JP2959837B2 - 癌関連ハプトグロビン - Google Patents

癌関連ハプトグロビン

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Description

【発明の詳細な説明】 この研究は国立衛生研究所（National Institutes of
Health）からの助成金により支援された。米国政府は
この発明に一定の権利を保持する。
発明の技術分野 本発明は新生物組織から発現されるが大部分の正常組
織からは発現されないヒト蛋白質の分野に関する。
発明の背景 通常のヒト・ハプトグロビンは十分に研究されてい
る；それらは40年以上前に発見され、それらの役割はヘ
モグロビンの血漿輸送であると考えられている。ハプト
グロビンの合成は主として肝臓で起こるが、いくつかの
場合にはリンパ球培養物と脳がハプトグロビンを合成す
ると報告された。
すべてのハプトグロビンは２種類のポリペプチド鎖、
ベータ鎖とアルファ鎖、を含んでいる。ベータ鎖はすべ
てのハプトグロビンにおいてほとんど同じであるが、ア
ルファ鎖は３つの型で存在している。２つのアルファ鎖
型（Hp1fおよびHp1s）は54位のアミノ酸残基が１個相違
するだけである。３つ目の型（Hp2）は他の２つのアル
ファ鎖のどちらよりも長く、明らかにアルファ鎖が部分
的に重複する不等乗換え（unequal crossing over）に
よって生じたものである。
1985年に、Maeda（J.Biol.Chem.,vol.260,p.6698−67
09、この文献は特別にここに引用される）は通常のハプ
トグロビン遺伝子座から2.2kb下流に位置するDNAの領域
を開示した。このDNA配列は、この遺伝子座が理論蛋白
質（そのアルファ鎖とベータ鎖は通常のハプトグロビン
と相違するが、高度に相同である）をコードする完全な
遺伝子を含むことを示した。Maedaはこの遺伝子座を
“ハプトグロビン関連”としてHprと名付けた。数人の
研究者はこの遺伝子の発現を検出するのに失敗した。
（Oh,et al.,Cancer Research,vol.47,p.5120−5126,19
87;Maeda,Journal of Biological Chemistry,vol.260,
p.6698−6709,1985;およびBensi et al.,The EMBO Jour
nal,vol.4,p.119−126,1985）。
発明の要約 本発明の目的は、hpr遺伝子のヌクレオチド配列に対
応するアミノ酸配列を有しかつhpr遺伝子産物に存在し
てハプトグロビン１または２に存在しないエピトープと
免疫反応性である抗体の哺乳動物による生産を刺激する
能力を有するポリペプチドの実質的に純粋な調製物を提
供することである。
本発明の他の目的は、Hpr蛋白質と免疫反応性であっ
てハプトグロビン１または２とは免疫反応性でない抗体
の調製物を提供することである。
本発明のさらに他の目的は、Hp1およびHp2から実質的
に精製されるHpr蛋白質の調製物を提供することであ
る。
本発明のさらに他の目的は、ヒト細胞からHpr調製物
を生産する方法を提供することである。
本発明の別の目的は、乳癌の予後を判定するためのキ
ットおよび方法を提供することである。
本発明の他の目的は、固形腫瘍を有する患者の予後を
判定する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、生物学的液体中のHpr蛋白質を
検定する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、患者の腫瘍細胞の増殖を検出す
る方法を提供することである。
これらの目的と本発明の他の目的は以下に記載する実
施態様により実現される。一実施態様において、hpr遺
伝子のヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配列を有す
るポリペプチドの実質的に純粋な調製物が提供される。
このポリペプチド調製物を哺乳動物に投与すると、それ
はhpr遺伝子産物に存在してハプトグロビン１または２
に存在しないエピトープと免疫反応性である抗体の生産
を刺激する。
本発明の他の実施態様では、Hpr蛋白質と免疫反応性
であってハプトグロビン１または２とは免疫反応性でな
い抗体の調製物が提供される。
本発明のさらに他の実施態様では、Hp1およびHp2から
実質的に精製されるHpr蛋白質の調製物が提供される。
本発明の別の実施態様では、Hpr調製物を生産する方
法が提供される。ヒト乳癌細胞はHprに存在してHp1やHp
2に存在しないエピトープと反応する抗体との免疫反応
性について試験される。免疫反応性の乳癌細胞を培養
し、この培養細胞からHprを含む細胞質画分を回収す
る。別の実施態様では、ヒト脱落膜または胎盤組織が集
められる。Hpr調製物を得るために、この脱落膜または
胎盤組織からHpr蛋白質を含む細胞質画分を回収する。
さらに別の実施態様では、乳癌の予後を判定するため
のキットが提供される。このキットHpr蛋白質に存在し
てハプトグロビン１または２に存在しないエピトープと
免疫反応性である抗体の調製物、およびこの抗体を検出
するための手段を含んでいる。また、固形腫瘍の経過を
判定する方法も提供され、この場合は組織学的切片をHp
r蛋白質と免疫反応性であってハプトグロビン１または
２とは免疫反応性でない抗体の調製物と接触させる。切
片への抗体結合を測定する。
本発明の他の実施態様では、生物学的液体中のHprを
検定する方法が提供される。Hprに存在してHp1やHp2に
存在しないエピトープと免疫反応性の抗体を担体に結合
させ、次にこの担体と未知量のHprを含む生物学的液体
とを抗体−抗原複合体が安定して形成される条件下に接
触させる。その後、担体はHprとエピトープを共有する
がHp1やHp2とは共有しないポリペプチドと、抗体−抗原
複合体が安定して形成される条件下で接触させる。この
ポリペプチドはまた、担体に結合されたポリペプチドの
量が検出可能な成分を検出・定量することにより定量化
できるように、検出可能な成分を保有する。生物学的液
体を担体と接触させないで、この担体へのポリペプチド
の100％結合を測定する対照実験も行われる。生物学的
液体の存在下で観測された結合低下の量が生物学的液体
中のHprの量に関係づけられる。
本発明のさらに別の実施態様では、患者の腫瘍細胞の
増殖を検出する方法が提供される。腫瘍保持患者から生
物学的液体を採取する。この液体中のHprの量を定量化
する。液体中に存在するHprの量は、検出できる腫瘍を
もたない患者から集めた対照液体中のHprの量と比較す
る。腫瘍保持患者の液体中のHprの量の増加は腫瘍細胞
の増殖を示す。これらと他の実施態様は本発明の詳細な
説明において以下で述べることにする。
ハプトグロビンと違って、肝臓ではHprの合成が発見
されていないという事実にもかかわらず、本発明はHpr
を含む４種類の異なる供給源を提供する。ヒト乳癌細
胞、ヒト脱落膜、ヒト胎盤、およびヒト妊娠血清はすべ
てHpr特異的抗体と特異的に交差反応する物質を含むこ
とが見いだされた。さらに、Hprは腫瘍の侵入および初
期転移の傾向を予告するための、ヒト固形腫瘍の特に有
用な診断マーカーであることが判明した。
図面の簡単な説明 図１は、Hpr蛋白質の漸進的精製を示す。抗PAPP−Ａ
