【発明の詳細な説明】
生物学的液体中の ＰＳＡ−α２−マクログロブリン複合体の検出 発明の背景
前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）は、摂護腺の上皮細胞により分泌されるカリクレ
イン様セリンプロテアーゼである。これは、前立腺液中に存在する主要タンパク
質のうちの一つである。低レベルのＰＳＡが全ての男性に検出されるけれども、
血液循環におけるＰＳＡの生理的機能はまだ明らかではない。摂護腺の解剖学的
構造が変化することにより、ＰＳＡが血液循環中に拡散するのかもしれない。血
清中の高ＰＳＡ濃度は、良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺炎および前立腺癌を
含むいくつかの病理状態を示す。
活性プロテアーゼが制御されていない状態で循環している場合には、潜在的に
細胞成分が損傷を受けるかもしれない。血清中のＰＳＡのタンパク質分解活性は
、アルファ−１−抗キモトリプシン（α１−ＡＣＴ）、アルファ−２−マクログ
ロブリン（α２−Ｍ）、および他の急性期タンパクのようなプロテアーゼ阻害因
子により阻害される。前立腺癌患者の血清中のＰＳＡの優先形態は、現在のイム
ノアッセイにより検出されるように、α１−ＡＣＴと複合体を形成している。免
疫学的に検出可能なＰＳＡの残りは、酵素的非活性の遊離形態として存在する。
ほとんどの前立腺癌患者において、ＰＳＡレベルは、正常な男性のものよりも常
に高い。ＰＳＡは主に摂護腺により産生されるので、前立腺癌患者におけるその
血清値は、成功した根治的前立腺切除後に、ほとんど検出できないレベルまで減
少する。したがって、ＰＳＡは現在、治療的および／または外科的関与後の残留
する病気および再発を検出するために、前立腺癌を有する患者をモニタするため
の重要な生体外診断パラメータとして認識されている。
α２−Ｍは、異なる特異性および触媒機構を示すタンパク質分解酵素を阻害す
る能力を有している。餌領域内のペプチド結合の開裂が、タンパク質分解酵素を
閉じこめ、より大きい物質および活性部位指向性阻害因子、並びに抗体への接近
を立体的に妨げる配座的変化を誘発する。α２−ＭはＰＳＡのタンパク質分解活
性の主な阻寓因子であることが示されている。ホンダ等のClin.Chem ．vol.42，1
785-1788頁(1996)。現在の世代の全ＰＳＡアッセイは、ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体
を認識せず、患者の血清中に含まれるこの複合体の測定における技術的難点のた
めに、ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体の臨床的重要性が損なわれている。現在、全ＰＳ
Ａに対する遊離ＰＳＡの比率が、ＢＰＨおよび前立腺癌を識別するのに用いられ
ている。高い比率の遊離ＰＳＡが、ＢＰＨの可能性が高いことを示す。
前立腺癌は、米国の男性の人口における二番目の死因である。現在、ＰＳＡは
、前立腺癌の早期診断およびモニタに用いられている。良性前立腺肥大（ＢＰＨ
）のような良性の病気を患っている患者から得られたＰＳＡ血清レベル値と、前
立腺癌を患っている患者のものとの間には、相当の重複が見られる。したがって
、ＰＳＡ単独では、前立腺癌をスクリーニングするための、またはＢＰＨを前立
腺癌から識別するための信頼性のあるパラメータとして使用することができない
。
本発明の目的は、前立腺癌の存在および／または病期の信頼性のある指標とし
て、患者の血液試料中のＰＳＡ−α２−マタログロブリン複合体のレベルを正確
に測定できる方法および診断組成物を提供することにある。発明の概要
本発明は、ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体が、前立腺癌を患った個体から採取された
液体試料中に臨床的に重要な濃度で存在することを本願出願人が発見したことに
基づくものである。本願出願人は、最初に、これらの複合体が体内に存在するこ
とを示し、前立腺癌患者の血清中のこの複合体の存在および濃度を、分子篩クロ
マトグラフィー、ウエスタンブロット分析および二部位イムノアッセイを用いて
検出した。本願出願人は、ＰＳＡの総循環レベルの60％ほど多くが、前立腺癌患
者中にＰＳＡ−α２−Ｍ複合体として存在することを示した。生物学的液体中の
ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体レベルの測定は、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体または遊離ＰＳ
