JPH0569517B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、α−フエトプロテイン（以下AFP
と略す）上の一の抗原決定基を認識し、且つ当該
一の抗原決定基に結合することにより他の抗原決
定基に対する他の抗体の結合を促進する性質を有
する新規な単クローン性抗体に関する。さらに、
本発明は該単クローン性抗AFP抗体を用いる
AFPの測定法に関する。 AFPは、胎生期の肝及びヨークサツク（yolk
sac）で生産される胎児性血清蛋白であり、健康
成人の血清中にはほとんど存在しない。物理化学
的性状は、沈降定数４−5S、分子量約64600等電
点4.7、糖含量約４％であり、電気泳動的にはα
位に易動度を示す。 AFPは、健康成人血清中にはほとんど認めら
れないが、肝細胞癌、ヨークサツクチユーモア
（yolk sac tumor）において著しい高値を示すこ
とから血中のAFPの量を知ることにより、肝細
胞癌の診断および治療効果の判定を行うことがで
きる。 AFPに対する抗体としては、通常のウサギ、
ヤギ、ウマなどに、直接免疫することによつて得
られるポリクローナル抗体と、ハイブリドーマー
より得られるモノクローナル抗体が知られてい
る。ポリクローナル抗体が、種々の抗原決定基に
対する抗体の混合物であるのに対し、モノクロー
ナル抗体は一つの抗原決定基に対する抗体のみで
あり、特異性はポリクローナル抗体より極めて高
い。 本発明者らは、AFPに対する単クローン性抗
体の作製について研究を行つた結果、これまでに
知られていた単クローン性抗AFP抗体にはない
性質を持つ単クローン性AFP抗体を見い出し、
本発明を完成するに至つた。 本発明の単クローン性抗AFP抗体は、以下の
ようにして製造される。 精製AFPでマウスに免疫し、一定期間後マウ
スの脾臓を摘出する。摘出した脾臓細胞は、ポリ
エチレングリコールの存在下ミエローマ細胞と融
合されAFPに対する特異的モノクローナル抗体
産生細胞のハイブリドーマとなる。このハイブリ
ドーマを培地中で培養させて抗体を得るか、また
はマウス腹腔に注射し、腹水中に抗体を生成させ
て得てもよい。 このようにして生成した抗体は硫安塩析、イオ
ン交換クロマトグラフイー、ゲル過法で精製し
高純度の抗体とする。 生成した抗体をサンドイツチEIA法を用い認識
する抗原決定基を検討しAFPの一の抗原決定基
を認識し、且つ当該一の抗原決定基に結合するこ
とにより他の抗原決定基に対する他の抗体の結合
を促進する性質を有する単クローン性抗AFP抗
体を得た。 そしてこの単クローン性抗体を用いてAFPの
免疫学的測定を行うことで下記の表の通り迅速、
高感度に行うことができる。

