JPH02503059A - 抗グリコシルアルブミンモノクロナル抗体とそれらの抗体を産生するハイブリッド細胞株、およびその使用 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 抗グリコジルアルブミンモノクロナル抗体とそれらの抗体を産生ずるハイブリッ ド細胞株、およびその使用 この発明は、抗グリコジルアルブミンモノクロナル抗体、これらの抗体を産生ず るハイブリッド細胞株、およびこれらのモノクローナル抗体の使用方法に関する 。

一般の血中グルコースレベルの定期的測定は、真性糖尿病のコントロールを確豆 、維持するのに不可欠である。

糖尿病コントロールの頼みの綱は血中グルコース濃度と、ある種の血中（ｃｉｒ ｃｓｌａｔｉｎｇ）タンパク質が非酵素的にグリコジル化される程度、の測定で ある。非酵素的グリコジル化の量を測定するのに有効であることがわかっている 主要タンパク質はヘモグロビンとアルブミンである。

グルコシルアルブミンは、体内でグルコースと、血清中の主なタンパク質である アルブミン間の反応で作られる。グルコシル化されるアルブミンの量に影響する 主たる因子は、血中のグルコース濃度である。かくして糖尿病が５まくコントロ ールされていない糖尿病患者におけるように、血糖が上昇する時には高レベルの グリコジルアルブミンが存在する。その反応は遅（、連続的なので、ある人の血 中グルコシルアルブミンの絶対量は、アルブミンが血中での寿命中にさらされた 平均血中グルコース濃度を反映する。この期間は約２週間である。１回のグルコ シルアルブミン（量）決定は、それ故過去１０−２０日間の糖尿病コントロール 全体を監視する窓口を供給する。上昇したグリコジルアルブミンのレベルは、医 者と患者に、抗糖尿病摂生法の転換がなされなければならないことを語っている 。反対に以前上昇していたグリコジルアルブミンの低下は、１−３週間前に設定 された摂生療法の転換に対する反応がおこっていることを示す。

ｆ、ｓｚフコースントロールがうま（いかないと失明や腎不全のよ５な糖尿病性 合併症の主要因子であるという説得力のある証拠があるので、糖尿病の人々にお いて正常血中グルコースレベルを達成、維持することは哲学的ではなく倫理上の 問題である。近代医学は、各２４時間周期中−貫して血糖が常態化されているよ ５あらゆる努力がなされることを命じている。これは経口剤、インシュリン注射 、断続的インシュリン供給システム、またはスイ臓小島細胞移植などによって達 成できる。これらの摂ルタンパク質の定期的測定によって査定される。グリコジ ル化ヘモグロビンは、イオン交換かまたは高圧液体クロマトグラフィによってＨ ｂＡｒｃＱ形で測定される。’ＩＣの形状でグリコジル化されたヘモグロビンは 、そのペプチド鎖に沿った他の場所（がグリコジル化されたヘモグロビン）と同 様に総グリコジルヘモグロビンと称されアフイニテイクロマトダラフイで測定さ れる。

皿中グルコースは家庭用グルコースモニターとして知られている技術を用いて１ 日に１−４回測定される。このテストを使うにあたり患者は使いすてランセット で自分の指を刺し、出てきた血液の一滴を、血液サンプル中のグルコース量に従 って色が変わる試薬を含有する小片につける。その色が、それが測定された時点 での血糖値ヲ示ス。グリコジルヘモグロビン又はＨＢＡ、ｄｒｔ一般に３力月に １回、そのような瞬間の無作為（ランダム）な血糖値が数週間から数カ月にわた る長期間の糖尿病コントロールの統合的レベルを示しているかどうか決定するた め測定される。グリコジルアルブミンはｌ又は２週間間隔で、より最低のコント ロール全体を決定するために、そしてより最近の一時的（−とりあえずの）適切 なコントロールが改善（を示す）か悪化（を示す）かを検出し記録するために測 定することができる。

グリコジルアルブミンや他の血清タンパク質を測定するために記述されている方 法は、チオバルビッール酸反応に基づ（比色定量法、アフイニテイクロマトグラ フイ、フロシン（ハげｏｓｉｎａ　）測定のための高圧液体クロマトグラフィ、 そしてフラクトースアミン（ｌｒｓｃｔｏｓａｍｉｎａ　）アッセイなどを含む 。これらのテストの多（は再現性、コスト、高価な装置、精度、あるいは他の因 子に関して欠点を持つ。

例えばフラクトースアミンアッセイは、Ｎ−置換ケトアミン（７ラクトースアミ ン）のニトロブルー・テトラゾリウムとの反応における発色性産物の生成に依拠 しており、またそれは自動分析機に適応させ得るのだが、それらの欠点のい（り かが克服されることが期待されていにジＥ７ンンら、Ｃｌ１ｎ、Ｃｈｉｍ、Ａｃ ｔａ　１２７　：　８７　＋１９８２；サン−ギル（Ｓａｎ−Ｇｉｇ　）ら、Ｃ １１ｎ、Ｃｈｉｍ、　３１　：　２０Ｑ５−６．１９８５）。しかしながら、こ のアッセイは非特異的送元活性に基づいており、グリコジル化したアルブミン間 を測定している。結果的に、何が測定されている°のか、またはその決定は血糖 の状態について過去の期間のどの時期を反映しているのか解釈するのは困難であ る。

