JP2598893B2

JP2598893B2 - 特異性ｃｅａファミリー抗原に対し特異性の抗体を使用するイム／アッセイ

Info

Publication number: JP2598893B2
Application number: JP59500835A
Authority: JP
Inventors: ジエ−ムスプリマス，フレデリツク; デービツドゴールデンバーグ，ミルトン
Original assignee: プリマス，フレデリックジェームス; ゴールデンバーグ，ミルトンデービッド
Priority date: 1983-01-21
Filing date: 1984-01-20
Publication date: 1997-04-09
Anticipated expiration: 2012-04-09
Also published as: JP2936247B2; AU582731B2; AU2493184A; EP0131627A4; JPH11315100A; CA1274794A; DE3485733D1; EP0131627A1; JPS60500427A; DK436184D0; WO1984002983A1; DK436184A; AU629213B2; JP3074383B2; JPH07188299A; IL70746A; AU3529889A; EP0131627B1; IL70746A0

Description

【発明の詳細な説明】本発明の背景腫瘍特異性の化学的特徴化および決定と、ガン胎児性
抗原（CEA）の臨床応用における大きな問題は、ポリク
ロナール抗血清試薬の使用である。何故ならばCEAは厄
介な、そして大部分不正確で不完全な抗体吸着技術によ
ってある程度限定および特徴化できる多数の抗原性部位
を含んでいることが示されているからである。このよう
に、“精製したCEA"と称するものに対して調製された抗
血清の使用により、少なくとも12種の交差反応性抗原が
記載されている。しかしながらそのような“精製したCE
A"はなおこれら交差反応性抗原決定基の変化量を含有し
ていた。例えば抗血液グループＡ抗血清はCEAおよびCEA
のグリコペプチドフラグメントを結合し得る。

CEA分子はまた、胃がん患者の胃液中にしばしば発見
される胎児スルホグリコタンパクと交差反応性である決
定基を持つことがある。消化管がん、正常結腸、正常
肺、正常脾臓中に、そしてある種の白血球、例えばがん
性を含む顆粒球に多量に存在する非特異的交差反応性抗
原は、最も豊富なCEA交差反応性決定基である。

これら既知のCEAの交差反応性決定基のほかに、CEAを
検出するためのアッセイ、例えば生体外イムノアッセ
イ、生体内ラジオイムノ検出および療法、および生体外
免疫組織化学的検出の特異性を妨害し得る他のものが存
在する可能性がある。従って、そのような交差反応性物
質の特徴化および単離は関心がある。一つの有用な派生
は精密な特異性、例えば密接に関連し、そして交差は反
応性の抗原群中の一つの抗原にのみに発見されるエピト
ープに対する特異性、またはそのような抗原の２種以上
に共通なエピトープに対する特異性を有する抗血清の製
造である。これら抗血清は数多くの臨床および研究室設
備において有用である。エピトープとは、その特異性に
影響する抗原または免疫原の単一決定基と定義される
（Dictionary of Scientific and Technical Terms,McG
raw−Hill,New Yourk,1976）。

過去において、モノ特異性抗CEA抗血清を製造する試
みは、正常組織抽出液または他の物質による徹底的吸着
を採用していたが、しかしこれらの方法は厄介であり、
コントロールが困難で、精密でなく、そしてなおポリク
ロナール抗血清中に存在する交差反応性免疫グロブリン
を有するという問題がつきまとっていた。

最近モノクロナール抗体の使用により前記問題を克服
する試みがなされている。しかしながらCEAに対するモ
ノクロナール抗体を製造するいくつかの試みでさえも、
それらが反応性であるCEAのエピトープのカテゴリー化
を基にして抗CEAモノクロナール抗体の異なるスペシス
を解明できなかった。このように、真のCEA特異性の範
囲は、CEA抗原ファミリー中に発見されるエピトープの
精密な特徴化および／またはCEAと交差反応性の抗原に
発見されるエピトープの解明をなお待たなければならな
い。CEAファミリー抗原とは、CEAと共通するいくつかの
物理化学的および免疫学的性質を有するグリコタンパク
またはタンパク物質のグループと定義される。

イムノアッセイにおいて抗原と特異性抗体の両者を使
用することは既知である。しかしながらそのようなアッ
セイはしばしば誤って規定されたエピトープ特異性を持
った抗原および抗体の使用に限られていた。従って本発
明の一部を構成するいくつかの応用はこれまで可能でな
かった。

免疫組織化学、生体内造影および腫瘍治療の分野にお
ける同様の制限は本発明によって克服される。

本発明の目的本発明の一目的は、CEAおよび／またはCEAと交差反応
性の抗原の精密に限定されたエピトープに対する実質上
モノ特異性の抗体を提供することである。

本発明の他の一目的は、精密に限定されたエピトープ
および免疫反応性を有する精製した抗原および／または
抗原フラグメントを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、CEAファミリー中の抗原
上の特定エピトープの存在を検出する方法を提供するこ
とである。

本発明のなお他の一目的は、同一抗原上または２種の
異なる交差反応性抗原上に存在する少なくとも２種の異
なるエピトープの相対的割合を決定する方法を提供する
ことである。

本発明のなお他の一目的は、病原的状態の診断および
／または鑑別診断方法、および／または密接に関連した
抗体および／または抗原の精密な識別、特徴化および滴
定のための方法を提供することである。

本発明のなお他の一目的は、がんの検出、同定、位置
測定、特徴化およびステージング方法と、腫瘍治療方法
を提供することである。

明細書および請求の範囲のそれ以上の検討により、当
業者には本発明のそれ以上の目的および利益は明らかに
なるであろう。

本発明の要旨以下の説明を読む時もっと容易に明らかになるであろ
うこれらおよび他の目的は本発明によって達成すること
ができる。組成物面においては、本発明は、少なくとも
一つのCEA交差反応性決定基、例えば実質上純粋な胎便
抗原に対する実質上モノ特異性抗体に関する。

方法面においては、本発明は、CEA上またはCEAと交差
反応性の抗原上に存在する、少なくとも一つの抗原上の
特定エピトープの存在を検出する方法に関し、該方法は
前記抗原を前記エプトープに対し特異性の抗体と接触さ
せることよりなる、本発明はさらに、同一または異なる
抗原上に存在する少なくとも二つの異なるエピトープの
相対的比率を測定する方法を提供し、該方法は、前記少
なくとも二つの異なるエピトープを含む被分析物を前記
少なくとも二つのエピトープを有するスペシスを結合す
ることができる少なくとも一つの捕獲抗体と接触させる
工程、生成する結合したスペシスを前記二つのエピトー
プと一方を結合することができるプローブ抗体を含むプ
ローブと接触させる工程、および前記結合したプローブ
の濃度を測定する工程とよりなる。本発明はまたイムノ
アッセイ方法、免疫組織化学方法、生体内検出、位置測
定および治療方法、および精密な抗体、抗原および抗原
フラグメンの単離および生成方法を提供する。

詳細な議論 CEAの発見以来、この抗原の定義はある物理化学的、
免疫化学的、および生物化学的基準を充足する分子に基
づいている。最初に記載されたように、CEAは胎児およ
びがん性胃腸組織へ限定され、そして過塩素酸に可溶
で、特定のアミノ酸および炭水化物組成を有する分子量
200,000のβ−グリコタンパクであった。この物質の同
定は、抗血清が該グリコタンパク上の免疫支配基をもと
の抗CEA抗血清によって検出されるものと同じであると
認識する能力にもっぱら存在していた。後にCEAはその
物理化学的および免疫学的性質において広い不均一性を
示すことが示された。CEAの特徴は、“Immunodiagnosis
of Cancer,Part I",Herberman et al.,Eds.,Marcel Ba
kker,Inc.,New York and Basel 1979と、“Carcinoembr
yonic Proteins:Recent Progress",Norgaad−Pedersen
and Axelsen,Eds,Blackwell Scientific Publications,
london,1978に記載されている。これら参照文献および
それに引用されている参照文献のすべてを参照としてこ
こに取り入れる。

その離床的応用を含むCEAの多数の研究に浸透してい
る大きい問題は、この抗原を検出するために用いる各種
方法の特異性であった。CEAに対して上昇させた慣用の
抗血清は、CEAに密接に関連した物質のグループと反応
する抗体を特徴的に含有する。後者の抗原のうち、最初
に記載すべきは正常ヒト組織、特に肺および脾臓中にCE
Aより高いレベルで存在する60,000分子サイズのグリコ
タンパクである、非特異性交差反応性抗原（NCA）であ
る。それらの免疫化学的類似性に基づいてNCAらしいい
くつかの他の物質が記載され、そしてこれらは正常グリ
コタンパク、CEA関連タンパク、結腸CEA−2,結腸カルシ
ノーマ抗原−III,および腫瘍関連抗原を含む。NCAとCEA
とは、それらが個々に区別される決定基を表現するので
免疫学的に区別することができる。胎便および成人便中
のCEA様抗原の第２のグループも固定された。

Burtinおよび協力者によって特徴化されたNCA−２は
分子サイズがCEAより少し低く、そしてNCAまたはCEAの
どれも持たない決定基を表現した。三つの抗原間に共通
の決定基に加え、第２の決定基はNCA−２とCEAとの間に
だけ共通しているので、NCA−２はNCAよりもCEAへもっ
と密接に関連していように見える。成人便中の正常便抗
原（NFA）は最近三つの分子スペシスに分離され、その
すべては免疫化学的にNCA−2,NCAおよびCEAとは異な
る。胎便中のCEA様抗原とCEAとの間の化学的、抗原的、
および発生的相互関係の解明が必要であった。これら抗
原の一部の臨床的有用性は未知であり、そしてそれらは
CEAの開裂生成物か、CEA前駆体分子か、または本当に異
なる遺伝子生成物を代表するかどうかは未解明であった
が、ポリクロナール抗体によるそれらの同定は関連する
抗原間に等しく共有されない少なくとも三つのCEA上の
エピトープの決定をもたらした。例えば、Burtin,P,Rou
bertie,P.,Chavanel,G.,Sabine,M.C.,およびHirsch−Ma
rie,H.“CEA and related antigens:A study of NCA−
２″;W.H.FishmanおよびS.Sell（eds.）.,“Onco−Deve
lopmental Gane Expression",pp.609−611,New York,Ac
ademic Press,Inc.,1976;Kuroki,M.,Koga,Y.,およびMat
suoka Y.“Puri−fication and characterization of c
arbinoembryonic antigen−related antigens in norma
l adult faces",Cancer Res.h41:713−720,1981;Primus
F.J.,Collins,R.W.,III,およびBlue,A.“Antigenic re
lationship of carcinoembryonic,nonspecificcross−r
eacting,and meconium antigens",Proc.Amer.Ass.Cance
r Res.,22:298,1981参照。

CEAの免疫組織化学的位置決定は、ポリクロナール抗
体を使用して多種類の上皮がんにおいて広く研究されて
いる。それは正常および非がん性病的組織、良性腫瘍、
および種々の器官の異型上皮中に種々の程度に存在する
ので、組織片中のこの抗原の検出は正常または良性細胞
をがん性細胞から区別するのに使用できない。大部分の
研究は、血中抗原レベルの測定は治療の予後およびモニ
タリングを助けることができるが、大部分の研究は一次
腫瘍のCEA染色と病的段階もしくは予後との間の相関関
係を見出していない。

