CN1656231A - 分析样品中非复合形式的前列腺特异抗原以改进前列腺癌检测的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于检测和确定前列腺癌存在的试验方法。试验能够在游离PSA与总PSA的比例显著高的男人群体中检测前列腺癌。试验还能够在少量总PSA，即范围为2－4ng/ml的男人群体中检测前列腺癌。根据本发明的一个实施方案，试验包括下列步骤：(a)确定来自患者的生物样品中所含的总PSA的量，(b)确定同一样品中游离PSA的量，并且计算游离PSA与总PSA的比例，(c)确定同一样品中的pPSA的量，(d)确定同一样品中BPSA的量，(e)确定同一样品中inPSA的量，以及(f)基于总PSA的水平和游离PSA，通过将inPSA的量与用已知癌症和良性疾病诊断的对照样品所建立的预定值进行比较，使样品中所含的inPSA的量与患者中前列腺癌的存在相关。

Description

分析样品中非复合形式的 前列腺特异抗原以改进前列腺癌检测的方法

相关发明

本申请是2002年5月24日提交的U.S.申请No.10/154,715，1999年4月30日提交的U.S.申请No.09/303,208，以及1999年4月30日提交的U.S.申请No.09/303,339的部分继续申请，所述申请的内容在此以其全文引作参考。

发明背景

技术领域

总的来说，本发明涉及检测和鉴定作为诊断标记、具有潜在用途的蛋白，以及蛋白的各种形式和亚基。具体而言，本发明涉及检测或确定前列腺特异抗原在人的生物流体中的失活形式，以及涉及提高检测前列腺癌的方法。

现有技术描述

血清前列腺特异抗原(PSA)的测量广泛用于筛选和早期诊断前列腺癌[1-3]。通过当今临床免疫分析可测量的血清PSA主要以游离“非复合的”形式(游离PSA)存在或以与α-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)的复合物形式存在[1-5]。血清中游离PSA与总PSA的比例已显示可显著提高PCa与BPH的辨别，以更高的比例相关于较低风险的前列腺癌[1-7]。

游离PSA水平在血清中变化的生物学机理是未知的。已经变成复合的血清PSA可能是相对均一的，因为它代表了酶活性的完整的PSA。从PAS-ACT复合物释放的PSA在前列腺癌(PCa)和良性前列腺增生(BPH)血清中发现与精浆PSA是不可区分的，正确认了这种假设[8]。由此得出结论，游离PSA可提供更好的生化指标(insight)，以及表征游离PSA的分子形式可帮助阐明其前列腺起源和释放到血清中的机理。

含有失活形式的PSA的各种PSA的混合物已经从前列腺组织和精浆中分离出来。BPH组织的PSA已经以更普遍的方式被表征为内部更高度截短的形式[9]，尽管没有单个或多个形式的PSA分离自本发明所研究的截短和未截短的PSA形式的混合物。精浆中的PSA通过色谱法已经被分离成组分，显示含有截短和非截短的PSA的各种混合物[10]。然而，在这些研究中没有一个研究表明，抗体被开发为任何单个形式的失活PSA，或者这些PSA形式在血清中得到证实。

在血清中，现在已知游离(未复合的)PSA包含至少两种特异形式的失活PSA。一种形式已被鉴定成酶原，或PSA的前体形式(pPSA)，包括与癌症更相关的pPSA的截短形式[11-13]。第二特异形式的PSA称为BPSA，其是内部切割或降解形式的PSA，与BPH更高度相关[14；15]。BPSA被分离并且广泛表征为同源物种的PSA。有关BPSA和pPSA的详细综述最近已经公布[16]。

另一描述和测量血清中游离形式的PSA的亚群的方法也已由Nurmikko[17]报道。在此情况下，完整PSA(PSA-I)定义为在Lys145位点处未被截短的游离PSA。该试验识别在Lys145位点处不被内部截短的游离PSA形式，Lys145位点是PSA在精浆中降解的最常见的形式。通过该方法测量的PSA的性质还未完全明确，除了在Lys145位点处不被截短之外。照此，该试验测量的是pPSA形式与其他未表征的失活形式的PSA的混合物，所述失活形式的PSA在Lys145位点处不被截短。

由于血清中存在的PSA在临床上有用浓度低于10ng/ml，因此必须开发免疫测定或其他非常灵敏的方法才能测量PSA。利用当前市售的游离PSA免疫测定方法测量的所有形式的游离PSA，总和水平通常低于2ng/ml。pPSA，BPSA和PSA-I的抗体和免疫测定保持仅有的被报道的研究免疫测定，用于测量血清中亚形式的游离PSA。所以，仍需要开发测量不同形式的游离PSA的新方法，以及进一步研究其与不同前列腺病状态的联系。

发明概述

本发明的一个方面提供帮助区分个体中前列腺癌与良性疾病的方法。所述方法包括下列步骤：

a)确定个体生物样品中所含的总PSA的量，

b)确定同一样品中游离PSA的量，并且计算游离PSA与总PSA的比例，

c)确定同一样品中inPSA的量，以及

d)基于总PSA的水平以及游离PSA与总PSA的比例，通过将inPSA的量与用已知癌症和良性疾病诊断的对照样品所建立的预定值进行比较，使样品中所含的inPSA的量与个体中前列腺癌的存在相关。

优选地，免疫测定用于确定不同形式的PSA。根据本发明的一个实施方案，通过利用特异于pPSA和BPSA的封闭抗体来封闭样品中所含的pPSA和BPSA，然后以确定inPSA量的方式测量同一样品中所含的游离PSA的量，从而可以确定inPSA的量。此外，在不同的实施方案中，所述方法进一步包括确定BPSA和pPSA的量的步骤。从游离PSA的量中减去BPSA和pPSA的量，可以确定inPSA的量。

根据本发明的实施方案，相关步骤可以同是使单独inPSA的量，或者使inPSA与总PSA，游离PSA，BPSA和pPSA进行数学组合后的量同预先确定的值相关的步骤。数学组合可以为加，减，除或其组合。

根据本发明的实施方案，总PSA可以在低于20ng/ml的任意水平，或更优选低于10ng/ml，或最优选处于2.5-10ng/ml的范围内。游离PSA与总PSA的比例可以是通常在患者血清中发现的游离PSA的任意范围1-50％，尽管在本发明的一个实施方案中，优选的范围大于20％，而最优选大于25％。pPSA可以是[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5，-7]pPSA或这三种形式的天然和截短的pPSA的总和，以pPSA表示。样品可以是任何生理流体，尽管血清或血浆是优选的。

