JP2001509270A - 生物学的液体中のPSA−α2−マクログロブリン複合体の検出 - Google Patents
生物学的液体中のPSA−α2−マクログロブリン複合体の検出Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、前立腺癌の危険のある患者の血清中のPSA−α2−マクログロブリン複合体を検出し、定量する方法を提供する。この複合体の血清レベルを測定することにより、患者内の前立腺癌を検出し、モニタする方法も記載されており、並びに、それらの方法を実施するキットも記載されている。
Description
【発明の詳細な説明】
生物学的液体中の PSA−α2−マクログロブリン複合体の検出 発明の背景
前立腺特異的抗原(PSA)は、摂護腺の上皮細胞により分泌されるカリクレ
イン様セリンプロテアーゼである。これは、前立腺液中に存在する主要タンパク
質のうちの一つである。低レベルのPSAが全ての男性に検出されるけれども、
血液循環におけるPSAの生理的機能はまだ明らかではない。摂護腺の解剖学的
構造が変化することにより、PSAが血液循環中に拡散するのかもしれない。血
清中の高PSA濃度は、良性前立腺肥大(BPH)、前立腺炎および前立腺癌を
含むいくつかの病理状態を示す。
活性プロテアーゼが制御されていない状態で循環している場合には、潜在的に
細胞成分が損傷を受けるかもしれない。血清中のPSAのタンパク質分解活性は
、アルファ−1−抗キモトリプシン(α1−ACT)、アルファ−2−マクログ
ロブリン(α2−M)、および他の急性期タンパクのようなプロテアーゼ阻害因
子により阻害される。前立腺癌患者の血清中のPSAの優先形態は、現在のイム
ノアッセイにより検出されるように、α1−ACTと複合体を形成している。免
疫学的に検出可能なPSAの残りは、酵素的非活性の遊離形態として存在する。
ほとんどの前立腺癌患者において、PSAレベルは、正常な男性のものよりも常
に高い。PSAは主に摂護腺により産生されるので、前立腺癌患者におけるその
血清値は、成功した根治的前立腺切除後に、ほとんど検出できないレベルまで減
少する。したがって、PSAは現在、治療的および/または外科的関与後の残留
する病気および再発を検出するために、前立腺癌を有する患者をモニタするため
の重要な生体外診断パラメータとして認識されている。
α2−Mは、異なる特異性および触媒機構を示すタンパク質分解酵素を阻害す
る能力を有している。餌領域内のペプチド結合の開裂が、タンパク質分解酵素を
閉じこめ、より大きい物質および活性部位指向性阻害因子、並びに抗体への接近
を立体的に妨げる配座的変化を誘発する。α2−MはPSAのタンパク質分解活
性の主な阻寓因子であることが示されている。ホンダ等のClin.Chem .vol.42,1
785-1788頁(1996)。現在の世代の全PSAアッセイは、PSA−α2−M複合体
を認識せず、患者の血清中に含まれるこの複合体の測定における技術的難点のた
めに、PSA−α2−M複合体の臨床的重要性が損なわれている。現在、全PS
Aに対する遊離PSAの比率が、BPHおよび前立腺癌を識別するのに用いられ
ている。高い比率の遊離PSAが、BPHの可能性が高いことを示す。
前立腺癌は、米国の男性の人口における二番目の死因である。現在、PSAは
、前立腺癌の早期診断およびモニタに用いられている。良性前立腺肥大(BPH
)のような良性の病気を患っている患者から得られたPSA血清レベル値と、前
立腺癌を患っている患者のものとの間には、相当の重複が見られる。したがって
、PSA単独では、前立腺癌をスクリーニングするための、またはBPHを前立
腺癌から識別するための信頼性のあるパラメータとして使用することができない
。
本発明の目的は、前立腺癌の存在および/または病期の信頼性のある指標とし
て、患者の血液試料中のPSA−α2−マタログロブリン複合体のレベルを正確
に測定できる方法および診断組成物を提供することにある。発明の概要
本発明は、PSA−α2−M複合体が、前立腺癌を患った個体から採取された
液体試料中に臨床的に重要な濃度で存在することを本願出願人が発見したことに
基づくものである。本願出願人は、最初に、これらの複合体が体内に存在するこ
とを示し、前立腺癌患者の血清中のこの複合体の存在および濃度を、分子篩クロ
マトグラフィー、ウエスタンブロット分析および二部位イムノアッセイを用いて
検出した。本願出願人は、PSAの総循環レベルの60%ほど多くが、前立腺癌患
者中にPSA−α2−M複合体として存在することを示した。生物学的液体中の
PSA−α2−M複合体レベルの測定は、PSA−ACT複合体または遊離PS
Aを測定するよりも、前立腺癌の存在のより良好な指標、並びに悪性度のより早
期の指標を提供する。PSA−α2−M複合体の測定は、PSA試験を用いると
生じる偽陰性を検出し、臨床的感度を改良できる。PSA−α2−M複合体の測
定はまた、前立腺癌のスクリーニングまたはその診断に、BPHのような良性の
病気と前立腺癌との識別に、前立腺癌の早期検出に、転移の指標として、そして