いくつかの研究はCEAに対するモノクロナール抗体の
開発を記載したが、しかし組織片中のこの抗原の免疫組
織化学的検出に対するそれらの使用は適切に探究されな
かった。同様に、Goldenbergの米国特許第4,348,376号
および米国特許出願第414,729号に開示された方法を採
用するがんの生体内造影に本発明によるCEAファミリー
抗原に対する限定されたモノクロナールの応用が今や追
求され、そしていくつかのがんのタイプの検出および位
置決定にいくつかの利益を提供する。同様に、CEAファ
ミリー抗原上のエピトープに対するそのような抗体は、
抗体フラグメントについてのGoldenbergの米国特許第4,
348,376号および第4,331,647号に記載されているよう
な、単一抗体もしくは抗体組合せと、ラジオアイソトー
プ、薬剤、トキシン、または同様な有毒剤でラベルした
抗体とを含むがん免疫療法のための、および中性子捕獲
療法に使用する好ましい試薬である。

CEA検出および生体外イムノアッセイの免疫特異性を
改良するための最近の努力は、CEAに対するモノクロナ
ール抗体の開発および慣用アッセイとの比較に集中して
いる。しかしながら、CEA関連抗原との交差反応性がCEA
に対するモノクロナール抗体でもそれらの慣用の対応物
と同様に遭遇すること、およびそれらのエピトープが適
切に限定されていないCEAファミリー抗原に対するモノ
クロナール抗体の使用はこの応用を重大に制限すること
が予期される。

結腸腫瘍CEAに対し発生させたモノクロナール抗体
は、抗原決定基の三つの一般的クラスをそれらのCEA様
抗原、NCAおよびMAとの反応性に基づいて分化すること
が今や示された（第１図）。クローンの最小パーセント
は三つのすべての抗原が共通して持ち、そしてクラスＩ
のカテゴリーに属するエピトープを認識する抗体を産生
する。クラスIIモノクロナール抗体はCEAおよびMA間に
共通する部位と反応するが、クラスIIIタイプのそれら
はCEAのみを結合し、明らかにこの分子に特有な決定基
を認識する。われわれはNCA交差反応性モノクロナール
抗体NP−１のNCA対する親和性は、そのCEAに対する親和
性に比較して著しく低いことを発見した。それでCEAに
対するモノクロナール抗体のNCA交差反応性質は、抗体
またはNCAの適切な量を直接標識抗体結合または競合的
阻止アッセイに使用しない限り顕在化しない可能性があ
る。NP−１の匹敵する量はCEAおよびMAの両方を結合す
るのに有効であり、そしてMAはNP−１とCEAとの反応を
阻止するのにCEAと類似であるので、これはMAについて
はそのようではないらしい。われわれは、好中球がそれ
らのCEAではなくNCAの既知の合成から予期されるように
NP−１で陽性に染色されることを示した。このように、
好中球の免疫細胞学的染色反応はCEAに対するモノクロ
ナール抗体のNCA交差反応性の代替評価方法を提供す
る。

モノクロナール抗体により限定されるCEAエピトープ
のレパートリーが今や解明できる。相互阻止実験は、ク
ラスＩおよびIIの抗体それぞれNP−１およびNP−２は相
互に阻止可能であるが、そのどれもがクラスIIの抗体NP
−３を阻止できず、またはNP−３によって阻止できない
ことを明らかにした。NP−１とNP−２との間の相互阻止
特性は、それらによって認識されるそれぞれのエピトー
プは部分的に重複または相互に非常に近いことを示唆す
る。しかしながら、NP−２とNP−３との間の相互阻止の
欠如は、それらはクラスIIカテゴリー内の二つの別のエ
ピトープを認識することを指示している。このように、
われわれはわれわれのモノクロナール抗体は結腸腫瘍CE
A上の少なくとも四つの抗原性部位を区別することがで
きることを発見した。その一つはCEA,MAおよびNCAによ
って共に保有され（第１図α１）、他の二つはCEAとMA
とによって共に保有され（β１およびβ２）、そして４
番目はCEAに対し特異性であることが見られ（γ１）、
そしてそれ以外のCEA決定子は第１図に図示した３クラ
スの全部の内に同定されることが予期される。

NP−４モノクロナール抗体および他のクラスIII抗体
は、典型的にはCEAに対して特異的なヤギ抗体によって
認識されるCEA分子の50％未満を結合する。クラスIII抗
体の部分的反応性に対する基礎は、CEA分子の部分個数
の識別に関係している。

CEAに対する免疫特異性モノクロナール抗体の開発の
ための一つの主要目標は、CEA検出の精巧な応用の発達
を促進することである。もしCEAの種々の免疫形が異な
る個体または異なる病状段階で産生されるのであれば、
このアプローチの究極的利益生は限定された特異性を持
ったモノクロナール抗体の複合体の創製に依存するであ
ろう。モノクロナール抗体エピトープ特異性の決定にCE
A関連抗原の取り入れは、CEA検出に対して診断および予
後適切性を有する抗体の境界化を容易にするに違いな
い。これはNCA−2,NFA−2,またはMAとCEAとの間の生物
学的相互関係と、腫瘍マーカーとしての前者の抗原の役
割を解明することによってさらに強化されるであろう。
最後に、CEAに対するモノクロナール抗体の研究に免疫
組織化学のような他の方法の使用は、他に知り得ない予
後可能性を有する分子決定基を明らかにすることができ
る。

本発明のこの開示は、本発明者Primusらによる、Canc
er Research,43（1983年２月発行，印刷中）三つの論文
の完全な開示を含み、該論文を参照として取り入れる。

胎便中のNCA非関連,CEA交差反応性抗原の同定 NCA中和抗CEA抗血清を二重免疫拡散法で個々の胎便サ
ンプルに対して試験する時、ほぼ同数の標本が通常相互
に非常に近似した一つまたは二つの沈降素バンドを与え
る。二つのバンドが存在する大部分の標本においては、
両者はCEAと部分的に一致する反応を生成するが、未抽
出またはPCA抽出標本の10％未満において、第２のバン
ドはCEAと一致する反応を与える。その二つのCEAと交差
反応性の沈降素バンドは、同様に胎便中に存在するCEA
と融合しない。これらゲル拡散バターンは、NCA中和抗
血清にCEAおよびNCAが共有するエピトープへ関連しない
CEA上の二つの共通決定基を認識する二つの追加の抗体
特異性の存在を示している。

CEA抗血清中のNCA非関連CEA交差反応性抗体がラジオ
イムノアッセイ（RIA）による胎便中のCEAの測定に寄与
したかどうかを決定するため、NCA中和抗血清は二重拡
散法によってCEAとの一致反応を与えない胎便サンプル
によってさらに吸収される。この胎便吸収抗血清はCEA
に対する沈降活性を保有し、そしてその標識したCEAの
最大結合は吸収しない抗血清のそれに比較して約10％低
下する。しかしながら、NCA中和抗血清中に当初存在し
た抗体活性の80％以上が胎便による吸収によって除去さ
れる。ロシュ社のキットCEA,NCA−中和抗血清、または
特異性抗CEA抗血清とCEAとを標識したトレーサーおよび
インヒビターとして使用し、RIAによって胎便中のCEA濃
度を比較した。３種のすべての抗血清はCEAによる阻止
に対し同じ感度を得る濃度に調節された。12の胎便サン
プルの分析は、ロシュおよびNCA中和抗血清により測定
したCEA含有は、特異性抗CEA抗血清によって得られる値
よりも３ないし10倍大きい（ｐ＜0.001;スチュデントｔ
−テスト）ことを示した（表１）。

胎便からのMAの精製 MAの精製中の種々のステップにおいて、抗原活性は、
胎便中の種としてNCA非関連CEA交差反応性物質を測定す
るものと考えてロシュ社のキット抗体を使用するRIAに
より、そしてCEA活性を追跡するために特異性抗抗CEA抗
血清によってモニターされた。単離操作中の各種段階に
おけるこれら抗原活性と、特異性NCA濃度とは表２に示
されている。pH8.0において40％エタノール中へと胎便
の抽出はエタノール上清中に当初のMA活性の約75％を与
えた。大きい沈澱がエタノール分画によって生成した
が、上清は粘性でそして高度に着色されたままであっ
た。DEAEセルロース上のエタノール抽出液のクロマトグ
ラフィーは色素の大部分を除去したが、しかし全体のク
ロマトグラムを通じMAのサブ分画を生じた。

セファクリルＳ−300上の0.1M NaCl分画のクロマトダ
ラフィーの後、MA活性の出現は少し小さいサイズで放射
標識したCEAマーカーの溶離と重複した。225ないし270m
lの溶離容積間に出現するMAをプールし、そして二つの
アフィニティークロマトグラフィーのステップへかけ
た。最初のものはMAと複合して残っている少量のCEAを
除去するため、特異性抗CEAを含んでいる免疫吸着剤上
の通過を含んでいた。この操作はCEAの95％を除去した
が、MAの45％が失われ、そして吸着した分画中には発見
されなかった（表２）。第２のステップのため、胎便中
のNCA非関連CEA交差反応性物質の少なくとも一つのグル
ープと交差反応性のネズミモノクロナールCEA抗体,NP−
３を含有する免疫吸着剤がMAを選択しそしてさらに精製
するために用いられた。適用されたMA活性の80％以上が
この免疫吸着剤によって保持された。胎便50gから出発
したMA活性の全収率は４％であり、または0.1M NaCl D
EAE分画中に存在したそれの20％であった。

（ａ）未抽出胎便サンプルは最初PBS中1:4（w/v）を
懸濁し、次にアッセイ前0.01Mホウ酸緩衝液pH8.5中に希
釈した。

（ｂ）値はNCA RIAにおいて測定したNCAの特異性レ
ベル（ｃ） μg/g （ａ） NCAについてはNCA特異性アッセイを使用するRI
A,CEAについてはヤギ特異性抗CEA抗血清を、またはMAに
ついてはロシュ社キット抗体を使用するCEA RIAで測定
した。

精製MAの免疫学的分析 RIAにおける中和活性を基にして、最終的に精製され
たMAはCEAまたはNCA1.0％未満を含有していた（表
２）。NCA中和抗CEA抗血清に対するMAの二重免疫拡散は
CEAとの部分的一致反応を形成する単一沈降素バンドを
与えた。未抽出胎便および後者の抗血清との間に現れる
二つのバンドは両方とも精製されたMAにより形成された
単一ラインに融合した。精製したMAにより１本のみの沈
降素バンドの出現は、それが第２のNCA非関連CEA関連抗
原を含んでいないことを示唆する。精製したMAは二重拡
散において特異性抗CEA抗血清を反応しなかったが、こ
の抗血清はCEAを沈降するその能力は保有していた。MA
は免疫電気泳動においても血清タンパクに関しアルファ
グロブリンとして移動する、NCA中和CEA抗血清に対する
単一沈降素バンドを与えた。

