JP2005527828A

JP2005527828A - 前立腺癌検出改善のための試料中の非複合体型前立腺特異抗原の分析方法

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Publication number: JP2005527828A
Application number: JP2004508248A
Authority: JP
Inventors: スティーヴン、ディーミコラジャクズィク、; ハリー、ジーリッテンハウス、
Original assignee: ハイブリテックインコーポレイテッド
Priority date: 2002-05-24
Filing date: 2003-05-22
Publication date: 2005-09-15
Also published as: WO2003100006A3; CN1656231A; US7211397B2; EP1546360A4; US20030059864A1; WO2003100006A2; EP1546360A2

Abstract

前立腺癌の存在を検出し決定するためのアッセイが提供される。前記アッセイは、全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比が著しく高い男性の集団における前立腺癌を検出することができる。前記アッセイは、全ＰＳＡ量が低い、すなわち、２ないし４ｎｇ／ｍＬの範囲内の男性の集団における前立腺癌を検出することができる。本発明の１つの実施態様によると、前記アッセイは、（ａ）患者由来の生物学的試料に含まれる全ＰＳＡ量を決定するステップと、（ｂ）前記試料中の遊離ＰＳＡ量を決定し、前記全ＰＳＡに対する前記遊離ＰＳＡの比を計算するステップと、（ｃ）前記試料中のｐＰＳＡ量を決定するステップと、（ｄ）前記試料中のＢＰＳＡ量を決定するステップと、（ｅ）前記試料中のｉｎＰＳＡ量を決定するステップと、（ｆ）前記全ＰＳＡおよび遊離ＰＳＡの両方のレベルに基づいて癌および良性疾患の診断が知られた対照試料で確立された予め定められた値と、前記ｉｎＰＳＡ量とを比較することによって、前記試料中に含まれるｉｎＰＳＡ量を前記患者における前立腺癌の存在と関係付けるステップとを含む。

Description

本発明は、一般的に、タンパク質の検出および同定と、診断マーカーとしての潜在的な有用性を有するタンパク質のさまざまな型（ｆｏｒｍ）およびサブユニットとに関する。具体的には本発明は、ヒトの生物学的液体中の前立腺特異抗原の不活性型の検出と、改良された前立腺癌検出方法とに関する。

本出願は２００２年５月２４日出願の米国特許出願第１０／１５４，７１５号、１９９９年４月３０日出願の米国特許出願第０９／３０３，２０８号および１９９９年４月３０日出願の米国特許出願第０９／３０３，３３９号の一部継続出願であり、これらの開示内容は引用によりここにその全体が取り込まれる。

血清前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の測定は、前立腺癌のスクリーニングおよび早期検出のために広く用いられている（非特許文献１−３、文献表の文献１−３）。最新の臨床免疫アッセイで決定可能な血清ＰＳＡは主に、遊離の「非複合体」型（遊離ＰＳＡ）か、α１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）との複合体として存在する（非特許文献１−５、文献表の文献１−５）。血清中の全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比が、ＢＰＨからのＰＣａの鑑別を著しく改善し、比が高いほど前立腺癌のリスクが低いことが証明されている（非特許文献１−７、文献表の文献１−７）。
Ｃａｔａｌｏｎａ、Ｗ．Ｊ．、Ｓｍｉｔｈ、Ｄ．Ｓ．、Ｒａｔｌｉｆｆ、Ｔ．Ｌ．、Ｄｏｄｄｓ、Ｋ．Ｍ．．Ｃｏｐｌｅｎ．Ｄ．Ｅ．．Ｙｕａｎ、Ｊ．Ｊ．ｅｔａｌ．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｍｓｅｒｕｍａｓａｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｅｓｔｆｏｒｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ、１９９１；３２４：１１５６−６１．Ｌａｂｒｉｅ、Ｆ．、Ｄｕｐｏｎｔ、Ａ．、Ｓｕｂｕｒｕ、Ｒ．、Ｃｕｓａｎ、Ｌ．、Ｔｒｅｍｂｌａｙ．Ｍ．．Ｇｏｍｅｚ．Ｊ．Ｌ．、Ｅｍｏｎｄ．Ｊ．Ｓｅｒｕｍｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎａｓｐｒｅ−ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｔｅｓｔｆｏｒｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ、ｄＵｒｏｌ、１９９２；１４７：８４６−５１．Ｏｅｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｊ．Ｅ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ：ａｃｒｉｔｉｃａｌａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔｈｅｍｏｓｔｕｓｅｆｕｌｔｕｍｏｒｍａｒｋｅｒｆｏｒａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｏｆｔｈｅｐｒｏｓｔａｔｅ．ＪＵｒｏｌ、１９９１；１４５：９０７−２３．４．Ｌｉｌｊａ、Ｈ．、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ、Ａ．、Ｄａｈｌｅｎ、Ｕ．、Ｍａｔｉｋａｉｎｅｎ、Ｍ．Ｔ．、Ｎｉｌｓｓｏｎ．Ｏ．、Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、Ｋ．、Ｌｏｖｇｒｅｎ、Ｔ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＡｎｔｉｇｅｎｉｎＳｅｒｕｍＯｃｃｕｒｓＰｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙｉｎＣｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈａｌ．ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ．ＣｌｉｎＣｈｅｍ、１９９１：３７：１６１８−２５．Ｌｉｌｊａ、Ｈ．、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎ、Ａ．、Ｄａｈｌｅｎ、Ｕ．、Ｍａｔｉｋａｉｎｅｎ、Ｍ．Ｔ．、Ｎｉｌｓｓｏｎ．Ｏ．、Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、Ｋ．、Ｌｏｖｇｒｅｎ、Ｔ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＡｎｔｉｇｅｎｉｎＳｅｒｕｍＯｃｃｕｒｓＰｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙｉｎＣｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈａｌ．ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ．ＣｌｉｎＣｈｅｍ、１９９１：３７：１６１８−２５．Ｓｔｅｎｍａｎ、Ｕ．Ｈ．、Ｌｅｉｎｏｎｅｎ、Ｊ．、Ａｌｆｔｈａｎ、Ｈ．、Ｒａｎｎｉｋｋｏ、Ｓ．、Ｔｕｈｋａｎｅｎ、Ｋ．、Ａｌｆｔｈａｎ、Ｏ．Ａｃｏｍｐｌｅｘｂｅｔｗｅｅｎｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎａｎｄａ − ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎｉｓｔｈｅｍａｊｏｒｆｏｒｍｏｆｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｉｎｓｅｒｕｍｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｐｒｏｓｔａｔｉｃｃａｎｃｅｒ：ａｓｓａｙｏｆｔｈｅｃｏｍｐｌｅｘｉｍｐｒｏｖｅｓｃｌｉｎｉｃａｌｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｆｏｒｃａｎｃｅｒ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、１９９１；５１：２２２−６．Ｃａｔａｌｏｎａ、Ｗ．Ｊ．、Ｐａｒｔｉｎ、Ａ．Ｗ．、Ｓｌａｗｉｎ、Ｋ．Ｍ．、Ｂｒａｗｅｒ、Ｍ．Ｋ．、Ｆｌａｎｉｇａｎ、Ｒ．Ｃ．、Ｐａｔｅｌ、Ａ．ｅｔａｌ．Ｕｓｅｏｆｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆｆｒｅｅｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｔｏｅｎｈａｎｃｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｆｒｏｍｂｅｎｉｇｎｐｒｏｓｔａｔｉｃｄｉｓｅａｓｅ：ａｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ．ＪＡＭＡ、１９９８；２７９：１５４２−７．Ｗｏｏｄｒｕｍ、Ｄ．Ｌ．、Ｂｒａｗｅｒ、Ｍ．Ｋ．、Ｐａｒｔｉｎ、Ａ．Ｗ．、Ｃａｔａｌｏｎａ、Ｗ．Ｊ．、Ｓｏｕｔｈｗｉｃｋ、Ｐ．Ｃ．Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎｏｆｆｒｅｅｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｃｌｉｎｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈｓｔｕｄｉｅｓｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ．ＪＵｒｏｌ、１９９８；１５９：５−１２．

血清中の遊離ＰＳＡのレベルが変動する生物学的なメカニズムは不明である。複合体を形成した血清ＰＳＡは、酵素活性がある無傷の（ｉｎｔａｃｔ）ＰＳＡを表すので、比較的均質であるらしい。前立腺癌（ＰＣａ）および良性前立腺過形成（ＢＰＨ）の血清中でＰＳＡ−ＡＣＴ複合体から放出されたＰＳＡは精漿ＰＳＡと区別できないことがわかり、この仮説を確認する（非特許文献８、文献表の文献８）。遊離ＰＳＡはよりよい生化学的な洞察を提供し、遊離ＰＳＡの分子型の特徴付けがその前立腺起源と血清中への放出メカニズムを解明するのを助けるかもしれないということになる。
Ｐｅｔｅｒ、Ｊ．、Ｕｎｖｅｒｚａｇｔ、Ｃ．、Ｈｏｅｓｅｌ、Ｗ．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｆｒｅｅｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）ａｆｔｅｒｃｈｅｍｉｃａｌｒｅｌｅａｓｅｆｒｏｍｔｈｅｃｏｍｐｌｅｘｗｉｔｈａｌｐｈａ（１）− ａｎｔｉｃｈｙｍｏｔｒｙｐｓｉｎ（ＰＳＡ−ＡＣＴ）．ＣｌｉｎＣｈｅｍ、２０００；４６：４７４−８２．

