CN1871362A - 卵巢癌的诊断标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及通过评估生物液体样品中触珠蛋白－1前体的浓度而检测卵巢癌、监测卵巢癌的治疗功效和评估卵巢癌严重程度的方法。本发明还涉及包含触珠蛋白－1前体特异性抗体或核酸探针的试剂盒，所述试剂盒用于卵巢癌的诊断、监测卵巢癌的治疗功效或评估卵巢癌的严重程度。

Description

卵巢癌的诊断标记物
本申请要求2003年9月5日提交的申请号2003904844的澳大利亚临时申请的优先权。
发明领域
本发明涉及癌症的诊断和监测方法。特别是本发明涉及尤其在疾病早期用于卵巢癌和生殖器官其他癌症的筛查，以及卵巢癌和其他癌症治疗和临床控制的监测和预后的方法，以及用于所述方法的分子标记物。
发明背景
本说明书中引用的所有参考文献，包括任何专利或专利申请此处引入作为参考。并不认为任何参考文献构成先有技术。参考文献的讨论陈述其作者的主张，而本申请人保留评论所引用文献的准确性和针对性的权利。可以非常明确的是，虽然此处涉及许多先有技术的出版物，在澳大利亚或任何其他国家，该参考文献并不构成对任何这些文献形成本领域公知常识一部分的认可。
卵巢癌为澳大利亚妇女中死于妇科恶性肿瘤的主要原因以及癌症死亡的第四大主要原因。该癌症为高转移性的，引起远离部位的二次生长，并且诊断为晚期上皮卵巢癌的大多数患者具有广泛的转移。卵巢癌令人生忧的结果由该肿瘤在早期、可治愈阶段不能检测到而引起。由于I级肿瘤的90％可通过目前的控制方法治愈，患有卵巢癌的患者如果在早期诊断则有恢复的良好前景。目前认为在早期、可治愈阶段鉴定卵巢癌唯一可行的方法是确定癌细胞中过表达、且因此从癌细胞分泌进入腹膜腔、并且最终吸收进入循环血液中的蛋白质的身份。
迄今为止，没有发现适于早期-阶段筛查目的的、确定的卵巢癌标记物。CA 125为与卵巢癌相关的血清抗原，该抗原的单克隆抗体广泛用于病情的诊断和监测中。然而，由于该抗原的水平在其他妇科癌症、非-恶性的妇科病情如卵巢囊肿、子宫内膜异位或子宫纤维瘤、肝病、肾衰竭或胰腺炎，以及有时甚至在感染的应答中提高，CA 125值并不是卵巢癌的特异性指征(Mackay和Creasman，1995)。
此外，卵巢癌的一些病例中没有确定CA 125值和疾病进程之间的关系，使得其为卵巢癌早期筛查的不可靠标记物。近年来，肿瘤-相关的差异表达基因-12(TADG-12)，一种通过聚合酶链式反应克隆的丝氨酸蛋白酶，已显示在大约75％的卵巢癌中过表达，而提示其作为一个可选择的标记物(Underwood LJ，2000)。然而，由于与卵巢癌的低关联度该标记物具有假阴性的可能。
因此对于降低卵巢癌的死亡率，存在鉴定分子标记物的急切需求，其优选可在血液、血浆或血清中检测以补充检测早期-阶段疾病中现有试验的使用。
蛋白质组学为一种新兴技术，其可在患者血清、其他生物液体和组织中以高-通量发现方法鉴定蛋白质分子，提供以足够浓度分泌自或释放自肿瘤细胞的蛋白质的相关信息。由于随着疾病发展该血清蛋白分布的改变，癌症患者的血清蛋白代表了生物标记物的丰富来源。当血清循环经过患病器官时，其挑选由肿瘤和其宿主微环境产生的蛋白质。因此癌症-相关的血清蛋白组代表了作为疾病发展过程结果的过-表达或异常排出的蛋白质，或代表了作为蛋白水解降解途径异常活化结果的从该蛋白组除去的蛋白质。因此甚至在疾病最早时期，蛋白质分子对癌细胞特异性中微小但显著的变化可以反映在血清蛋白组中，使得能够确定在检测和监测疾病中更有效的生物标记物的组合。分泌自癌细胞并且由循环血液吸收的过-表达的蛋白质是用于测定血清中蛋白质产物的测定法中潜在的候选标记物。分泌的蛋白质可在患者中激起抗体应答，而在这样情况下基于抗体的血清标记物将是可行的。
通常用于蛋白质组方法的电离质谱技术，基质-辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)和表面-增强的激光解吸电离飞行时间质谱(SELDI-TOFMS)，具有鉴定数千蛋白质的模式或变化的潜力，并且能进行存在于复杂的生物液体(如血清或血浆)中几乎所有小分子量蛋白质的全面分析。
最近描述了具有94％阳性预计值的将癌区别于非癌组的卵巢癌患者的血清学蛋白质组模式(Petricoin等人，2002)。该方法代表了搜索用于卵巢癌早期筛查的生物标记物的新方向，其中早期-阶段癌症患者蛋白质的独特性分布可以产生相对于正常受试者的不同蛋白质模式，其可用作诊断标准。然而，由于其低的特异性，仍在评估该方法的适用范围。
触珠蛋白为结合血红蛋白的急性期糖蛋白，由此防止由于炎症或损伤引起的铁损耗和肾损害(Wassell，2000)。成熟触珠蛋白的天然形式为分子量大约90,000kDa的四聚物，由通过分子间二硫键连接的两个不同α和β-亚单位组成(Hanley和Heath，2000)。