放射標識したMAの抗体結合特性をRIAにおいて評価し
た。表３に示すように、ロシュ社のキットCEA抗体およ
びモノクロナールCEA抗体NP−３の両者は、これら抗体
による標識CEAの結合に比肩し得る、類似量のMAを結合
した。MAの80％以上は標識後短時間にテストする時免疫
反応性であった。ヤギ特異性抗CEA抗血清のみが標識し
たMAと限界的に免疫反応性であったが、ヤギ抗NCA抗体
は比反応性であった。前者の抗血清およびロシュ社のキ
ット抗体はそれらの標識したCEAとの反応性において似
ていた。過剰の特異性抗CEAとロシュ社のキット抗体と
の併用はロシュ社のキット抗体自体によるもの以上にCE
Aの最高結合を増加せず、標識したCEAの同じ主個数が両
方の抗血清によって認識されたことを示している。阻止
アッセイおよび二重拡散はMA中のCEAの有意量を示さな
かったので、ヤギ特異性抗CEA抗血清への標識したMAの
結合に低レベルは、標識したCEA混雑物との反応性では
なく、この抗血清中の残存交差反応性抗体の存在のため
である可能性が最も大であった。

（ａ）４時間45℃でインキュベート後抗体過剰で測定
した。固相ヤギ抗マウスIgGまたはロバ抗ヤギIgGを遊離
抗原から結合抗原を分離するために用いた。

MAの分子サイズリン酸緩衝化食塩水で平衡化したセファクリルＳ−30
0上の標識MAのクロマトグラフィーは、CEAよりも少し大
きい溶離容積においてのみ溶離する単一の対称ピークを
与えた。MAおよひCEAの溶離パターンにおけるこの関係
は、6.0MグアニジンHClで平衡化し溶離されるセファク
リルＳ−300上の通過の後にも維持された。MAとCEAとの
間のサイズ分布の重複は、校正したゲル上の還元したサ
ンプルのSDS−PAGE電気泳動の後にも観察された。標準
の移動度に対する対数分子サイズプロットからの補内法
による、MAに対する分子サイズの推定は、CEAについて2
00,000に対し、185,000の値を与えた。Coomassieブリリ
アントブルーまたは周期的酸性シッフ試薬によるSDS−P
AGE中の還元したMAの染色は、CEAと似た位置へ移動する
単一拡散バンドを示した。

コンコナバリン−ＡへのMAの結合コンカナバリン−Ａセファローズへの放射標識MAの結
合をCEAおよびNCAのそれと比較した。CEAおよびNCAの９
％以上がこのレクチンへ結合したが、MAの20％未満が反
応性であった。

CEAおよびMAのプロナーゼ消化プロナーゼＥによるCEAの消化はヤギ特異性抗CEA抗血
清とのその反応性を完全に除去し、そしてNP−３モノク
ロナール抗体またはロシュ社キットヤギ抗体へのその結
合力の50％低下をもたらした。この抗体結合活性の損失
または低下は酵素の不存在下の同様な処理の後には観察
されなかった。6.0MグアニジンHClで平衡化したセファ
クリルＳ−300上の酵素消化液のクロマトグラフィー
は、CEAの大部分が小さいフラグメントへ分解されたこ
とを示した。対照的に、MAの酵素消化はNP−３およびロ
シュ社キット抗体へのその結合力を20％減らし、そして
その分子サイズにほんの少しの減少をもたらした。胎便
抗原MAと命名された、胎便中のNCA非関連CEA関連分子ス
ペシスの一つのための我々の単離操作は、初期段階にお
ける免疫分離ステップの適用を避ける。これは、アフィ
ニティークロマトグラフィーに有利な特性を持った抽出
液を提供する手段として、過塩素酸PA単独またはアルコ
ールとの併用による可溶化に失敗したためである。テス
トした異なるアルコール濃度およびpH範囲の中で、pH8.
5における40％アルコールが最良のMA可溶化および最大
の不適切タンパクの沈澱を得た。その後のDEAEセルロー
ス上のクロマトグラフィーは色素の大部分を残す望まし
い特徴を持つが、不適切なタンパクおよびNCAの大量は
吸着されなかった。これらの利益はイオン交換体上に観
察されるMA活性のサブ分画に重きを置かせた。最終段階
において、MAはCEAに対する交差反応性モノクロナール
抗体NP−３を含有する免疫吸着剤へ特異的に吸着され
た。モノクロナール抗体の使用は、他の決定基に関して
は差が存在し得るけれども、該抗体によって認識される
エピトープの表現において均一である分子スペシスを選
択する利益を有する。

MAは、NCA−２と、そして成人便中のCEA様抗原のNFA
ファミリー、特にNFA−２から区別される。NCA−２およ
びNFA−２は分子サイズ、および炭水化物およびアミノ
酸組成においてCEAと類似である。免疫学的には、NCA−
２はCEAと二つのエピトープを共有し、一方NFA−２上に
は三つの交差反応部位が示された。我々はCEAに対する
モノクロナール抗体について、胎便中の二つのNCA−非
関連CEA交差反応性物質の一つを代表するMAはCEAと少な
くとも三つのエピトープを共有することを発見した。胎
便中の第２のCEA関連抗原は、CEAおよびMAの両方に存在
する少なくとも一つの交差反応部位を欠いている。

MAは前に記載した胎便中の他のCEA関連抗原から識別
し得る。MAはCEAと類似の分子サイズを有するが、しか
し我々が使用した慣用の抗血清によってCEA上に区別さ
れる少なくとも一つの決定基を欠くことにおいて抗原的
には異なり、そしてこの相違はCEAに対するモノクロナ
ール抗体でも認められる。さらに、MAはCEAまたはNCAの
どちらよりもコンカナバリンＡに対しもっと低い親和性
を有する。このレクチンに対するMAの低親和性は、CEA
およびNCAからMAの分離のための、特異性免疫吸着剤を
必要としない他の可能性ある方法を提供する。MAおよび
他のNCA非関連CEA関連抗体は合体して胎便中CEAよりも
約約６倍高い濃度で現れるとの我々の観察は、これら抗
原はCEAよりも分化の早期マーカーであることを指示す
るかも知れない。精製したMAの供給はCEAに対するモノ
クロナール抗体のエピトープ特異性と、そしてCEA,MAお
よびNCA間のこれらエピトープの分布の境界分けを容易
にした。

正常結腸粘膜の染色形態学的に正常な結腸粘膜の染色はすべての４種のモ
ノクロナール抗体をもって可視化できた。これはホルマ
リンでなく、エタノール／酢酸（EA）中の固定した標本
中に最良に観察された。正常および腫瘍上皮の陽性染色
は、抗原中和ポリクロナール抗血清および腹水と反応さ
せたものを含む対照片には現れなかった。ホルマリンで
はなくEA中に固定した標本はしばしば試験片および対照
片中に結合組織の可変非特異性染色を示した。

ヤギ抗血清およびモノクロナール抗体NP1,2および４
による正常粘膜の染色は、陽性染色が主として陰窩の上
方レベルを覆う円柱細胞の細胞質および粘膜表面に局在
した。腺または消化管腔内の分泌物質も染色されたが、
ゴブレット細胞の粘液は抗原陰性であった。これら抗体
のすべてによる染色反応の強度および存在は陰窩間で全
く様々であったが、しかしヤギ抗CEAおよびNCA抗血清お
よびNP−１モノクロナール抗体により最も顕著であっ
た。NP−４モノクロナール抗体は不変的に他の抗体のど
れよりも一層顕著でない弱い染色反応を与えた。

正常結腸上皮細胞のほかに、標識した抗原結合を基に
してNCAと交差反応することが既知のクラスＩモノクロ
ナール抗体NP−１も、血管内および血管外組織中の好中
球を染色した、この染色反応はEA中に固定した標本中で
は容易に明らかであったが、ホルマリン中ではそうでは
なかった。好中球局在化はイムノペルオキシターゼ操作
によって可視化できたが、それは好中球中の内在ペルオ
キシターゼ活性の阻止を必要とせず、このためバックグ
ラウンドレベル以上の陽性抗原染色の認識を容易にする
イムノグルコースオキシターゼ法によって容易に識別さ
れた。NP−１に加え、研究した他の抗体の中でヤギ抗NC
A抗血清のみが好中球を染色した。

結腸腫瘍の染色ヤギ抗CEAおよびNCA抗体、それにNP−1,2および３モ
ノクロナール抗体は中程度に分化した結腸腺がんの22例
のすべてをそれらの結腸中の発生部位に関係なく染色し
た。これら結腸腺がんの約70％（15/22）はクラスIIIモ
ノクロナール抗体NP−４と陽性染色反応を与えた。ホル
マリン中に固定した標本に得られた支配的染色パターン
は腫瘍細胞および腺内沈着物の尖端表面の標識であっ
た。NP−４抗体を除き、腫瘍標本の同じ面積が他の抗体
により類似した強度へ染色されたが、細胞局在化におい
て絶対的な対応性は確立されなかった。モノクロナール
抗体のうち、NP−１はその強度および範囲において一貫
してより強い染色を与え、いくつかのケースにおいてギ
ヤは抗CEAまたはNCA抗血清により得たものよりも大であ
った。NP−４染色の強度は６ケースにおいて他の抗体に
より得たものよりも少し低かったが、それは残りの９標
本においては著しく低下した。腫瘍腺の大部分は12例に
おいてNP−４によって染色されたが、他の３標本におい
ては腫瘍組織の30ないし50％がこの抗体と反応した。こ
れらの例のすべてにおいて、腫瘍組織の80％以上が他の
抗体と反応した。NP−４陰性と分離された２例は、腫瘍
腺の10％未満に弱い病巣反応を与えた。

一次腫瘍の６標本については、EA中の別の固定に十分
な材料が利用可能であった。抗体のすべてによる染色の
強度は各例についてホルマリン固定後に観察されたもの
以上にEA固定標本で高められた。腫瘍細胞の細胞質染色
はEA固定標本中では非常に明瞭であったが、ホルマリン
固定後はそれは存在しないかまたは弱くなった。EA固定
組織における細胞質染色の増強はヤギ抗血清のそれと比
較してNP−４抗体ではそれほど大きくなかったが、前者
の抗体によって得られた全体の染色反応はホルマリン固
定標本と比較するときEA固定組織ではかなり大であっ
た。

退行性がんの一例だけが研究され、そしてこれはヤギ
およびモノクロナール抗体のすべてについて完全に陰性
であった。

転移のNP−４染色検査した中程度に分化した腺がんの22例のうち、Duke
の階段A,B,CおよびＤ患者からの一次腫瘍の1/1,5/7,3/4
および6/10がそれぞれNP−４と反応した。患者数が少な
くてNP−４反応性と臨床的階段化との間の正確な相関関
係に到達できないけれども、これら予備的結果は絶対的
な関係を確立されないであろうということを示唆する。
NP−４反応性と結腸または直腸中の腫瘍の位置との間の
関係も明らかでなかった。上記患者８人から、それぞれ
DukeのＣおよびＤ段階の２例および６例からホルマリン
固定標本として領域リンパ節および／または肝臓転移が
研究のため得られた。これら標本は、ヤギ抗CEAおよびN
CA抗体、そしてNP−３およびNP−４モノクロナール抗体
で染色された（表４）。NP−４抗体は、この抗体で陽性
に染色される単一片中に可視化されたそれらの一次腫瘍
組織を80％以上有する患者においてさえも、転移腫瘍に
おいては僅かの陽性染色反応を与えたのみであった。こ
れら転移の大部分はヤギ抗体およびNP−３モノクロナー
ル抗体との反応性を残していた。

