α−ｈＣＧサブユニット又はｈＣ
Ｇで免疫することにより産生ずることができる。所望の
特異性をもつモノクローナル抗体は、上記ＲＩＡにより
スクリーニングした場合に、１２５Ｉ−（β−ｈＣＧ）
とではなく１２５Ｉ−〔α−ｈＣＧ）及び１２５１−
（ｈｃＧ］と反応する。
本発明により検出可能な物質としては、ホルモン、酵素
、炎症性タンパク質及び、更に一般的には分子ｆｆ１５
．０Ｘ１０３ドルトン以上の球状タンパク質がある。
、炎症性タンパク質及び、更に一般的には分子ｆｆ１５
．０Ｘ１０３ドルトン以上の球状タンパク質がある。
ホルモンとは代謝活性を抑制又は促進させるように作用
する物質である。極めて重要なホルモンの例としては、
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン及び卵
胞刺激ホルモンのように再生産に関与するホルモン、並
びに甲状腺刺激ホルモンその他のような代謝に関与する
ホルモンがある。
する物質である。極めて重要なホルモンの例としては、
ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン及び卵
胞刺激ホルモンのように再生産に関与するホルモン、並
びに甲状腺刺激ホルモンその他のような代謝に関与する
ホルモンがある。
酵素とは生化学反応を触媒するタンパク質分子である。
酵素は生体恒常性環境を維持するためには非常に重要で
あって、それらは生物体内における中間代謝を効果的に
機能させている。一定の生化学的経路に関与する酵素の
濃度変化は、病態を把握する上で価値のある診断的重要
性がある。重要な酵素の例としては、大半のタンパク質
キナーゼ、クレアチニンホスホキナーゼ、乳酸デヒドロ
ゲナーゼ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ） 、血清アミ
ロイドＰ成分（ＳＡＰ） 、α−２−マクログロブリン
その他がある。
あって、それらは生物体内における中間代謝を効果的に
機能させている。一定の生化学的経路に関与する酵素の
濃度変化は、病態を把握する上で価値のある診断的重要
性がある。重要な酵素の例としては、大半のタンパク質
キナーゼ、クレアチニンホスホキナーゼ、乳酸デヒドロ
ゲナーゼ、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ） 、血清アミ
ロイドＰ成分（ＳＡＰ） 、α−２−マクログロブリン
その他がある。
本発明の分析において使用される物質は、キットの製造
に際しても申し分なく適合している。このようなキット
はバイアル、管その他のような１以上の容器手段を密閉
収納するために仕切られた運搬体手段からなり、上記各
容器手段は本発明の方法に使用される各種要素のうち１
種を収容している。
に際しても申し分なく適合している。このようなキット
はバイアル、管その他のような１以上の容器手段を密閉
収納するために仕切られた運搬体手段からなり、上記各
容器手段は本発明の方法に使用される各種要素のうち１
種を収容している。
例えば、上記容器手段の１つは担体と結合した第１のモ
ノクローナル抗体を収容する。第２の容器は可溶性でか
つ検出可能に標識された第２のモノクローナル抗体を凍
結乾燥品として又は溶液状態で収容する。運搬体手段は
、検出可能に標識された第３のモノクローナル抗体を凍
結乾燥品として又は溶液状態で収容する第３の容器手段
を収納することもできる。
ノクローナル抗体を収容する。第２の容器は可溶性でか
つ検出可能に標識された第２のモノクローナル抗体を凍
結乾燥品として又は溶液状態で収容する。運搬体手段は
、検出可能に標識された第３のモノクローナル抗体を凍
結乾燥品として又は溶液状態で収容する第３の容器手段
を収納することもできる。
更には、運搬体手段は、既知量の別個の公知抗原をそれ
ぞれの収容した複数の容器を収納していてもよい。これ
ら後者の容器類は標準曲線を作成するために使用するこ
とができ、この標準曲線には未知量の抗原を含有する試
料から得られた結果を適用することができる。
ぞれの収容した複数の容器を収納していてもよい。これ
ら後者の容器類は標準曲線を作成するために使用するこ
とができ、この標準曲線には未知量の抗原を含有する試
料から得られた結果を適用することができる。
一定のモノクローナル抗体又はその実質的免疫学的等価
物は、ｈＣＧに対し本試験法を適用する場合に使用する
ことができる。第１のモノクローナル抗体、即ち以下の
ＦＢＴ１０は、細胞系ｌ−４８８由来抗体から得られる
か又はそれと同一の特性を有する。第２のモノクローナ
ル抗体、即ち以下のＦＢＴｌｌは、細胞系１−４８９由
来抗体から得られるか又はそれと同一の特性を有する。
物は、ｈＣＧに対し本試験法を適用する場合に使用する
ことができる。第１のモノクローナル抗体、即ち以下の
ＦＢＴ１０は、細胞系ｌ−４８８由来抗体から得られる
か又はそれと同一の特性を有する。第２のモノクローナ
ル抗体、即ち以下のＦＢＴｌｌは、細胞系１−４８９由
来抗体から得られるか又はそれと同一の特性を有する。
第３のモノクローナル抗体、即ち以下のＨＴ−１３は、
細胞系１−４９０由来抗体から得られるか又はそれと同
一の特性を有する。第４のモノクローナル抗体、即ち以
下のＡＨＴ２０は、細胞系１−４９１由来抗体から得ら
れるか又はそれと同一の特性を有する。これらの細胞系
は、フランス、バリア ５７２４、ドクトールルス通り
２５、パスツール研究所の微生物培養物寄託機関 （ＣｏｌｌｅｃＬｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｃ
ａ１ｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍ＋ｃｒｏ−Ｏｒｇａｎｉｓｍ
ｓ；ＣＮＣＭ）に１９８５年１０月３日に寄託された。
細胞系１−４９０由来抗体から得られるか又はそれと同
一の特性を有する。第４のモノクローナル抗体、即ち以
下のＡＨＴ２０は、細胞系１−４９１由来抗体から得ら
れるか又はそれと同一の特性を有する。これらの細胞系
は、フランス、バリア ５７２４、ドクトールルス通り
２５、パスツール研究所の微生物培養物寄託機関 （ＣｏｌｌｅｃＬｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｃ
ａ１ｔｕｒｅｓ ｄｅ Ｍ＋ｃｒｏ−Ｏｒｇａｎｉｓｍ
ｓ；ＣＮＣＭ）に１９８５年１０月３日に寄託された。
これら各々の細胞系（１−４，８８〜■−４９１）と同
一の番号が該寄託機関における受託番号である。
一の番号が該寄託機関における受託番号である。
第５のモノクローナル抗体、即ち以下のＣ８は、特許発
行前に寄託されるであろう細胞系Ｚに由来する抗体から
得られるか又はそれと同一の特性を有する。
行前に寄託されるであろう細胞系Ｚに由来する抗体から
得られるか又はそれと同一の特性を有する。
これらのモノクローナル抗体は、ｈＣＧ及び遊離αもし
くはβ−ｈＣＧサブユニット上の特有のエピトープに対
し特異性を示す。モノクローナル抗体Ｃ８は、天然型ホ
ルモンに対し特異的ではあるがそのサブユニットには特
異的でないｈＣＧ上の構造的に特異的な抗原決定基に対
して配向するものである。モノクローナル抗体ＦＢＴ１
１は、天然ｈＣＧには接近不可能であるがこのモノクロ
ーナル抗体とは結合する遊離β−ｈＣＧサブユニット上
のエピトープに対して配向する。他方、ＦＢＴ１０は、
サブユニットが遊離しているか又は完全な四次構造ｈＣ
Ｇと会合している場合に、ｈＣＧのβ−サブユニット上
に存在するエピトープ抗原決定基と結合する。モノクロ
ーナル抗体ＡＨＴ２０は、α−サブユニットが完全な四
次構造タンパク質の一部分をなしている場合に結合する
抗体とは接近不可能な遊離α−サブユニット上のエピト
ープに対して配向する。ＨＴ１３は、α−サブユニット
及びβ−サブユニットが遊離しているか又は完全な四次
構造タンパク質の一部分をなしている場合にこれらのサ
ブユニット上のエピトープを認識するモノクローナル抗
体である。これらのモノクローナル抗体は高度の感受性
及び特異性を有するため、過剰のｈＣＧの存在下におい
て天然型のｈＣＧ又は遊離αもしくはβ−ｈＣＧサブユ
ニットを測定する免疫試験の実施を可能ならしめること
ができる。これらの免疫試験は、正常な妊娠期間中にお
いて遊離αもしくはβ＝ｈＣＧの産生を研究する場合に
特に実施される。
くはβ−ｈＣＧサブユニット上の特有のエピトープに対
し特異性を示す。モノクローナル抗体Ｃ８は、天然型ホ
ルモンに対し特異的ではあるがそのサブユニットには特
異的でないｈＣＧ上の構造的に特異的な抗原決定基に対
して配向するものである。モノクローナル抗体ＦＢＴ１
１は、天然ｈＣＧには接近不可能であるがこのモノクロ
ーナル抗体とは結合する遊離β−ｈＣＧサブユニット上
のエピトープに対して配向する。他方、ＦＢＴ１０は、
サブユニットが遊離しているか又は完全な四次構造ｈＣ
Ｇと会合している場合に、ｈＣＧのβ−サブユニット上
に存在するエピトープ抗原決定基と結合する。モノクロ
ーナル抗体ＡＨＴ２０は、α−サブユニットが完全な四
次構造タンパク質の一部分をなしている場合に結合する
抗体とは接近不可能な遊離α−サブユニット上のエピト
ープに対して配向する。ＨＴ１３は、α−サブユニット
及びβ−サブユニットが遊離しているか又は完全な四次
構造タンパク質の一部分をなしている場合にこれらのサ
ブユニット上のエピトープを認識するモノクローナル抗
体である。これらのモノクローナル抗体は高度の感受性
及び特異性を有するため、過剰のｈＣＧの存在下におい
て天然型のｈＣＧ又は遊離αもしくはβ−ｈＣＧサブユ
ニットを測定する免疫試験の実施を可能ならしめること
ができる。これらの免疫試験は、正常な妊娠期間中にお
いて遊離αもしくはβ＝ｈＣＧの産生を研究する場合に
特に実施される。
本発明の方法によれば、生物学的液体中でのｈＣＧ又は
そのサブユニットの特異的な免疫学的検出に際して大き
な問題を克服することができる。
そのサブユニットの特異的な免疫学的検出に際して大き
な問題を克服することができる。
糖タンパク質ホルモン間には、特にｈＣＧ及びｈＬ）１
間には構造的相同性かあるため、ｈＣＧに対してこれま
で産生されてきた通常のポリクローナル抗血清はｈＬＨ
と交差反応するという結果を生じてきた。この交差反応
性は、免疫原としての遊離β−ｈＣＧサブユニット、そ
の化学的類似体又はカルボキシ末端ペプチドに対する抗
血清を産生ずることによって、幾分減少させることがで
きる。この研究により、更にｈＣＧ特異的な抗血清の産
生に関して近年実質的進歩を遂げるに至り、各種糖タン
パク質ホルモン間の交差反応性に関するいくつかの問題
を部分的に解決したのであるが、新たな問題が発生した
のである。例えば、これらの抗血清は、ｈＣＧ及びその
関連産物、例えば遊離β−ｈＣＧサブユニット及びカル
ボキシ末端ペプチドの間で特異性を欠いていた。このよ
うなｈＣＧの関連産物は、妊娠期間中の血清もしくは尿
中に、繊毛要素における腫瘍中に、又は所定箇所以外で
産生能をもつ癌患者において検出することができる。更
に、免疫原として遊離β−ｈＣＧサブユニット又はＣＴ
Ｐを使用した場合であっても、ｈＣＧ自体よりもｈＣＧ
関連産物の方について認識し易い抗血清を産生させてし
まうことになる。このように、免疫試験においてポリク
ローナル抗体を使用しても、糖タンパク質ホルモンとし
て構造的相同性の程度に差異がある属もしくは族が存在