不活性型ＰＳＡを含むさまざまなＰＳＡの混合物が、前立腺組織および精漿から単離されてきた。ＢＰＨ組織由来のＰＳＡは、もっと高度に内部が切断された（ｃｌｉｐｐｅｄ）ものとしてより一般的に特徴付けられてきたが（非特許文献９、文献表の文献９）、この研究では、切断型および非切断型ＰＳＡの混合物から単数または複数のＰＳＡの型は単離されなかった。精漿中のＰＳＡはクロマトグラフィー法によって切断型および非切断型ＰＳＡのさまざまな混合物を含むことが示された分画に分離された（非特許文献１０、文献表の文献１０）。しかしこれらの研究のうちのいずれにおいても、不活性型ＰＳＡの単一の型に対する抗体を作成しなかったし、これらのＰＳＡ型が血清中で証明されなかった。
Ｃｈｅｎ、Ｚ．、Ｃｈｅｎ、Ｈ．、Ｓｔａｍｅｙ、Ｔ．Ａ．Ｐｒｏｓｔａｔｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｉｎｂｅｎｉｇｎｐｒｏｓｔａｔｉｃｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ：ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．ＪＵｒｏｌ、１９９７；１５７：２１６６−７０．Ｚｈａｎｇ、Ｗ．Ｍ．、Ｌｅｉｎｏｎｅｎ、Ｊ．、Ｋａｌｋｋｉｎｅｎ、Ｎ．、Ｄｏｗｅｌｌ、Ｂ．．Ｓｔｅｎｍａｎ、Ｕ．Ｈ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｄｉｆｉｒｅｎｔｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｏｒｍｓｏｆｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｉｎｈｕｍａｎｓｅｍｉｎａｌｆｌｕｉｄ．ＣｌｉｎＣｈｅｍ、１９９５；４１：１５６７−７３．

血清においては、遊離（複合体を形成しない）ＰＳＡは不活性ＰＳＡの少なくとも２つの特異的な型を含むことが今では知られている。１つの型はプロ酵素、あるいは、ＰＳＡの前駆体型（ｐＰＳＡ）として同定され、ｐＰＳＡは癌とより関連があるｐＰＳＡの短縮された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）型を含む（非特許文献１１−１３、文献表の文献１１−１３）。ＢＰＳＡという名称のＰＳＡの第２の特異的な型は、ＢＰＨとより関連性が強いＰＳＡの内部切断または分解された型である（非特許文献１４、１５、文献表の文献１４、１５）。ＢＰＳＡは、ＰＳＡの均質な分子種として単離され、広範な特徴付けが行われた。ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡの詳細な総説が最近刊行された（非特許文献１６、文献表の文献１６）。
Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ、Ｓ．Ｄ．、Ｇｒａｕｅｒ、Ｌ．Ｓ．、Ｍｉｌｌａｒ、Ｌ．Ｓ．、Ｈｉｌｌ、Ｔ．Ｍ．、Ｋｕｍａｒ．Ａ．．Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ、Ｈ．Ｇ．ｅｔａｌ．ＡｐｒｅｃｕｒｓｏｒｆｏｒｍｏｆＰＳＡ（ｐＰＳＡ）ｉｓａｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆｔｈｅｆｒｅｅＰＳＡｉｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｓｅｒｕｍ．Ｕｒｏｌ、１９９７；５０：７１０−４．Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ、Ｓ．Ｄ．、Ｍｉｌｌａｒ、Ｌ．Ｓ．、Ｗａｎｇ、Ｔ．Ｊ．、Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ、Ｈ．Ｇ．、Ｍａｒｋｓ、Ｌ．Ｓ．、Ｓｏｎｇ、Ｗ．ｅｔａｌ．Ａｐｒｅｃｕｒｓｏｒｆｏｒｍｏｆｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｉｓｍｏｒｅｈｉｇｈｌｙｅｌｅｖａｔｅｄｉｎｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｂｅｎｉｇｎｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｚｏｎｅｐｒｏｓｔａｔｅｔｉｓｓｕｅ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、２０００；６０：７５６−９．Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ、Ｓ．Ｄ．、Ｍａｒｋｅｒ、Ｋ．Ｍ．、Ｍｉｌｌａｒ、Ｌ．Ｓ．、Ｋｕｍａｒ、Ａ．．Ｓａｅｄｉ．Ｍ．Ｓ．、Ｐａｙｎｅ、Ｊ．Ｋ．ｅｔａｌ．Ａｔｒｕｎｃａｔｅｄｐｒｅｃｕｒｓｏｒｆｏｒｍｏｆｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｉｓａｍｏｒｅｓｐｅｃｉｆｉｃｓｅｒｕｍｍａｒｋｅｒｏｆｐｒｏｓｔａｔｅｃａｎｃｅｒ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、２００１；６１：６９５８−６３．Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ、Ｓ．Ｄ．、Ｍｉｌｌａｒ、Ｌ．Ｓ．、Ｗａｎｇ、Ｔ．Ｊ．、Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ、Ｈ．Ｇ．、Ｗｏｌｆｅｒｔ．Ｒ．Ｌ．、Ｍａｒｋｓ、Ｌ．Ｓ．ｅｔａｌ．"ＢＰＳＡ，" ａｓｐｅｃｉｆｉｃｍｏｌｅｃｕｌａｒｆｏｒｍｏｆｆｒｅｅｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ、ｉｓｆｏｕｎｄｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｉｔｉｏｎｚｏｎｅｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｎｏｄｕｌａｒｂｅｎｉｇｎｐｒｏｓｔａｔｉｃｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ．Ｕｒｏｌ、２０００；５５：４１−５．Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ、Ｓ．Ｄ．、Ｍｉｌｌａｒ、Ｌ．Ｓ．、Ｍａｒｋｅｒ、Ｋ．Ｍ．、Ｗａｎｇ、Ｔ．Ｊ．、Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ、Ｈ．Ｇ．、Ｍａｒｋｓ、Ｌ．Ｓ．、Ｓｌａｗｉｎ、Ｋ．Ｍ．ＳｅｍｉｎａｌＰｌａｓｍａＣｏｎｔａｉｎｓ "ＢＰＳＡ"、ａＭｏｌｅｃｕｌａｒＦｏｒｍｏｆＰｒｏｓｔａｔｅＳｐｅｃｉｆｉｃＡｎｔｉｇｅｎｔｈａｔｉｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈＢｅｎｉｇｎＰｒｏｓｔａｔｉｃＨｙｐｅｒｐｌａｓｉａ．Ｐｒｏｓｔａｔｅ、２０００；４５：２７１−６．１６．Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ、Ｓ．Ｄ．、Ｍａｒｋｓ、Ｌ．Ｓ．、Ｐａｒｔｉｎ、Ａ．Ｗ．、Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ、Ｈ．Ｇ．Ｆｒｅｅｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｉｎｓｅｒｕｍｉｓｂｅｃｏｍｉｎｇｍｏｒｅｃｏｍｐｌｅｘ．Ｕｒｏｌ、２００２；５９：７９７−８０２．Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ、Ｓ．Ｄ．、Ｍａｒｋｓ、Ｌ．Ｓ．、Ｐａｒｔｉｎ、Ａ．Ｗ．、Ｒｉｔｔｅｎｈｏｕｓｅ、Ｈ．Ｇ．Ｆｒｅｅｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎｉｎｓｅｒｕｍｉｓｂｅｃｏｍｉｎｇｍｏｒｅｃｏｍｐｌｅｘ．Ｕｒｏｌ、２００２；５９：７９７−８０２．

血清中のＰＳＡの遊離型のサブ集団を記載し測定する別の方法はＮｕｒｍｉｋｋｏによって報告された（非特許文献１７、文献表の文献１７）。この場合には、無傷のＰＳＡ（ＰＳＡ−Ｉ）は、精漿中の分解したＰＳＡの最もありふれた型の切断部位である、１４５番のＬｙｓ残基（以下「Ｌｙｓ１４５」という。）で切断されていない遊離ＰＳＡとして定義される。この方法で測定されたＰＳＡの性質は、Ｌｙｓ１４５で切断されていないことを除いてあまりわかっていない。このような状況であるから、このアッセイ方法は、ｐＰＳＡの型の混合物を、まだ特徴付けされていない、他の不活性型のＬｙｓ１４５で切断されていないＰＳＡと組み合わせて測定しているのであろう。
Ｎｕｒｍｉｋｋｏ、Ｐ．、Ｖａｉｓａｎｅｎ、Ｖ．、Ｐｉｉｒｏｎｅｎ、Ｔ．、Ｌｉｎｄｇｒｅｎ、Ｓ．、Ｌｉｌｊａ、Ｈ．、Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ、Ｋ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｎｏｖｅｌａｎｔｉ−ｐｒｏｓｔａｔｅ− ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｇｅｎ（ＰＳＡ）ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｈａｔｄｏｎｏｔｄｅｔｅｃｔｉｎｔｅｒｎａｌｌｙｃｌｅａｖｅｄＬｙｓ１４５−Ｌｙｓ１４６ｉｎａｃｔｉｖｅＰＳＡ［ＩｎＰｒｏｃｅｓｓＣｉｔａｔｉｏｎ］．ＣｌｉｎＣｈｅｍ、２０００；４６：１６１０−８．

ＰＳＡの臨床上有用な血清中濃度は１０ｎｇ／ｍＬ未満であるため、免疫アッセイ法その他の前記ＰＳＡを測定するための非常に敏感な方法を開発する必要がある。現在の商業的な遊離ＰＳＡの免疫アッセイは、典型的には２ｎｇ／ｍＬより低いレベルの遊離ＰＳＡの全ての型の総和を測定する。ｐＰＳＡ、ＢＰＳＡおよびＰＳＡ−Ｉ用の抗体および免疫アッセイだけが、異なる型の遊離ＰＳＡを測定するための研究用免疫アッセイとして報告されたものである。したがって異なる型の遊離ＰＳＡを測定する新規な方法を開発し、これらの型と異なる前立腺疾患の病態との関連を研究する必要性が存在する。