附图描述

图1示出了pPSA，BPδA和inPSA在癌症血清中的常见比例。

图2示出了接受者操作特征(ROC)分析覆盖图，其中比较了患有癌症或BPH以及总血清PSA为4-10ng/ml的男人中游离PSA(F)，总PSA(T)，inPSA(i)，pPSA(P)和BPSA(B)。

图3示出了患有癌症或BPH以及总血清PSA为4-10ng/ml的男人中游离PSA/总PSA，inPSA/总PSA以及BPSA/总PSA的ROC分析。

图4示出了患有癌症或BPH以及总血清PSA为4-10ng/ml的男人中inPSA/游离PSA和pPSA/游离PSA的ROC分析。

图5示出了患有癌症或BPH以及总血清PSA为4-10ng/ml的男人中inPSA，inPSA/pPSA以及游离PSA的ROC分析。

图6示出了患有癌症或BPH以及总血清PSA为4-10ng/ml的男人中pPSA+inPSA，pPSA+BPSA以及BPSA+inPSA的ROC分析。

图7示出了患有癌症或BPH以及总血清PSA为4-10ng/ml的男人中pPSA减BPSA，inPSA减BPSA以及inPSA减pPSA的ROC分析。

图8示出了患有癌症或BPH以及总血清PSA为4-10ng/ml的男人中inPSA减pPSA，(inPSA减pPSA)/总PSA，以及(inPSA减pPSA)/游离PSA的ROC分析。

图9示出了患有癌症或BPH，总血清PSA为4-10ng/ml以及游离PAS大于25％的男人中inPSA/pPSA，以及inPSA/[-2]pPSA的ROC分析。

图10示出了患有癌症或BPH以及总血清PSA为2.5-4ng/ml的男人中inPSA/pPSA，inPSA减pPSA以及游离PSA/总PSA的ROC分析。

图11示出了患有癌症或BPH以及总血清PSA为2.5-4ng/ml的男人中游离PSA以及inPSA/[-2]pPSA的ROC分析。

图12示出了患有癌症或BPH以及总血清PSA为2.5-10ng/ml的男人中游离PSA/总PSA以及inPSA/pPSA的ROC分析。

图13示出了患有癌症或BPH以及总血清PSA为2.5-10ng/ml的男人中游离PSA/总PSA以及inPSA减pPSA的ROC分析。

图14示出了所有形式的失活精浆PSA的阳离子交换色谱图。

图15示出了还原条件下的SDS-PAGE凝胶，其中泳道1为含有所有形式的失活精浆PSA的原始出发材料，以及泳道2为图14所示的inPSA的纯化峰，含有纯化的完整的非天然的PSA。

图16示出了成熟PSA的全长氨基酸序列。

发明详述

定义

如上所述，血清前列腺特异抗原(PSA)有不同形式。对于本发明而言，术语“总PSA”是指所有可检测形式的PSA，包括游离PSA和复合有ACT的PSA。如本发明所用的术语“游离PSA”是指在溶液中不与其他任何蛋白复合，分子量却有约30kDa的PSA。

一种形式的游离PSA为pPSA或proPSA。如本发明所用的pPSA和proPSA是指前体形式的PSA。全长前体形式的PSA包括7个氨基酸的前肽，APLILSR，其位于237个氨基酸的成熟PSA蛋白的前面。proPSA的全长氨基酸序列在本领域是公知的，并且被充分描述在参考文献[18]中，相关内容在此以其全文引作参考。对本发明而言，前肽序列的最后一个氨基酸“R”计成[-1]氨基酸。例如，[-7]proPSA为其末端起始于前肽-7aa处的proPSA。它含有全长proPSA。[-5]proPSA表示proPSA的末端起始于前肽的-5aa处，并且含有proPSA的前肽序列的最后5个氨基酸序列，依此类推。对于本发明而言，本发明的proPSA既包括全长形式的proPSA又包括其末端起始于proPSA前肽的任意氨基酸处的截短形式的proPSA。本发明proPSA的例子包括但不限于[-1]pPSA，[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5]pPSA以及[-7]pPSA。对本发明而言，不带任何前缀的术语“pPSA”总是表示[-2]pPSA，[-4]pPSA和[-5，-7]pPSA的总和。如本发明所用的[-5，-7]pPSA是指[-5]与[-7]的总和，这是因为在某些情况下，识别[-5]形式的抗体也能识别[-7]形式。

proPSA无活性，即其缺乏胰凝乳蛋白酶样酶活性，因而以游离PSA的形式而非以PSA抗胰凝乳蛋白酶复合物的形式存在于血清中。本发明的proPSA可采用本领域公知的方法制备，所述方法诸如蛋白纯化技术，重组蛋白技术以及蛋白合成技术，但不限于此。制备和检测本发明的proPSA的细节公开在下列在审U.S.专利申请中：于1997年4月30日提交的发明名称为“前列腺特异抗原的形式及其检测方法”的No.08/846,408，以及于2002年5月24日提交的发明名称为“分析血清中前列腺特异抗原的酶原形式以提高前列腺癌检测的方法”的No.08/846,408，相关内容在此以其全文引作参考。

另一形式的游离PSA是BPSA。如本发明所用的术语“BPSA”是指在成熟PSA的氨基酸序列的Lys182处含有至少一个截断(clip)的PSA形式。成熟形式的PSA具有237个氨基酸残基，其分子量为28,400道尔顿[19]，氨基酸序列充分描述在参考文献中[20]。成熟形式的PSA的序列示于图16中。本发明的BPSA在成熟PSA的氨基酸序列的Lys182处含有至少一个截断。换言之，本发明的BPSA与成熟形式的PSA具有相同的氨基酸序列，除了本发明的PSA的多肽链在残基182和183之间已被水解之外。本发明BPSA还可在成熟PSA的氨基酸序列的Ilel，Lys145和Lys146处另有一个或多个截断。在本发明的一个实施方案中，本发明的BPSA由Lys145和Lys182处的两个截断组成。

BPSA无活性，即其缺乏胰凝乳蛋白酶样酶活性，并因此以游离PSA形式而非以PSA抗胰凝乳蛋白酶复合物的形式存在于血清中。BPSA的详细描述以及制备和检测BPSA的方法公开在1999年4月30日提交的发明名称为“特异于良性前列腺增生(BPH)的新型前列腺特异抗原(PSA)及其应用方法”的在审U.S.专利申请No.09/303,208中，相关内容在此以其全文引作参考。

