JPH09274039A - 免疫学的手法を利用した診断装置 - Google Patents
免疫学的手法を利用した診断装置Info
- Publication number
- JPH09274039A JPH09274039A JP8126696A JP8126696A JPH09274039A JP H09274039 A JPH09274039 A JP H09274039A JP 8126696 A JP8126696 A JP 8126696A JP 8126696 A JP8126696 A JP 8126696A JP H09274039 A JPH09274039 A JP H09274039A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- sample
- labeled
- hcg
- absence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 簡便に検出対象物の有無を判定することが可
能な診断キットの提供。 【解決手段】 標識あるいは未標識抗体を含浸させた部
材とその下部に反応体と未反応体を物理的に分別するフィ
ルタ部材を備えている。
能な診断キットの提供。 【解決手段】 標識あるいは未標識抗体を含浸させた部
材とその下部に反応体と未反応体を物理的に分別するフィ
ルタ部材を備えている。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、蛋白質を初めとす
る生体機能性物質の診断に関するものである。この診断
装置は体液中に分泌する物質を検出する手段として利用
することができ、特に医療の分野に有用である。
る生体機能性物質の診断に関するものである。この診断
装置は体液中に分泌する物質を検出する手段として利用
することができ、特に医療の分野に有用である。
【０００２】
【従来の技術】これまでに、抗体を利用して非検出物質
を検出する方法として酵素免疫測定法、ラッテクス凝集法ある
いはサント゛イッチ法を利用した免疫クロマトク゛ラフィなどの方法があ
る。特に近年よく利用される方法は、サント゛イッチ法を利用し
た免疫クロマトク゛ラフィであり、他の方法に比べて簡便的に検出
することができる。この方法は、少なくとも2種類の抗体
を利用して一方の抗体は液相中で移動可能で標識されて
いる。他方はクロマト担体に永久的に固定化されている。試
料を添加するとまず標識された抗体と試料が反応し、そ
の後結合物の状態でクロマト担体中を移動し、固定化部に来
るとそこでトラッフ゜される。この方法については、多くの特
許出願がされており、一例を挙げると、 ユニリーハ゛出願（特
開平5-150881、平5-150882、 平2-503925）、アホ゛ット出願
（特開昭62-242872） 、ハイフ゛リテック出願（特開昭60-502364
）あるいは ヘ゛ーリンク゛ウ゛ェルケ出願（特開昭60-279418）が
ある。
を検出する方法として酵素免疫測定法、ラッテクス凝集法ある
いはサント゛イッチ法を利用した免疫クロマトク゛ラフィなどの方法があ
る。特に近年よく利用される方法は、サント゛イッチ法を利用し
た免疫クロマトク゛ラフィであり、他の方法に比べて簡便的に検出
することができる。この方法は、少なくとも2種類の抗体
を利用して一方の抗体は液相中で移動可能で標識されて
いる。他方はクロマト担体に永久的に固定化されている。試
料を添加するとまず標識された抗体と試料が反応し、そ
の後結合物の状態でクロマト担体中を移動し、固定化部に来
るとそこでトラッフ゜される。この方法については、多くの特
許出願がされており、一例を挙げると、 ユニリーハ゛出願（特
開平5-150881、平5-150882、 平2-503925）、アホ゛ット出願
（特開昭62-242872） 、ハイフ゛リテック出願（特開昭60-502364
）あるいは ヘ゛ーリンク゛ウ゛ェルケ出願（特開昭60-279418）が
ある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】従来の方法では、hCGを
はじめとする検出対象物を検出する際に、サンドイッチ
法という手法を利用している。この手法は、少なくとも
２種類以上のモノクローナル抗体が必要であるとともにその組
み合わせが重要である。また、ホ゜リクローナル抗体を使用する
場合にはその他に１種類以上のモノクローナル抗体が必要であ
るとともにその組み合わせも重要である。このような組
み合わせを選定するためには、一般的には酵素免疫測定
法（ELISA）を利用して行うが、よい組み合わせが見つ
からない場合、再度抗体を作製することから始めなけれ
ばならない欠点があった。
はじめとする検出対象物を検出する際に、サンドイッチ
法という手法を利用している。この手法は、少なくとも