Ａを測定するよりも、前立腺癌の存在のより良好な指標、並びに悪性度のより早
期の指標を提供する。ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体の測定は、ＰＳＡ試験を用いると
生じる偽陰性を検出し、臨床的感度を改良できる。ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体の測
定はまた、前立腺癌のスクリーニングまたはその診断に、ＢＰＨのような良性の
病気と前立腺癌との識別に、前立腺癌の早期検出に、転移の指標として、そして
潜伏性のおよび潜在的に攻撃的な前立腺癌の識別に用いることもできる。
ある態様において、本発明は、被験者の生物学的液体中のＰＳＡ−α２−Ｍ複
合体の存在を検出および／またはその量を測定する方法を含む。この方法は概し
て、生物学的液体の試料を、ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体に特異的に結合する一つ以
上の結合タンパク質と接触させ、この複合体に結合した結合タンパク質を検出す
る各工程を含む。この被験者は好ましくは人間であり、生物学的液体は好ましく
は血液の血清または血漿、もしくはその分画である。好ましい実施の形態におい
て、本発明の方法は二部位イムノアッセイである。このイムノアッセイ実験方法
は、試料中における結合タンパク質のＰＳＡへの結合を促進させるのに十分な条
件下で、前立腺癌を有すると疑われるまたはその危険性のある被験者からの血清
をＰＳＡに特異的な結合タンパク質と組み合わせる工程を含む。次いで、この混
合物を試料中のα２−Ｍに特異的な第二の結合タンパク質と組み合わせる。次い
で、血清試料中のＰＳＡ−α２−Ｍの量を、両方の結合タンパク質と結合した物
質を検出することにより測定することができる。
本発明はさらに、ウエスタン法を用いて被験者の生理学的液体中のＰＳＡ−α
２−Ｍ複合体の存在を検出するまたはその量を測定する方法を含む。この実施の
形態において、生物学的液体、またはその分画は、洗浄剤、好ましくは、ドデシ
ル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）により可溶化され、次いで、ゲルに施される。電気
泳動を行って、成分を分離する。次いで、分離された成分を、ニトロセルロース
膜のような固体基質に移送させる。好ましい実施の形態において、この基質に遮
断薬を施して、非特異的結合を遮断させる。次いで、これらの成分は、ＰＳＡに
対する単クローン性抗体により免疫学的に検出する。次いで、存在する複合体の
量を、例えば、定量的デンシトメトリーを用いて定量することができる。
別の態様において、本発明は、被験者の生物学的液体中のＰＳＡ−α２−Ｍ複
合体の存在を検出することにより、被験者中に前立腺癌の存在する検出する方法
を含む。この方法の好ましい実施の形態において、ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体は、
ウエスタン法または上述したイムノアッセイ法のいずれかを用いて検出される。
本発明はさらに、良性の前立腺の病気と前立腺癌とを識別する、または前立腺
癌の病期を決定する方法を含む。この方法は、被験者の生物学的液体中のＰＳＡ
−α２−Ｍ複合体の量を定量し、この複合体のレベルをその病気または癌の病期
と関係づける各工程を含む。好ましい実施の形態において、その生物学的液体中
の複合体の量は、ウエスタン法またはイムノアッセイ法により測定される。特に
好ましい実施の形態において、ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体の血清レベルは、前立腺
癌を患っているかまたはその危険性のある個体から血清試料を得て、その血清試
料を、ＰＳＡ特異的結合タンパク質および固相を含む第一の接合体と、この第一
の接合体と試料中のＰＳＡとの間の反応を誘発させるのに十分な条件下で組み合
わせることにより測定される。次いで、この段階後に形成された混合物を、この
試料中のα２−Ｍに特異的な結合タンパク質および検出可能な部位を含む第二の
接合体と、この第二の接合体と試料中のα２−Ｍとの間の反応を誘発させるのに
十分な条件下で接触させる。この時点では、ＰＳＡ特異的結合タンパク質と、Ｐ
ＳＡ−α２−Ｍ複合体と、検出可能な部位を有するα２−Ｍ特異的結合タンパク
質とを含む反応生成物に付着したこの固相を反応混合物から分離する。次いで、
ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体の量を、検出可能な部位の量に基づいて測定することが
できる。