本発明の１つの側面は、被検者の良性疾患から前立腺癌を鑑別する補助方法を提供する。前記方法は、
（ａ）前記被検じゃの生物学的試料中に含まれる全ＰＳＡ量を決定するステップと、
（ｂ）前記試料中の遊離ＰＳＡ量を決定し、前記全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比を計算するステップと、
（ｃ）前記試料中のｉｎＰＳＡ量を決定するステップと、
（ｄ）全ＰＳＡレベルと、前記全ＰＳＡに対する前記遊離ＰＳＡの比との両方に基づいて、癌および良性疾患の診断が知られた対照試料で確立された予め定められた値と、前記ｉｎＰＳＡ量を比較することによって、前記試料中のｉｎＰＳＡ量を前立腺癌の存在と関係づけるステップとを含む。

好ましくは、異なる型のＰＳＡを決定するために免疫アッセイが用いられる。本発明の１つの実施態様によると、ｉｎＰＳＡ量は、ｐＰＳＡおよびＢＰＳＡに特異的なブロッキング抗体を用いて試料中に含まれるｐＰＳＡおよびＢＰＳＡをブロックし、それから、ｉｎＰＳＡ量を決定する方法として、前記試料中に含まれる遊離ＰＳＡ量を測定することによって決定される場合がある。代替的には、異なる実施態様では前記方法は、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡの量を決定するステップを含む。ｉｎＰＳＡ量は、遊離ＰＳＡ量からＢＰＳＡおよびｐＰＳＡ量を減算することによって決定される場合がある。

本発明の実施態様によると、前記関係づけるステップは、ｉｎＰＳＡ量単独か、あるいは、ｉｎＰＳＡと全ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡとの数学的な組み合わせかを予め定められた値と関係づけるステップの場合がある。前記数学的な組み合わせは、加算、減算、除算またはこれらの組み合わせの場合がある。

本発明の実施態様によると、前記全ＰＳＡは、２０ｎｇ／ｍＬより低いか、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬより低いか、最も好ましくは２．５ないし１０ｎｇ／ｍＬの範囲内のいずれのレベルであってもよい。全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比は、患者の血清に典型的にみられる１から５０％までの遊離ＰＳＡのいずれの範囲であってもよいが、本発明の１つの実施態様では、好ましい範囲は２０％より大きく、最も好ましくは２５％を越える。前記ＰＳＡは、［−２］ｐＰＳＡ、［−４］ｐＰＳＡ、［−５，−７］ｐＰＳＡか、ｐＰＳＡと表されるこれら３種類の型のネイティブおよび短縮ＰＳＡの合計かの場合がある。前記試料はいずれかの生理的な液体でよいが、血清または血漿が好ましい。

定義
上記のとおり、血清の前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は異なる型で存在する。本発明の目的のためには、「全ＰＳＡ」という用語は、遊離ＰＳＡと、ＡＣＴとのＰＳＡ複合体とを含むＰＳＡの全ての検出可能な型を指す。ここで用いられるところの「遊離ＰＳＡ」という用語は、他のいずれのタンパク質との複合体を形成せず、溶液中に〜３０ｋＤａタンパク質としてみられるＰＳＡを指す。

遊離前立腺特異抗原の１つの型はｐＰＳＡまたはプロＰＳＡである。ここで用いられるｐＰＳＡおよびプロＰＳＡは、ＰＳＡの前駆体型を指す。完全長前駆体型のＰＳＡは、２３７個のアミノ酸の成熟ＰＳＡタンパク質の前にＡＰＬＩＬＳＲという７個のアミノ酸のプロペプチドを含む。プロＰＳＡの完全長アミノ酸配列は当業者に知られており、文献表の文献１８に完全に記載されている。本発明の目的のためには、前記プロペプチド配列の最後のアミノ酸「Ｒ」が［−１］番目のアミノ酸として数えられる。例えば、［−７］プロＰＳＡは、前記プロペプチドの−７番目のアミノ酸で開始する末端を有するプロＰＳＡである。これは完全長プロＰＳＡを含む。［−５］プロＰＳＡは、前記プロペプチドの末端が−５番目のアミノ酸で開始し、プロＰＳＡのプロペプチドの最後の５個のアミノ酸配列を含むこと等を示す。本発明の目的のためには、本発明のプロＰＳＡは、末端が前記プロＰＳＡのプロペプチドのいずれかのアミノ酸で開始する、完全長型および短縮型の両方を含む。本発明のプロＰＳＡの例は、［−１］ｐＰＳＡ、［−２］ｐＰＳＡ、［−４］ｐＰＳＡ、［−５］ｐＰＳＡおよび［−７］ｐＰＳＡを含むが、これらに限定されない。本発明の目的のためには、接頭辞のない用語「ｐＰＳＡ」は［−２］ｐＰＳＡ、［−４］ｐＰＳＡおよび［−５，−７］ｐＰＳＡの合計を常に意味する。ここで用いられる［−５，−７］ｐＰＳＡは、場合によっては［−５］型を認識する抗体は［−７］も認識するので、［−５］および［−７］の合計を指す。

前記プロＰＳＡは不活性である、すなわち、キモトリプシン様酵素活性がないので、ＰＳＡとアンチキモトリプシンとの複合体としてではなく、遊離ＰＳＡとして血清中に存在する。本発明のプロＰＳＡは、タンパク質精製技術、組換えタンパク質技術およびタンパク質合成技術のような当業者に周知の方法で作られる場合がある。本発明のプロＰＳＡの生産および検出の詳細は、１９９７年４月３０日に出願された同時係属中の米国特許出願第０８／８４６．４０８号および２００２年５月２４日に出願された米国特許出願第０８／８４６．４０８号の明細書に説明されており、これらの関係する内容は引用によりここにその全体が取り込まれる。

遊離ＰＳＡの別の型はＢＰＳＡである。ここで用いられるところの用語「ＢＰＳＡ」は、成熟型ＰＳＡのアミノ酸配列の少なくともＬｙｓ１８２での１カ所の切断を含むＰＳＡの型を指す。成熟型ＰＳＡは分子量２８，４００Ｄの２３７個のアミノ酸残基を有し（文献１９）、前記アミノ酸配列は文献２０に完全に記載されている。成熟型ＰＳＡの配列は図１６に示される。本発明のＢＰＳＡは、成熟型ＰＳＡのアミノ酸配列の少なくとも１カ所の１８２番目のリジン残基での切断を有する。換言すると、本発明のＢＰＳＡは、本発明のＰＳＡのポリペプチド鎖が第１８２番目と第１８３番目の残基の間で加水分解されている点を除いて、成熟型ＰＳＡと同じのアミノ酸配列を有する。本発明のＢＰＳＡは、成熟型ＰＳＡの１番目のＩｌｅ、１４５番目のＬｙｓおよび１４６番目のＬｙｓでの１カ所または２のカ所以上の追加の切断を含む場合がある。本発明の１つの実施態様では、本発明のＢＰＳＡは、１４５番目のＬｙｓおよび１８２番目のＬｙｓでの２カ所の切断からなる。

ＢＰＳＡは不活性である、すなわち、キモトリプシン様酵素活性がないので、ＰＳＡとアンチキモトリプシンとの複合体としてではなく、遊離ＰＳＡとして血清中に存在する。ＢＰＳＡと、ＢＰＳＡの生産および検出方法との詳細な説明は、１９９９年４月３０日出願の同時係属中の米国特許出願第０９／３０３．２０８号の明細書に説明され、その関係する内容はここにその全体が取り込まれる。

ここで用いられるところの用語「ｉｎＰＳＡ」は、ｐＰＳＡおよびＢＰＳＡ以外の全ての型の遊離ＰＳＡを含む。ｉｎＰＳＡは酵素的に不活性な遊離ＰＳＡである。ｉｎＰＳＡは〜３０ｋＤａの無傷の非ネイティブ型のＰＳＡを表す。内部切断されたＰＳＡはネイティブ条件下では内部のジスルフィド結合のために無傷のままであるから、これは、分子量〜３０ｋＤａを保持し、２−メルカプトエタノール処理付きのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のような還元変性条件下では断片ペプチドを形成しない。この型のＰＳＡは、フォールディングの誤り、内部ジスルフィド結合の異常、側鎖アシル化その他の２次構造および３次構造に影響を与える因子によって生じる構造またはコンフォメーションの相違のために酵素的に不活性化ＰＳＡを含む場合がある。本発明のｉｎＰＳＡは、ここに説明する既知の免疫アッセイによって検出可能なレベルのｐＰＳＡまたはＢＰＳＡ型を含む場合はないが、１８２番目のリジン以外での内部のペプチド結合の切断を有するＰＳＡの低レベル（１０％未満）を含む場合があり、Ｎ末端またはＣ末端から２０個以内のアミノ酸が除去されたＰＳＡのいずれかの割合を含む場合もある。したがって本発明のｉｎＰＳＡは、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡを含まない、無傷で非ネイティブのＰＳＡを実質的に含む。したがって本発明の目的のためには、ｉｎＰＳＡは遊離ＰＳＡからＢＰＳＡおよびｐＰＳＡを引いたものに等しい。

接頭辞なしの用語「ｐＰＳＡ」は、［−２］ｐＰＳＡ、［−４］ｐＰＳＡおよび［−５，−７］ｐＰＳＡの合計を常に意味し、ここで「ｐＰＳＡ」はＢＰＳＡまたはｉｎＰＳＡを用いる数式で表される。