するｈＣＧのような抗原の場合には、多大な制限が課さ
れている。本発明に開示されている抗体の中の特異的な
モノクローナル抗体を使用した免疫試験の場合は、従来
の免疫試験に見られる欠点を有していない。
間には構造的相同性かあるため、ｈＣＧに対してこれま
で産生されてきた通常のポリクローナル抗血清はｈＬＨ
と交差反応するという結果を生じてきた。この交差反応
性は、免疫原としての遊離β−ｈＣＧサブユニット、そ
の化学的類似体又はカルボキシ末端ペプチドに対する抗
血清を産生ずることによって、幾分減少させることがで
きる。この研究により、更にｈＣＧ特異的な抗血清の産
生に関して近年実質的進歩を遂げるに至り、各種糖タン
パク質ホルモン間の交差反応性に関するいくつかの問題
を部分的に解決したのであるが、新たな問題が発生した
のである。例えば、これらの抗血清は、ｈＣＧ及びその
関連産物、例えば遊離β−ｈＣＧサブユニット及びカル
ボキシ末端ペプチドの間で特異性を欠いていた。このよ
うなｈＣＧの関連産物は、妊娠期間中の血清もしくは尿
中に、繊毛要素における腫瘍中に、又は所定箇所以外で
産生能をもつ癌患者において検出することができる。更
に、免疫原として遊離β−ｈＣＧサブユニット又はＣＴ
Ｐを使用した場合であっても、ｈＣＧ自体よりもｈＣＧ
関連産物の方について認識し易い抗血清を産生させてし
まうことになる。このように、免疫試験においてポリク
ローナル抗体を使用しても、糖タンパク質ホルモンとし
て構造的相同性の程度に差異がある属もしくは族が存在
するｈＣＧのような抗原の場合には、多大な制限が課さ
れている。本発明に開示されている抗体の中の特異的な
モノクローナル抗体を使用した免疫試験の場合は、従来
の免疫試験に見られる欠点を有していない。
更に重要なことには、このような特異性をもったモノク
ローナル抗体によれば、過剰量の遊離αもしくはβ−ｈ
ＣＧサブユニットの産生が臨床的に重要視される一定の
腫瘍を検出することができる。例えば、これらモノクロ
ーナル抗体の診断能は、遊離αもしくはβ−ｈＣＧサブ
ユニット産生の増加が報告されている、正常妊娠からの
胞状奇胎と進行性絨毛癌とを区別するために利用するこ
とができる。
ローナル抗体によれば、過剰量の遊離αもしくはβ−ｈ
ＣＧサブユニットの産生が臨床的に重要視される一定の
腫瘍を検出することができる。例えば、これらモノクロ
ーナル抗体の診断能は、遊離αもしくはβ−ｈＣＧサブ
ユニット産生の増加が報告されている、正常妊娠からの
胞状奇胎と進行性絨毛癌とを区別するために利用するこ
とができる。
更に、この特異性をもったモノクローナル抗体は、高精
製ホルモン標準中の交差反応成分又は混入汚染物質の存
在を検出するために使用することができる。
製ホルモン標準中の交差反応成分又は混入汚染物質の存
在を検出するために使用することができる。
以上本発明を概括的に説明してきたが、本発明は具体例
を参考にするとより詳しく理解できることになり、一方
具体例は説明だけの目的で本明細書に組込まれているの
であって、他に指示のない限り本発明を制限するための
ものではない。
を参考にするとより詳しく理解できることになり、一方
具体例は説明だけの目的で本明細書に組込まれているの
であって、他に指示のない限り本発明を制限するための
ものではない。
例１
ｈＣＧの存在下における遊離β−ｈＣＧサブユニットの
分析 Ａ、モノクローナル抗体の産生 精製されたｈＣＧ （ＣＲ−１２３） 、α−ｈＣＧ
（ＣＲ−１２３）及びβ−ｈＣＧ（ＣＲ−１２３−β−
ＩＩ−３）を人工研究センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆ’ｏ
ｒ Ｐｏｐｕｌａｔ１０ｎ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、ＮＩ
ＣＨＨＤ、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌｌｎｓｔ
ｌｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から人手した。ｈ
Ｆｓｌ（（ｈＦｓＨ−３） 、ｈＬＨ（ｈＬＩ（−１−
３）、ｈＴＳＨ（ｈＴＳＨ−１−５） 、β−ｈＴＳＨ
（バッチＮ１１２）、β−ｈＦＳＨ（バッチＮｏ、 ２
）及びβ−ｈＬＨ（バッチＮａ５）を国立ホルモン下
垂体プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｏｒｍｏｎｅ
ａｎｄ ＰｉｔｕｉｔａｒｙＰｒｏｇｒａｍ ） 、Ｎ
Ｉ ＡＤＤＫＤ、国立衛生研究所から入手した。 １
２５１− （ｈＣＧ）、 １２５ニー［ｈＦＳＨ］及
び１２５Ｉ−〔β−ｈｃＧ］ホルモンを原子力委員会（
Ｃｏｍｍｉｓａｒｉａｔ ａ ＩｏＥｆｌｃｒｇ１０Ａ
ｔｏｍｌｑｕｏ） （フランス）から入手した。
分析 Ａ、モノクローナル抗体の産生 精製されたｈＣＧ （ＣＲ−１２３） 、α−ｈＣＧ
（ＣＲ−１２３）及びβ−ｈＣＧ（ＣＲ−１２３−β−
ＩＩ−３）を人工研究センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆ’ｏ
ｒ Ｐｏｐｕｌａｔ１０ｎ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、ＮＩ
ＣＨＨＤ、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌｌｎｓｔ
ｌｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）から人手した。ｈ
Ｆｓｌ（（ｈＦｓＨ−３） 、ｈＬＨ（ｈＬＩ（−１−
３）、ｈＴＳＨ（ｈＴＳＨ−１−５） 、β−ｈＴＳＨ
（バッチＮ１１２）、β−ｈＦＳＨ（バッチＮｏ、 ２
）及びβ−ｈＬＨ（バッチＮａ５）を国立ホルモン下
垂体プログラム（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｈｏｒｍｏｎｅ
ａｎｄ ＰｉｔｕｉｔａｒｙＰｒｏｇｒａｍ ） 、Ｎ
Ｉ ＡＤＤＫＤ、国立衛生研究所から入手した。 １
２５１− （ｈＣＧ）、 １２５ニー［ｈＦＳＨ］及
び１２５Ｉ−〔β−ｈｃＧ］ホルモンを原子力委員会（
Ｃｏｍｍｉｓａｒｉａｔ ａ ＩｏＥｆｌｃｒｇ１０Ａ
ｔｏｍｌｑｕｏ） （フランス）から入手した。
３回の免疫処理を数種類のモノクローナル抗体ライブラ
リーの産生のために行なった。モノクローナル抗体の産
生法については記載済である〔ベレットら、ハイブリド
ーマ、第１巻、第２１８頁、１９８２年（Ｂｅｌｌｅｔ
ｅｔ ａｌ、、Ｈｙｂｒｉｄｏｇ＋ａ、 １：２１８
（１９８２）） ］ 、抗体Ｃ８は、Ｂａ１ｂ／Ｃｖウ
スを天然ｈＣＧ （ニー・シー・ビー（Ｕ、 Ｃ，Ｂ
、 ）、ブリュッセル、ベルギー）で免疫することによ
り産生じた。簡単に述べると、免疫に際して、フロイン
ト完全アジュバント（ＦＣＡ）中のｈＣＧ２５μｇを皮
下注射し、しかる後３６日目及び８５日目にそれぞれｈ
ＣＧ２５μｇ及び５０μｇを皮下注射した。細胞融合を
２５３日目に実施した。細胞融合前に、動物を融合の４
日前、３日前（腹腔内）及び１日前（静脈内）にｈｃＧ
１００μｇの腹腔内及び静脈内注射により追加免疫した
。
リーの産生のために行なった。モノクローナル抗体の産
生法については記載済である〔ベレットら、ハイブリド
ーマ、第１巻、第２１８頁、１９８２年（Ｂｅｌｌｅｔ
ｅｔ ａｌ、、Ｈｙｂｒｉｄｏｇ＋ａ、 １：２１８
（１９８２）） ］ 、抗体Ｃ８は、Ｂａ１ｂ／Ｃｖウ
スを天然ｈＣＧ （ニー・シー・ビー（Ｕ、 Ｃ，Ｂ
、 ）、ブリュッセル、ベルギー）で免疫することによ
り産生じた。簡単に述べると、免疫に際して、フロイン
ト完全アジュバント（ＦＣＡ）中のｈＣＧ２５μｇを皮
下注射し、しかる後３６日目及び８５日目にそれぞれｈ
ＣＧ２５μｇ及び５０μｇを皮下注射した。細胞融合を
２５３日目に実施した。細胞融合前に、動物を融合の４
日前、３日前（腹腔内）及び１日前（静脈内）にｈｃＧ
１００μｇの腹腔内及び静脈内注射により追加免疫した
。
細胞融合は、５０％ポリエチレングリコール（分子量１
，０００）中ＳＰ２１０Ａｇ１４骨髄腫細胞１０ 個を
肺臓細胞５×１０８個と一緒にインキュベートすること
により行なった。
，０００）中ＳＰ２１０Ａｇ１４骨髄腫細胞１０ 個を
肺臓細胞５×１０８個と一緒にインキュベートすること
により行なった。
モノクローナル抗体ＦＢＴ１０及びＦＢＴＩＩを免疫処
理により産生じたが、その処理においては、免疫原とし
て破傷風毒素（ＣＴＰ−ＴＴ）と−緒にβ−ｈＣＧ及び
カルボキシ末端ペプチドを使用した〔ビダードら、ジャ
ーナル・オブ・イムノロジー、第１３４巻、第４５７頁
、１９８５年（Ｂｉｄａｒｄ ｅｔ ａｌ、、Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ’ １ｍｍｕｎｏ１０ｇｙ、 １３４：４
５７（１９８５） ） ）。免疫処理では、最初に１回
目の投与量としてＦＣＡ中のβ−ｈｃ０１５μｇをＢａ
１ｂ／Ｃマウスに皮下注射し、次いで８か月後にフロイ
ント不完全アジュバント（ＦＩＡ）中のＣＴＰ−ＴＴ１
００μｇを皮下注射した。細胞融合を４２０日目に実施
した。動物に細胞融合の９日前（皮下）及び３日前（静
脈内）にβ−ｈｃＧ１５μｇで追加免疫した。
理により産生じたが、その処理においては、免疫原とし
て破傷風毒素（ＣＴＰ−ＴＴ）と−緒にβ−ｈＣＧ及び
カルボキシ末端ペプチドを使用した〔ビダードら、ジャ
ーナル・オブ・イムノロジー、第１３４巻、第４５７頁
、１９８５年（Ｂｉｄａｒｄ ｅｔ ａｌ、、Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ’ １ｍｍｕｎｏ１０ｇｙ、 １３４：４
５７（１９８５） ） ）。免疫処理では、最初に１回
目の投与量としてＦＣＡ中のβ−ｈｃ０１５μｇをＢａ
１ｂ／Ｃマウスに皮下注射し、次いで８か月後にフロイ
ント不完全アジュバント（ＦＩＡ）中のＣＴＰ−ＴＴ１
００μｇを皮下注射した。細胞融合を４２０日目に実施
した。動物に細胞融合の９日前（皮下）及び３日前（静
脈内）にβ−ｈｃＧ１５μｇで追加免疫した。
モノクローナル抗体ＨＴ１３は、ＦＣＡ中のｈｃＧ１０
／ｊｇで皮下的にＢａ１ｂ／Ｃマウスを免疫することに
より産生じた。７か月後、動物に、融合９日前にＦＩＡ
中のｈｃＧ１０μｇで皮下的に及び３日前に１０μｇで
静脈内に追加免疫した。
／ｊｇで皮下的にＢａ１ｂ／Ｃマウスを免疫することに
より産生じた。７か月後、動物に、融合９日前にＦＩＡ
中のｈｃＧ１０μｇで皮下的に及び３日前に１０μｇで
静脈内に追加免疫した。
モノクローナル抗体ＡＨＴ２０を産生ずるために、Ｂａ
１ｂ／Ｃ７ウスをＦＩＡ中のａ −ｈＣＧ１５μｇで皮
下的に免疫した。６か月後、動物にＦＩＡ中のα−ｈｃ
Ｇ１５μｇで皮下注射した。
１ｂ／Ｃ７ウスをＦＩＡ中のａ −ｈＣＧ１５μｇで皮
下的に免疫した。６か月後、動物にＦＩＡ中のα−ｈｃ
Ｇ１５μｇで皮下注射した。
α−ｈｃＧ１５μｇの３回目の注射を６週間後に静脈内
に行なった。融合はこの最後の免疫の３０後に実施した
。
に行なった。融合はこの最後の免疫の３０後に実施した
。
αもしくはβ−サブユニット又はｈＣＧに対するモノク
ローナル抗体を産生ずるために、ハイブリドーマ細胞培
養液上澄のスクリーニングを、ベレット（Ｂａｌｌｅｔ