潜伏性のおよび潜在的に攻撃的な前立腺癌の識別に用いることもできる。
ある態様において、本発明は、被験者の生物学的液体中のPSA−α2−M複
合体の存在を検出および/またはその量を測定する方法を含む。この方法は概し
て、生物学的液体の試料を、PSA−α2−M複合体に特異的に結合する一つ以
上の結合タンパク質と接触させ、この複合体に結合した結合タンパク質を検出す
る各工程を含む。この被験者は好ましくは人間であり、生物学的液体は好ましく
は血液の血清または血漿、もしくはその分画である。好ましい実施の形態におい
て、本発明の方法は二部位イムノアッセイである。このイムノアッセイ実験方法
は、試料中における結合タンパク質のPSAへの結合を促進させるのに十分な条
件下で、前立腺癌を有すると疑われるまたはその危険性のある被験者からの血清
をPSAに特異的な結合タンパク質と組み合わせる工程を含む。次いで、この混
合物を試料中のα2−Mに特異的な第二の結合タンパク質と組み合わせる。次い
で、血清試料中のPSA−α2−Mの量を、両方の結合タンパク質と結合した物
質を検出することにより測定することができる。
本発明はさらに、ウエスタン法を用いて被験者の生理学的液体中のPSA−α
2−M複合体の存在を検出するまたはその量を測定する方法を含む。この実施の
形態において、生物学的液体、またはその分画は、洗浄剤、好ましくは、ドデシ
ル硫酸ナトリウム(SDS)により可溶化され、次いで、ゲルに施される。電気
泳動を行って、成分を分離する。次いで、分離された成分を、ニトロセルロース
膜のような固体基質に移送させる。好ましい実施の形態において、この基質に遮
断薬を施して、非特異的結合を遮断させる。次いで、これらの成分は、PSAに
対する単クローン性抗体により免疫学的に検出する。次いで、存在する複合体の
量を、例えば、定量的デンシトメトリーを用いて定量することができる。
別の態様において、本発明は、被験者の生物学的液体中のPSA−α2−M複
合体の存在を検出することにより、被験者中に前立腺癌の存在する検出する方法
を含む。この方法の好ましい実施の形態において、PSA−α2−M複合体は、
ウエスタン法または上述したイムノアッセイ法のいずれかを用いて検出される。
本発明はさらに、良性の前立腺の病気と前立腺癌とを識別する、または前立腺
癌の病期を決定する方法を含む。この方法は、被験者の生物学的液体中のPSA
−α2−M複合体の量を定量し、この複合体のレベルをその病気または癌の病期
と関係づける各工程を含む。好ましい実施の形態において、その生物学的液体中
の複合体の量は、ウエスタン法またはイムノアッセイ法により測定される。特に
好ましい実施の形態において、PSA−α2−M複合体の血清レベルは、前立腺
癌を患っているかまたはその危険性のある個体から血清試料を得て、その血清試
料を、PSA特異的結合タンパク質および固相を含む第一の接合体と、この第一
の接合体と試料中のPSAとの間の反応を誘発させるのに十分な条件下で組み合
わせることにより測定される。次いで、この段階後に形成された混合物を、この
試料中のα2−Mに特異的な結合タンパク質および検出可能な部位を含む第二の
接合体と、この第二の接合体と試料中のα2−Mとの間の反応を誘発させるのに
十分な条件下で接触させる。この時点では、PSA特異的結合タンパク質と、P
SA−α2−M複合体と、検出可能な部位を有するα2−M特異的結合タンパク
質とを含む反応生成物に付着したこの固相を反応混合物から分離する。次いで、
PSA−α2−M複合体の量を、検出可能な部位の量に基づいて測定することが
できる。
本願出願人は、相当な濃度のPSA−α2−M複合体が、前立腺癌患者の血清
中に存在することを発見した。このPSA−α2−M複合体の量は、癌の病期ま
たは病原力を表す。したがって、前立腺癌の存在を検出することに加えて、本発
明の別の態様は、検出された癌の病期を決定する方法、患者内の前立腺癌の経過
をモニタする方法、および前立腺癌とBPHのような良性の病気とを識別する方
法を含む。
本発明はさらに、上述した方法を実施するキットを含む。ある実施の形態にお
いて、本発明のキットは、最小限で、PSA特異的結合タンパク質および分離可
能なタグまたは固相を含む第一の接合体;およびα2−Mに特異的な結合タンパ
ク質および検出可能な部位を含む第二の接合体を含む。このキットは、必要に応
じて、様々な試薬および容器、または本発明の方法を実施するのに有用な他の成
分または部材を含んでもよい。
本発明は、被験者の生物学的液体中のPSA−α2−M複合体の存在および/
または量が前立腺癌の存在および病期を表すという発見に基づいて、個体におけ
る前立腺癌の存在を検出する、その癌をモニタする、および癌の病期を決定する
、改良された方法およびキットを提供する。本発明の方法およびキットは、前立
腺癌と、BPHのような良性の前立腺の病気とを識別する手段も提供する。図面の簡単な説明
図1は、前立腺癌患者の血清中のPSAのクロマトグラフ溶出分布を示すダラ
フである。
図2は、抗PSA単クローン性抗体により検出された前立腺癌患者からの分画
血清のウエスタンブロット分析である。
図3は、抗α1−ACT性抗体により検出された前立腺癌患者からの分画血清