と反応性の血漿蛋白質の段階的クロマトグラフィー精製
のポリアクリルアミドゲル電気泳動および対応するウェ
スタンブロットを示す。
図２は、勾配アニオン交換クロマトグラフィーによる
免疫反応性重鎖および軽鎖のポリアクリルアミド電気泳
動分離を示す。
図３は、（１）遺伝子配列から推定されたHpr蛋白
質；（２）ハプトグロビン1;および（３）ハプトグロビ
ン2;の配列を示し、それぞれは妊娠血清から単離した蛋
白質のＮ末端ベータ鎖配列と整合してある。
図４は、ハプトグロビン１、ハプトグロビン２および
精製した妊娠関連ハプトグロビン（Hpr）のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動分離、並びに抗ハプトグロビンお
よび抗PAPP−Ａとの対応するイムノブロットを示す。
図５は、ハプトグロビン１、ハプトグロビン関連蛋白
質（Hpr）、ハプトグロビン２、およびハプトグロビン
の混合物のハプトグロビンアルファ鎖のトリプシンペプ
チド地図を示す。
図６は、ハプトグロビン１とハプトグロビン関連蛋白
質のポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。パネルＢ
−Ｅは同一蛋白質と種々の抗体調製物とのイムノブロッ
トである。
図７のパネルＡは、合成ペプチド（その配列はhpr遺
伝子に対応する）に対して誘導された抗体を用いたヒト
乳癌細胞の免疫組織化学的染色を示す。パネルＢは同一
の実験を示すが、ただし抗体は妊娠血清からの精製Hpr
とプレインキュベートした。パネルＣは抗CEAによる染
色を示し、抗CEA染色はHprとのプレインキュベーション
により阻止されなかった（パネルＤ）。
図８は、癌関連ハプトグロビン染色と乳癌の再発との
相関関係を示す。
図９は、hpr遺伝子の配列に従って合成したペプチド
に対して誘導された抗体による乳癌細胞系列の染色を示
す。
図10は、hpr遺伝子からの推定配列に従って合成した
ペプチドに対して誘導された抗体による脱落膜の染色を
示す。
図11は、hpr遺伝子からの推定配列に従って合成した
ペプチドに対して誘導された抗体によるヒト脱落膜中の
反応性蛋白質のウエスタンブロット分析を示す。
発明の詳細な説明 これまで検出されなかったHpr蛋白質がいろいろなヒ
ト細胞および組織に存在しうるということは本発明の発
見である。これらにはヒト乳癌組織、ヒト脱落膜および
胎盤、妊娠女性からの血清、および培養したヒト乳癌細
胞系列が含まれる。妊娠血清からのHpr蛋白質はHp1とHp
2を実質的に含まないように物理化学的方法を使って精
製された。ヌクレオチド配列から推定されたHpr蛋白質
はハプトグロビン１および２と非常に類似しているが、
アルファ鎖のＮ末端に多くのアミノ酸の相違が集中して
いる。
次のアミノ酸配列をもつ合成ポリペプチドがつくられ
た： このポリペプチドはMaedaにより同定されたHpr遺伝子
のヌクレオチド配列から推定された34個のＮ末端アミノ
酸にほぼ一致している。このペプチドはHpr遺伝子産物
に存在してハプトグロビン１または２に存在しないエピ
トープと免疫反応性である抗体の哺乳動物による生産を
刺激することができる。これらの抗体はヒト組織でのHp
r発現を確実に検出するためばかりでなく、当分野でよ
く知られたイムノアフィニティー技法を使ってHprを精
製するためにも使用される。
hpr遺伝子のヌクレオチド配列に対応するアミノ酸配
列を有するポリペプチドの実質的に純粋な調製物は、当
分野で知られた技法のどれかを使ってつくることができ
る。例えば、Merrifield法（Journal of American Chem
ical Society,vol.85,p.2149−2154,1968）が使用され
る。実質的に純粋とは、その調製物がハプトグロビン１
および２をほとんど完全に含まないことを意味する。推
定Hpr蛋白質の34個のＮ末端アミノ酸に一致する配列が
使用されたが、他のポリペプチドも同様に使用できる。
他のポリペプチドはより長くてもより短くてもよく、ま
たHprに存在してHp1やHp2に存在しないエピトープを変
えることのない保存的アミノ酸の変更を含んでいてもよ
い。ポリペプチドはHpr、ハプトグロビン１およびハプ
トグロビン２のアミノ酸配列を比較して、最大量の相違
を有する配列の領域を利用することによってデザインさ
れる。Maeda,Journal of Biological Chemistry,vol.26
0,p.6698−6709,1985の文献に開示されたHpr配列は以下
の表Ｉに示してあり、ハプトグロビン１および２の配列
はナショナル・バイオメディカル・リサーチ・ファウン
デーションのデータベース、並びにKurosky,Proceeding
s of a National Academy of Sciences USA,vol.77,p.3
388−3392,1980;Black et al.,Nature,vol.218,p.736−
741,1968;Black er al.,Canadian Journal of Biochemi
stry,vol.48,p.123−132,1970;およびBlack et al.,Can
adian Journal of Biochemistry,vol.48,p.133−146,19
70から得られる。
ポリペプチドは、それらがHprに存在してHp1やHp2に
存在しないエピトープと免疫反応性の抗体を生産すべく
哺乳動物を刺激することができるかどうか調べるために
試験される。抗体生産を刺激するように哺乳動物を免疫
する方法は当分野でよく知られている。また、既知抗原
に対する抗体の免疫反応性を試験する方法も周知であ
る。
本発明の実質的に純粋なポリペプチド調製物はHpr蛋
白質に特異的な抗体をアフィニティー精製するために使
用される。さらに、本発明のポリペプチド調製物はこの
調製物で哺乳動物を免疫して哺乳動物による抗体生産を
刺激するために使用される。通常、この種の免疫法はキ
ーホール・リンペット・ヘモシアニンのような大きい免
疫原物質へのポリペプチドの結合を使用するだろう。ア
フィニティー精製の場合には、ポリペプチドをアガロー
スビーズのような不活性マトリックスに結合させる。こ
のような結合技術は当分野でよく知られている。ポリペ
プチド調製物はさらに抗体調製物中のHpr特異的抗体を
定量するために使用される。このような場合、合成ペプ
チドは通常ウシ血清アルブミンのような大きい不活性の
蛋白様物質に結合されるだろう。このような物質にポリ
ペプチドを結合させる技術も当分野でよく知られてい
る。
上で述べたように、Hpr蛋白質と免疫反応性であるが
ハプトグロビン１または２とは免疫反応性でないという
点でHpr蛋白質に対して特異的である抗体は本発明の合
成ポリペプチドを使ってつくることができる。抗体を生
産させるためのウサギ、マウス、ヤギなどの哺乳動物の
免疫法は当分野でよく知られている。この種のポリクロ
ーナル抗体調製物は、本発明の合成ポリペプチドを用い
るイムノアフィニティー技法により部分精製することが
できる。このような精製法は当分野でよく知られてい
る。また、Hprエピトープに特異的で、ハプトグロビン
１または２と交差反応しないモノクローナル抗体も誘導
することができる。一般に、ラットやマウスを本発明の
合成ポリペプチド（またはHpr蛋白質）で免疫し、その
後これらの動物を犠牲にして、ミエローマ細胞との融合