）ら〔エンドクリノロジー、第１１５巻、第３３０頁、
１９８４年 （Ｅｎｄｏｃ ｒ ｉｎｏ ｌ ｏｇｙ ＋、見５：３
３０（１９ｇ４））に記載された放射免疫試験法により
実施した。簡単に述べると、培養液上澄１００μｌを１
２５．〔α−ｈｃＧ］、１２５、〔β−ｈｃＧ］又は１
２５１− ＣｈＣＧＥ１００μｌと一緒に２０℃で１
８時間インキュベＣ ｈ （５０，ＯＯＯ＊ ｐ ｍ） シた。抗原−抗体複
合体を、マウス免疫グロブリンに対する１％ヤギ抗血清
（ＩｇＧ及びＩｇＭのＨ鎖に対して特異的）含有８％ポ
リエチレングリコール（ＰＥＣ；）（分子ｆｆ１６，０
００）２ｍｌにより沈降させた。抗体産生ハイブリドー
マを確認した後、それらを限界希釈法により２回クロー
ン培養した。腹水は、ハイブリドーマ細胞５×１０５個
をＢａ１ｂ／Ｃヌードマウスに腹腔内接種することによ
り得た。重要な抗体産生腹水について１２りｒ −（ｈ
ｃＧ］、１２５１−（α−ｈｃＧ］、 ■ 〔β
−ｈｃＧ’１及び１２５１− （ｈＬＨ）に対するそ
れらの特異性に関して調べた。これらの結合試験の結果
を表１に示した。そこに示した５種のモノクローナル抗
体のうちで、ＨＴ１３及びＦＢＴ１０はすべての放射線
標識ホルモンと結合する。更にＨＴ１３はα及びβ−ｈ
ＣＧサブユニットに共通した抗原決定基と結合する。し
かしながら、Ｃ８は１２５゜（ｈｃＧ］のみ、ＦＢＴＩ
Ｉは１２５ｔ−〔β−ｈＣＧ）のみ、ＡＨＴ２０は遊離
α−サブユニットのみを認識する。
ローナル抗体を産生ずるために、ハイブリドーマ細胞培
養液上澄のスクリーニングを、ベレット（Ｂａｌｌｅｔ
）ら〔エンドクリノロジー、第１１５巻、第３３０頁、
１９８４年 （Ｅｎｄｏｃ ｒ ｉｎｏ ｌ ｏｇｙ ＋、見５：３
３０（１９ｇ４））に記載された放射免疫試験法により
実施した。簡単に述べると、培養液上澄１００μｌを１
２５．〔α−ｈｃＧ］、１２５、〔β−ｈｃＧ］又は１
２５１− ＣｈＣＧＥ１００μｌと一緒に２０℃で１
８時間インキュベＣ ｈ （５０，ＯＯＯ＊ ｐ ｍ） シた。抗原−抗体複
合体を、マウス免疫グロブリンに対する１％ヤギ抗血清
（ＩｇＧ及びＩｇＭのＨ鎖に対して特異的）含有８％ポ
リエチレングリコール（ＰＥＣ；）（分子ｆｆ１６，０
００）２ｍｌにより沈降させた。抗体産生ハイブリドー
マを確認した後、それらを限界希釈法により２回クロー
ン培養した。腹水は、ハイブリドーマ細胞５×１０５個
をＢａ１ｂ／Ｃヌードマウスに腹腔内接種することによ
り得た。重要な抗体産生腹水について１２りｒ −（ｈ
ｃＧ］、１２５１−（α−ｈｃＧ］、 ■ 〔β
−ｈｃＧ’１及び１２５１− （ｈＬＨ）に対するそ
れらの特異性に関して調べた。これらの結合試験の結果
を表１に示した。そこに示した５種のモノクローナル抗
体のうちで、ＨＴ１３及びＦＢＴ１０はすべての放射線
標識ホルモンと結合する。更にＨＴ１３はα及びβ−ｈ
ＣＧサブユニットに共通した抗原決定基と結合する。し
かしながら、Ｃ８は１２５゜（ｈｃＧ］のみ、ＦＢＴＩ
Ｉは１２５ｔ−〔β−ｈＣＧ）のみ、ＡＨＴ２０は遊離
α−サブユニットのみを認識する。
モノクローナル抗体ＦＢＴ１０，Ｃ８、ＦＢＴｌｌ、Ａ
ＨＴ２０及びＨＴ１３を更に精製かつ特徴化するために
選別した。腹水からのこれらモノクローナル抗体の精製
をプロティンＡセファロースアフィニティークロマトグ
ラフィーにより行なった。すべてのこれらの抗体をｐＨ
８，０のカラムに付し、ｐＨ５，０で溶出させた。精製
された抗体を次いでそれらのイソタイプ及びアフィニテ
ィ一定数に関して特徴づけた（表２）。モノクローナル
抗体のアフィニティ一定数を１２５．〔α−ｈＣＧ）、
１２５Ｉ−（β−ｈＣＧ）又は１２５■−（ｈＣＧ）を
用いた実験により調べた。簡単に述べると、未標識ホル
モンを、徐々に増加させながら、標識ホルモン又はサブ
ユニットと最大５０％結合する濃度まで希釈された精製
モノクローナル抗体含有反応混合物に加えた〔ベレット
ら、ハイブリドーマ、第１巻、第２１８頁、１９８２年
（Ｂｅｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ、、ｔｌｙｂｒｉｄｏｍａ
、 ｌ：２１８（１９８２）） ）。
ＨＴ２０及びＨＴ１３を更に精製かつ特徴化するために
選別した。腹水からのこれらモノクローナル抗体の精製
をプロティンＡセファロースアフィニティークロマトグ
ラフィーにより行なった。すべてのこれらの抗体をｐＨ
８，０のカラムに付し、ｐＨ５，０で溶出させた。精製
された抗体を次いでそれらのイソタイプ及びアフィニテ
ィ一定数に関して特徴づけた（表２）。モノクローナル
抗体のアフィニティ一定数を１２５．〔α−ｈＣＧ）、
１２５Ｉ−（β−ｈＣＧ）又は１２５■−（ｈＣＧ）を
用いた実験により調べた。簡単に述べると、未標識ホル
モンを、徐々に増加させながら、標識ホルモン又はサブ
ユニットと最大５０％結合する濃度まで希釈された精製
モノクローナル抗体含有反応混合物に加えた〔ベレット
ら、ハイブリドーマ、第１巻、第２１８頁、１９８２年
（Ｂｅｌｌｅｔ ｅｔ ａｌ、、ｔｌｙｂｒｉｄｏｍａ
、 ｌ：２１８（１９８２）） ）。
結合データの評価をスキャッチャード分析法〔スカッチ
ャード、アナルズ・オブ・ザ・二ニーヨーク・アカデミ
−・オブ拳サイエンシス、第５１巻、第６６０頁、１９
４９年（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ’ｔ
ｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｒ ５ｃ
１ｅｎｃｅｓ、 ５１：６８０（１９４９）） ］によ
り行なった。
ャード、アナルズ・オブ・ザ・二ニーヨーク・アカデミ
−・オブ拳サイエンシス、第５１巻、第６６０頁、１９
４９年（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ’ｔ
ｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｒ ５ｃ
１ｅｎｃｅｓ、 ５１：６８０（１９４９）） ］によ
り行なった。
表 ２
３各抗体のイソタイプは、ＲＩＡにより、第２抗体とし
てマウス免疫グロブリンイソタイプ（ＩｇＧ ＩｇＧ
２ａｂ１■ｇＧ３、ＩｇＭ。
てマウス免疫グロブリンイソタイプ（ＩｇＧ ＩｇＧ
２ａｂ１■ｇＧ３、ＩｇＭ。
１ ゝ
ＩｇＡ）に対し特異的なウサギ抗血清を用いて調べた。
ｂアフィニティ一定数は、未標識ホルモン又はサブユニ
ットを徐々に増加させて存在せしめながら、モノクロー
ナル抗体を標識された１２５゜（ｈＣＧ）、１２５．〔
α−ｈＣＧ）又は１２５■−〔β−ｈｃＧ］ と−緒に
インキュベートすることにより、ｈＣＧ、α−ｈＣＧ及
びβ−ｈＣＧに関して測定した。Ｋａ値は１モル当りの
リットル数で表示する。
ットを徐々に増加させて存在せしめながら、モノクロー
ナル抗体を標識された１２５゜（ｈＣＧ）、１２５．〔
α−ｈＣＧ）又は１２５■−〔β−ｈｃＧ］ と−緒に
インキュベートすることにより、ｈＣＧ、α−ｈＣＧ及
びβ−ｈＣＧに関して測定した。Ｋａ値は１モル当りの
リットル数で表示する。
０試験せず。
Ｂ、モノクローナル放射免疫試験の開発固相上の又は放
射線標識指示抗体としてのＣ８、ＦＢＴ１０ｌＦＢＴＩ
Ｉ、ＡＲＴ２０及びＨＴ１３を様々に組合せて、ｈＣＧ
、α−サブユニット及びβ−ｈＣＧ上の抗原ドメインに
対し特異的なモノクローナルＲＩＡを確立するために使
用した。これらの操作において、ポリスチレンビーズ〔
外径０．６４ｃｍ、プリシジョン・プラスチック・ボー
ル社（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｂａ１１
） 、シカゴ、イリノイ州〕を抗体の存在下（腹水を０
．１５ＭＮａＣ１及び０．１％Ｎ ａ Ｎ ａ （Ｐ
ｉ／ Ｎ ａ Ｃ１）含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，２）で１ ： ５００に希釈した）２０℃で一
夜インキユベートした。抗体被覆ビーズを使用前に脱イ
オン水で３回洗浄した。
射線標識指示抗体としてのＣ８、ＦＢＴ１０ｌＦＢＴＩ
Ｉ、ＡＲＴ２０及びＨＴ１３を様々に組合せて、ｈＣＧ
、α−サブユニット及びβ−ｈＣＧ上の抗原ドメインに
対し特異的なモノクローナルＲＩＡを確立するために使
用した。これらの操作において、ポリスチレンビーズ〔
外径０．６４ｃｍ、プリシジョン・プラスチック・ボー
ル社（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｂａ１１
） 、シカゴ、イリノイ州〕を抗体の存在下（腹水を０
．１５ＭＮａＣ１及び０．１％Ｎ ａ Ｎ ａ （Ｐ
ｉ／ Ｎ ａ Ｃ１）含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ７，２）で１ ： ５００に希釈した）２０℃で一
夜インキユベートした。抗体被覆ビーズを使用前に脱イ
オン水で３回洗浄した。
プロティンＡ精製抗体をヨードゲン（Ｉｏｄｏｇｅｎ
）法〔フレーカ−ら、バイオケミカル・アンド・バイオ
フィジカルψリサーチφコミュニケーションズ、第８０
巻、第８４９頁、１９７８年（Ｆｒａｋｅｒｅｔ ａｌ
、、Ｂ１０ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｏａｕａｕｎｉｃａｔｉ
ｏｎｓ、 ８０：８４９（１９７８）） ］により１２
５（ＩＦで放射線標識した。遊離ヨウ素を１％ウシ血清
アルブミン含有Ｐｉ／ＮａＣ１で平衡化されたセファデ
ックス（Ｓｃｐｈａ−ｄｃｘ ） Ｇ １５ Ｃ７７７
１７２７社（Ｐｈａｒｍａｃｆａ ） ）でゲラ１冫戸
遇することにより除去した。比活性は１０〜１４μＣＬ
／μｇである。精製されたホルモン又はそれらの遊離サ
ブユニットをウシ胎児血清で希釈し、様々な濃度の分析
標準を得た。
）法〔フレーカ−ら、バイオケミカル・アンド・バイオ
フィジカルψリサーチφコミュニケーションズ、第８０
巻、第８４９頁、１９７８年（Ｆｒａｋｅｒｅｔ ａｌ
、、Ｂ１０ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ
ｉｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｏａｕａｕｎｉｃａｔｉ
ｏｎｓ、 ８０：８４９（１９７８）） ］により１２
５（ＩＦで放射線標識した。遊離ヨウ素を１％ウシ血清
アルブミン含有Ｐｉ／ＮａＣ１で平衡化されたセファデ
ックス（Ｓｃｐｈａ−ｄｃｘ ） Ｇ １５ Ｃ７７７
１７２７社（Ｐｈａｒｍａｃｆａ ） ）でゲラ１冫戸
遇することにより除去した。比活性は１０〜１４μＣＬ
／μｇである。精製されたホルモン又はそれらの遊離サ
ブユニットをウシ胎児血清で希釈し、様々な濃度の分析
標準を得た。
“同時的（ｓｉＩＩｌｕｌｔａｎｅｏｕｓ） ’及び“
フォワード（［’ｏｒｖａｒｄ ）”サンドイッチＲＩ
Ａを様々なイムノアッセイコンフィギユレーションを調
べるために利用した。
フォワード（［’ｏｒｖａｒｄ ）”サンドイッチＲＩ
Ａを様々なイムノアッセイコンフィギユレーションを調
べるために利用した。
“同時的”サンドイッチＲＩＡでは、実験用試料１００
μｍ及びＰｉ／ＮａＣ１で希釈された１２５〔！〕抗体
１００μｍ （２００，０００ｃｐｍ）を２０℃で４時
間抗体被覆ビーズと一緒に同時にインキュベートした。