如本发明所用的术语“inPSA”包括除了pPSA和BPSA之外所有形式的游离PSA。inPSA为酶法失活游离PSA的形式。它表示完整的分子量约30kDa的非天然形式的PSA。在天然条件下由于内部二硫键内部截短的PSA保持完整，这是指在诸如含有2-巯基乙醇的SDS-聚丙烯酰胺电泳的还原变性条件下，仍保留分子量约30kDa，并且不形成肽片段的PSA。由于折叠错误，内部二硫键的畸形，侧基酰化，或影响其二级或三级结构的其他因素所导致的结构或构型差异，这种形式的PSA可包括酶法失活的PSA。通过如本发明所述的公知免疫测定，本发明的inPSA可不包括任何可检测水平的pPSA或BPSA形式，但可包括低水平(＜10％)的具有除Lys182位点之外的内肽键切割的PSA，并且可包括任意百分比的PSA，其N-端或C-端去除的氨基酸不超过20个。因此，本发明的inPSA基本上含有完整的非天然PSA，但不包括BPSA和pPSA。所以，对于本发明而言，inPSA等于游离PSA减BPSA和pPSA。

不带任何前缀的术语“pPSA”总是表示[-2]pPSA，[-4]pPSA和[-5，-7]pPSA的总和，其中“pPSA”在数学等式中以BPSA或inPSA表示。

本发明是基于下列意想不到的发现，血清中inPSA的测量改进了癌症预测的值。此外，inPSA与总PSA，游离PSA以及其他单个形式的游离PSA，BPSA和pPSA的各种数学组合相对于总PSA也改进了对前列腺癌的检测。这包括但不限于inPSA减pPSA，或者inPSA除以pPSA的值。pPSA所示为所有天然和截短形式的pPSA的组合。然而，当具体说明时，也可指inPSA与单个天然或截短的pPSA形式，[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5]pPSA和[-7]pPSA的比例([-5]pPSA加[-7]pPSA可以[-5，-7]pPSA表示，这是因为[-7]pPSA的试验同样识别[-5]pPSA)。除了inPSA，这包括BPSA和pPSA之间的数学关系，诸如BPSA减pPSA。本发明描述了inPSA，BPSA和pPSA之间非线性和非显而易见的相互作用关系，但是通过实验已经表明提高前列腺癌的检测。因此，通过确定inPSA，pPSA和BPSA的水平，以及尤其是inPSA与BPSA和pPSA的比例或减/加的差/和，本发明提供了手段帮助检测前列腺癌。

因此，本发明的一个方面提供了帮助区分个体中前列腺癌与良性疾病的方法。所述方法包括下列步骤：

a)确定个体生物样品中所含的总PSA的量，

b)确定同一样品中游离PSA的量，并且计算游离PSA与总PSA的比例，

c)确定同一样品中inPSA的量，以及

d)基于总PSA的水平以及游离PSA与总PSA的比例，通过将inPSA的量或者inPAS和BPSA或pPSA的数学组合与用已知癌症和良性疾病诊断的对照样品所建立的预定值进行比较，使样品中所含的inPSA的量或者inPAS和BPSA或pPSA的数学组合与个体中存在的前列腺癌的存在相关。

测量总PSA和游离PSA的方法在本领域中是众所周知的，因此在此不再赘述。

inPSA量的确定可以采用本发明所述或本领域公知或将来开发的方法，只要能够确定除BPSA或pPSA之外的游离PSA的浓度就行。例如，inPSA可直接或间接加以测量。根据本发明的一个实施方案，inPSA的测量可通过包括下列步骤的方法进行：向样品中加入足够量的BPSA或pPSA的抗体以封闭样品中所含的BPSA和pPSA，以及测量游离PSA的量，其等于inPSA的量。对于本发明而言，如果抗体可以结合全部样品中所含的相应BPSA或pPSA，并且封闭BPSA和pPSA与游离PSA的抗体的结合，则抗体的量是足够的。如果BPSA或pPSA不可结合到游离PSA的抗体，则它们被封闭。

根据本发明的另一实施方案，样品中所含的inPSA可通过从样品中所含的游离PSA的量减去BPSA和pPSA的量而进行计算。该方法要求分别测量样品中所含的游离PSA，pPSA和BPSA的量。然后，从游离PSA中减去BPSA和pPSA的值以确定inPSA的量。

根据本发明的实施方案，pPSA或BPSA或游离PSA的测量可通过免疫测定方法进行，并且用于计算inPSA。游离PSA试验可从市场上获得，并且在本领域是众所周知的。可用于测量pPSA的量的抗体和免疫测定描述在在审U.S.申请No.09/251,686，09/302,965，09,792,692；和09,792,534中，内容在此以其全文引作参考。可用于测量BPSA的量的抗体和免疫测定描述在最近授权的专利，U.S.申请No.09/303,208中，内容在此以其全文引作参考。可用于测量BPSA和pPSA的量的抗体和免疫测定以及利用这些测量因子以相互之间的比例检测前列腺癌的方法描述在最近授权的专利，U.S.申请No.09/303,339中，内容在此以其全文引作参考。

根据本发明的一个实施方案，生物样品中所含的inPSA的量的计算方法可包括下列步骤：将特异性与目的PSA结合的抗体与样品在允许形成含有PSA和抗体的二元复合物的条件下接触；(b)检测和确定复合物的量，以及(c)从游离PSA的量中减去pPSA和BPSA的量确定inPSA的量。

对于本发明而言，能够与pPSA，BPSA或游离PSA形成可检测的复合物的任何因子可视为抗体的等同物。潜在的分子种类的例子包括但不限于抗体，衍生自抗体的抗原结合片段，以及抗体的等同物，诸如但不限于适体(aptamer)等。对于本发明而言，采用本领域公知的方法，可选择特异于pPSA或BPSA或游离PSA的因子。例如，任何公知结合试验可用来确定任何给定因子的特异性结合活性。

通常，样品中要求计算本发明inPSA的任何形式的PSA的定性和/或定量确定都可通过竞争或非竞争性免疫测定步骤以直接或间接方式完成。这种免疫测定的例子有放射性免疫测定(RIA)和夹心(免疫测定(immunometric assay))试验。利用本发明的单克隆抗体检测抗原可以通过以正向，反向或双向的方式运行的免疫测定，包括对生理学样品进行的免疫组织化学试验来实施。本领域的专业技术人员会知道，或者可容易地辨别其他免疫测定方式而无需过多的实验。

术语“免疫测定试验”或“夹心免疫测定”包括双向夹心，正向夹心以及反向夹心的免疫测定。这些术语为本领域专业技术人员所熟知。本领域的专业人员还会意识到，本发明的抗体在试验的其他变体和形式中将是有用的，这些变体和形式无论是当今公知的还是将来有待开发的，都欲包括在本发明的范围内。

对于本发明而言，生物样品可以是含有本发明的inPSA的人生理流体样品。人生理生理流体样品的例子包括但不限于血清，精液，尿和血浆，尽管血清和血浆是优选的。此外，单克隆和多克隆抗体均可使用，只要这种抗体对本发明所提供的抗原具有必要的特异性。优选的是采用单克隆抗体。