のために脾細胞を回収する。ハイブリッド細胞は当分野
で知られた技法、例えば２つの表現型（各母細胞から１
つ）の補足を含む選別法、に従って選別される。各ハイ
ブリッド細胞の抗体生産は個々にスクリーニングされ
る。Hprのエピトープに結合するがHp1やHp2のエピトー
プには結合しない抗体はHprまたはこれらのエピトープ
を発現する他の蛋白質と結合することができる。
Hpr遺伝子産物に存在するがHp1やHp2に存在しないエ
ピトープと免疫反応性である抗体をスクリーニングする
ために、一組の簡単な試験が行われる。実質的に純粋な
Hpr調製物か、またはウシ血清アルブミンのような大き
い成分に結合させた本発明のポリペプチド調製物を使っ
て、Hprとの免疫反応性について抗体を試験する。希望
する特異的抗体はこれらの試験のいずれか一方または両
方において陽性であるべきである。また、抗体はHp1お
よびHp2との免疫反応性についても試験される。Hprに対
する絶対特異性を有する希望の抗体は両方のこのような
試験において陰性であるべきである。さらに、Hp1およ
びHp2と比べてHprに対して相対特異性を有する抗体もこ
の一組の試験を使って検出することができる。すなわ
ち、Hp1やHp2とよりもHprと一層強く反応するいくつか
のモノクローナル抗体が存在しうる。Hprに対して相対
的特異性を有するこれらの抗体もまた有用である。これ
らを使う手段は以下で述べることにする。
Hprと反応性であるがHp1やHp2とは反応性でない単一
特異的ポリクローナル抗体を精製するためのイムノアフ
ィニティー技法が採用される。上でモノクローナル抗体
に関して記載した試験の場合と同じ結合特性が用いられ
る。すなわち、Hprと免疫反応性の抗体は陽性として選
別され、一方Hp1やHp2と免疫反応性のものは希望する抗
体調製物から除かれるだろう。
Hp1およびHp2と比べてHprに対して相対または優先特
異性を示す抗体は、免疫反応性の検定条件を変えること
により絶対特異性にすることができる。変更しうる検定
媒体の条件には、制限するものではないが、イオン強
度；界面活性剤の濃度；尿素、グアニジン、カリウムチ
オシアネートのようなカオトロピック剤の濃度；および
pHが含まれる。これらの条件の変更は抗体−抗原結合に
寄与するいろいろな結合力の不安定化へ導く。それぞれ
の条件を変える試薬の滴定は、相対的または優先的に特
異性の抗体がHprと免疫反応するがHp1やHp2とは反応し
ない一組の条件の決定を可能にする。不安定化試薬の濃
度を変えるための適当な範囲は簡単に決定することがで
きる。例えば、イオン強度を変えるために、塩化カリウ
ムは約0.05Mから2Mまで滴定される。イオンまたは非イ
オン界面活性剤は約0.05％から２％まで滴定される。カ
オトロピック剤は約0.5Mから8Mまで滴定される。pH範囲
は約２から10まで滴定される。このような条件はHprと
免疫反応性のモノクローナル抗体をスクリーニングする
ためと、いろいろな生物学的供給源中のHprを検定する
ための両方において有用である。種々の不安定化試薬の
上記滴定方法はまた、反応の特異性を高めるために他の
抗体−抗原対と共に使用することができる。
本発明者らは４種類の異なるヒト細胞型の中にHprを
見いだした。このうち３種類の細胞型は、生化学的研究
並びに生理学的条件下でのHprの生物学的作用を調べる
研究のためのHpr量の生産に実際に使用することができ
る。１つの特に有用な供給源はヒト乳癌細胞系列であ
り、これはメリーランド州ロックビルのアメリカン・タ
イプ・カルチャー・コレクションから入手できる。１つ
のこのような細胞系列はMDA−MB−231と呼ばれ、エスト
ロゲンレセプターネガティブ細胞系列である。Hprエピ
トープはこの種の乳癌細胞系列の約50％の細胞質に検出
された。これらの細胞系列は、例えば上記の34アミノ酸
ポリペプチドと免疫反応性の抗体の使用により、容易に
同定することができる。
Hpr調製物をつくる１つの手段は、Hpr蛋白質を生産す
るヒト乳癌細胞当分野でよく知られた培養条件下で培養
することである。その後細胞を回収し、細胞膜を破壊し
て細胞リゼイトを得る。核および膜画分を除くと、Hpr
を含む細胞質画分が得られる。分画遠心のような、細胞
画分の分離手段は当分野で周知である。
Hpr蛋白質の他の供給源はヒト脱落膜組織と胎盤であ
ることが見いだされた。このような組織は異なる源から
集めることができ、当分野の公知技法に従ってホモジナ
イズされる。その後、ホモジナイズした細胞の細胞膜を
溶解すると、Hpr蛋白質を含む細胞質画分が得られる。
また、妊娠女性からの血清も回収可能な量のHprを含む
ことが分かった。同様に、乳癌の組織学的切片もHpr蛋
白質を含むが、これはHprの精製を可能にする量および
方法で得るためには困難な組織源である。
いったんHprを含む細胞質画分が得られると、Hprの精
製は蛋白質精製分野でよく知られた技法を使って達成さ
れる。例えば、いろいろなタイプのクロマトグラフィー
が使用できる。特に有用なカラムにはシバクロンF3GAセ
ファロースカラム、DEAEセルロースカラム、アニオン交
換カラム、およびゲル透過カラムが含まれる。
Hprはまたイムノアフィニティー技法を使って精製さ
れる。ここでHprエプトープに特異的な抗体が提供され
るので、Hpr蛋白質は多数の蛋白質の混合物からポジテ
ィブに選別できる。この蛋白質を精製するために本発明
の抗体を使用すると、Hprに最も類似した蛋白質、すな
わちハプトグロビン１および２、からの良好な分離が可
能となる。もちろん、他の精製法も当分野で知られてお
り、Hprを精製するために使用される。
本発明に従って得られたHpr調製物は実質的に純粋で
あり、たぶん均質である。この結論はポリアクリルアミ
ドゲルで電気泳動により分離された蛋白質の視覚化に基
づいており、この場合Hp2は検出されない。一般に、実
質的に純粋な調製物はHp1とHp2を含まず、存在するハプ
トグロビン型蛋白質の75％より多くがHpr蛋白質である
だろう。より好ましくは、この調製物はハプトグロビン
型蛋白質の90％より多くをHprとして含むだろう。
本発明の抗体は乳癌組織ばかりでなく、例えば肺癌組
織、尿生殖器腫瘍組織および胃腸腫瘍組織のような他の
固形腫瘍にあるHprエピトープを検出するために使用さ
れる。乳癌組織にHprエピトープが存在することは悪化
する予後と関係のあることが分かった；それは、乳癌組
織がHprネガティブであるものと比べて、その癌が恐ら
く初期に再発して転移することを示す。Hprエピトープ
が存在する乳癌組織は次の３つの点に特徴がある：免疫
反応性が浸潤する乳癌に存在する；顆粒細胞質免疫反応
性が核染色なしで観察される；およびその染色が不均質
である、すなわち細胞ごとにまたは領域ごとに変わりや
すい。
組織切片への抗体結合は当分野で知られた検出手段、
例えば放射性標識または染色、により検出することがで
きる。特に有用な染色はペルオキシダーゼ、過酸化水
素、およびアミノエチルカルバゾールのような発色原物
質を使用する。ペルオキシダーゼ（多数の供給源から入
手できる公知の酵素）は抗Hpr抗体に結合させるか、ま
たは１以上の抗体を介してそれと複合体を形成させる。
例えば、ヤギ抗ペルオキシダーゼ抗体とヤギ抗Hpr抗体
は抗ヤギIgGを介して複合体を形成させることができ
る。このような技術は当分野でよく知られている。その
