JPH07188299A - モノ特異性抗ｃｅａモノクローナル抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ＣＥＡに対してモノ特異性であり、胎便抗原
および非特異的交差反応性抗原のいずれへも結合しない
抗ＣＥＡモノクローナル抗体を提供する。 【構成】 ２００，０００ダルトンＣＥＡ上の一つのエ
ピトープへ特異的に結合するが、しかし胎便抗原および
非特異的交差反応性抗原のいずれへも特異的に結合しな
い、精製されたハイブリドーマ由来抗ＣＥＡモノクロー
ナル抗体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明の背景 腫瘍特異性の化学的特徴化および決定と、ガン胎児性抗
原（ＣＥＡ）の臨床応用における大きな問題は、ポリク
ロナール抗血清試薬の使用である。何故ならばＣＥＡは
厄介な、そして大部分不正確で不完全な抗体吸着技術に
よってある程度限定および特徴化できる多数の抗原性部
位を含んでいることが示されているからである。このよ
うに、“精製したＣＥＡ”と称するものに対して調製さ
れた抗血清の使用により、少なくとも１２種の交差反応
性抗原が記載されている。しかしながらそのような“精
製したＣＥＡ”はなおこれら交差反応性抗原決定基の変
化量を含有していた。例えば抗血液グループＡ抗血清は
ＣＥＡおよびＣＥＡのグリコペプチドフラグメントを結
合し得る。

【０００２】ＣＥＡ分子はまた、胃がん患者の胃液中に
しばしば発見される胎児スルホグリコタンパクと交差反
応性である決定基を持つことがある。消化管がん、正常
結腸、正常肺、正常脾臓中に、そしてある種の白血球、
例えばがん性を含む顆粒球に多量に存在する非特異的交
差反応性抗原は、最も豊富なＣＥＡ交差反応性決定基で
ある。

【０００３】これら既知のＣＥＡの交差反応性決定基の
ほかに、ＣＥＡを検出するためのアッセイ、例えば生体
外イムノアッセイ、生体内ラジオイムノ検出および療
法、および生体外免疫組織化学的検出の特異性を妨害し
得る他のものが存在する可能性がある。従って、そのよ
うな交差反応性物質の特徴化および単離は関心がある。
一つの有用な派生は精密な特異性、例えば密接に関連
し、そして交差反応性の抗原群中の一つの抗原にのみに
発見されるエピトープに対する特異性、またはそのよう
な抗原の２種以上に共通なエピトープに対する特異性を
有する抗血清の製造である。これら抗血清は数多くの臨
床および研究室設備において有用である。エピトープと
は、その特異性に影響する抗原または免疫原の単一決定
基と定義される（Dictionaryof Scientific and Techni
cal Terms, McGraw-Hill, New Yourk,1976）。

【０００４】過去において、モノ特異性抗ＣＥＡ抗血清
を製造する試みは、正常組織抽出液または他の物質によ
る徹底的吸着を採用していたが、しかしこれら方法は厄
介であり、コントロールが困難で、精密でなく、そして
なおポリクロナール抗血清中に存在する交差反応性免疫
グロブリンを有するという問題がつきまとっていた。

【０００５】最近モノクロナール抗体の使用により前記
問題を克服する試みがなされている。しかしながらＣＥ
Ａに対するモノクロナール抗体を製造するいくつかの試
みでさえも、それらが反応性であるＣＥＡのエピトープ
のカテゴリー化を基にして抗ＣＥＡモノクロナール抗体
の異なるスペシスを解明できなかった。このように、真
のＣＥＡ特異性の範囲は、ＣＥＡ抗原ファミリー中に発
見されるエピトープの精密な特徴化および／またはＣＥ
Ａと交差反応性の抗原に発見されるエピトープの解明を
なお待たなければならない。ＣＥＡファミリー抗原と
は、ＣＥＡと共通するいくつかの物理化学的および免疫
学的性質を有するグリコタンパクまたはタンパク物質の
グループと定義される。

【０００６】イムノアッセイにおいて抗原と特異性抗体
の両者を使用することは既知である。しかしながらその
ようなアッセイはしばしば誤って規定されたエピトープ
特異性を持った抗原および抗体の使用に限られていた。
従って本発明の一部を構成するいくつかの応用はこれま
で可能でなかった。

【０００７】免疫組織化学、生体内造影および腫瘍治療
の分野における同様の制限は本発明によって克服され
る。

【０００８】本発明の目的 本発明の一目的は、ＣＥＡの精密に限定されたエピトー
プに対する実質上モノ特異性の抗体を提供することであ
る。

【０００９】明細書および請求の範囲のそれ以上の検討
により、当業者には本発明のそれ以上の目的および利益
は明らかになるであろう。

【００１０】本発明の要旨 本発明は、２００，０００ダルトンガン胎児性抗原上の
一つのエピトープへ特異的に結合するが、しかし胎便抗
原および非特異的交差反応性抗原のいずれへも特異的に
結合しない、精製されたハイブリドーマから誘導された
抗ＣＥＡモノクローナル抗体に関する。

【００１１】詳細な議論 ＣＥＡの発見以来、この抗原の定義はある物理化学的、
免疫化学的、および生物化学的基準を充足する分子に基
づいている。最初に記載されたように、ＣＥＡは胎児お
よびがん性胃腸組織へ限定され、そして過塩素酸に可溶
で、特定のアミノ酸および炭水化物組成を有する分子量
２００，０００のβ−グリコタンパクであった。この物
質の同定は、抗血清が該グリコタンパク上の免疫支配基
をもとの抗ＣＥＡ抗血清によって検出されるのもと同じ
であると認識する能力にもっぱら依存していた。後にＣ
ＥＡはその物理化学的および免疫学的性質において広い
不均一性を示すことが示された。ＣＥＡの特徴は、“Im
munodiagnosis of Cancer,Part Ｉ”, Herberman et a
l., Eds., Marcel Bakker, Inc., New York and Basel
1979と、“Carcinoembryonic Proteins ：Recent Progr
ess ”, Norgaad −Pedersen and Axelsen, Eds, Black
well Scientific Publications, London, 1978に記載さ
れている。これら参照文献およびそれに引用されている
参照文献のすべてを参照としてここに取り入れる。

【００１２】その臨床的応用を含むＣＥＡの多数の研究
に浸透している大きい問題は、この抗原を検出するため
に用いる各種方法の特異性であった。ＣＥＡに対して上
昇させた慣用の抗血清は、ＣＥＡに密接に関連した物質
のグループと反応する抗体を特徴的に含有する。後者の
抗原のうち、最初に記載すべきは正常ヒト組織、特に肺
および脾臓中にＣＥＡより高いレベルで存在する６０，
０００分子サイズのグリコタンパクである、非特異性交
差反応性抗原（ＮＣＡ）である。それらの免疫化学的類
似性に基づいてＮＣＡらしいいくつかの他の物質が記載
され、そしてこれらは正常グリコタンパク、ＣＥＡ関連
タンパク、結腸ＣＥＡ−２，結腸カルシノーマ抗原−II
I ，および腫瘍関連抗原を含む。ＮＣＡとＣＥＡとは、
それらが個々に区別される決定基を表現するので免疫学
的に区別することができる。胎便および成人便中のＣＥ
Ａ様抗原の第２のグループも同定された。

【００１３】Burtinおよび協力者によって特徴化された
ＮＣＡ−２は分子サイズがＣＥＡより少し低く、そして
ＮＣＡまたはＣＥＡのどれも持たない決定基を表現し
た。三つの抗原間に共通の決定基に加え、第２の決定基
はＮＣＡ−２とＣＥＡとの間にだけ共通しているので、
ＮＣＡ−２はＮＣＡよりもＣＥＡへもっと密接に関連し
ているように見える。成人便中の正常便抗原（ＮＦＡ）
は最近三つの分子スペシスに分離され、そのすべては免
疫化学的にＮＣＡ−２，ＮＣＡおよびＣＥＡとは異な
る。胎便中のＣＥＡ様抗原とＣＥＡとの間の化学的、抗
原的、および発生的相互関係の解明が必要であった。こ
れら抗原の一部の臨床的有用性は未知であり、そしてそ
れらはＣＥＡの開裂生成物か、ＣＥＡ前駆体分子か、ま
たは本当に異なる遺伝子生成物を代表するかどうかは未
解明であったが、ポリクロナール抗体によるそれらの同
定は関連する抗原間に等しく共有されない少なくとも三
つのＣＥＡ上のエピトープの決定をもたらした。例え
ば、Burtin, P, Roubertie, P.,Chavanel, G., Sabine,
M.C., および Hirsch-Marie, H. “CEA and related a
ntigens：A study of NCA-2”；W.H. Fishman および
S. Sell（eds.）.,“Onco-Developmental Gane Express
ion”, pp. 609-611, New York, Academic Press,Inc.,
1976；Kuroki, M., Koga, Y., および Matsuoka Y.“P
urification and characterization of carbinoembryon
ic antigen-related antigens in normal adult fece
s”, Cancer Res., 41 ：713-720, 1981 ；Primus F.
J., Collins, R.W., III , および Blue,A.” Antigeni
c relationship of carcinoembryonic, nonspecific c
ross-reacting, and meconium antigens ”, Proc. Ame
r. Ass.Cancer Res., 22 ：298, 1981 参照。

【００１４】ＣＥＡの免疫組織化学的位置決定は、ポリ
クロナール抗体を使用して多種類の上皮がんにおいて広
く研究されている。それは正常および非がん性病的組
織、良性腫瘍、および種々の器官の異型上皮中に種々の
程度に存在するので、組織片中のこの抗原の検出は正常
または良性細胞をがん性細胞から区別するのに使用でき
ない。大部分の研究は、血中抗原レベルの測定は治療の
予後およびモニタリングを助けることができるが、大部
分の研究は一次腫瘍のＣＥＡ染色と病的段階もしくは予
後との間の相関関係を見出していない。

【００１５】いくつかの研究はＣＥＡに対するモノクロ
ナール抗体の開発を記載したが、しかし組織片中のこの
抗原の免疫組織化学的検出に対するそれらの使用は適切
に探究されなかった。同様に、Goldenbergの米国特許第
4,348,376号および米国特許出願第 414,729号に開示さ
れた方法を採用するがんの生体内造影に本発明によるＣ
ＥＡファミリー抗原に対する限定されたモノクロナール
の応用が今や追求され、そしていくつかのがんのタイプ
の検出および位置決定にいくつかの利益を提供する。同
様に、ＣＥＡファミリー抗原上のエピトープに対するそ
のような抗体は、抗体フラグメントについてのGoldenbe
rgの米国特許第 4,348,376号および第 4,331,647号に記
載されているような、単一抗体もしくは抗体組合せと、
ラジオアイソトープ、薬剤、トキシン、または同様な有
毒剤でラベルした抗体とを含むがん免疫療法のための、
および中性子捕獲療法に使用する好ましい試薬である。

【００１６】ＣＥＡ検出および生体外イムノアッセイの
免疫特異性を改良するための最近の努力は、ＣＥＡに対
するモノクロナール抗体の開発および慣用アッセイとの
比較に集中している。しかしながら、ＣＥＡ関連抗原と
の交差反応性がＣＥＡに対するモノクロナール抗体でも
それらの慣用の対応物と同様に遭遇すること、およびそ
れらのエピトープが適切に限定されていないＣＥＡファ
ミリー抗原に対するモノクロナール抗体の使用はこの応
用を重大に制限することが予期される。