２種類以上のモノクローナル抗体が必要であるとともにその組
み合わせが重要である。また、ホ゜リクローナル抗体を使用する
場合にはその他に１種類以上のモノクローナル抗体が必要であ
るとともにその組み合わせも重要である。このような組
み合わせを選定するためには、一般的には酵素免疫測定
法（ELISA）を利用して行うが、よい組み合わせが見つ
からない場合、再度抗体を作製することから始めなけれ
ばならない欠点があった。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明は、液体中に存在
する試料（hCGを初めとする測定対象物）と、その試料に
対して免疫学的に結合する抗体あるいは、その試料に対
して免疫学的に結合しかつ標識した抗体とを反応させた
後、その反応物と未反応物を物理的大きさにより分ける
ためのフィルタを備えており、試料の有無を検知あるいは定
量的に測定することを特徴とする診断キットであり、この
ような測定原理により１種類のホ゜リクローナル抗体あるいは２
種類以上のモノクローナル抗体が存在すれば、その検出対象物
を検出することができる。このことにより、抗体の組み
合わせという煩雑な選定手段を講じることなく検出対象
物である試料を検出することができる。
する試料（hCGを初めとする測定対象物）と、その試料に
対して免疫学的に結合する抗体あるいは、その試料に対
して免疫学的に結合しかつ標識した抗体とを反応させた
後、その反応物と未反応物を物理的大きさにより分ける
ためのフィルタを備えており、試料の有無を検知あるいは定
量的に測定することを特徴とする診断キットであり、この
ような測定原理により１種類のホ゜リクローナル抗体あるいは２
種類以上のモノクローナル抗体が存在すれば、その検出対象物
を検出することができる。このことにより、抗体の組み
合わせという煩雑な選定手段を講じることなく検出対象
物である試料を検出することができる。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明による診断キットを利用する
ことにより、得られた抗体の組み合わせを選定すること
なく、hCGを初めとする測定対象物の診断キットを得ること
が可能となる。
ことにより、得られた抗体の組み合わせを選定すること
なく、hCGを初めとする測定対象物の診断キットを得ること
が可能となる。
【０００６】２種類のモノクローナル抗体あるいは１種類のホ゜リ
クローナル抗体及び、10nm以上のホ゜アサイス゛を有するフィルタ、好ま
しくは着色されているフィルタを利用して、図１に示した構
成の診断キットによりhCG、CRP、LH、GH、IgG、CEA、αFP、LDH、FS
H、TSH、LH-RHを検出できる。
クローナル抗体及び、10nm以上のホ゜アサイス゛を有するフィルタ、好ま
しくは着色されているフィルタを利用して、図１に示した構
成の診断キットによりhCG、CRP、LH、GH、IgG、CEA、αFP、LDH、FS
H、TSH、LH-RHを検出できる。
【０００７】さらに、図２に示したように未反応物を含
む溶液を積極的に除去吸収するための部材を導入した診
断キットによりhCG、CRP、LH、GH、IgG、CEA、αFP、LDH、FSH、TSH、
LH-RHを検出できる。
む溶液を積極的に除去吸収するための部材を導入した診
断キットによりhCG、CRP、LH、GH、IgG、CEA、αFP、LDH、FSH、TSH、
LH-RHを検出できる。
【０００８】また、標識した抗体、特に好ましくは色素
あるいは酵素標識された抗体を用いることによりフィルタの
色に関係なく高感度に検出することができる。特に、妊
娠診断のマーカとして利用されている人絨毛性性腺刺激ホ
ルモンを検出するための診断キットは重要であり、以下に
一実施例として詳細に記述する。
あるいは酵素標識された抗体を用いることによりフィルタの
色に関係なく高感度に検出することができる。特に、妊
娠診断のマーカとして利用されている人絨毛性性腺刺激ホ
ルモンを検出するための診断キットは重要であり、以下に
一実施例として詳細に記述する。
【０００９】〔抗体の作製〕 （免疫）精製hCG（純度:98%以上、SDS電気泳動検定）をP
BSを用いて2mg/mlに調整し、これに同体積のアシ゛ュハ゛ント（ヒ
ト結核死菌含有完全フロイントアシ゛ュハ゛ント、和光純薬製、H37Rv）
を添加し、よくホモシ゛ュナイサ゛（1000rpm）で乳化した。 生後
約8週のマウス（A/J）20匹に免疫原を含むアシ゛ュハ゛ントエマルシ゛ョン
を100μLずつ注射した。3週間後、2mg/mlhCG溶液と同体
積の不完全フロイントアシ゛ュハ゛ントをホモシ゛ュナイサ゛で乳化し、このエマル
シ゛ョンをA/Jマウスに100μlずつ注射した。
BSを用いて2mg/mlに調整し、これに同体積のアシ゛ュハ゛ント（ヒ