【表】 AFPの免疫学的測定法としては、SRIDから
RIAまで種々の方法があるが、感度の点では
EIA、RIAのサンドイツチ法が優れている。しか
しながらこれまでの測定系ではポリクローナル抗
体を使用する場合、ワンステツプでサンドイツチ
複合体を形成させることが困難であつた。またモ
ノクローナル抗体を使用した例もあるが知られて
いる抗体はAFPに対する反応速度がおそいため
測定に長時間を要するなどの問題点があつた。 本発明で用いることのできる測定法としては、
通常の免疫学的測定法を利用することができるが
EIA、RIA法が特に適していると考えられる。 以下、本発明で得た単クローン性抗体の特性を
利用し、AFPの測定法の一例について説明する。 (1) ワンステツプサンドイツチ法；後記記載の単
クローン性抗体Ａ−８を用い、種々の標識物を
結合させた標識抗体を調製する。一方Ａ−８と
抗原決定基の異なる単クローン性抗体を不溶性
担体に結合させたものを調製する。 適当な、緩衝液中において、被検液、標識抗
体、抗体結合担体を同時に反応させることによ
り、不溶性担体上でサンドイツチ複合体が形成
される。次いで、不溶性担体を分離したのち、
不溶性担体に結合した標識物質の量を測定する
ことにより、被検液中に含まれるAFP量を測
定することができる。 (2) 凝集反応法；不溶性微粒子担体（以下担体）
に、単クローン性抗体Ａ−８を結合させたもの
及びＡ−８と抗原認識部位の異なる１種以上の
単クローン性抗体を結合させた担体を調製す
る。Ａ−８結合担体を含む２種以上の担体を適
当な割り合いで混合し担体の懸濁液を調製す
る。この懸濁液と被検体を反応させることによ
りAFPを介して担体が凝集し、AFPを迅速に
検出することができる。 本発明において用いることのできる不溶性担体
としては、ポリスチレン、ナイロン、ポリエチレ
ン、テフロン、シリコンゴム、ガラス、紙などこ
れまでに使用されて来たものを使用することがで
き、不溶性担体に抗体を結合させる方法も公知の
方法を用いることができる。 標識物質についても特に限定されることなく、
酵素、ラジオアイソトープ、ケイ光物質など任意
のものが選択できる。 また、本発明において使用する不溶性微粒子担
体としては、これまでに知られているものを用い
ることができる。 即ち、ポリスチレンラテツクス、アミノ基を導
入したポリスチレンラテツクス、カルボキシル基
を導入したポリスチレンラテツクス、その他のコ
ポリマーラテツクス、細菌、赤血球などである。 以下、実施例を上げて本発明をさらに詳細に説
明する。 実施例 １ 単クローン性抗体、それを産生するハイブリド
ーマの製法 (1) 免疫 オスのBall／ｃマウスの腹腔内に完全フロイ
ントアジユバンド中のAFP10μｇを注射した。
さらに２週間間隔で２度、同一マウスの腹腔内
に不完全フロイントアジユバンド中のAFP10μ
ｇを注射した。融合の３日前にアジユバンドを
含まない可溶性AFP50μｇをマウス静脈内に投
与した。 (2) 細胞融合 最終免疫より３日後のマウスの脾臓をとりだ
し、単一細胞の懸濁液とした。この１×10⁸個
の脾細胞を１×10⁷の８−アザクアニン耐性骨
髄腫細胞sp2／0Ag14の50％ポリエチレングリ
コール（平均分子量1540）を用いて融合した。
細胞は96穴マイクロプレート３枚に100μづ
つ分注しHAT培地を１日後、２日後、３日後
に各100μづつ加えた。HAT耐性細胞＝ハイ
ブリドーマが288穴すべてに増殖するのが観察
された。 (3) ハイブリドーマの選択及び単クローン化 AFPを吸着させ、牛血清アルブミンを含む
リン酸バツフアーで洗浄済みのマイクロプレー
トの各穴にハイブリドーマの培養上清50μを
加え37℃１時間反応させた。生理食塩水で洗浄
後、適当に希釈した西洋ワサビペルオキシダー
ゼ結合ヤギ抗マウスIgG50μを加え37℃１時
間反応させた。生理食塩水で洗浄後0.2％オル
ト・フエニレンジアミン、0.02過酸化水素水を
含むクエン酸−リン酸緩衝液（PH5.0）を50μ
加え室温で、30分反応させた。1N硫酸50μを
加え、反応を停止させ呈色のある所をAFPに
特異的な抗体産生細胞を含むものとした。 単クローン化は、選択したハイブリドーマを
フイーダー細胞にマウスの胸線細胞を用いて限
界希釈法に３度かけることによりなされた。 以上の様にして８個のクローンが確立され、
それぞれについてクローン及び抗体をＡ−１〜
Ａ−８とした。 (4) 単クローン性抗体の作成 あらかじめプリスタン（２，６，10，14−テ
トラメチルペンタデカン）を腹腔内に注射した
マウスの腹腔内に抗体を産生するハイブリドー
マを注射する。注射されたマウスを適当な時間
飼育すると、マウス体内にハイブリドーマによ
る腫瘍が形成されそれに伴い腹水中に高濃度の
抗体が生成してくる。このマウスの腹水を採取
した。抗体の精製は、50％飽和硫酸アンモニウ
ムで分画後DEAE−セフアセル（フアルマシア
社・スエーデン）を用いて行つた。 実施例 ２ 実施例１で確立されたハイブリドーマ株５種の
免疫学的分類を以下に示す。

【表】 認識する抗原決定基の異同を決定するため、そ
れぞれの抗体をパーオキシダーゼで標識し、
AFPに対し未標識の抗体と競合反応を行なわせ、
阻害の有無により、認識部位の異同を決定した。 その結果を示す。