他の発色原物質および酵素も使用される。抗体の放射性
標識付けも切片への抗体結合を検出するために使用され
る。標識抗体は抗Hprまたは抗Hpr抗体と免疫反応性の第
二抗体でありうる。この場合も、この種の技術は広く知
られている。乳癌患者のHprを検出する技術そのものは
本発明にとって限定的ではない。免疫組織化学は本発明
の好適な方法であるが、それを使わない生化学的または
免疫学的技法も現在使用することができる。
Hprは当分野で知られた蛋白質検出手段のいずれかを
使って血清、血漿、浸出液、腹水、尿、脳脊髄液、およ
び卵巣由来の体液のような生物学的液体において定量化
される。好適な方法は免疫学的検出手段を利用する。こ
れらにはラジオイムノアッセイ、酵素免疫吸着検定法、
補体結合法、比濁分析検定法、免疫拡散法または免疫電
気泳動検定法が含まれる。血漿は当分野で知られている
ように使用前に抗凝血されるべきである。細胞成分と脂
質は、例えば遠心により、この液体から取り除くべきで
ある。尿のような希薄液体の場合は、例えば限外濾過や
塩析により、蛋白質を濃縮すべきである。
液体サンプル中のHprを検出および／または定量する
ための特に好適な方法は競合検定を利用する。Hprに存
在するがHp1とHp2には存在しないエピトープと免疫反応
性の抗体は、当分野で知られた技法を使って、ポリスチ
レン製マイクロタイター皿やニトロセルロースペーパー
のような担体に結合させる。その後、担体は分析すべき
液体の存在下に抗体−抗原複合体が安定して形成される
条件下でインキュベートする。液体中の過剰の未結合成
分を取り除き、抗体−抗原複合体が担体上に保持される
ようにその担体を洗浄する。次に、Hprに存在するがHp1
やHp2には存在しないエピトープを含むポリペプチドの
一定量をこの担体と共にインキュベートする。ポリペプ
チドは担体に結合させたHprと免疫反応性の抗体に結合
する。このポリペプチドは、当分野でよく知られた手段
により、ビオチン、ペルオキシダーゼまたは放射性標識
のような検出可能な成分に結合させておく。過剰の未結
合ポリペプチドを除き、担体を上記のように洗浄する。
担体に結合された検出可能な成分を定量する。Hprとポ
リペプチドは同じ抗体結合部位について競合するので、
液体中のHprは担体へのポリペプチド結合の減少により
定量することができる。この検定に使用した抗体はHpr
と免疫反応性であるが、Hp1やHp2とは免疫反応性でな
い。これとは別に、相対的に特異性の抗体をHp1およびH
p2との免疫反応性を不安定にする条件下で使用してもよ
い。また、Hprのエピトープと免疫反応性であるがHp1や
Hp2のエピトープとは免疫反応性でない抗体種を含むポ
リクローナル抗体も使用できる。
この検定法は特にHpr系について記載してあるが、生
物学的液体中の他の蛋白質被分析体を定量するためにも
使用される。すなわち、蛋白質被分析体とエピトープを
共有する標識ポリペプチドを使って、この被分析体を定
量することが可能である。特異性はこのポリペプチドに
よって検定に付与されるので、単一特異性抗体を必要と
しない。
患者由来の血液または生物学的液体中のHprの高レベ
ルは、乳癌ばかりでなく他の固形腫瘍の増殖や恐らく転
移と関連がある。他の腫瘍には肺癌、尿生殖器腫瘍およ
び胃腸腫瘍が含まれる。Hprの高レベルの決定は検出し
うる固形腫瘍をもたない患者と比べて行われる。これは
同一患者であっても、異なる患者であってもよい。例え
ば、最初のサンプルを固形腫瘍の外科的切除直後に採取
する。その後、腫瘍の再発および／または腫瘍細胞の増
殖をモニターするために後続のサンプルを採取する。さ
らに、生物学的液体中のHprの検定は、悪性腫瘍の診断
を有する患者において腫瘍性と非腫瘍性の液体蓄積を区
別するために使用される。
以下の実施例は本発明を制限するものではなく、使用
できる特定の実施態様を提供するにすぎない。
実施例１ 本実施例は、ヒト妊娠血漿からのHpr蛋白質の単離・
精製および２つのサブユニットの分離を示す。
第三トリメスター妊娠からの母親の血漿は処分された
EDTA抗凝固全血サンプルから得られた。この血漿は使用
するまで−70℃で貯蔵した。
妊娠関連血漿プロテインＡ（PAPP−Ａ）（Dako Labor
atories,Santa Barbara,Ca.）に対するウサギ抗血清の
全IgG画分と反応性の蛋白質は、連続クロマトグラフィ
ー工程により精製した。この精製は280nmでのクロマト
グラフィー流出液の光学密度、クーマシー染色されたLa
emmliゲルを用いる画分の分析、およびウェスタンブロ
ッティングにより監視した。最初に、80mlの血漿を、50
mMリン酸ナトリウム（pH6.8）で平衡化したシバクロン
ブルーF3G−Ａセファロース（Pharmacia）カラムに４℃
で装填した。すべての検出可能な免疫反応性物質を含む
通り抜け画分は1mMのNaN3を含む20mMリン酸ナトリウム
（pH6.8）に対して４℃で透析し、同一緩衝液で平衡化
したDEP52 DEAE−セルロース（Pierce Chemical Co.）
の2.5x10cmカラムに加えた。免疫反応性物質は出発緩衝
液中の0.2M NaClで溶出した。溶出物は0.15M NaCl、1
mMベーターメルカプトエタノール、および1mM NaN3を
含む20mMトリス−HCl（pH8.5）に対して４℃で透析し、
その後同一緩衝液で平衡化したファーストフローＱ−セ
ファロース（Pharmacia,Piscataway,N.J.）の2.5x60cm
カラムに装填した。このカラムは150mM−500mM NaClの
500ml直線勾配を使って100ml/hrの流速で４℃にて溶出
した。免疫反応性の蛋白種は0.25−0.8M NaClの範囲で
溶出された。免疫反応性蛋白質を含む画分はプールし、
1mMベーターメルカプトエタノールおよび1mM NaN3を含
む200mMトリス−アセテート（pH7.5）に対して４℃で透
析し、その後5x90cmセファロースCL−4B（Pharmacia）
カラムに加えた。
図１には、ポリ特異性抗PAPP−Ａ（Dako）により認識
された主な免疫反応性バンドの精製を要約してある。こ
の図面はクーマシー染色した10−15％Laemmliゲル（Nat
ure,vol.227,p.680−685,1970）および対応するウェス
タンブロットを示す。ウェスタンブロッティングは本質
的に公表された方法に従って行った。NaDodSO4ポリアク
リルアミドゲル電気泳動後、蛋白質は0.45μニトロセル
ロースシート（Schleicher ＆ Schuell）に96mMグリシ
ン、12.5mMトリス、0.1％ NaDodSO4、および20％メタ
ノール中で40V、250−300mA、４℃で６時間移行させ
た。ポンソーＳ染色で移行効率を評価した後、このメン
ブランは３％ウシ血清アルブミンでブロックし、その後
抗PAPP−Ａ抗体と２時間、次に125Iで標識したプロテイ
ンＡと１時間インキュベートした（Gershoni,et.al.,An
alyt.Biochem.,vol.131,p.1−15,1983）。各工程後の洗
浄は1mM NaN3を含むトリス−塩水中で行った。
連続クロマトグラフィー工程はシバクロンブルーF3GA
セファロースによるアルブミンと他の蛋白種の除去（レ
ーンａ）、DEAEセルロースカラムからの溶出（レーン
ｂ）、ファーストフローＱセファロースアニオン交換カ