【００１７】結腸腫瘍ＣＥＡに対し発生させたモノクロ
ナール抗体は、抗原決定基の三つの一般的クラスをそれ
らのＣＥＡ様抗原、ＮＣＡおよびＭＡとの反応性に基づ
いて分化することが今や示された（第１図）。クローン
の最小パーセントは三つのすべての抗原が共通して持
ち、そしてクラスＩのカテゴリーに属するエピトープを
認識する抗体を産生する。クラスIIモノクロナール抗体
はＣＥＡおよびＭＡ間に共通する部位と反応するが、ク
ラスIII タイプのそれらはＣＥＡのみを結合し、明らか
にこの分子に特有な決定基を認識する。われわれはＮＣ
Ａ交差反応性モノクロナール抗体ＮＰ−１のＮＣＡ対す
る親和性は、そのＣＥＡに対する親和性に比較して著し
く低いことを発見した。それでＣＥＡに対するモノクロ
ナール抗体のＮＣＡ交差反応性質は、抗体またはＮＣＡ
の適切な量を直接標識抗体結合または競合的阻止アッセ
イに使用しない限り顕在化しない可能性がある。ＮＰ−
１の匹敵する量はＣＥＡおよびＭＡの両方を結合するの
に有効であり、そしてＭＡはＮＰ−１とＣＥＡとの反応
を阻止するのにＣＥＡと類似であるので、これはＭＡに
ついてはそのようではないらしい。われわれは、好中球
がそれらのＣＥＡではなくＮＣＡの既知の合成から予期
されるようにＮＰ−１で陽性に染色されることを示し
た。このように、好中球の免疫細胞学的染色反応はＣＥ
Ａに対するモノクロナール抗体のＮＣＡ交差反応性の代
替評価方法を提供する。

【００１８】モノクロナール抗体により限定されるＣＥ
Ａエピトープのレパートリーが今や解明できる。相互阻
止実験は、クラスＩおよびIIの抗体それぞれＮＰ−１お
よびＮＰ−２は相互に阻止可能であるが、そのどれもが
クラスIIの抗体ＮＰ−３を阻止できず、またはＮＰ−３
によって阻止できないことを明らかにした。ＮＰ−１と
ＮＰ−２との間の相互阻止特性は、それらによって認識
されるそれぞれのエピトープは部分的に重複または相互
に非常に近いことを示唆する。しかしながら、ＮＰ−２
とＮＰ−３との間の相互阻止の欠如は、それらはクラス
IIカテゴリー内の二つの別のエピトープを認識すること
を指示している。このように、われわれはわれわれのモ
ノクロナール抗体は結腸腫瘍ＣＥＡ上の少なくとも四つ
の抗原性部位を区別することができることを発見した。
その一つはＣＥＡ，ＭＡおよびＮＣＡによって共に保有
され（第１図α１）、他の二つはＣＥＡとＭＡとによっ
て共に保有され（β１およびβ２）、そして４番目はＣ
ＥＡに対し特異性であることが見られ（γ１）、そして
それ以外のＣＥＡ決定子は第１図に図示した３クラスの
全部の内に同定されることが予期される。

【００１９】ＮＰ−４モノクロナール抗体および他のク
ラスIII 抗体は、典型的にはＣＥＡに対して特異的なヤ
ギ抗体によって認識されるＣＥＡ分子の５０％未満を結
合する。クラスIII 抗体の部分的反応性に対する基礎
は、ＣＥＡ分子の部分個数の識別に関係している。

【００２０】ＣＥＡに対する免疫特異性モノクロナール
抗体の開発のための一つの主要目標は、ＣＥＡ検出の精
巧な応用の発達を促進することである。もしＣＥＡの種
々の免疫形が異なる個体または異なる病状段階で産生さ
れるのであれば、このアプローチの究極的利益性は限定
された特異性を持ったモノクロナール抗体の複合体の創
製に依存するであろう。モノクロナール抗体エピトープ
特異性の決定にＣＥＡ関連抗原の取り入れは、ＣＥＡ検
出に対して診断および予後適切性を有する抗体の境界化
を容易にするに違いない。これはＮＣＡ−２, ＮＦＡ−
２，またはＭＡとＣＥＡとの間の生物学的相互関係と、
腫瘍マーカーとしての前者の抗原の役割を解明すること
によってさらに強化されるであろう。最後に、ＣＥＡに
対するモノクロナール抗体の研究に免疫組織化学のよう
な他の方法の使用は、他に知り得ない予後可能性を有す
る分子決定基を明らかにすることができる。

【００２１】本発明のこの開示は、本発明者 Primus ら
による、 Cancer Research, 43（1983年 2月発行, 印刷
中）三つの論文の完全な開示を含み、該論文を参照とし
て取り入れる。

【００２２】胎便中のＮＣＡ非関連，ＣＥＡ交差反応性抗原の同定 ＮＣＡ中和抗ＣＥＡ抗血清を二重免疫拡散法で個々の胎
便サンプルに対して試験する時、ほぼ同数の標本が通常
相互に非常に近似した一つまたは二つの沈降素バンドを
与える。二つのバンドが存在する大部分の標本において
は、両者はＣＥＡと部分的に一致する反応を生成する
が、未抽出またはＰＣＡ抽出標本の１０％未満におい
て、第２のバンドはＣＥＡと一致する反応を与える。こ
の二つのＣＥＡと交差反応性の沈降素バンドは、同様に
胎便中に存在するＣＥＡと融合しない。これらゲル拡散
パターンは、ＮＣＡ中和抗血清中にＣＥＡおよびＮＣＡ
が共有するエピトープへ関連しないＣＥＡ上の二つの共
通決定基を認識する二つの追加の抗体特異性の存在を示
している。

【００２３】ＣＥＡ抗血清中のＮＣＡ非関連ＣＥＡ交差
反応性抗体がラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）による胎
便中のＣＥＡの測定に寄与したかどうかを決定するた
め、ＮＣＡ中和抗血清は二重拡散法によってＣＥＡとの
一致反応を与えない胎便サンプルによってさらに吸収さ
れる。この胎便吸収抗血清はＣＥＡに対する沈降活性を
保有し、そしてその標識したＣＥＡの最大結合は吸収し
ない抗血清のそれに比較して約１０％低下する。しかし
ながら、ＮＣＡ中和抗血清中に当初存在した抗体活性の
８０％以上が胎便による吸収によって除去される。ロシ
ュ社のキットＣＥＡ，ＮＣＡ−中和抗血清、または特異
性抗ＣＥＡ抗血清とＣＥＡとを標識したトレーサーおよ
びインヒビターとして使用し、ＲＩＡによって胎便中の
ＣＥＡ濃度を比較した。３種のすべての抗血清はＣＥＡ
による阻止に対し同じ感度を得る濃度に調節された。１
２の胎便サンプルの分析は、ロシュおよびＮＣＡ中和抗
血清により測定したＣＥＡ含量は、特異性抗ＣＥＡ抗血
清によって得られる値よりも３ないし１０倍大きい（ｐ
＜０．００１；スチュデントｔ−テスト）ことを示した
（表１）。

【００２４】胎便からのＭＡの精製 ＭＡの精製中の種々のステップにおいて、抗原活性は、
胎便中の種としてＮＣＡ非関連ＣＥＡ交差反応性物質を
測定するものと考えてロシュ社のキット抗体を使用する
ＲＩＡにより、そしてＣＥＡ活性を追跡するために特異
性抗ＣＥＡ抗血清によってモニターされた。単離操作中
の各種段階におけるこれら抗原活性と、特異性ＮＣＡ濃
度とは表２に示されててる。ｐＨ８．０において４０％
エタノール中への胎便の抽出はエタノール上清中に当初
のＭＡ活性の約７５％を与えた。大きい沈澱がエタノー
ル分画によって生成したが、上清は粘性でそして高度に
着色されたままであった。ＤＥＡＥセルロース上のエタ
ノール抽出液のクロマトグラフィーは色素の大部分を除
去したが、しかし全体のクロマトグラムを通じＭＡのサ
ブ分画を生じた。

【００２５】セファクリル S-300上の０．１M NaCl分画
のクロマトグラフィーの後、ＭＡ活性の出現は少し小さ
いサイズで放射標識したＣＥＡマーカーの溶離と重複し
た。２２５ないし２７０ｍｌの溶離容積間に出現するＭ
Ａをプールし、そして二つのアフィニティークロマトグ
ラフィーのステップへかけた。最初のものはＭＡと複合
して残っている少量のＣＥＡを除去するため、特異性抗
ＣＥＡ抗体を含んでいる免疫吸着剤上の通過を含んでい
た。この操作はＣＥＡの９５％を除去したが、ＭＡの４
５％が失われ、そして吸着した分画中には発見されなか
った（表２）。第２のステップのため、胎便中のＮＣＡ
非関連ＣＥＡ交差反応性物質の少なくとも一つのグルー
プと交差反応性のネズミモノクロナールＣＥＡ抗体，Ｎ
Ｐ−３を含有する免疫吸着剤がＭＡを選択しそしてさら
に精製するために用いられた。適用されたＭＡ活性の８
０％以上がこの免疫吸着剤によって保持された。胎便５
０ｇから出発したＭＡ活性の全収率は４％であり、また
は０．１M NaCl ＤＥＡＥ分画中に存在したそれの２０
％であった。

【００２６】

【表１】

【００２７】（ａ） 未抽出胎便サンプルは最初ＰＢＳ
中１：４（w ／v ）に懸濁し、次にアッセイ前０．０１
Ｍホウ酸緩衝液ｐＨ８．５中に希釈した。 （ｂ） 値はＮＣＡ ＲＩＡにおいて測定したＮＣＡの
特異性レベル （ｃ） μｇ／ｇ

【００２８】

【表２】

【００２９】（ａ） ＮＣＡについてはＮＣＡ特異性ア
ッセイを使用するＲＩＡ，ＣＥＡについてはヤギ特異性
抗ＣＥＡ抗血清を、またはＭＡについてはロシュ社キッ
ト抗体を使用するＣＥＡ ＲＩＡで測定した。

【００３０】精製ＭＡの免疫学的分析 ＲＩＡにおける中和活性を基にして、最終的に精製され
たＭＡはＣＥＡまたはＮＣＡ１．０％未満を含有してい
た（表２）。ＮＣＡ中和抗ＣＥＡ抗血清に対するＭＡの
二重免疫拡散はＣＥＡとの部分的一致反応を形成する単
一沈降素バンドを与えた。未抽出胎便および後者の抗血
清との間に現れる二つのバンドは両方とも精製されたＭ
Ａにより形成された単一ラインに融合した。精製したＭ
Ａにより１本のみの沈降素バンドの出現は、それが第２
のＮＣＡ非関連ＣＥＡ関連抗原を含んでいないことを示
唆する。精製したＭＡは二重拡散において特異性抗ＣＥ
Ａ抗血清と反応しなかったが、この抗血清はＣＥＡを沈
澱するその能力は保有していた。ＭＡは免疫電気泳動に
おいても血清タンパクに関しアルファグロブリンとして
移動する、ＮＣＡ中和ＣＥＡ抗血清に対する単一沈降素
バンドを与えた。