ト結核死菌含有完全フロイントアシ゛ュハ゛ント、和光純薬製、H37Rv）
を添加し、よくホモシ゛ュナイサ゛（1000rpm）で乳化した。 生後
約8週のマウス（A/J）20匹に免疫原を含むアシ゛ュハ゛ントエマルシ゛ョン
を100μLずつ注射した。3週間後、2mg/mlhCG溶液と同体
積の不完全フロイントアシ゛ュハ゛ントをホモシ゛ュナイサ゛で乳化し、このエマル
シ゛ョンをA/Jマウスに100μlずつ注射した。
【００１０】その後、6、9、12週間後に再度hCGを含む不完
全フロイントアシ゛ュハ゛ントエマルシ゛ョンをマウスに100μlずつ注射した。
注射後、1週間目に採血し、以下に示す抗体産生を確認し
た。
全フロイントアシ゛ュハ゛ントエマルシ゛ョンをマウスに100μlずつ注射した。
注射後、1週間目に採血し、以下に示す抗体産生を確認し
た。
【００１１】（抗体産生の確認）採取した血清を、以下
に示す酵素免疫測定法（ELISA）で抗体産生の確認をし
た。固相として2.5μg/mlに0.1mg/mlBSA・PBS・Azで調整
したhCGを100μl/ウェルずつ使用した。
に示す酵素免疫測定法（ELISA）で抗体産生の確認をし
た。固相として2.5μg/mlに0.1mg/mlBSA・PBS・Azで調整
したhCGを100μl/ウェルずつ使用した。
【００１２】第二抗体としてヘ゜ルオキシタ゛ーセ゛標識抗マウスIgG
抗体あるいはヘ゜ルオキシタ゛ーセ゛標識抗マウスIgM抗体を使用し
た。
抗体あるいはヘ゜ルオキシタ゛ーセ゛標識抗マウスIgM抗体を使用し
た。
【００１３】その結果、すべてのマウスにおいて抗hCG抗体
の産生が認めらるとともに、IgG/IgM比が100以上ありクラス
スイッチが起こっていること確認した。
の産生が認めらるとともに、IgG/IgM比が100以上ありクラス
スイッチが起こっていること確認した。
【００１４】（細胞融合）免疫したマウスの中、特に力価の
高かった2匹についてマウスの脾臓を肥大させるために、フ゛ー
スト（弱い免疫原の注射）した。免疫原は、1mg/mLhCG溶液
をアシ゛ュハ゛ントを加えずにそのまま用いた。
高かった2匹についてマウスの脾臓を肥大させるために、フ゛ー
スト（弱い免疫原の注射）した。免疫原は、1mg/mLhCG溶液
をアシ゛ュハ゛ントを加えずにそのまま用いた。
【００１５】フ゛ースト後3日を経過したマウスの脾臓細胞を摘
出し、平均分子量1,500のホ゜リエチレンク゛リコールを用いた常法に
より、マウス骨髄腫由来細胞ライン（P3X63-Ag8.653）と融合し
た。フィータ゛ー（成長因子を供給する細胞）として同じマウス
の脾臓細胞を用い、96ウェルフ゜レート2枚の上で15%のウシ胎児血
清（以下、FCS）を含むイシコフ培地で1日間培養した後（100
μl/ウェル）、2倍濃度のHAT培地を100μl/ウェル添加してCO2イ
ンキュヘ゛ータ（CO2濃度:5%、温度:37℃、湿度:95%）内で1週間
培養した。その後、培養上清を除いた後、15%のFCSを含む
HT培地（250μl/ウェル）と交換した。
出し、平均分子量1,500のホ゜リエチレンク゛リコールを用いた常法に
より、マウス骨髄腫由来細胞ライン（P3X63-Ag8.653）と融合し
た。フィータ゛ー（成長因子を供給する細胞）として同じマウス
の脾臓細胞を用い、96ウェルフ゜レート2枚の上で15%のウシ胎児血
清（以下、FCS）を含むイシコフ培地で1日間培養した後（100
μl/ウェル）、2倍濃度のHAT培地を100μl/ウェル添加してCO2イ
ンキュヘ゛ータ（CO2濃度:5%、温度:37℃、湿度:95%）内で1週間
培養した。その後、培養上清を除いた後、15%のFCSを含む
HT培地（250μl/ウェル）と交換した。
【００１６】（細胞選別）HT培地と交換1週間後、培養上
清を200μl/ウェルずつ取り出した。15%のFCSを含むHT培地
（200μl/ウェル）を添加し、3日間培養し後培養上清を200
μl/ウェルずつ取り出した。合計で培養上清を400μl/ウェル
を得ることができた。
清を200μl/ウェルずつ取り出した。15%のFCSを含むHT培地
（200μl/ウェル）を添加し、3日間培養し後培養上清を200
μl/ウェルずつ取り出した。合計で培養上清を400μl/ウェル
を得ることができた。
【００１７】この培養上清を用いて以下に示すELISA法
によりhCG、hCG-α、hCG-β に対する結合能を測定した。
によりhCG、hCG-α、hCG-β に対する結合能を測定した。
【００１８】固相として2.5μg/mlに0.1mg/mlBSA・PBS・A
zで調整したhCG、hCG-α、hCG-β を100μl/ウェルずつ使用
した。抗体液として細胞培養上清を使用した。
zで調整したhCG、hCG-α、hCG-β を100μl/ウェルずつ使用
した。抗体液として細胞培養上清を使用した。
【００１９】この結果、hCG、hCG-α に対してのみ結合能