のウエスタンブロット分析である。
図4は、抗α2−M単クローン性抗体により検出された前立腺癌患者からの分
画血清のウエスタンブロット分析である。
図5は、抗PSA単クローン性抗体により検出された前立腺癌患者からのその
ままの血清中のPSAの様々な形態のウエスタンブロット分析である。
図6は、数千の相対光単位(relative light unints:RLU)で表したPSA−
α2−M対PSA−α2−M希釈率に関するイムノアッセイの用量応答を示すグ
ラフである。
図7は、相対光単位で表した、複合体へのpH処理の効果対血清試料番号を示
すグラフである。pH処理した血清(+)および非処理血清(−)について、値
が示されている。
図8は、相対光単位で表した、pH処理後の用量応答対血清試料容積を示すグ
ラフである。pH処理した血清(+)および非処理血清(−)の両方に関する曲
線が示されている。詳細な説明
α2−マクログロブリン(α2−M)によるPSAの被包のために、PSAが
二部位免疫学的アッセイに使えなくなる。α2−Mと複合体が形成されたPSA
は免疫学的に反応性であるけれども、その臨床的な重要性は、検出および定量が
技術的に困難であるために評価されていない。PSAに関して、分子篩クロマト
グラフィー、ウエスタンブロット分析、およびイムノアッセイを用いることによ
り、本願出願人は、前立腺癌患者全ての血清中に高分子量のPSA−α2−M複
合体が存在することを示した。
分子篩クロマトグラフィーを用いて、PSA−α2−マクログロブリン複合体
を特徴付け、この未変性分子の分子量を定性的に確認した。前立腺癌を患ってい
る数人の患者から血清を得た。分子篩クロマトグラフィーを用いて、PSA−α
2−M複合体を720kDaの複合体としてクロマトグラフ的に単離した。700kD
aより大きい分子量のタンパク質分子を含有する分画を、全そのままの血清と同
様な様式でウエスタンブロットで調査した。SDS処理後、700kDaの分子よ
り大きい分子を、270kDaから360kDaまでに亘るサブユニットに分断した。
免疫反応性PSAをMr約300kDaで単離し、α2−Mが四分割構造からダイ
マーに分断されたことを示した。精製α2−MおよびPSAを組み合わせること
により、生体外で調製した対照PSA−α2−M複合体についても、同様の分布
が見られた。
本願出願人は、ウエスタンブロット分析および走査デンシトメトリーを用いて
、クロマトグラフにより精製したPSA−α2−M複合体の定量分析を行った。
表1に示したこの分析の結果から、前立腺癌患者の血清中の総循環PSAの約35
%から約59%がPSA−α2−M複合体として存在することが分かる。これは、
α2−Mと複合体を形成したPSAを定量し、このPSAが前立腺癌患者の血清
中に多量で存在することを示す第一の方法である。本願出願人は、血清中のPS
A−α2−M複合体のレベルがこの癌の病期と関係することを発見した。したが
って、PSA−α2−M複合体の低血清レベルは良性の前立腺の病気または早期
の癌を表し、高レベルのPSA−α2−M複合体は進行した前立腺癌を示す。
表 1
前立腺癌患者の血清中のPSAの異なる形態の百分率
前立腺癌 前立腺癌 前立腺癌 PSAの形態 患者#1 患者#2 患者#3 平均値
遊離PSA 18.1 9.9 9.9 12.6
PSA−ACT 46.6 30.8 44.9 40.8
PSA−α2−M 35.3 59.2 45.2 46.6
ある態様において、本発明は、被験者の生物学的液体中のPSA−α2−M複
合体の存在を検出するおよび/またはその量を測定する方法を含む。この方法は
、一般的に、生物学的液体の試料を、PSA−α2−M複合体に特異的に結合す
る一つ以上の結合タンパク質と接触させ、この複合体に結合した結合タンパク質
を検出する各工程を含む。好ましい実施の形態において、この方法は、二部位イ
ムノアッセイである。このイムノアッセイ実験方法は、前立腺癌を有すると疑わ
れるまたはその危険性のある被験者からの血清をPSAに特異的な結合タンパク
質と、試料中の結合タンパク質のPSAへの結合を促進させるのに十分な条件下
で組み合わせる工程を含む。その結合タンパク質は、好ましくは、抗PSA単ク
ローン性抗体である。この目的のために、F5−A−1/22.8.13(AT
CC HB 8051)と称する抗PSA抗体、またはPSAに対する他の抗体
を用いても差し支えない。次いで、この混合物を、試料中のα2−Mに特異的な
第二の結合タンパク質と組み合わせる。この第二の結合タンパク質は、好ましく
は、親和性精製抗α2−M単クローン性または多クローン性抗体である。適切な
抗α2−M抗体試薬が、例えば、デンマーク、コペンハーゲンのダコー社および
アセンズリサーチラボ(ジョージア州、アセンズ)から市販されている。次いで
、血清試料中のPSA−α2−Mの量を、両方の結合タンパク質に結合した物質
を検出することにより測定することができる。少なくとも一つの結合タンパク質
が、好ましくは、化学発光化合物または放射性化合物のような、検出可能な部位
でラベルされている。どのような検出可能なラベルを本発明の方法に用いても差