μｍ及びＰｉ／ＮａＣ１で希釈された１２５〔！〕抗体
１００μｍ （２００，０００ｃｐｍ）を２０℃で４時
間抗体被覆ビーズと一緒に同時にインキュベートした。
ビーズを次いで脱イオン水で３回洗浄し、結合した放射
能をガンマ−ウェルカウンターで測定した。正確な結合
値は、各種ホルモン標準と結合したｃｐｍ値をウシ胎児
血清のみと結合したｃｐｍ値で割ることにより測定した
場合に、２６５以上のＳ／Ｎ （シグナル／ノイズ）値
として計算した。
能をガンマ−ウェルカウンターで測定した。正確な結合
値は、各種ホルモン標準と結合したｃｐｍ値をウシ胎児
血清のみと結合したｃｐｍ値で割ることにより測定した
場合に、２６５以上のＳ／Ｎ （シグナル／ノイズ）値
として計算した。
ｈＣＧ及びβ−ｈＣＧに関する“フォワード。
サンドイッチＲＩＡも確立した。Ｃ８又は）ＩＴ１３で
被覆されたビーズをｈＣＧ検出用に使用し、ＦＢＴＩＩ
波覆ビーズを遊離β−ｈＣＧサブユニット測定用に使用
した。“フォワード１サンドイツチ゛法では、試料２０
０μｌを抗体被覆ビーズと一緒に２０℃で２時間インキ
ュベートした。ビーズを脱イオン水で完全に洗浄し、次
いで （Ｉ〕−ＦＢＴ１０２００μｍ （１０％ウシ
胎児血清及び非特異的精製マウスＩ ｇ Ｇ ２ａ４０
μｇ／１００μｍ含有Ｐｉ／ＮａＣ１中で １００．０００ｃｐｍ）を加えた。反応混合物を２０℃
で１時間インキュベートし、しかる後洗浄工程を経て、
結合した放射能を測定した。
被覆されたビーズをｈＣＧ検出用に使用し、ＦＢＴＩＩ
波覆ビーズを遊離β−ｈＣＧサブユニット測定用に使用
した。“フォワード１サンドイツチ゛法では、試料２０
０μｌを抗体被覆ビーズと一緒に２０℃で２時間インキ
ュベートした。ビーズを脱イオン水で完全に洗浄し、次
いで （Ｉ〕−ＦＢＴ１０２００μｍ （１０％ウシ
胎児血清及び非特異的精製マウスＩ ｇ Ｇ ２ａ４０
μｇ／１００μｍ含有Ｐｉ／ＮａＣ１中で １００．０００ｃｐｍ）を加えた。反応混合物を２０℃
で１時間インキュベートし、しかる後洗浄工程を経て、
結合した放射能を測定した。
可溶性タンパク質に対する高親和性モノクローナル抗体
を用いた過去の研究では、″同時的”サンドイッチアッ
セイコンフィギユレーションが生物学的液体中のタンパ
ク質を検出する場合に最も高感度であることを示唆して
いた〔ワンスら、ランセット、第２巻、第９７７頁、１
９８２年（Ｗａｎｄｓ ｅｔ ａｌ、、Ｌａｎｃｅｔ、
２：９７７（１９８２）） ； Ｌ−ルソッヒら、
サイエンス、第２２１巻、ｆＪ２７９頁、１９８３年（
Ｅｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、 ２
２１ ：２７９（１９８３）） ）。α及びβ−ｈＣＧ
サブユニット及び完全なｈＣＧの場合における大きな問
題は、高濃度の完全ｈＣＧ存在下で低濃度のサブユニッ
トを検出しなければならないことである。このことは、
正常な妊娠時及び腫瘍形成時において、β−ｈＣＧサブ
ユニットがｎｇ量で血中に存在し、その一方で完全ｈＣ
Ｇがμｇｊｌで存在している場合に特に該当する〔コー
ルら、ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロ
ジー・アンド・メタボリズム、第５８巻、第１２００頁
、１９８４年（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｃ１Ｃ１１ｎｉｃａｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏ１
０ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓａ＋、 ５８：１２０
０（１９８４）） ）。このような観察結果は、免疫試
験がもっばらβ−ｈＣＧ及びｈＣＧに対して特異的であ
ったとしても、考慮されなければならない。したがって
、β−ｈＣＧに関し抗体ＦＢＴ１０及びＦＢＴＩＩを用
いて確立された最初の試験法では“同時的”サンドイツ
チ法によりそれらの効能を研究した。（β−ｈＣＧに対
し特異的な）ＦＢＴｌｌを固相支持体に結合させ、ＦＢ
Ｔ１０（β−ｈＣＧ及びｈＣＧ双方と等しく反応する）
を放射線標識指示プローブとして作用させた場合の実験
において、“同時的″サンドイッチコンフィギユレーシ
ョンにより感受性分析法（＜０．４ｎｇ／ｍ１）を開発
した。しかしながら、ｈｃ０１０μｇ ／ ｍｌ存在下
での血清中β−ｈＣＧレベル（１〜１０ｎｇ／ｍ１）、
即ち正常な妊娠時に血清中に一般的に見出される濃度〔
ブローシュタインら、アメリカン・ジャーナル・オブ・
オブステトリクス・アンド・ギネコロジー、第１２６巻
、第６７８頁、１９７６年（Ｂｒａｕ−ｓｔｅｉｎ ａ
ｔ ａｌ、、ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ
０ｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏ１０ｇｙ
、 １２６：８７１ｔ（１９７Ｂ） ） ］を測定した
場合に、不正確な否定的結果が観察された。そこで、例
えば、実験を逆に行ない、即ちＦＢＴ１０を固相支持体
上の固定抗体とし、ＦＢＴＩＩを放射線標識指示プロー
ブとしたが、同一の結果が得られた。このように、低レ
ベルのβ−ｈＣＧがｈＣＧと共存するような通常の生理
的条件下においてβ−ｈＣＧを検出するために、ここに
提案された“同時的”サンドイッチ試験法を利用するこ
とは不可能である。不正確な否定的結果は、はとんどの
場合において、ＦＢＴ１０プローブが固相中高濃度のｈ
ＣＧと結合してしまった結果、ＦＢＴＩ １を介して固
相支持体に結合したβ−ｈＣＧとの結合及びその検出を
不可能ならしめているためであろう。第２の実験で７ｉ
Ｉｌｊ定した場合にも、高レベルのｈＣＧは固相支持体
に結合した利用可能なすべてのＦＢＴ１０抗体とやはり
結合しているため、可溶性遊離β−ｈＣＧサブユニット
と結合し得る抗体がほとんど残留していない。
を用いた過去の研究では、″同時的”サンドイッチアッ
セイコンフィギユレーションが生物学的液体中のタンパ
ク質を検出する場合に最も高感度であることを示唆して
いた〔ワンスら、ランセット、第２巻、第９７７頁、１
９８２年（Ｗａｎｄｓ ｅｔ ａｌ、、Ｌａｎｃｅｔ、
２：９７７（１９８２）） ； Ｌ−ルソッヒら、
サイエンス、第２２１巻、ｆＪ２７９頁、１９８３年（
Ｅｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、 ２
２１ ：２７９（１９８３）） ）。α及びβ−ｈＣＧ
サブユニット及び完全なｈＣＧの場合における大きな問
題は、高濃度の完全ｈＣＧ存在下で低濃度のサブユニッ
トを検出しなければならないことである。このことは、
正常な妊娠時及び腫瘍形成時において、β−ｈＣＧサブ
ユニットがｎｇ量で血中に存在し、その一方で完全ｈＣ
Ｇがμｇｊｌで存在している場合に特に該当する〔コー
ルら、ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロ
ジー・アンド・メタボリズム、第５８巻、第１２００頁
、１９８４年（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａ
ｌ ｏｆ Ｃ１Ｃ１１ｎｉｃａｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏ１
０ ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓａ＋、 ５８：１２０
０（１９８４）） ）。このような観察結果は、免疫試
験がもっばらβ−ｈＣＧ及びｈＣＧに対して特異的であ
ったとしても、考慮されなければならない。したがって
、β−ｈＣＧに関し抗体ＦＢＴ１０及びＦＢＴＩＩを用
いて確立された最初の試験法では“同時的”サンドイツ
チ法によりそれらの効能を研究した。（β−ｈＣＧに対
し特異的な）ＦＢＴｌｌを固相支持体に結合させ、ＦＢ
Ｔ１０（β−ｈＣＧ及びｈＣＧ双方と等しく反応する）
を放射線標識指示プローブとして作用させた場合の実験
において、“同時的″サンドイッチコンフィギユレーシ
ョンにより感受性分析法（＜０．４ｎｇ／ｍ１）を開発
した。しかしながら、ｈｃ０１０μｇ ／ ｍｌ存在下
での血清中β−ｈＣＧレベル（１〜１０ｎｇ／ｍ１）、
即ち正常な妊娠時に血清中に一般的に見出される濃度〔
ブローシュタインら、アメリカン・ジャーナル・オブ・
オブステトリクス・アンド・ギネコロジー、第１２６巻
、第６７８頁、１９７６年（Ｂｒａｕ−ｓｔｅｉｎ ａ
ｔ ａｌ、、ＡｍｅｒｉｃａｎＪｏｕｒｎａｌ ｏｆ
０ｂｓｔｅｔｒｉｃｓ ａｎｄ Ｇｙｎｅｃｏ１０ｇｙ
、 １２６：８７１ｔ（１９７Ｂ） ） ］を測定した
場合に、不正確な否定的結果が観察された。そこで、例
えば、実験を逆に行ない、即ちＦＢＴ１０を固相支持体
上の固定抗体とし、ＦＢＴＩＩを放射線標識指示プロー
ブとしたが、同一の結果が得られた。このように、低レ
ベルのβ−ｈＣＧがｈＣＧと共存するような通常の生理
的条件下においてβ−ｈＣＧを検出するために、ここに
提案された“同時的”サンドイッチ試験法を利用するこ
とは不可能である。不正確な否定的結果は、はとんどの
場合において、ＦＢＴ１０プローブが固相中高濃度のｈ
ＣＧと結合してしまった結果、ＦＢＴＩ １を介して固
相支持体に結合したβ−ｈＣＧとの結合及びその検出を
不可能ならしめているためであろう。第２の実験で７ｉ
Ｉｌｊ定した場合にも、高レベルのｈＣＧは固相支持体
に結合した利用可能なすべてのＦＢＴ１０抗体とやはり
結合しているため、可溶性遊離β−ｈＣＧサブユニット
と結合し得る抗体がほとんど残留していない。
不正確な否定的結果が得られるという聞届を解消するた
めに、β−ｈＣＧのための分析法を“フォワード”サン
ドイツチ法に変更した。上記過去の研究から判断して、
固相支持体に結合させるべき適格な固定抗体を選択する
ことが重要であり、したがってビーズに結合するβ−ｈ
ＣＧのブロックを避けるためには、高濃度のｈＣＧが血
清中に存在する場合にβ−ｈＣＧと結合するＦＢＴ１０
はブロックされてしまうことから（データ示さず）、Ｆ
ＢＴｌｌを固相上に使用した。“フォワード°サンドイ
ッチ試験法では、まず固相支持体を血清で希釈された天
然ホルモン又はサブユニットと一緒にインキュベートし
、次いで洗浄工程に付して、過剰の非結合ホルモンを除
去する。次いで、放射線標識指示抗体を加え、しかる後
洗浄工程に移る。β−ｈＣＧサブユニットのための“フ
ォワード”サンドイッチ試験法では、０．１０ｇ／ｍｌ
の濃度に対し感受性がある。
めに、β−ｈＣＧのための分析法を“フォワード”サン
ドイツチ法に変更した。上記過去の研究から判断して、
固相支持体に結合させるべき適格な固定抗体を選択する
ことが重要であり、したがってビーズに結合するβ−ｈ
ＣＧのブロックを避けるためには、高濃度のｈＣＧが血
清中に存在する場合にβ−ｈＣＧと結合するＦＢＴ１０
はブロックされてしまうことから（データ示さず）、Ｆ
ＢＴｌｌを固相上に使用した。“フォワード°サンドイ
ッチ試験法では、まず固相支持体を血清で希釈された天
然ホルモン又はサブユニットと一緒にインキュベートし
、次いで洗浄工程に付して、過剰の非結合ホルモンを除
去する。次いで、放射線標識指示抗体を加え、しかる後
洗浄工程に移る。β−ｈＣＧサブユニットのための“フ