触珠蛋白具有三种主要的表型形式，触珠蛋白1-1、触珠蛋白2-1和触珠蛋白2-2，并且每个或所有的等位基因可以存在于单一个体。个体表型与多种病情相关，包括心血管的和自身免疫病症以及一些恶性的病情。然而，在其他癌症如前列腺癌中，触珠蛋白的表达由于恶性转化而终止(Meechan等人，2002)。
体内，触珠蛋白以显示38,000kDa分子量的单一多肽前体合成。认为成熟蛋白质所有的三种表型源自单一前体，触珠蛋白-1前体。多肽前体经蛋白水解加工形成天然蛋白质的α和β-亚单位(Haugen等人，1981)。前体蛋白包括α链前氨基端18个残基的信号序列，和/或α和β-区域间的干预多肽(Misumi等人，1983)。体内，翻译后事件导致信号序列的蛋白水解去除以及核心寡糖侧链通过膜-联酶系统掺入β-区域(Haugen等人，1981)。翻译后修饰还可导致前体多肽α和β区域的裂解而形成天然蛋白质(Haugen等人，1981)。触珠蛋白生物合成和加工的独特模式的生物学意义还不明确，但是其已显示相当比例新-合成的触珠蛋白以单一多肽前体分泌(Misumi等人，1983)。
在70年代早期首次在卵巢癌患者中报道血清触珠蛋白提高的浓度。触珠蛋白浓度证实受肿瘤负荷程度的影响，而不依赖于卵巢恶性肿瘤的组织类型或等级(Mueller等人，1971)。一些研究已显示卵巢癌患者血清触珠蛋白中提高的岩藻糖基化和其他糖基化的变化(Thompson等人，1992)。最近，已在卵巢癌中显示了触珠蛋白、CA125和白介素-6水平间的关联性(Dobryszycka等人，1999)。由于这些研究依靠触珠蛋白的分光光度法(Mueller等人，1971)、免疫扩散(Thompson等人，1992)和电泳(Thompson等人，1992)检测，检测的是同源的天然蛋白质而不是触珠蛋白前体。
Ono等人，2000年公开了卵巢肿瘤组织中对应于触珠蛋白α(15)-β前体的mRNA的表达。该作者并不认为可在卵巢癌患者的血清和腹水液体中检测触珠蛋白-1前体。虽然众所周知生物液体中成熟触珠蛋白的表达在如癌症、关节炎和蛋白尿的病情中上调，触珠蛋白的前体形式在这些情况下没有检测到。
上述报告均没有提示生物液体中任何触珠蛋白前体的检测或测定可用于卵巢癌或任何其他癌症的诊断、分级或预后。
发明概述
利用蛋白质组和蛋白质印迹法方法我们目前已经鉴定了早期卵巢癌患者血清中的触珠蛋白-1前体。已表明相比于正常血清，卵巢癌患者血清中触珠蛋白-1前体的浓度提高了。因此提示触珠蛋白-1前体作为生物标记物开发的候选物。此外，随着卵巢癌的发展触珠蛋白-1前体表达提高的发现使得其成为一种理想的候选物，以补充或替代广泛使用的但非特异性的CA 125标记物。
在第一个方面，本发明提供了卵巢癌的检测方法，包括测定来自怀疑患有卵巢癌的受试者之生物液体样品中触珠蛋白-1前体浓度的步骤，其中相比于对照样品中触珠蛋白-1前体的浓度，触珠蛋白-1前体提高的浓度为癌症存在的指征。
与获得组织样品如活体检查相比，利用生物液体样品检测触珠蛋白-1前体的能力在获得样品方面提供了相对的便利。此外，其使得触珠蛋白-1前体能在卵巢癌发展中较早地检测到，而活体检查样品常常取自疾病发展的后期。在卵巢癌情况下，直至肿瘤利用外科手术切除，并不经常采取活体检查。
在第二个方面，本发明提供了监测卵巢癌治疗功效的方法，包括测定来自怀疑患有卵巢癌的受试者之生物液体样品中触珠蛋白-1前体浓度的步骤，其中相比于治疗前的水平，触珠蛋白-1前体水平的降低为治疗功效的指征。
在第三个方面，本发明提供了评估卵巢癌严重程度的方法，包括定量测定来自诊断患有或怀疑患有卵巢癌的受试者之生物液体样品中触珠蛋白-1前体浓度的步骤，其中相比于对照样品中触珠蛋白-1前体的浓度，触珠蛋白-1前体提高的浓度为癌症存在和/或严重程度的指征。在本发明的所有三种方法中触珠蛋白-1前体的水平可选择性地和一种或多种其他卵巢癌标记物相关联。
在本发明的所有三个方面中生物液体可以是血液、血浆、血清、腹水或尿。本领域技术人员将很容易确定是否可以使用其他生物液体，如唾液。
触珠蛋白-1前体的浓度可通过任何用于检测触珠蛋白-1前体蛋白或编码其的核酸的便利方法而测定，包括但不限于ELISA、放射免疫测定、化学发光测定、实时PCR、核酸杂交方法等等。触珠蛋白-1前体的特异性抗体，包括单克隆抗体可利用常规方法方便地制备，并且可用于所述方法中。优选这些抗体不与α链内的表位反应。可定性或定量测定浓度。
生物液体样品可选择性地经过一个预处理步骤，利用亲和胶Blue蛋白A或Blue琼脂糖凝胶-蛋白A柱，或利用对应于2002年8月23日提交的澳大利亚临时专利申请2002951240，皇家妇女医院(RoyalWomen’s Hospital)于2003年8月22日提交的国际专利申请PCT/AU03/01075中所述的方法，而耗贫高丰度的蛋白质(如白蛋白)。此提高了低丰度蛋白质的检测灵敏度。