ラムからの勾配溶出（レーンｃ）、およびセファロース
CL−4Bによるゲル透過クロマトグラフィー（レーンｄ）
を含んでいた。面白いことには、ゲル濾過は免疫反応性
蛋白質を弱反応性20kDa種と同時溶出する40kDa種、弱免
疫反応性16.5kDa種と同時溶出する40kDaバンド、および
最後に、重複するが別のピークとして、強免疫反応性1
6.5kDaバンドと同時溶出する40kDa種から成る３つの連
続して溶出する蛋白種に不完全に分割した。
変性条件下で個々の免疫反応性鎖を分離するために、
免疫反応性蛋白質を含む画分はプールし、20mMトリス−
HCl、6M尿素、10mMベーターメルカプトエタノール（25
℃でpH8.5）に対して透析した（透析は４℃で行った
が、pHは指定温度で8.5となるように調節した）。最終
精製工程は5x50mm Mono Q HR5/5（Pharmacia）カラムを
備えたWatersシステムによるHPLCを利用した。サンプル
はトリス−尿素−メルカプトエタノール出発緩衝液で注
入し、10mlの2ml/分でのイソクラチック溶出後、0.5M
NaClを含む出発緩衝液の最終条件に15分にわたる30mlの
直線勾配を適用した。
HPLCを使用するMono Q HR5/5での勾配アニオン交換ク
ロマトグラフィーによる免疫反応性重鎖および軽鎖の分
離を示すクーマシーブルー染色した10％Laemmliゲルを
図２に示してある。レーンａは100μｇの精製した免疫
反応性蛋白質である。レーンｂはボイドボリュームを通
り抜けたアルファ鎖を含み、一方レーンｃは0.85M NaC
lで溶出した免疫反応性40kDa鎖を含む。40kDa種を含む
画分はプールし、0.2M NH3HCO3緩衝液に対して透析し
た後に凍結乾燥した。
実施例２ 本実施例は、Hprの重鎖（ベータ鎖）の20アミノ酸領
域がハプトグロビン１および２のベータ鎖に100％相同
であることを示す。
実施例１に従って調製した40kDa種の凍結乾燥サンプ
ルは0.2M NH4HCO3に対して３回透析し、凍結乾燥し、
その後HPLC級の水から３回凍結乾燥した。気相シークエ
ンシング（アミノ酸配列分析）を実施した。完全な蛋白
鎖のサンプルは一般にLowry検定で測定して100μｇの蛋
白質から成っていた（J.Biol.Chem.,vol.193,p.265−27
5,1951）。ペプチドのサンプルは一般にシークエンサー
で定量して0.5−２ナノモルから成っていた。蛋白質は
オンラインフェニルチオヒダントイン（PTH）分析を備
えたアプライド・バイオシステムズ470型シークエンネ
ーターで通常のプログラムO3RPTHを使ってアミノ酸配列
を決定した。PTH誘導体はアプライド・バイオシステム2
00x21mmC−18カラムでの逆相HPLCにより分離した。
Ｎ末端のアミン酸配列分析は図３に示した20残基をも
たらした。ナショナル・バイオメディカル・リサーチ・
ファウンデーションの蛋白質配列データベースおよびDF
ASTP整合プログラムを使うことにより、３種類の蛋白質
の配列は20アミノ酸領域にわたって100％相同を示し
た：ヒトハプトグロビン１のベータ鎖；ヒトハプトグロ
ビン２のベータ鎖；およびハプトグロビン関連蛋白質前
駆体の推定ベータ鎖。
実施例３ 本実施例は、実施例１に従って妊娠血清から単離した
ハプトグロビンがその16.5kDa鎖においてHp1およびHp2
と相違することを示す。
アミノ酸配列分析は妊娠血漿蛋白質をハプトグロビン
（Hp）遺伝子ファミリーに明確に位置づけたが、全蛋白
種のベータ鎖のＮ末端配列が同一であるので、これ以上
明確な指定はなされないであろう。図４は、精製Hp1お
よび２標品、妊娠血清から精製したハプトグロビン、ウ
サギ抗ハプトグロビンおよび抗PAPP−Ａを用いて行った
免疫学的分析の結果を示す。パネルＡはHp1、Hp2、およ
び妊娠血清から精製したハプトグロビンの10−15％クー
マシー染色Laemmliゲルを示す（それぞれレーンａ−
ｃ）。パネルＢは抗ハプトグロビン、1:50、との対応す
るイムノブロットであり；パネルＣは抗PAPP−Ａ、1:5
0、とのイムノブロットである。
抗ハプトグロビンはすべての40kDaベータ鎖およびHp1
とHp2のアルファ鎖と強く反応する；精製蛋白質を含む
レーンｃからの16.5kDaバンドはほんの弱く反応する。
対照的に、抗PAPP−Ａは40kDaベータ鎖を強く標識する
が、Hp2アルファ鎖とは弱く反応し、そしてHp1アルファ
鎖とはほんのわずかに反応するだけである。レーンｃの
精製蛋白質からの16.5kDaバンドはそのクーマシー染色
と比較して不釣合いに強烈であり、特にレーンａに示し
たHp1アルファ鎖の不釣合いに弱い相対免疫反応性と比
べたとき強烈である。従って、妊娠血清から単離したア
ルファ鎖は、Hp1およびHp2アルファ鎖に存在しない抗PA
PP−Ａにより認識されるエピトープを含み、免疫学的に
別個のものである。
実施例４ 本実施例は、Hprのアルファ鎖とHp1およびHp2のアル
ファ鎖の間には配列の相違が存在することを示す。さら
に、この相違は妊娠血清からのハプトグロビンをhpr遺
伝子産物であると指定することと一致する。
ペプチドマッピングはElderの技法を用いて行った（S
peicher,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,voi.77,p.567
3−5677,1980;Elder,et al.,J.Biol.Chem.,vol.252,p65
10−6515,1977）。簡単に述べると、目的の蛋白質を含
む切片をクーマシー染色ゲルから切り出し、徹底的に放
射性ヨウ素化し、そしてトリプシンで消化した。得られ
た制限ペプチドはその後セルロースシートの一方向に沿
って高電圧電気泳動にかけ、続いて垂直方向に分配薄層
クロマトグラフィーを上昇させた。
この技法によるペプチドマッピングはチロシン含有ペ
プチドのみを検出する。発表されたアミノ酸配列を使用
すると、Hp1およびHp2鎖のトリプシンペプチドのファミ
リーは、Hp2がHp1の部分重複により生じたものであか
ら、それぞれ類似しているだろう（図5aおよび5c）。Hp
r、Hp1およびHp2間のアミノ酸配列の主な相違はアルフ
ァ鎖にある。アルファ鎖の中で、これらの相違は特にＮ
末端に集まっている。ペプチドマッピングに関連して、
推定されたHprアルファ鎖配列を使用すると、Hp1から得
られたものと同じトリプシンペプチドと追加のチロシン
含有ペプチドが予測されるだろう。図5bは精製蛋白質ア
ルファ鎖のペプチドマップを示し、矢印は実験的に得ら
れた追加のペプチドを強調するものである。従って、こ
れらの結果は、妊娠血漿から精製された特異なハプトグ
ロビンがHpr遺伝子産物であることを示唆している。図5
dはマッピング前にHp1と精製蛋白質アルファ鎖を混合し
た混合実験である。この場合も、追加のペプチドは存在
するが、その相対強度は小さい。一方共有ペプチドはす
べて共泳動する。
実施例５ 本実施例は、妊娠血清からのハプトグロビンのアルフ
ァ鎖が推定Hpr配列に従って製造した合成ペプチドとエ
ピトープを共有することを示す。
推定Hpr遺伝子産物の34個のＮ末端残基（Maeda et a
l.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.83,p.7395−7399,198