を示したものは2ウェルあり、hCGおよびhCG-βに対してのみ
結合能を示したものも2ウェルあった。また、すべてのホルモン
に対して結合能を示したものは、4ウェルあった。
を示したものは2ウェルあり、hCGおよびhCG-βに対してのみ
結合能を示したものも2ウェルあった。また、すべてのホルモン
に対して結合能を示したものは、4ウェルあった。
【００２０】（クローニンク゛）上記8ウェルの細胞についてウェルあ
たり1ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、96ウ
ェルのマイクロフ゜レート8枚に分注した。フィータ゛ーとして生後5週のマ
ウス（Balb/c）の胸線細胞を用いて初期増殖を促した。フ゜
レートのサイス゛を上げながら培養を進め、適時上清についてEL
ISA法によるスクリーニンク゛を繰り返し、hCGに対して高い力価
を示し、かつ良好な増殖を示している細胞ラインを最終的に
選別し、200ml中で5x105 細胞/mLの濃度に至るまで培養
を進めた。
たり1ケの細胞が含まれる濃度に希釈（限界希釈）し、96ウ
ェルのマイクロフ゜レート8枚に分注した。フィータ゛ーとして生後5週のマ
ウス（Balb/c）の胸線細胞を用いて初期増殖を促した。フ゜
レートのサイス゛を上げながら培養を進め、適時上清についてEL
ISA法によるスクリーニンク゛を繰り返し、hCGに対して高い力価
を示し、かつ良好な増殖を示している細胞ラインを最終的に
選別し、200ml中で5x105 細胞/mLの濃度に至るまで培養
を進めた。
【００２１】その結果、hCG、hCG-α に対してのみ結合能
を示し、かつhCGに対して親和性の高かった1株、およびhC
GおよびhCG-βに対してのみ結合能を示し、かつhCGに対
して親和性の高かった1株を選定した。
を示し、かつhCGに対して親和性の高かった1株、およびhC
GおよびhCG-βに対してのみ結合能を示し、かつhCGに対
して親和性の高かった1株を選定した。
【００２２】（細胞の保存）最終的に選別された細胞ライ
ンは、上清を遠心分離し、5×106 細胞/mLの濃度でFCS:シ゛メ
チルスルフォキシト゛=9:1の溶液1mLに浮遊させ、ー80℃で凍結した
後、-135℃に移して長期保存状態にした。
ンは、上清を遠心分離し、5×106 細胞/mLの濃度でFCS:シ゛メ
チルスルフォキシト゛=9:1の溶液1mLに浮遊させ、ー80℃で凍結した
後、-135℃に移して長期保存状態にした。
【００２３】（抗体の精製）選んだ2株について大量培
養を行い、その上清を遠心分離より単離した。各株の細
胞培養上清についてフ゜ロティンA結合ケ゛ル（フ゜ロティンAセファロース CL
-4B、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトク゛ラフィにより細胞培
養上清から各モノクローナル抗体を精製した。このモノクローナル抗体
はSDSホ゜リアクリルアミト゛ケ゛ル電気泳動により、標準蛋白との比較
から、精製抗体は分子量約50,000のH鎖と約25,000のL鎖
からなるIgGであることを確認した。
養を行い、その上清を遠心分離より単離した。各株の細
胞培養上清についてフ゜ロティンA結合ケ゛ル（フ゜ロティンAセファロース CL
-4B、ファルマシア製）を用いたアフィニティークロマトク゛ラフィにより細胞培
養上清から各モノクローナル抗体を精製した。このモノクローナル抗体
はSDSホ゜リアクリルアミト゛ケ゛ル電気泳動により、標準蛋白との比較
から、精製抗体は分子量約50,000のH鎖と約25,000のL鎖
からなるIgGであることを確認した。
【００２４】（抗体の評価）上記のアフィニティクロマトにより精
製した2種類のモノクローナル抗体について以下に示すELISA法
で抗体評価を行った。
製した2種類のモノクローナル抗体について以下に示すELISA法
で抗体評価を行った。
【００２５】その結果、hCG、hCG-α に対してのみ結合能
を示した1株（細胞ライン名:MN-α1）についてhCGに対する
結合能力を測定した。hCGおよびhCG-βに対してのみ結
合能を示した1株（細胞ライン名:MN-β3）についてhCGに対
する結合能力を測定した。
を示した1株（細胞ライン名:MN-α1）についてhCGに対する
結合能力を測定した。hCGおよびhCG-βに対してのみ結
合能を示した1株（細胞ライン名:MN-β3）についてhCGに対
する結合能力を測定した。
【００２６】MN-α1では、10-9Mより高い濃度のhCGを検
出することができた。また、MN-β3でも、10-9Mより高い
濃度のhCGを検出することができた。
出することができた。また、MN-β3でも、10-9Mより高い
濃度のhCGを検出することができた。
【００２７】また、ここではテ゛ータを示さないが、各細胞ライ