可选择的，本发明的方法还包含测定另一个卵巢癌标记物，如整联蛋白-连接激酶(ILK)、CA 125、TADG-12、间皮素(mesothelin)、激肽释放酶10、prostasin、骨桥蛋白、肌酸激酶β、血清转铁蛋白(serotransferrin)、嗜中性-明胶酶相关脂卡林(lipocalin)(NGAL)、CD163或Gc-球蛋白水平的步骤。或者，也可检测一种或多种其他假定的卵巢癌标记物，如mesothelin、激肽释放酶10、prostasin、骨桥蛋白或肌酸激酶β提高的表达。利用本领域已知的方法可在DNA、RNA或蛋白水平检测第二个标记物。
在第四个方面，本发明提供用于以下的试剂盒：
a)卵巢癌的诊断；
b)卵巢癌治疗功效的监测；或
c)卵巢癌严重程度的评估；
其中包含触珠蛋白-1前体特异性抗体或核酸探针。
在第五个方面，本发明提供触珠蛋白-1前体特异性抗体或核酸探针在以下的用途：
a)卵巢癌的诊断；
b)监测卵巢癌的治疗功效；或
c)卵巢癌严重程度的评估。
在本发明的第四个和第五个方面，抗体优选单克隆抗体。更优选抗体不与α链内的表位反应，并且更加优选抗体特异于触珠蛋白-1前体。
虽然特别指出本发明适用于人，其也适用于兽医用途，包括用于宠物动物(如狗和猫)，以及家畜(如马、牛和绵羊)，或动物园动物(如非-人灵长类、猫科动物、犬科动物、牛科动物以及有蹄类)。
附图简述
图1显示了血清样品在双向电泳(2-DE)之前用亲和胶Blue和蛋白A预处理的结果，图解说明了白蛋白的减少和增强的低丰度蛋白质的检测。图1a：通过SYPRO Ruby染料显现的正常血清双向电泳的分布图；图1b：用亲和胶Blue和蛋白质预处理的血清2-DE的分布图。
图2显示了双向电泳的结果，图解说明了相比于蛋白质组分析所确定的正常受试者的表达，卵巢癌患者血清中六种不同触珠蛋白-1前体同工型的增强的表达。图2a：正常受试者；图2b：1级卵巢癌患者；图2c：2级卵巢癌患者和图2d：3级卵巢癌患者。
图3显示了证实触珠蛋白-1前体在卵巢癌患者腹水(AS)中表达的双向电泳的分布图。
图4显示了不同等级卵巢癌患者的双向电泳分布图，证实蛋白质的差异表达。
图4a：1级；图4b：2级；图4c：3级。
图5显示分离自2-DE凝胶的六种蛋白质的MALDI-TOF MS和n-ESIQ(q)TOF MS质量指纹分析结果。
图6a图解说明了如通过单向电泳和利用单克隆的抗-触珠蛋白抗体的蛋白质印迹测定的，1级和3级卵巢癌患者血清中38kDa触珠蛋白-1前体的免疫活性水平。
图6b图解说明了如通过单向电泳和利用单克隆的抗-触珠蛋白抗体的蛋白质印迹测定的，正常的、良性的和临界的受试者以及1、2和3级卵巢癌患者血清中38kDa触珠蛋白-1前体的免疫活性水平。
图6c显示了正常的、良性的和临界的受试者以及1、2和3级卵巢癌患者血清中触珠蛋白-1前体表达的水平。
图7a、7b和7c显示了相比于正常血清中的水平，(a)正常受试者、(b)1级和(c)3级卵巢癌患者血清中触珠蛋白-1前体异构型提高的免疫活性水平。表达水平通过双向凝胶电泳和利用单克隆的抗-触珠蛋白抗体的蛋白质印迹法测定。
图8显示组织样品中免疫活性触珠蛋白-1前体利用触珠蛋白的单克隆抗体的免疫组织化学检测结果。免疫活性触珠蛋白-1前体在正常卵巢中缺乏(平板a)，但是存在于1、2和3级卵巢肿瘤组织中(血清肿瘤，平板b和子宫内膜样肿瘤；平板c和d)。
图9a图解说明了如通过双向电泳所测定的，化疗治疗前、后3级卵巢癌患者样品中触珠蛋白-1前体的表达分布。
图9b显示了化疗治疗前、后卵巢癌患者样品中不同触珠蛋白-1前体同工型的相对表达水平。
发明详述
定义
很显然本发明不限于此处所述的具体材料和方法，因为这些可以改变。还可明确的是此处所用术语仅是为了描述具体的实施方案，而并不试图限制本发明的范围，其仅仅由附加的权利要求限定。
如此处使用的，除非上下文另有明确规定，单数形式“一”、“一个”和“这个”包含对应的复数解释。因此例如，″一种蛋白质″的解释包括所述蛋白质的复数，并且“一种分子”的解释指一种或多种分子的解释。除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有本发明所述技术领域的普通技术人员通常理解的相同的意思。虽然与此处所述的类似的或等同的任何材料和方法可用于实践或验证本发明，优选的材料和方法描述如下。
在随后的权利要求中以及之前的发明说明书中，除了上下文由于表述语言或必需的含意所需，单词″包括″或变体如″包含″或″含有(comprising)″用于包括端点在内的意义，即表明所述特征的存在而不排除本发明不同实施方案中另外特征的存在或加入。
当表达数值范围时，很明确的是该范围包涵范围的上下限，所有值处于那些限定之中。
″触珠蛋白-1″指分子量大约90kD的成熟的糖基化的四聚物。
“触珠蛋白-1前体”指分子量大约38kD的单链前体蛋白，其包括18个氨基酸的信号序列。