【００３１】放射標識したＭＡの抗体結合特性をＲＩＡ
において評価した。表３に示すように、ロシュ社のキッ
トＣＥＡ抗体およびモノクロナールＣＥＡ抗体ＮＰ−３
の両者は、これら抗体による標識ＣＥＡの結合に比肩し
得る、類似量のＭＡを結合した。ＭＡの８０％以上は標
識後短時間にテストする時免疫反応性であった。ヤギ特
異性抗ＣＥＡ抗血清のみが標識したＭＡと限界的に免疫
反応性であったが、ヤギ抗ＮＣＡ抗体は非反応性であっ
た。前者の抗血清およびロシュ社のキット抗体はそれら
の標識したＣＥＡとの反応性において似ていた。過剰の
特異性抗ＣＥＡとロシュ社のキット抗体との併用はロシ
ュ社のキット抗体自体によるもの以上にＣＥＡの最高結
合を増加せず、標識したＣＥＡの同じ主個数が両方の抗
血清によって認識されたことを示している。阻止アッセ
イおよび二重拡散はＭＡ中のＣＥＡの有意量を示さなか
ったので、ヤギ特異性抗ＣＥＡ抗血清への標識したＭＡ
の結合の低レベルは、標識したＣＥＡ混雑物との反応性
ではなく、この抗血清中の残存交差反応性抗体の存在の
ためである可能性が最も大であった。

【００３２】

【表３】

【００３３】（ａ） ４時間４５℃でインキュベート後
抗体過剰で測定した。固相ヤギ抗マウス IgGまたはロバ
抗ヤギ IgGを遊離抗原から結合抗原を分離するために用
いた。

【００３４】ＭＡの分子サイズ リン酸緩衝化食塩水で平衡化したセファクリル S-300上
の標識ＭＡのクロマトグラフィーは、ＣＥＡよりも少し
大きい溶離容積においてのみ溶離する単一の対称ピーク
を与えた。ＭＡおよひＣＥＡの溶離パターンにおけるこ
の関係は、６．０Ｍグアニジン HClで平衡化し溶離され
るセファクリル S-300上の通過の後にも維持された。Ｍ
ＡとＣＥＡとの間のサイズ分布の重複は、校正したゲル
上の還元したサンプルの SDS-PAGE 電気泳動の後にも観
察された。標準の移動度に対する対数分子サイズプロッ
トからの補内法による、ＭＡに対する分子サイズの推定
は、ＣＥＡについて 200,000に対し、185,000 の値を与
えた。Coomassie ブリリアントブルーまたは周期的酸性
シッフ試薬による SDS-PAGE 中の還元したＭＡの染色
は、ＣＥＡと似た位置へ移動する単一拡散バンドを示し
た。

【００３５】コンコナバリン−ＡへのＭＡの結合 コンカナバリン−Ａセファローズへの放射標識ＭＡの結
合をＣＥＡおよびＮＣＡのそれと比較した。ＣＥＡおよ
びＮＣＡの９％以上がこのレクチンへ結合したが、ＭＡ
の２０％未満が反応性であった。

【００３６】ＣＥＡおよびＭＡのプロナーゼ消化 プロナーゼＥによるＣＥＡの消化はヤギ特異性抗ＣＥＡ
抗血清とのその反応性を完全に除去し、そしてＮＰ−３
モノクロナール抗体またはロシュ社キットヤギ抗体への
その結合力の５０％低下をもたらした。この抗体結合活
性の損失または低下は酵素の不存在下の同様な処理の後
には観察されなかった。６．０Ｍグアニジン HClで平衡
化したセファクリル S-300上の酵素消化液のクロマトグ
ラフィーは、ＣＥＡの大部分が小さいフラグメントへ分
解されたことを示した。対照的に、ＭＡの酵素消化はＮ
Ｐ−３およびロシュ社キット抗体へのその結合力を２０
％減らし、そしてその分子サイズにほんの少しの減少を
もたらした。胎便抗原ＭＡと命名された、胎便中のＮＣ
Ａ非関連ＣＥＡ関連分子スペシスの一つのための我々の
単離操作は、初期段階における免疫分離ステップの適用
を避ける。これは、アフィニティークロマトグラフィー
に有利な特性を持った抽出液を提供する手段として、過
塩素酸ＰＡ単独またはアルコールとの併用による可溶化
に失敗したためである。テストした異なるアルコール濃
度およびｐＨ範囲の中で、ｐＨ８．５における４０％ア
ルコールが最良のＭＡ可溶化および最大の不適切タンパ
クの沈澱を得た。その後のＤＥＡＥセルロース上のクロ
マトグラフィーは色素の大部分を残す望ましい特徴を持
つが、不適切なタンパクおよびＮＣＡの大量は吸着され
なかった。これらの利益はイオン交換体上に観察される
ＭＡ活性のサブ分画に重きを置かせた。最終段階におい
て、ＭＡはＣＥＡに対する交差反応性モノクロナール抗
体ＮＰ−３を含有する免疫吸着剤へ特異的に吸着され
た。モノクロナール抗体の使用は、他の決定基に関して
は差が存在し得るけれども、該抗体によって認識される
エピトープの表現において均一である分子スペシスを選
択する利益を有する。

【００３７】ＭＡは、ＮＣＡ−２と、そして成人便中の
ＣＥＡ様抗原のＮＦＡファミリー、特にＮＦＡ−２から
区別される。ＮＣＡ−２およびＮＦＡ−２は分子サイ
ズ、および炭水化物およびアミノ酸組成においてＣＥＡ
と類似である。免疫学的には、ＮＣＡ−２はＣＥＡと二
つのエピトープを共有し、一方ＮＦＡ−２上には三つの
交差反応部位が示された。我々はＣＥＡに対するモノク
ロナール抗体について、胎便中の二つのＮＣＡ−非関連
ＣＥＡ交差反応性物質の一つを代表するＭＡはＣＥＡと
少なくとも三つのエピトープを共有することを発見し
た。胎便中の第２のＣＥＡ関連抗原は、ＣＥＡおよびＭ
Ａの両方に存在する少なくとも一つの交差反応部位を欠
いている。

【００３８】ＭＡは前に記載した胎便中の他のＣＥＡ関
連抗原から識別し得る。ＭＡはＣＥＡと類似の分子サイ
ズを有するが、しかし我々が使用した慣用の抗血清によ
ってＣＥＡ上に区別される少なくとも一つの決定基を欠
くことにおいて抗原的には異なり、そしてこの相違はＣ
ＥＡに対するモノクロナール抗体でも認められる。さら
に、ＭＡはＣＥＡまたはＮＣＡのどちらよりもコンカナ
バリンＡに対しもっと低い親和性を有する。このレクチ
ンに対するＭＡの低親和性は、ＣＥＡおよびＮＣＡから
ＭＡの分離のための、特異性免疫吸着剤を必要としない
他の可能性ある方法を提供する。ＭＡおよび他のＮＣＡ
非関連ＣＥＡ関連抗体は合体して胎便中ＣＥＡよりも約
６倍高い濃度で現れるとの我々の観察は、これら抗原は
ＣＥＡよりも分化の早期マーカーであることを指示する
かも知れない。精製したＭＡの供給はＣＥＡに対するモ
ノクロナール抗体のエピトープ特異性と、そしてＣＥ
Ａ，ＭＡおよびＮＣＡ間のこれらエピトープの分布の境
界分けを容易にした。

【００３９】正常結腸粘膜の染色 形態学的に正常な結腸粘膜の染色はすべての４種のモノ
クロナール抗体をもって可視化できた。これはホルマリ
ンでなく、エタノール／酢酸（ＥＡ）中に固定した標本
中に最良に観察された。正常および腫瘍上皮の陽性染色
は、抗原中和ポリクロナール抗血清および腹水と反応さ
せたものを含む対照片には現れなかった。ホルマリンで
はなくＥＡ中に固定した標本はしばしば試験片および対
照片中に結合組織の可変非特異性染色を示した。

【００４０】ヤギ抗血清およびモノクロナール抗体ＮＰ
１，２および４による正常粘膜の染色は、陽性染色が主
として陰窩の上方レベルを覆う円柱細胞の細胞質および
粘膜表面に局在した。腺または消化管腔内の分泌物質も
染色されたが、ゴブレット細胞の粘液は抗原陰性であっ
た。これら抗体のすべてによる染色反応の強度および存
在は陰窩間で全く様々であったが、しかしヤギ抗ＣＥＡ
およびＮＣＡ抗血清およびＮＰ−１モノクロナール抗体
により最も顕著であった。ＮＰ−４モノクロナール抗体
は不変的に他の抗体のどれよりも一層顕著でない弱い染
色反応を与えた。

【００４１】正常結腸上皮細胞のほかに、標識した抗原
結合を基にしてＮＣＡと交差反応することが既知のクラ
スＩモノクロナール抗体ＮＰ−１も、血管内および血管
外組織中の好中球を染色した。この染色反応はＥＡ中に
固定した標本中では容易に明らかであったが、ホルマリ
ン中ではそうではなかった。好中球局在化はイムノペル
オキシターゼ操作によって可視化できたが、それは好中
球中の内在ペルオキシターゼ活性の阻止を必要とせず、
このためバックグラウンドレベル以上の陽性抗原染色の
認識を容易にするイムノグルコースオキシターゼ法によ
って容易に識別された。ＮＰ−１に加え、研究した他の
抗体の中でヤギ抗ＮＣＡ抗血清のみが好中球を染色し
た。

【００４２】結腸腫瘍の染色 ヤギ抗ＣＥＡおよびＮＣＡ抗体、それにＮＰ−１，２お
よび３モノクロナール抗体は中程度に分化した結腸腺が
んの２２例のすべてをそれらの結腸中の発生部位に関係
なく染色した。これら結腸腺がんの約７０％（１５／２
２）はクラスIII モノクロナール抗体ＮＰ−４と陽性染
色反応を与えた。ホルマリン中に固定した標本に得られ
た支配的染色パターンは腫瘍細胞および腺内沈着物の尖
端表面の標識であった。ＮＰ−４抗体を除き、腫瘍標本
の同じ面積が他の抗体により類似した強度へ染色された
が、細胞局在化において絶対的な対応性は確立されなか
った。モノクロナール抗体のうち、ＮＰ−１はその強度
および範囲において一貫してより強い染色を与え、いく
つかのケースにおいてはヤギ抗ＣＥＡまたはＮＣＡ抗血
清により得たものよりも大であった。ＮＰ−４染色の強
度は６ケースにおいて他の抗体により得たものよりも少
し低かったが、それは残りの９標本においては著しく低
下した。腫瘍腺の大部分は１２例においてＮＰ−４によ
って染色されたが、他の３標本においては腫瘍組織の３
０ないし５０％がこの抗体と反応した。これらの例のす
べてにおいて、腫瘍組織の８０％以上が他の抗体と反応
した。ＮＰ−４陰性と分離された２例は、腫瘍腺の１０
％未満に弱い病巣反応を与えた。

【００４３】一次腫瘍の６標本については、ＥＡ中の別
の固定に十分な材料が利用可能であった。抗体のすべて
による染色の強度は各例についてホルマリン固定後に観
察されたもの以上にＥＡ固定標本で高められた。腫瘍細
胞の細胞質染色はＥＡ固定標本中では非常に明瞭であっ
たが、ホルマリン固定後はそれは存在しないかまたは弱
くなった。ＥＡ固定組織における細胞質染色の増強はヤ
ギ抗血清のそれと比較してＮＰ−４抗体ではそれほど大
きくなかったが、前者の抗体によって得られた全体の染
色反応はホルマリン固定標本と比較するときＥＡ固定組
織ではかなり大であった。