２人の患者Ｃ−２およびＤ−３の領域リンパ節および
肝臓転移はそれらの染色表現型においてさらに相違を示
した（表４）。患者Ｃ−２からの二つの結節は抗体のす
べてと反応しなかったが、第３の結節はNP−４抗体のみ
と陰性反応を与えた。患者Ｄ−３からの一つの結節は抗
体のどれによっても染色されず、加えて他の一つの結節
および肝臓転移はヤギ抗CEA抗血清と、NP−３およびNP
−４モノクロナール抗体で染色されなかった。対照的
に、残りの４結節および肝臓転移はNCA陽性であった。
患者Ｄ−３からのこれらの標本をNCA交差反応性モノク
ロナール抗体NP−１に対してテストした時、その染色パ
ターンはヤギ抗NCA抗体で得られたものと同じであっ
た。

（ａ）＝NP−４で陽性に染色される一次腺腫瘍のパーセ
ント（ｂ）＝文字はDukeの段階を示す。数字は個々の患者を
特定する。

（ｃ）＝試験した全数中の陽性数の比形態学的に類似した腫瘍の究極的な攻撃的行動はそれ
らが生成するいくつかの抗原マーカーの検出によって確
かめることができる可能性は、いくつかのがんのタイプ
の免疫組織化学的研究から出現した。他のマーカーで
は、ある抗原の分子または微妙な決定基変化の識別はポ
リクロナール抗体によって本来認識されるエピトープの
多様性のために見落とされたであろう。これらの分子変
化の同定は、もしそれらががん細胞の生物学的表現にお
ける付随した変化に本当に結びつくのであれば有意義で
あろう。モノクロナール抗体の精密な免疫特異性は、こ
れらの抗原修飾を探究することがそれによって可能な道
具を提供し、そしてこの態様において我々はポリクロナ
ール抗体と、CEAに対して誘導された４種のモノクロナ
ール抗体とを用いて、結腸腺がんの染色特性を比較し
た。

慣用の抗血清を使用した免疫組織化学により正常結腸
にCEAの存在を示した以前の実験から予測されるよう
に、この組織は３種の交差反応性モノクロナール抗体に
よって染色された。これは、NCAおよびMAとの交差反応
性を欠くがしかし標識した抗原結合性に基づいてCEA分
子の少数個数を認識するように見えるNP−４についても
真理である。これら抗体による染色は個々の抗体と反応
させた別々の組織片に可視化されるように、同じ細胞内
において局在化されるように見えた。モノクロナール抗
体は結腸ゴブレット細胞の粘液を染色しなかった。モノ
クナール抗体のうち、NP−１だけがそれらによる既知の
NCA合成から予見し得るように、ヤギ抗NCA抗体とも同様
に反応する好中球を染色した。このように、免疫組織学
的操作は他の方法によって決定されたCEAに対するモノ
クロナール抗体の特異性を確認することができ、そして
他の方法が容易に利用できない時それらのNCA交差反応
性を同定するのに有用である。

NP−４抗体を除き、他のモノクロナール抗体および慣
用のヤギ抗血清は一次の中程度分化結腸腫瘍のすべて
と、そしてこの研究において検査した領域リンパ節およ
び肝臓転移の大部分を染色した。NP−４からは、一次腫
瘍の約30％が非反応性であり、そしてNP−４陽性一次腫
瘍から発生し転移の大部分はこの抗体で染色されなかっ
た点で相違する染色パターンが出現した。

我々は、NP−４モノクロナール抗体で得られた染色強
度は、ホルマリンでなくEA中に固定した一次腫瘍標本に
おいて相当に改善されることを発見した。その代わり
に、陽性一次腫瘍を持つ患者の転移のNP−４染色の殆ど
実質上の不存在は、転移腫瘍からの認識された決定基も
しくは抗原のもし定量的でなくても定性的欠失か、また
は抗原陰性腫瘍細胞のクローニングを示唆する。

我々は組織中の決定基表現を循環中のそれと未だ比較
していないが、組織CEA決定基不均一性の存在は、モノ
クロナール抗体で測定したこの抗原の血中濃度と疾病活
性と間の相関関係に潜在的問題で発生することを示唆す
る。ここに提供した免疫組織化学的研究を基にして、我
々は様々の部位における腫瘍による循環抗原への相対的
寄与およびイムノアッセイに使用されるモノクロナール
抗体の特異性に依存して、多様なアッセウイ結果および
疾病活性との貧弱な相関関係を予想する。

抗体特異性と、組織および血中の反応性抗原の存在に
関して基本的疑問が未解答であるが慣用の組織病理学標
本いついて便利に適用し得る免疫組織化学は、予後およ
び診断価値を有するCEA変種または決定基と反応するモ
ノクロナール抗体を識別するのに大きい役割を持つであ
ろう。これは結腸腫瘍のラジオイムノ検出および抗体利
用療法に対するモノクロナール抗体の適切な選択にもあ
てはまる。

CEAハイブリドーマクローンのクラス抗原結合プロフィルは、CEAハイブリドーマクローン
はそれらのCEA,MAおよびNCAとの比較免疫反応性（表
５）を基にして三つの別のクラスに分化できることを明
らかにした。第１の融合からのクローンの大部分はCEA
およびMA（クラスII）を結合する抗体を産生し、第２の
融合からのクローンはクラスIIと、そしてCEA反応性の
みを示すもの（クラスIII）との間に大体等しく分布し
た。三つの抗原すべてとの反応性（クラスＩ）は、第１
および第２の融合からのクローンのそれぞれ16％および
２％に見られた。表１に記載した結果は希釈培養物上清
の50μ部分標本をアッセイすることによって得られ
た。クラスＩおよびIIのクローンによる標識CEAの結合
パーセントは似ていたが、クラスIIIのクローンには一
貫して低い値を与えた。MAに対するクラスＩおよびIIの
クローンの反応性はそれらのCEAの結合に似ていたが、
クラスＩのクローンの培養物上清は標識NCAお平均して
9.9％（f2.4 S.E.）結合した。この低いNCAの結合は、C
EAおよびMA結合に必要な抗体の量に比較して、高いNCA
結合を得るため抗体の高濃度が必要であることに帰せら
れる。NCAの最適結合もCEAおよびMAに比較してより長い
インキュベーション時間を要した。

CEA反応培養物のどれも、分泌者および非分泌者個人
の両者から得たヒト赤血球へ結合しなかった。

選択したクローンのRIAにおける抗原結合性クラスＩからの１種（NP−１），クラスIIからの２種
（NP−２およびNP−３）、およびクラスIIIからの１種
（NP−４）の４種のハイブリドーマクローンが選択さ
れ、そしてそれ以上の特徴化のために再クローンされ
た。NP−1,2および３抗体は無ガンマウマ血清を含有す
る培地から精製され、NP−４は腹水として使用された。
NP−1,2および３クローンはIgG 1（κ）サブクラスを産
生したが、NP−４クローンはIgG 1（λ）アイソタイプ
を産生した。これら４種のモノクロナール抗体は二重免
疫拡散においてCEAを沈澱しなかった。NP−1,2および３
は、ヤギ抗CEA抗体のCEAおよびMAとの反応性と同様に、
これら抗体の60ないし70％を結合した。NP−４はMPを結
合せず、そして放射標識CEAの最高約30％のみを結合し
た。正常ネズミ腹水または血清はCEAと反応せず、そし
てNP−４について観察された最高CEA結合レベルは他の
クラスIIIハイブリドーマの特性である。CEAおよびMAの
結合に加えて、クラスＩモノクロナール抗体NP−１はヤ
ギ抗NCA抗体と同程度に標識したNCAと反応した。しかし
ながらNP−１の2600ngが標識NCAの30％を結合するのに
必要であったが、同じレベルのCEAおよびMAを結合する
のにこの抗体1.1および2.5ngが必要であった。CEAに比
較して少し多い量のNP−２がMAを結合するのに必要であ
ったが、NP−３については反対であった。

クラスIIIハイブリドーマクローンNP−４はヤギ抗CEA
抗体による70％の結合と対照に標識CEAを最高30％だけ
結合するので、NP−４はヤギ抗体によっても検出される
CEA分子の母集団を認識することを示すために二つの実
験が計画された。第１の実験は、NP−４とヤギ抗血清と
をそれぞれについて最高抗原結合レベルの量において混
合し、次にＺ−ゲルにより遊離抗原から結合抗原を分離
することにより、CEAの添加結合について試験した。こ
の試験の結果は、併用抗原混合物によるCEAの結合はヤ
ギ抗血清単独で得られるものよりも大きくないことを示
した。もしNP−４がヤギ抗血清と反応したものとは別の
標識分子の個数を認識したものであれば、二つの抗体の
混合物は個々の結合パーセントの合計にほぼ等しい抗原
結合パーセントを与えた筈である。第２の実験は、標識
抗原をヤギ抗体と、次いでNP−４と順次にインキュベー
トし、次に固相ヤギ抗マウス抗体により遊離抗原から結
合抗原を分離することにより、ヤギ抗体がNP−４と標識
抗原との反応を阻止する能力を評価した。添加実験を基
にして予期されたように、ヤギ抗CEA抗血清はNP−４の
標識抗原への結合を完全に阻止した。正常ヤギ血清また
は不適切なNCAに対するヤギ抗体は効果がなかった。

（ａ）ハイブリドーマ培養50μを個々に放射標識抗
原への結合についてアッセイした。

（ｂ）抗CEA活性を示すクローンの合計数中の特定ク
ラスへ属するクローンの数。カッコ内の数字は各クラス
へ属するクローンのパーセントを指示する。

（ｃ）平均±S.E. 競合的阻止および抗原親和性未標識CEAが４種のハイブリドーマモノクロナール抗
体の標識したCEAとの反応を阻止する能力を競合的RIAで
試験した。この操作において、使用したモノクロナール
またはヤギ抗体の量は、未標識抗原の不存在下標識抗原
の50％結合を与えるように調節した。これら条件下にお
いて、４種のモノクロナール抗体は著しく異なった抗原
阻止曲線を発生した。NP−１抗体は抗原阻止感度におい
てロシュ社キットヤギ抗体へ似ていないが、NP−2,3お
よび４モノクロナール抗体は阻止のためもっと多量の抗
原を必要とした。CEAの分子サイズとしてM 200,000を用
い、得られたデータをミューラーの方法によって平均ア
フィニティー定数の決定に変換した（表６）。この処理
によって得られたＫ値と、結合を50％阻止するのに必要
なCEAのng/mlは、NP−１とヤギ抗CEA抗体との間の抗体
親和性との類似性と、そしてNP−2,3および４の減少す
る抗体親和性を例証する。