6）に対応する合成ペプチドは、アプライド・バイオシ
ステムズ43A型ペプチド合成機を使って、Merrifieldの
固相法（J.Am.Chem.Soc.,vol.85,p.2149−2154,1968）
により合成した。ヒスチジンカップリングは効率の悪い
ことがあるので、28位のヒスチジンの代わりにリシンが
保存的に使用された。
ハプトグロビン１および34−mer合成ペプチドを結合
させたビーズを使って、２つの別個のカラムを製造し
た。ハプトグロビン１（Hp1）とHpr合成ペプチドは、安
定したＮ−アルキルカルバメート結合をもたらす1,1−
カルボニルジイミダゾールで誘導体化したアガロースビ
ーズ（Reacti−Gel 6X,Pierce）を使って固定化した。5
mlのゲルは0.1Mホウ酸塩および0.15M NaCl（pH8.5）を
使って室温で洗浄し、アセトンを除いた。ホウ酸塩緩衝
液で1mg/mlに希釈した4mgのHp1（Sigma）、およびホウ
酸塩緩衝液で12.5mg/mlに希釈した50mgのHpr合成ペプチ
ドはそれぞれ5mlのゲルに加え、撹拌しながら４℃で30
時間インキュベートした。インキュベーション後、上清
をデカントし、等量の0.2Mトリスを加えて残存する反応
を停止させた。その後ゲルはトリス−塩水緩衝液で十分
に洗浄した。Hprペプチドカラムはトリス−塩水緩衝液
中の0.1％NaDOdSO4100mlで変性した。
Hprペプチドと反応性の抗Hpr抗体は、連続アフィニテ
ィークロマトグラフィー工程によって粗製抗PAPP−Ａ血
清から単離した。最初に、10mlトリス−塩水緩衝液中の
粗製抗PAPP−Ａ抗体100μｌはHp1ゲルと撹拌しながら４
℃で一晩インキュベートした。次に、このゲルをトリス
−塩水で十分に洗い、通り抜け画分は5mlヒドロキシア
パタイトカラムを通して集めた。Hp1カラムと反応性の
抗体は20mlの酢酸塩緩衝液（0.05M酢酸ナトリウム、0.1
5M NaCl、pH3.5、室温）で溶出した。このカラムを通
り抜けた抗体は20mlの0.4Mリン酸ナトリウムを用いてヒ
ドロキシアパタイトカラムから溶出した。両方の抗体を
21のトリス−塩水緩衝液に対して透析した。
その後、Hp1カラムと非反応性の抗体は変性Hprペプチ
ドゲルと撹拌しながら４℃で一晩インキュベートした。
Hprペプチドと反応性の抗体は20mlの酢酸塩緩衝液で溶
出し、トリス−塩水に対して透析した。これらの抗体画
分のそれぞれは、ハプトグロビン１とハプトグロビン関
連蛋白質（実施例１による）のサブユニットを電気泳動
により分離させた10−15％勾配Laemmliゲルのイムノブ
ロットを標識するために使用した。
図６のパネルＡは、左のレーンに25μgHp1の、右のレ
ーンに100μｇハプトグロビン関連蛋白質のクーマシー
染色10−15％勾配Laemmliゲルを示す。パネルＢ−Ｅは
同一蛋白質負荷のイムノブロットである。パネルＢは非
吸着抗PAPP−Ａ抗体、1:50、とインキュベートした。パ
ネルＣは固定化Hp1に結合させた抗PAPP−Ａ抗体のサブ
セットとインキュベートした；パネルＤは通り抜けた未
反応抗体とインキュベートした。パネルＣのHp1ゲルに
結合した40kDaベータ鎖に対する抗体の濃縮に注目され
たい；一方、特異な免疫反応性アルファ鎖に対する抗体
は固定化Hp1と反応せず、通り抜けた（パネルＤ）。パ
ネルＥは固定化変性合成Hprペプチドと反応したパネル
Ｄの抗体のサブセットとインキュベートした。合成Hpr
ペプチドに結合したこれらの抗体は妊娠関連ハプトグロ
ビンの16.5kDaアルファ鎖とのみ反応することに注目さ
れたい。これはこのハプトグロビンの特異なアルファ鎖
がHprエピトープを含むことを立証するものである。
実施例６ 本実施例は、Hprエピトープがヒト乳癌の細胞質にお
いて同定されることを示す。
パラフィンに埋め込んだヒト乳癌標本はJohns Hopkin
s病院の病理学部のファイルから得られた。緩衝化10％
ホルマリン固定した、パラフィンに埋め込んだ６μ組織
切片はキシレン中でパラフィンを除き、アルコール−水
浴中で再水和し、トリス−塩水（pH7.6）中でインキュ
ベートし、その後３％H2O2で内因性ペルオキシダーゼ活
性を15分間ブロックした。トリス−塩水で洗浄後、切片
は1/100に希釈した正常ブタ血清（Dako）で30分間ブロ
ックし、続いて特異的抗体または非免疫血清と４℃で一
晩インキュベートした。トリス−塩水で洗浄後、0.5Mト
リス緩衝液中1/100のブタ抗ウサギ免疫グロブリンIgG画
分（Dako）を30分間加え、その後ペルオキシダーゼ−ウ
サギ抗ペルオキシダーゼ複合体（Dako）を加えた。最終
洗浄の後、切片はジアミノベンジジン（Sigma）基質と
６分間インキュベートし、Mayerのヘマトキシリンで対
比染色し、カバーグラスでおおって試験した。
抗体は実施例５に記載した34−mer合成ペプチドでウ
サギを免疫することによりHprに対して誘導した。免疫
するために、このペプチドはキーホール・リンペット・
ヘモシアニン（KLH）（Boehringer Mannheim）と本質的
に文献に記載された通りに結合させた（Lerner,et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA,vol.78,p.3403−3407,198
1）。ジメチルホルムアミド中のマレミドベンゾイン−
ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（MBS）（Pierce Chemic
al Co.）の8.75mM溶液８μｌはリン酸緩衝溶液中の14.8
mgのKLHに加え、室温で30分間インキュベートした。KLH
−MBS複合体はPharmacia PD−10カラムでのゲル濾過に
より未反応MBSから分離した。1.2mgのHprペプチドを直
接KLH−MBSに加え、この混合物を室温でさらに30分間イ
ンキュベートした。結合効率を概算するために、未分画
化3.0ml反応容量の3.5μｌサンプルは、Pharmacia Supe
rose12カラムでWaters HPLCを使ってPBSにより1ml/分で
クロマトグラフィーにかけ、流出物を214nmで監視し
た。未反応ペプチドはピーク積分法およびペプチド流れ
単独の標準への比較により定量した。この方法は4.6ペ
プチド/KLH分子のおおよその置換比をもたらした。
２匹のパスツレラ菌（Pasteurella）非感染ニュージ
ーランド白ウサギ（Dutchland）にそれぞれ等量のリン
酸緩衝液（PBS）と完全フロインドアジュバントから成
るエマルジョン1ml中の抗原200μｇを０日目に接種し
た；接種は３−４カ所の皮下と筋肉内に分けて行った。
14日目に、この動物は不完全フロインドアジュバント中
の等量の抗原で追加免疫した。32日目にウサギから試験
採血した；陽性ウサギからの血清を次の数カ月間にわた
って集めた。
ウシ血清アルブミンは上記のように合成Hprペプチド
で誘導体化した。酵素免疫吸着検定法はウェルあたり２
μｇのBSA−ペプチドを使い、これをウサギ血清の希釈
物に対して試験し、そしてプロテインＡ−西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ複合体とｏ−フェニレンジアミン基質で
発色させることにより、記載通りに（Voller et al.,J.