【００４４】退行性がんの一例だけが研究され、そして
これはヤギおよびモノクロナール抗体のすべてについて
完全に陰性であった。

【００４５】転移のＮＰ−４染色 検査した中程度に分化した腺がんの２２例のうち、Duke
の段階Ａ，Ｂ，ＣおよびＤ患者からの一次腫瘍の１／
１，５／７，３／４および６／１０がそれぞれＮＰ−４
と反応した。患者数が少なくてＮＰ−４反応性と臨床的
段階化との間の正確な相関関係に到達できないけれど
も、これら予備的結果は絶対的な関係は確立されないで
あろうということを示唆する。ＮＰ−４反応性と結腸ま
たは直腸中の腫瘍の位置との間の関係も明らかでなかっ
た。上記患者８人から、それぞれDukeのＣおよびＤ段階
の２例および６例からホルマリン固定標本として領域リ
ンパ節および／または肝臓転移が研究のため得られた。
これら標本は、ヤギ抗ＣＥＡおよびＮＣＡ抗体、そして
ＮＰ−３およびＮＰ−４モノクロナール抗体で染色され
た（表４）。ＮＰ−４抗体は、この抗体で陽性に染色さ
れる単一片中に可視化されたそれらの一次腫瘍組織を８
０％以上有する患者においてさえも、転移腫瘍において
は僅かの陽性染色反応を与えたのみであった。これら転
移の大部分はヤギ抗体およびＮＰ−３モノクロナール抗
体との反応性を残していた。

【００４６】２人の患者Ｃ−２およびＤ−３の領域リン
パ節および肝臓転移はそれらの染色表現型においてさら
に相違を示した（表４）。患者Ｃ−２からの二つの結節
は抗体のすべてと反応しなかったが、第３の結節はＮＰ
−４抗体のみと陰性反応を与えた。患者Ｄ−３からの一
つの結節は抗体のどれによっても染色されず、加えて他
の一つの結節および肝臓転移はヤギ抗ＣＥＡ抗血清と、
ＮＰ−３およびＮＰ−４モノクロナール抗体で染色され
なかった。対照的に、残りの４結節および肝臓転移はＮ
ＣＡ陽性であった。患者Ｄ−３からのこれらの標本をＮ
ＣＡ交差反応性モノクロナール抗体ＮＰ−１に対してテ
ストした時、その染色パターンはヤギ抗ＮＣＡ抗体で得
られたものと同じであった。

【００４７】

【表４】

【００４８】（ａ）＝ＮＰ−４で陽性に染色される一次
腺腫瘍のパーセント （ｂ）＝文字は Duke の段階を示す。数字は個々の患者
を特定する。 （ｃ）＝試験した全数中の陽性数の比

【００４９】形態学的に類似した腫瘍の究極的な攻撃的
行動はそれらが生成するいくつかの抗原マーカーの検出
によって確かめることができる可能性は、いくつかのが
んタイプの免疫組織化学的研究から出現した。他のマー
カーでは、ある抗原の分子または微妙な決定基変化の識
別はポリクロナール抗体によって本来認識されるエピト
ープの多様性のために見落とされたであろう。これらの
分子変化の同定は、もしそれらががん細胞の生物学的表
現における付随した変化に本当に結びつくのであれば有
意義であろう。モノクロナール抗体の精密な免疫特異性
は、これらの抗原修飾を探究することがそれによって可
能な道具を提供し、そしてこの態様において我々はポリ
クロナール抗体と、ＣＥＡに対して誘導された４種のモ
ノクロナール抗体とを用いて、結腸腺がんの染色特性を
比較した。

【００５０】慣用の抗血清を使用した免疫組織化学によ
り正常結腸にＣＥＡの存在を示した以前の実験から予期
されたように、この組織は３種の交差反応性モノクロナ
ール抗体によって染色された。これは、ＮＣＡおよびＭ
Ａとの交差反応性を欠くがしかし標識した抗原結合性に
基づいてＣＥＡ分子の少数個数を認識するように見える
ＮＰ−４についても真理である。これら抗体による染色
は個々の抗体と反応させた別々の組織片に可視化される
ように、同じ細胞内において局在化されるように見え
た。モノクロナール抗体は結腸ゴブレット細胞の粘液を
染色しなかった。モルクナール抗体のうち、ＮＰ−１だ
けがそれらによる既知のＮＣＡ合成から予見し得るよう
に、ヤギ抗ＮＣＡ抗体とも同様に反応する好中球を染色
した。このように、免疫組織化学的操作は他の方法によ
って決定されたＣＥＡに対するモノクロナール抗体の特
異性を確認することができ、そして他の方法が容易に利
用できない時それらのＮＣＡ交差反応性を同定するのに
有用である。

【００５１】ＮＰ−４抗体を除き、他のモノクロナール
抗体および慣用のヤギ抗血清は一次の中程度分化結腸腫
瘍のすべてと、そしてこの研究において検査した領域リ
ンパ節および肝臓転移の大部分を染色した。ＮＰ−４か
らは、一次腫瘍の約３０％が非反応性であり、そしてＮ
Ｐ−４陽性一次腫瘍から発生し転移の大部分はこの抗体
で染色されなかった点で相違する染色パターンが出現し
た。

【００５２】我々は、ＮＰ−４モノクロナール抗体で得
られた染色強度は、ホルマリンでなくＥＡ中に固定した
一次腫瘍標本において相当に改善されることを発見し
た。その代わりに、陽性一次腫瘍を持つ患者の転移のＮ
Ｐ−４染色の殆ど実質上の不存在は、転移腫瘍からの認
識された決定基もしくは抗原のもし定量的でなくても定
性的欠失か、または抗原陰性腫瘍細胞のクローニングを
示唆する。

【００５３】我々は組織中の決定基表現を循環中のそれ
と未だ比較していないが、組織ＣＥＡ決定基不均一性の
存在は、モノクロナール抗体で測定したこの抗原の血中
濃度と疾病活性との間の相関関係に潜在的問題で発生す
ることを示唆する。ここに提供した免疫組織化学的研究
を基にして、我々は様々の部位における腫瘍による循環
抗原への相対的寄与およびイムノアッセイに使用される
モノクロナール抗体の特異性に依存して、多様なアッセ
イ結果および疾病活性との貧弱な相関関係を予想する。

【００５４】抗体特異性と、組織および血中の反応性抗
原の存在に関して基本的疑問が未解答であるが慣用の組
織病理学標本について便利に適用し得る免疫組織化学
は、予後および診断価値を有するＣＥＡ変種または決定
基と反応するモノクロナール抗体を識別するのに大きい
役割を持つであろう。これは結腸腫瘍のラジオイムノ検
出および抗体利用療法に対するモノクロナール抗体の適
切な選択にもあてはまる。

【００５５】ＣＥＡハイブリドーマクローンのクラス 抗原結合プロフィルは、ＣＥＡハイブリドーマクローン
はそれらのＣＥＡ，ＭＡおよびＮＣＡとの比較免疫反応
性（表５）を基にして三つの別のクラスに分化できるこ
とを明らかにした。第１の融合からのクローンの大部分
はＣＥＡおよびＭＡ（クラスII）を結合する抗体を産生
し、第２の融合からのクローンはクラスIIと、そしてＣ
ＥＡ反応性のみを示すもの（クラスIII ）との間に大体
等しく分布した。三つの抗原すべてとの反応性（クラス
Ｉ）は、第１および第２の融合からのクローンのそれぞ
れ１６％および２％に見られた。表１に記載した結果は
希釈培養物上清の５０μＬ部分標本をアッセイすること
によって得られた。クラスＩおよびIIのクローンによる
標識ＣＥＡの結合パーセントは似ていたが、クラスIII
のクローンには一貫して低い値を与えた。ＭＡに対する
クラスＩおよびIIのクローンの反応性はそれらのＣＥＡ
の結合に似ていたが、クラスＩのクローンの培養物上清
は標識ＮＣＡを平均して９．９％（ｆ2.4 S.E.）結合し
た。この低いＮＣＡの結合は、ＣＥＡおよびＭＡ結合に
必要な抗体の量に比較して、高いＮＣＡ結合を得るため
抗体の高濃度が必要であることに帰せられる。ＮＣＡの
最適結合もＣＥＡおよびＭＡに比較してより長いインキ
ュベーション時間を要した。

【００５６】ＣＥＡ反応性培養物のどれも、分泌者およ
び非分泌者個人の両者から得たヒト赤血球へ結合しなか
った。

【００５７】選択したクローンのＲＩＡにおける抗原結
合性 クラスＩからの１種（ＮＰ−１），クラスIIからの２種
（ＮＰ−２およびＮＰ−３）、およびクラスIII からの
１種（ＮＰ−４）の４種のハイブリドーマクローンが選
択され、そしてそれ以上の特徴化のために再クローンさ
れた。ＮＰ−１，２および３抗体は無ガンマウマ血清を
含有する培地から精製され、ＮＰ−４は腹水として使用
された。ＮＰ−１，２および３クローンは IgG 1（κ）
サブクラスを産生したが、ＮＰ−４クローンは IgG 1
（λ）アイソタイプを産生した。これら４種のモノクロ
ナール抗体は二重免疫拡散においてＣＥＡを沈澱しなか
った。ＮＰ−１，２および３は、ヤギ抗ＣＥＡ抗体のＣ
ＥＡおよびＭＡとの反応性と同様に、これら抗体の６０
ないし７０％を結合した。ＮＰ−４はＭＰを結合せず、
そして放射標識ＣＥＡの最高約３０％のみを結合した。
正常ネズミ腹水または血清はＣＥＡと反応せず、そして
ＮＰ−４について観察された最高ＣＥＡ結合レベルは他
のクラスIII ハイブリドーマの特性である。ＣＥＡおよ
びＭＡの結合に加えて、クラスＩモノクロナール抗体Ｎ
Ｐ−１はヤギ抗ＮＣＡ抗体と同程度に標識したＮＣＡと
反応した。しかしながらＮＰ−１の２６００ｎｇが標識
ＮＣＡの３０％を結合するのに必要であったが、同じレ
ベルのＣＥＡおよびＭＡを結合するのにこの抗体１．１
および２．５ｎｇが必要であった。ＣＥＡに比較して少
し多い量のＮＰ−２がＭＡを結合するのに必要であった
が、ＮＰ−３については反対であった。

【００５８】クラスIII ハイブリドーマクローンＮＰ−
４はヤギ抗ＣＥＡ抗体による７０％の結合と対照に標識
ＣＥＡを最高３０％だけ結合するので、ＮＰ−４はヤギ
抗体によっても検出されるＣＥＡ分子の母集団を認識す
ることを示すために二つの実験が計画された。第１の実
験は、ＮＰ−４とヤギ抗血清とをそれぞれについて最高
抗原結合レベルの量において混合し、次にＺ−ゲルによ
り遊離抗原から結合抗原を分離することにより、ＣＥＡ
の添加結合について試験した。この試験の結果は、併用
抗原混合物によるＣＥＡの結合はヤギ抗血清単独で得ら
れるものよりも大きくないことを示した。もしＮＰ−４
がヤギ抗血清と反応したものとは別の標識分子の個数を
認識したのであれば、二つの抗体の混合物は個々の結合
パーセントの合計にほぼ等しい抗原結合パーセントを与
えた筈である。第２の実験は、標識抗原をヤギ抗体と、
次いでＮＰ−４と順次にインキュベートし、次に固相ヤ
ギ抗マウス抗体により遊離抗原から結合抗原を分離する
ことにより、ヤギ抗体がＮＰ−４と標識抗原との反応を
阻止する能力を評価した。添加実験を基にして予期され
たように、ヤギ抗ＣＥＡ抗血清はＮＰ−４の標識抗原へ
の結合を完全に阻止した。正常ヤギ血清または不適切な
ＮＣＡに対するヤギ抗体は効果がなかった。

【００５９】

【表５】

【００６０】（ａ） ハイブリドーマ培養５０μＬを個
々に放射標識抗原への結合についてアッセイした。 （ｂ） 抗ＣＥＡ活性を示すクローンの合計数中の特定
クラスヘ属するクローンの数。カッコ内の数字は各クラ
スへ属するクローンのパーセントを指示する。 （ｃ） 平均±S.E.