標識したCEAまたはMAよりも標識したNCAを結合するの
に著しく高いレベルのNP−１モノクロナール抗体を要す
るため、NP−１の標識CEAとの反応をCEA,MAおよびNCAが
阻止する能力を比較した。結果は、MAおよびNCAはこの
反応と競合することができるが、しかしCEAに比較し
て、結合を50％減らすのにMAおよびNCAをそれぞれ約２
および８倍必要とした。MAおよびNCAの阻止は、ヤギ特
異性抗CEA抗体によるRIAで測定してこれら製剤はCEA1.0
％未満を含有していたので、CEA混入によるものではな
かった。試験したNCAの最高濃度においてのみ、CEA挟雑
物がNCAによって誘発される阻止へ寄与し始める。CEA,M
AおよびNAに対しそれぞれ200,000〜185,000および60,00
0の分子量を使用して、NP−１はそのCEAに対する親和性
に比較して、MAに対しては少し低く、そしてNCAに対し
ては10倍低かった。

（ａ）標識CEAの抗体結合を50％阻止するのに要する
未標識CEAのモル濃度またはng/ml モノクロナール抗体結合の阻止２種のモノクロナール抗体NP−２およびNP−３をCEA
結合に対するインキュベーション緩衝液イオン強度の影
響を基にして研究のために最初に選択した。標識CEAの3
0％の結合を得るため、0.01M酢酸アンモニウムに比較し
て0.1Mでは、ヤギ、NP−１およびNP−２のかなりの多
量、NP−２では36倍が必要であることが発見された。対
照的に、これら２種の緩衝液中のNP−３およびNP−４に
よる抗原結合は非常に似ていた。NP−２およびNP−３が
クラスIIIカテゴリーリー内の別々のエピトープを認識
する可能性は相互阻止実験によって分析された。これら
研究において、CEAで増感された固相ポリクロナールヤ
ギ抗CEAを放射標識モノクロナール抗体プローブを使用
するサンドウィッチ系に使用した。未標識モノクロナー
ル抗体が放射標識抗体の結合を阻止する能力を相互交差
阻止実験において評価した。別々のクラスカテゴリーへ
属するが、NP−１およびNP−２は相互を阻止するのに非
常に効率的であった。NP−３は試験した最高濃度におい
てNP−１およびNP−２結合を阻止できず、後者のモノク
ロナール抗体をNP−３のCEAへの結合を阻止できなかっ
た。

本発明は、同じまたは異なる抗原上に存在する少なく
とも二つの異なるエピトープの相対的割合をそれによっ
て決定することができる一般的イムノアッセイ方法を含
む。該方法は、（ａ）同じ分子または異なる分子上の少なくとも二つ
の異なるエピトープを含有する被分析物をこれら二つの
エピトープを担持するスペシスを結合し得る少なくとも
一つの捕獲抗体と接触させるステップ、（ｂ）生成する結合したスペシスを二つのエピトープ
の一つを結合し得るプローブ抗体を含むプローブと接触
させるステップ、および（ｃ）結合したプローブの濃度を測定するステップと
よりなる。

捕獲抗体は、結合される、結合されるとができる、も
しくは固相を形成するように沈澱し得る、および／また
は任意の方法で被分析物から分離し得る抗体または抗体
混合物であろう。例えば捕獲抗体は前記二つの異なるエ
ピトープを含んでいる二つの異なる抗原を結合し得るポ
リクロナール抗体、測定すべき二つの異なるエピトープ
に対し特異性のポリクロナール、またはモノクロナール
または実質上モノ特異性な抗体、測定すべき二つのエピ
トープの両方とから異なるがしかしそのような二つの異
なるエピトープと同じ抗原上にあるエピトープを結合し
得る抗体、または適切な特異性を有する抗体フラグメン
トを含む、任意の他の均等な抗体または抗体混合物であ
り得る。捕獲抗体は固体支持体、例えば種々の物質の固
形粒子、例えばポリスチレン、ポリエチレン、ガラスそ
の他へ結合させることができ、または例えば捕獲抗体に
対し特異性な他の抗体との反応により、または沈澱その
他によって後で分離し得る相を形成するように結合する
能力を持つことができる。その代わりに、捕獲抗体は例
えば磁化もしくは他の公知のプロセスによって分離する
ことができる材料へ結合させることができる。

一旦決定すべき二つのエピトープを担持するスペシス
を捕獲抗体へ結合すれば、生成した結合スペシスは二つ
の異なるエピトープの一方を結合することができるが他
方はできないプローブ抗体と接触させられる。好ましく
は、プローブ抗体は実質上モノ特異性および／またはモ
ノクロナール抗体であろう。プローブ抗体の結合は捕獲
抗体結合エピトープ間の識別を許容する。この決定は慣
用のイムノアッセイ操作から適用した種々の技術を使用
して実施することができる。適当なそのような技術はプ
ローブ抗体へ標識、例えばラジオアイソトープ、蛍光マ
ーカー、酵素その他を結合し、捕獲抗体、決定すべき二
つのエピトープを含むスペシスおよびプローブ抗体を含
んでいる複合体を被分析物の残りから分離し、そして標
識の濃度を測定することを含む。その代わりに、競合阻
止および／または他の間接測定を実施することができ
る。その上に少数の、または好ましくは単一のエピトー
プを持っている抗原フラグメントを含む、精密に限定さ
れた抗原および／または抗原フラグメントが、そのよう
な操作に適した別のプローブスペシスを使用し、イムノ
アッセイによって抗体を検出するための捕獲スペシスと
して使用することが認識されるであろう。

生体外液標本中の抗原検出に基づくイムノアッセイ
は、固相担体へ結合した抗体または抗原のどちらも同様
に使用できる競合的および非競合的操作に大別される。
選ばれるアッセイの特定のタイプは、精製した抗体およ
び抗原の入手可能性、反応を定量するために使用するマ
ーカーでこれら試薬を標識できる容易性、望まれる感度
レベル、アッセイの企図する目的、それにアッセイのオ
ートメーションへの適応可能性に依存する。

酵素標識抗体を使用する固相非競合的イムノアッセイ
が、それらの簡単さと実施容易性のために多数抗原およ
び／またはエピトープ決定によく適している。このタイ
プの操作には二つの主要ステップが含まれる。抗原溶液
が不活性担体上へ固定化された抗体へ露出される。この
抗原捕獲段階の間、固定化抗体は抗原と反応し、その後
全体の複合体が不活性担体を緩衝液で洗浄することによ
って余計な物質から分離される。次に過剰の酵素標識遊
離抗体が固定化抗体担体抗原複合体へ添加される。この
抗体プローブ段階の間、遊離抗体は捕獲抗体によって担
体へ二次的に結合した抗原と相互反応する。次に担体を
洗浄し、酵素基質溶液とインキュベートし、そして検出
された酵素標識抗体の量はテスト標本中に抗原および／
またはエピトープの濃度に正比例する。

本発明において同定されたモノクロナール抗体は、限
定されたエピトープ特異性と、そして高められた結合定
数とを基にして選択される。例として、共通のCEA−MA
−NCAエピトープを認識するモノクロナール抗体は5.3×
10¹¹M^-1の親和定数を有し、そしてこの値はポリクロナ
ール抗体の1.6×10¹²M^-1の定数より少し小さいだけであ
る。イムノアッセイは二つのタイプに構成される。第１
のものは、疏水性結合によってポリスチレンボールへ結
合された捕獲抗体として、CEAファミリーのすべてを認
識する広スペクトルモノクロナール抗体を有する。アガ
ロース、セルロース、アクリルアミド、ポリカーボネー
トおよび鉄粉のような他の不活性担体も使用することが
できる。ボールは次に血清のような生物学的標本か、ま
たは遊離担体プローブの結合をステト標本中の抗原の濃
度と関連させるために使用される外既知量の抗原CEA,MA
もしくはNCAへ露出される。インキュベーションおよび
洗浄後、結合した捕獲された抗原を持つ個々のボール
は、特異性または共通のエピトープ認識能を有する酵素
標識モノクロナールおよびポリクロナール抗体プローブ
へ露出される。抗体標識に適当なマーカー酵素は、ペル
オキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリ性フ
ォスファターゼまたはβ−ガラクトシターゼを含む。そ
の代わりに、酵素の代わりに螢光または放射活性化合物
を抗体標識のために使用することができる。インキュベ
ーションおよび洗浄後、ボールへ結合した酵素活性を適
切な酵素基質溶液とインキュベーションによって測定
し、そして生成した着色生成物のレベルを分光分析によ
って決定する。この方法により、各抗原の特異レベルが
決定され、そして個々に同様なまたは異なる病気を有す
る患者間で比較され、または全体として特異性抗原の比
として比較される。特異性抗体レベル、それらの凝集
比、および部分的または全体の共通エピトープ表現は、
がん性対非がん性疾病を持つ患者間で、そして疾病活動
または退化の異なる段階によって変化することが予期さ
れる。

固相アッセイの第２のタイプは第１のタイプと同じ態
様に構成されるが、主な例外はモノ特異性モノクロナー
ルおよびポリクロナール抗体が別々にボールへ結合さ
れ、そして抗原捕獲のために使用されることである。捕
獲抗体のそれとは異なる、適当な抗体上の第２の特異性
エピトープに対する特異性を有するモノクロナール抗
体、または共通エピトープ抗体が抗体プローブとして使
用される。

これらのイムノアッセイ技術は、被分析物中の特異性
抗原および／または抗体を検出するため、不均質抗原お
よび／または抗体混合物の純度および／または交差反応
性を評価するため、酵素、標識もしくはトキシンのよう
な薬剤もしくはマーカーで標識した抗原または抗体を含
む、抗原および／または抗体の純度および力価を決定す
るため、または密接に関連する抗原の混合物、例えばCE
Aファミリー中に存在する抗原の比、酵素抽出液中のイ
ソ酵素、リンパ腫細胞によって産生される抗体のK/L光
チェーンの比、血液もしくは羊膜液中の胎便抗原の相対
的上昇温度等を測定するために用いることができる。

密接に関連する抗原および／またはそのエピトープ特
徴の存在および／または相対的豊富度の定性的および／
まはた定量的測定をなし得る能力は、種々の診断状況に
おいて有用であり得る。例えば、NCAに対するCEAの比
は、非がん性消化管病、例えば潰瘍性結腸炎に対する消
化器がん、特に結腸がんの識別診断を助けるために使用
することができる。他の例は、のう胞性線維症の診断お
よび／または予後インディケーターとして、血中胎便抗
原の存在を検出するための前記操作の使用である。毛膜
液中の上昇したMAレベル、および／または毛膜液中のCE
A以上のMAの上昇した相対的比率は、便／母性問題、特
に難便のインディケーターである。ヒト絨毛ゴナンドト
ロビンα−サブユニットおよびβ−サブユニットの相対
比率の検出は、腫瘍の特定タイプ、例えば栄養胚葉腫瘍
の診断を助けることができる。