根据本发明的实施方案，免疫测定包括特异于[-2]pPSA，[-4]pPSA和[-5，-7]pPSA的试验。例如，在患有已知前列腺癌或BPH的男人的血清中测量特异形式的pPSA，以及这些分析物的水平与inPSA一起用来开发算法以区分前列腺癌和良性前列腺病。本发明的试验可用来帮助区分前列腺癌和良性前列腺增生。

本发明令人惊奇地发现，当分析含有2-10ng/ml总PSA的血清样本时，inPSA具有显著升高的癌症指示值。此外，inPSA与其他形式的总PSA，游离PSA，BPSA和pPSA一起的各种数学算法也改进了前列腺癌的检测。对于本发明而言，术语“数学组合”是指但不限于加，减，除及其组合。例如，数学组合可包括inPSA减pPSA，或inPSA除以pPSA的值。在此情形下，pPSA可以是所有天然和截短形式的pPSA或单个[-2]，[-4]和[-5，-7]pPSA形式的组合。除了inPSA，这还包括BPSA和pPSA之间的数学关系，诸如BPSA减pPSA。本发明描述了非线性和非显而易见的3种单个形式的游离PSA之间的关系，所述3种单个形式的游离PSA，即inPSA，BPSA和pPSA，构成了总游离PSA。这种关系是通过实验发现的。因此，通过确定inPSA，pPSA和BPSA的水平，尤其通过inPSA与BPSA和pPSA的比例或其差值，本发明提供了手段帮助检测前列腺癌。

在游离PSA％高度升高的特定亚群的总PSA中，inPSA除以pPSA以及inPSA减pPSA也具有显著提高的癌症指示值。inPSA和pPSA之间的关系在游离PSA％大于20％，尤其大于25％的男人中提高了癌症的检测。

根据本发明的实施方案，总PSA可以是低于20ng/ml的任意浓度，或更优选低于10ng/ml，或最优选在2.5-10ng/ml的范围。在一个优选的实施方案中，总PSA介于2.5-4ng/ml。在另一优选的实施方案中，总PSA介于4-10ng/ml。游离PSA与总PSA的比例可以是通常在患者血清中发现的游离PSA的任意范围1-50％，尽管在本发明的一个实施方案中，游离PSA优选的范围大于20％，而最优选地大于25％。在特殊的实施方案中，总PSA介于4-10ng/ml，而游离PSA的比例大于20％，或25％的范围。pPSA可以是[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5，-7]pPSA或这三种形式的天然和截短的pPSA的总和，以pPSA表示。inPSA可以优选表示成血清中ng/ml的inPSA，inPSA除以pPSA，或inPSA减pPSA。样品可以是任何生理流体，尽管血清或血浆是优选的。

对于本发明而言，在患者样品中检测的单独inPSA的量及其与总PSA和游离PSA，pPSA和BPSA的组合可以以任何生成诊断值用于确定前列腺癌存在的方式与前列腺癌的存在相关。根据本发明的实施方案，将inPSA的量或其与总PSA，游离PSA，BPSA或pPSA数学组合与预定值比较用于确定前列腺癌的存在。鉴于本发明的教导，本领域专业技术人员通过常规实验可容易地确定“预定的界限值”(或阈值)或其他对在确定前列腺癌的存在中使用inPSA的水平所必需的分析参数。例如，可在诊断有前列腺癌的个体与没患有前列腺癌或BPH的个体中比较上述inPSA的比例，以确定界限值。接受者操作特征(ROC)分析可以以要求的特异性和灵敏度用来确定界限值。ROC分析在本领域中是公知的，并且详细描述在参考文献22(22)中，相关内容在此以其全文引作参考。然后，样品中inPSA的量或其数学组合可与预定的界限值进行比较，以确定个体中前列腺癌的存在，如同从ROC分析中确定的一样，其中较高或较低水平的inPSA或其与其他PSA形式的数学组合可以指示前列腺癌。根据本发明的教导，本领域技术人员基于ROC分析能够确定，较高或较低水平是否指示前列腺癌。以要求的特异性和灵敏度确定界限值的这种方法和其他方法在本领域是众所周知的，无需在此重复(23-29)。

参照下列实施例进一步对本发明加以描述。

实施例1

分析患有癌症和良性疾病的男人的含有总PSA为4-10ng/ml的血清

材料和方法

开发针对BPSA和pPSA的单克隆抗体(mAbs)

针对[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5，-7]pPSA和BPSA的单克隆抗体在先已经描述[12-16]。[-7]pPSA mAb也识别[-5]pPSA形式的pPSA。对于这些实施例而言，无论什么情况下，术语[-7]pPSA表示[-5]加[-7]pPSA。术语pPSA表示[-2]加[-4]加[-5]加[-7]pPSA。

免疫测定PSA

PSA在血清和纯化的制剂中的浓度通过Tandem-MP PSA和Tandem-MP游离PSA试验(Hybritech Incorporated，San Diego，CA；Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，CA)确定。

免疫测定[-2]，[-4]和[-5，-7]pPSA

本发明人已经开发了如下用于测量pPSA形式的免疫测定。将50ul生物素酰化的抗PSA Ab PSM 773的TandemPSA零cal稀释剂(5ug/ml)加入EG&G Wallac链亲和素包被的微滴定板，并且在室温下振荡反应1小时。然后，用TandemE洗涤液洗涤板5次。接着将50ul的TandemPSA零cal稀释剂加入板中，随后加入50ul的待测血清或抗原。如上让混合物室温下反应2小时。用TandemE洗涤液洗涤板5次。向板中加入100ul合适的铕标记的检测mAb的ImA溶液，用于测量各种形式的pPSA。对于[-2]pPSA，检测mAb为PS2X373；对于[-4]pPSA，为PS2V 411；以及对于[-5，-7]pPSA，为PS2P309。如上使混合物室温下反应1小时。然后用TandemE洗涤液洗涤板5次，并且在EG&G Wallac Victor仪上读数。

免疫测定BPSA

BPSA试验方案如下。将生物素酰化的捕获抗PSA mAb，PSM773(100uL，0.25mg/L)振荡下在链亲和素微滴定板中温育1小时。板用封闭缓冲液(50uL)洗涤，接着加入50uL校准品或样品，并且振荡下温育2小时。洗涤板，加入碱性磷酸酶标记的抗BPSA mAbPS2E290(100uL，2ug/ml)，并且振荡下温育1小时。洗涤板，加入100uL的4-甲基伞形酮酰磷酸盐，并且振荡下温育5分钟。然后，在5，60和120分钟对板进行读数。采用1234 Delfia研究荧光计(Wallac，EG&G)测量相对荧光。