本願出願人は、相当な濃度のＰＳＡ−α２−Ｍ複合体が、前立腺癌患者の血清
中に存在することを発見した。このＰＳＡ−α２−Ｍ複合体の量は、癌の病期ま
たは病原力を表す。したがって、前立腺癌の存在を検出することに加えて、本発
明の別の態様は、検出された癌の病期を決定する方法、患者内の前立腺癌の経過
をモニタする方法、および前立腺癌とＢＰＨのような良性の病気とを識別する方
法を含む。
本発明はさらに、上述した方法を実施するキットを含む。ある実施の形態にお
いて、本発明のキットは、最小限で、ＰＳＡ特異的結合タンパク質および分離可
能なタグまたは固相を含む第一の接合体；およびα２−Ｍに特異的な結合タンパ
ク質および検出可能な部位を含む第二の接合体を含む。このキットは、必要に応
じて、様々な試薬および容器、または本発明の方法を実施するのに有用な他の成
分または部材を含んでもよい。
本発明は、被験者の生物学的液体中のＰＳＡ−α２−Ｍ複合体の存在および／
または量が前立腺癌の存在および病期を表すという発見に基づいて、個体におけ
る前立腺癌の存在を検出する、その癌をモニタする、および癌の病期を決定する
、改良された方法およびキットを提供する。本発明の方法およびキットは、前立
腺癌と、ＢＰＨのような良性の前立腺の病気とを識別する手段も提供する。図面の簡単な説明
図１は、前立腺癌患者の血清中のＰＳＡのクロマトグラフ溶出分布を示すダラ
フである。
図２は、抗ＰＳＡ単クローン性抗体により検出された前立腺癌患者からの分画
血清のウエスタンブロット分析である。
図３は、抗α１−ＡＣＴ性抗体により検出された前立腺癌患者からの分画血清
のウエスタンブロット分析である。
図４は、抗α２−Ｍ単クローン性抗体により検出された前立腺癌患者からの分
画血清のウエスタンブロット分析である。
図５は、抗ＰＳＡ単クローン性抗体により検出された前立腺癌患者からのその
ままの血清中のＰＳＡの様々な形態のウエスタンブロット分析である。
図６は、数千の相対光単位（relative light unints:RLU）で表したＰＳＡ−
α２−Ｍ対ＰＳＡ−α２−Ｍ希釈率に関するイムノアッセイの用量応答を示すグ
ラフである。
図７は、相対光単位で表した、複合体へのｐＨ処理の効果対血清試料番号を示
すグラフである。ｐＨ処理した血清（＋）および非処理血清（−）について、値
が示されている。
図８は、相対光単位で表した、ｐＨ処理後の用量応答対血清試料容積を示すグ
ラフである。ｐＨ処理した血清（＋）および非処理血清（−）の両方に関する曲
線が示されている。詳細な説明
α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）によるＰＳＡの被包のために、ＰＳＡが
二部位免疫学的アッセイに使えなくなる。α２−Ｍと複合体が形成されたＰＳＡ
は免疫学的に反応性であるけれども、その臨床的な重要性は、検出および定量が
技術的に困難であるために評価されていない。ＰＳＡに関して、分子篩クロマト
グラフィー、ウエスタンブロット分析、およびイムノアッセイを用いることによ
り、本願出願人は、前立腺癌患者全ての血清中に高分子量のＰＳＡ−α２−Ｍ複
合体が存在することを示した。
分子篩クロマトグラフィーを用いて、ＰＳＡ−α２−マクログロブリン複合体
を特徴付け、この未変性分子の分子量を定性的に確認した。前立腺癌を患ってい
る数人の患者から血清を得た。分子篩クロマトグラフィーを用いて、ＰＳＡ−α
２−Ｍ複合体を720ｋＤａの複合体としてクロマトグラフ的に単離した。700ｋＤ
ａより大きい分子量のタンパク質分子を含有する分画を、全そのままの血清と同
様な様式でウエスタンブロットで調査した。ＳＤＳ処理後、700ｋＤａの分子よ
り大きい分子を、270ｋＤａから360ｋＤａまでに亘るサブユニットに分断した。
免疫反応性ＰＳＡをＭｒ約300ｋＤａで単離し、α２−Ｍが四分割構造からダイ
マーに分断されたことを示した。精製α２−ＭおよびＰＳＡを組み合わせること
により、生体外で調製した対照ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体についても、同様の分布
が見られた。
本願出願人は、ウエスタンブロット分析および走査デンシトメトリーを用いて
、クロマトグラフにより精製したＰＳＡ−α２−Ｍ複合体の定量分析を行った。
表１に示したこの分析の結果から、前立腺癌患者の血清中の総循環ＰＳＡの約35
％から約59％がＰＳＡ−α２−Ｍ複合体として存在することが分かる。これは、
α２−Ｍと複合体を形成したＰＳＡを定量し、このＰＳＡが前立腺癌患者の血清
中に多量で存在することを示す第一の方法である。本願出願人は、血清中のＰＳ
Ａ−α２−Ｍ複合体のレベルがこの癌の病期と関係することを発見した。したが