前述の方法は循環しているリンパ球の部分母集団の比
の決定に適合させることができる。これは感染症、例え
ばインフルエンザおよび肝炎の診断に、そしてリンパが
んのタイプ化のために有用である。イソ酵素の存在およ
び／または相対比率の測定のためのこのイムノアッセイ
の洗練の使用は、イソ酵素の異常レベルを特徴とする種
々の病変、例えば血流中へ高レベルにおいてクレアチン
キナーゼ−MBの放出によって特徴化される心筋梗塞、お
よびある種の肝臓デヒドロゲナーゼイソ酵素の異常レベ
ルを特徴とする種々の病変の検出および管理を助けるこ
とができる。

特定の腫瘍関連決定基の検出のためのイムノアッセイ
技術および／または免疫細胞化学技術的の使用は診断に
有用である。例えば、特定の決定基の存在はがんの支持
証拠であろうし、そして推定的がんが異所的部位にある
場合は、これは転移腫瘍の存在の協力な指示であろう。
CEAの決定基特徴の存在を示すが、しかし移所的であ
る、すなわち発生した器官とは異なる器官中にそして多
分悪性腫瘍細胞中に発見されるCEA産生腫瘍の転移の検
出は腫瘍転移の強力な確認証拠である。

がんの早期からもっと進行した状態への腫瘍の進行は
いくつかの決定基の表現またはそれらのそう失によって
決定することができる。これは好ましくは特異性エピト
ープに対するモノクロナール抗体の使用により、ラジオ
イムノアッセイおよび／または免疫細胞化学的方法によ
って検出することができる。ある決定基の存在または不
存在は、このように腫瘍進行指示または特定段階の相関
し、また予後インディケーターとしても役立つ。

この方法の使用の他の例は、骨髄球白血病において腫
瘍負担のインディケーターとして白血病患者中のNCAの
検出である。

本発明は、CEAファミリー抗原上の器官特異性エピト
ープをこれらエピトープに特異性の抗体を使用して検出
することを許容する。前述した操作と同様に、これら抗
体は免疫細胞化学的、生体外イムノアッセイおよび生体
内造影操作によって新生物の組織形成源の決定のため
に、そしてまたそのような腫瘍の一層選択的免疫療法の
ために使用することができる。すべて参照としてここに
取り入れる米国特許第4,331,647号、第4,348,376号およ
び第4,361,544号に記載されている腫瘍位置測定、検出
および治療方法は、以前に指示したように本発明の方法
および組成物と組み合わせることができる。例えば、CE
A上の特定エピトープに特異性のモノクロナール抗体
は、腫瘍位置決定および／または治療のため米国特許第
4,348,376号の方法に従って使用することができる。CEA
ファミリー抗原に対して特異性な二つの異なる抗体から
のＦ（ab）^２フラグメントの混合物は、米国特許第4,33
1,647号の方法に従って使用するための二価ハイブリッ
ド抗体フラグメントの製造に使用することができる。CE
Aの精密なエピトープに特異性の抗体と結腸特異性抗原
−ｐ（CSAp）とは、適当な放射性標識と共に、特定の腫
瘍のタイプ、特に結直腸がんのための増加した結合性を
有する抗体製剤を製造するために協力的に使用すること
ができる。

本発明の新しいモノクロナール抗体を免疫組織化学的
技術またはイムノアッセイ操作を使って骨髄白血病およ
びある種のリンパ腫の検出のために使用することも有用
である。免疫組織学的技術による組織サンプル中のCEA
検出に使用されるいくつかのCEA特異性抗体、それらが
モノクロナール抗体であるかもまたはポリクロナール抗
体であるかに関係なく比較し得るであろうが、他の場合
には、本発明によるモノクロナール抗体の使用は有意義
な利益、特にそれらはもっとコンスタントな結果を与え
る利益を有するであろう。本発明による抗原の免疫組織
化学的応用は、同じ組織標本中の多数マーカー局在化の
ため、それへ導入された異なる標識、例えば放射標識、
螢光標識等を有するこれら抗原の使用を含む。他の用途
はリンパ腫表現型におけるK/L軽チェーン比の決定また
は白血病患者の組織中のNCAの検出におけるように、組
織中のマーカー比の検出である。

本発明の抗体は、慣用技術、例えばアフィニティクロ
マトグラフィー、沈澱その他を使って抗原決定基の精製
のために使用することができる。それらはまた新規な決
定基および関連する抗原のファミリー中の未だ限定され
ない決定基を解明するための助けとして使用することが
できる。反対に、単一エピトープを含有する抗原フラグ
メントを含む精製抗原は抗体、例えばモノクロナール抗
体、不均質抗体製剤、および血液、組織、他の体液その
他のような他の調製物を検出し、精製し、滴定しそして
特徴化するのに用途がある。精製した抗原は、融合の必
要性なしに高度にモノ特異性の抗体の製造のため、すな
わちモノクロナール抗体と実質上同じモノ特異性を有す
る抗体をそれらの製造のためハイブリドーマ技術を使用
しない製造のために勿論有用である。

抗原性フラグメントを生成するための高度に精製した
抗原の消化は、該フラグメントが単一の免疫化学的に活
性はエピトープへ限られる場合、そのような技術の有用
性をさらに増幅する。本発明抗原は、例えばスタフィロ
コッカスプロテアーゼＶ−8,トリプシン、キモトリプシ
ン、サーモリシンその他のようなタンパク分解酵素へ露
出することによってフラグメント化することができる。
フラグメントは共通または特定エピトープ特異性を有す
る結合したモノクロナール抗体を含有する免疫吸収剤を
使用することによって単離することができる。好ましく
は、そのようなフラグメントは単一エピトープのみを含
有するであろう。

これ以上苦心することなく、当業者はこれまでの説明
を使用し、本発明をその全範囲において使用することが
できるものと信じられる。従って以下の好ましい特定具
体例は単に例証であり、記載の残部を少しも限定しない
ものと考えるべきである。以下の実施例において、すべ
ての温度は未補正摂氏であり、すべての部およびパーセ
ントはことわりのない限り重量による。

実施例１腫瘍組織からCEAおよびNCAの精製この研究に用いたCEA製品は、RIA用を除いて、Newman
et al,（Cancer Res.34:2125,1974）によって修飾され
たKrupey et al,（Immunochem.9:617,1972）の操作に従
って、結腸アデカルチノーマの肝臓転移から単離され
た。概して、濃縮したPCA抽出液は0.1M NH₄Ac,pH4.0へ
平衡化したDEADおよびCMセルロース1:1混合物（Whatma
n,Clifton,N.J.）へ適用された。吸着された物質を同じ
緩衝液中の0.05M,0.1Mおよび0.2M NaClの非連続勾配で
溶離し。PCA抽出液の当初のCEA免疫反応性の約30％が、
ロシュCEAアッセイキット（Nitly,N.V.）でモニター
し、適用緩衝液（Ａ）,0.05M NaCl（Ｂ）、お余び0.1M
NaCl（Ｃ）分画のめいめい中に出現した。該Ｃ分画は、
0.05M PO₄,pH5.0プラス0.15M NaCl緩衝液中のセファロ
ーズ6BおよびセファデックスＧ−200（ファルシマ）上
の順次クロマトグラフィーにかけた。コンカナバリン−
Ａセファローズ（ファルマシア）上の最終分離ステップ
は、PritchardおよびToddの方法に従って実施され、そ
れにより吸着された抗原は室温で20％（w/v）のα−メ
チル−Ｄ−グルコシッドで溶離された。CEAは蒸溜水に
対して透析され、凍結乾燥され、CaCl₂上でコンスタン
ト重量へ乾燥された。精製したCEAはロシュアッセイで
決定する時特異活性（単位乾燥重量当たりの中和活性）
0.7を持っていた。それは免疫電気泳動において正常ヒ
ト血清に比較してα−グロブリンとして移動し、そして
二重免疫拡散においてロシュ参照CEAと一致するバンド
を与えた。タンパクまたは炭水化物のために染色した7.
5％ポリアクリルアミドゲル中において単一バンドが観
察された。

DEAD−CMセルロースイオン交換体からのＡ分画はNCA
を含有し、そしえ５×90cmセファデックスＧ−200カラ
ム上のクロマトグラフィーによってこの分画中にやはり
存在するCEAから分離された。NCAの存在は二重免疫拡散
によってモニターされ、抗原活性のピークは1000ないし
1200mlの溶出容積中に現れた。この分画はCEAについて
記載したコンカナバリン−Ａセファローズクロマトグラ
フィーにかけられ、そして吸着された抗原は抗NCA免疫
吸着剤上の通過によってさらに精製された。NCAは0.2 M
グリシン−HCl,pH2.0によって免疫吸着剤から溶出さ
れ、NaOHで中和され、PSBに対して透析され、そしてAmi
con PM−10膜（Amicon,Lexington,Mass）上で凝縮され
た。精製されたNCAは免疫電気泳動においてβ−グロブ
リンとして移動し、そして二重免疫拡散において参照NC
Aとの一致反応を与えた。NCAはまた前に記載したように
（Primus et al.,J.Immunol.118:55,1977）免疫沈澱に
よって正常脾臓から部分的に精製された。

実施例２胎便からMAの精製胎便50gを0.1M PO₄,pH8.0の300ml中に懸濁し、一夜４
゜で混合した。30分間10P000×ｇにおいて遠心後、上清
のpHを8.5へ調節し、そして冷無水エタノールを最終濃
度40％まで加えた。遠心後得られたエタノール性上清を
0.02M PO₄,pH7.8に対して透析し、同じ緩衝液で平衡化
したDE52（Whatman）5.0gと混合した。適用した緩衝液
で未結合物質を溶出した後、吸着した物質を同じ緩衝液
中の非連続NaCl勾配で除去した。0.1M NaCl分画中に出
て来る抗原活性を0.05M PO₄,pH5.0プラス0.15NaClに対
して透析し、YM−10膜（Amicon）上で濃縮し、そして2.
6×90cmセファクリルＳ−300（ファルマシア）カラムへ
適用した。225ないし270ml溶離容積に含まれている抗原
活性をプールし、0.1M PO₄,pH7.0に対して透析し、そし
てヤギ特異性抗CEA抗体を含有する免疫吸着剤の上を通
過させた。後者の免疫吸着剤からの未吸着分画を次に記
載した胎便モノクロナールCEA抗体NP−３を含んでいる
第２の免疫吸着剤へ適用した。ヤギからの交差反応性CE
A抗体による阻止研究を基にして、NP−３は胎便中のCEA
およびNCA非関連物質間に共有される決定基を認識する
ことを示した。NP−３へ結合した抗原をNCA精製のため
前記のように溶離した。吸着した分画を中和し、PBSに
対して透析し、そしてYM−10膜上で凝縮した。

実施例３動物免疫および抗血清の製造ヤギ抗CEA血清は、等量のメチル化ウシ血清アルブミ
ン（Sigma,St.Louis,Mo）へ結合しそして等容積の完全
フロインドアジュバント（Difco,Detroit,Mich）中に乳
化した精製CEA100ないし200μｇの注射によって調製し
た。不完全アジュバントは最初の注射の後で使用され
た。21回の注射の後得られたヤギ抗CEA抗血清は、血液
凝集活性がなくなるまで、Le^aおよびLe^b個人からのA,B
およびＯ赤血球で反復吸収した。抗血清は次に正常結腸
およびNCA免疫吸着剤上の順次クロマトグラフィーにか
けられ、吸着されない分画が両方の場合に使用された。
吸着の完全性は、正常組織抽出液およびNCAに対する二
重免疫拡散において分析された。NCA中和抗CEA抗血清の
一部は、抗血清ml当たりアルコール抽出胎便250mg（乾
燥重量）を加えることにより胎便でさらに吸収された。
免疫沈澱の分離後、吸収の完全性は胎便に対する二重免
疫拡散により証明された。このNCAおよび胎便吸着抗血
清は、以後特異性抗CEA抗血清と同定された。