Clin.Pathol.,vol.31,p.507−520,1978）行った。
抗体を精製するために、10cmx5mm Selectispher−10
活性化トレシルカラムHPLCアフィニティーカラム（Pier
ce Chemical Co.）はHpr合成ペプチドで誘導体化した。
カラムは30mlのPBSを使って2ml/分の流速で洗浄し、そ
の後4.5mlのPBSに溶解したペプチド27mgの1ml/分の流速
でカラムに通した。未反応トレシル基はカラムに30mlの
0.2Mトリス−HCl（pH8.0）を通してキャップした。抗体
精製のために、このカラムは300mM NaCl、20mMリン酸
ナトリウム（pH7.5）を使って室温で平衡化した。10−2
0mlの血清を0.5ml/分の流速でカラムに装填した。装填
後、カラムは280nmでの流出物の光学密度がゼロに戻る
まで緩衝液で洗った。その後、同一緩衝液中の6M尿素を
使って抗体を溶出し、抗体含有画分は直ちに1mM NaN3
を含むトリス−緩衝塩水に対して透析した。
図７は、抗Hpr抗体（パネル7a）と抗CEA抗体（パネル
7c）の両方による原発性乳癌のイムノペルオキシダーゼ
染色を示す；抗Hpr染色の強い細胞質陽性に注目された
い。抗Hpr抗体を天然Hprと４℃で２時間インキュベート
すると、陽性の細胞質染色が阻止された（パネル7b）。
免疫吸着の特異性を立証するために、抗癌胎児性抗原
（CEA）抗体を類似の条件下で天然Hprとインキュベート
した。細胞質CEA陽性はこのようなHprとのプレインキュ
ベーションにより阻止されなかった（パネル7d）。Hp1
とHp2の染色阻止の失敗と合わせて、これはHpr遺伝子産
物の推定アルファ鎖のＮ末端から誘導されたエピトープ
がヒト乳癌を検出しうることを立証している。従って、
Hpr、Hprの修飾型、または高度に交差反応性の蛋白質が
ヒト乳癌細胞に存在するにちがいない。
実施例７ 本実施例は、ヒト乳癌によるHprの発現と患者が病気
にかかっていない時間間隔との間に相関関係があること
を示す。
61例のヒト乳癌は癌関連ハプトグロビンの発現および
抗PAPP−Ａ抗血清との免疫反応性の同時評価のために入
手することができた。癌関連ハプトグロビン（Hpr）の
発現は、合成ペプチド（その配列は癌関連ハプトグロビ
ン配列から誘導された）に対するアフィニティー精製ポ
リクローナル抗体を使って、パラフィン包理材料を免疫
組織化学的に染色することにより評価した。同様に、PA
PP−Ａ陽性は抗PAPP−Ａ抗血清を用いて評価した。61人
の患者のうち、40人はＩ期の病気（5cm未満の腫瘍、リ
ンパ節陰性）に、そして21人はII期の病気（5cm未満の
腫瘍、わきのしたのリンパ節陽性）にかかっていた。デ
ータはBMDP統計プログラムを使って生命表フォーマット
で分析した。曲線間の有意差を判定するために、２つの
統計テスト、一般化ウィルコクソン（Generalized Wilc
oxon;Breslow）と一般化サベージ（Generalized Savag
e;Mantel−Cox）が使用された。
結果は図８に示してある。縦座標は病気にかかってい
ない患者の百分率を示し、一方横座標は診断時からの時
間的間隔を示す。曲線間の差は、0.0005未満のｐ（ウィ
ルコクソン）および0.0003未満のｐ（サベージ）であっ
て、高度に有意である。
実施例８ 本実施例は、培養乳癌細胞がHprを発現することを示
す。
新鮮なヒト乳癌をHpr蛋白質の供給源として使用する
ことができるが、その量は一般に少なく、入手可能性は
不規則である。これらの理由のために、一連のヒト乳癌
細胞系列をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン（メリーランド州ロックビル）から入手して、免疫
組織化学的手法によりHpr発現についてスクリーニング
した。図９は１つのこのような系列、MDA−MB−231、エ
ストロゲンレセプターネガティブ細胞系列（Anderson.
J.Submicroscop.Cytol.,vol.16,p.673−690,1984）での
この方法の結果を示す。
簡単に述べると、細胞は10％ウシ胎児血清と抗生物質
を補給したＬ−15培地を使ってチャンバースライド上で
増殖させ、パラホルアルデヒド中で固定し、トリトンＸ
−100を浸透させ、抗Hpr40μg/mlまたは対照と４℃で一
晩インキュベートし、順次ビオチニル化第二抗体、アビ
ジン−ペルオキシダーゼ、およびアミノエチル−カルバ
ゾール−ペルオキシド基質溶液を用いて発色させた。
左側のパネルは特異的抗体による顆粒細胞質染色を示
し、右側のパネルは第一抗体を含まない対照を示す；無
関係のアフィニティー精製抗体は、この方法で無関係の
陽性第一抗体対照として使用したとき、適当に分布して
染色する。従って、これらの培養細胞がHprを生産でき
るということは容易に見てとれる。
実施例９ 本実施例は、脱落膜組織が生理学的条件下でHprを合
成することを示す。
Hprは妊娠血清から精製されるので、妊娠特異的組織
が発現のために免疫組織化学的にスクリーニングされ
た。新鮮な脱落膜は選択流産後に処分されるはずの組織
から入手し、ホルマリン固定した。緩衝化10％ホルマリ
ン固定され、パラフィンに埋め込まれた６μ組織切片は
キシレン中でパラフィンを除き、アルコール−水浴中で
再水和し、その後トリス−塩水（pH7.6）中でインキュ
ベートし、３％H2O2を用いて内因性ペルオキシダーゼ活
性を15分間ブロックした。トリス−塩水で洗浄後、切片
は1/100に希釈した正常ブタ血清（Dako）で30分間ブロ
ックし、実施例６に記載したように製造した特異的抗体
と、あるいは対照として、非免疫血清と４℃で一晩イン
キュベートし、順次ビオチニル化第二抗体、アビジン−
ペルオキシダーゼ、およびアミノエチル−カルバゾール
ペルオキシド基質溶液を用いて発色させた。スライドグ
ラスはジアミノベンジジン（Sigma）基質と10分間イン
キュベートし、Mayerのヘマトキシリン中で対比染色し
て試験した。
脱落膜染色の結果は図10に示してある。左側のパネル
は抗Hpr抗体による顕著な細胞質染色を示し、右側のパ
ネルは第一抗体が除かれた対照を示す。他の胎盤組織は
陰性であった（データは示してない）。この実験は脱落
膜が生理学的条件下でHprを合成することを示唆してい
る。
実施例11 本実施例は、脱落膜により発現されたHprが妊娠血清
から単離されたHprよりも大きいポリペプチドとして合
成されることを示す。
図11は抗Hprが脱落膜リゼイト中の意外に重いアルフ
ァ差を認識することを示す。簡単に述べると、1gの凍結
脱落膜はBrinkmannポリトロンを使って10mlの溶解緩衝
液（10mMトリスHCl、４℃でpH7.5、1mM EDTA、１％ト
リトンＸ−100、0.5mMジイソプロピルフルオロホスフェ
ート）中でホモジナイズした。不溶性物質は1200xg、４
℃で５分間遠心して除き、得られた上清をLaemmli可溶
化緩衝液と混合した。50μｌのアリコートは10−15％ポ
リアクリルアミドゲルで電気泳動にかけ、半乾燥ブロッ
ティング装置（ポリブロット、American Bionetics）を
使ってニトロセルロースに移行させた。ブロットはトリ
ス−塩水中の３％BSAを用いて室温で２時間ブロック
し、その後トリス−塩水中の40μg/mlの抗Hprと一晩イ
ンキュベートした。インキュベーション後、ブロットは
順次0.05％トリトンＸ−100を含むPBSで洗い、ビオチニ
ル化ヤギ抗ウサギIgGとインキュベートし、洗浄後アジ
ビン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体とインキュベ
ートし、そして洗浄後アミノエチルカルバゾール基質溶
液中でインキュベートした。
ブロットは脱落膜リゼイトが特異なアルファ鎖種を含
むことを示す。左側のレーンはハプトグロビン２で汚染
された部分精製Hpr調製物を示す；この実験で使用した
抗Hprはハプトグロビン２アルファ鎖（一番上のバン
ド）と交差反応するが、ハプトグロビン１アルファ鎖と
は反応しない。左側のレーンの下の方のバンドはHprア