【００６１】競合的阻止および抗原親和性 未標識ＣＥＡが４種のハイブリドーマモノクロナール抗
体の標識したＣＥＡとの反応を阻止する能力を競合的Ｒ
ＩＡで試験した。この操作において、使用したモノクロ
ナールまたはヤギ抗体の量は、未標識抗原の不存在下標
識抗原の５０％結合を与えるように調節した。これら条
件下において、４種のモノクロナール抗体は著しく異な
った抗原阻止曲線を発生した。ＮＰ−１抗体は抗原阻止
感度においてロシュ社キットヤギ抗体へ似ていないが、
ＮＰ−２，３および４モノクロナール抗体は阻止のため
もっと多量の抗原を必要とした。ＣＥＡの分子サイズと
してＭ 200,000を用い、得られたデータをミューラーの
方法によって平均アフィニティー定数の決定に変換した
（表６）。この処理によって得られたΚ値と、結合を５
０％阻止するのに必要なＣＥＡのｎｇ／ｍｌは、ＮＰ−
１とヤギ抗ＣＥＡ抗体との間の抗体親和性との類似性
と、そしてＮＰ−２，３および４の減少する抗体親和性
を例証する。

【００６２】標識したＣＥＡまたはＭＡよりも標識した
ＮＣＡを結合するのに著しく高いレベルのＮＰ−１モノ
クロナール抗体を要するため、ＮＰ−１の標識ＣＥＡと
の反応をＣＥＡ，ＭＡおよびＮＣＡが阻止する能力を比
較した。結果は、ＭＡおよびＮＣＡはこの反応と競合す
ることができるが、しかしＣＥＡに比較して、結合を５
０％減らすのにＭＡおよびＮＣＡをそれぞれ約２および
８倍必要とした。ＭＡおよびＮＣＡの阻止は、ヤギ特異
性抗ＣＥＡ抗体によるＲＩＡで測定してこれら製剤はＣ
ＥＡ１．０％未満を含有していたので、ＣＥＡ混入によ
るものではなかった。試験したＮＣＡの最高濃度におい
てのみ、ＣＥＡ夾雑物がＮＣＡによって誘発される阻止
へ寄与し始める。ＣＥＡ，ＭＡおよびＮＣＡに対しぞれ
ぞれ 200,000、185,000 および60,000の分子量を使用し
て、ＮＰ−１はそのＣＥＡに対する親和性に比較して、
ＭＡに対しては少し低く、そしてＮＣＡに対しては１０
倍低かった。

【００６３】

【表６】

【００６４】（ａ） 標識ＣＥＡの抗体結合を５０％阻
止するのに要する未標識ＣＥＡのモル濃度またはｎｇ／
ｍｌ

【００６５】モノクロナール抗体結合の阻止 ２種のモノクロナール抗体ＮＰ−２およびＮＰ−３をＣ
ＥＡ結合に対するインキュベーション緩衝液イオン強度
の影響を基にして研究のために最初に選択した。標識Ｃ
ＥＡの３０％結合を得るため、０．０１Ｍ酢酸アンモニ
ウムに比較して０．１Ｍでは、ヤギ、ＮＰ−１およびＮ
Ｐ−２のかなりの多量、ＮＰ−２では３６倍が必要であ
ることが発見された。対照的に、これら２種の緩衝液中
のＮＰ−３およびＮＰ−４による抗原結合は非常に似て
いた。ＮＰ−２およびＮＰ−３がクラスIII カテゴリー
内の別々のエピトープを認識する可能性は相互阻止実験
によって分析された。これら研究において、ＣＥＡで増
感された固相ポリクロナールヤギ抗ＣＥＡを放射標識モ
ノクロナール抗体プローブを使用するサンドウィッチ系
に使用した。未標識モノクロナール抗体が放射標識抗体
の結合を阻止する能力を相互交差阻止実験において評価
した。別々のクラスカテゴリーへ属するが、ＮＰ−１お
よびＮＰ−２は相互を阻止するのに非常に効率的であっ
た。ＮＰ−３は試験した最高濃度においてＮＰ−１およ
びＮＰ−２結合を阻止できず、後者のモノクロナール抗
体をＮＰ−３のＣＥＡへの結合を阻止できなかった。

【００６６】本発明は、同じまたは異なる抗原上に存在
する少なくとも二つの異なるエピトープの相対的割合を
それによって決定することができる一般的イムノアッセ
イ方法を含む。該方法は、（ａ） 同じ分子または異な
る分子上の少なくとも二つの異なるエピトープを含有す
る被分析物をこれら二つのエピトープを担持するスペシ
スを結合し得る少なくとも一つの捕獲抗体と接触させる
ステップ、（ｂ） 生成する結合したスペシスを二つの
エピトープの一つを結合し得るプローブ抗体を含むプロ
ーブと接触させるステップ、および（ｃ） 結合したプ
ローブの濃度を測定するステップとよりなる。

【００６７】捕獲抗体は、結合される、結合されること
ができる、もしくは固相を形成するように沈澱し得る、
および／または任意の方法で被分析物から分離し得る抗
体または抗体混合物であろう。例えば捕獲抗体は前記二
つの異なるエピトープを含んでいる二つの異なる抗原を
結合し得るポリクロナール抗体、測定すべき二つの異な
るエピトープに対し特異性のポリクロナール、またはモ
ノクロナールまたは実質上モノ特異性な抗体、測定すべ
き二つのエピトープの両方とから異なるがしかしそのよ
うな二つの異なるエピトープと同じ抗原上にあるエピト
ープを結合し得る抗体、または適切な特異性を有する抗
体フラグメントを含む、任意の他の均等な抗体または抗
体混合物であり得る。捕獲抗体は固体支持体、例えば種
々の物質の固形粒子、例えばポリスチレン、ポリエチレ
ン、ガラスその他へ結合させることができ、または例え
ば捕獲抗体に対し特異性な他の抗体との反応により、ま
たは沈澱その他によって後で分離し得る相を形成するよ
うに結合する能力を持つことができる。その代わりに、
捕獲抗体は例えば磁化もしくは他の公知のプロセスによ
って分離することができる材料へ結合させることができ
る。

【００６８】一旦決定すべき二つのエピトープを担持す
るスペシスを捕獲抗体へ結合すれば、生成した結合スペ
シスは二つの異なるエピトープの一方を結合することが
できるが他方はできないプローブ抗体と接触させられ
る。好ましくは、プローブ抗体は実質上モノ特異性およ
び／またはモノクロナール抗体であろう。プローブ抗体
の結合は捕獲抗体結合エピトープ間の識別を許容する。
この決定は慣用のイムノアッセイ操作から適用した種々
の技術を使用して実施することができる。適当なそのよ
うな技術はプローブ抗体へ標識、例えばラジオアイソト
ープ、螢光マーカー、酵素その他を結合し、捕獲抗体、
決定すべき二つのエピトープを含むスペシスおよびプロ
ーブ抗体を含んでいる複合体を被分析物の残りから分離
し、そして標識の濃度を測定することを含む。その代わ
りに、競合阻止および／または他の間接測定を実施する
ことができる。その上に少数の、または好ましくは単一
のエピトープを持っている抗原フラグメントを含む、精
密に限定された抗原および／または抗原フラグメント
が、そのような操作に適した別のプローブスペシスを使
用し、イムノアッセイによって抗体を検出するための捕
獲スペシスとして使用できることが認識されるであろ
う。

【００６９】生体外液体標本中の抗原検出に基づくイム
ノアッセイは、固相担体へ結合した抗体または抗原のど
ちらも同様に使用できる競合的および非競合的操作に大
別される。選ばれるアッセイの特定のタイプは、精製し
た抗体および抗原の入手可能性、反応を定量するために
使用するマーカーでこれら試薬を標識できる容易性、望
まれる感度レベル、アッセイの企図する目的、それにア
ッセイのオートメーションへの適応可能性に依存する。

【００７０】酵素標識抗体を使用する固相非競合的イム
ノアッセイが、それらの簡単さと実施容易性のために多
数抗原および／またはエピトープ決定によく適してい
る。このタイプの操作には二つの主要ステップが含まれ
る。抗原溶液が不活性担体上へ固定化された抗体へ露出
される。この抗原捕獲段階の間、固定化抗体は抗原と反
応し、その後全体の複合体が不活性担体を緩衝液で洗浄
することによって余計な物質から分離される。次に過剰
の酵素標識遊離抗体が固定化抗体担体抗原複合体へ添加
される。この抗体プローブ段階の間、遊離抗体は捕獲抗
体によって担体へ二次的に結合した抗原と相互反応す
る。次に担体を洗浄し、酵素基質溶液とインキュベート
し、そして検出された酵素標識抗体の量はテスト標本中
に抗原および／またはエピトープの濃度に正比例する。

【００７１】本発明において同定されたモノクロナール
抗体は、限定されたエピトープ特異性と、そして高めら
れた結合定数とを基にして選択される。例として、共通
のＣＥＡ−ＭＡ−ＮＣＡエピトープを認識するモノクロ
ナール抗体は５．３×１０¹¹Ｍ^-1の親和定数を有し、そ
してこの値はポリクロナール抗体の１．６×１０¹²Ｍ^-1
の定数より少し小さいだけである。イムノアッセイは二
つのタイプに構成される。第１のものは、疏水性結合に
よってポリスチレンボールへ結合された捕獲抗体とし
て、ＣＥＡファミリーのすべてを認識する広スペクトル
モノクロナール抗体を有する。アガロース、セルロー
ス、アクリルアミド、ポリカーボネートおよび鉄粉のよ
うな他の不活性担体も使用することができる。ボールは
次に血清のような生物学的標本か、または遊離担体プロ
ーブの結合をステト標本中の抗原の濃度と関連させるた
めに使用される既知量の抗原ＣＥＡ，ＭＡもしくはＮＣ
Ａへ露出される。インキュベーションおよび洗浄後、結
合した捕獲された抗原を持つ個々のボールは、特異性ま
たは共通のエピトープ認識能を有する酵素標識モノクロ
ナールおよびポリクロナール抗体プローブへ露出され
る。抗体標識に適当なマーカー酵素は、ペルオキシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリ性フォスファタ
ーゼまたはβ−ガラクトシダーゼを含む。その代わり
に、酵素の代わりに螢光または放射活性化合物を抗体標
識のために使用することができる。インキュベーション
および洗浄後、ボールへ結合した酵素活性を適切な酵素
基質溶液とインキュベーションによって測定し、そして
生成した着色生成物のレベルを分光分析によって決定す
る。この方法により、各抗原の特異レベルが決定され、
そして個々に同様なまたは異なる病気を有する患者間で
比較され、または全体として特異性抗原の比として比較
される。特異性抗体レベル、それらの凝集比、および部
分的または全体の共通エピトープ表現は、がん性対非が
ん性疾病を持つ患者間で、そして疾病活動または退化の
異なる段階によって変化することが予期される。