ヤギ抗NCA抗血清は、CEA免疫吸着剤上の通過によって
CEAと交差反応する抗体を除去された。CEA中和抗血清は
二重免疫拡散またはRIAにおいてCEAと反応しなかった。

実施例４抗原およびヤギ抗血清マウス免疫に使用するCEAおよびNCAは、結腸アデノカ
ルチノーマの肝臓転移から単離され、そしてMAは胎便か
らPrimus et al.,Cancer.43,Feb.,1983（以後“Primus
'83）に記載のように単離された。すべての抗原はクロ
ラミンＴ法により¹²⁵I（Amersham,Arlington Heights,I
L）で約30Ci/gの比活性へ放射ヨード化された。ロシュC
EAアッセイキット（Nutley,N.J.）からの放射標識CEA
は、それが免疫化のために使用したCEAで得られたもの
と同様の結果を与えることが判明した時、日常的に用い
られた。

ロシュキットのヤギ抗CEA抗体はRIAに用いられた。ヤ
ギ抗NCA抗血清（No.80）は、Roche Research Center,Nu
tley,N.J.のEdward Newmanの好意で供給され、そして使
用前CEA免疫吸着剤上の通過によってCEAと交差反応する
抗体が除去された。

ヤギ抗血清との標識CEA,MAおよびNCAの結合特性はPri
mus '83に記載されている。ロシュキット抗体と、NCAお
よび胎便で吸収したCEAに対し特異性となしたヤギ抗CEA
血清は、標識CEAと同様に反応した。標識したMAはロシ
ュキット抗体によって結合されたが、しかしヤギ特異性
抗CEA抗血清によっては結合されなかった。NCAはロシュ
キット抗体または特異性抗CEA抗血清と反応せず、また
ヤギ特異性抗NCA抗体はCEAおよびMAと結合しなかった。

実施例５マウス免疫化３ないし４月令のBALB/C雌マウス（Harlan−Sprague
−Dawley,Indianaporis,IN.）へ、不完全フロインドア
ジュバント中のCEA20μｇのi.p.注射３回を投与した。
２回目および３回目の注射は第１回からそれぞれ２およ
び８週離した。最初の免疫化から６ケ月後、CEAに対す
る血清抗体を示す２匹のマウスを脾臓細胞ドナーとして
選び、そしてStahli et al.のRes.Monogr.Immunol.3:20
1,1981の免疫化プロトコールに従って食塩水中各50mgの
最終CEA注射シリーズを受けた。融合の４日および１日
前に、CEAをi.p.注射し、融合の３日および２日前に、
それはi.p.とi.v.注射のために等量に分離した。

実施例６細胞融合およびクローニング Primus '83に引用されているMcKearnの方法に従っ
て、２匹のCEA免疫マウスから得た脾臓細胞と二つの別
々の融合が実施された。各融合のため、５×10⁷のFicol
l−Hypaque分離脾臓細胞と５×10⁶,P3_-×63−Ag8.653骨
髄細胞（Salk Institute San Diego,CA.）とを60mm培養
皿中で混合し、250×ｇで５分間遠心した。過剰の媒体
を除去し、そして37℃でDulbeccoの修飾イーグル培地
（GIBCO,Grand Island,N.Y.）中50％（v/v）ポリエチレ
ングリコール（1500,fisher）1.0mlで置換した。ポリエ
チレングリコールへ30秒露出後、細胞を２回洗浄し、そ
して次に20％無ガンマウマ血清（KC Boilogicals,inc.,
Lenexa,KS）,L−グルタミン2mM,ピルビン酸ナトリウム1
mM,L−アルギニン0.55mM,L−アスパラギン0.27mM,およ
び葉酸14μＭを補給したDulbeccoの修飾イーグル培地5m
l中で一夜インキュベートした。細胞をヒポキサンチン
0.1mM,アミノプテリン0.4μm,およびチミジン16μm,を
さらに補給した後者の培地30ml以上中に分散した。細胞
分散液を96ウェルのミクロウェルプレート（Caster,Cam
bridge,Mass.）中にウェル当たり100μづつ分配し
た。アミノプテリンの除いた培地の追加100μを７日
後にウェルへ加えた。培養２ないし４週後、生育してい
る細胞クローンを含んでいるウェルからの培地をRIAに
よってCEA抗体についてアッセイした。CEA抗体陽性ウェ
ルを、ウェル当たり10⁷個の照射した（1400R）ルイスラ
ット胸腺細胞を含んでいる24ウェルプレート（Costar）
中へ広げた。交会に達した時、抗体陽性を持続している
すべての培養物を凍結し、他方４クローンを制限希釈度
において２回再クローンした。ハイブリドーマをウェル
当たり10⁶個の照射ルイスラット胸腺細胞を含んでいる9
6ウェルプレート中に再クローンした。選択された再ク
ローンしたハイブリドーマ細胞系統を10％無ガンマウマ
血清と、Ｌ−グルタミン2mMと、ピルビン酸ナトリウム1
mMとを補給したDulbecco修飾イーグル培地を収容した培
養フラスコ中に拡大した。

実施例７モノクロナール抗体精製モノクロナール抗体は10％無ガンマウマ血清を含有す
る培地から精製された。概して、免疫グロブリンをpH7.
0において50％（NH₄）₂SO₄で沈澱し、蒸溜水の再溶解
し、ポリエチレングリコール（7000−9000）で最終濃度
13％（w/v）において再沈澱した。ポリエチルングリコ
ール沈澱は0.02M PO₄,pH5.6中に溶解し、同じ緩衝液中
で平衡化したCMセルロース（Whatman,Clifton,N.J.）へ
適用した。吸着された免疫グロブリンを0.02M PO₄,pH7.
8プラス0.2M NaClで溶離し、0.01M PO₄,pH8.0に対して
透析し、そして後者の緩衝液で平衡化したDEAEセルロー
ス（Whatman）カラムへ適用した。吸着された抗体を0.0
25M PO₄,pH8.0で溶離し、PBSに対して平衡化し、限外ロ
過（Amicon,Danvers,MA.）によって濃縮した。精製した
モノクロナール抗体はクロラミン−Ｔ法によって比活性
５ないし10μCi/μｇへ放射性ヨード化された。マウスI
gGに加え、精製した抗体は、放射性ヨード化した製品を
固相ヤギ抗ウマIgGへ結合させることによって測定し10
ないし40％のウマ免疫グロブリンを含有していた。製品
中のモノクロナール抗体のパーセントは、Primus et a
l.,J.Immunol.118:55,1977に記載されているように、放
射性ヨード化した製品のCEA免疫吸着剤への結合によっ
て決定された。

実施例８ RIA（ラジオイムノアッセイ）結合および遊離標識抗原の分離方法について異なる二
つのタイプのRIAが使用された。抗CEAおよび抗MA抗体活
性についてパイブリドーマ培養物からの上清培地アッセ
イは、Hansen et al,Himan Pathol.,5:139,1974記載の
Ｚ−ゲル法を使用した。選定したモノクロナール抗体の
CEAおよびMAとの結合研究と、そしてNCA反応についての
すべてのアッセイは、固相ダブル抗体操作（Newman et
al,Proc.Am.Assoc.Cancer Res.21:218,1980）を使用し
た。基本アッセイは、10％正常ウサギ血清と、約0.5ng
の標識抗原（30ないし50μCi/μｇ）と、そして抗体製
品の0.05ml部分標識とを含む2.0mlの0.01M NH₄Ac,pH6.2
5とからなっていた。45゜１時間のインキュベーション
がハイブリドーマ培養中のCEAおよびMA抗体活性の検出
に使用され、同温度４時間のインキュベーションがNCA
抗体の検出に使用された。標識抗体結合曲線および競合
的阻止測定は、それぞれ45゜４時間および室温24時間の
インキュベーション後に誘導された。インキュベーショ
ン後、Ｚ−ゲルまたは固相抗免疫グロブリンGAMもしく
はDAGの1mlへ添加され、試験管が混合された。Ｚ−ゲル
が入っている試験管を直ちに遠心し、GAMまたはDAGが入
っている試験管については追加の室温15分のインキュベ
ーションが実施された。試験管は、カウントの前に0.1M
NH₄Ac（Ｚ−ゲルアッセイ）またはPBS（ダブル抗体ア
ッセイ）2.0mlで一回洗浄した。非特異性結合は、Ｚ−
ゲルおよびダブル抗体アッセイに対しそれぞれ10％およ
び１％であった。モノクロナール抗体、ヤギ抗血清、未
標識抗原、および標識抗原はヒト血清アルブミン1.0％
を含有するPBS中に希釈された。

実施例９抗体親和性測定抗体親和性は、Mueller,J.Immunol.Methods 34:345,1
980の競合RIA法によって測定した。計算した結合定数と
抗体濃度との積は、Jacobsen et al.J.Immunol.Method
s.50:77,1982によって推奨されるように10未満であっ
た。

実施例10 阻止アッセイ相互阻止実験は固相競合サンドイッチ操作を使用し
た。ポリクロナールヤギ抗CEA血清はフッ化ビニリデン
粉末（Kynar,グレード 30/F;Pennwalt Corp.,King of P
russia,PA.）へ結合され、0.01M NH₄Ac中45゜１時間の
インキュベーションにより未標識CEAで増感された。使
用したCEAの量は結合し得る放射標識モノクロナール抗
体の最大量の40％を結合した。CEA増感Kynar0.5mlをモ
ノクロナール抗体希釈液の0.05ml部分標本と45゜で１時
間インキュベートし、遠心し、そしてペレットを１％正
常ウサギ血清を含有する0.01M NH₄Ac1.0ml中に再懸濁し
た。0.05ml中に含まれる放射性ヨード化モクロナール抗
体を試験管へ加え、45゜で１時間インキュベートし、遠
心し、一回洗浄し、そしてペレットをカウントした。標
識した抗体製品の未増感Kynarへの非特異性結合は５％
未満であった。

実施例11 赤血球結合 A,BおよびＯ分泌者および非分泌者個人からの赤血球
を同個数で２％または10％懸濁液として混合し、そして
ハイブリドーマ組織培地の50μ部分標本と室温で１時
間インキュベートした。血球を洗浄し、PBS中に再懸濁
し、そして重い軽いチェーン特異性を有する放射性ヨー
ド化アフィニティー精製GAMと室温で１時間インキュベ
ートした。インキュベーションした後、赤血球を洗い、
カウントした。