ンについて再度各ホルモンに対する結合能を測定したところ、
MN-α1についてはhCG、hCG-α に対して結合能を示し
た。一方、、MN-β3についてはhCGおよびhCG-βに対して
結合能を示し、hCG-α に対しては結合能を示さなかっ
た。
ンについて再度各ホルモンに対する結合能を測定したところ、
MN-α1についてはhCG、hCG-α に対して結合能を示し
た。一方、、MN-β3についてはhCGおよびhCG-βに対して
結合能を示し、hCG-α に対しては結合能を示さなかっ
た。
【００２８】（酵素免疫測定法（ELISA法））得られた
抗血清、培養上清およびモノクローナル抗体の評価をした。その
操作法を以下に記載する。
抗血清、培養上清およびモノクローナル抗体の評価をした。その
操作法を以下に記載する。
【００２９】（A）抗原のコーティンク゛ 2.5μg/mlになるようにhCG、hCG-α、hCG-βを0.1mg/mlBS
A・PBS・Azで調整した。マイクロフ゜レート（塩化ヒ゛ニル製96ウェルフ゜レー
ト コスター社製）に抗原溶液を100μL/ウェル注入し、20℃で1夜
保存した。アスヒ゜レータで抗原溶液を除去した。
A・PBS・Azで調整した。マイクロフ゜レート（塩化ヒ゛ニル製96ウェルフ゜レー
ト コスター社製）に抗原溶液を100μL/ウェル注入し、20℃で1夜
保存した。アスヒ゜レータで抗原溶液を除去した。
【００３０】（B）フ゛ロッキンク゛ BSA・PBS・Azを250μL/ウェル注入し、30分間室温で放置し
た。その後、アスヒ゜レータでBSA・PBS・Azを除去した。即日に以
降の実験を行わないときは、この状態で、水で湿したろ紙
と共に4℃で保存した。
た。その後、アスヒ゜レータでBSA・PBS・Azを除去した。即日に以
降の実験を行わないときは、この状態で、水で湿したろ紙
と共に4℃で保存した。
【００３１】（C）抗体の反応 1%BSA・PBS・Azで種々の希釈率に希釈した抗体溶液（抗血
清、培養上清、精製抗体等）50μL/ウェルおよび1%BSA・PBS・A
z50μL/ウェルを注入した。相対的な親和性を測定する目的
でインヒヒ゛ションの実験を行うときはインヒヒ゛タ溶液（hCG、hCG-
α、hCG-β）50μL/ウェルを注入し、振とうしながら抗体溶
液50μL/ウェルをさらに加えた。常温で3時間保存した後、ア
スヒ゜レータで抗体溶液を除去し、PBSで3回洗浄し、アスヒ゜レータで
残存するPBSを除去した。
清、培養上清、精製抗体等）50μL/ウェルおよび1%BSA・PBS・A
z50μL/ウェルを注入した。相対的な親和性を測定する目的
でインヒヒ゛ションの実験を行うときはインヒヒ゛タ溶液（hCG、hCG-
α、hCG-β）50μL/ウェルを注入し、振とうしながら抗体溶
液50μL/ウェルをさらに加えた。常温で3時間保存した後、ア
スヒ゜レータで抗体溶液を除去し、PBSで3回洗浄し、アスヒ゜レータで
残存するPBSを除去した。
【００３２】（D）第2抗体の反応 0.2μg/mLのヘ゜ルオキシタ゛ーセ゛標識抗マウスIgG抗体ヤキ゛由来（KPL
社製）を1%BSAのPBS溶液に溶解したもの、あるいは0.2μ
g/mLのヘ゜ルオキシタ゛ーセ゛標識抗マウスIgM抗体ヤキ゛由来（KPL社
製）を1%BSAのPBS溶液に溶解したもの50μL/ウェルを注入
し、常温で30分放置した。アスヒ゜レータで除去し、PBSで3回洗
浄し、さらにアスヒ゜レータで残存するPBSを除去した。
社製）を1%BSAのPBS溶液に溶解したもの、あるいは0.2μ
g/mLのヘ゜ルオキシタ゛ーセ゛標識抗マウスIgM抗体ヤキ゛由来（KPL社
製）を1%BSAのPBS溶液に溶解したもの50μL/ウェルを注入
し、常温で30分放置した。アスヒ゜レータで除去し、PBSで3回洗
浄し、さらにアスヒ゜レータで残存するPBSを除去した。
【００３３】（E）基質の反応と停止 o-フェニレンシ゛アミン（生化学用）40mgを10mLのクエン酸-リン酸ハ゛ッフ
ァー（pH5）に溶解し、使用直前に30%過酸化水素水4μLを
加えた溶液（基質溶液）を100μL/ウェル注入し、室温放置
した。10分後、4N硫酸を25μL/ウェル注入して反応を停止し
た。
ァー（pH5）に溶解し、使用直前に30%過酸化水素水4μLを
加えた溶液（基質溶液）を100μL/ウェル注入し、室温放置
した。10分後、4N硫酸を25μL/ウェル注入して反応を停止し
た。
【００３４】（F）測定 東洋ソータ゛マイクロフ゜レートリータ゛を用いて492nm以上の吸光度を測
定した。通常第1列は純水を注入して参照値とし、適時
（C）項のみを省いたフ゛ランク値を使用した。
定した。通常第1列は純水を注入して参照値とし、適時
（C）項のみを省いたフ゛ランク値を使用した。
【００３５】〔hCG抗体のタ゛ンシル標識〕得られた２種類の
抗hCGモノクローナル抗体のそれぞれ500mg（0.0076mmol）ずつ