これは個々の血清タンパク質のグルコースとの反応性が、循環系におけるそれら の存在時間と同様、非常に大きな多様性を持つせいである。それ故、それぞれの タンパク質は異なった間隔で高血糖環境にさらされたのかもしれないし、またそ れぞれ、異なる程度のグリコジル化を５けているかもしれない。より長い半減期 を持つタンパク質はより高度のグリコジル化を受け、それ故、血清中の相対濃度 に比例しない７ラクトースアミンの量が上昇して、糖尿病コントロールが改善又 は改悪された期間の不正確な推定となる。更にその上、血清タンパク質が増加あ るいは減少するような情況は、フラクトースアミンアッセイにおいて擬似的に上 昇又は低下した値を生む。

循環系における存在時間が限定されているタンパク質である血中グリコジルアル ブミンの量を正確に特異的に定量することは、その測定が過去ｌＯから２０日間 の一般血中グルコース濃度の正確な指標を供給するが故に、望ましい。

疾病の効果的診断を目的として、グリコジルアルブミンと反応し得るモノクロー ナル抗体を供給することが本発明の目的である。

他のタンパク質ではな（、グリコジルアルブミンと反応するモノクローナル抗体 を用いた、疾病の診断方法を提供することが本発明のも５一つの目的である。

本発明はこのようにグリコジルアルブミンに存在するエピトープと反応し、他の タンパク質とはグリコジル化、非グリコジル化にかかわらずほとんど反応したい よプなモノクローナル抗体に関するものである。本発明はさらにこれらの抗体を 産生ずるハイブリッド細胞株、またこれらのモノクローナル抗体作製過程と使用 方法をも含んでいる。

非酵母的にグリコジル化されたアルブミンの測定のための新たな、そして改良さ れた方法を供給することが本発明の目的である。

本発明のも５１つの目的は、患者血液中のグリコジルアルブミン量を測定するこ とによって彼らの血糖のコントロールをモニターするための新たな改良された方 法を提供することである。

本発明のも５１りの目的は、１回の血液テストで糖尿病の診断をつけるための新 方法を提供することである。

本発明のもう１つの目的は、経口グルコース耐性テストの結果があいまいな時に 糖尿病の診断を確定する新方法を提供することである。

本発明のこれらの、あるいは他の目的はアルブミンのグリコジル化残基な特異的 に認識するモノクローナル抗体を使用することによって達成される。このモノク ローナル抗体に対するエピトープはケトアミン構造にあり、そこではイン・ビボ で例えばホウ素水素化物による還元のような人工的修飾のないエピトープが成ユ する。これは当分野に記述されている、グリコジル化されたエピトープがホウ素 水素化物による還元によってグルシド−ルーリジンに変えられるような、他の抗 グリコジル化タンパク抗体による認識部位とは異なる（カーティスとライラタム （Ｃｕｒｔｉｓｓ　ａｎｄ　ＴＦ’１ｔｚｔｓｒｎ）、Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅ ｓｔ、。

７２．１４２７−１４３８，１９８３；ナカヤマら、Ｊ。

Ｉｍｒｈｕｎｏｌｏｇ、Ｍａｔｈｏｄｓ、　９９　：　９５−１００　＋１９８ ７）。

本発明はグリコクルアルブミンのチックローナル抗体に関係している。これらの モノクローナル抗体は例ｔば真性糖尿病のよ５なある種の疾患に伴うグリコジル アルブミンの免疫学的検出に非常に有効である。

本発明は、モノクローナル抗体と、抗体が唯−無二に、かつ特異的に結合する抗 原エピトープとの間の特異的免疫認識と反応の原理に基づいている。その認識と 結合は、例えば抗体がプラスチック溝の底のよ５な固体相支持体（５ｏｌｉｄ　 ｐｈａｓｅ　５ｕｐｐｏｒｔ）上で非動化されるＥＬＩｓＡ型テストによって検 出可能である。テスト液と酵素標識試薬と薄紫基質は、何回かの希釈、インキュ ベーション、洗浄ステップを経て非動化された抗体と反応し、結合した試薬と非 結合の試薬が分離される。発色反応が、抗原の抗体への結合と、酵素とその基質 の必然的反応の結果として行われる。色の形成はテストサンプル中のグリコジル アルブミンの存在を示し、色の濃さはサンプル中のグリコジルアルブミン量の定 量的測定となる。ＥＬ　Ｉ　ＳＡ型アッセイはまた非動化酵素結合モノクローナ ル抗体と加えるテスト液と基質によって、あるいは非動化抗原又はサンプルと加 えるモノクローナル抗体、酵素ラベルされた試薬と基質によって行われてもよい 。

非酵素的グリコジル化はグルコースのカルボニル基（Ｃ１）とアミノ酸のフリー アミノ基間のシフ塩基（５ｃｈｉｆｆ　ｂａｓｅ）形成によって進行する。基本 的には主にタンパク質のＮ末端と、リジンあるいはヒドロキシルリジンのニブシ ロンアミノ基のたった２つの型のフリーアミノ基が存在する。結果的に形成され るアルドイミン（ａｌｄｉｍｉｎａ　）結合はアマトリ転位を受けてＣ２にカル ボニルによるケトアミンを生じて安定化される。このようにして、この安定な産 物はＡ’−１−（１−デオキシフルクトシル）リジンとなる（パンら（Ｅｓｎｎ 　）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２５４：３８９２− ３８９８，１９７９；パンら、サイエンス、２００：２１−２７．１９７８）。