って、ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体の低血清レベルは良性の前立腺の病気または早期
の癌を表し、高レベルのＰＳＡ−α２−Ｍ複合体は進行した前立腺癌を示す。
表 １
前立腺癌患者の血清中のＰＳＡの異なる形態の百分率
前立腺癌 前立腺癌 前立腺癌 ＰＳＡの形態 患者＃１ 患者＃２ 患者＃３ 平均値
遊離ＰＳＡ 18.1 9.9 9.9 12.6
ＰＳＡ−ＡＣＴ 46.6 30.8 44.9 40.8
ＰＳＡ−α２−Ｍ 35.3 59.2 45.2 46.6
ある態様において、本発明は、被験者の生物学的液体中のＰＳＡ−α２−Ｍ複
合体の存在を検出するおよび／またはその量を測定する方法を含む。この方法は
、一般的に、生物学的液体の試料を、ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体に特異的に結合す
る一つ以上の結合タンパク質と接触させ、この複合体に結合した結合タンパク質
を検出する各工程を含む。好ましい実施の形態において、この方法は、二部位イ
ムノアッセイである。このイムノアッセイ実験方法は、前立腺癌を有すると疑わ
れるまたはその危険性のある被験者からの血清をＰＳＡに特異的な結合タンパク
質と、試料中の結合タンパク質のＰＳＡへの結合を促進させるのに十分な条件下
で組み合わせる工程を含む。その結合タンパク質は、好ましくは、抗ＰＳＡ単ク
ローン性抗体である。この目的のために、Ｆ５−Ａ−１／２２．８．１３（ＡＴ
ＣＣ ＨＢ ８０５１）と称する抗ＰＳＡ抗体、またはＰＳＡに対する他の抗体
を用いても差し支えない。次いで、この混合物を、試料中のα２−Ｍに特異的な
第二の結合タンパク質と組み合わせる。この第二の結合タンパク質は、好ましく
は、親和性精製抗α２−Ｍ単クローン性または多クローン性抗体である。適切な
抗α２−Ｍ抗体試薬が、例えば、デンマーク、コペンハーゲンのダコー社および
アセンズリサーチラボ（ジョージア州、アセンズ）から市販されている。次いで
、血清試料中のＰＳＡ−α２−Ｍの量を、両方の結合タンパク質に結合した物質
を検出することにより測定することができる。少なくとも一つの結合タンパク質
が、好ましくは、化学発光化合物または放射性化合物のような、検出可能な部位
でラベルされている。どのような検出可能なラベルを本発明の方法に用いても差
し支えない。
本発明はさらに、ウエスタン法を用いて、被験者の生物学的液体中のＰＳＡ−
α２−Ｍ複合体の存在を検出する、またはその量を測定する方法を含む。この実
施の形態において、生物学的液体、またはその分画は、洗浄剤、好ましくは、ド
デシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で可溶化され、次いで、ゲルに施される。電気
泳動を行って、成分を分離する。次いで、分離された成分を、ニトロセルロース
膜のような固体基質に移送する。次いで、これらの成分を、上述した抗体のよう
な、ＰＳＡに対する単クローン性抗体で免疫学的に検出する。次いで、存在する
複合体の量を、例えば、定量デンシトメトリーを用いて定量することができる
（数千の相対光単位（ＲＵＬ）で表したＰＳＡ−α２−Ｍの典型的な用量応答対
ＰＳＡ−α２−Ｍ希釈率に関する図６を参照）。
好ましい実施の形態において、遮断剤を基質に施して、非特異的結合を遮断す
る。非特異的結合に特に効果的であればどのような遮断剤を用いても差し支えな
い。この目的に特に効果的な遮断剤は、サイテックラボラトリーズ（ユタ州、ロ
ーガン）から市販されている、スーパーブロックである。
この試料をイムノアッセイまたはウエスタン法の前に前処理してもよい。前処
理により、このＰＳＡ−α２−Ｍ複合体中のＰＳＡエピトープをより露出させ、
したがって、結合により利用しやすくしてもよい。本発明の方法の現在好ましい
実施の形態において、この前処理段階は、溶液試料を暖め、この試料をＳＤＳの
ような洗浄剤と接触させる各工程を含む。他の洗浄剤をこの目的に用いてもよい
。
別の態様において、本発明は、被験者の生物学的液体中のＰＳＡ−α２−Ｍ複
合体の存在を検出することにより、被験者の前立腺癌の存在を検出する方法を含
む。これらの方法の好ましい実施の形態において、このＰＳＡ−α２−Ｍ複合体
は、上述したウエスタン法またはイムノアッセイ法のいずれかを用いて検出され
る。
本発明はさらに、良性の前立腺の病気と前立腺癌とを識別する、または前立腺
癌の病期を決定する方法を含む。この方法は、被験者の生物学的液体中のＰＳＡ
−α２−Ｍ複合体の量を定量し、この複合体のレベルをこの病気または癌の病期
と関係付ける各工程を含む。好ましい実施の形態において、この生物学的液体中