【００７２】固相アッセイの第２のタイプは第１のタイ
プと同じ態様に構成されるが、主な例外はモノ特異性モ
ノクロナールおよびポリクロナール抗体が別々にボール
へ結合され、そして抗原捕獲のために使用されることで
ある。捕獲抗体のそれとは異なる、適当な抗体上の第２
の特異性エピトープに対する特異性を有するモノクロナ
ール抗体、または共通エピトープ抗体が抗体プローブと
して使用される。

【００７３】これらのイムノアッセイ技術は、被分析物
中の特異性抗原および／または抗体を検出するため、不
均質抗原および／または抗体混合物の純度および／また
は交差反応性を評価するため、酵素、標識もしくはトキ
シンのような薬剤もしくはマーカーで標識した抗原また
は抗体を含む、抗原および／または抗体の純度および力
価を決定するため、または密接に関連する抗原の混合
物、例えばＣＥＡファミリー中に存在する抗原の比、酵
素抽出液中のイソ酵素、リンパ腫細胞によって産生され
る抗体のＫ／Ｌ光チェーンの比、血液もしくは羊膜液中
の胎便抗原の相対的上昇度等を測定するために用いるこ
とができる。

【００７４】密接に関連する抗原および／またはそのエ
ピトープ特徴の存在および／または相対的豊富度の定性
的および／まはた定量的測定をなし得る能力は、種々の
診断状況において有用であり得る。例えば、ＮＣＡに対
するＣＥＡの比は、非がん性消化管病、例えば潰瘍性結
腸炎に対する消化器がん、特に結腸がんの識別診断を助
けるために使用することができる。他の例は、のう胞性
線維症の診断および／または予後インディケーターとし
て、血中胎便抗原の存在を検出するための前記操作の使
用である。毛膜液中の上昇したＭＡレベル、および／ま
たは毛膜液中のＣＥＡ以上のＭＡの上昇した相対的比率
は、便／母性問題、特に難便のインディケーターであ
る。ヒト絨毛ゴナンドトロビンのα−サブユニットおよ
びβ−サブユニットの相対比率の検出は、腫瘍の特定タ
イプ、例えば栄養胚葉腫瘍の診断を助けることができ
る。

【００７５】前述の方法は循環しているリンパ球の部分
母集団の比の決定に適合させることができる。これは感
染症、例えばインフルエンザおよび肝炎の診断に、そし
てリンパがんのタイプ化のために有用である。イソ酵素
の存在および／または相対比率の測定のためこのイムノ
アッセイの洗練の使用は、イソ酵素の異常レベルを特徴
とする種々の病変、例えば血流中へ高レベルにおいてク
レアチンキナーゼ−ＭＢの放出によって特徴化される心
筋梗塞、およびある種の肝臓デヒドロゲナーゼイソ酵素
の異常レベルを特徴とする種々の病変の検出および管理
を助けることができる。

【００７６】特定の腫瘍関連決定基の検出のためのイム
ノアッセイ技術および／または免疫細胞化学的技術の使
用は診断に有用である。例えば、特定の決定基の存在は
がんの支持証拠であろうし、そして推定的がんが異所的
部位にある場合は、これは転移腫瘍の存在の協力な指示
であろう。ＣＥＡの決定基特徴の存在を示すが、しかし
移所的である、すなわち発生した器管とは異なる器管中
にそして多分悪性腫瘍細胞中に発見されるＣＥＡ産生腫
瘍の転移の検出は腫瘍転移の強力な確認証拠である。

【００７７】がんの早期からもっと進行した状態への腫
瘍の進行はいくつかの決定基の表現またはそれらのそう
失によって決定することができる。これは好ましくは特
異性エピトープに対するモノクロナール抗体の使用によ
り、ラジオイムノアッセイおよび／または免疫細胞化学
的方法によって検出することができる。ある決定基の存
在または不存在は、このように腫瘍進行指示または特定
段階と相関し、また予後インディケーターとしても役立
つ。

【００７８】この方法の使用の他の例は、骨髄球白血病
において腫瘍負担のインディケーターとして白血病患者
中のＮＣＡの検出である。

【００７９】本発明は、ＣＥＡファミリー抗原上の器管
特異性エピトープをこれらエピトープに特異性の抗体を
使用して検出することを許容する。前述した操作と同様
に、これら抗体は免疫細胞化学的、生体外イムノアッセ
イおよび生体内造影操作によって新生物の組織形成源の
決定のために、そしてまたそのような腫瘍の一層選択的
免疫療法のために使用することができる。すべて参照と
してここに取り入れる米国特許第 4,331,647号、第 4,3
48,376号および第 4,361,544号に記載されている腫瘍位
置測定、検出および治療方法は、以前に指示したように
本発明の方法および組成物と組み合わせることができ
る。例えば、ＣＥＡ上の特定エピトープに特異性のモノ
クロナール抗体は、腫瘍位置測定および／または治療の
ため米国特許第 4,348,376号の方法に従って使用するこ
とができる。ＣＥＡファミリー抗原に対して特異性な二
つの異なる抗体からのＦ（ab)²フラグメントの混合物
は、米国特許第 4,331,647号の方法に従って使用するた
めの二価ハイブリッド抗体フラグメントの製造に使用す
ることができる。ＣＥＡの精密なエピトープに特異性の
抗体と結腸特異性抗原−ｐ（CSAp）とは、適当な放射性
標識と共に、特定の腫瘍タイプ、特に結直腸がんのため
の増加した結合性を有する抗体製剤を製造するために協
力的に使用することができる。

【００８０】本発明の新しいモノクロナール抗体を免疫
組織化学的技術またはイムノアッセイ操作を使って骨髄
白血病およびある種のリンパ腫の検出のために使用する
ことも有用である。免疫組織化学的技術による組織サン
プル中のＣＥＡ検出に使用されるいくつかのＣＥＡ特異
性抗体は、それらがモノクロナール抗体であるかまたは
ポリクロナール抗体であるかに関係なく比較し得るであ
ろうが、他の場合には、本発明によるモノクロナール抗
体の使用は有意義な利益、特にそれらはもっとコンスタ
ントな結果を与える利益を有するであろう。本発明によ
る抗原の他の免疫組織化学的応用は、同じ組織標本中の
多数マーカー局在化のため、それへ導入された異なる標
識、例えば放射標識、螢光標識等を有するこれら抗原の
使用を含む。他の用途はリンパ腫表現型化におけるＫ／
Ｌ軽チェーン比の決定または白血病患者の組織中のＮＣ
Ａの検出におけるように、組織中のマーカー比の検出で
ある。

【００８１】本発明の抗体は、慣用技術、例えばアフィ
ニティクロマトグラフィー、沈澱その他を使って抗原決
定基の精製のために使用することができる。それらはま
た新規な決定基および関連する抗原のファミリー中の未
だ限定されない決定基を解明するための助けとして使用
することができる。反対に、単一エピトープを含有する
抗原フラグメントを含む精製抗原は抗体、例えばモノク
ロナール抗体、不均質抗体製剤、および血液、組織、他
の体液その他のような他の調製物を検出し、精製し、滴
定しそして特徴化するのに用途がある。精製した抗原
は、融合の必要性なしに高度にモノ特異性の抗体の製造
のため、すなわちモノクロナール抗体と実質上同じモノ
特異性を有する抗体をそれらの製造のためハイブリドー
マ技術を使用しない製造のために勿論有用である。

【００８２】抗原性フラグメントを生成するための高度
に精製した抗原の消化は、該フラグメントが単一の免疫
化学的に活性なエピトープへ限られる場合、そのような
技術の有用性をさらに増幅する。本発明抗原は、例えば
スタフィロコッカスプロテアーゼＶ−８，トリプシン、
キモトリプシン、サーモリシンその他のようなタンパク
分解酵素へ露出することによってフラグメント化するこ
とができる。フラグメントは共通または特定エピトープ
特異性を有する結合したモノクロナール抗体を含有する
免疫吸収剤を使用することによって単離することができ
る。好ましくは、そのようなフラグメントは単一エピト
ープのみを含有するであろう。

【００８３】これ以上苦心することなく、当業者はこれ
までの説明を使用し、本発明をその全範囲において使用
することができるものと信じられる。従って以下の好ま
しい特定具体例は単に例証であり、記載の残部を少しも
限定しないものと考えるべきである。以下の実施例にお
いて、すべての温度は未補正摂氏であり、すべての部お
よびパーセントはことわりのない限り重量による。

【００８４】実施例１腫瘍組織からＣＥＡおよびＮＣＡの精製 この研究に用いたＣＥＡ製品は、ＲＩＡ用を除いて、Ne
wman et al, （CancerRes. 34：2125, 1974）によって
修飾された Krupey et al,（Immunochem. 9 ：617, 197
2 ）の操作に従って、結腸アデノカルチノーマの肝臓転
移から単離された。概して、濃縮したＰＣＡ抽出液は
０．１Ｍ NH₄Ac, ｐＨ４．０へ平衡化したＤＥＡＥおよ
びＣＭセルロース１：１混合物（Whatman, Clifton, N.
J.）へ適用された。吸着された物質を同じ緩衝液中の
０．０５M ，０．１M および０．２MNaClの非連続勾配
で溶離した。ＰＣＡ抽出液中の当初のＣＥＡ免疫反応性
の約３０％が、ロシュＣＥＡアッセイキット（Nutly,
N. V.）でモニターし、適用緩衝液（Ａ），０．０５M N
aCl（Ｂ）、お余び０．１M NaCl（Ｃ）分画のめいめい
中に出現した。該Ｃ分画は、０．０５M PO₄, ｐＨ５．
０プラス０．１５M NaCl緩衝液中のセファローズ6Bおよ
びセファデックス G-200（ファルマシア）上の順次クロ
マトグラフィーにかけた。コンカナバリン−Ａセファロ
ーズ（ファルマシア）上の最終分離ステップは、Pritch
ard および Todd の方法に従って実施され、それにより
吸着された抗原は室温で２０％（w ／v ）のα−メチル
-D−グルコシッドで溶離された。ＣＥＡは蒸溜水に対し
て透析され、凍結乾燥され、CaCl₂ 上でコンスタント重
量へ乾燥された。精製したＣＥＡはロシュアッセイで決
定する時特異活性（単位乾燥重量当たりの中和活性）
０．７を持っていた。それは免疫電気泳動において正常
ヒト血清に比較してα−グロブリンとして移動し、そし
て二重免疫拡散においてロシュ参照ＣＥＡと一致するバ
ンドを与えた。タンパクまたは炭水化物のために染色し
た７．５％ポリアクリルアミドゲル中において単一バン
ドが観察された。