“免疫活性触珠蛋白-1前体”指利用针对成熟的触珠蛋白-1之单克隆抗体检测到的触珠蛋白-1前体。
此处所用的缩写如下：
1-DE                               单向电泳
2-DE                               双向电泳
ir                               免疫活性的
MALDI-TOF             基质-辅助激光解吸干涉测量-飞行时间
MS                               质谱法
MS/MS                          串联质谱法
SELDI-TOF MS          表面-增强的激光解吸电离飞行时间质谱法
TOF MS                         飞行时间质谱法
已发现触珠蛋白前体存在于1级、2级和3级卵巢癌患者的腹水和血清中。卵巢癌组织中，免疫活性触珠蛋白-1前体存在于上皮细胞、基质和卵巢血管中。触珠蛋白-1前体与成熟的触珠蛋白有＞90％的同源性。因此触珠蛋白的单克隆抗体能检测免疫活性触珠蛋白-1前体。
这些数据与触珠蛋白-1前体的过表达为卵巢癌发病中的早期事件的假设相一致。因此触珠蛋白-1前体增强的表达可以反应急性应答的情况，其为肿瘤发展的先决条件。
不希望限于任何可能的机制，我们认为由于大多数分泌蛋白质最早作为具有在分泌加工晚期，或在高尔基体内或有关囊泡中被裂解的、延伸的氨基末端序列的较大前体而合成，癌症患者血清中触珠蛋白-1前体提高的水平可能源于癌细胞特异的缺陷型胞内加工。
转录分布或相关的基因表达系列分析、消减杂交和差异显示技术已经鉴定了14个候选卵巢癌标记物(Mok等人，2001；Schummer等人，1999)。这些蛋白质中，mesothelin和激肽释放酶10通过单克隆抗体和候选基因方法分别鉴定(Scholler等人，1999；Luo等人，2001)。Mesothelin在76％的卵巢癌患者血清中增高(Diamandis等人，2000)，而激肽释放酶10在56％的卵巢癌患者中增高(Luo等人，2001)。已认为mesothelin和/或激肽释放酶10的测试可以配合CA 125的测试，提高在早期、可治愈阶段检测卵巢癌的希望。
由于在患有卵巢癌的患者血清中增高，基因阵列技术已用于鉴定prostasin(一种早先在前列腺分泌物中鉴定的丝氨酸蛋白酶)、骨桥蛋白(一种分泌的骨成形素)和肌酸激酶B(一种肾和肺癌的标记物)(Mok等人，2001；Kim等人，2002)。这些数据表明DNA或RNA水平的筛查方法可用于鉴定一系列的标记物，其也具有配合目前所用的CA125测试以及提供提高的特异性和灵敏度的潜力。
最近鉴定了作为卵巢癌标记物的整联蛋白-连接激酶(ILK)的无细胞免疫活性形式，其与癌症阶段高度相关。参见皇家妇女医院2003年8月20日提交的国际专利申请PCT/AU03/01058。
卵巢癌一种或多种另外的标记物，如ILK(PCT/AU03/01058)、CA 125(Mackay和Creasman，1995)、TADG-12(Underwood LJ 2000)或更多最近所述的标记物，血清转铁蛋白(Kawakami等.，1999)、嗜中性明胶酶相关脂卡林(Kjeldsen等.，1994)、可溶性CD163(Baeton等.，2003)和Gc-球蛋白(Jorgensen等.，2004)可作为触珠蛋白-1前体检测的辅助物而用于本发明的方法中。
常规方法
双向电泳和质谱法
第一向分离：25μg的血清蛋白与再水合缓冲液(7M尿素，2M硫脲，100mM二硫苏糖醇(DTT)，4％(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲胺基]-1-丙基磺酸酯)(CHAPS)，0.5％载体两性电解质，0.01％溴酚蓝(BPB)40mM Tris并且pH 4-7)混合至终体积200μl，并且室温下孵育1h。该混合物随后加样于Ready strip(11cm，pH4-7；Bio-RadLaboratories，USA)并且在50V 20℃主动再水合16h。血清蛋白在250V等电聚焦15分钟；电压随后缓慢升至8000V 150分钟，随后维持在8000V至总共35000Vh/凝胶(即每块凝胶总共42000Vh)。随后在第二向分离之前Ready Strip储存于-80℃。