の複合体の量は、ウエスタン法またはイムノアッセイ法により測定される。特に
好ましい実施の形態において、ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体の血清レベルは、前立腺
癌を患った、またはその危険性のある個体から血清試料を得て、この血清試料を
、ＰＳＡ特異的結合タンパク質および固相を含む第一の接合体と、この第一の接
合体と試料中のＰＳＡとの間の反応を誘発させるのに十分な条件下で組み合わせ
ることにより測定される。この接合に用いられる固相は、この特異的結合タンパ
ク質と結合し、この処理中に形成される反応生成物を反応混合物から除去できる
どのような固体物質であっても差し支えない。固相としては、例えば、磁気粒子
、膜、高分子支持体または所望の特性を有する他の物質が挙げられる。本発明の
使
用するのには、磁気粒子が好ましい。次いで、この段階後に形成された混合物を
、この試料中のα２−Ｍに特異的な結合タンパク質および検出可能な部位を含む
第二の接合体と、この第二の接合体と試料中のα２−Ｍとの間の反応を誘発させ
るのに十分な条件下で接触させる。この時点では、ＰＳＡ特異的結合タンパク質
、ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体および検出可能な部位を有するα２−Ｍ特異的結合タ
ンパク質を含む反応生成物に付着している固相を、反応混合物から分離する。次
いで、ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体の量を検出可能な部位の量に基づいて測定するこ
とができる。
本発明の全ての実施の形態に関して、被験者は好ましくは人間であり、生物学
的液体は好ましくは血液血清または血漿、もしくはその分画である。「結合タン
パク質」という用語は、単クローン性および多クローン性抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ
’Ｆｖのような抗体断片、および一本鎖結合部位を含む。
本願出願人は、多量のＰＳＡ−α２−Ｍ複合体が前立腺癌患者の血清中に存在
することを発見した。ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体の量は、癌の病期または病原力を
表す。したがって、前立腺癌の存在を検出することに加えて、本発明の別の態様
は、検出された癌の病期を決定する方法、患者内の前立腺癌の経過をモニタする
方法、および前立腺癌とＢＰＨのような良性の病期とを識別する方法を含む。
本発明はさらに、これらの方法を実施するキットを含む。ある実施の形態にお
いて、このキットは、最小限で、ＰＳＡ特異的結合タンパク質および分離可能な
タグまたは固相を含む第一の接合体；およびα２−Ｍに特異的な結合タンパク質
および検出可能な部位を含む第二の接合体を含む。このキットは、必要に応じて
、様々な試薬および容器、またはこの方法を実施するのに有用な他の成分を含ん
でもよい。
本発明は、被験者の生物学的液体中のＰＳＡ−α２−Ｍ複合体の存在および／
または量が前立腺癌の存在および病期を表すという発見に基づいて、個体内の前
立腺癌の存在を検出する、その病期をモニタする、およびその病期を決定する、
改良された方法およびキットを提供する。本発明の方法およびキットは、前立腺
癌とＢＰＨのような良性の前立腺の病期とを識別する手段も提供する。
本発明はさらに、いかようにも限定するものを意図するものではない以下の実
施例により説明される。実施例１ 分子篩クロマトグラフィー
スーパーデックス２００ゲルをファーマシア（スウエーデン、ウップサレ）か
ら購入した。分子量マーカーをバイオラド（カリフォルニア州、リッチモンド）
から購人した。このマーカーは、カタラーゼ（240ｋＤａ）、ウシ血清アルブミ
ン（67ｋＤａ）、オバルブミン（43ｋＤａ）、キモトリプシノーゲン（25ｋＤａ
）およびリボヌクレアーゼ（14ｋＤａ）を含んでいた。この実施例および以下の
実施例に使用した患者の血清試料は、前立腺癌の進行した形態を有する患者から
採取した。これらの血清は、エム．ディー．アンダーソン癌センター（テキサス
州、ヒユーストン）のハーバート エー．フリッシェ博士(Herbert A．Fritsche
，Ph.D.)およびスタンフォード大学医療センター（カリフォルニア州、スタンフ
ォード）のトーマス エー．ステイミー医学博士(Thoma A．Stamey，M.D.)から
得た。患者の血清試料（200-500μL）を、バイオラドのエコノカラム中に充填し
た75×1.5ｃｍのスーパーデクス２００ゲル上で0.1ｍＬ／分の流量で分別した。