ォワード”サンドイッチ試験法では、０．１０ｇ／ｍｌ
の濃度に対し感受性がある。
この実験において、遊離β−ｈＣＧサブユニットの測定
時にｈｃｃａ度を徐々に高めていった場合の影響を調べ
るための実験も行なった。β−ｈＣＧ分析標準にｈｃＧ
１００ｎｇ／ｍｌを加えても、血清中β−ｈＣＧの正確
な測定には影響を及ぼさなかった。しかしながら、ｈｃ
Ｇｉａ度が１０、 ０００ｎｇ／ｍｌまで次第に高まる
につれ、発明者は、ＦＢＴＩＩ−ＦＢＴ１０試験におい
てβ−ｈＣＧとの結合が多くなり、やや不正確な結果と
なることを観察した。これと同様の現象は、同一条件下
でｈＣＧのためのＣ３−ＦＢＴ１０“フォワード”サン
ドイッチ試料を行なった場合にも観察された。換言すれ
ば、β−ｈＣＧａ度が非常に高い場合に（１，０００ｎ
ｇ／ｍ１）ｈＣＧ検出した際、やや不正確な否定的結果
が観察された。これらの結果は、最初の特異性試験（表
１）では観察されなかったｈＣＧ上のエピトープとのＦ
ＢＴｌｌの交差反応性、又はｈＣＧ標準製剤中における
β−ｈＣＧもしくはβ−ｈＣＧｍ様”不純物の存在によ
って部分的に説明することができる。同様に、Ｃ８はｈ
ＣＧに対し完全に特異的ではなく、精製β−ｈＣＧホル
モン標準中の交差反応性物質を検出することも可能であ
る。
時にｈｃｃａ度を徐々に高めていった場合の影響を調べ
るための実験も行なった。β−ｈＣＧ分析標準にｈｃＧ
１００ｎｇ／ｍｌを加えても、血清中β−ｈＣＧの正確
な測定には影響を及ぼさなかった。しかしながら、ｈｃ
Ｇｉａ度が１０、 ０００ｎｇ／ｍｌまで次第に高まる
につれ、発明者は、ＦＢＴＩＩ−ＦＢＴ１０試験におい
てβ−ｈＣＧとの結合が多くなり、やや不正確な結果と
なることを観察した。これと同様の現象は、同一条件下
でｈＣＧのためのＣ３−ＦＢＴ１０“フォワード”サン
ドイッチ試料を行なった場合にも観察された。換言すれ
ば、β−ｈＣＧａ度が非常に高い場合に（１，０００ｎ
ｇ／ｍ１）ｈＣＧ検出した際、やや不正確な否定的結果
が観察された。これらの結果は、最初の特異性試験（表
１）では観察されなかったｈＣＧ上のエピトープとのＦ
ＢＴｌｌの交差反応性、又はｈＣＧ標準製剤中における
β−ｈＣＧもしくはβ−ｈＣＧｍ様”不純物の存在によ
って部分的に説明することができる。同様に、Ｃ８はｈ
ＣＧに対し完全に特異的ではなく、精製β−ｈＣＧホル
モン標準中の交差反応性物質を検出することも可能であ
る。
様々な他の糖タンパク質及びそれらのサブユニットの相
対的免疫応答性を測定することにより、それぞれｈＣＧ
及び遊離β−ｈＣＧサブユニットに関するＣ３−ＦＢＴ
１０及びＦＢＴＩＩ−ＦＢＴ１０試験の特異性を調べる
実験を行なった。
対的免疫応答性を測定することにより、それぞれｈＣＧ
及び遊離β−ｈＣＧサブユニットに関するＣ３−ＦＢＴ
１０及びＦＢＴＩＩ−ＦＢＴ１０試験の特異性を調べる
実験を行なった。
生理的濃度においては〔バシカイティスら、り一セント
・プログレス・イン・ホーモン・リサーチ、第３２巻、
第２８９頁、１９７６年（Ｖａｔｕｋａｆ ｔ ｌ５ｅ
ｔ ａｌ、、Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇ−ｒｅｓｓ ｉｎ
Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。
・プログレス・イン・ホーモン・リサーチ、第３２巻、
第２８９頁、１９７６年（Ｖａｔｕｋａｆ ｔ ｌ５ｅ
ｔ ａｌ、、Ｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｇ−ｒｅｓｓ ｉｎ
Ｈｏｒｍｏｎｅ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。
録：２８９（１９７Ｂ）） ） 、ｈ ＣＧホルモン標
準を除き、糖タンパク質ホルモン又はそれらのサブユニ
ットはいずれもＦＢＴＩＩ−ＦＢＴ１０免疫試験におい
てβ−ｈＣＧとの実質的な交差反応性を示さなかったこ
とは注目に値する。しかしながら、α−ｈＣＧ及びβ−
ｈＬＨの濃度が非常に高い場合にはＦＢＴｌｌ−ＦＢＴ
１０免疫試験において免疫応答性があった。同様に、ｈ
ＣＧに関するＣ３−ＦＢＴ１０試験において、α−ｈＣ
Ｇとの顕著な結合反応性（１，９％、表３）が観察され
た。残りの糖タンパク質ホルモン及びそれらのサブユニ
ットの相対的交差反応性は１％未満であった。これらの
結果は、ＦＢＴＩＩ及びＣ８抗体と他の糖タンパク質ホ
ルモン及びサブユニット上の類似エピトープとには部分
的に交差反応性があるか、あるいは精製された分析標準
中には糖タンパク質ホルモン混入汚染物が存在している
ことと合致する。
準を除き、糖タンパク質ホルモン又はそれらのサブユニ
ットはいずれもＦＢＴＩＩ−ＦＢＴ１０免疫試験におい
てβ−ｈＣＧとの実質的な交差反応性を示さなかったこ
とは注目に値する。しかしながら、α−ｈＣＧ及びβ−
ｈＬＨの濃度が非常に高い場合にはＦＢＴｌｌ−ＦＢＴ
１０免疫試験において免疫応答性があった。同様に、ｈ
ＣＧに関するＣ３−ＦＢＴ１０試験において、α−ｈＣ
Ｇとの顕著な結合反応性（１，９％、表３）が観察され
た。残りの糖タンパク質ホルモン及びそれらのサブユニ
ットの相対的交差反応性は１％未満であった。これらの
結果は、ＦＢＴＩＩ及びＣ８抗体と他の糖タンパク質ホ
ルモン及びサブユニット上の類似エピトープとには部分
的に交差反応性があるか、あるいは精製された分析標準
中には糖タンパク質ホルモン混入汚染物が存在している
ことと合致する。
Ｃ１糖タンパク質ホルモン標準の分析
精製された標準ｈＣＧ及びそのサブユニットを１０％及
び１２．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。試料を
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と−緒に又は−緒ではな
く０．１％ＳＤＳ緩衝液で希釈した。標準分子量マーカ
ー〔バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ） ）を使用し、ホル
モン標準の分子量を調べた。ＤＴＴと一緒に試料を、ゲ
ルに付す前に、１００℃で２分間煮沸した。電気泳動後
、タンパク質をコマッシーブルー又は銀染色（バイオラ
ッド）技術によりゲル上で視覚化させた。いくつかの実
験では、ｈＣＧ及びそのサブユニットを二重にゲルに付
着させた。ゲルの一部をタンパク質染色に付し、残部を
モノクローナルＲＩＡによる分析に使用した。この操作
のために、湿潤したゲルをゲルスライサーにより１．７
ｍ＋ｓの両分に切断した。タンパク質をＰｉ／ＮａＣ１
０，５ｍｌと一緒に４℃で一夜振盪することにより、ゲ
ル画分から溶出させた。溶出物をウシ胎児血清で希釈し
た後、モノクローナルＲＩＡによりｈＣＧ及びβ−ｈＣ
Ｇサブユニット結合活性について分析した。
び１２．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。試料を
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）と−緒に又は−緒ではな
く０．１％ＳＤＳ緩衝液で希釈した。標準分子量マーカ
ー〔バイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ） ）を使用し、ホル
モン標準の分子量を調べた。ＤＴＴと一緒に試料を、ゲ
ルに付す前に、１００℃で２分間煮沸した。電気泳動後
、タンパク質をコマッシーブルー又は銀染色（バイオラ
ッド）技術によりゲル上で視覚化させた。いくつかの実
験では、ｈＣＧ及びそのサブユニットを二重にゲルに付
着させた。ゲルの一部をタンパク質染色に付し、残部を
モノクローナルＲＩＡによる分析に使用した。この操作
のために、湿潤したゲルをゲルスライサーにより１．７
ｍ＋ｓの両分に切断した。タンパク質をＰｉ／ＮａＣ１
０，５ｍｌと一緒に４℃で一夜振盪することにより、ゲ
ル画分から溶出させた。溶出物をウシ胎児血清で希釈し
た後、モノクローナルＲＩＡによりｈＣＧ及びβ−ｈＣ
Ｇサブユニット結合活性について分析した。
５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析をｈＣＧ、α−ｈＣＧ及びβ−ｈ
ＣＧ標準について実施した。この技術を利用した場合に
、単一のｈＣＧタンパク質バンドを観察した。更に、α
−ｈＣＧ及びβ−ｈＣＧホルモン標準も単一バンドとし
て移動していた。還元条件下で調べた場合には、ｈＣＧ
はそのα及びβサブユニットに解離した。たとえあるに
しても少ないが、他の糖タンパク質ホルモンとの相互混
入があることはこの技術から明らかである。
ＣＧ標準について実施した。この技術を利用した場合に
、単一のｈＣＧタンパク質バンドを観察した。更に、α
−ｈＣＧ及びβ−ｈＣＧホルモン標準も単一バンドとし
て移動していた。還元条件下で調べた場合には、ｈＣＧ
はそのα及びβサブユニットに解離した。たとえあるに
しても少ないが、他の糖タンパク質ホルモンとの相互混
入があることはこの技術から明らかである。
非還元条件下でゲル電気泳動に付し、ゲルをスライスし
、Ｐｉ／ＮａＣ１で溶出させた後、ｈＣＧに関して更に
実験を行なった。各溶出画分を、ＦＢＴＩ １− ＦＢ
Ｔ１０免疫試験によりβ−ｈＣＧの存在について、更に
Ｃ３−ＦＢＴ１０免疫試験によりｈＣＧの存在について
調べた。２つの免疫応答ピークが存在していた。Ｃ３−
ＦＢＴ１０試験では天然ｈＣＧを検出する。第２のピー
クはβ−ｈＣＧのＦＢＴＩＩ−ＦＢＴ１０ＲＩＡでのみ
反応した。両試験で免疫応答性がある場合には、ｈＣＧ
及びβ−ｈＣＧホルモン標準に関しそれぞれ共同移動性
が見られた。したがって、“精製された” ｈＣＧ標準
はβ−ｈＣＧサブユニットで汚染されていた。この汚染
はβ−ｈＣＧＦＢＴ１１−ＦＢＴ１０免疫試験によって
のみ検出できた。これらの実験から明らかなように、Ｃ
８及びβ−ｈＣＧ間又はＦＢＴＩＩ及びｈＣＧ間には交
差反応性がなかった。このように、β−ｈＣＧ上にはＦ
ＢＴｌｌによって認識され、更にｈＣＧ上にはＣ８によ
って認識される唯一のエピトープ特異性ドメインが存在
している。
、Ｐｉ／ＮａＣ１で溶出させた後、ｈＣＧに関して更に
実験を行なった。各溶出画分を、ＦＢＴＩ １− ＦＢ
Ｔ１０免疫試験によりβ−ｈＣＧの存在について、更に
Ｃ３−ＦＢＴ１０免疫試験によりｈＣＧの存在について
調べた。２つの免疫応答ピークが存在していた。Ｃ３−
ＦＢＴ１０試験では天然ｈＣＧを検出する。第２のピー
クはβ−ｈＣＧのＦＢＴＩＩ−ＦＢＴ１０ＲＩＡでのみ
反応した。両試験で免疫応答性がある場合には、ｈＣＧ
及びβ−ｈＣＧホルモン標準に関しそれぞれ共同移動性
が見られた。したがって、“精製された” ｈＣＧ標準
はβ−ｈＣＧサブユニットで汚染されていた。この汚染
はβ−ｈＣＧＦＢＴ１１−ＦＢＴ１０免疫試験によって
のみ検出できた。これらの実験から明らかなように、Ｃ
８及びβ−ｈＣＧ間又はＦＢＴＩＩ及びｈＣＧ間には交
差反応性がなかった。このように、β−ｈＣＧ上にはＦ
ＢＴｌｌによって認識され、更にｈＣＧ上にはＣ８によ
って認識される唯一のエピトープ特異性ドメインが存在
している。
α−ｈＣＧホルモン標準はｈＣＧに関するＣ３−ＦＢＴ
１０試験においてわずかに交差反応性を示しているため
（表３）、上記試験と同一の実験を行なった。α−ｈＣ