非糖尿病ではインビボでグリコジル化を受けるアルブミンの第一の部位はリジン −５２５である。グリコジル化全体の約３３％に該当するのがこの位置である。

しかしながら、グリコジル化はリジン−１９９、リジン−２８１、リジン−４３ ９を含む他の部位でもおこる（ガーリック（Ｇαｒｌｉｃ　）ら、ジャーナル・ オブ・バイオロジカル・ケミストリー、２５８：６１４２−６１４６．１９８３ ；グラッキジャー（Ｆｌｕｃｋｉｇａｒ　）、モノグラ７ス　イアーア七ロセレ ローシス（Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ　１ｎＡｔｈａｒｏｓｃｌａｒｏｓｉｓ　）、 １３：５３−６２．１９８５；アイバーブ（ｌｂｇｒｇ）ら、ジャーナル・オブ ・バイオロジカル・ケミストリー、２６１　：１３５４２−１３５４５．１９８ ６）。これら他の部位のグルコースとの反応性はインビボ系よりインビトロ系に おいて顕著であり、それは（多分）非据尿病性基質よりも糖尿病性基質において より顕著であるだろ５゜このことからリジン−５２５部位にあるようなりジン− リジン配列が最もグルコースと反応しやすく、リジン−ヒスチジンとりジン−ヒ スチジン−リジンがそれに続くことが明らかになる。

本発明のモノクローナル抗体Ａ７１７は本来の（イン・ビボ）グリコジルアルブ ミンで免疫されたネズミ（マウス）内で起されたもので、本来のグリコジルアル ブミンよりむしろ合成（イン・ビトロ）グリコジルアルブミンと良（反応する。

このことは、抗体のニブシロン−Ｄ−７ラクトースーリジン存在の有無の認識は 、もう１つのリジンあるいはヒスチジンと連結した過程であることを示唆する。

グリコジルポリリジンのＡ７１７による認識（実施例６）は、この説明を支持す る。、しかしながら、ＡｌＩ３は無関係なタンパク質のニブ７０ンーＤ−７ラク トースーリジンを認識せず、またＡｌＩ３は同量のグリコジルポリリジンとは本 来性または合成グリコジル化アルブミンのいずれよりも低い反応性を持つことか ら、エピトープの認識にはアルブミンに特異的な立体的あるいはコン７オメーシ ヨン上の要素が存在することは明らかである。

本来のグリコジルアルブミン（抗原）は、正常あるいは糖尿病性血漿をまずアフ イーゲル・ブルーＣＡｆｆｓ−ｇａｌ　ｂＬ％−）のクロマトグラフィーにかけ て（ディ（Ｄｔｓｔ　　）　　ら、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈａｍ、、　　２　５　 ４　　：　　９　３　９　４−９４００．１９７９；）ラヴイス（Ｔｒａｖｉｓ ）ら、Ｂｉｏｃｈａｔｍ、Ｊ、、１５７：３０１−３０６．１９７６）、アルブ ミンを他の血漿タンパク質から分離し、その後２Ｍ食食塩ユニティクロマトグラ フィブラウンリー（Ｂｒｏｓｃ＋ｎｊ＊ｇ）ら、ダイアビーテイーズ２９：１０ ４４−１０４７．１９８０；レンダＡ／　（Ｒｅｎｄａ　ｌ　ｌ　）ら、Ｊ　Ｌ ａｂ　Ｃ１ｉＣ１１ｎ、　　１０５　：　６３−６９．１９８５；ウィリーω’ ｉｌり）ら、ダイアビトロ−ジャ（Ｄｉａｂ　ｇ　ｕｉｏｇｉａ　）、２７　： 　５６−５８，１９８４）にかけてグリコジルアルブミンを非グリコクル型から 分離して調製される。この分離物は本来性イン・ビボグリコシルアルブミンと呼 ばれる。

グリコジルアルブミンはまた真性の本来性ヒトアルブミンを、５００■／ｄｉ　 のグルコースを含むＰＢＳ中ｐＨ７，４に緩衝された溶液中で２５℃７日間イン キユベートシて調製される。この調製液は遊離のグルコースを除くために透析さ れ、無反応アルブミンをグリコジルアルブミンから分離するためホウ酸フェニル の７フイニテイクロマトグラフイにかけられる。この分離物は合成イン・ビトロ グリコジルアルブミンと呼ばれる。

モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの産生に用いられる一般的方法は 、技術法において普通に熟練した人々によ（知られている。本発明で用いられた 技術の実例はプロシーデングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ イエンス（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　Ｏ／　ｔｋａＮａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄ ｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅ　）、ＵＳＡ、７５．３４０５、（１９７８）に 記載されている。

簡単に述べると、メスＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　　ネズミがグリコジルアルブミ ンで４週間にわたって免疫された。最終免疫の後、その動物は殺され、膵臓細胞 はネズミ非分泌性骨髄細胞株と融合された。ハイブリドーマは抗体産生の有無で 選別され、陽性のクローンはグルコシルアルブミンに結合するモノクローナル抗 体についてテストされた。