本発明は、血清中のｉｎＰＳＡの測定が癌予測値の改善を提供するという予想外の発見にもとづく。さらに、全ＰＳＡと、遊離ＰＳＡと、遊離ＰＳＡ、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡの他の個々の型とｉｎＰＳＡとのさまざまな数学的な組み合わせも前立腺癌の検出を全ＰＳＡよりも改善する。これは、ｐＰＳＡを引いたｉｎＰＳＡか、ｐＰＳＡで割ったｉｎＰＳＡかのレベルを含むが、これらに限定されない。しかし、特定されるとき、［−２］ｐＰＳＡ、［−４］ｐＰＳＡ、［−５］ｐＰＳＡおよび［−７］ｐＰＳＡ（［−７］ｐＰＳＡ用のアッセイは［−５］ｐＰＳＡも認識するために、［−５］ｐＰＳＡおよび［−７］ｐＰＳＡの和は［−５，−７］ｐＰＳＡと表される場合がある。）という個々のネイティブ型または短縮型ＰＳＡに対するｉｎＰＳＡの比の場合がある。ｉｎＰＳＡに加えて、これは、ｐＰＳＡを引いたＢＰＳＡのような、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡの間の数学的関係を含む。本発明は、非線形で非自明だが、前立腺癌の検出を改善することが実験的に証明されている、ｉｎＰＳＡ、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡの間の相互作用する関係を説明する。したがって本発明は、ｉｎＰＳＡ、ｐＰＳＡおよびＢＰＳＡのレベルの決定と、特に、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡとｉｎＰＳＡとの比または減算／加算結果とによって前立腺癌の検出を補助する手段を提供する。

したがって本発明の１つの側面は、被検者における前立腺癌を良性疾患から鑑別する補助方法を提供する。前記方法は、
（ａ）前記被検者由来の生物学的試料中に含まれる全ＰＳＡ量を決定するステップと、
（ｂ）前記試料中の遊離ＰＳＡ量を決定して、前記全ＰＳＡに対する前記遊離ＰＳＡの比を計算するステップと、
（ｃ）前記試料中のｉｎＰＳＡ量を決定するステップと、
（ｄ）全ＰＳＡレベルと、前記全ＰＳＡに対する前記遊離ＰＳＡの比との両方に基づいて、癌および良性疾患の診断が知られた対照試料で確立された予め定められた値と、ｉｎＰＳＡ量か、ＢＰＳＡまたはｐＰＳＡとｉｎＰＳＡとの数学的な組み合わせかを比較することによって、前記試料中に含まれるｉｎＰＳＡ量か、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡとｉｎＰＳＡとの数学的組み合わせかを前記被検者での前立腺癌の存在と関係づけるステップとを含む。

全ＰＳＡおよび遊離ＰＳＡの測定方法は当業者に周知であるので、ここでは繰り返さない。

ｉｎＰＳＡ量は、ＢＰＳＡでもｐＰＳＡでもない遊離ＰＳＡ濃度を決定できるかぎり、ここに説明されるか、当業者に知られているか、将来開発されるかのいずれの方法によって決定されてもかまわない。例えば、ｉｎＰＳＡは直接測定されても間接的に測定されてもかまわない。本発明の１つの実施態様によると、試料中に含まれるＢＰＳＡおよびｐＰＳＡをブロッキングするのに十分な量のＢＰＳＡまたはｐＰＳＡに対する抗体を前記試料に添加するステップと、ｉｎＰＳＡ量に等しい遊離ＰＳＡ量を測定するステップとを含む方法によって測定される場合がある。本発明の目的のためには、抗体の量は、試料中に含まれるＢＰＳＡまたはｐＰＳＡのそれぞれの全てと結合でき、遊離ＰＳＡに対する抗体と前記ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡとの結合をブロックできる場合に十分とされる。ＢＰＳＡまたはｐＰＳＡは、遊離ＰＳＡに対する抗体が結合できない場合にブロックされるといえる。

本発明の別の実施態様によると、試料中に含まれるｉｎＰＳＡは、試料中に含まれる遊離ＰＳＡ量からＢＰＳＡおよびｐＰＳＡ量を減算することによって計算される場合がある。前記本発明は、試料中に含まれる、遊離ＰＳＡ、ｐＰＳＡおよびＢＰＳＡのそれぞれの測定を必要とする。ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡについての値が遊離ＰＳＡから減算されて、ｉｎＰＳＡ量が決定される。

本発明の実施態様によると、ｐＰＳＡ、ＢＰＳＡまたは遊離ＰＳＡは、免疫アッセイによって測定され、ｉｎＰＳＡを計算するために用いられる場合がある。遊離ＰＳＡのアッセイは市販されており、当業者に周知である。ｐＰＳＡ量の測定に使用される場合がある抗体および免疫アッセイは、同時係属中の米国特許出願第０９／２５１，６８６号、第０９／３０２，９６５号、第０９，７９２，６９２号および第０９，７９２，５３４号の明細書に説明され、その内容は引用によりここにそれらの全体が取り込まれる。ＢＰＳＡ量の測定に使用される場合がある抗体および免疫アッセイは、最近特許が発行された米国特許出願第０９／３０３，２０８号の明細書に説明され、その内容は引用によりここにその全体が取り込まれる。ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡ量を測定するために使用される場合がある抗体および免疫アッセイと、これらの測定値を互いとの比で使用して、前立腺癌を検出する方法は、最近特許が発行された米国特許出願第０９／３０３，３３９号の明細書に説明され、その内容は引用によりここにその全体が取り込まれる。

本発明の１つの実施態様によると、生物学的試料中に含まれるｉｎＰＳＡ量を計算するための方法は、（ａ）関心のあるＰＳＡと該ＰＳＡと特異的に結合する抗体とを含まれる２分子複合体の形成を可能にする条件下で、前記試料と前記抗体とを接触させるステップと、（ｂ）前記複合体の量を検出し決定するステップと、（ｃ）遊離ＰＳＡ量からｐＰＳＡおよびＢＰＳＡ量を減算することによりｉｎＰＳＡ量を決定するステップとを含む場合がある。

本発明の目的のためには、ｐＰＳＡ、ＢＰＳＡまたは遊離ＰＳＡと検出可能な複合体を形成できるいずれかの試薬が前記抗体の均等物と考えられるであろう。可能性のある分子種の例は、抗体と、抗体由来の抗原結合断片と、アプタマー等を含むがこれらに限定されない抗体の均等物とを含むが、これらに限定されない。本発明の目的のためには、ｐＰＳＡ、ＢＰＳＡまたは遊離ＰＳＡに特異的な試薬は当業者に知られた方法によって選択される場合がある。例えば、いずれかの既知の結合アッセイが、いずれかの特定の試薬の特異的結合活性を決定するために用いられる場合がある。

典型的には、試料中の本発明のｉｎＰＳＡを計算するために必要なＰＳＡのいずれかの型の定性的および／または定量的決定は、直接的または間接的なフォーマットのいずれかでの競合的または非競合的免疫アッセイの手順によって達成される場合がある。かかる免疫アッセイの例は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）およびサンドイッチ（イムノメトリック）アッセイである。本発明のモノクローナル抗体を用いる抗原検出は、生理的試料の上での免疫組織化学的なアッセイを含む、正方向（ｆｏｒｗａｒｄ）、逆方向（ｒｅｖｅｒｓｅ）または同時（ｓｉｍａｌｔａｎｅｏｕｓ）モードのいずれかで実行される免疫アッセイを用いて行われることがある。当業者は、過度の実験を伴うことなく、他の免疫アッセイのフォーマットを知り、あるいは、容易にわかる。

「イムノメトリックアッセイ」または「サンドイッチ免疫アッセイ」という用語は、同時サンドイッチ法、正方向サンドイッチ法および逆方向サンドイッチ法免疫アッセイを含む。これらの用語は当業者によく理解されている。当業者は、本発明の抗体が現在知られているか、あるいは、将来開発されるかもしれないアッセイの他の変法および形式において有用であることを理解するであろう。これらは、本発明の範囲内に含まれるものとする。

本発明の目的のためには、前記生物学的試料は、本発明のｉｎＰＳＡを含むいずれかのヒトの生理的液体試料の場合がある。前記ヒトの生理的液体試料の例は、血清、精液、尿および血漿を含み、血清および血漿が好ましいが、これらに限定されない。さらに、本発明によって提供される抗原に必要な特異性を有するかぎり、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方を用いてもよい。モノクローナル抗体を用いるのが好ましい。

本発明の目的によると、前記免疫アッセイは、［−２］ｐＰＳＡ、［−４］ｐＰＳＡおよび［−５，−７］ｐＰＳＡに特異的なアッセイを含む。例えば、ｐＰＳＡの特定の型が、癌および良性疾患であることが知られた男性の血清中で測定され、これらの被検体のレベルが前立腺癌を良性前立腺疾患から鑑別するためのｉｎＰＳＡを用いるアルゴリズムを開発するために用いられる。本発明のアッセイは、前立腺癌を良性前立腺過形成から鑑別するのを補助するために用いられる場合がある。

ｉｎＰＳＡが、２−１０ｎｇ／ｍＬの全ＰＳＡを含む血清献体を分析するとき、癌予測値が著しく高いことは本発明の驚くべき発見である。さらに、全ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡの他の型とｉｎＰＳＡとのさまざまな数学的なアルゴリズムも、前立腺癌の検出を改善する。本発明の目的のためには、「数学的組み合わせ（ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」という用語は、加算、減算、除算およびこれらの組み合わせを指すが、これらに限定されない。例えば、数学的組み合わせは、ｐＰＳＡから減算されたｉｎＰＳＡか、ｐＰＳＡで除算されたｉｎＰＳＡかのレベルを含むが、これらに限定されない場合がある。この場合ｐＰＳＡは、ｐＰＳＡのすべてのネイティブ型および短縮型か、［−２］ｐＰＳＡ、［−４］ｐＰＳＡおよび［−５，−７］ｐＰＳＡの個々の型かの組み合わせの場合がある。ｉｎＰＳＡに加えて、これは、ｐＰＳＡを減算したＢＰＳＡのような、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡの間の数学的関係を含む。本発明は、全遊離ＰＳＡを構成する遊離ＰＳＡの３つの個々の型、すなわち、ｉｎＰＳＡ、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡの間の非線形と非自明な関係を説明する。この関係は、実験的に発見された。したがって、本発明は、ｉｎＰＳＡ、ｐＰＳＡおよびＢＰＳＡのレベルと、特に、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡとｉｎＰＳＡとの比または減算の結果とを決定することによって、前立腺癌の検出を補助する手段を提供する。