Ｇ標準のゲル電気泳動後に、ｈＣＧ及びβ−ｈＣＧ混入
汚染があることを確認した。このデータでは、表３に示
された相対的交差反応性は他の糖タンパク質ホルモン及
びそれらのサブユニット上のＦＢＴＩＩ及びＣ８共通の
エピトープに起因するものではなく、糖タンパク質ホル
モン標準中での混入汚染物質の存在に起因するものであ
ることを示している。
１０試験においてわずかに交差反応性を示しているため
（表３）、上記試験と同一の実験を行なった。α−ｈＣ
Ｇ標準のゲル電気泳動後に、ｈＣＧ及びβ−ｈＣＧ混入
汚染があることを確認した。このデータでは、表３に示
された相対的交差反応性は他の糖タンパク質ホルモン及
びそれらのサブユニット上のＦＢＴＩＩ及びＣ８共通の
エピトープに起因するものではなく、糖タンパク質ホル
モン標準中での混入汚染物質の存在に起因するものであ
ることを示している。
モノクローナル抗体ＦＢＴ１１を使用してアフィニティ
ークロマトグラフィーを実施した。
ークロマトグラフィーを実施した。
ＦＢＴ１１含有腹水を、ワンズ（Ｗａｎｄｓ ）ら〔プ
ロシーディンゲス・オブφザ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンシス、ＵＳＡ、第７９巻、第１２７７
頁、１９８２年（Ｐｒｏｃｅｅｄｌｎｇｓ ｏｆ ｔｈ
ｅＮａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅａ＋ｙ ｏｆ’ ５ｃ
ｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、 ７９：１２７７（１９８２）
） ）が記載しているようにして、ＣＮＢ ｒ活性化セ
ファロース４Ｂ（ファルマシア社）に結合させた。非反
応性部位をブロックするために、ゲルを０．１Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ８，０）中で２時間インキュベートした。
ロシーディンゲス・オブφザ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンシス、ＵＳＡ、第７９巻、第１２７７
頁、１９８２年（Ｐｒｏｃｅｅｄｌｎｇｓ ｏｆ ｔｈ
ｅＮａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅａ＋ｙ ｏｆ’ ５ｃ
ｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ、 ７９：１２７７（１９８２）
） ）が記載しているようにして、ＣＮＢ ｒ活性化セ
ファロース４Ｂ（ファルマシア社）に結合させた。非反
応性部位をブロックするために、ゲルを０．１Ｍトリス
緩衝液（ｐＨ８，０）中で２時間インキュベートした。
ゲルを次いで焼結ガラス漏斗上でいずれも０．５Ｍ
ＮａＣ１含宵の大量の０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０
）及び０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，０）で連続的に
洗浄した。セファロース４Ｂと共有結合したＦＢＴＩＩ
を最終的にＰｉ／ＮａＣ１に懸濁させ、４℃で保存した
。ＦＢＴ１１結合セファロースの小カラムを５ｍｌシリ
ンジで調製し、０．１Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）で平衡化した。Ｐｉ／ＮａＣ１中のｈＣＧ又
はβ−ｈＣＧサブユニット含有試料をカラムに供給した
。ホルモンをカラム中４℃で２時間インキュベートした
。
ＮａＣ１含宵の大量の０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０
）及び０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８，０）で連続的に
洗浄した。セファロース４Ｂと共有結合したＦＢＴＩＩ
を最終的にＰｉ／ＮａＣ１に懸濁させ、４℃で保存した
。ＦＢＴ１１結合セファロースの小カラムを５ｍｌシリ
ンジで調製し、０．１Ｍ重炭酸アンモニウム緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）で平衡化した。Ｐｉ／ＮａＣ１中のｈＣＧ又
はβ−ｈＣＧサブユニット含有試料をカラムに供給した
。ホルモンをカラム中４℃で２時間インキュベートした
。
未吸着物質を重炭酸アンモニウム緩衝液で完全に洗浄す
ることにより除去した。カラムを次いで脱イオン水１５
ｍ１で洗浄した。結合物質をしかる後２．５％（ｖ／ｖ
）酢酸で溶出した。溶出物をアセトン／ドライアイスで
迅速に凍結し、凍結乾燥させた。凍結乾燥生成物をＰｉ
／ＮａＣ１に溶解させ、分析前に一２０℃で保存した。
ることにより除去した。カラムを次いで脱イオン水１５
ｍ１で洗浄した。結合物質をしかる後２．５％（ｖ／ｖ
）酢酸で溶出した。溶出物をアセトン／ドライアイスで
迅速に凍結し、凍結乾燥させた。凍結乾燥生成物をＰｉ
／ＮａＣ１に溶解させ、分析前に一２０℃で保存した。
ｈＣＧ及びβ−ｈＣＧのアフィニティークロマトグラフ
ィーにおいて、ＦＢＴ１１セファロースカラム上に混合
物として供給した場合には、ｈＣＧはカラムと結合せず
、ｐＨ７，２で溶出した。逆に、β−ｈＣＧはこれらの
条件下で完全にカラムと結合し、ｐＨ３，０で溶出した
後に回収された（８０％、）。
ィーにおいて、ＦＢＴ１１セファロースカラム上に混合
物として供給した場合には、ｈＣＧはカラムと結合せず
、ｐＨ７，２で溶出した。逆に、β−ｈＣＧはこれらの
条件下で完全にカラムと結合し、ｐＨ３，０で溶出した
後に回収された（８０％、）。
このアプローチを、前記のようにｈＣＧホルモン標準中
のβ−ｈＣＧ不純物を更に特徴化するために利用した。
のβ−ｈＣＧ不純物を更に特徴化するために利用した。
この実験では、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析をｈＣＧのＦＢＴ
ＩＩアフィニティークロマトグラフィーの前後にわたっ
て実施し、次いでＦＢＴＩＩ−ＦＢＴ１０及びＣ３−Ｆ
ＢＴ１０免疫試験により溶出画分の免疫応答性測定を合
わせて行なった。
ＩＩアフィニティークロマトグラフィーの前後にわたっ
て実施し、次いでＦＢＴＩＩ−ＦＢＴ１０及びＣ３−Ｆ
ＢＴ１０免疫試験により溶出画分の免疫応答性測定を合
わせて行なった。
これらの研究では、β−ｈＣＧ成分がアフィニティーク
ロマトグラフィー前のｈＣＧ標準中に存在していること
を示していた。ＦＢＴＩＩカラムでのアフィニティーク
ロマトグラフィー後、未保持画分はｈＣＧのみを含有し
、β−ｈＣＧ混入汚染物は固相支持体に結合していた。
ロマトグラフィー前のｈＣＧ標準中に存在していること
を示していた。ＦＢＴＩＩカラムでのアフィニティーク
ロマトグラフィー後、未保持画分はｈＣＧのみを含有し
、β−ｈＣＧ混入汚染物は固相支持体に結合していた。
β−ｈＣＧ混入汚染物が存在していることの最終的証拠
は、ｐＨ３，０でＦＢＴＩＩアフィニティーカラムから
β−ｈＣＧを溶出させ回収することによって得られた。
は、ｐＨ３，０でＦＢＴＩＩアフィニティーカラムから
β−ｈＣＧを溶出させ回収することによって得られた。
例２
ＡＨＴ２０−ＨＴ１３サンドイッチ免疫試験による遊離
α−ｈＣＧサブユニットの検出に際してｈＣＧ標準の濃
度を次第に高めていった場合の影響を調べる実験を行な
った。この試験は上記と同様にして行なわれたが、但し
遊離α−ｈＣＧサブユニットに対し特異的なＡＨＴ２０
をポリスチレンビーズに結合させ、しかも１２５１−Ｈ
Ｔ１３を使用して、結合した遊離α−ｈＣＧサブユニッ
トの存在を検出した。精製されたα−ｈＣＧサブユニッ
ト（１，５，１０及び２０ ｎｇ／ ｍｌ ）をｈＣＧ
標準０．１０２．１０３及び１０ ’ ｎｇ／ ｍｌの
存在下で／Ｉｌｌ定した。この実験結果は表４に示され
ている。
α−ｈＣＧサブユニットの検出に際してｈＣＧ標準の濃
度を次第に高めていった場合の影響を調べる実験を行な
った。この試験は上記と同様にして行なわれたが、但し
遊離α−ｈＣＧサブユニットに対し特異的なＡＨＴ２０
をポリスチレンビーズに結合させ、しかも１２５１−Ｈ
Ｔ１３を使用して、結合した遊離α−ｈＣＧサブユニッ
トの存在を検出した。精製されたα−ｈＣＧサブユニッ
ト（１，５，１０及び２０ ｎｇ／ ｍｌ ）をｈＣＧ
標準０．１０２．１０３及び１０ ’ ｎｇ／ ｍｌの
存在下で／Ｉｌｌ定した。この実験結果は表４に示され
ている。
差異は、ｈＣＧが存在していない場合とｈＣＧｌ ０２
ｎｇ／ ｍｌが存在している場合とで検出された遊離α
−ｈＣＧサブユニットレベルの間には見られなかった。
ｎｇ／ ｍｌが存在している場合とで検出された遊離α
−ｈＣＧサブユニットレベルの間には見られなかった。
しがしながら、ｈＣＧ標準濃度を更に高めた場合（１ｏ
３及び１０’ｎｇ／ｍ１）には、遊離α−ｈＣＧ特異的
結合試験に際して結合が増大した。この結合の増加は、
ｈＣＧ標準が遊離α−ｈＣＧサブユニットで汚染されて
いることを示している。
３及び１０’ｎｇ／ｍ１）には、遊離α−ｈＣＧ特異的
結合試験に際して結合が増大した。この結合の増加は、
ｈＣＧ標準が遊離α−ｈＣＧサブユニットで汚染されて
いることを示している。
表４
ｈＣＧ標準の存在下における遊離
α−ｈＣＧサブユニットの検出
（ｉ離ａ−ｈＣＧ 遊離ａ−ｈＣＧ １０
１０３ １０’１．０ ６’
６ ２２ ３５５．０ ２２
２４ ３０ ３６１０．０
３４ ３４ ３４ ３８ングナル／ノイ
ズ比 例３ 遊離β−ｈＣＧサブユニットのレベルを妊娠１２２回目
患者の血清及び絨毛癌患者の血清について調べた（表４
）。試験は、（遊離β−ｈＣＧサブユニットに対し特異
的な）ＦＢＴＩＩで被覆されたビーズ及び（遊離β−ｈ
ＣＧサブユニット及びｈＣＧ双方と反応する） Ｉ
−ＦＢＴ１０を使用して実施した。このデータでは、絨
毛癌患者からの試料は正常妊娠患者の血清中に存在する
よりも著しく高い遊離β−ｈＣＧサブユニットの血清レ
ベルを有していたことを示している。
１０３ １０’１．０ ６’
６ ２２ ３５５．０ ２２
２４ ３０ ３６１０．０
３４ ３４ ３４ ３８ングナル／ノイ
ズ比 例３ 遊離β−ｈＣＧサブユニットのレベルを妊娠１２２回目
患者の血清及び絨毛癌患者の血清について調べた（表４
）。試験は、（遊離β−ｈＣＧサブユニットに対し特異
的な）ＦＢＴＩＩで被覆されたビーズ及び（遊離β−ｈ
ＣＧサブユニット及びｈＣＧ双方と反応する） Ｉ
−ＦＢＴ１０を使用して実施した。このデータでは、絨
毛癌患者からの試料は正常妊娠患者の血清中に存在する
よりも著しく高い遊離β−ｈＣＧサブユニットの血清レ
ベルを有していたことを示している。
表５
正常妊娠及び絨毛癌の場合における高濃度ｈＣＧ存在下
での遊離β−ｈＣＧサブユニット血清レベルの測定３ １：１０ ４，２５６ （８３） １
３，５００ （＞２００）１ ： １００
４２０ （８０） １４，５００ （＞２
０００）４試料２００μｌを使用したフォワード試験で
は、最初にＦＢＴＩＩ被覆ビーズと一緒にインキュベー
トシた（２時間）。２回目のインキュベートはＦＢＴ１
１被覆ビーズ及び１２５１−ＦＢＴ１０（１００，００
０ｃｐｍ）の存在下で行なった（１時間）。合計インキ
ベート時間は３時間であった。
での遊離β−ｈＣＧサブユニット血清レベルの測定３ １：１０ ４，２５６ （８３） １