この発明のモノクローナル抗体の特異性による、モノクローナル抗体分泌性の他 のハイブリドーマの分離は、従来の通常技法の１つ、選別に使用できる抗イデイ オ型（ａｎｔｉ−ｉｄｉｏｔｙｐｉｇ）抗体（ハーリｙ　（Ｈａｒｌｙｎ　）ら 、サイエンス、２３２：Ｚｏｏ、１９８６）の産生によってなしとげられる。抗 イデイオ型抗体とは、興味の対象のハイブリドーマによって作られたモノクロー ナル抗体に存在する唯−無二の決定基を認識する抗体のことである。これらの決 定基は抗体のｙｔ４”ｑ変（ｈｙｐａｎａｒｉａｂｌｇ　）領域に位置している 。この領域が与えられたエピトープに結合するのであり、かくして抗体の特異性 を担っている。抗イデイオ型抗体は、興味の対象であるモノクローナル抗体で動 物を免疫して調製することができる。免疫された動物は、これらのイデイオ型決 定基に対する抗体を産生じて、免疫した抗体のイデイオ型決定基を認識し反応す る。抗イデイオ型抗体は、単独のノ・イブリドーマから産生され２番目の動物を 免疫するのに使われたモノクローナル抗体に特異的なので、２番目の動物の抗イ デイオ型抗体を使５ことによって、免疫化に用いられたハイブリドーマの抗体と 同じイデイオ屋の他のクローンの確認が可能でありそれ数本発明のモノクローナ ル抗体の特異性を持ったモノクローナル抗体を分泌する他のハイブリドーマを見 つけ出すのに必要な選別の量を極めて単純化し減少することが可能である。２つ の−・イブリドーマのモノクローナル抗体間のイデイオ盤同−性は、その２つの モノクローナル抗体が同じエピトープ決定基の認識に関して同じであることで示 される。このよ５にモノクローナル抗体上のエピトープ決定基に対する抗イデイ オ型抗体３用いることによって、同一エピトープ特異性を持つモノクローナル抗 体を発現する他の−・イブリドーマ同定が可能である。

に本発明のモノクローナル抗体が結合するのを妨げるかどうか決定することによ って、そのモノクローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と同一特異性を持 つかどうか、過度の実験なしで判定が可能である。もしテストされているモノク ローナル抗体が本発明のモノクローナル抗体と競合し、本発明のモノクローナル 抗体による結合の減少が示されるなら、その２つのモノクローナル抗体は同じエ ピトープに結合すると考えられる。また、モノクローナル抗体は、グリコジル化 アルブミンに対し発明のモノクローナル抗体と同じ反応パターンを示すかどうか でもテストが可能である。

ある環境下で、あるアイソタイプ（１８ｏｔｙｐａ）のモノクローナル抗体が診 断的有効性に関して他（の抗体）よりより好ましいかもしれない。モノクローナ ル抗体の特定のアイソタイプは直接最初の融合から選択するか、あるいは二次的 にクラス切り換え変ｓ（ｃｌａｓｓ−ｓｗｉｔｃｈｖａｒｉａｎｔｓ　）を分離 するシブの選択技法（ｓｉｂ　ｓｇｌｍｃ−ｔｉｏｎ　ｔａｃｈｎｉｑｓｐ）を 用いて異なるアイソタイプのモノクローナル抗体を分泌する親ハイブリドーマか ら調製できる（ステップレウスキ−（Ｓｔａｐ１ｇｗｓｋ’ｊｊら１．プロシー デイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス、ＵＳＡ、　８ ２：８６５３．１９８５；スパイラ（５ｐｉｒα）ら、ジャーナル・オブ・イミ ュノロジカル・メソッド、７４：３０７．１９８４）。このように本発明のモノ クローナル抗体は、ＡＴＣＣＨＢ９５９６　で産生されるモノクローナル抗体Ａ ７１７の特異性を持つクラス切り換え変種を含む。

この発明内で使われているように、用語“抗体”は、エピトープ決定基に結合し 得る、例えばＦａｂやＦ（αｂ′）２のような、無傷の分子やその断片を含んで 意味づけられている。

本発明のモノクローナル抗体は、液体相中で使われるかあるいは固体相キャリア に結合されるかが可能なイムノアッセイでの使用に特に適している。更にこれら のイムノアッセイにおけるモノクローナル抗体は様々な方法で、検出可能にラベ ルされることができる。本発明のモノクローナル抗体を使用できるイムノアッセ イの型の例は、直接又は間接様式、両者における競合、非競合イムノアッセイで ある。そのよ５なイムノアッセイの例はラジオイムノアッセイ（ＲＩＢ）とサン ドイッチ（イムノメリック）アッセイである。この発明のモノクローナル抗体を 使った抗原検出は、前向き、逆向き、あるいは同時モードのいずれかで進行され るイムノアッセイを用いて行５ことができ、それは生理学的サンプルの免疫組織 化学的アッセイを含む。用いられるイムノアッセイのタイプに係わらず、使用さ れた抗体の濃度は技術法の一技法によって簡単に決定されることができる。