【００８５】ＤＥＡＥ−ＣＭセルロースイオン交換体か
らのＡ分画はＮＣＡを含有し、そして５×９０cmセファ
デックス G-200カラム上のクロマトグラフィーによって
この分画中にやはり存在するＣＥＡから分離された。Ｎ
ＣＡの存在は二重免疫拡散によってモニターされ、抗原
活性のピークは１０００ないし１２００ｍｌの溶出容積
中に現れた。この分画はＣＥＡについて記載したコンカ
ナバリン−Ａセファローズクロマトグラフィーにかけら
れ、そして吸着された抗原は抗ＮＣＡ免疫吸着剤上の通
過によってさらに精製された。ＮＣＡは０．２ Mグリシ
ン− HCl, ｐＨ２．０によって免疫吸着剤から溶出さ
れ、NaOHで中和され、ＰＢＳに対して透析され、そして
Amicon PM-10 膜（Amicon, Lexington, Mass ）上で濃
縮された。精製されたＮＣＡは免疫電気泳動においてβ
−グロブリンとして移動し、そして二重免疫拡散におい
て参照ＮＣＡとの一致反応を与えた。ＮＣＡはまた前に
記載したように（Primus et al., J. Immunol. 118：5
5, 1977）免疫沈澱によって正常脾臓から部分的に精製
された。

【００８６】実施例２胎便からＭＡの精製 胎便５０ｇを０．１M PO₄, ｐＨ８．０の３００ｍｌ中
に懸濁し、一夜４゜で混合した。３０分間 10P000 ×ｇ
において遠心後、上清のｐＨを８．５へ調節し、そして
冷無水エタノールを最終濃度４０％まで加えた。遠心後
得られたエタノール性上清を０．０２M PO₄, ｐＨ７．
８に対して透析し、同じ緩衝液で平衡化したＤＥ５２
（Whatman ）５．０ｇと混合した。適用した緩衝液で未
結合物質を溶出した後、吸着した物質を同じ緩衝液中の
非連続NaCl勾配で除去した。０．１M NaCl分画中に出て
来る抗原活性を０．０５M PO₄, ｐＨ５．０プラス０．
１５NaClに対して透析し、YM-10 膜（Amicon）上で濃縮
し、そして２．６×９０cmセファクリル S-300（ファル
マシア）カラムへ適用した。２２５ないし２７０ｍｌ溶
離容積に含まれている抗原活性をプールし、０．１M P
O₄, ｐＨ７．０に対して透析し、そしてヤギ特異性抗Ｃ
ＥＡ抗体を含有する免疫吸着剤の上を通過させた。後者
の免疫吸着剤からの未吸着分画を次に前に記載した胎便
モノクロナールＣＥＡ抗体ＮＰ−３を含んでいる第２の
免疫吸着剤へ適用した。ヤギからの交差反応性ＣＥＡ抗
体による阻止研究を基にして、ＮＰ−３は胎便中のＣＥ
ＡおよびＮＣＡ非関連ＣＥＡ関連物質間に共有される決
定基を認識することを示した。ＮＰ−３へ結合した抗原
をＮＣＡ精製のため前記のように溶離した。吸着した分
画を中和し、ＰＢＳに対して透析し、そして YM-10膜上
で濃縮した。

【００８７】実施例３動物免疫および抗血清の製造 ヤギ抗ＣＥＡ抗血清は、等量のメチル化ウシ血清アルブ
ミン（Sigma, St. Louis, Mo. ）へ結合しそして等容積
の完全フロインドアジュバント（ Difco, Detroit, Mic
h.）中に乳化した精製ＣＥＡ１００ないし２００μg の
注射によって調製した。不完全アジュバントは最初の注
射の後で使用された。２１回の注射の後得られたヤギ抗
ＣＥＡ抗血清は、血液凝集活性がなくなるまで、Le^a お
よびLe^b 個人からのＡ，ＢおよびＯ赤血球で反復吸収し
た。抗血清は次に正常結腸およびＮＣＡ免疫吸着剤上の
順次クロマトグラフィーにかけられ、吸着されない分画
が両方の場合に使用された。吸着の完全性は、正常組織
抽出液およびＮＣＡに対する二重免疫拡散において分析
された。ＮＣＡ中和抗ＣＥＡ抗血清の一部は、抗血清ｍ
ｌ当たりアルコール抽出胎便２５０mg（乾燥重量）を加
えることにより胎便でさらに吸収された。免疫沈澱の分
離後、吸収の完全性は胎便に対する二重免疫拡散により
証明された。このＮＣＡおよび胎便吸着抗血清は、以後
特異性抗ＣＥＡ抗血清と同定された。

【００８８】ヤギ抗ＮＣＡ抗血清は、ＣＥＡ免疫吸着剤
上の通過によってＣＥＡと交差反応する抗体を除去され
た。ＣＥＡ中和抗血清は二重免疫拡散またはＲＩＡにお
いてＣＥＡと反応しなかった。

【００８９】実施例４抗原およびヤギ抗血清 マウス免疫に使用するＣＥＡおよびＮＣＡは、結腸アデ
ノカルチノーマの肝臓転移から単離され、そしてＭＡは
胎便から Primus etal., Cancer Res. 43, Feb., 1983
（以後“Primus '83）に記載のように単離された。すべ
ての抗原はクロラミンT 法により ¹²⁵Ｉ（Amersham, Ar
lington Heights, IL ）で約３０ Ci ／g の比活性へ放
射ヨード化された。ロシュＣＥＡアッセイキット（ Nut
ley,N.J.）からの放射標識ＣＥＡは、それが免疫化のた
めに使用したＣＥＡで得られたものと同様の結果を与え
ることが判明した時、日常的に用いられた。

【００９０】ロシュキットのヤギ抗ＣＥＡ抗体はＲＩＡ
に用いられた。ヤギ抗ＮＣＡ抗血清（No. ８０）は、Ro
che Research Center, Nutley,N.J.の Edward Newmanの
好意で供給され、そして使用前ＣＥＡ免疫吸着剤上の通
過によってＣＥＡと交差反応する抗体が除去された。

【００９１】ヤギ抗血清との標識ＣＥＡ，ＭＡおよびＮ
ＣＡの結合特性はPrimus '83に記載されている。ロシュ
キット抗体と、ＮＣＡおよび胎便で吸収したＣＥＡに対
し特異性となしたヤギ抗ＣＥＡ抗血清は、標識ＣＥＡと
同様に反応した。標識したＭＡはロシュキット抗体によ
って結合されたが、しかしヤギ特異性抗ＣＥＡ抗血清に
よっては結合されなかった。ＮＣＡはロシュキット抗体
または特異性抗ＣＥＡ抗血清と反応せず、またヤギ特異
性抗ＮＣＡ抗体はＣＥＡおよびＭＡと結合しなかった。

【００９２】実施例５マウス免疫化 ３ないし４月令のＢＡＬＢ／Ｃ雌マウス（Harlan-Sprag
ue-Dawley,Indianapolis, IN. ）へ、不完全フロインド
アジュバント中のＣＥＡ２０μｇの i.p. 注射３回を投
与した。２回目および３回目の注射は第１回からそれぞ
れ２および８週離した。最初の免疫化から６ケ月後、Ｃ
ＥＡに対する血清抗体を示す２匹のマウスを脾臓細胞ド
ナーとして選び、そして Stahli et al.の Res. Monog
r. Immunol. 3：201, 1981 の免疫化プロトコールに従
って食塩水中各５０mgの最終ＣＥＡ注射シリーズを受け
た。融合の４日および１日前に、ＣＥＡを i.p. 注射
し、融合の３日および２日前に、それは i.p. とi.v.注
射のために等量に分離した。

【００９３】実施例６細胞融合およびクローニング Primus '83に引用されている McKearnの方法に従って、
２匹のＣＥＡ免疫マウスから得た脾臓細胞と二つの別々
の融合が実施された。各融合のため、５×１０⁷ の Fic
oll-Hypaque 分離脾臓細胞と５×１０⁶ ，Ｐ3-× 63 −
Ａｇ８．６５３骨髄細胞（Salk Institute SanDiego, C
A.）とを６０mm培養皿中で混合し、２５０×ｇで５分間
遠心した。過剰の媒体を除去し、そして３７℃で Dulb
eccoの修飾イーグル培地（GIBCO, Grand Island, N.Y.
）中５０％（v ／v ）ポリエチレングリコール（1500,
fisher）１．０ｍｌで置換した。ポリエチレングリコ
ールへ３０秒露出後、細胞を２回洗浄し、そして次に２
０％無ガンマウマ血清（KC Boilogicals, Inc., Lenex
a, KS）, L-グルタミン２mM, ピルビン酸ナトリウム１m
M, L-アルギニン０．５５mM, L-アスパラギン０．２７m
M, および葉酸１４μMを補給したDulbeccoの修飾イーグ
ル培地５ｍｌ中で一夜インキュベートした。細胞をヒポ
キサンチン０．１mM, アミノプテリン０．４μM,および
チミジン１６μM,をさらに補給した後者の培地３０ｍｌ
以上中に分散した。細胞分散液を９６ウェルのミクロウ
ェルプレート（Castar, Cambridge,Mass. ）中にウェル
当たり１００μＬづつ分配した。アミノプテリンの除い
た培地の追加１００μＬを７日後にウェルへ加えた。培
養２ないし４週後、生育している細胞クローンを含んで
いるウェルからの培地をＲＩＡによってＣＥＡ抗体につ
いてアッセイした。ＣＥＡ抗体陽性ウェルを、ウェル当
たり１０⁷ 個の照射した（１４００Ｒ）ルイスラット胸
腺細胞を含んでいる２４ウェルプレート（Costar）中へ
広げた。交会に達した時、抗体陽性を持続しているすべ
ての培養物を凍結し、他方４クローンを制限希釈度にお
いて２回再クローンした。ハイブリドーマをウェル当た
り１０⁶ 個の照射ルイスラット胸腺細胞を含んでいる９
６ウェルプレート中に再クローンした。選択された再ク
ローンしたハイブリドーマ細胞系統を１０％無ガンマウ
マ血清と、Ｌ−グルタミン２mMと、ピルビン酸ナトリウ
ム１mMとを補給した Dulbecco修飾イーグル培地を収容
した培養フラスコ中に拡大した。

【００９４】実施例７モノクロナール抗体精製 モノクロナール抗体は１０％無ガンマウマ血清を含有す
る培地から精製された。概して、免疫グロブリンをｐＨ
７．０において５０％（NH₄)₂SO₄で沈澱し、蒸溜水に再
溶解し、ポリエチレングリコール（7000-9000 ）で最終
濃度１３％（w／v ）において再沈澱した。ポリエチレ
ングリコール沈澱は０．０２M PO₄, ｐＨ５．６中に溶
解し、同じ緩衝液で平衡化したＣＭセルロース（Whatma
n, Clifton, N.J.）へ適用した。吸着された免疫グロブ
リンを０．０２M PO₄, ｐＨ７．８プラス０．２M NaCl
で溶離し、０．０１M PO₄, ｐＨ８．０に対して透析
し、そして後者の緩衝液で平衡化したＤＥＡＥセルロー
ス（Whatman ）カラムへ適用した。吸着された抗体を
０．０２５M PO₄, ｐＨ８．０で溶離し、ＰＢＳに対し
て平衡化し、限外ロ過（Amicon, Danvers,MA. ）によっ
て濃縮した。精製したモノクロナール抗体はクロラミン
-T法によって比活性５ないし１０μCi／μg へ放射性ヨ
ード化された。マウス IgGに加え、精製した抗体は、放
射性ヨード化した製品を固相ヤギ抗ウマ IgGへ結合させ
ることによって測定し、１０ないし４０％のウマ免疫グ
ロブリンを含有していた。製品中のモノクロナール抗体
のパーセントは、Primus et al., J. Immunol. 118：5
5,1977 に記載されているように、放射性ヨード化した
製品のＣＥＡ免疫吸着剤への結合によって決定された。