ルファ鎖を表す。右側のレーンは脱落膜リゼイトが約30
kDaの範囲に主要な免疫反応性のバンドを含むことを示
す。
肝臓において、ハプトグロビンは加水分解切断されて
アルファ鎖とベータ鎖を形成する単一の隣接ポリペプチ
ド鎖として合成される。このブロットと多価抗ハプトグ
ロビン抗体との反応は単一の45kDa種を検出した。成熟
アルファ鎖やベータ鎖は検出されなかった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 33/574 Ｄ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 Ｊ．Ｂ．Ｃ．，Ｖｏｌ．260（11）ｐ 6707−6709（1985) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C07K 14/47,16/18 A61K 38/16,39/395,39/00 C01N 33/53 C12P 21/00,21/08 C12N 15/00 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (15)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】患者からのサンプルを用意し； 該サンプル中の、Leu Tyr Ser Gly Asn Asp Val Thr As
    p Ile Ser Asp Asp Arg Phe Pro Lys Pro Pro Glu Ile
    Ala Asn Gly Tyr Val Glu Lys Leu Phe Arg Tyr Gln Cy
    sのアミノ酸配列で示されるポリペプチドと特異的に結
    合するがハプトグロビン１またはハプトグロビン２とは
    特異的に結合しない抗体と免疫学的に交差反応性を有す
    るタンパク質を定量し；そして 該患者からの該サンプル中の該タンパク質の量を、固形
    癌が検出されない患者から得られたコントロールサンプ
    ル中に観察される上記タンパク質の量と比較し、コント
    ロールサンプル中に比べて該タンパク質の量が増大して
    いることを該患者の腫瘍細胞の増殖を示すものとする、 患者の腫瘍細胞の増殖を検出するためのin vitro方
    法。
  2. 【請求項２】固形癌を有する患者からサンプルを用意
    し； 該サンプル中の、請求項１のポリペプチドと特異的に結
    合するがハプトグロビン１またはハプトグロビン２には
    特異的に結合しない抗体により免疫学的に結合されるタ
    ンパク質を定量し；そして 該患者からの該サンプル中の該タンパク質の量を、固形
    癌が検出されない患者から得られたコントロールサンプ
    ル中に観察される上記タンパク質の量と比較し、コント
    ロールサンプル中に比べて該タンパク質の量が増大して
    いることを該患者の腫瘍細胞の増殖を示すものとする、 患者の腫瘍細胞の増殖の検出を助けるためのin vitro
    アッセイ方法。
  3. 【請求項３】患者からの生物学的液体サンプルを用意
    し； 該液本中の、請求項１のポリペプチドと特異的に結合す
    るがハプトグロビン１またはハプトグロビン２とは特異
    的に結合しない抗体により免疫学的に結合される、該患
    者から得られた液体サンプル中に存在するいずれかのタ
    ンパク質を定量し；そして 該患者からの液体サンプル中の該タンパク質の量を、固
    形癌が検出されない１人もしくはそれ以上の患者から集
    めたコントロール液体中に観察される上記タンパク質の
    量と比較し、コントロール液体中における上記タンパク
    質の量と比べて、該患者からの液体中の該タンパク質の
    量が増大していることを腫瘍細胞の増殖を示すものとす
    る、 検出可能な固形癌を有するか、有することが疑われる患
    者の腫瘍細胞の増殖の検出を助けるためのin vitroア
    ッセイ方法。
  4. 【請求項４】コントロール液体が、患者が検出可能な固
    形癌を有しない初期に集めた患者の液体である、請求項
    ３の方法。
  5. 【請求項５】生物学的液体が、血液、血漿または血清で
    ある、請求項３の方法。
  6. 【請求項６】固形癌からの組織学的セクションを用意
    し； 該組織学的セクションを、請求項１のポリペプチドと特
    異的に結合するがハプトグロビン１またはハプトグロビ
    ン２とは特異的に結合しない複数の抗体との特異的な免
    疫学的反応性を有するタンパク質に特異的に結合する抗
    体と接触せしめ；そして 該抗体が、細胞質内細胞領域中で組織学的セクションと
    特異的に結合するか調べ、該抗体が該組織学的セクショ
    ンに特異的に結合することを、該セクションを採取した
    固形癌の予後の悪性と関連させることよりなる、 固形癌の予後決定を助けるための、ヒト固形癌サンプル
    のin vitroスクリーニング方法。
  7. 【請求項７】固形癌が乳癌である、請求項１、２、３ま
    たは６のいずれか１項の方法。
  8. 【請求項８】Leu Tyr Ser Gly Asn Asp Val Thr Asp Il
    e Ser Asp Asp Arg Phe Pro Lys Pro Pro Glu Ile Ala
    Asn Gly Tyr Val Glu Lys Leu Phe Arg Tyr Gln Cysの
    アミノ酸配列で示されるポリペプチド。
  9. 【請求項９】少なくともLeu Tyr Ser Gly Asn Asp Val
    Thr Asp Ile Ser Asp Asp Arg Phe Pro Lys Pro Pro Gl
    u Ile Ala Asn Gly Tyr Val Glu Lys Leu Phe Arg Tyr
    Gln Cysのアミノ酸配列を含み、請求項８に記載のポリ
    ペプチドに特異的に結合する抗体を生じさせることがで
    きるポリペプチド。
  10. 【請求項１０】請求項８のポリペプチドと特異的に結合
    するがハプトグロビン１またはハプトグロビン２とは特
    異的に結合しない抗体により特異的に結合されるタンパ
    ク質上に存在するエピトープと特異的に結合するモノク
    ローナル抗体。
  11. 【請求項１１】請求項９のアミノ酸配列を含むHprタン
    パク質上に見られるエピトープには特異的に結合する
    が、ハプトグロビン１またはハプトグロビン２とは特異
    的に結合しない抗体。
  12. 【請求項１２】モノクローナル抗体である、請求項11の
    抗体。
  13. 【請求項１３】（ａ）ヒト乳癌細胞ラインを、請求項８
    のポリペプチドと特異的に結合する抗体と免疫学的に交
    差反応性であるHprタンパク質上に見られるエピトープ
    と特異的に結合するが、ハプトグロビン１またはハプト
    グロビン２上に見られるエピトープとは特異的に結合し
    ない抗体調製物と結合する能力に関して試験し； （ｂ）上記抗体調製物と結合する能力を有するヒト乳癌
    細胞ラインを培養し； （ｃ）上記細胞ラインの請求項８のポリペプチドと特異
    的に結合する抗体と免疫学的に交差反応性であるタンパ
    ク質を含む細胞質フラクションから該タンパク質を収穫
    する ことよりなる、請求項８のポリペプチドと特異的に結合
    する抗体と免疫学的に交差反応性であるタンパク質調製
    物の製造方法。
  14. 【請求項１４】一つまたはそれ以上の容器内に、 請求項11の抗体；および 該抗体を検出する試薬手段 を含んでなる、乳癌の予後決定の助けとなる、ヒトサン
    プルのスクリーニングのためのキット。
  15. 【請求項１５】抗体がモノクローナル抗体である、請求
    項14のキット。
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