この発明のモノクローナル抗体は、異った多くのキャリアに結合され、グリコジ ルアルブミン抗原の存在を検出するのに使用されることができる。よく知られて いるキャリアの例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリプロ ピレン、ポリエチレン、ポリカーボネイト、デキストラン、ナイロン、アミラー ゼ、自然のあるいは変化したセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、磁 鉄鉱などがある。キャリアの性質は、この発明の目的のためには可溶性、不溶性 、いずれでもよい。

技術法で熟練した人々は、モノクローナル抗体結合のための他の適切なキャリア がわかるだろプし、普通の実験を使ってそれらを確めることができるだろう。

技術法において普通（程度）に熟練した人々に知られている、たくさんの異なる ラベルとラベル方法がある。

本発明で用いることのできるラベルタイプの例は、酵素、放射性同位体、コロイ ド状金属、螢光性化合物、化学ルシネセンス化合物、生物ルミネセンス化合物な どである。

当業者は、モノクローナル抗体結合のための他の適切な標識がわかるだろうし、 普通の実験を使ってそれらを確めることができるだろう。更にその上、これらの ラベルとって周知の標準的技法を用いて行われることが可能である。

この発明の目的にとって、モノクローナル抗体によって検出されるグリコジルア ルブミンは様々な生物学的液体と組織に存在できる。検出可能なグリコジルアル ブミンを含むとのよ５なサンプルも用いることができる。一般にはサンプルは、 尿、唾液、髄液、血液、血清などの体液、あるいは組織、便などの固体または半 固体である。

さらにまたより高い感受性をもたらすであろうもうｌりの技術は、抗体を低分子 量のハプテンに結合することである。そのあとこれらのハプテンは２番目の反応 、という手段によって特異的に検出されることができる。例えば、アビジンと反 応するビオチン、あるいは特異的抗ハプテン抗体と反応し得るジニトロフェニル 、ピリドキサル、フルオレセインのようなハプテンの使用はよく卸られている。

この発明で用いられているように、用語“エピトープ”は、この発明のモノクロ ーナル抗体と特異的相互作用の可能ないかなる決定基も含んで意味づけられてい る。エピトープ決定基はたいていアミノ酸や糖側鎖などのよ５な化学的に活発な 表層分子グループから成り、またたいてい特異的荷電の特徴はもちろん、特異的 な３次元構造上の特徴を持つ。

用語１診断上効果的”は、モノクローナル抗体の量が、この発明のモノクローナ ル抗体に特異的なエピトープを持つグリコクルアルブミンを検出可能にするのに 光分量であることを意味する。

用語”優先的反応性”は、この発明のモノクローナル抗体がグリコジルアルブミ ンと他のタンパク質を、それら他のタンパク質がグリコジル化されているかどう かにかかわらず判別できることを意味する。この発明のモノクローナル抗体がグ リコジルアルブミンと非グリコジルアルブミンを区別する能力は特に顕著である 。用語“有意でない反応性”は、この発明モノクローナル抗体と他のグリコジル 化されたタンパク質の間に見られる反応の度合いがモノクローナル抗体の特徴ま たは有効性を妨げないことを意味する。例えば診断に用いられた時にこの発明の モノクローナル抗体は他のグリコジルタンパク質に比較してグリコジルアルブミ ンの方にずっと顕著に結合するので、サンプル中のグリコジルアルブミンの存在 は、抗体の他のグリコジルタンパク質への結合によるあらゆるバックグランドと 明確に識別可能である。

モノクローナル抗体Ａ７１７は本発明において用いられることができる。Ａ７１ ７は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ９５９６を持つ細胞株から得られた抗体から得られ 、その（ＨＢ９５９６から得られた抗体であるとい５）同定特性を持つ。この細 胞株は１９８７年１２月２日より以前に、メリーランドのロックビル（Ｒｏｃｋ ｖｉｌｌａ）にあるアメリカン・タイプ・カルテア−会コレククヨン（ＡＩＣＣ ）に３０年間寄託された。

上で明らかにした事柄は大体本発明を描いている。より完全な理解は以下の特定 の例を参照すると得られるであろうが、それらはここで例証の目的のみで挙げら れており、この発明の領域限定を意図するものではない。