し支えない。
本発明はさらに、ウエスタン法を用いて、被験者の生物学的液体中のPSA−
α2−M複合体の存在を検出する、またはその量を測定する方法を含む。この実
施の形態において、生物学的液体、またはその分画は、洗浄剤、好ましくは、ド
デシル硫酸ナトリウム(SDS)で可溶化され、次いで、ゲルに施される。電気
泳動を行って、成分を分離する。次いで、分離された成分を、ニトロセルロース
膜のような固体基質に移送する。次いで、これらの成分を、上述した抗体のよう
な、PSAに対する単クローン性抗体で免疫学的に検出する。次いで、存在する
複合体の量を、例えば、定量デンシトメトリーを用いて定量することができる
(数千の相対光単位(RUL)で表したPSA−α2−Mの典型的な用量応答対
PSA−α2−M希釈率に関する図6を参照)。
好ましい実施の形態において、遮断剤を基質に施して、非特異的結合を遮断す
る。非特異的結合に特に効果的であればどのような遮断剤を用いても差し支えな
い。この目的に特に効果的な遮断剤は、サイテックラボラトリーズ(ユタ州、ロ
ーガン)から市販されている、スーパーブロックである。
この試料をイムノアッセイまたはウエスタン法の前に前処理してもよい。前処
理により、このPSA−α2−M複合体中のPSAエピトープをより露出させ、
したがって、結合により利用しやすくしてもよい。本発明の方法の現在好ましい
実施の形態において、この前処理段階は、溶液試料を暖め、この試料をSDSの
ような洗浄剤と接触させる各工程を含む。他の洗浄剤をこの目的に用いてもよい
。
別の態様において、本発明は、被験者の生物学的液体中のPSA−α2−M複
合体の存在を検出することにより、被験者の前立腺癌の存在を検出する方法を含
む。これらの方法の好ましい実施の形態において、このPSA−α2−M複合体
は、上述したウエスタン法またはイムノアッセイ法のいずれかを用いて検出され
る。
本発明はさらに、良性の前立腺の病気と前立腺癌とを識別する、または前立腺
癌の病期を決定する方法を含む。この方法は、被験者の生物学的液体中のPSA
−α2−M複合体の量を定量し、この複合体のレベルをこの病気または癌の病期
と関係付ける各工程を含む。好ましい実施の形態において、この生物学的液体中
の複合体の量は、ウエスタン法またはイムノアッセイ法により測定される。特に
好ましい実施の形態において、PSA−α2−M複合体の血清レベルは、前立腺
癌を患った、またはその危険性のある個体から血清試料を得て、この血清試料を
、PSA特異的結合タンパク質および固相を含む第一の接合体と、この第一の接
合体と試料中のPSAとの間の反応を誘発させるのに十分な条件下で組み合わせ
ることにより測定される。この接合に用いられる固相は、この特異的結合タンパ
ク質と結合し、この処理中に形成される反応生成物を反応混合物から除去できる
どのような固体物質であっても差し支えない。固相としては、例えば、磁気粒子
、膜、高分子支持体または所望の特性を有する他の物質が挙げられる。本発明の
使
用するのには、磁気粒子が好ましい。次いで、この段階後に形成された混合物を
、この試料中のα2−Mに特異的な結合タンパク質および検出可能な部位を含む
第二の接合体と、この第二の接合体と試料中のα2−Mとの間の反応を誘発させ
るのに十分な条件下で接触させる。この時点では、PSA特異的結合タンパク質
、PSA−α2−M複合体および検出可能な部位を有するα2−M特異的結合タ
ンパク質を含む反応生成物に付着している固相を、反応混合物から分離する。次
いで、PSA−α2−M複合体の量を検出可能な部位の量に基づいて測定するこ
とができる。
本発明の全ての実施の形態に関して、被験者は好ましくは人間であり、生物学
的液体は好ましくは血液血清または血漿、もしくはその分画である。「結合タン
パク質」という用語は、単クローン性および多クローン性抗体、Fab、Fab
’Fvのような抗体断片、および一本鎖結合部位を含む。
本願出願人は、多量のPSA−α2−M複合体が前立腺癌患者の血清中に存在
することを発見した。PSA−α2−M複合体の量は、癌の病期または病原力を
表す。したがって、前立腺癌の存在を検出することに加えて、本発明の別の態様
は、検出された癌の病期を決定する方法、患者内の前立腺癌の経過をモニタする
方法、および前立腺癌とBPHのような良性の病期とを識別する方法を含む。
本発明はさらに、これらの方法を実施するキットを含む。ある実施の形態にお
いて、このキットは、最小限で、PSA特異的結合タンパク質および分離可能な
タグまたは固相を含む第一の接合体;およびα2−Mに特異的な結合タンパク質
および検出可能な部位を含む第二の接合体を含む。このキットは、必要に応じて
、様々な試薬および容器、またはこの方法を実施するのに有用な他の成分を含ん
でもよい。
本発明は、被験者の生物学的液体中のPSA−α2−M複合体の存在および/
または量が前立腺癌の存在および病期を表すという発見に基づいて、個体内の前
立腺癌の存在を検出する、その病期をモニタする、およびその病期を決定する、
改良された方法およびキットを提供する。本発明の方法およびキットは、前立腺