接受者操作特征(ROC)曲线分析

采用MedCalc软件程序(MedCalc Software，Belgium，(info@medcalc.be))生成ROC分析和图。理论和实践描述在：Zwieg和Campbell，接受者操作特征(ROC)：临床医学中的基本评价工具(a fundamental evaluation tool in clinical medicine)，Clinical Chemistry，39，561-577，1993。

结果

单个游离PSA形式，BPSA，pPSA和inPSA在总PSA为4-10ng/ml的癌症血清中的典型平均比例示于图1中。单个pPSA和BPSA样品的范围为从0到大于70％的游离PSA。这表明单个游离PSA形式可分别表示显著和可变百分比的游离PSA，并且支持的数据显示inPSA单独及其与BPSA和pPSA组合代表了独特的血清图，所述血清图可改进癌症血清的检测。采用近1100个诊断有癌症或良性疾病、总PSA范围为2-10ng/ml的血清样品，进行ROC曲线和分析。对各个样品测量游离PSA值。测量各个样品中的BPSA以及单个pPSA形式，[-2]pPSA，[-4]pPSA，和[-5，-7]pPSA。除非另有所指，pPSA表示所有3种pPSA形式的总和。inPSA计算成游离PSA减BPSA和pPSA。

为了生成ROC曲线分析，将各个PSA异型的值输入MedCalc程序。ROC是统计学方法，其对一群中的各个样品赋予癌症的阳性和阴性预测值，并且是最广泛使用的方法以评价作为癌症预测器的PSA以及游离PSA试验的值和性能。以最简单的术语，对于各个ROC分析曲线下面积AUC用于评价试验预测值。较高的AUC值指示更好的总预测值。ROC值范围从0.5(随机机会上没有改进)到1.0(100％预测值的完全试验)。ROC曲线的内标如下：T＝总PSA，F＝游离PSA，i＝inPSA，B＝BPSA，P＝pPSA，2p＝[-2]pPSA。例如，在等式中，(i-P)/T等于inPSA减pPSA后除以总PSA。

在大多数情况下，ROC分析的目的是使辨别患有癌症的男人的最大化，以及使那些没患有癌症，即假阳性的男人的活检最小化。当分析诸如血清中PSA的生物样品时，在真阳性和假阳性的检测之间存在平衡。例如，取决于所需的结果，最期望的是检测95％的癌症，而对那些患有良性疾病的男人，这不可避免地伴随着较高的假阳性率。在游离PSA％的情形下，例如，为了检测95％的癌症，它要求对游离PSA小于25％的所有男人进行活检。然而，这却伴随着80％的假阳性率。这些假设的例子表示ROC分析的评价和值不是绝对的，并且在本发明采用inPSA的情形下，将需要常规试验以建立有待在实践中使用的真正参数。但是，鉴于本发明的教导，本领域技术人员应该能够容易地确定必要的参数，而无需过多的试验。下文给出的实施例表明在以给定组的标准检测给定群体中癌症的情形下，inPSA，inPSA与pPSA和BPSA的组合以及pPSA与BPSA的组合的值和功效，但是这些参数的用途和界限不限于这些实施例。

图2示出了总PSA，inPSA，BPSA和游离PSA在血清中的ROC曲线的覆盖图，以ng/ml表示。inPSA具有最高的曲线下面积(AUC)，这表明inPSA比其他参数更好地区分癌症和良性疾病。在PSA测试的领域中，已知游离PSA％在总PSA为4-10ng/ml的早期癌症检测范围中，与单独总PSA比较，改进癌症检测。游离PSA％，即F/T已表明是癌症测试的最好的诊断用PSA，并可被视为判断新测试的标准。图3示出了％inPSA(inPSA/总PSA)优于游离PSA％。图4示出了以与游离PSA的比例表示的inPSA可比得上以与总PSA的比例表示的游离PSA。这些例子示出了inPSA和以与游离或总PSA的比例表示的inPSA同单独总PSA或游离PSA相比，给出的癌症检测是优良的。

图5-8示出了inPSA与其他游离形式的PSA的各种数学组合甚至比单独inPSA可提高癌症检测。图5示出了inPSA/pPSA可比得上单独inPSA，但是好于游离PSA。图6示出了inPSA，pPSA和BPSA相互之间的各种可能的组合。BPSA加inPSA给出了最好的AUC，因而是最好的癌症检测。在这些组合中，pPSA加inPSA效果稍差，而pPSA加BPSA效果最差。图7示出了pPSA，BPSA和inPSA之间相减的各种可能的组合。由这些数学组合获得的值通过任何试验方法本身不能被推知或测量。所有组合都给出了显著的AUC，从而相对于游离或总PSA提高了癌症检测。图8示出了inPSA减pPSA后与游离和总PSA各种更多的比例。利用以与总PSA的比例表示的inPSA减pPSA，相对于仅仅是inPSA减pPSA提高了ROC。图5-8中各个ROC实施例表明，inPSA，pPSA和BPSA的多种组合和比例在ROC分析中提供了显著的AUC，并且相对于单独的游离和总PSA可提高癌症的检测。

图9示出了利用inPSA提高癌症检测的另一实施例。在这种情形下，本发明人对患有前列腺癌和游离PSA％升高的男人进行了检查。在该图中，只分析了游离PSA％大于25％的男人。在真正随机筛选的群体中，游离PSA大于25％的男人建议不对癌症进行活检，这是因为癌症发现的可能性只有大约8％。因此，在正常环境下，由于在该组中常规血检不能预测癌症，这组男人中的癌症往往保持不被检测。图9示出了在这组中inPSA/总PSA和inPSA/[-2]pPSA对癌症具有高度增强的预测值。在特定范围或界限的游离PSA％中，inPSA会显示出选择的癌症预测，这是未预料到的。

实施例II

分析患有癌症和良性疾病的男人的含有总PSA为2.5-4ng/ml的血清

如实施例1一样，在这群总PSA值为2.5-4ng/ml的患者中，测量了同样系列的PSA试验。2.5-4g/ml的范围为一区域，其中在随机筛选的群体中存在许多癌症，但出现机会低于4-10ng/ml的患者。总PSA在此范围不会区分癌症，目前试图用％F来提高该范围中的癌症检测尚未显示出诊断价值。

图10和11示出了在范围为2.5-4ng/ml中，inPSA比游离形式的PSA是更好的前列腺癌的预测器。在图10中，inPSA/pPSA和inPSA减pPSA给出了相似的AUC，得到癌症的阳性区分，而F/T几乎没有给出癌症的区分。在图11中，inPSA/[-2]pPSA也给出了阳性癌症区分，但游离PSA给出很小或没有癌症区分。