を20ｍｌのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しながら390ｍ
ｇ（0.38mmol）のタ゛ンシルクロライト゛のＰＢＳ溶液１ｍｌを滴
下した。室温で10分間撹拌した後、４度で一晩放置し
た。反応液をゲル濾過（Ｇ−２５Ｍカラム、展開液：Ｐ
ＢＳ）して40mlの抗体溶液を得た。この標識抗体溶液を
ガラス繊維濾紙に含浸させ、凍結乾燥した。
抗hCGモノクローナル抗体のそれぞれ500mg（0.0076mmol）ずつ
を20ｍｌのＰＢＳに溶解し、室温で撹拌しながら390ｍ
ｇ（0.38mmol）のタ゛ンシルクロライト゛のＰＢＳ溶液１ｍｌを滴
下した。室温で10分間撹拌した後、４度で一晩放置し
た。反応液をゲル濾過（Ｇ−２５Ｍカラム、展開液：Ｐ
ＢＳ）して40mlの抗体溶液を得た。この標識抗体溶液を
ガラス繊維濾紙に含浸させ、凍結乾燥した。
【００３６】〔ニトロセルロースフィルタの処理〕ニトロセルロースフィルタ（S&
S社製、ホ゜アサイス゛1μm）を1%BSA・PBS溶液に３０分間浸潤
する。その後、水分をよく切り、蒸留水100ｍｌで振と
うさせながら洗浄する。この操作をさらに2回繰り返
す。その後、室温下で乾燥し、湿度35%以下で１時間放
置する。このニトロセルロースフィルタは、湿度35%以下で遮光状態
で保存することにより少なくとも3カ月は使用すること
ができる。
S社製、ホ゜アサイス゛1μm）を1%BSA・PBS溶液に３０分間浸潤
する。その後、水分をよく切り、蒸留水100ｍｌで振と
うさせながら洗浄する。この操作をさらに2回繰り返
す。その後、室温下で乾燥し、湿度35%以下で１時間放
置する。このニトロセルロースフィルタは、湿度35%以下で遮光状態
で保存することにより少なくとも3カ月は使用すること
ができる。
【００３７】〔診断キットの作製〕診断キットは、図3の構成
をしている。上記の標識抗体含浸濾紙1の下部にホ゜アサイス゛
1μmのニトロセルロースフィルタ2を置く。さらにその下部に未反応
物を吸水除去するための吸水部材3を設置する。これら1
〜3の部材は、容器4の中に装着されている。また、標識
抗体含浸濾紙1は、左右に移動可能である。
をしている。上記の標識抗体含浸濾紙1の下部にホ゜アサイス゛
1μmのニトロセルロースフィルタ2を置く。さらにその下部に未反応
物を吸水除去するための吸水部材3を設置する。これら1
〜3の部材は、容器4の中に装着されている。また、標識
抗体含浸濾紙1は、左右に移動可能である。
【００３８】〔人絨毛性性腺刺激ホルモンの測定〕図3に示
した診断キットの上部より測定対象物であるhCG水溶液500
μl（濃度40000IU/L）を添加した。約3分後、標識抗体
含浸濾紙をスライト゛させてニトロセルロースフィルタを露出した。その
結果、ニトロセルロースフィルタ表面は、黄色になっていた。一方、
hCGを含まない水溶液500μlを添加した後、同様に含浸
濾紙をスライドさせた。その結果、ニトロセルロースフィルタ表面
は、白色のままであった。
した診断キットの上部より測定対象物であるhCG水溶液500
μl（濃度40000IU/L）を添加した。約3分後、標識抗体
含浸濾紙をスライト゛させてニトロセルロースフィルタを露出した。その
結果、ニトロセルロースフィルタ表面は、黄色になっていた。一方、
hCGを含まない水溶液500μlを添加した後、同様に含浸
濾紙をスライドさせた。その結果、ニトロセルロースフィルタ表面
は、白色のままであった。
【００３９】
【発明の効果】以上のように本発明は、得られた抗体を
効率よく診断キットに導入する方法を提供する。
効率よく診断キットに導入する方法を提供する。
【００４０】また、簡便に検出対象物の有無を判定する
ことが可能となる。
ことが可能となる。
【図1】本発明の一実施例における診断キットの構成を示す
図
図
【図2】本発明の一実施例における診断キットの構成を示す
図
図
【図3】本発明の一実施例における人絨毛性性腺刺激ホ
ルモンの診断キットの構成を示す図
ルモンの診断キットの構成を示す図
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/545 Ｇ０１Ｎ 33/545 Ｂ 33/68 33/68 // Ｇ０１Ｎ 33/577 33/577 Ａ
Claims (9)
- 【請求項１】 液体中に存在する試料と、前記試料に対
して免疫学的に結合する抗体あるいは、前記試料に対し
て免疫学的に結合しかつ標識した抗体とを反応させた
後、その反応物と未反応物を物理的大きさにより分ける
ためのフィルタを備えており、前記試料の有無を検知あるい
は定量的に測定することを特徴とする診断装置。 - 【請求項２】 液体中に存在する試料と、前記試料に対
して免疫学的に結合する抗体あるいは、前記試料に対し