ｐＰＳＡで除算されたｉｎＰＳＡと、ｐＰＳＡを減算したｉｎＰＳＡとは、遊離ＰＳＡの百分率が非常に高い全ＰＳＡの特定のサブ集団では、著しく高い癌予測値を有する。ｉｎＰＳＡとｐＰＳＡとの関係は、遊離ＰＳＡの百分率が２０％を超え、特に、２５％を超える男性における癌の出てを改善する。

本発明の実施態様によると、前記全ＰＳＡは、２０ｎｇ／ｍＬ未満、より好ましくは１０ｎｇ／ｍＬ未満、最も好ましくは２．５ないし１０ｎｇ／ｍＬの範囲内のいずれかの濃度の場合がある。本発明の１つの好ましい実施態様では、前記全ＰＳＡは２．５ないし４ｎｇ／ｍＬである。別の好ましい実施態様では、前記全ＰＳＡは４ないし１０ｎｇ／ｍＬの範囲内である。全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比は、患者の血清に典型的にみられる、１％から５０％までのいずれか遊離ＰＳＡの範囲であってもかまわないが、本発明の１つの実施態様では、好ましい遊離ＰＳＡの範囲は２０％を超え、最も好ましくは２５％を超える。特定の実施態様では、前記全ＰＳＡは、４ないし１０ｎｇ／ｍＬの範囲内で、遊離ＰＳＡの比は２０％または２５％を超える範囲内である。前記ｐＰＳＡは、［−２］ｐＰＳＡ、［−４］ｐＰＳＡ、［−５，−７］ｐＰＳＡまたはこれら３つのネイティブ型および短縮型ｐＰＳＡの合計の場合がある。前記ｉｎＰＳＡは、ｐＰＳＡで除算されたｉｎＰＳＡまたはｐＰＳＡで減算されたｉｎＰＳＡと同じくらい、血清中のｎｇ／ｍＬのｉｎＰＳＡ濃度で表現されるのが好ましい。前記試料はいずれの生理的液体でもかまわないが、血清または血漿が好ましい。

本発明の目的のためには、患者の試料中に検出される、ｉｎＰＳＡ単独の量と、全ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、ｐＰＳＡおよびＢＰＳＡとの組み合わせでのｉｎＰＳＡの量とは、前立腺癌の存在を決定する診断値を精製するいずれかの方法で、前立腺癌の存在と関係づけられる場合がある。本発明の実施態様によると、ｉｎＰＳＡ量か、全ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、ＢＰＳＡまたはｐＰＳＡとの数学的な組み合わせかが、前立腺癌の存在を決定するための予め定められた値と比較される。本発明の開示内容を考慮して、当業者は、ルーティン化した実験を通して「予め定められた判断値（ｃｕｔｏｆｆｖａｌｕｅ）」（あるいは閾値）か、前記ｉｎＰＳＡのレベルを前立腺癌の存在を決定するために用いることを可能にするために必要なその他のパラメータかを容易に決定することができる。例えば、前立腺癌と診断された個人のｉｎＰＳＡの上記の比を、前立腺癌でないか、ＢＰＨである個人の上記の比と比較して、前記判断値を決定する場合がある。受信者操作特性（ＲＯＣ）解析が、必要な特異度および感度を有する判断値を決定するために用いることができる。ＲＯＣ解析は当業者に知られており、文献２２に詳細に説明されており（文献２２）、その関連する内容は引用によりここに取り込まれる。そして、試料のｉｎＰＳＡの数学的組み合わせまたは量が、前記ＲＯＣ解析から決定された、被検者での前立腺癌の存在を決定するための予め定められた判断値と比較される場合があるが、前記ＲＯＣではｉｎＰＳＡの高いレベルまたは低いレベルか、他のＰＳＡの型とのｉｎＰＳＡの数学的な組み合わせが、前立腺癌の指標となる場合がある。当業者は、ＲＯＣ解析に基づいて、前記高いレベルまたは低いレベルが前立腺癌の指標であるかどうかを本発明の開示内容を考慮して決定することができるであろう。必要とされる特異度および感度を有する判断値を決定するこれおよびその他の方法は、当業者に周知で、繰り返す必要はない（文献２３−２９）。

本発明は以下の実施例を参照してさらに説明される。

４ないし１０ｎｇ／ｍＬの全ＰＳＡを含む癌および良性疾患の男性の血清の解析
材料と方法
ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡに対するモノクローナル抗体の開発
［−２］ｐＰＳＡ、［−４］ｐＰＳＡ、［−５，−７］ｐＰＳＡおよびＢＰＳＡに対するモノクローナル抗体は既に記載された（文献１２−１６）。［−７］ｐＰＳＡのモノクローナル抗体はｐＰＳＡの［−５］ｐＰＳＡ型も認識する。これらの実施例の目的のためには、［−７］ｐＰＳＡという用語は［−５］ｐＰＳＡおよび［−７］ｐＰＳＡの両方を意味する。ｐＰＳＡという用語は、［−２］ｐＰＳＡと［−４］ｐＰＳＡと［−５］ｐＰＳＡと［−７］ｐＰＳＡとの和を意味する。

ＰＳＡの免疫アッセイ
血清中のＰＳＡと、精製標品との濃度は、Ｔａｎｄｅｍ（登録商標）−ＭＰＰＳＡおよびＴａｎｄｅｍ（登録商標）−ＭＰ遊離ＰＳＡアッセイ（ハイブリテク、カリフォルニア州、サンジエゴ、ベックマン・コールター、カリフォルニア州、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ）によって決定された。

［−２］ｐＰＳＡと［−４］ｐＰＳＡと［−５，−７］ｐＰＳＡとの免疫アッセイ
発明者が前記ｐＰＳＡの型の測定用に開発した免疫アッセイは以下のとおりである。Ｔａｎｄｅｍ（登録商標）ＰＳＡｚｅｒｏｃａｌ希釈液中の５μｇ／ｍｌビオチン化抗ＰＳＡ抗体ＰＳＭ７７３の５０μＬが、ＥＧ＆ＧＷａｌｌａｃのストレプトアビジンでコーティングされたマイクロプレートに添加され、室温で振盪しながら１時間反応させられた。それから前記プレートはＴａｎｄｅｍ（登録商標）Ｅ洗浄液で５回洗浄された。つぎに、５０μＬのＴａｎｄｅｍ（登録商標）ＰＳＡｚｅｒｏｃａｌ希釈液が前記プレートに添加された後、５０μＬのテストされるべき血清または抗原が添加された。混合液は室温で２時間上記のとおり反応させられる。それから、前記プレートはＴａｎｄｅｍ（登録商標）Ｅ洗浄液で５回洗浄された。ｐＰＳＡのそれぞれの型の所期の決定用の適当なユーロピウム標識検出モノクローナル抗体のＩｍＡ溶液１００μＬが前記プレートに添加される。［−２］ｐＰＳＡについてはＰＳ２Ｘ３７３で、［−４］ｐＰＳＡについてはＰＳ２Ｖ４１１で、［−５，−７］ｐＰＳＡについてはＰＳ２Ｐ３０９である。前記混合液は室温で１時間上記のとおり反応させられる。その後、前記プレートはＴａｎｄｅｍ（登録商標）Ｅ洗浄液で５回洗浄され、ＥＧ＆ＧＷａｌｌａｃＶｉｃｔｏｒ装置で読みとられた。

ＢＰＳＡの免疫アッセイ
ＢＰＳＡアッセイプロトコールは以下のとおりである。ビオチン化捕捉抗ＰＳＡモノクローナル抗体であるＰＳＭ７７３（１００μＬ、０．２５ｍｇ／Ｌ）が、ストレプトアビジン・マイクロプレート中で１時間振盪しながらインキュベーションされた。前記プレートは、ブロッキング・バッファー（５０μＬ）で洗浄され、その後較正用対照または試料のいずれか５０μＬを添加して、２時間振盪しながらインキュベーションした。前記プレートは洗浄され、アルカリフォスファターゼ標識抗ＢＰＳＡモノクローナル抗体ＰＳ２Ｅ２９０が添加され（２μｇ／ｍｌ、１００μＬ）、１時間振盪しながらインキュベーションされた。前記プレートは洗浄され、１００μＬの４−メチルウンベリフェリルリン酸が添加され、５分間振盪しながらインキュベーションされた。前記プレートは、５、６０および１２０分経過時に読み取られた。比蛍光が１２３４Ｄｅｌｆｉａ研究用蛍光分光光度計（Ｗａｌｌａｃ，ＥＧ＆Ｇ）で測定された。

受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線解析
ＲＯＣ解析およびグラフはＭｅｄＣａｌｃソフトウェアプログラム（ＭｅｄＣａｌｃＳｏｆｔｗａｒｅ、ベルギー、（ｉｎｆｏ＠ｍｅｄｃａｌｃ．ｂｅ））を用いて作成された。理論と実際は、ＺｗｉｅｇおよびＣａｍｐｂｅｌｌ、Ｒｅｃｅｉｖｅｒ−ｏｐｅｒａｔｉｎｇｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ（ＲＯＣ）：ａｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｅｖａｌｕａｔｉｏｎｔｏｏｌｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｍｅｄｉｃｉｎｅ、ＣｌｉｎｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｏｙ、３９、５６１−５７７、１９９３に説明されている。