【表】 この結果、次の様なグループ化ができた。

【表】 実施例 ３ (A) 実施例２により分類された単クローン性抗体
を用いサンドイツチEIA法に用いるのに適した
組み合せを検討した所、Ａ−８とＡ−４の組み
合せが感度の点から最も良いことが判明した。 (B) 単クローン性抗体Ａ−８がこれまで知られた
抗体と異なり、AFPの一つの抗原決定基にこ
の抗体が結合することにより、他の抗原決定基
に対する抗体の結合を促進することは以下のデ
ータにより証明される。 単クローン性抗体Ａ−４をポリスチレンボー
ルに結合させたものを用い、AFPとＡ−８を
あらかじめ反応させ複合体を形成せしめたもの
とＡ−４との反応とＡ−４とAFPを直接反応
させた場合とで、Ａ−４に対するAFPの結合
反応速度を図１及び図２に示した。 この結果から明らかな様に、単クローン性抗
体Ａ−８は単クローン性抗体Ａ−４のAFPの
結合を促進している。 実施例 ４ 酸素免疫測定法によるAFPの測定 １ 抗AFPモノクローナル抗体不溶化ポリスチ
レンビーズの製造 ポリスチレンボース（φ6.4mm）1000個をマウ
ス腹水より精製したIgG分画（実施例１参照）
を0.15MNaCl−0.01Mリン酸緩衝液に1μｇ／
mlとなるように溶解した溶液300mlに浸し、４
℃で24時間放置した。その後緩衝液を除去し、
牛血清アルブミン１％．、Tween20 0.05％を含
む0.15MNaCl−0.01Mリン酸緩衝液で洗浄し、
同緩衝液に保存した。 ２ 酵素標識抗体の製造 酵素としてペルオキシダーゼ（西洋ワサビ）
を用い、中根ら（J.Histochem cylochem.、22
巻、1084頁、1974年）による方法にて以下の様
にして製造した。 ペルオキシダーゼ（東洋紡）４mgを１mlの水
に溶解し、0.1MNaIO₄0.2mlを加え室温で20分
反応する。反応終了後１ｍＭ酢酸ナトリウム緩
衝液に透析し0.2M炭酸ナトリウム緩衝液にて
PHを9.95に調製した後、５mgのFab′を添加し室
温で２時間反応した。４mg／mlのNaBH₄0.1ml
を加え、４℃２時間放置後、ウロトロゲル
AcA₄₄（LKB）を用いゲル過を行い280nｍ及
び405nｍの吸光度より酵素標識抗体のピーク
を集め濃縮保存した。 ３ AFPの測定法 試験官（φ12mm×80mm）に20μの検体（血
清）または標準液を取る。次に１％BSA、0.05
％Tween20を含む0.15MNaCl−0.01Mリン酸
緩衝液PH7.2を用い、２で製造した酵素標識抗
体を1000倍に希釈したものを0.5ml加え、更に
１で製造した不溶化抗体１個を加え37℃10分保
温した。 保温終了後反応液を吸引除去し生理食塩水２
mlを加え洗浄する。この操作を２回行つた。洗
浄終了後あらかじめ準備した0.2％０−フエニ
レンジアミン・２塩酸塩（H₂O₂を含むリン酸
−クエン酸緩衝液PH5.0）0.5mlにビーズを移し
室温で５分間反応させた。1NH₂SO₄2.0mlを加
え反応を停止させたのち、酵素反応により生成
した赤かつ色の色素を492nｍで測定した。

【表】 免疫反応10分酵素反応５分という短時間であ
つても非常に高感度で、精度の高い測定が可能
であつた。

【図面の簡単な説明】

図−１はAFP濃度25nｇ／ml、図−２はAFP濃
度100nｇ／mlにおける反応速度である。−●−●
−はAFP−Ａ−８に複合体に対するＡ−４結合
の反応速度−○−○−はAFPに対するＡ−４の
結合の反応速度なお、横軸は反応時間（分）、縦
軸はAFPに対するＡ−４の結合率（％）。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ α−フエトプロテインの一の抗原決定基を認
   識し、且つ当該一の抗原決定基に結合することに
   より他の抗原決定基に対する他の抗体の結合を促
   進する性質を有する単クローン性抗α−フエトプ
   ロテイン抗体。 ２ α−フエトプロテインの一の抗原決定基を認
   識し、且つ当該一の抗原決定基に結合することに
   より他の抗原決定基に対する他の抗体の結合を促
   進する性質を有する単クローン性抗α−フエトプ
   ロテイン抗体を用いることを特徴とするα−フエ
   トプロテインの免疫学的測定法。