癌とBPHのような良性の前立腺の病期とを識別する手段も提供する。
本発明はさらに、いかようにも限定するものを意図するものではない以下の実
施例により説明される。実施例1 分子篩クロマトグラフィー
スーパーデックス200ゲルをファーマシア(スウエーデン、ウップサレ)か
ら購入した。分子量マーカーをバイオラド(カリフォルニア州、リッチモンド)
から購人した。このマーカーは、カタラーゼ(240kDa)、ウシ血清アルブミ
ン(67kDa)、オバルブミン(43kDa)、キモトリプシノーゲン(25kDa
)およびリボヌクレアーゼ(14kDa)を含んでいた。この実施例および以下の
実施例に使用した患者の血清試料は、前立腺癌の進行した形態を有する患者から
採取した。これらの血清は、エム.ディー.アンダーソン癌センター(テキサス
州、ヒユーストン)のハーバート エー.フリッシェ博士(Herbert A.Fritsche
,Ph.D.)およびスタンフォード大学医療センター(カリフォルニア州、スタンフ
ォード)のトーマス エー.ステイミー医学博士(Thoma A.Stamey,M.D.)から
得た。患者の血清試料(200-500μL)を、バイオラドのエコノカラム中に充填し
た75×1.5cmのスーパーデクス200ゲル上で0.1mL/分の流量で分別した。
0.5mLの分画を採集し、イムノアッセイにより分析した。溶出緩衝液は、0.02
%のウシ血清アルブミンおよび0.1%のトリトンX−100を有するリン酸緩衝
生理食塩水(50mMのリン酸ナトリウム、150mMの塩化ナトリウム、pH6.9)
を含有していた。クロマトグラフ分画中のPSAを製造業者の指示にしたがって
以下のアッセイにより測定した:i)ACS(商標)PSAアッセイ(マサチュー
セッツ州、イーストワルポールのカイロンダイアグノスティクス社のカイロンA
CS:180(登録商標)システムに使用するようにフォーマットされた、自動
化多クローン性/単クローン性イムノケミルミノメトリッタアッセイ)、および
ハイブリテック(登録商標)タンデム(登録商標)−R PSAアッセイ(カリ
フォルニア州、サンディエゴのハイブリテック社の手動式二重単クローン性イム
ノラジオメトリックアッセイ)。現在のPSAイムノアッセイでは、PSA−α
2−マクログロブリン複合体を認識し、測定できない。
図1は、上述した方法による、血清の分別により得られたPSAのクロマトグ
ラフィー溶出分布を示している。血清(0.2mL)をスーパーデックス200(7
5×1.5cm)カラムに施した。分画(0.5mL)を0.1mL/分の流量で採集し、
PSAに関してタンデム−RアッセイおよびACS PSAアツセイによりアッ
セイした。前立腺癌患者のこの典型的な分布は、16.5%の遊離PSAおよび83.5
%のPSA−アルファ1−抗キモトリプシン複合体を含有している。実施例2 ウエスタンブロット分析
標準的なイムノアッセイによるPSA検出に加えて、いくつかの患者の血清お
よび血清の選択した分画(分子篩クロマトグラフィー後の)に、トービン(Towbi
n)およびゴーデン(Gorden)の方法にしたがってウエスタンブロット分析を施した
。J.Immunol.Methods 72:313-340(1984)。陰イオン系洗浄剤(SDS)中での可
溶化後、試料を線形勾配でラエムリ(Laemmli)ゲル(1.5mm厚)に施した。バイ
オラドのプロティーンIIxiシステム内で電気泳動を行った。タンパク質をバイ
オラドのトランスブロットセルを用いてニトロセルロース膜に移した。膜をスー
パーブロック(ユタ州、ローガン、P.O.Box3286のサイテックラボラトリ
ーズ)を用いて遮断して、非特異的タンパク質結合を減少させ、タンパク質をヒ
トPSAに対する単クローン性抗体(F5−A−1/22.8.13;ATCC
HB 8051)で免疫的に検出した。単離したバンドの視覚化を、抗マウス
IgGに接合したホースラディッシュペルオキシダーゼ(カリフォルニア州、ハ
ーキュレスのバイオラド)で行い、ECLシステム(イリノイ州、ロックフォー
ドのアメルシャム)を用いて、向上した化学発光技術により検出した。
ウエスタンブロットの定量デンシトメトリーに関して、IS−1000デジタ
ルイメージングシステム(コネチカット州、ブラッドフォード、765イーストメ
インストリートのサンバイオサイエンス社)を用いた。このシステムにおいて、
デジタルビデオカメラが、ウエスタンブロットの画像をとらえ、全てのバンドの
染色密度を定量する。システムのソフトウェアを用いて、PSAの異なる形態(
遊離PSA、PSA−α1−抗キモトリプシンおよびPSA−α2−マクログロ
ブリン複合体)への分布を計算できる。実施例3 PSA−α2−M複合体に関するイムノアッセイ実験方法
血清 100μL
+
固相(抗PSA Mab:F5)
250μL
↓2時間に亘り37℃で保温
磁気分離、2回洗浄
試薬を添加(ヒツジ抗α2−M多クローン性)
100μL
↓30分間に亘り37℃で保温
磁気分離、2回洗浄
マジックライトアナライザ2内でフラッシュさせる
このアッセイに使用したPSA単クローン性抗体:F5−A−1/22.8.