这些实施例示出，当总PSA低于4ng/ml时，inPSA也给出了阳性前列腺癌区分，而正常参数的游离和总PSA不能区分癌症和良性疾病。

实施例III

分析患有癌症和良性疾病的男人的含有总PSA为2.5-10ng/ml的血清

目前用于早期诊断前列腺癌的PSA范围为4-10ng/ml。PSA在此范围内的男人建议接受活检以确定是否存在癌症。对是否将PSA界限降低至4ng/ml以下，有可能低至2.5ng/ml，在临床文献中还有争论。在这种情形下，目前的诊断PSA和游离PSA会用于推荐活检，除非有其他改进的测试可用。

图12和13示出了在2.5-10ng/ml的整个范围，相对于当前的试验，inPSA可用于提高癌症检测。在图12中，相对于F/T PSA，inPSA/pPSA提高了癌症检测。在图13中，与F/T PSA比较，inPSA减pPSA给出了甚至更好的改进。由于F/T PSA是如今所用的最好的PSA诊断标记，因此这说明inPSA对癌症辨别具有显著的潜力。

实施例IV

纯化inPSA以及制备inPSA抗体的方法

方法1：在用血清体外温育精浆后纯化inPSA

10ml精浆与50ml雌性血清混合，并在37℃下温育3小时。用PBS(磷酸盐缓冲液，pH7)以1∶2稀释此混合物，0.2μm滤膜过滤，并施加到含有单克隆抗体mAb PSM773的免疫亲和柱上。PSM773先前已经证明可结合所有形式的游离PSA以及与ACT复合的PSA。然后将洗脱自免疫亲和柱的PSA施加到S12大小排阻层析柱，收集以约33kDa洗脱的游离PSA。纯化的失活PSA透析到组成为25 mM Mes(2-[N-吗啉]乙烷磺酸)和40％乙腈pH 5.6(缓冲液A)的缓冲液中，并且施加到平衡在缓冲液A中的0.8×5cm MA7S阳离子交换柱(Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA)。PSA形式采用图14所示的梯度以组成为400 mM乙酸钠，40％乙腈，pH7.0的缓冲液B洗脱。收集图14中的峰，对PBS透析，浓缩，并在2-巯基乙醇的还原条件下施加到4-18％梯度聚丙烯酰胺凝胶上。蛋白在标准条件下用考马斯亮兰染色。

方法II：在用血清体外温育精浆后免疫亲和纯化inPSA

10ml精浆与50ml雌性血清混合，并在37℃下温育3小时。用PBS(磷酸盐缓冲液，pH7)以1∶2稀释此混合物，0.2μm滤膜过滤，并施加到含有单克隆抗体mAb PSM773的免疫亲和柱上。PSM773先前已经证明可结合所有形式的游离PSA以及与ACT复合的PSA。然后将洗脱自免疫亲和柱的PSA施加到S12大小排阻层析柱，和收集以约33kDa洗脱的游离PSA。纯化的失活PSA对PBS透析，并且施加到含有选自下列抗体的组合的免疫亲和柱：PS2P309，PS2P446，PS2X094，PS2X373，PS2V411和PS2V476以去除这些pPSA形式的PSA。穿过峰施加到含有mAbs PS2E290和/或PS2E055的免疫亲和柱上以去除溶液中的BPSA。此时的穿过峰含有inPSA，即为不含BPSA和pPSA的游离PSA。

针对inPSA的单克隆抗体的制备

可将纯化的inPSA注射到小鼠中，腹水中产生的抗体采用组织培养和筛选的标准技术[21]测试其对inPSA的反应性。这包括抗原免疫耐受作用(tolerization)和在inPSA上采用抗PSA封闭抗体以使对显性PSA表位的反应最小化的技术。对于筛选而言，抗体可对释放自PSA-ACT的PSA加以筛选。已知活性天然的PSA经温和化学处理可释放自PSA-ACT复合物，以及这种PSA与精浆PSA在所有方面都显示正常[8]。用于筛选inPSA的活性PSA将挑选识别inPSA特性的抗体，所述特性不同于活性PSA的特性。

讨论

这些实施例表明，inPSA异型的游离PSA与游离PSA相比担当独立的癌症检测用标记。这在如今诊断用PSA的整个目的范围2.5-10ng/ml是真实的。采用inPSA的这些发现延伸了目前对游离PSA形式的理解。本发明人先前于1999年4月30日提交的在审U.S.专利申请No.09/302,965(其是1999年2月17日提交的U.S.申请No.09/251,686的部分继续申请，后者又是1997年4月30日提交的U.S.申请No.08/846,408的继续申请)中已经显示pPSA形式提高了患者群体中的癌症检测。本发明人的下列主题已被授予专利权：BPSA(U.S.申请No.09/303,208)以及BPSA与pPSA的比例以提高癌症检测(U.S.申请No.09/303,339)，内容在此以其全文引作参考。

尽管本发明人最初考虑BPSA和pPSA对提供癌症检测具有特异性，但是预料之外的是血清中剩余的游离PSA——inPSA显示了独立的诊断特性。利用BPSA，pPSA和inPSA的各种算法提高了癌症检测，这一发现只是在本发明人已经用BPSA和pPSA试验测量了足够的癌症和良性样品并且分析数据后才变成明显的。因此，在最终的分析中，单个形式的pPSA，BPSA和inPSA，无论是单个还是彼此之间的组合，与总PSA和游离PSA比较都显示前列腺癌检测显著提高。

这些新的发现暗示了血清中pPSA，BPSA和inPSA之间的复杂关系。为了提高癌症检测和减少不必要的活检，在早期诊断范围为2-10ng/ml PSA时，可应用inPSA的确定。结果中给出的实施例表明inPSA以及inPSA与pPSA和BPSA的组合对前列腺癌检测的实用性，并且提示除了这些实施例以外的某些相关实施例并不意谓着限制其他潜在的不同范围的PSA，游离PSA％或者pPSA，BPSA和inPSA的组合的应用。

参考文献

1.Catalona，W.J.，Smith，D.S.，Ratliff，T.L.，Dodds，K.M.，Coplen.D.E.，Yuan，J.J.等，测量血清中的前列腺特异抗原作为前列腺癌的筛选测试(Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screeningtest for prostate cancer)，N Engl J Med，1991；324：1156-61。

2.Labrie，F.，Dupont，A.，Suburu，R.，Cusan，L.，Tremblay，Ai.，Gomez，J.L.，Emond，J.血清前列腺特异抗原作为前列腺癌的筛选前测试(Serum prostate specific antigen as pre-screening test for prostatecancer)，J Urol，1992；147：846-51。