結果
全ＰＳＡが４−１０ｎｇ／ｍＬの癌の血清中での個々の遊離ＰＳＡの型である、ＢＰＳＡ、ｐＰＳＡおよびｉｎＰＳＡの典型的な平均比率は、図１に示す。個々のｐＰＳＡおよびＢＰＳＡ試料は、前記遊離ＰＳＡの０％から７０％を超えるまでの範囲の場合がある。これは、個々の遊離ＰＳＡの型はそれぞれかなりの割合だが変動する場合があることを証明し、ｉｎＰＳＡ単独と、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡとの組み合わせでのｉｎＰＳＡとは癌の血清の検出を改善できるユニークは血清のプロフィールを表すことを示すデータを支持する。ＲＯＣ曲線および解析は、全ＰＳＡが２ないし１０ｎｇ／ｍＬの範囲内で、癌および良性疾患の診断がされた、約１１００例の血清試料について実施された。遊離ＰＳＡの値は、それぞれの試料について測定された。ＢＰＳＡと、個々のｐＰＳＡの型である、［−２］ｐＰＳＡ、［−４］ｐＰＳＡおよび［−５，−７］ｐＰＳＡとが各試料で測定された。特記されないかぎり、ｐＰＳＡはｐＰＳＡの３つの型の全ての和を示す。前記ｉｎＰＳＡはＢＰＳＡおよびｐＰＳＡを減算された遊離ＰＳＡとして計算された。

各ＰＳＡアイソフォームについての値は、ＲＯＣ曲線解析を作成するためにＭｅｄＣａｌｃプログラムに入力された。ＲＯＣは、コホートにおける各試料について癌の陽性および陰性の予測値を割り当てる統計的方法で、癌の予測方法としてのＰＳＡおよび遊離ＰＳＡのアッセイの価値および性能を評価するための最も広範に用いられる方法である。最も簡単に述べると、各ＲＯＣ解析について曲線下面積ＡＵＣがアッセイの予測値を評価するために用いられる。ＡＵＣ値が高いほど、全体の予測値が良いことを示す。ＲＯＣ値は０．５（ランダムな偶然からの改善なし）から、１．０（予測値１００％の完璧なアッセイ）までの範囲にある。前記ＲＯＣ曲線の内部標識は以下のとおりである。Ｔ＝全ＰＳＡ、Ｆ＝遊離ＰＳＡ、ｉ＝ｉｎＰＳＡ；Ｂ＝ＢＰＳＡ；Ｐ＝ｐＰＳＡ：２ｐ＝［−２］ｐＰＳＡ。例えば、等式（ｉ−Ｐ）／Ｔは、ｐＰＳＡを減算したｉｎＰＳＡを全ＰＳＡで除算したものに等しい。

たいていの場合では、ＲＯＣ解析の目的は、癌である男性の鑑別を最大化し、癌でない男性、すなわち偽陽性の生検を最少にすることである。血清中のＰＳＡのような生物学的試料を解析するとき、真陽性および偽陽性の検出の間にバランスがある。例えば所望の結果に応じて、癌の９５％を検出することが最も望ましい場合があり、この場合には良性疾患の男性についての偽陽性が高いことを伴うことが避けられない。例えば遊離ＰＳＡの百分率の場合には、癌の９５％を検出するためには、遊離ＰＳＡが２５％未満の全ての男性の生検を必要とする。しかしこれは、８０％の偽陽性の割合を伴う。これらの仮定の例は、ＲＯＣ解析の評価および価値が絶対的なものではなく、ｉｎＰＳＡについての本発明の場合では、実際に用いられる正確なパラメーターを確立するためのルーティン化した実験を必要とすることを証明するためのものである。しかし本発明の開示内容を考慮すると、当業者は過度の実験を要することなく必要なパラメーターを容易に決定できるはずである。以下の実施例は、一定の基準の下で一定集団での癌の検出におけるｉｎＰＳＡと、ｐＰＳＡおよびＢＰＳＡと組み合わされたｉｎＰＳＡと、ＢＰＳＡと組み合わされたｐＰＳＡとの価値および有効性を証明することを目的とするが、ｐＰＳＡの使用および判断値はこれらの実施例に限定されない。

図２は、血清中のｎｇ／ｍＬで表された全ＰＳＡ、ｉｎＰＳＡ、ＢＰＳＡおよび遊離ＰＳＡについてのＲＯＣ曲線を重ね合わされたものを示す。ｉｎＰＳＡは最大の曲線下面積（ＡＵＣ）を有し、これは、ｉｎＰＳＡが他のパラメータよりもうまく良性疾患から癌を鑑別することを示す。ＰＳＡ試験の分野では、４−１０ｎｇ／ｍＬの全ＰＳＡの初期癌検出範囲においては遊離ＰＳＡの百分率は全ＰＳＡに比べて癌検出が改善することが知られている。遊離ＰＳＡの百分率、すなわち、Ｆ／Ｔは癌についての最良の診断ＰＳＡ試験であることが証明されており、新規な試験を判定する基準と考えられている。図３は、ｉｎＰＳＡの百分率（ｉｎＰＳＡ／全ＰＳＡ）が遊離ＰＳＡの百分率より優れていることを示す。図４は、遊離ＰＳＡとの比としてのｉｎＰＳＡは、全ＰＳＡとの値として表現された遊離ＰＳＡに比肩することを示す。これらの例は、ｉｎＰＳＡと、遊離ＰＳＡまたは全ＰＳＡとの比としてのｉｎＰＳＡとは、全ＰＳＡまたは遊離ＰＳＡ単独よりも優れた癌検出をすることを示す。

図５−８は、他の遊離ＰＳＡの型とｉｎＰＳＡのさまざまな数学的な組み合わせが、ｉｎＰＳＡ単独よりももっと癌検出を改善することができることを示す。図５は、ｉｎＰＳＡ／ｐＰＳＡは、ｉｎＰＳＡ単独と比肩できるが、遊離ＰＳＡよりもよいことを示す。図６は、ｉｎＰＳＡ、ｐＰＳＡおよびＢＰＳＡの互いに可能なさまざまな組み合わせを示す。ＢＰＳＡを加算したｉｎＰＳＡが最高のＡＵＣ、したがって最高の癌検出を示し、ｐＰＳＡを加算したｉｎＰＳＡはやや劣り、ｐＰＳＡを加算したＢＰＳＡがこの組み合わせの中では最悪の成績であった。図７は、互いから減算したｐＰＳＡ、ＢＰＳＡおよびｉｎＰＳＡの可能なさまざまな組み合わせを示す。これらの数学的作図によって得られた値は、前記アッセイ方法のいずれか自体によって還元されたり測定されたいすることはできない。全てが遊離ＰＳＡまたは全ＰＳＡよりも癌検出を改善する著しいＡＵＣを示す。図８は、ｐＰＳＡを減算したｉｎＰＳＡの遊離ＰＳＡおよび全ＰＳＡとのさまざまな比を
示す。ｐＰＳＡを減算したｉｎＰＳＡの全ＰＳＡとの比を用いることは、ｐＰＳＡを減算したｉｎＰＳＡ単独よりもＲＯＣを改善する。図５−８のそれぞれのＲＯＣの例は、ｉｎＰＳＡ、ｐＰＳＡおよびＢＰＳＡのさまざまな組み合わせおよび比が、ＲＯＣ解析において、著しいＡＵＣを提供し、遊離ＰＳＡおよび全ＰＳＡ単独よりも癌検出を改善できることを証明する。

図９は、ｉｎＰＳＡを用いる改善された癌検出の１つの追加例を示す。この場合では、遊離ＰＳＡの百分率が上昇した前立腺癌の男性を調べた。この図では、２５％を超える遊離ＰＳＡの男性だけが分析された。真にランダムなスクリーニング集団では、癌がみつかる確率はたった約８％しかないため、２５％を超える遊離ＰＳＡの男性は癌のための生検をすることは推奨されない。したがって、このグループでの癌を予測するルーティン化した血液検査がないため、このグループの男性における癌は正常の状況では検出されないままになる傾向がある。図９は、ｉｎＰＳＡ／全ＰＳＡと、ｉｎＰＳＡ／［−２］ｐＰＳＡがこのグループにおける癌予測値を非常に増大させることを示す。ｉｎＰＳＡは遊離ＰＳＡの百分率の特定の範囲または判断値において選択的な癌予測を示すであろうことは予想外であった。

２．５ないし４ｎｇ／ｍＬの全ＰＳＡを含む癌および良性疾患の男性の血清の分析
実施例１と同じ一連のＰＳＡアッセイが、２．５−４ｎｇ／ｍＬの全ＰＳＡ値を有する患者のこのコホートにおいて測定された。２．５−４ｎｇ／ｍＬの範囲は、多くの癌が存在するがランダムなスクリーニング集団では４−１０ｎｇ／ｍＬの患者よりも発生頻度が低い領域である。全ＰＳＡはこの範囲では癌を鑑別しないので、この範囲での癌検出を改善するためにＦの百分率を用いる現在までの試みは診断上の価値を示していなかった。

図１０および１１は、２２．５−４ｎｇ／ｍＬの範囲内でのｉｎＰＳＡは、遊離型のＰＳＡよりも前立腺癌のよい予測指標であることを示す。図１０では、ｉｎＰＳＡ／ｐＰＳＡと、ｐＰＳＡを減算したｉｎＰＳＡとは、癌の陽性鑑別を示す同様のＡＵＣになるが、Ｆ／Ｔは、ほとんど全く癌の鑑別を示さなかった。図１１では、ｉｎＰＳＡ／［−２］ｐＰＳＡが陽性の癌鑑別を示すが、遊離ＰＳＡはほとんどあるいは全く癌鑑別を示さなかった。

これらの例は、全ＰＳＡが４ｎｇ／ｍＬ未満のときには、前記ｉｎＰＳＡは陽性の前立腺癌鑑別を示すが、正常のパラメータである遊離ＰＳＡおよび全ＰＳＡは、良性疾患から癌を鑑別しないことを示す。

２．５ないし１０ｎｇ／ｍＬの全ＰＳＡを含む癌および良性疾患の男性の血清の分析
前立腺癌の初期検出のための現在までのＰＳＡ範囲は、４−１０ｎｇ／ｍＬである。この範囲のＰＳＡの男性は、癌が存在するか否かを決定するために整形を受けることが推奨されている。ＰＳＡの判断値を４ｎｇ／ｍＬ未満に、できれば、２．５ｎｇ／ｍＬまで下げるべきか否か臨床文献では議論がある。かかる場合、他の改善された試験が利用できないかぎり、現在の診断指標のＰＳＡおよび遊離ＰＳＡが生検を推奨するために用いられる。