３，５００ （＞２００）１ ： １００
４２０ （８０） １４，５００ （＞２
０００）４試料２００μｌを使用したフォワード試験で
は、最初にＦＢＴＩＩ被覆ビーズと一緒にインキュベー
トシた（２時間）。２回目のインキュベートはＦＢＴ１
１被覆ビーズ及び１２５１−ＦＢＴ１０（１００，００
０ｃｐｍ）の存在下で行なった（１時間）。合計インキ
ベート時間は３時間であった。
５特異性試験により測定されたｈＣＧレベルは、妊娠の
場合が３７． ０００ｎｇ／ｍｌ、絨毛癌の場合が４０
． ０００ｎｇ／ｍｌであった。
場合が３７． ０００ｎｇ／ｍｌ、絨毛癌の場合が４０
． ０００ｎｇ／ｍｌであった。
０標準曲線から調べた値
例４
遊離β−ｈＣＧサブユニット及びｈＣＧのレベルを、正
常妊娠期間中の様々な妊娠進行時点で採取された血清中
、及び絨毛癌患者の血清中で測定した。
常妊娠期間中の様々な妊娠進行時点で採取された血清中
、及び絨毛癌患者の血清中で測定した。
遊離β−ｈＣＧサブユニットを、試料２００μｌをＦＢ
ＴＩＩ被覆ビーズと一緒に２時間インキュベートするこ
とにより検出した。洗浄後、１２５１−ＦＢＴ１０２０
０μｍ （１００，ＯＯＯｃｐｍ）をビーズに加え、更に１時間
インキュベートした。インキュベート終了後、ビーズを
再び洗浄し、ビーズに結合した総カウント数をガンマ−
カウンターにより測定した。
ＴＩＩ被覆ビーズと一緒に２時間インキュベートするこ
とにより検出した。洗浄後、１２５１−ＦＢＴ１０２０
０μｍ （１００，ＯＯＯｃｐｍ）をビーズに加え、更に１時間
インキュベートした。インキュベート終了後、ビーズを
再び洗浄し、ビーズに結合した総カウント数をガンマ−
カウンターにより測定した。
ｈＣＧレベルを上記と同様の操作により測定したが、但
しビーズはＣ８で被覆した。
しビーズはＣ８で被覆した。
図２は胎児年令の経過に伴う正常妊娠時におけるβ−ｈ
ＣＧサブユニット及びｈＣＧの血清レベルを示している
。妊娠期間中では遊離β−ｈＣＧサブユニット及びｈＣ
Ｇのレベル間には直接的関係がある。更に重要なことに
は、図２０で示されているように、遊離β−ｈＣＧサブ
ユニットＺｈＣＧ比は妊娠５−１−２３週目の間一定で
あるという事実が存在する。この現象は、正常妊娠と絨
毛箱とを識別するためには特に重要である。
ＣＧサブユニット及びｈＣＧの血清レベルを示している
。妊娠期間中では遊離β−ｈＣＧサブユニット及びｈＣ
Ｇのレベル間には直接的関係がある。更に重要なことに
は、図２０で示されているように、遊離β−ｈＣＧサブ
ユニットＺｈＣＧ比は妊娠５−１−２３週目の間一定で
あるという事実が存在する。この現象は、正常妊娠と絨
毛箱とを識別するためには特に重要である。
図３は、６例の絨毛癌患者の血清中の遊離β−ｈＣＧサ
ブユニット／総ｈＣＧ比を正常妊娠時に通常見られる比
と比較して示したものである。６例すべての絨毛癌患者
は、正常妊娠時の通常の比よりも約３〜１３％高い比を
示した。この比により、絨毛箱又は絨毛性疾患の患者を
正常妊娠患者から識別することが可能となる。
ブユニット／総ｈＣＧ比を正常妊娠時に通常見られる比
と比較して示したものである。６例すべての絨毛癌患者
は、正常妊娠時の通常の比よりも約３〜１３％高い比を
示した。この比により、絨毛箱又は絨毛性疾患の患者を
正常妊娠患者から識別することが可能となる。
例５
様々な腫瘍患者から採取した血清試料中の遊離β−ｈＣ
Ｇサブユニット及びｈＣＧについて測定した。試験は上
記のようにして実施した。表６はｈＣＧレベルを示し、
表７は血清中に存在する遊離β−ｈＣＧサブユニットレ
ベルを示す。遊離β−ｈＣＧサブユニット及びｈＣＧの
基準血清レベルは、肝炎又は肝硬変のような非腫瘍性疾
患の３６６例の患者（病気コントロール）から採取した
試料を用いて定めた。これらの結果から判断すると、ｈ
ｃｃ＜ｌｎｇ／ｍｌのレベル及び遊離β−ｈＣＧサブユ
ニット＜０． ２ｎｇ／ｍｌのレベルは正常であると考
えられる。この判断基準からみて、本発明の免疫試験法
は一定のヒト腫瘍の存在を検出する場合に極めて正確で
ある。このことは、治療後の精巣及び絨毛性の腫瘍患者
から採取した試料の場合に特に該当し、この場合におい
てすべての試料は高いｈＣＧ及び遊離β−ｈＣＧサブユ
ニットレベルを示した。
Ｇサブユニット及びｈＣＧについて測定した。試験は上
記のようにして実施した。表６はｈＣＧレベルを示し、
表７は血清中に存在する遊離β−ｈＣＧサブユニットレ
ベルを示す。遊離β−ｈＣＧサブユニット及びｈＣＧの
基準血清レベルは、肝炎又は肝硬変のような非腫瘍性疾
患の３６６例の患者（病気コントロール）から採取した
試料を用いて定めた。これらの結果から判断すると、ｈ
ｃｃ＜ｌｎｇ／ｍｌのレベル及び遊離β−ｈＣＧサブユ
ニット＜０． ２ｎｇ／ｍｌのレベルは正常であると考
えられる。この判断基準からみて、本発明の免疫試験法
は一定のヒト腫瘍の存在を検出する場合に極めて正確で
ある。このことは、治療後の精巣及び絨毛性の腫瘍患者
から採取した試料の場合に特に該当し、この場合におい
てすべての試料は高いｈＣＧ及び遊離β−ｈＣＧサブユ
ニットレベルを示した。
女性の場合でのｈＣＧの存在は、妊娠、絨毛性疾患又は
非絨毛性悪性腫瘍のいずれかを示唆する。
非絨毛性悪性腫瘍のいずれかを示唆する。
遊離β−ｈＣＧサブユニットが異常レベルで存在する場
合には、絨毛性疾患又は非絨毛性悪性腫瘍のいずれかの
進行を示唆する。試料が異常レベルで遊離β−ｈＣＧサ
ブユニットを含有しているか否かを調べるためには、具
体的試料について得た遊離β−ｈＣＧサブユニット値を
妊婦又は外見上健庸な個人の場合に観察される通常値と
比較する。
合には、絨毛性疾患又は非絨毛性悪性腫瘍のいずれかの
進行を示唆する。試料が異常レベルで遊離β−ｈＣＧサ
ブユニットを含有しているか否かを調べるためには、具
体的試料について得た遊離β−ｈＣＧサブユニット値を
妊婦又は外見上健庸な個人の場合に観察される通常値と
比較する。
臨床データでは、遊離β−ｈＣＧサブユニット／ｈＣＧ
比の上昇が悪性腫瘍患者の場合に見られることを示して
いる。
比の上昇が悪性腫瘍患者の場合に見られることを示して
いる。
表 ６
以上本発明を十分に説明してたきたが、本発明は、パラ
メーター、条件その他の広範かつ実質的量等の範囲内で
、本発明又はその具体例の精神もしくは範囲に影響を及
ぼさない限りにおいて実施可能であることは容易に明ら
かなとなるであろう
メーター、条件その他の広範かつ実質的量等の範囲内で
、本発明又はその具体例の精神もしくは範囲に影響を及
ぼさない限りにおいて実施可能であることは容易に明ら
かなとなるであろう
図１は本発明により検出される四次構造タンパク質ポリ
ペプチドサブユニット及び四次構造タンパク質のエピト
ープ配置の概略図である。 図２は妊娠期間中における正常妊娠血清中のｈＣＧ （
Ａ）及び遊離β−ｈＣＧサブユニット（Ｂ）のレベルを
示すグラフである。遊離β−ｈＣＧサブユニット（○・
・・○）はＦＢＴＩ １−ＦＢＴ１０により分析され、
ｈＣＧ（・・・・・）はＣ３−ＦＢＴ１０により分析さ
れた。（Ｃ）モル比％。 図３は繊毛癌患者から採取した試料の遊離β−ｈＣＧサ
ブユニット／総β−ｈＣＧ比と正常妊娠時の同様の比と
の比較グラフである。 ＦＩＧ、 ２ Ｆ４白リピ２竿＋ａ」ン
ペプチドサブユニット及び四次構造タンパク質のエピト
ープ配置の概略図である。 図２は妊娠期間中における正常妊娠血清中のｈＣＧ （
Ａ）及び遊離β−ｈＣＧサブユニット（Ｂ）のレベルを
示すグラフである。遊離β−ｈＣＧサブユニット（○・
・・○）はＦＢＴＩ １−ＦＢＴ１０により分析され、
ｈＣＧ（・・・・・）はＣ３−ＦＢＴ１０により分析さ
れた。（Ｃ）モル比％。 図３は繊毛癌患者から採取した試料の遊離β−ｈＣＧサ
ブユニット／総β−ｈＣＧ比と正常妊娠時の同様の比と
の比較グラフである。 ＦＩＧ、 ２ Ｆ４白リピ２竿＋ａ」ン
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、試料中における四次構造タンパク質の遊離タンパク
質サブユニットの測定方法であって、（ａ）上記試料を
担体と結合しているか又は結合するであろう第１の免疫
学的結合相手と接触させ（上記第１の免疫学的結合相手
は上記遊離タンパク質サブユニット上でのみ結合可能な
エピトープ抗原決定基と結合する）； （ｂ）上記遊離タンパク質サブユニット、上記第１の免
疫学的結合相手及び上記担体間で免疫複合体を形成させ
るために十分な時間及び条件において工程（ａ）の成分
をインキュベートし； （ｃ）上記試料から工程（ｂ）の上記担体を分離し； （ｄ）工程（ｃ）の上記担体に、検出可能に標識された
第２の免疫学的結合相手を加え（上記第２の免疫学的結
合相手は上記遊離タンパク質サブユニット及び上記四次
構造タンパク質双方上の結合可能なエピトープ抗原決定
基と結合する）；及び （ｅ）上記担体又は液相中における検出可能に標識され
た第２の免疫学的結合相手を測定する；ことからなる方
法。 ２、試料中における四次構造タンパク質の遊離タンパク
質サブユニット対上記サブユニット含有四次構造タンパ
ク質の比の測定方法であって、 （ａ）上記試料中に存在する遊離タンパク質サブユニッ
トの量を特許請求の範囲第１項の方法に従い測定し； （ｂ）上記試料中における上記サブユニット含有四次構
造タンパク質の量を測定し；及び（ｃ）上記工程（ａ）
の得られた値を上記工程（ｂ）で得られた値で割る； ことからなる方法。 ３、工程（ｂ）が、 （ｂ１）試料を担体と結合しているか又は結合するであ
ろう第１の免疫学的結合相手と接触させ（上記第１の免
疫学的結合相手は四次構造タンパク質上で結合可能なエ
ピトープ抗原決定基と結合する）； （ｂ２）上記四次構造タンパク質、上記第１の免疫学的
結合相手及び上記担体間で免疫複合体を形成させるため
に十分な時間及び条件において工程（ｂ１）の成分をイ
ンキュベートし； （ｂ３）上記試料から工程（ｂ２）の上記担体を分離し
； （ｂ４）工程（ｂ３）の上記担体に、検出可能に標識さ
れた第２の免疫学的結合相手を加え（上記第２の免疫学
的結合相手は上記四次構造タンパク質上で結合可能なエ
ピトープ抗原決定基と結合する）；及び （ｂ５）上記担体又は液相中における検出可能に標識さ
れた第２の免疫学的結合相手を測定する； ことからなる、特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、タンパク質サブユニットがβ−ｈＣＧで、完全な四
次構造タンパク質がｈＣＧである、特許請求の範囲第１
項〜第３項のいずれか一項に記載の方法。 ５、タンパク質サブユニットがα−ｈＣＧで、四次構造
タンパク質がｈＣＧである、特許請求の範囲第１項〜第
３項のいずれか一項に記載の方法。 ６、第１の免疫学的結合相手がモノクローナル抗体ＦＢ
Ｔ１１で、第２の免疫学的結合相手がＦＢＴ１０及びＨ
Ｔ１３からなる群より選択されるモノクローナル抗体で
ある、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、第１の免疫学的結合相手がモノクローナル抗体Ｃ８
で、第２の免疫学的結合相手がＦＢＴ１０及びＨＴ１３
からなる群より選択されるモノクローナル抗体である、
特許請求の範囲第３項記載の方法。 ８、第２の免疫学的結合相手がモノクローナル抗体Ｃ８
で、第１の免疫学的結合相手がＦＢＴ１０及びＨＴ１３
からなる群より選択されるモノクローナル抗体である、