0.5ｍＬの分画を採集し、イムノアッセイにより分析した。溶出緩衝液は、0.02
％のウシ血清アルブミンおよび0.1％のトリトンＸ−１００を有するリン酸緩衝
生理食塩水（50ｍＭのリン酸ナトリウム、150ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ6.9）
を含有していた。クロマトグラフ分画中のＰＳＡを製造業者の指示にしたがって
以下のアッセイにより測定した：i)ＡＣＳ（商標）ＰＳＡアッセイ（マサチュー
セッツ州、イーストワルポールのカイロンダイアグノスティクス社のカイロンＡ
ＣＳ：１８０（登録商標）システムに使用するようにフォーマットされた、自動
化多クローン性／単クローン性イムノケミルミノメトリッタアッセイ）、および
ハイブリテック（登録商標）タンデム（登録商標）−Ｒ ＰＳＡアッセイ（カリ
フォルニア州、サンディエゴのハイブリテック社の手動式二重単クローン性イム
ノラジオメトリックアッセイ）。現在のＰＳＡイムノアッセイでは、ＰＳＡ−α
２−マクログロブリン複合体を認識し、測定できない。
図１は、上述した方法による、血清の分別により得られたＰＳＡのクロマトグ
ラフィー溶出分布を示している。血清（0.2ｍＬ）をスーパーデックス２００（7
5×1.5ｃｍ）カラムに施した。分画（0.5ｍＬ）を0.1ｍＬ／分の流量で採集し、
ＰＳＡに関してタンデム−ＲアッセイおよびＡＣＳ ＰＳＡアツセイによりアッ
セイした。前立腺癌患者のこの典型的な分布は、16.5％の遊離ＰＳＡおよび83.5
％のＰＳＡ−アルファ１−抗キモトリプシン複合体を含有している。実施例２ ウエスタンブロット分析
標準的なイムノアッセイによるＰＳＡ検出に加えて、いくつかの患者の血清お
よび血清の選択した分画（分子篩クロマトグラフィー後の）に、トービン(Towbi
n)およびゴーデン(Gorden)の方法にしたがってウエスタンブロット分析を施した
。J.Immunol.Methods 72:313-340(1984)。陰イオン系洗浄剤（ＳＤＳ）中での可
溶化後、試料を線形勾配でラエムリ(Laemmli)ゲル（1.5ｍｍ厚）に施した。バイ
オラドのプロティーンIIｘｉシステム内で電気泳動を行った。タンパク質をバイ
オラドのトランスブロットセルを用いてニトロセルロース膜に移した。膜をスー
パーブロック（ユタ州、ローガン、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ3286のサイテックラボラトリ
ーズ）を用いて遮断して、非特異的タンパク質結合を減少させ、タンパク質をヒ
トＰＳＡに対する単クローン性抗体（Ｆ５−Ａ−１／２２．８．１３；ＡＴＣＣ
ＨＢ ８０５１）で免疫的に検出した。単離したバンドの視覚化を、抗マウス
ＩｇＧに接合したホースラディッシュペルオキシダーゼ（カリフォルニア州、ハ
ーキュレスのバイオラド）で行い、ＥＣＬシステム（イリノイ州、ロックフォー
ドのアメルシャム）を用いて、向上した化学発光技術により検出した。
ウエスタンブロットの定量デンシトメトリーに関して、ＩＳ−１０００デジタ
ルイメージングシステム（コネチカット州、ブラッドフォード、765イーストメ
インストリートのサンバイオサイエンス社）を用いた。このシステムにおいて、
デジタルビデオカメラが、ウエスタンブロットの画像をとらえ、全てのバンドの
染色密度を定量する。システムのソフトウェアを用いて、ＰＳＡの異なる形態（
遊離ＰＳＡ、ＰＳＡ−α１−抗キモトリプシンおよびＰＳＡ−α２−マクログロ
ブリン複合体）への分布を計算できる。実施例３ ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体に関するイムノアッセイ実験方法
血清 100μＬ
＋
固相（抗ＰＳＡ Ｍａｂ：Ｆ５）
250μＬ
↓２時間に亘り37℃で保温
磁気分離、２回洗浄
試薬を添加（ヒツジ抗α２−Ｍ多クローン性）
100μＬ
↓30分間に亘り37℃で保温
磁気分離、２回洗浄
マジックライトアナライザ２内でフラッシュさせる
このアッセイに使用したＰＳＡ単クローン性抗体：Ｆ５−Ａ−１／２２．８．
１３ ＡＴＣＣ ＨＢ８０５１。使用したこの抗α２−Ｍ多クローン性抗体は、
ダコー社（デンマーク、コペンハーケン）から得られる、親和性精製されたウサ
ギ抗ヒトα２−マクログロブリンであった。ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体を認識する
他の抗体を使用しても差し支えなく、それらは市販されている。
前立腺操作の前に血清試料を採集し、評価するまで−20℃または−80℃で貯蔵
した。血清試料は、以下の研究所および研究者から得た：エム．ディー．アンダ