13 ATCC HB8051。使用したこの抗α2−M多クローン性抗体は、
ダコー社(デンマーク、コペンハーケン)から得られる、親和性精製されたウサ
ギ抗ヒトα2−マクログロブリンであった。PSA−α2−M複合体を認識する
他の抗体を使用しても差し支えなく、それらは市販されている。
前立腺操作の前に血清試料を採集し、評価するまで−20℃または−80℃で貯蔵
した。血清試料は、以下の研究所および研究者から得た:エム.ディー.アンダ
ーソン癌センター(テキサス州、ヒューストン)のハーバート エー.フリッシ
ェ博士(Herbert A.Fritsche,Ph.D.)およびスタンフォード大学医療センター(
カリフォルニア州、スタンフォード)のトーマス エー.ステイミー医学博士(T
homa A.Stamey,M.D.)。この研究に使用した血清試料は、前立腺癌の進行した
患者からのものであった。実施例4
実施例2に記載した実験方法を用いて、実施例1に記載した分別した前立腺癌
血清において様々な形態のPSAのウエスタンブロット分析を行った。タンパク
質を、SDS PAGE(3-15%勾配)を行った後にニトロセルロース膜上にブ
ロットし、抗PSA MAB F5で免疫学的に検出した。その結果が図2に示
されている:レーン1、低Mrマーカー;レーン2、スタンフォードの対照PS
A;レーン3、純粋α1−ACT;レーン4、純粋α2−M;レーン5、精製P
SA−α1−ACT複合体(生体外で調製した);レーン6、精製PSA−α2
−M複合体(生体外で調製した);レーン7、分画90番;レーン8、分画124番
;レーン9、分画153番;レーン10、高Mrマーカー。実施例5
実施例2に記載した実験方法を用いて、実施例1に記載した、分別された前立
腺癌血清のウエスタンブロット分析を行った。分離したタンパク質を抗α1−A
CT Mabで免疫学的に検出した。その結果か図3に示されている。レーン1
、スタンフォードの対照PSA;レーン2、純粋α1−ACT;レーン3純粋α
2−M;レーン4、生体外で調製し、非反応遊離α1−ACTを含有するPSA
−α1−ACT複合体;レーン5、分画90番、約700kDaの分画;レーン6、
分画124番、PSA−α1−ACTピーク分画;レーン7、分画153番、遊離PS
Aピーク分画;レーン8、分子量マーカー;レーン9、還元α1−ACT(レー
ン2と同様);レーン10、生体外で調製した還元PSA−α1−ACT複合体;
レーン11、還元分画124番、PSA−α1−ACTピーク分画。実施例6
実施例2に記載した実験方法を用いて、実施例1に記載した、分別された前立
腺癌血清のウエスタンブロット分析を行った。分離したタンパク質を抗α2−M
Mabで免疫学的に検出した。その結果が図4に示されている。レーン1、分
子量マーカー;レーン2、スタンフォードの対照PSA;レーン3、純粋α1−
ACT;レーン4、純粋α2−M;レーン5、生体外で調製したPSA−α2−
M複合体;レーン6、分画92番、約700kDaの分画;レーン7、分画124番、P
SA−α1−ACTピーク分画;レーン8、分画152番、遊離PSAピーク分画
;レーン9、分子量マーカー;レーン10、還元α2−M;レーン11、生体外で調
製した還元PSA−α2−M複合体;レーン12、還元分画92番、血清から分別し
たPSA−α2−M分画;レーン13、還元分画124番。実施例7
実施例2に記載した実験方法を用いて、前立腺癌のそのままの血清において様
々なPSAのウエスタンブロット分析を行った。タンパク質を、SDS PAG
E(10-15%勾配)を行った後にニトロセルロース膜上にブロットし、抗PSA
Mab F5で免疫学的に検出した。その結果が図5に示されている。レーン1
、低Mrマーカー;レーン2、正常な女性の血清;レーン3から6、以下のPS
A濃度を有する前立腺癌血清:レーン3、945μg/L;レーン4,980μg/L
;レーン5、1540μg/L;レーン6、1600μg/L;レーン7、高Mrマーカ
ー。実施例8 PSA−α2−Mイムノアッセイの校正
:
校正物質またはイムノアッセイを用いなければ、このアッセイを標準化し、校
正するのが非常に難しくなる。本願出願人は、非常に単純な概念を用いて、α2
−Mと複合体を形成したPSAに関してこのアッセイを校正した。遊離PSAを
正常な女性の血清に添加した場合、この遊離PSAは、α2−Mと複合体を形成
し、形成されたPSA−α2−M複合体は、現在の全PSAイムノアッセイによ
り認識したり、測定することができないことが知られている。我々は、タンパク
質緩衝溶液(1%のウシ血清アルブミンを有するリン酸緩衝生理食塩水)および
正常な女性の血清中の精製された遊離PSAの同一の希釈物を調製した。両方の
希釈物を48時間に亘り保温し、全PSAをACS PSA2イムノアッセイ(マ