実施例１゜ グリコジルアルブミンに対するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細 胞株の調製 ０．８％ＮａＣ１，０，０２％ＫＣＩ、　０．０８　Ｍ　Ｈａ２ＥＰＯ，，０， ００１５Ｍ　　ＫＢ、ＰＯ，（ｐＨ７，４）を含むリン酸塩緩衝液を加えた塩水 （ＰＢＳ）で溶解され、フロイント（Ｆｒ＃ｓ％ｄ）の完全アジュバントと混和 されたインービボまたはイン−ビトログリコジルアルブミン１００μ２でメスＥ 　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　　ネズミが免疫された。混和液（１：１）は腹膜内に注 射された。７日後そのネズミは不完全アジュバントと混和された抗原（１：１） を、さらに１週間後と、その後４週間目中に３日連続して抗原のみを注射された 。最後の注射の次の日にこの動物は殺され膵臓がとり除かれる。肺臓細胞はＳＰ 　２１０　　骨髄腫細胞と融合され、標準法に従ってハイブリドーマコロニーが 確立される（ケネット（Ｋａｎｎｉｔ　）、Ｒ，：Ｈ，、ｆｆ７カー７（ＭｃＫ ａａｒｎ　）、Ｔ、Ｊ、、ペク）−Ａ／　（ＢａｃｈｔｏＬ　）、Ｋ、Ｂ、編： １９８２）。結果としてできた、イン・ビボあるいはイン・ビトログリコジルア ルブミンに結合活性のあるコログリコジルアルブミン反応性モノクローナル抗体 の特性決定 ヒトアルブミン、イン・ビボグリコシルアルブミン、イン・ビトログリコジルア ルブミン（各２Ｏ−５０１１２）の個別サンプル２つづつが標準的方法に従って （リームリ（Ｌａａｍｎｈｌｉ）、ネイテアー（Ｎａｔｓｒａ　）、２２６：６ ８０．１９７０　）　５ＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動にかけら れた。ゲルの各二組のセットの５ち１つはタンパク質が染色され、本来の、ある いはグリコジル化されたアルブミンの電気泳動上の移動位置が決定された。各二 組のセットのも５１つのゲルは電気泳動的ニトロセルロースに移され、１％ゼラ チン０．１Ｍ）リス（ｐＨ８，９）ＰＢＳの溶液中に１時間浸して固定され、イ ン・ビボグリコシルアルブミンに対しておこされたモノクローナル抗体Ａ７１７ 溶液（ｌレーンにつき１０Ｍのハイブリドーマ培養上澄）中に２時間浸された。

洗浄後ニトロセルロース切片はホースラデイシュペルオキシダーゼ結合のヤギ抗 ネズミＩＱＧ抗体（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、リッチ％７ド（７？ｊｃ 五ｍａｎｄ、カルフォルニア（ＣＡ））の０．１％溶液に浸され、トリス／ＰＢ Ｓと洗剤（０，０５％トウイーン（Ｔｓｕａａｎ）　２０　）で更に洗浄された 後過酸化水累の０．０３％溶液と４−クロロナフトールを含む発色剤で処理され た。電気泳動的トランスファーとイムノブロッティングは標準法（トピン（Ｔｏ ｂｊｓ）ら、　Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔｌ　　Ａｃａｄ　　ｏｆ　　Ｓｃｉ、７　６ 　　：　　４３５０−４３５４．１９７９）に従って行われた。ニトロセルロー ス切片は、モノクローナル抗体の、認識する抗原への結合を示す着色したタンパ ク質バンドの存在とその位置について検討される。

本来のアルブミンはポリアクリルアミドゲル上で、期待通り分子量６００００に 相当する位置へ移動した。グリコジルアルブミンの電気泳動的易動度はわずかに 太き（、リジン残基の７リーアミノグループの非醪素的グリコジル化の結果とし ての荷電のわずかな変化に相当した。

本来のアルブミンを電気泳動的に移動して、モノクローナル抗体Ａ７１７、酵素 標識された試薬と基質にさらした後着色バンドが見いだせなかった事実から明ら かにされたようにモノクローナル抗体Ａ７１７は本来のアルブミンとは結合しな かった。

反対にイン・ビボグリコシルアルブミンをモノクローナル抗体Ａ７１７と酵素ラ ベルされた試薬と基質にさらした後、電気泳動上の移動位置に対応して１本の着 色バンドが見い出された事実によって示されるよ５に、モノクローナル抗体Ａ７ １７は特異的にイン・ビボグリコシルアルブミンに結合した。

モノクローナル抗体Ａ７１７はイン・ビトログリコジルアルブミンを認識で結合 し、それはイン・ビトログリコジルアルブミンのモノクローナル抗体Ａ７１７． 酵累標識された試薬１．そして基質との反応後、この抗原の電比されることから 示された。更に加えてゲル拡散法によってＡ７１７がアイソタイプＩＱＧ、を持 りことが決定された。

これらの研究で示されたように、モノクローナル抗体Ａ７１７は本来的非グリコ ジルアルブミンではな（、グリコジルアルブミンを特異的に認識、結合する。抗 体がイン・ビボグリコシルアルブミンと同様イン・ビトロとも反応しそれら両者 ともそのケトアミン構造部がグリコジル化されるのでモノクローナル抗体Ａ７１ ７によるグリコジルアルブミンの認識・結合はケトアミングループに特異的であ る。

モノクローナル抗体Ａ７１７を用いたヒト血漿グリコシヒト血漿サンプルは５Ｄ Ｓ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動され、ニトロセルロースに電気泳動的 に移されて実施例２の方法に従ってイムノプロットが行われた。

ヒト血漿は標準タンパク質染色法で期待されるよ５な複数のタンパク質バンドを 生じ、それは分子量２αｏｏ。

から２００，０００に及んだ。　反対に、電気泳動的トランスファーとモノクロ ーナル抗体Ａ７１７．Ｗ素標識された試薬、基質との反応後ただ１本のバンドが 見い出された。このバンドは唯一、モノクローナル抗体−抗原複合体反応で形成 された着色産物を表わし、その位置は本来のイン・ビボグリコシルアルブミンと 一致する。このよ５にモノクローナル抗体Ａ７１７は、いくつかはグリコジル化 の形で存在する多種類のタンパク質を含むヒト血漿中グリコジルアルブミンを特 異的に認識し、結合することができる。モノクローナル抗体Ａ７１７はアルブミ ン以外のグリコジルタンパク質を認識、あるいは結合することはない。