第二向的分离：来自第一向分离的Ready Strip在5ml平衡缓冲液(50mM Tris-HCl pH 8.8，6M尿素，30％甘油，2％十二烷基硫酸钠(SDS)，0.01％BPB，2mM三丁基膦(TBP))中平衡。Strip在Tris-甘氨酸-SDS电泳缓冲液(25mM Tris，192mM甘氨酸，0.1％w/v SDS；pH8.3)中漂洗并且随后上样至10％Tris-HCl预制的标准凝胶(Bio-Rad Laboratories，USA)顶端。在Strip的顶端铺一层低熔点琼脂糖(包含BPB的电泳缓冲液中，0.5％)。分子量标记(150、100、75、50、37和25kDa)同时电泳。凝胶以10mA/凝胶电泳1h、20mA/凝胶2h并且随后30mA/凝胶30分钟。随后凝胶在甲醇/乙酸(dH2O中40％/10％)中室温下固定1h并且在振荡平台上SYPRO Ruby(Bio-Radlaboratories，USA)中室温下孵育16h。凝胶在甲醇/乙酸(dH2O中10％/7％)去染1h，利用Bio-Rad FX成像仪在100nm分辨率成像，并且利用PDQuest version 6软件(Bio-Rad laboratories，USA)分析。计算机程序识别出来自凝胶数字化图象的蛋白质斑点。一些血清样品的分析重复三次以评估用不同凝胶的实验之间的差异性。
质谱法：成像之后，凝胶用考马斯蓝染色以使得能够进行肉眼可见的鉴定和蛋白带的分离。从凝胶切除考马斯染色的条带并且用胰蛋白酶消化。质谱实验在Ettan MALDI-TOF仪器(Amersham Bioscience，UK)和API QSTAR Pulsari质谱仪(Applied Biosystems，MDS Sciex，Framingham，USA)上进行。通过PepSea服务器搜索TOFMS数据，其被归入分析软件中(Applied Biosystems，MDS Sciex，Framingham，USA)。串联MS数据通过MASCOT搜索引擎搜索。
本发明将通过仅参照下列非限制性实施例和附图的方法详细描述。
实施例1  高丰度白蛋白从人血清的去除
用亲和胶-Blue和蛋白A(5∶1)混合物以离心柱的形式(Bio-RadLaboratories，USA)处理人血清样品。该离心柱包含亲和胶Blue和蛋白A的混合物，其选择性地结合和除去白蛋白和免疫球蛋白。离心柱用1ml结合缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH7.0)通过1000×g离心20秒洗涤两次。50μl血清加至150μl的结合缓冲液，通过涡流混合，并且加载至离心柱。室温下孵育1h后，柱在1000×g离心20秒以收集洗脱物。柱用200μl结合缓冲液洗涤并且与第一个洗脱物结合以产生废弃的血清样品。测定结合洗脱物的总蛋白浓度。洗脱物储存于-80℃直至另外的分析。
图1a表示由SYPRO Ruby染色显现的典型2-DE人血清分布。超过300种蛋白质得到检测并且定位于pI 4-7和20-200kDa的分子量范围之间。68kDa附近的白蛋白模糊条带存在于未处理的血清中，但亲和胶Blue和蛋白A处理1h实现白蛋白的明显损耗，而没有其他所展示蛋白的明显损耗。如图1b中所示，伴随白蛋白的去除一些蛋白质斑点染色强度产生显著的提高。该结果表明人血清的亲和胶Blue和蛋白A处理导致高丰度白蛋白的去除，由此提高了低丰度蛋白质的检测，否则其在白蛋白存在时仍然是模糊不清的。我们已经执行该白蛋白清除的方法而用于鉴定卵巢癌患者血清中差异-表达的低丰度蛋白质。
实施例2  卵巢癌患者血清和腹水中触珠蛋白-1前体的表达
蛋白质组分析和质谱法用于评估正常健康的妇女和卵巢癌患者血清中触珠蛋白-1前体的表达。癌症患者根据标准的组织学方法分级(Silverberg，2000)。
对照组中妇女和卵巢癌妇女的平均年龄分别为47和62岁。通过静脉穿刺收集全血(10ml)入用于血清的平收集管中(允许血液在室温下凝固30分钟)。样品在2000g离心10分钟，随后收集血清。移出等分试样(100μl)用于总蛋白的测定。血清储存于-80℃直至分析。
分析来自8个正常雌性受试者和19个卵巢癌患者血清样品的触珠蛋白-1前体表达。患者中，6个为1级，8个为2级，而24个为3级。还检测卵巢癌患者腹水的触珠蛋白-1前体表达。通过蛋白质组分析和通过利用成熟触珠蛋白的单克隆抗体(Sigma，St Louis，USA)的非还原条件下的蛋白质印迹法检测血清和腹水中的触珠蛋白-1前体表达。触珠蛋白-1前体与成熟的触珠蛋白有＞90％的同源性。因此触珠蛋白的单克隆抗体能检测免疫活性触珠蛋白-1前体。
通过静脉穿刺收集全血(2ml)入平收集管中，并且允许血液在室温下凝固30分钟。样品随后在2000g离心10min，之后收集血清。移出等分试样(100μl)用于总蛋白的测定。血清储存于-80℃直至分析。血液样本在室温下融解，并且对样品进行双向电泳。
图2显示了正常受试者和1级、2级以及3级卵巢癌患者血清中触珠蛋白-1前体表达的蛋白质组分析结果。图3显示了来自卵巢癌患者的腹水中触珠蛋白-1前体表达的蛋白质组分析结果。
实施例3  不同组织学等级的卵巢癌患者的血清蛋白分布