実施例12 組織処理および固定結直腸がんを有する23人から組織を得た。これらアデ
ノカルチノーマのうち、３例は盲腸、６例は上行結腸、
および14例は直腸Ｓ状結腸であった。１例はあまり分化
されていなかったが、残りはよく分化されていた。腫瘍
に隣接したおよび／または切除縁の形態上正常な粘膜が
これらの例の21例から入手可能であった。Dukeの分類が
臨床的ステージングに使用された（Duke,G.E.,J.Patho
l,Bacteriol.35:322,1932）。

外科標本は日常的に10％緩衝化ホルマリンpH7.2中の
固定され、６例においては、それらはPrimus et al.,J.
Natl.Cancer Insti.,67:10,1981に以前記載したようにE
A中にも固定された。組織はパラフィン中に埋め込ま
れ、５μｍの厚さに順次切片化された。切片はゼラチン
化スライド上にマウントされ、キシレンで脱パラフィン
化され、減少するエタノールと、最後にPBSで再水和さ
れた。

実施例13 免疫組織化学的操作 BRAB免疫ペルオキシダーゼ方法がヤギおよびモノクロ
ナール抗体による染色反応の大部分のために使用された
（Guesdon et al.,J.Histochem.Cytochem.27:1131,197
9）。ヤギ抗体による基本的操作は、一時ヤギ抗体、ビ
オチン化ウサギ抗ヤギIgG（50μg/ml），遊離アビシン
（100μg/ml），およびビオチン化ワサビペルオキシダ
ーゼ（50μg/ml）を順次適用することによりなってい
た。ビオチン化試薬およびアビシンはVector Laborator
ies（Burlingame,CA）から得た。アビシンを0.05M トリ
ス,pH8.6プラス0.15M NaCl中に希釈したのを除き、すべ
ての試薬はPBS中に希釈された。ネズミモノクロナール
抗体による抗原の検出のため、基本的操作はモノクロナ
ール抗体の最初の適用後アフィニティー精製ヤギ抗マウ
ス IgG（30μg/ml）ステップの導入によって修飾され
た。すべての免疫およびビオチン−アビシン反応は加温
雰囲気内において37℃で20分および室温で30分間実施さ
れた。各ステップの後PBS中２回５分間洗浄した。各ス
ライド中の一切片はテスト抗体を受け、隣りの切片は対
照品へ露出された。ヤギ抗CEAおよび抗NCA抗血清をそれ
ぞれ1/600および1/100希釈度で使用した。これら抗血清
の対照は、同様に希釈した抗原中和CEAおよび／また正
常ヤギ血清からなっていた。モノクロナール抗体は５μ
g/mlで使用し、そして正常マウスIgG（Pel−Freeze,Rog
erl,AR）は50μg/mlで使用し、そして抗体中和精製モノ
クロナール抗体および腹水を対照目的に使用した。一次
抗体の適用前に、水和した切片は、メタノール中３％H₂
O₂中でインキュベートし、PBS中で洗浄し、そして希釈
した正常ウサギ血清と37℃で10分間インキュベートし
た。ビオチン化酵素ステップの後、組織化学的反応を0.
05M トリス−HCl,pH7.6中の0.01％ジアミノベンジジン
および0.003％H₂O₂により、室温15分間で進行させた。
免疫ペルオキシダーゼ染色スライドをHarrisのヘマトキ
シリンで明るく対比染色した。

グルコースオキシダーゼ抗グルコースオキシダーゼ複
合体を使用する未標識抗体方法（Clark et al,J.Histoc
hem.Cytochem.30:27,1982）を好中球中のNCAの検出のた
めに使用した。基本的操作は、ロバ抗ヤギIgGおよびヤ
ギ抗グルコースオキシダーゼ−グルコースオキシダーゼ
複合体をそれぞれビオチン化ウサギ抗ヤギIgGおよびビ
オチン化ワサビペルオキシダーゼの代わりに使用したこ
とを除き、BRAB技術に類似であった。アビジンおよびH₂
O₂ステップも省略し、そして正常ウサギ血清の代わりに
未希釈正常ウマ血清とのプレインキュベーションを使用
した。酵素開示反応は以下のものからなっていた。6.7m
g/ml β−Ｄ−グルコース（calbiochem−Behrinnger,La
Jolla,CA）,0.67mg/mlNBT（Reseach Orgfnics Incs.,Cl
eveland,OH），および0.005M トリス,pH8.3中の0.0167m
g/mlフェナジンメトサルフェート（Sigma,St.Louis,M
O）。グルコースおよびNBTを37℃で１時間プレヒート
し、その時点でフェナジンメトサルフェートおよび組織
片を加えた。37℃においてさらに45分インキュベーショ
ン後、スライドを洗浄し、そして核ファーストレッドで
対比染色した。

以上の実施例は、本発明の一般的にまたは特定的に記
載した反応剤および／または作業条件を以上の実施例に
用いたそれらに代えることにより、同程度の成功度をも
ってくり返すことができる。

以上の説明から、当業者は本発明の必須の特徴を容易
に確かめることができ、そしてこの精神および範囲から
逸脱することなく、それを種々の用途および条件に適合
させるため種々の変更および修飾をすることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者プリマス，フレデリツクジエ−ムスアメリカ合衆国 08867ニユ−ジヤ−ジ −，ピツツタウン、ル−ト１、ピ−オ− ボツクス６ (72)発明者ゴールデンバーグ，ミルトンデービツドアメリカ合衆国 07078ニユ−ジヤ−ジ −、シヨートヒルズ、デンマンコート 11 (56)参考文献特開昭59−5120（ＪＰ，Ａ) 特開昭56−46819（ＪＰ，Ａ) 特表昭57−500195（ＪＰ，Ａ) 国際公開81／1469（ＷＯ，Ａ) Ｂｒ，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，43 Ｐ．１ −４（1981) Ｂｒ，Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，44 Ｐ. 371−380（1981) Ｓｃｉｅｎｃｅ，212 Ｐ．53−55 （1981) ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．41，Ｐ．3306 −3310（1981) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，77．563−566（1980)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】血清又は血漿サンプル中のガン胎児性抗原
（CEA）の定量のためのイムノアッセイ方法にあって、（１）サンプルと、CEA,胎便抗原及び非特異的交差反応
性抗原によって共有されるエピトープに特異的に結合す
る、ハイブリドーマより誘導された抗CEAモノクローナ
ル抗体である、固体支持体へ結合された捕捉抗体とを、
該サンプル中のCEAへの抗体結合を許容するに充分な時
間接触させるステップ、（２）前記捕捉抗体へ結合したCEAをその上に有する得
られた固体支持体と、検出可能に標識した抗CEAプロー
ブ抗体とを、該プローブ抗体が前記捕捉抗体へ結合した
CEAに結合するに充分な時間接触させ、そして前記捕捉
抗体へ結合したCEAへの前記プローブ抗体の結合の程度
を測定するステップよりなり、そして前記プローブ抗体は、CEA上のあるエピトーブへ
は特異的に結合するが、しかし胎便抗原および非特異的
交差反応性抗原のいずれとも特異的に結合しない、ハイ
ブリドーマより誘導された抗CEAモノクローナル抗体で
あることを特徴とする前記イムノアッセイ方法。
【請求項２】前記プローブ抗体は、ラジオアイソトー
プ、蛍光マーカー又は酵素によって標識されている請求
項１記載の方法。
【請求項３】血清又は血漿サンプル中のガン胎児性抗原
（CEA）の定量のためのイムノアッセイキットであっ
て、該イムノアッセイを実施するに充分な量において、（１）CEA,胎便抗原及び非特異的交差反応性抗原によっ
て共有されるエピトープに特異的に結合する、ハイブリ
ドーマより誘導された抗CEAモノクローナル抗体であ
る、固体支持体へ結合させた捕捉抗体と、（２）前記捕捉抗体とは別異の抗体であり、かつCEA上
のあるエピトープへは特異的に結合するがしかし胎便抗
原および非特異的抗差反応性抗原のいずれとも特異的に
結合しない、ハイブリドーマより誘導された抗CEAモノ
クローナル抗体である、検出可能に標識された抗CEAプ
ローブ抗体、を含んでいることを特徴とする前記キット。
【請求項４】前記プローブ抗体は、ラジオアイソトー
プ、蛍光マーカー又は酵素によって標識されている請求
項３記載のキット。
【請求項５】血清又は血漿サンプル中のガン胎児性抗原
（CEA）の定量のためのイムノアッセイ方法であって、（１）サンプルと、CEA,胎便抗原及び非特異的交差反応
性抗原によって共有されるエピトーブに特異的に結合す
る、ハイブリドーマより誘導された抗CEAモノクローナ
ル抗体である、固体支持体へ結合された捕捉抗体とを、
該サンプル中のCEAへの抗体結合を許容するに充分な時
間接触させるステップ、（２）前記捕捉抗体へ結合したCEAをその上に有する得
られた固体支持体と、検出可能に標識した抗CEAプロー
ブ抗体とを、該プローブ抗体が前記捕捉抗体へ結合した
CEAに結合するに充分な時間接触させ、そして前記捕捉
抗体へ結合したCEAへの前記プローブ抗体の結合の程度
を測定するステップよりなり、そして前記プローブ抗体は、CEAおよび胎便抗原によっ
て共有されるエピトープへは特異的に結合するがしかし
非特異的交差反応性抗原へは特異的に結合しない、ハイ
ブリドーマより誘導された抗CEAモノクローナル抗体で
あり、かつ該プローブ抗体のCEAおよび胎便抗原によっ
て共有されるエピトープへの結合は、CEA,胎便抗原およ
び非特異的交差反応性抗原によって共有されるエピトー
プに対して特異的に結合する、ハイブリドーマより誘導
された抗CEAモノクローナル抗体によっては交差ブロッ
クされないことを特徴とする前記イムノアッセイ方法。
【請求項６】前記プローブ抗体は、ラジオアイソトー
プ、蛍光マーカー又は酵素によって標識されている請求
項５記載の方法。
【請求項７】血清又は血漿サンプル中のガン胎児性抗原
（CEA）の定量のためのイムノアッセイキットであっ
て、該イムノアッセイを実施するに充分な量において、（１）CEA,胎便抗原及び非特異的交差反応性抗原によっ
て共有されるエピトープに特異的に結合する、ハイブリ
ドーマより誘導された抗CEAモノクローナル抗体であ
る、固体支持体へ結合させた捕捉抗体と、（２）前記捕捉抗体とは別異の抗体であり、かつCEAお
よび胎便抗原によって共有されるエピトープへは特異的
に結合するがしかし非特異的交差反応性抗原へは特異的
に結合しない、ハイブリドーマより誘導された抗CEAモ
ノクローナル抗体であるプローブ抗体にして、該プロー
ブ抗体のCEAおよび胎便抗原によって共有されるエピト
ープへの結合は、CEA,胎便抗原および非特異的交差反応
性抗原によって共有されるエピトープに対して特異的に
結合する、ハイブリドーマより誘導された抗CEAモノク
ローナル抗体によっては交差ブロックされない検出可能
に標識された抗CEAプローブ抗体、を含んでいることを特徴とする前記キット。
【請求項８】前記プローブ抗体は、ラジオアイソトー
プ、蛍光マーカー又は酵素によって標識されている請求
項７記載のキット。