図１２および１３では、ｉｎＰＳＡが２．５ないし１０ｎｇ／ｍＬの全範囲にわたって、現在のアッセイよりも癌検出を改善するために用いることができる。図１２では、ｉｎＰＳＡ／ｐＰＳＡがＦ／Ｔよりも癌検出を改善する。図１３では、ｐＰＳＡを減算したｉｎＰＳＡがＦ／Ｔよりもさらに改善を示す。Ｆ／Ｔは今日用いられる最良のＰＳＡの診断マーカーであるため、これは、ｉｎＰＳＡが癌鑑別の著しい可能性を有することを示す。

ｉｎＰＳＡの精製方法およびｉｎＰＳＡ抗体の作成方法
方法Ｉ：精漿と血清との試験管内インキュベーション後のｉｎＰＳＡの精製
精漿１０ｍＬが５０ｍＬの女性の血清と３時間３７°Ｃでインキュベーションされた。この混合液はＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７）で１：２に希釈され、０．２ミクロン膜フィルターでろ過され、モノクローナル抗体ＰＳＭ７７３を含む免疫アフィニティカラムに適用された。ＰＳＭ７７３は既に遊離ＰＳＡの全ての型と、ＡＣＴと複合体を形成したＰＳＡとに結合することが示されている。前記免疫アフィニティカラムから溶出されたＰＳＡはつぎにＳ１２サイズ排除カラムに適用され、〜３３ｋＤａとして溶出する遊離ＰＳＡが回収された。精製された不活性ＰＳＡは２５ｍＭＭｅｓ（２−［モルフォリノ］エタンスルホン酸）と、４０％アセトニトリルｐＨ５．６とからなるバッファー（バッファーＡ）に透析され、バッファーＡで平衡化された０．８ｘ５ｃｍのＭＡ７Ｓ陽イオン交換カラム（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）に適用された。ＰＳＡの複数の型が、４００ｍＭ酢酸ナトリウムと、４０％アセトニトリル、ｐＨ７．０からなるバッファーＢで図１４に示す勾配を用いて溶出された。図１４からのピークが回収され、ＰＢＳに対して透析され、濃縮され、２−メルカプトエタノール入りの還元条件下で４−１８％の勾配のポリアクリルアミドゲルに適用された。タンパク質は標準条件下でクーマジー・ブルーで染色された。

方法ＩＩ：精漿の血清との試験管内インキュベーション後のｉｎＰＳＡの免疫アフィニティ精製
１０ｍＬの精漿が５０ｍＬの女性の血清と３７°Ｃ３時間インキュベーションされた。この混合液はＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７）で１：２に希釈され、０．２μ膜フィルターでろ過され、モノクローナル抗体ＰＳＭ７７３を含む免疫アフィニティカラムに適用された。ＰＳＭ７７３は既に遊離ＰＳＡの全ての型と、ＡＣＴと複合体を形成したＰＳＡとに結合することが示されている。前記免疫アフィニティカラムから溶出されたＰＳＡはつぎにＳ１２サイズ排除カラムに適用され、〜３３ｋＤａとして溶出する遊離ＰＳＡが回収された。精製された不活性ＰＳＡはＰＢＳに対して透析され、ＰＳ２Ｐ３０９、ＰＳ２Ｐ４４６、ＰＳ２Ｘ０９４、ＰＳ２Ｘ３７３、ＰＳ２Ｖ４１１およびＰＳ２Ｖ４７６のリストから選択される抗体の組み合わせを含む免疫アフィニティカラムに適用され、これらのｐＰＳＡ型のＰＳＡを除去した。フロースルー分画はモノクローナル抗体ＰＳ２Ｅ２９０および／またはＰＳ２Ｅ０５５を含む免疫アフィニティカラムに適用され、溶液からＢＰＳＡを除去した。フロースルー分画はＢＰＳＡおよびｐＰＳＡを含まない遊離ＰＳＡである、ｉｎＰＳＡを含む。

ｉｎＰＳＡに対するモノクローナル抗体の調製
精製されたｉｎＰＳＡは、マウスに注射して腹水中の抗体が組織培養およびスクリーニングの標準的な技術を用いてｉｎＰＳＡに対する反応性についてテストされた（文献２１）。これは、抗原寛容誘導（ａｎｔｉｇｅｎｔｏｌｅｒｉｚａｔｉｏｎ）の技術と、優勢なＰＳＡエピトープに対する応答を最小にするための抗ＰＳＡブロッキング抗体のｉｎＰＳＡへの使用とを含ま。スクリーニングの目的のために、前記抗体はＰＳＡ−ＡＣＴ複合体から解離されたＰＳＡに対してスクリーニングされた。穏やかな化学的処理で、活性のあるネイティブＰＳＡがＰＳＡ−ＡＣＴ複合体から解離され、このＰＳＡは精漿ＰＳＡと全ての点で正常に見えることが知られている（文献８）。ｉｎＰＳＡのスクリーニングに用いられる活性ＰＳＡは活性ＰＳＡの特性とは異なるｉｎＰＳＡの特性を認識する抗体を選択する。

考察
これらの実施例は、遊離ＰＳＡのｉｎＰＳＡアイソフォームが遊離ＰＳＡと比べて独立したマーカーとして作用することを示す。これは、現在関心のある診断ＰＳＡ範囲である２．５−１０ｎｇ／ｍＬを通じて正しい。これらのｉｎＰＳＡについての知見は、遊離ＰＳＡの型についての現在までの理解を拡大する。ｐＰＳＡの型が患者集団での癌検出を改善することが同時係属中の１９９９年４月３０日に出願した米国特許出願第０９／３０２，９６５号（該出願は、１９９７年４月３０日出願の米国特許出願第０８／８４６，４０８号の一部継続出願の１９９９年２月１７日出願の米国特許出願第０９／２５１，６８６号のさらに一部継続出願である。）の明細書で既に示された。癌検出を改善するためのＢＰＳＡについての特許（米国特許出願第０９／３０３，２０８号）と、ｐＰＳＡに対するＢＰＳＡの比についての特許（米国特許出願第０９／３０３，３３９号）は発行され、それらの内容は引用によりここにそれらの全体が取り込まれる。

ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡが癌検出を改善する特異的な特性を有することが最初に考えられたが、血清中の残りの遊離ＰＳＡであるｉｎＰＳＡが独立な診断特性を示すことは予想外であった。ＢＰＳＡ、ｐＰＳＡおよびｉｎＰＳＡを用いるさまざまなアルゴリズムで癌検出を改善することの発見は、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡアッセイで十分な癌および良性疾患の試料を測定し、データを解析したときにのみ明らかになった。したがって、最終的な分析で、ｐＰＳＡ、ＢＰＳＡおよびｉｎＰＳＡの個々の型は、個別的と、互いの組み合わせとの両方で、全ＰＳＡおよび遊離ＰＳＡよりも前立腺癌の検出を著しく改善することを示した。

これらの新規知見は、血清中のｐＰＳＡ、ＢＰＳＡおよびｉｎＰＳＡの間に複雑な関係があることを示唆する。ｉｎＰＳＡの決定は、癌検出を改善し、不必要な生検を減らすために、早期診断範囲の２−１０ｎｇ／ｍＬのＰＳＡを通じて適用できる。前記結果の項に示した例は、ｉｎＰＳＡと、ｐＰＳＡおよびＢＰＳＡとの組み合わせでのｉｎＰＳＡの前立腺癌検出に向けた適用可能性を証明することを目的とするものであって、かかる関連する実施例の一部を示唆するが、これらの実施例はＰＳＡ、遊離ＰＳＡの百分率または、ｐＰＳＡ、ＢＰＳＡおよびｉｎＰＳＡの組み合わせの異なる範囲での他の適用の可能性を限定することを目的とするものではない。

文献表
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２８．Ｓｏｌｂｅｒｇ、Ｈ．Ｅ．１９７８．Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．、９：２０９−４２．
２９．Ｍａｔｔｈｅｗｓ、Ｊ．Ｎ．Ｓ．、Ａｌｔｍａｎ、Ｄ．Ｇ．、Ｃａｍｐｂｅｌｌ、Ｍ．Ｊ．、Ｒｏｙｓｔｏｎ、Ｐ．１９９０．Ａｎａｌｙｓｉｓｏｆｓｅｒｉａｌｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓｉｎｍｅｄｉｃａｌｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｂｒ．Ｍｅｄ．Ｊ．、３００：２３０−５．