1级(n＝6)、2级(n＝8)和3级(n＝24)卵巢癌患者血清的蛋白质分布通过2-DE分析并且通过用SYPRO-Ruby染色显现。利用PDQuest软件比较来自癌症患者样品的平行组和正常健康妇女(n＝8)的蛋白质分布，并且图4中显示为高斯分布。利用Student′s t检验进行正常组相对1级、2级或3级卵巢癌患者中差异表达的血清蛋白的定量评估。相比于正常的健康志愿者，1、2和3级卵巢癌患者中获得血清蛋白总分布的显著差异。相比于正常血清，24种蛋白质在1级卵巢癌患者中差异表达(图4a)。这些蛋白质中，15种蛋白质上调2倍，4种蛋白质为5倍以及2种蛋白质为10倍。相反，分别有一种蛋白质下调2、5和10倍。2级癌症患者中，观察到31种蛋白质的差异表达，其中25种上调2倍，4种为5倍以及2种为10倍。3级癌症患者血清的分析表明25种差异表达的蛋白质中13种蛋白质下调2倍(图4b和4c)。分别有6种蛋白质上调2倍，3种蛋白质为5倍以及2种蛋白质为10倍(p＜0.05)。
发现一些蛋白质仅在特定病理等级的癌症患者血清中特异表达，而一些蛋白质在三种组织学等级的癌症患者中并不持续表达。为了确保所观察到的差异表达分布中的一致性，在三个不同天数制备的来自同一个患者的血清样品分析重复三次，并且研究以消除可能由于样品处理而引起的混淆因素。在不同天数重复的相同样品的蛋白质斑点分布中没有检测到本质的改变。
差异表达的血清蛋白中，发现10种蛋白质在1、2和3级癌症患者中持续表达(p＞0.05)。这些蛋白质中的6种，其具有约40kD的分子量和5.9-6.6的pI，在1、2和3级卵巢癌患者血清中明显过表达。选择这些用于另外的分析和鉴定。
实施例4  卵巢癌患者中过-表达蛋白质的鉴定
实施例3中发现的在卵巢癌患者中过表达的6种蛋白质通过纳-电离四极飞行时间质谱法(ESIQ(q)TOF MS)和基质-辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF MS)分析而鉴定。
图5中显示的来自6种蛋白质的质量指纹谱显现相同的多肽裂解模式，提示了以不同pI和/或分子质量值分开的单个蛋白质的一系列翻译后修饰的可能性。6种蛋白质的MS/MS分析证实其作为触珠蛋白-1前体同工型的身份(Swissprot登录号P00737)，该前体为具有38.42kD分子量和6.1-6.6 pI的蛋白质，与存在于正常血清中的肝脏糖蛋白触珠蛋白具有90％的同源性(Beutler等人，2002)。这些多肽的氨基酸序列概括在表1中。获得的多肽序列包含对应触珠蛋白-1前体不同区域的氨基酸序列。
表1：3级卵巢癌患者血清中1-6斑点的多肽序列
  多肽序列   氨基酸位置
  ILGGHLDAKDIAPTLTLYVGKRVMPICLPSKDYAEVGRVYVMLPVADQDQCIRHSPVGVQPILNEHTFCAGMSKYQEDTCYGDAGSAFAVHDLEEDTWYATGILSFDK   103-111157-168202-219239-253266-286287-320
Blast搜索结果
SwissProt登录号：P00737
质量：38，427D
所鉴定的蛋白质：人触珠蛋白-1前体
这些多肽在全长触珠蛋白-1前体序列中的定位显示在表2中。
表2：对应于触珠蛋白-1前体分子的来自1-6斑点的多肽(下划线)：
  MSALGAVIALLLWGQLFAVDSGNDVTDIADDGCPKPPEIAHGYVEHSVRYQCKNYYKLRTEGDGVYTLNNEKQWINKAVGDKLPECEAVCGKPNPANPVQR103 ILGGHLDAK 111GSFPWQAKMVSMMNLTTGATLINEQWLLTTAKNLFLNHSENATAK157 DIAP TLTLYVGK 168KQLVEIEKVVLHPNYSQVDIGLIKLNQKVSVNE202 RVMPICLPSKDYAEVGRV 219 GYVSGWGRNANFKFTDHLK 239 YV MLPVADQDQCIRH 253YEGSTVPEKKTPK266 SPVGVQPILNEHTF CRGMSK 286287 YQEDTCYGDAAGSAFAVHDLEEDTWYATGILSFDK 320SCAVAEYGVYVKVTSIQDWVQKTIAEN   4080120160200240280320
蛋白质糖基化模式的差异具有改变蛋白质pI和分子量的可能性，而利用2-DE方法已证实正常血清中的触珠蛋白不同的唾液酸化形式(Wilson等人，2002)。我们的结果与这些观察相一致，其证实6种不同的触珠蛋白-1前体同工型存在于卵巢癌患者血清中。
此外证实为触珠蛋白-1前体同工型的这些蛋白质通过利用单克隆抗-人触珠蛋白抗体的蛋白质印迹法获得。6种触珠蛋白-1前体的同工型通过1-DE或2-DE以及蛋白质印迹法因蛋白质斑点链系具有略微不同的分子量和不同的pI而检测。天然蛋白质与前体具有90％同源性，因此单克隆-抗-触珠蛋白抗体预期可在2-DE蛋白质印迹中显现触珠蛋白同工型前体。