3.Oesterling，J.E.前列腺特异抗原：临界评价最有用的针对前列腺腺癌的肿瘤标记(Prostate-specific antigen：a critical assessment of themost useful tumor marker for adenocarcinoma of the prostate)，J Urol，1991；145：907-23。

4.Lilja，H.，Christensson，A.，Dahlen，U.，Matikainen，M.T.，Nilsson，O.，Pettersson，K.，Lovgren，T.血清中的前列腺特异抗原主要以与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物出现(Prostate-specific antigen in serum occurspredominantly in complex with α1-antichymotrypsin)，Clin Chem，1991；37：1618-25。

5.Stenman，U.H.，Leinonen，J.，Alfthan，H.，Rannikko，S.，Tuhkanen，K.，Alfthan，O.前列腺特异抗原与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物是患有前列腺癌的患者血清中主要形式的前列腺特异抗原：复合物的试验提高了癌症的临床灵敏度(A complex between prostate specific antigen andA.L-antichymotrypsin is the major form of prostate-specific antigen inserum of patients with prostatic cancer：assay of the complex improvesclinical sensitivity for cancer)，Cancer Res，1991；51：222-6。

6.Catalona，W.J.，Partin，A.W.，Slawin，K.M.，Brawer，M.K.，Flanigan，R.C.，Patel，A.等，利用游离前列腺特异抗原的百分比以增强前列腺癌与良性前列腺疾病的区分：未来的多中心临床试验(Use of thepercentage of free prostate-specific antigen to enhance differentiation ofprostate cancer from benign prostatic disease：a prospective multicenterclinical trial)，JAMA，1998；279：1542-7。

7.Woodrum，D.L.，Brawer，M.K.，Partin，A.W.，Catalona，W.J.，Southwick，P.C.游离前列腺特异抗原临床研究对检测前列腺癌的解释(Interpretation of free prostate specific antigen clinical research studies forthe detection ofprostate cancer)，J Urol，1998；159：5-12。

8.Peter，J.，Unverzagt，C.，Hoesel，W.化学释放自与α1-抗胰凝乳蛋白酶的复合物(PSA-ACT)后的游离前列腺特异抗原(PSA)的分析(Analysis of free prostate-specific antigen(psa)after chemical releasefrom the complex with alpha(1)-antichymotrypsin(PSA-ACT))，ClinChem，2000；46：474-82。

9.Chen，Z.，Chen，H.，Stamey，T.A.良性前列腺增生中的前列腺特异抗原：纯化和表征(Prostate specific antigen in benign prostatichyperplasia：purification and characterization)，J Urol，1997；157：2166-70。

10.Zhang，W.M.，Leinonen，J.，Kalkkinen，N.，Dowell，B.，Stenman，U.H.人精液中不同分子形式的前列腺特异抗原的纯化和表征(Purification and characterization of different molecular forms ofprostate-specific antigen in human seminal fluid)，Clin Chem，1995；41：1567-73。

11.Mikolajczyk，S.D.，Grauer，L.S.，Millar，L.S.，Hill，T.Al.，Kumar.A.Rittenhouse，H.G.等，前体形式的PSA(pPSA)是游离PSA在前列腺癌血清中的组分(A precursor form OF PSA(PPSA)is a component ofthe free PSA in prostate cancer serum)，Urol，1997；50：710-4。

12.Mikolajczyk，S.D.，Millar，L.S.，Wang，T.J.，Rittenhouse，H.G.，Marks，L.S.，Song，W.等，前体形式的前列腺特异抗原与良性过渡区前列腺组织比较在前列腺癌中是更高度升高的(A precursor form ofprostate-specific antigen is more highly elevated in prostate cancercompared with benign transition zone prostate tissue)，Cancer Res，2000；60：756-9。

13.Mikolajczyk，S.D.，Marker，K.M.，Millar，L.S.，Kumar，A.，Saedi，Ni.S.，Payne，J.K.等，截短的前体形式的前列腺特异抗原是前列腺癌更特异的血清标记(A truncated precursor form of prostate-specific antigenis a more specific serum marker of prostate cancer)，Cancer Res，2001；61：6958-63。

14.Mikolajczyk，S.D.，Millar，L.S.，Wang，T.J.，Rittenhouse，H.G.，Wolfert，R.L.，Marks，L.S.等，一种特异分子形式的游离前列腺特异抗原“BPSA”主要发现在患有结节状良性前列腺增生的患者的过渡区中(″BPSA，″a specific molecular form of free prostate-specific antigen，isfound predominantly in the transition zone of patients with nodular benignprostatic hyperplasia)，Urol，2000；55：41-5。

15.Mikolajczyk，S.D.，Millar，L.S.，Marker，K.M.，Wang，T.J.，Rittenhouse，H.G.，Marks，L.S.，Slawin，K.M.精浆含有“BPSA”，一种与良性前列腺增生相关的分子形式的前列腺特异抗原(Seminal plasmacontains″bpsa″，a molecular form of prostate specific antigen that isassociated with benign prostatic hyperplasia)，Prostate，2000；45：271-6。

16.Mikolajczyk，S.D.，Marks，L.S.，Partin，A.W.，Rittenhouse，H.G.血清中的游离前列腺特异抗原正变得更为复杂(Free prostate-specificantigen in serum is becoming more complex)，Urol，2002；59：797-802。

17.Nurmikko，P.，Vaisanen，V.，Piironen，T.，Lindgren，S.，Lilja，H.，Pettersson，K.生产和表征不检测内部切割的Lys145-Lys146失活PSA的新型抗前列腺特异抗原(PSA)单克隆抗体[在方法引用中](Productionand characterization of novel anti-prostate-specific antigen(PSA)monoclonal antibodies that do not detect internally cleaved Lysl45-Lysl46inactive PSA[In Process Citation])，Clin Chem，2000；46：1610-8。

18.Kumar，A.，Mikolajczyk，S.D.，Goel，A.S.，Millar，L.S.，Saedi，M.S.通过哺乳动物细胞表达前体形式的前列腺特异抗原并且由人激肽释放酶2转化为成熟的活性形式(Expression of pro form of Prostate-specific antigen by mammalian cells and its conversion to mature，activeform by human kallikrein 2)，Cancer Res，1997；57：3111-4。

19.Stamey，T.A.，Teplow，D.B.，Graves，H.C.B.采用不同方法识别自精液中纯化的PSA：通过氨基酸分析和分配的消光系数进行比较(Identity of psa purified from seminal fluid by different methods：comparison by amino acid analysis and assigned extinction coefficients)，Prostate，1995；27：198-203。

20.Bridon，D，Dowell，B.利用分子模型对前列腺特异抗原和人腺状激肽释放酶进行结构比较(Structural comparison of prostate-specificantigen and human glandular kallikrein using molecular modeling)，Urol，1995；45：801-6。