ーソン癌センター（テキサス州、ヒューストン）のハーバート エー．フリッシ
ェ博士(Herbert A．Fritsche，Ph.D.)およびスタンフォード大学医療センター（
カリフォルニア州、スタンフォード）のトーマス エー．ステイミー医学博士(T
homa A．Stamey，M.D.)。この研究に使用した血清試料は、前立腺癌の進行した
患者からのものであった。実施例４
実施例２に記載した実験方法を用いて、実施例１に記載した分別した前立腺癌
血清において様々な形態のＰＳＡのウエスタンブロット分析を行った。タンパク
質を、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（3-15％勾配）を行った後にニトロセルロース膜上にブ
ロットし、抗ＰＳＡ ＭＡＢ Ｆ５で免疫学的に検出した。その結果が図２に示
されている：レーン１、低Ｍｒマーカー；レーン２、スタンフォードの対照ＰＳ
Ａ；レーン３、純粋α１−ＡＣＴ；レーン４、純粋α２−Ｍ；レーン５、精製Ｐ
ＳＡ−α１−ＡＣＴ複合体（生体外で調製した）；レーン６、精製ＰＳＡ−α２
−Ｍ複合体（生体外で調製した）；レーン７、分画90番；レーン８、分画124番
；レーン９、分画153番；レーン10、高Ｍｒマーカー。実施例５
実施例２に記載した実験方法を用いて、実施例１に記載した、分別された前立
腺癌血清のウエスタンブロット分析を行った。分離したタンパク質を抗α１−Ａ
ＣＴ Ｍａｂで免疫学的に検出した。その結果か図３に示されている。レーン１
、スタンフォードの対照ＰＳＡ；レーン２、純粋α１−ＡＣＴ；レーン３純粋α
２−Ｍ；レーン４、生体外で調製し、非反応遊離α１−ＡＣＴを含有するＰＳＡ
−α１−ＡＣＴ複合体；レーン５、分画90番、約700ｋＤａの分画；レーン６、
分画124番、ＰＳＡ−α１−ＡＣＴピーク分画；レーン７、分画153番、遊離ＰＳ
Ａピーク分画；レーン８、分子量マーカー；レーン９、還元α１−ＡＣＴ（レー
ン２と同様）；レーン10、生体外で調製した還元ＰＳＡ−α１−ＡＣＴ複合体；
レーン11、還元分画124番、ＰＳＡ−α１−ＡＣＴピーク分画。実施例６
実施例２に記載した実験方法を用いて、実施例１に記載した、分別された前立
腺癌血清のウエスタンブロット分析を行った。分離したタンパク質を抗α２−Ｍ
Ｍａｂで免疫学的に検出した。その結果が図４に示されている。レーン１、分
子量マーカー；レーン２、スタンフォードの対照ＰＳＡ；レーン３、純粋α１−
ＡＣＴ；レーン４、純粋α２−Ｍ；レーン５、生体外で調製したＰＳＡ−α２−
Ｍ複合体；レーン６、分画92番、約700ｋＤａの分画；レーン７、分画124番、Ｐ
ＳＡ−α１−ＡＣＴピーク分画；レーン８、分画152番、遊離ＰＳＡピーク分画
；レーン９、分子量マーカー；レーン10、還元α２−Ｍ；レーン11、生体外で調
製した還元ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体；レーン12、還元分画92番、血清から分別し
たＰＳＡ−α２−Ｍ分画；レーン13、還元分画124番。実施例７
実施例２に記載した実験方法を用いて、前立腺癌のそのままの血清において様
々なＰＳＡのウエスタンブロット分析を行った。タンパク質を、ＳＤＳ ＰＡＧ
Ｅ（10-15％勾配）を行った後にニトロセルロース膜上にブロットし、抗ＰＳＡ
Ｍａｂ Ｆ５で免疫学的に検出した。その結果が図５に示されている。レーン１
、低Ｍｒマーカー；レーン２、正常な女性の血清；レーン３から６、以下のＰＳ
Ａ濃度を有する前立腺癌血清：レーン３、945μｇ／Ｌ；レーン４，980μｇ／Ｌ
；レーン５、1540μｇ／Ｌ；レーン６、1600μｇ／Ｌ；レーン７、高Ｍｒマーカ
ー。実施例８ ＰＳＡ−α２−Ｍイムノアッセイの校正
：
校正物質またはイムノアッセイを用いなければ、このアッセイを標準化し、校
正するのが非常に難しくなる。本願出願人は、非常に単純な概念を用いて、α２
−Ｍと複合体を形成したＰＳＡに関してこのアッセイを校正した。遊離ＰＳＡを
正常な女性の血清に添加した場合、この遊離ＰＳＡは、α２−Ｍと複合体を形成
し、形成されたＰＳＡ−α２−Ｍ複合体は、現在の全ＰＳＡイムノアッセイによ
り認識したり、測定することができないことが知られている。我々は、タンパク
質緩衝溶液（１％のウシ血清アルブミンを有するリン酸緩衝生理食塩水）および
正常な女性の血清中の精製された遊離ＰＳＡの同一の希釈物を調製した。両方の
希釈物を48時間に亘り保温し、全ＰＳＡをＡＣＳ ＰＳＡ２イムノアッセイ（マ
サチューセッツ州、イーストワルポールのカイロンダイアグノスティクス）を用
いて測定した。女性の血消中の希釈物は、タンパク質緩衝液中の全ＰＳＡ値と比