对于蛋白质印迹，血清样品与5倍体积的Laemmli缓冲液孵育。包含等份蛋白质(60μg)的样品在10％SDS-PAGE凝胶电泳至非还原的状态下，随后转至硝酸纤维素膜。膜用初始的触珠蛋白抗体(Sigma，USA)，随后为过氧化物酶-标记的二抗(Amersham，UK)探测并且通过ECL检测系统根据厂家说明书显像(Amersham，UK)。结果在图6和7中显示。
图6a显示了健康志愿者和卵巢癌患者血清中触珠蛋白分子的1-DE Western分布。抗体主要识别分子量约为20、40和70kD的三条带。令人感兴趣的是，由抗-触珠蛋白抗体鉴定的40和70kD蛋白质的表达在1和3级癌症患者中比在健康成人中更多。与之相一致的是，通过2-DE蛋白质印迹在40kD分子量的6种蛋白质组观察到高的反应性(图6b、6c和6d)。如在图7中图解说明的，利用2-DE和蛋白质印迹法获得类似的结果。在分子量20和70kD的另外2种蛋白质也观察到反应性，与1-DE分布一致。分子量20和70kD蛋白质的身份是未知的，而正在研究中。以具有略微不同分子量和不同pI的蛋白质斑点链系呈现的6种触珠蛋白-1前体异构型提示翻译后修饰的存在。
这些结果表明卵巢癌患者血清中触珠蛋白-1前体表达例如通过ELISA或放射免疫测定的定量可用作筛查目的的诊断标记物。
实施例5  免疫组织化学分析
从皇家妇女医院病理系获得石蜡-处理的归档组织。这些包括对照比较所需的正常卵巢(n＝6)，其由于可疑的超声波图象、触摸得到的腹部块和家族史而从患者经手术除去。通过皇家妇女医院，Melbourne病理系的2位病理学家确定病理诊断和肿瘤等级。肿瘤的分级作为临床诊断的一部分进行。卵巢癌的组织学等级通过Silverberg(2000)所述的方法进行。
组织切片切成4μm厚，固定于聚-L-赖氨酸涂布的载玻片上并且在60℃孵育1h。切片在梯度二甲苯和乙醇中3次脱水。抗原暴露利用柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)在微波炉中进行。内源性的过氧化物酶利用甲醇中3％的过氧化氢除去，并且内源性的生物素活性利用稀释的蛋清(蒸馏水中5％)和稀释的脱脂奶粉(蒸馏水中5％)阻断。切片在1/10000稀释于1％BSA Tris缓冲液(100mM，pH7.6)的抗-触珠蛋白单克隆抗体(Sigma，St Louis USA)中孵育1h。抗体结合利用生物素和链亲和素HRP(DAKO，Denmark)每个放大15分钟，并且利用二氨基联苯胺显现复合物。细胞核用Mayer′s苏木精淡染。适当稀释的同位型IgG1替代抗体用作阴性对照。
切片在显微镜下评估阳性的二氨基联苯胺染色。触珠蛋白表达的强度以阴性的、弱的、中等的或强的免疫反应性的不明方式分级。除了染色类型外，测定染色的组织和胞内分布。
图8显示正常卵巢上皮和不同等级的血清和子宫内膜样卵巢肿瘤样品间的免疫组织化学比较的结果。如图8a所示，正常的卵巢表皮或基质中未检测到免疫活性的触珠蛋白-1前体。如图8b、8c和8d分别所示，在1级和3级血清和子宫内膜样卵巢肿瘤中，表皮、基质和卵巢血管中检测到免疫活性触珠蛋白-1前体的高表达。由于染色的大多数在分散的细胞组中观察到，染色主要为胞质的。具腺模式的肿瘤倾向于更多的染色。深染在粘液瘤基质或血管间隙以及卵巢血管区域中明显。不希望限于任何可能的机制，我们认为触珠蛋白前体由卵巢肿瘤细胞表达，而卵巢癌患者血清中增高的触珠蛋白前体浓度很可能是肝来源的。
实施例6  化疗前和化疗后触珠蛋白-1的表达
评估检测六轮化疗前后卵巢癌患者生物液体样品中触珠蛋白-1前体表达的功效。
化疗治疗包括由卡波氯氨铂(AUC 5)/紫杉酚(175mg/m2体重)组成的疗法以及随后手术的常规组合。组合药物通过静脉内输液每三周给予患者。化疗前样品在手术前采集，而化疗后样品在治疗完成后5个月采集。所检的生物液体为血清。测定每轮治疗前后采集的血清样品中触珠蛋白-1前体和CA 125的值。
化疗前后触珠蛋白-1前体的表达在图9a和9b中显示。可看出相对于化疗前的水平，触珠蛋白-1前体表达的水平在化疗后降低。
手术前该患者血清中CA 125的水平为376U/ml。化疗完成后CA125的水平降低至16u/ml。因此化疗治疗后生物液体中触珠蛋白-1前体水平的降低与化疗后生物液体中CA 125水平的降低相关联。
实施例7  生物液体中触珠蛋白-1前体和其同工型浓度的评估
卵巢癌治疗的功效、治疗后疾病的复发以及卵巢癌发病的早期检测通过如下定量生物液体中触珠蛋白-1前体和其同工型的浓度而评估，
(i)利用靶向中间体和β链表位的多克隆或单克隆抗体的直接或间接的夹心ELISA
(ii)基于荧光珠的免疫测定法(Luminx技术)和/或
(iii)基于磁珠的免疫测定法和质谱分析。