実施例４゜ 非グリコジルアルブミンとグリコジルアルブミンに対す本来のアルブミン、イン ・ビボグリコクルアルブミン、またはイン・ビトログリコジルアルブミン５００ 　ｎｙが炭酸−重炭酸カンプリング・バッファー（ｐＨ９，６）を用いて４℃　 １８時間プラスチック溝内で非動化された。

丼胎合の抗原を洗浄除去した後室温で３０分１．０％ゼラチン／、ＰＢＳ１０． ０５％トウィーン２０で固定され、モノクローナル抗体Ａ７１７（ハイブリドー マ培養上澄１００μｌまたは精製Ａ７１７を０．１％ゼラチン溶液で約１０から 約１００　ｎｙ）が６溝に加えられ２時間反応を受けた。

０．１％トウイーン２０ＰＢＳ溶液で洗浄後ホースラディツシュ・ペルオキシダ ーゼ結合ヤギ抗ネズミＩＱＧ抗体０．１％ゼラチン／ＰＢＳ／トウイーン溶液が 加えられ室温で１時間インキュベートされた。ＰＢＳ／トウイー７で更に洗浄し た後、オルンーフェニルジアミン（ＯＰＤ）Ｉ）ン酸−クエン酸バッファー（ｐ Ｈ５，０）溶液を０．０３％過酸化水素と共に用いて呈色生成物の存在とその濃 度が決定され、４５０　ｎｍでの吸光でＥＬＩＳＡ　　リーダーによって読まれ た。

イン拳ビボグリコシルアルブミン　　　　　　＋＋＋イン・ビトログリコジルア ルブミン　　　　　＋＋＋＋表１に示すよ５に、モノクローナル抗体（，４７１ ？　）はＥＬＩＳＡ型のアッセイにおいて本来の非グリコジルアルブミンをイン ・ビボあるいはイン・ビトログリコモル化形アルブミンから選択的に識別するこ とができる。これらの実験条件下で未精製のモノクローナル抗体Ａ７１７１００ μｌは抗原５００ｎｙＫ−感受性を持っていた。イン・ビボグリコシルアルブミ ンと同量のイン・ビトログリコジルアルブミンは、より多（のりジンアミノグル ープがグリコジル化しているせいでより強い発色を示した。

ヒト血漿中グリコクルフルブミン検出におけるモノクロ尿病の提供者からの、１ ：１０００，１：１０，０００゜１：１００，０００希釈？−）血漿１００　ｐ ｌが実施例４のようにカッ、プリング緩衝液を用いてプラスチック溝内で非動化 された。モノクローナル抗体Ａ７１７はバイオラッド（Ｅｉｏ　Ｒａｄ）　（リ ツテモンド（Ｒｉｃｈｒｎｏｎｄ　）、カル７オルニアＣＣＡ））タンパク質Ａ システムを使って精製された。ＰＢＳ／トウィーンで洗浄し室温で１時間１％ゼ ラチンＰ　Ｅ　Ｓ／　）ウィーン溶液で固定した後精製モノクローナル抗体Ａ７ １７（１０−１００ｓｙ）が６溝に加えられ室温で１時間反応を受けた。ＰＢＳ ／トウイーンで洗浄後ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ネズミＩＱＧ抗体１：１ｏｏ ｏ希釈液が加えられ２３℃で２時間インキュベートされた。この時間の後プレー トはＰＥ５７０．０５％トウイーンで洗浄され、ＯＰＤ基質が加えられて反応が 進行された。反応は１０分後に２Ｍ　　Ｅ２Ｓｏ、（５０μｌ）で停止され、実 流例４にあるよ５に呈色生成物の存在とその濃度が決定された。

表　　２ 血漿希釈　　　　　　　　　吸光度 １：１，０００　　　　　　　　．３２１：１０，０００　　　　　　　　．２ ３１：１００，０００　　　　　　　．０５モノクロ一ナル抗体（Ａ７１７　） はヒト血清中のグリコフルアルブミンを選択的に識別し定量することができる。

この選択性と識別は血清をいかなる変形、準備的ステップ、あるいは工程にかけ ることなく得ることができる。

マ培養上澄）１００μｌが実施例４にあるようにカップリング緩衝液でプラスチ ック溝内で非動化された。ＰＢＳ／トウイー／で洗浄の後、本来のイン・ビボま たはイン・ビトログリコジルアルブミンあるいは５−ヒドロキシーメテルフルフ ラルアルデヒドを用いたチオバルビッール酸反応でケトアミン結合しているグル コース測定（コー１８、スプリンガーーバーラッグ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒ ｌａｇ）、ニューヨーク（ＮｅｗＹｏｒｋ　）、１９８６）によって決定された 量と等量のグリコジルアルブミンを含むと推定された血漿１００μｌが０．１％ ゼラチン中で６０％溶液として加えられ室温で１時間反応を受けた。ＰＢＳ／ト ウイーンで洗浄後ベルオキクダーゼに結合したヤギ抗ヒトアルブミン抗体１：２ ００希釈０゜１％ゼラチン溶液が加えられ、反応が進行された。洗浄後、実施例 ４で決定されたよ５に呈色生成物の存在と濃度を測定して反応性が決定された。