サチューセッツ州、イーストワルポールのカイロンダイアグノスティクス)を用
いて測定した。女性の血消中の希釈物は、タンパク質緩衝液中の全PSA値と比
較して低い全PSA値が得られた(前述したように、この全PSAアッセイは、
PSA−α2−M複合体を認識しない)。全PSA値の差を用いて、女性の血清
中のα2−Mと複合体を形成したPSAの量を計算した。
タンパク質緩衝液および女性の血清中の全PSA濃度を、48時間に亘る同量の
遊離PSAとのインキュベーション後に測定した:
タンパク質緩衝液 2.256μg/mL
女性の血清 0.839μg/mL
したがって、女性の血清中のα2−Mと複合体を形成したPSAは、(2.256
−
0.839=)1.417μg/mLであった。α2−Mに結合した1.417μg/mLのP
SAを有するこの菌株溶液を用いて、標準物を調製し、PSA−α2−M複合体
イムノアッセイに用いた。この複合体アッセイは、女性の血清中の残留している
非反応性遊離PSAを認識したり、それと交差反応したりしない。実施例9 PSAエピトープを露出するための試料の前処理
:
α2−Mのプロテアーゼ阻害因子としての作用の機構および生化学的構造は、
この分子が、前記プロテアーゼ(PSA)をスプリング式取込様式で取り込む多
数のサブユニットからなるので複雑である。この取込みがこのPSA分子を遮断
し、この分子に、最初に部分的に解離されない限りは、抗体分子と相互作用させ
なくなる。本願出願人は、このPSA−α2−M複合体を破壊せずにPSAエピ
トープを露出する別の試薬およびpH処理も調査した。塩酸(HCl)または低
pH緩衝液による血清試料の処理がこのPSAエピトープを露出できた。
低pH(3未満)により、PSA−α2−M複合体分子の構造が不可逆的に変
化するようである。イムノアッセイは、強酸のpH(3未満)では機能しないか
もしれず、したがって、一時間後に、pHの大きいアルカリ性溶液を用いて酸を
中和する。この処理の後、PSA−α2−Mは、PSA−α2−Mイムノアッセ
イを用いて認識し、定量測定できた。
実施例:20μLの5NのHClを500μLの血清試料に加えて、そのpHを1.5
-3に低下させた。試料を室温で1時間に亘り1.5-3の間の低pHに保持した。1
時間後、5μLの6Nの水酸化ナトリウム溶液(NaOH)を加えて、酸を中和
させ、そのpHを5.8-7の間にした。この酸/低pH処理血清により、所定の試
料においてPSA−α2−M複合体を定量できる。
図7を参照する。ここでは、PSA−α2−M複合体イムノアッセイは、血清
試料のpH処理後(+により同定される試料)に複合体を認識できたけれども、
未処理血清試料(−により同定される試料)からの信号(相対光単位すなわちR
LU)は、ノイズ(バッタグラウンド)レベルに近かった。用量応答が、血清試
料のpH処理後に著しく改良された(図8参照)。同等物
当業者は、ここに記載した特定の実施の形態に対する同等物を決定することが
できる。そのような同等物の全ては、以下の請求の範囲内に含めることを意図す
るものである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,GM,KE,LS,M
W,SD,SZ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY
,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM),AL,AM
,AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,
CA,CH,CN,CU,CZ,DE,DK,EE,E
S,FI,GB,GE,GH,GM,GW,HU,ID
,IL,IS,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,
LC,LK,LR,LS,LT,LU,LV,MD,M
G,MK,MN,MW,MX,NO,NZ,PL,PT
,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL,
TJ,TM,TR,TT,UA,UG,US,UZ,V
N,YU,ZW