較して低い全ＰＳＡ値が得られた（前述したように、この全ＰＳＡアッセイは、
ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体を認識しない）。全ＰＳＡ値の差を用いて、女性の血清
中のα２−Ｍと複合体を形成したＰＳＡの量を計算した。
タンパク質緩衝液および女性の血清中の全ＰＳＡ濃度を、48時間に亘る同量の
遊離ＰＳＡとのインキュベーション後に測定した：
タンパク質緩衝液 2.256μｇ／ｍＬ
女性の血清 0.839μｇ／ｍＬ
したがって、女性の血清中のα２−Ｍと複合体を形成したＰＳＡは、（2.256
−
0.839＝）1.417μｇ／ｍＬであった。α２−Ｍに結合した1.417μｇ／ｍＬのＰ
ＳＡを有するこの菌株溶液を用いて、標準物を調製し、ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体
イムノアッセイに用いた。この複合体アッセイは、女性の血清中の残留している
非反応性遊離ＰＳＡを認識したり、それと交差反応したりしない。実施例９ ＰＳＡエピトープを露出するための試料の前処理
：
α２−Ｍのプロテアーゼ阻害因子としての作用の機構および生化学的構造は、
この分子が、前記プロテアーゼ（ＰＳＡ）をスプリング式取込様式で取り込む多
数のサブユニットからなるので複雑である。この取込みがこのＰＳＡ分子を遮断
し、この分子に、最初に部分的に解離されない限りは、抗体分子と相互作用させ
なくなる。本願出願人は、このＰＳＡ−α２−Ｍ複合体を破壊せずにＰＳＡエピ
トープを露出する別の試薬およびｐＨ処理も調査した。塩酸（ＨＣｌ）または低
ｐＨ緩衝液による血清試料の処理がこのＰＳＡエピトープを露出できた。
低ｐＨ（３未満）により、ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体分子の構造が不可逆的に変
化するようである。イムノアッセイは、強酸のｐＨ（３未満）では機能しないか
もしれず、したがって、一時間後に、ｐＨの大きいアルカリ性溶液を用いて酸を
中和する。この処理の後、ＰＳＡ−α２−Ｍは、ＰＳＡ−α２−Ｍイムノアッセ
イを用いて認識し、定量測定できた。
実施例：20μＬの５ＮのＨＣｌを500μＬの血清試料に加えて、そのｐＨを1.5
-3に低下させた。試料を室温で１時間に亘り1.5-3の間の低ｐＨに保持した。１
時間後、５μＬの６Ｎの水酸化ナトリウム溶液（ＮａＯＨ）を加えて、酸を中和
させ、そのｐＨを5.8-7の間にした。この酸／低ｐＨ処理血清により、所定の試
料においてＰＳＡ−α２−Ｍ複合体を定量できる。
図７を参照する。ここでは、ＰＳＡ−α２−Ｍ複合体イムノアッセイは、血清
試料のｐＨ処理後（＋により同定される試料）に複合体を認識できたけれども、
未処理血清試料（−により同定される試料）からの信号（相対光単位すなわちＲ
ＬＵ）は、ノイズ（バッタグラウンド）レベルに近かった。用量応答が、血清試
料のｐＨ処理後に著しく改良された（図８参照）。同等物
当業者は、ここに記載した特定の実施の形態に対する同等物を決定することが
できる。そのような同等物の全ては、以下の請求の範囲内に含めることを意図す
るものである。
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(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ
Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ
，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ
，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，
ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ
Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ
，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，
ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ
Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ
，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，
ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ
Ｎ，ＹＵ，ＺＷ