癌の血清中のｐＰＳＡ、ＢＰＳＡおよびｉｎＰＳＡの典型的な構成比率を示すグラフ。４−１０ｎｇ／ｍＬの全血清ＰＳＡで、癌またはＢＰＨを有する男性における、遊離ＰＳＡ（Ｆ）、全ＰＳＡ（Ｔ）、ｉｎＰＳＡ（ｉ）、ｐＰＳＡ（Ｐ）およびＢＰＳＡ（Ｂ）を比較した受信者操作特性（ＲＯＣ）解析結果を重ね合わせたグラフ。４−１０ｎｇ／ｍＬの全血清ＰＳＡで、癌またはＢＰＨを有する男性における、遊離ＰＳＡ／全ＰＳＡ、ｉｎＰＳＡ／全ＰＳＡおよびＢＰＳＡ／全ＰＳＡのＲＯＣ解析結果のグラフ。４−１０ｎｇ／ｍＬの全血清ＰＳＡで、癌またはＢＰＨを有する男性における、ｉｎＰＳＡ／遊離ＰＳＡおよびｐＰＳＡ／遊離ＰＳＡのＲＯＣ解析結果のグラフ。４−１０ｎｇ／ｍＬの全血清ＰＳＡで、癌またはＢＰＨを有する男性における、ｉｎＰＳＡ、ｉｎＰＳＡ／ｐＰＳＡおよび遊離ＰＳＡのＲＯＣ解析結果のグラフ。４−１０ｎｇ／ｍＬの全血清ＰＳＡで、癌またはＢＰＨを有する男性における、ｐＰＳＡ＋ｉｎＰＳＡ、ｐＰＳＡ＋ＢＰＳＡ、ＢＰＳＡ＋ｉｎＰＳＡのＲＯＣ解析結果のグラフ。４−１０ｎｇ／ｍＬの全血清ＰＳＡで、癌またはＢＰＨを有する男性における、ｐＰＳＡ−ＢＰＳＡ、ｉｎＰＳＡ−ＢＰＳＡおよびｉｎＰＳＡ−ｐＰＳＡのＲＯＣ解析結果のグラフ。４−１０ｎｇ／ｍＬの全血清ＰＳＡで、癌またはＢＰＨを有する男性における、ｉｎＰＳＡ−ｐＰＳＡ、（ｉｎＰＳＡ−ｐＰＳＡ）／全ＰＳＡおよび（ｉｎＰＳＡ−ｐＰＳＡ）／遊離ＰＳＡのＲＯＣ解析結果のグラフ。４−１０ｎｇ／ｍＬの全血清ＰＳＡで、癌またはＢＰＨを有する男性における、ｉｎＰＳＡ／ｐＰＳＡおよびｉｎＰＳＡ／［−２］ｐＰＳＡのＲＯＣ解析結果のグラフ。２．５−４ｎｇ／ｍＬの全血清ＰＳＡで、癌またはＢＰＨを有する男性における、ｉｎＰＳＡ／ｐＰＳＡ、ｉｎＰＳＡ−ｐＰＳＡおよび遊離ＰＳＡ／全ＰＳＡのＲＯＣ解析結果のグラフ。２．５−４ｎｇ／ｍＬの全血清ＰＳＡで、癌またはＢＰＨを有する男性における、遊離ＰＳＡおよびｉｎＰＳＡ／［−２］ｐＰＳＡのＲＯＣ解析結果のグラフ。２．５−１０ｎｇ／ｍＬの全血清ＰＳＡで、癌またはＢＰＨを有する男性における、遊離ＰＳＡ／全ＰＳＡおよびｉｎＰＳＡ／ｐＰＳＡのＲＯＣ解析結果のグラフ。２．５−１０ｎｇ／ｍＬの全血清ＰＳＡで、癌またはＢＰＨを有する男性における、遊離ＰＳＡ／全ＰＳＡおよびｉｎＰＳＡ−ｐＰＳＡのＲＯＣ解析結果のグラフ。不活性精漿ＰＳＡの全ての型の陽イオン交換クロマトグラフィーのプロフィールを示すグラフ。レーン１は不活性精漿ＰＳＡの全ての型を含む精製開始材料で、レーン２は精製された無傷で非ネイティブなＰＳＡを含む図１４のピークから精製されたｉｎＰＳＡである、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの泳動結果図。成熟ＰＳＡの完全なアミノ酸配列を示す図。

Claims

被検者における前立腺癌の良性疾患からの鑑別を補助する方法であって、
（ａ）前記被検者由来の生物学的試料に含まれる全ＰＳＡ量を決定するステップと、
（ｂ）前記試料中の遊離ＰＳＡ量を決定し、該遊離ＰＳＡの前記全ＰＳＡに対する比を計算するステップと、
（ｃ）前記試料中のｉｎＰＳＡ量を決定するステップと、
（ｄ）前記全ＰＳＡのレベルと、前記全ＰＳＡに対する前記遊離ＰＳＡの比との両方に基づいて癌および良性疾患の診断が知られた対照試料で確立された予め定められた値と、前記ｉｎＰＳＡ量とを比較することによって、前記試料中に含まれるｉｎＰＳＡ量を前記被検者における前立腺癌の存在と関係付けるステップとを含む、被検者における前立腺癌の良性疾患からの鑑別を補助する方法。
前記ステップ（ｃ）は、
（ｉ）前記生物学的試料中に含まれるＢＰＳＡおよびｐＰＳＡをブロッキングするのに十分な量の、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡに対するモノクローナル抗体を前記試料に添加するステップと、
（ｉｉ）前記試料中のｉｎＰＳＡ量である前記試料中の遊離ＰＳＡ量を決定するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
前記ステップ（ｃ）は、
（ｉ）ｐＰＳＡ量を決定するステップと、
（ｉｉ）ＢＰＳＡ量を決定するステップと、
（ｉｉｉ）ｐＰＳＡおよびＢＰＳＡの量を減算した遊離ＰＳＡ量としてｉｎＰＳＡ量を決定するステップとを含む、請求項１に記載の方法。
前記関係づけるステップは、全ＰＳＡレベルと、遊離ＰＳＡの比との両方に基づいて癌および良性疾患の診断が知られた対照試料で確立された予め定められた値と、前記ｐＰＳＡ量とを比較することによって、前記試料中に含まれる全ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、ＢＰＳＡまたはｐＰＳＡとｉｎＰＳＡとの数学的な組み合わせを前記被検者における前立腺癌の存在と関係づけるステップである、請求項３に記載の方法。
前記数学的組み合わせは、ｉｎＰＳＡ、ＢＰＳＡ、ｐＰＳＡ、全ＰＳＡおよび遊離ＰＳＡの間の加算、減算および除算を含む、請求項４に記載の方法。
前記数学的組み合わせは、ＢＰＳＡおよびｐＰＳＡと、ｉｎＰＳＡとの数学的組み合わせである、請求項４に記載の方法。
前記数学的組み合わせは、ｐＰＳＡに対するｉｎＰＳＡの比である、請求項４に記載の方法。
前記ｐＰＳＡは、［−２］ｐＰＳＡ、［−４］ｐＰＳＡ、［−５］ｐＰＳＡおよび［−７］ｐＰＳＡからなるグループから選択される、請求項４に記載の方法。
前記数学的組み合わせは、全ＰＳＡに対するｉｎＰＳＡの比である、請求項４に記載の方法。
前記数学的組み合わせは、遊離ＰＳＡに対するｉｎＰＳＡの比である、請求項４に記載の方法。
前記数学的組み合わせは、ｐＰＳＡを減算したｉｎＰＳＡである、請求項４に記載の方法。
前記数学的組み合わせは、全ＰＳＡに対する、ｐＰＳＡを減算したｉｎＰＳＡの比である、請求項４に記載の方法。
前記数学的組み合わせは、遊離ＰＳＡに対する、ｐＰＳＡを減算したｉｎＰＳＡの比である、請求項４に記載の方法。
前記数学的組み合わせは、ｐＰＳＡを加算したｉｎＰＳＡである。請求項４に記載の方法。
前記数学的組み合わせは、全ＰＳＡに対する、ｐＰＳＡを加算したｉｎＰＳＡの比である、請求項４に記載の方法。
前記数学的組み合わせは、遊離ＰＳＡに対する、ｐＰＳＡを加算したｉｎＰＳＡの比である、請求項４に記載の方法。
前記数学的組み合わせは、ＢＰＳＡを減算したｉｎＰＳＡである、請求項４に記載の方法。
前記数学的組み合わせは、ＢＰＳＡを加算したｉｎＰＳＡである、請求項４に記載の方法。
前記数学的組み合わせは、全ＰＳＡまたは遊離ＰＳＡに対する、ＢＰＳＡを加算または減算したｉｎＰＳＡの比である、請求項１に記載の方法。
前記全ＰＳＡは２．５ないし１０ｎｇ／ｍＬで、前記全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比は２０％を超え、前記予め定められた値より上の前記ｉｎＰＳＡ量が前立腺癌が存在することの指標である、請求項１に記載の方法。
前記ＰＳＡは、４ないし１０ｎｇ／ｍＬである、請求項２０に記載の方法。
前記全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比は２５％を超える、請求項２０に記載の方法。
前記全ＰＳＡは２．５ないし１０ｎｇ／ｍＬで、前記全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比は、５％と２５％との間の割合から選択され、前記予め定められた値より上か下かである前記ｉｎＰＳＡ量が前立腺癌が存在することの指標である、請求項１に記載の方法。
前記全ＰＳＡは４ないし１０ｎｇ／ｍＬである、請求項２３に記載の方法。
前記全血清ＰＳＡは、２．５ないし４ｎｇ／ｍＬである、請求項２３に記載の方法。
前記全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比は、５％と２５％との間の割合から選択される、請求項２３に記載の方法。
前記全ＰＳＡは、１．０から１０ｎｇ／ｍＬまでの濃度のいずれかの組み合わせから選択される範囲にある、請求項１に記載の方法。
前記全ＰＳＡは約２０ｎｇ／ｍＬ未満である、請求項１に記載の方法。
前記全ＰＳＡは１０ｎｇ／ｍＬ未満である、請求項１に記載の方法。
前記全ＰＳＡは約２．５ないし１０ｎｇ／ｍＬの範囲内にある、請求項１に記載の方法。
前記全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比は、１ないし５０％の範囲内にある、請求項１に記載の方法。
前記全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比は２０％を超える、請求項１に記載の方法。
前記全ＰＳＡに対する遊離ＰＳＡの比は２５％を超える、請求項１に記載の方法。
前記被検者はヒトである、請求項１に記載の方法。
前記試料は生理的液体である、請求項１に記載の方法。
前記生理的液体は、血清、血液または血漿である、請求項１３に記載の方法。
前記ｐＰＳＡは、［−２］ｐＰＳＡと、［−４］ｐＰＳＡと、［−５，−７］ｐＰＳＡと、これらの短縮型と、これらのいずれかの組み合わせとから選択される、請求項２に記載の方法。
前記数学的組み合わせは、ｐＰＳＡを減算したＢＰＳＡである、請求項５に記載の方法。