て免疫学的に結合しかつ標識した抗体とを反応させた
後、その反応物と未反応物を物理的大きさにより試料の
有無を検知あるいは定量的に測定する診断装置であっ
て、反応物を保持することにより試料の有無を検知でき
る部材と未反応物を含む溶液を吸収するための部材から
なることを特徴とする診断装置。 - 【請求項３】 液体中に存在する試料と、その試料に対
して免疫学的に結合する抗体あるいは、その試料に対し
て免疫学的に結合しかつ標識した抗体とを反応させた
後、その反応物と未反応物を物理的大きさにより試料の
有無を検知あるいは定量的に測定する診断キットであって、
抗体あるいは標識した抗体を乾燥状態で含んでいる部材
と反応物を保持することにより試料の有無を検知できる
部材と未反応物を含む溶液を吸収するための部材からな
ることを特徴とする診断装置。 - 【請求項４】 試料が、生体機能物質である蛋白質、ヘ゜フ゜
チト゛、核酸、多糖あるいは脂質であることを特徴とする請
求項１、２または３記載の診断装置。 - 【請求項５】 抗体がモノクローナル抗体、ホ゜リクローナル抗体、キメラ抗
体あるいはこれら抗体を酵素処理したものであることを
特徴とする請求項１、２または３記載の診断装置。 - 【請求項６】 標識が、酵素、蛍光物質、色素、染色ケ゛ル、金
属コロイト゛、金属酸化物コロイト゛あるいはラテックスをはじめとする
粒状ホ゜リマであることを特徴とする請求項１、２または３
記載の診断装置。 - 【請求項７】 フィルタが、10nm以上10μm以下の孔径を有す
ることを特徴とする請求項１、２または３記載の診断装
置。 - 【請求項８】 試料となる蛋白質が、hCG、CRP、LH、GH、Ig
G、CEA、αFP、LDH、FSH、TSH、LH-RHであることを特徴とする
請求項1記載の診断装置。 - 【請求項９】 体液中に存在する絨毛性性腺刺激ホルモン
と、その絨毛性性腺刺激ホルモンに対して免疫学的に結合す
る抗体あるいは、その絨毛性性腺刺激ホルモンに対して免疫
学的に結合しかつ標識した抗体とを反応させた後、その
反応物と未反応物を物理的大きさにより試料の有無を検
知あるいは定量的に測定する診断キットであっ、抗体あるい
は標識した抗体を乾燥状態で含んでいる部材と反応物を
保持することにより絨毛性性腺刺激ホルモンの有無を可視的
に検知できる部材と未反応物を含む溶液を吸収するため
の部材からなることを特徴とする妊娠診断装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8126696A JPH09274039A (ja) | 1996-04-03 | 1996-04-03 | 免疫学的手法を利用した診断装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8126696A JPH09274039A (ja) | 1996-04-03 | 1996-04-03 | 免疫学的手法を利用した診断装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09274039A true JPH09274039A (ja) | 1997-10-21 |
Family
ID=13741567
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8126696A Pending JPH09274039A (ja) | 1996-04-03 | 1996-04-03 | 免疫学的手法を利用した診断装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH09274039A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6753189B1 (en) | 1998-06-04 | 2004-06-22 | Mizuho Medy Co., Ltd. | Detection apparatus and method for the same |
| WO2004086036A1 (ja) * | 2003-03-25 | 2004-10-07 | The Circle For The Promotion Of Science And Engineering | Ａｂｃタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法 |
-
1996
- 1996-04-03 JP JP8126696A patent/JPH09274039A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6753189B1 (en) | 1998-06-04 | 2004-06-22 | Mizuho Medy Co., Ltd. | Detection apparatus and method for the same |