」Ｌ−一と イン・ビボグリコシルアルブミン　　　　　１．０　　　　１．１００．５　　 　　０．６６ ０．１　　　　　　０．２５ イン・ビトログリコジルアルブミン　　　　１．０　　　　１．５１０．５　　 　　０．９８ ０．１　　　　０．４１ １　：　２０００　　　　　　　　　　０．１　　　　０．０９にのデータはモ ノクローナル抗体Ａ７１７が精製されたイン・ピボ、イン・ビトログリコジルア ルフミン、またヒト血漿中のイン・ビボグリコシルアルブミン、どちらも特異的 に検出し定量できることを示している。

実施例６゜ モノクローナル抗体Ａ７１７の様々なグリコジルタンパ様々な関連性のあるいは 非関連性のタンパク質とペプチドのグリコジル化は本来のタンパク質をＰＥＳ中 でｐＨ７，４に緩衝された５００■／ｄｉのグルコースを含む溶液中で２５℃７ 日間インキュベートして行われる。

この調製液は遊離グルコースを除（ため透析され、反応性グリコジル化されたタ ンパク質と非反応性タンパク質を分けるためホウ酸フェニルのアフィニティー・ クロマトグラフィーにかけられる。

下記で確認された５００ｓｙ（０，５μ？）のグリコジルタンパク質またはペプ チドは実施例４で説明された様にプラスチック溝内で非動化された。ＰＢＳ／ト ウィーンで洗浄、実施例５方法Ａでのよ５に１％ゼラチンで固定された後、モノ クローナル抗体１００μｌ！（ハイブリドーマ培養上澄１００μｌまたは精製モ ノクローナル抗体１Ｏ−１００ｎｒ）が谷溝に加えられ２３℃で２時間反応ゼ結 合ヤギ抗ネズミＩＱＧと基質の添加の後実施例４のよ５に呈色生成物の存在とそ の浸度が決定された。

表４ 抗原　　　　　　　　　　　　　　　吸光度イン−ビトログリコジルアルブミン 　　　　　　　　　、６００インｅビボグリコシルアルブミン　　　　　　　　 　　　、２９５アルブミン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　−イン ・ビトログリコジルアルファーグロブリン　　　　　２゛イン・ビトログリコシ ルベーターグロブリン　　　　　　　−イン・ビトログリコシルガンマ−グロブ リン　　　　　　　−イン・ビトログリコジルポリリジン　　　　　　　　　　 、１４０これらの結果は、モノクローナル抗体１７１７は、ここでアルファ、ベ ータ、ガンマグロブリンで示されたように、たとえこれらのタンパク質がニブシ ロン−Ｄ−フブミン以外の）タンパク質を認識・結合しないことを示している。

この抗体はグリコジルポリリジンを認識しており、それ故この抗体は、ニブシロ ン−Ｄ−フラクトースリジンがアルブミンに存在する時、それに部位特異的であ ることが確認された。

この発明は今や充分に説明されており、尚業者にとって多（の変化と改変がこの 発明の真意あるいは範囲から離れることなしに為され得ることは明らかである。

国際調査報告 ＰＣＴ／ＵＳ８８１０４４４６ ｎｏｎｅｎｚｙｍａｔｔｃ？（ｗ）　　９１ＹＣ？　　（３ｗ）（ｐｒｏｔｅｉ ｎｓ　　ｏｒ　　ａｌｂｕｍｉｎｔ）

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．優先的にグリコシルアルブミンと反応し、他のタンパク質とは有意には反応 しないモノクローナル抗体の分泌が可能な、連続的ハイブリドーマ細胞株。
2. ２．上記タンパク質がグリコシル化している請求項１のハイブリドーマ。
3. ３．上記ハイブルドーマとはＡＴＣＣＨＢ９５９６およびそのアイソタイプ切り 換え変種である請求項１のハイブリドーマ。
4. ４．細胞株ＡＴＣＣＨＢ９５９６で産生されるモノクローナル抗体によって確認 されるグリコシルァルブミンエピトープと反応性のモノクローナル抗体。
5. ５．上記モノクローナル抗体が細胞株ＡＴＣＣＨＢ９５９６によつて産生される 請求項４のモノクローナル抗体。
6. ６．グリコシルアルブミンを検出する方法であつて、グリコシルアルブミンを含 むと考えられる試料を診断上有効量のモノクローナル抗体、あるいはそのフラグ メントと接触させることからなり、上記モノクローナル抗体は優先的にグリコシ ルアルブミンと反応し、他のタンパク質とは有意には反応しない方法。
7. ７．上記タンパク質がグリコシル化している請求項６の方法。
8. ８．上記抗体が細胞株ＡＴＣＣ９５９６によつて産生される請求項６の方法。
9. ９．上記モノクローナル抗体が検出可能に標識されている請求項６の方法。
10. １０．上記検出可能な標識が放射性同位体、螢光性化合物、コロイド状金属、化 学発光化合物、生物ルミネセンス化合物、および酵素ら成る群から選択される請 求項９の方法。