触珠蛋白-1前体的测定与利用本领域已知的方法，包括但不限于ELISA测定法对CA125(Mackay和Creasman，1995)、ILK(PCT/AU03/01058)、TADG-12(Underwood LJ，2000)、血清转铁蛋白(Kawakami等人，1999)、嗜中性明胶酶相关脂卡林(Kjeldsen等人，1994)、可溶性CD 163(Baeton等人，2003)和Gc-球蛋白(Jorgensen等人，2004)的卵巢癌相关其他分析物的测定联合进行。
如表3所示，触珠蛋白-1前体的表达水平可用于和其他标记物联合以提高测试的灵敏度和特异性。
表3：化疗前后卵巢癌患者血清中触珠蛋白-1前体、血清转铁蛋白和可溶的整联蛋白-连接激酶的表达
  患者编号   治疗后周数   触珠蛋白-1前体的表达   血清转铁蛋白的表达  可溶的ILK的表达   CA 125U/ml治疗前后
  1   5个月   降低   提高  降低   37016
  2   6周9周   提高提高   提高提高进一步  降低降低进一步   220407220392
化疗后2号患者中触珠蛋白-1前体抑制的缺乏与CA 125浓度的提高有关。该结果可能表明化疗剂抗性的发展，而正在进一步的研究中。
讨论
我们的发现显示早期卵巢癌患者中触珠蛋白-1前体的血清浓度显著提高。不希望限于任何可能的机制，我们认为由于卵巢癌患者中的急性期反应，可能发生触珠蛋白前体增强的肝内合成，其导致提高的血清触珠蛋白前体浓度。我们已经证实触珠蛋白前体表达水平和癌症等级之间的半定量相关性。我们认为利用如免疫测定法的定量测定方法可很容易建立定量相关性。我们认为触珠蛋白-1前体代表了用于卵巢癌诊断的一种新的和有效的生物标记物。正常表皮中免疫活性触珠蛋白-1前体表达的缺乏和后期肿瘤中提高的免疫活性触珠蛋白-1前体的表达提示触珠蛋白-1前体对卵巢癌发展是关键性的。
对于本领域技术人员很显然的是，虽然本发明为了明确和理解的目的已详细地进行描述，可在不背离说明书中所公开的发明构思的范围下对此处所述的实施方案和方法进行各种改进和改变。
此处引用的参考文献如下所列。
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Claims (16)

1.卵巢癌的检测方法，该方法包括测定来自怀疑患有卵巢癌的受试者之生物液体样品中触珠蛋白-1前体浓度的步骤，其中相比于对照样品中触珠蛋白-1前体的浓度，触珠蛋白-1前体增加的浓度为癌症存在的指征。
2.监测卵巢癌治疗功效的方法，包括测定来自怀疑患有卵巢癌的受试者之生物液体样品中触珠蛋白-1前体浓度的步骤，其中相比于治疗前的水平，触珠蛋白-1前体水平的降低为治疗功效的指征。
3.评估卵巢癌严重程度的方法，包括定量测定来自诊断患有或怀疑患有卵巢癌的受试者之生物液体样品中触珠蛋白-1前体浓度的步骤，其中相比于对照样品中触珠蛋白-1前体的浓度，触珠蛋白-1前体增加的浓度为癌症存在和/或严重程度的指征。
4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中生物液体为血液、血浆、血清、腹水或尿。
5.根据权利要求1至4中任一项的方法，其中生物液体已经过预处理步骤以耗贫高丰度的蛋白质，因此提高低丰度蛋白质检测的灵敏度。
6.根据权利要求1至5中任一项的方法，进一步包括将触珠蛋白-1前体的水平与一种或多种其他卵巢癌标记物关联的步骤。
7.根据权利要求6的方法，其中其他标记物为整联蛋白-连接激酶(I LK)、CA 125、TADG-12、间皮素、激肽释放酶10、prostasin、骨桥蛋白、肌酸激酶β、血清转铁蛋白、嗜中性-明胶酶相关脂卡林(NGAL)、CD163或Gc-球蛋白。
8.根据权利要求6或权利要求7的方法，其中其他标记物为整联蛋白-连接激酶(ILK)、CA 125、血清转铁蛋白、嗜中性-明胶酶相关脂卡林(NGAL)或CD163。
9.用于以下的试剂盒：
a)卵巢癌的诊断；
b)监测卵巢癌的治疗功效；或
c)卵巢癌严重程度的评估；
其中包含触珠蛋白-1前体特异性抗体或核酸探针。
10.根据权利要求9的试剂盒，其中抗体为单克隆抗体。
11.根据权利要求9或权利要求10的试剂盒，其中抗体不与α链内的表位反应。
12.根据权利要求9至11中任一项的试剂盒，其中抗体特异于触珠蛋白-1前体。
13.触珠蛋白-1前体特异性抗体或核酸探针在以下的用途：
a)卵巢癌的诊断；
b)监测卵巢癌的治疗功效；或
c)评估卵巢癌的严重程度。
14.根据权利要求13的用途，其中抗体为单克隆抗体。
15.根据权利要求13或权利要求14的用途，其中抗体不与α链内的表位反应。
16.根据权利要求13至15中任一项的用途，其中抗体特异于触珠蛋白-1前体。
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