特許請求の範囲第３項記載の方法。 ９、第１の免疫学的結合相手がモノクローナル抗体ＡＨ
Ｔ２０で、第２の免疫学的結合相手がモノクローナル抗
体ＨＴ１３である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０、第１の免疫学的結合相手及び第２の免疫学的結合
相手がモノクローナル抗体ＨＴ１３である、特許請求の
範囲第３項記載の方法。 １１、検出可能な標識が酵素である、特許請求の範囲第
１項〜第３項又は第３３項〜第３８項のいずれか一項に
記載の方法。 １２、酵素が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、スタフィロ
コッカスヌクレアーゼ、Δ−５−ステロイドイソメラー
ゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロー
ルリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラ
ーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファ
ターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、
β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ
、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナー
ゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼ
からなる群より選択される、特許請求の範囲第１１項記
載の方法。 １３、検出可能な標識が放射性同位体である、特許請求
の範囲第１項〜第３項又は第３３項〜第３８項のいずれ
か一項に記載の方法。 １４、同位体が、＾３Ｈ、＾１＾２＾５Ｉ、＾１＾３＾
１Ｉ、＾３＾２Ｐ、＾３＾５Ｓ、＾１＾４Ｃ、＾５＾１
Ｃｒ、＾３＾６Ｃｌ、＾５＾７Ｃｏ、＾５＾８Ｃｏ、＾
５＾９Ｆｅ、＾７＾５Ｓｅ及び＾１＾５＾２Ｅｕからな
る群より選択される、特許請求の範囲第１３項記載の方
法。 １５、検出可能な標識が蛍光化合物である、特許請求の
範囲第１項〜第３項又は第３３項〜第３８項のいずれか
一項に記載の方法。 １６、蛍光化合物が、イソチオシアン酸フルオレセイン
、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、ア
ロフィコシアニン、Ｏ−フタルアルデヒド及びフルオレ
スカミンからなる群より選択される、特許請求の範囲第
１５項記載の方法。 １７、検出可能な標識が化学ルミネセンス化合物である
、特許請求の範囲第１項〜第３項又は第３２項〜第３６
項のいずれか一項に記載の方法。 １８、化学ルミネセンス化合物が、ルミノール、イソル
ミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾー
ル、アクリジニウム塩及びシュウ酸エステルからなる群
より選択される、特許請求の範囲第１７項記載の方法。 １９、検出可能な標識が生物ルミネセンス化合物である
、特許請求の範囲第１項〜第３項又は第３３項〜第３８
項のいずれか一項に記載の方法。 ２０、生物ルミネセンス化合物が、ルシフェリン、ルシ
フェラーゼ及びエクオリンからなる群より選択される、
特許請求の範囲第１９項記載の方法。 ２１、試料中における四次構造タンパク質の第１の遊離
タンパク質サブユニットの検出のために使用されるキッ
トであって、 １以上の容器、即ち： （ａ）担体と結合しているか又は結合するであろう第１
の免疫学的結合相手を収容した第１容器（上記第１の免
疫学的結合相手は上記第１の遊離タンパク質サブユニッ
ト上でのみ結合可能なエピトープ抗原決定基と結合する
）；及び （ｂ）検出可能に標識された第２の免疫学的結合相手を
収容した第２容器（上記第２の免疫学的結合相手は上記
第１の遊離タンパク質サブユニット及び上記四次構造タ
ンパク質双方上の結合可能なエピトープ抗原決定基と結
合する）； を密閉収納するために仕切られた運搬体を含んでなるキ
ット。 ２２、第３の免疫学的結合相手を収容した第３容器（上
記第３の免疫学的結合相手は第２の遊離タンパク質サブ
ユニット上でのみ結合可能なエピトープ抗原決定基と結
合する）；及び 第４の免疫学的結合相手を収容した第４容器（上記第４
の免疫学的結合相手は第２の遊離タンパク質サブユニッ
ト及び四次構造タンパク質双方上の結合可能なエピトー
プ抗原決定基と結合する）； を更に収納した、特許請求の範囲第２１項記載のキット
。 ２３、第５の免疫学的結合相手を収容した第５容器（上
記第５の免疫学的結合相手は四次構造タンパク質上での
み結合可能なエピトープ抗原決定基と結合する）を更に
収納した、特許請求の範囲第２１項記載のキット。 ２４、第１の免疫学的結合相手がモノクローナル抗体Ｆ
ＢＴ１１で、第２の免疫学的結合相手がＦＢＴ１０及び
ＨＴ１３からなる群より選択されるモノクローナル抗体
である、特許請求の範囲第２１項記載のキット。 ２５、第３の免疫学的結合相手がモノクローナル抗体Ａ
ＨＴ２０で、第４の免疫学的結合相手がモノクローナル
抗体ＨＴ１３である、特許請求の範囲第２２項記載のキ
ット。 ２６、第５の免疫学的結合相手がモノクローナル抗体Ｃ
８である、特許請求の範囲第２３項記載のキット。 ２７、試料中の遊離β−ｈＣＧサブユニットの測定方法
であって、 （ａ）上記試料をモノクローナル抗体ＦＢＴ１１と接触
させ；及び （ｂ）上記抗体が上記遊離β−ｈＣＧサブユニットと結
合したか否かを測定する； ことからなる方法。 ２８、試料中の遊離α−ｈＣＧサブユニットの測定方法
であって、 （ａ）上記試料をモノクローナル抗体ＡＨＴ２０と接触
させ；及び （ｂ）上記抗体が上記遊離α−ｈＣＧサブユニットと結
合したか否かを測定する； ことからなる方法。 ２９、試料中のｈＣＧの測定方法であって、 （ａ）上記試料をＣ８及びＨＴ１３からなる群より選択
されるモノクローナル抗体と接触させ；及び （ｂ）上記抗体が上記ｈＣＧと結合したか否かを測定す
る； ことからなる方法。 ３０、（ａ）遊離β−ｈＣＧサブユニットをＦＢＴ１０
及びＨＴ１３からなる群より選択されるモノクローナル
抗体と接触させ；及び （ｂ）上記抗体が上記遊離β−ｈＣＧサブユニットと結
合したか否かを測定する； ことから更になる、特許請求の範囲第２７項記載の方法
。 ３１、（ａ）遊離α−ｈＣＧサブユニット をモノクローナル抗体ＨＴ１３と接触させ；及び（ｂ）
上記抗体が上記遊離α−ｈＣＧサブユニットと結合した
か否かを測定する； ことから更になる、特許請求の範囲第２８項記載の方法
。 ３２、（ａ）ｈＣＧをＦＢＴ１０及びＨＴ １３からなる群より選択されるモノクローナル抗体と接
触させ；及び （ｂ）上記抗体が上記ｈＣＧと結合したか否かを測定す
る； ことから更になる、特許請求の範囲第２９項記載の方法
。 ３３、モノクローナル抗体が検出可能に標識されている
、特許請求の範囲第２７項記載の方法。 ３４、モノクローナル抗体が検出可能に標識されている
、特許請求の範囲第２８項記載の方法。 ３５、モノクローナル抗体が検出可能に標識されている
、特許請求の範囲第２９項記載の方法。 ３６、モノクローナル抗体が検出可能に標識されている
、特許請求の範囲第３０項記載の方法。 ３７、モノクローナル抗体が検出可能に標識されている
、特許請求の範囲第３１項記載の方法。 ３８、モノクローナル抗体が検出可能に標識されている
、特許請求の範囲第３２項記載の方法。 ３９、Ｉ−４８８、Ｉ−４９９、Ｉ−４９０及びＩ−４
９１からなる群より選択される連続ハイブリドーマ細胞
系。 ４０、Ｉ−４８８、Ｉ−４８９、Ｉ−４９０及びＩ−４
９１からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞系か
ら産生されるモノクローナル抗体の特異性を有するモノ
クローナル抗体。 ４１、ＦＢＴ１０、ＦＢＴ１１、Ｃ８、ＡＨＴ２０及び
ＨＴ１３からなる群より選択されるハイブリドーマ細胞
系から産生されたモノクローナル抗体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US791114 | 1985-10-24 | ||
| US06/791,114 US4933275A (en) | 1985-10-24 | 1985-10-24 | Method for the detection of a polypeptide subunit in the presence of a quaternary protein containing the subunit |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62276461A true JPS62276461A (ja) | 1987-12-01 |
Family
ID=25152734
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61253552A Pending JPS62276461A (ja) | 1985-10-24 | 1986-10-24 | サブユニツト含有四次構造タンパク質の存在下におけるポリペプチドサブユニツトの検出方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4933275A (ja) |
| EP (1) | EP0219870A3 (ja) |
| JP (1) | JPS62276461A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2004537728A (ja) * | 2001-07-30 | 2004-12-16 | クエスト ダイアグノスティクス インヴェストメンツ インコーポレイテッド | 妊娠検出方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US6627404B1 (en) * | 1995-04-18 | 2003-09-30 | Biosite, Inc. | Methods for improving the recovery of troponin I and T in membranes, filters and vessels |
| US6991907B1 (en) | 1995-04-18 | 2006-01-31 | Biosite, Inc. | Methods for the assay of troponin I and T and complexes of troponin I and T and selection of antibodies for use in immunoassays |
| US5795725A (en) * | 1995-04-18 | 1998-08-18 | Biosite Diagnostics Incorporated | Methods for the assay of troponin I and T and selection of antibodies for use in immunoassays |
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