【００９５】実施例８ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ ） 結合および遊離標識抗原の分離方法において異なる二つ
のタイプのＲＩＡが使用された。抗ＣＥＡおよび抗ＭＡ
抗体活性についてハイブリドーマ培養物からの上清培地
のアッセイは、Hansen et al, Human Pathol., 5：139,
1974 記載のＺ−ゲル法を使用した。選定したモノクロ
ナール抗体のＣＥＡおよびＭＡとの結合研究と、そして
ＮＣＡ反応性についてのすべてのアッセイは、固相ダブ
ル抗体操作（Newman et al, Proc. Am. Assoc. Cancer
Res. 21 ：218, 1980 ）を使用した。基本アッセイは、
１．０％正常ウサギ血清と、約０．５ngの標識抗原（３
０ないし５０μCi／μg ）と、そして抗体製品の０．０
５ｍｌ部分標本とを含む２．０ｍｌの０．０１M NH₄A
c, ｐＨ６．２５とからなっていた。４５゜１時間のイ
ンキュベーションがハイブリドーマ培養物中のＣＥＡお
よびＭＡ抗体活性の検出に使用され、同温度４時間のイ
ンキュベーションがＮＣＡ抗体の検出に使用された。標
識抗体結合曲線および競合的阻止測定は、それぞれ４５
゜４時間および室温２４時間のインキュベーション後に
誘導された。インキュベーション後、Ｚ−ゲルまたは固
相抗免疫グロブリンＧＡＭもしくはＤＡＧの１ｍｌへ添
加され、試験管が混合された。Ｚ−ゲルが入っている試
験管を直ちに遠心し、ＧＡＭまたはＤＡＧが入っている
試験管については追加の室温１５分のインキュベーショ
ンが実施された。試験管は、カウントの前に０．１M N
H₄Ac（Z-ゲルアッセイ）またはＰＢＳ（ダブル抗体アッ
セイ）２．０ｍｌで一回洗浄した。非特異性結合は、Ｚ
−ゲルおよびダブル抗体アッセイに対しそれぞれ１０％
および１％であった。モノクロナール抗体、ヤギ抗血
清、未標識抗原、および標識抗原はヒト血清アルブミン
１．０％を含有するＰＢＳ中に希釈された。

【００９６】実施例９抗体親和性測定 抗体親和性は Mueller, J. Immunol. Methods 34：345,
1980 の競合ＲＩＡ法によって測定した。計算した結合
定数と抗体濃度との積は、Jacobsen et al. J.Immunol.
Methods. 50 ：77, 1982によって推奨されるように１
０未満であった。

【００９７】実施例１０阻止アッセイ 相互阻止実験は固相競合サンドイッチ操作を使用した。
ポリクロナールヤギ抗ＣＥＡ血清はフッ化ビニリデン粉
末（Kynar, グレード 30 ／F ； Pennwalt Corp., Kin
g of Prussia, PA. ）へ結合され、０．０１M NH₄Ac中
４５゜１時間のインキュベーションにより未標識ＣＥＡ
で増感された。使用したＣＥＡの量は結合し得る放射標
識モノクロナール抗体の最大量の４０％を結合した。Ｃ
ＥＡ増感Kynar ０．５ｍｌをモノクロナール抗体希釈液
の０．０５ｍｌ部分標本と４５゜で１時間インキュベー
トし、遠心し、そしてペレットを１％正常ウサギ血清を
含有する０．０１M NH₄Ac１．０ｍｌ中に再懸濁した。
０．０５ｍｌ中に含まれる放射性ヨード化モノクロナー
ル抗体を試験管へ加え、４５゜で１時間インキュベート
し、遠心し、一回洗浄し、そしてペレットをカウントし
た。標識した抗体製品の未増感 Kynarへの非特異性結合
は５％未満であった。

【００９８】実施例１１赤血球結合 Ａ，ＢおよびＯ分泌者および非分泌者個人からの赤血球
を同個数で２％または１０％懸濁液として混合し、そし
てハイブリドーマ組織培地の５０μＬ部分標本と室温で
１時間インキュベートした。血球を洗浄し、ＰＢＳ中に
再懸濁し、そして重いそして軽いチェーン特異性を有す
る放射性ヨード化アフィニティー精製ＧＡＭと室温で１
時間インキュベートした。インキュベーション後、赤血
球を洗い、カウントした。

【００９９】実施例１２組織処理および固定 結直腸がんを有する２３人から組織を得た。これらアデ
ノカルチノーマのうち、３例は盲腸、６例は上行結腸、
および１４例は直腸Ｓ状結腸であった。１例はあまり分
化されていなかったが、残りはよく分化されていた。腫
瘍に隣接したおよび／または切除縁の形態上正常な粘膜
がこれら例の２１例から入手可能であった。Dukeの分類
が臨床的ステージングに使用された（Duke, G.E., J. P
athol,Bacteriol. 35 ：322, 1932 ）。

【０１００】外科標本は日常的に１０％緩衝化ホルマリ
ンｐＨ７．２中に固定され、６例においては、それらは
Primus et al., J. Natl. Cancer Insti., 67：10, 19
81に以前記載したようにＥＡ中にも固定された。組織は
パラフィン中に埋め込まれ、５μm の厚さに順次切片化
された。切片はゼラチン化スライド上にマウントされ、
キシレンで脱パラフィン化され、減少するエタノール濃
度と、最後にＰＢＳで再水和された。

【０１０１】実施例１３免疫組織化学的操作 ＢＲＡＢ免疫ペルオキシダーゼ方法がヤギおよびモノク
ロナール抗体による染色反応の大部分のために使用され
た（Guesdon et al., J. Histochem. Cytochem. 27：11
31, 1979）。ヤギ抗体による基本的操作は、一時ヤギ抗
体、ビオチン化ウサギ抗ヤギIgG （５０μｇ／ｍｌ），
遊離アビジン（１００μｇ／ｍｌ），およびビオチン化
ワサビペルオキシダーゼ（５０μｇ／ｍｌ）を順次適用
することよりなっていた。ビオチン化試薬およびアビジ
ンは Vector Laboratories （Burlingame, CA）から得
た。アビジンを０．０５M トリス，ｐＨ８．６プラス
０．１５M NaCl中に希釈したのを除き、すべての試薬は
ＰＢＳ中に希釈された。ネズミモノクロナール抗体によ
る抗原の検出のため、基本的操作はモノクロナール抗体
の最初の適用後アフィニティー精製ヤギ抗マウス IgG
（３０μｇ／ｍｌ）ステップの導入によって修飾され
た。すべての免疫およびビオチン−アビジン反応は加温
雰囲気内において３７℃で２０分および室温で３０分間
実施された。各ステップの後ＰＢＳ中２回５分間洗浄し
た。各スライド中の一切片はテスト抗体を受け、隣りの
切片は対照品へ露出された。ヤギ抗ＣＥＡおよび抗ＮＣ
Ａ抗血清をそれぞれ 1／600 および 1／100 希釈度で使
用した。これら抗血清の対照は、同様に希釈した抗原中
和ＣＥＡ抗血清および／または正常ヤギ血清からなって
いた。モノクロナール抗体は５μｇ／ｍｌで使用し、そ
して正常マウスIgG （Pel-Freeze, Rogers, AR）は５０
μｇ／ｍｌで使用し、そして抗原中和精製モノクロナー
ル抗体および腹水を対照目的に使用した。一次抗体の適
用前に、水和した切片は、メタノール中３％H₂O₂中でイ
ンキュベートし、ＰＢＳ中で洗浄し、そして希釈した正
常ウサギ血清と３７℃で１０分間インキュベートした。
ビオチン化酵素ステップの後、組織化学的反応を０．０
５M トリス− HCl，ｐＨ７．６中の０．０１％ジアミノ
ベンジジンおよび０．００３％H₂O₂により、室温１５分
間で進行させた。免疫ペルオキシダーゼ染色スライドを
Harris のヘマトキシリンで明るく対比染色した。

【０１０２】グルコースオキシダーゼ抗グルコースオキ
シダーゼ複合体を使用する未標識抗体方法（Clark et a
l, J. Histochem. Cytochem. 30 ：27, 1982）を好中球
中のＮＣＡの検出のために使用した。基本的操作は、ロ
バ抗ヤギ IgGおよびヤギ抗グルコースオキシダーゼ−グ
ルコースオキシダーゼ複合体をそれぞれビオチン化ウサ
ギ抗ヤギIgG およびビオチン化ワサビペルオキシダーゼ
の代わりに使用したことを除き、ＢＲＡＢ技術に類似で
あった。アビジンおよびH₂O₂ステップも省略し、そして
正常ウサギ血清の代わりに未希釈正常ウマ血清とのプレ
インキュベーションを使用した。酵素開示反応は以下の
ものからなっていた。６．７mg／ｍｌβ−Ｄ−グルコー
ス（calbiochem−Behringer, LaJolla, CA），０．６７
mg／ｍｌＮＢＴ（Reseach OrganicsIncs., Cleveland,
OH）, および０．００５M トリス, ｐＨ８．３中の０．
０１６７mg／ｍｌフェナジンメトサルフェート（Sigma,
St. Louis, MO）。グルコースおよびＮＢＴを３７℃で
１時間プレヒートし、その時点でフェナジンメトサルフ
ェートおよび組織片を加えた。３７℃においてさらに４
５分インキュベーション後、スライドを洗浄し、そして
核ファーストレッドで対比染色した。

【０１０３】以上の実施例は、本発明の一般的にまたは
特定的に記載した反応剤および／または作業条件を以上
の実施例に用いたそれらに代えることにより、同程度の
成功度をもってくり返すことができる。

【０１０４】以上の説明から、当業者は本発明の必須の
特徴を容易に確かめることができ、そしてその精神およ
び範囲から逸脱することなく、それを種々の用途および
条件に適合させるため種々の変更および修飾をすること
ができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】ＣＥＡファミリー抗原に発見されるエピトープ
のクラフ分け、およびそれらエピトープに対し特異性の
モノクローナル抗体を解説するグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 Ｂ // Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＤＵ Ｔ Ｃ１２Ｑ 1/00 6807−4Ｂ (72)発明者 プリマス，フレデリック ジェームス アメリカ合衆国08867ニュージャージー、 ピッツタウン、ルート１、ピーオーボック ス６ (72)発明者 ゴールデンバーグ，ミルトン デービッド アメリカ合衆国07078ニュージャージー、 ショートヒルズ、デンマンコート11

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】２００，０００ダルトンガン胎児性抗原上
   の一つのエピトープへ特異的に結合するが、しかし胎便
   抗原および非特異的交差反応性抗原のいずれへも特異的
   に結合しない、精製されたハイブリドーマから誘導され
   た抗ＣＥＡモノクローナル抗体。