21.Knott，C.L.，Kuus-Reichel，K.，Liu，R.S.，和Wolfert，R.L.诊断试验用抗体的开发(DEVELOPMENT of antibodies for diagnosticassays)，免疫试验的原理和实践(Principles and Practice ofInimunoassay)，Price，C.P.和Newman，D.J.37-64.1997.New York.NY，Stockton Press.RefType：Serial(书，专论)。

22.Dawson，J.M.1999.临床试验：分析和呈递。在第26届医学诊断制造商协会年会上的发言(Clinical Trials：Analysis and Presentation，Presented at the 26TH Annual Meeting of the Association of MedicalDiagnostics  Manufacturers)，可获自http：//WWW.amdm.or/AMDM/NewsletterV12-2-2.html。

23.Linnet，K.1999.对基于回归分析的方法比较研究所必需的样品大小(Necessary sample size for method comparison studies based onregression analysis)，Clin.Chem.，45：882-94。

24.Bland，J.M.，Altman，D.G.1986.用于评价两种临床测量方法之间一致性的统计学方法(Statistical methods for assessing agreementbetween two methods of clinical measurement)，Lancet，i：307-10。

25.Reid，M.C.，Lachs，M.S.，Feinstein A.R.1995.方法学标准在诊断测试研究中的应用正变得更好但仍然不是最好(Use of methodologicstandards in diagnostic test research.Getting better but still not good)，JAMA，274：645-51。

26.Krouwer，J.S.累积分布分析图——ROC曲线的替代(Cumulative distribution analysis graphs-an alternative to ROC curves[Tech Briefl])，Clin.Chem.，33：2305-6。

27.Albert，A.1982.有关使用和计算临床化学中的可能性比例(Onthe use and computation of likelihood ratios in clinical chemistry)，Clin.Chem.，28：1113-9。

28.Solberg，H.E.1978.判别式分析(Discriminant analysis)，Crit.Rev.Clin.Lab.SCi.，9：209-42。

29.Matthews，J.N.S.，Altman，D.G.，Campbell，M.J.，Royston，P.1990.医学研究中系列测量的分析(Analysis of serial measurements inmedical researeh)，Br.Med.J.，300：230-5。

Claims (38)

1.一种帮助区分个体中前列腺癌与良性疾病的方法，包括下列步骤：

a)确定个体生物样品中所含的总PSA的量；

b)确定同一样品中游离PSA的量；并且计算游离PSA与总PSA的比例；

c)确定同一样品中inPSA的量；以及

d)基于总PSA的水平以及游离PSA与总PSA的比例，通过将inPSA的量与用已知癌症和良性疾病诊断的对照样品所建立的预定值进行比较，使样品中所含的inPSA的量与个体中前列腺癌的存在相关。

2.权利要求1的方法，其中步骤c进一步包括下列步骤：

(a)向生物样品中加入足够量的针对BPSA和pPSA的单克隆抗体以封闭样品中所含的BPSA和pPSA；以及

(b)确定样品中游离PSA的量，这就是样品中inPSA的量。

3.权利要求1的方法，其中步骤c进一步包括下列步骤：

(a)确定pPSA的量；

(b)确定BPSA的量；以及

(c)游离PSA减pPSA和BPSA的量确定inPSA的量。

4.权利要求3的方法，其中相关步骤为基于总PSA的水平和游离PSA与总PSA的比例，通过比较样品中所含的inPSA和总PSA，游离PSA，BPSA或pPSA的数学组合与用已知癌症和良性疾病诊断的对照样品所确立的预定值，使所述数学组合与个体中前列腺癌的存在相关的步骤。

5.权利要求4的方法，其中数学组合包括在inPSA，BPSA，pPSA，总PSA和游离PSA中的加法，减法和除法。

6.权利要求4的方法，其中数学组合为inPSA与BPSA或pPSA的数学组合。

7.权利要求4的方法，其中数学组合为inPSA与pPSA的比例。

8.权利要求4的方法，其中pPSA选自[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5]pPSA，以及[-7]pPSA。

9.权利要求4的方法，其中数学组合为inPSA与总PSA的比例。

10.权利要求4的方法，其中数学组合为inPSA与游离PSA的比例。

11.权利要求4的方法，其中数学组合为inPSA减pPSA。

12.权利要求4的方法，其中数学组合为inPSA减pPSA后与总PSA的比例。

13.权利要求4的方法，其中数学组合为inPSA减pPSA后与游离PSA的比例。

14.权利要求4的方法，其中数学组合为inPSA加pPSA。

15.权利要求4的方法，其中数学组合为inPSA加pPSA后与总PSA的比例。

16.权利要求4的方法，其中数学组合为inPSA加pPSA后与游离PSA的比例。

17.权利要求4的方法，其中数学组合为inPSA减BPSA。

18.权利要求4的方法，其中数学组合为inPSA加BPSA。

19.权利要求1的方法，其中数学组合为inPSA加或减BPSA后与总PSA或游离PSA的比例。

20.权利要求1的方法，其中总PSA为2.5-10ng/ml，游离PSA与总PSA的比例大于20％，以及inPSA的量高于预定值指示前列腺癌的存在。

21.权利要求20的方法，其中总PSA为4-10ng/ml。

22.权利要求20的方法，其中游离PSA与总PSA的比例大于25％。

23.权利要求1的方法，其中总PSA为2.5-10ng/ml，游离PSA与总PSA的比例选自5％-25％，以及inPSA的量高于或低于预定值指示前列腺癌的存在。

24.权利要求23的方法，其中总PSA为4-10ng/ml。

25.权利要求23的方法，其中总血清PSA为2.5-4ng/ml。

26.权利要求23的方法，其中游离PSA与总PSA的比例选自5％-25％。

27.权利要求1的方法，其中总PSA选自增量从1.0到10.0ng/ml的任何组合。

28.权利要求1的方法，其中总PSA低于约20ng/ml。

29.权利要求1的方法，其中总PSA低于10ng/ml。

30.权利要求1的方法，其中总PSA为约2.5-10ng/ml。

31.权利要求1的方法，其中游离PSA与总PSA的比例为1-50％。

32.权利要求1的方法，其中游离PSA与总PSA的比例为大于20％。

33.权利要求1的方法，其中游离PSA与总PAS的比例为大于25％。

34.权利要求1的方法，其中个体为人。

35.权利要求1的方法，其中样品为生理流体。

36.权利要求13的方法，其中生理流体为血清，血液或血浆。

37.权利要求2的方法，其中pPSA选自[-2]pPSA，[-4]pPSA，[-5，-7]pPSA，其截短的形式，及其任何组合。

38.权利要求5的方法，其中数学组合为BPSA减pPSA。

Images