| WO2004086036A1 (ja) * | 2003-03-25 | 2004-10-07 | The Circle For The Promotion Of Science And Engineering | Ａｂｃタンパク質と相互作用する物質のスクリーニング方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4228237A (en) | Methods for the detection and determination of ligands | |
| US5086002A (en) | Erythrocyte agglutination assay | |
| US4343896A (en) | Method and test pack for the demonstration and determination of an antigen or antibody | |
| JP3958797B2 (ja) | 抗原特異的ＩｇＭ検出 | |
| US4828985A (en) | Antibodies against the complex of a small molecule and its binding protein, their preparation and their use in diagnostic methods | |
| US4894347A (en) | Erythrocyte agglutination assay | |
| JPH05264553A (ja) | ヘリコバクターピロリ検出用の抗原調製物 | |
| JPH06258325A (ja) | 異なる２又は３種類のモノクローナル抗体を使用する 抗原測定法及び該モノクローナル抗体を利用した試験 キット | |
| US4513088A (en) | Assay for monoclonal antibody against surface Ig of a human B cell tumor | |
| JPS6120867A (ja) | 抗体‐レクチンのサンドイツチ検定 | |
| US6686169B2 (en) | Reagent for the detection of Staphylococcus aureus by agglutination | |
| US4933275A (en) | Method for the detection of a polypeptide subunit in the presence of a quaternary protein containing the subunit | |
| US5472696A (en) | Antigen of group B streptococci | |
| Wistar Jr | Immunoglobulin allotype in the rat: localization of the specificity to the light chain | |
| JP2736058B2 (ja) | 免疫検定用器具の製造方法 | |
| US5064755A (en) | Two-site confirmatory assay | |
| US7179611B2 (en) | Mono-specific polyclonal antibodies and methods for detecting Clostridium difficile Toxin A | |
| JPH09274039A (ja) | 免疫学的手法を利用した診断装置 | |
| JP2553159B2 (ja) | 赤血球凝集アッセイ | |
| EP0485377B1 (en) | Solid phase immuno-assay with labelled conjugate | |
| AU9239498A (en) | Method for immunological assay | |
| JP2000214165A (ja) | 均一系酵素免疫分析方法 | |
| WO2000073347A1 (en) | Diagnostic monoclonal antibody for yersinia pestis | |
| Takatori et al. | Lewis typing of human bloodstains by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) using monoclonal anti-Lea and anti-Leb | |
| JP2002209579A (ja) | 抗ヒトヘモグロビンモノクローナル抗体、およびそれを産生する細胞株またはそれを含むヒトヘモグロビン検出用キット |