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.ヒトの生物学的液体中のPSA−α2−マクロクロブリン複合体の存在を検 出する方法であって、該生物学的液体の試料を、PSA−α2−マクログロブ リン複合体に特異的に結合する結合タンパク質と接触させ、該複合体に結合し た結合タンパク質を検出する各工程を含むことを特徴とする方法。 2.前記生物学的液体が血清であることを特徴とする請求の範囲第1項記載の方 法。 3.前記液体を界面活性剤で前処理する工程を含むことを特徴とする請求の範囲 第1項記載の方法。 4.前記界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムを含むことを特徴とする請求の範 囲第3項記載の方法。 5.前記前処理工程が前記液体を加熱する工程を含むことを特徴とする請求の範 囲第3項記載の方法。 6.ヒトの生物学的液体中のPSA−α2−マクログロブリン複合体の量を測定 する方法であって、 a) 前記生物学的液体の試料を界面活性剤と組み合わせ、 b) 該試料中の化合物をSDS−PAGEを用いて分離し、 c) 工程(b)で得られた分離化合物を固体基質に移送し、 d) 該基質上の化合物を、PSAおよびα2−マクログロブリンに特異的 な検出可能なラベルと接触させ、それによって、PSA−α2−マクログロブ リン複合体をラベルし、 e) ラベルされた複合体の量を測定する各工程を含むことを特徴とする方 法。 7.前記生物学的液体が血清であることを特徴とする請求の範囲第6項記載の方 法。 8.前記工程(b)の前に、前記液体を界面活性剤で前処理する工程を含むことを 特徴とする請求の範囲第6項記載の方法。 9.前記工程(c)の後に前記固体基質に遮断剤を添加する工程を含むことを特徴 と する請求の範囲第6項記載の方法。 10.ヒトの生物学的液体中のPSA−α2−マクログロブリンの存在または量を 検出する方法であって、 a) 前記生物学的液体の試料を、(i)PSA特異的結合タンパク質;およ び(ii)固相を含む第一の接合体と、該第一の接合体および該試料中のPSAの 間の反応を誘発させるのに十分な条件下で組み合わせ、 b) 工程(a)において形成された混合物を、(i)α2−マクログロブリンに 特異的な結合タンパク質、および(ii)検出可能なラベルを含む第二の接合体と 、該第二の接合体および前記試料中のα2−マクログロブリンの間の反応を誘 発させるのに十分な条件下で接触させ、 c) 前記試料から前記固相を分離し、 d) 前記ラベルの存在を検出することにより、前記PSA−α2−マクロ グロブリン複合体の存在または量を決定する各工程を含むことを特徴とする方 法。 11.被験者中の前立腺癌の存在を検出する方法であって、該被験者の体液中のP SA−α2−M複合体の濃度を測定する工程を含み、該複合体の濃度が前記癌 の存在を表すことを特徴とする方法。 12.PSA−α2−マクログロブリン複合体の存在が、 a) 生物学的液体の試料を、(i)PSA特異的結合タンパク質、および(ii )分離可能なタグを含む第一の接合体と、該第一の接合体および前記試料中の PSAの間の反応を誘発させるのに十分な条件下で接触させ、それによって、 タグ付き反応生成物を形成させ、 b) 工程(a)において形成された混合物を、(i)α2−マクログロブリンに 特異的な結合タンパク質、および(ii)検出可能なラベルを含む第二の接合体と 、該第二の接合体および前記試料中のα2−マクログロブリンの間の反応を誘 発するのに十分な条件下で接触させ、 c) 前記試料からタグ付けされた反応体を分離し、 d) 前記ラベルの存在を検出することにより前記PSA−α2−マクログ ロブリン複合体の存在を決定する各工程を含むイムノアッセイ法により決定さ れることを特徴とする請求の範囲第11項記載の方法。 13.前記分離可能なタグが磁気ビーズを含むことを特徴とする請求の範囲第12項 記載の方法。 14.前記検出可能なラベルが化学発光化合物または放射性材料を含むことを特徴 とする請求の範囲第12項記載の方法。 15.前記PSA特異的結合タンパク質が、F5−A−1/22.8.13(AC TT No.HB8051)を含むことを特徴とする請求の範囲第12項記載の 方法。 16.前記α2−マクログロブリン結合タンパク質が親和性精製抗体を含むことを 特徴とする請求の範囲第12項記載の方法。 17.前記生物学的液体が血清を含むことを特徴とする請求の範囲第12項記載の方 法。 18.前記血清が工程(a)の前に前処理されていることを特徴とする請求の範囲第1 7項記載の方法。 19.被験者中の前立腺癌の病原力を測定する方法であって、該被験者の生物学的 液体中のPSA−α2−マクログロブリン複合体の濃度を測定する工程を含み 、該複合体の濃度が前記癌の病原力を表すことを特徴とする方法。 20.被験者中の前立腺癌をモニタする方法であって、該被験者の生物学的液体中 のPSA−α2−マクログロブリン複合体の濃度を測定する工程を含み、該複 合体の濃度が前記癌の病期を表すことを特徴とする方法。 21.被験者中の前立腺癌を診断する方法であって、該被験者の生物学的液体中の PSA−α2−マクログロブリン複合体の存在を測定する工程を含み、該複合 体の存在が前立腺癌の存在を表すことを特徴とする方法。 22.被験者中の前立腺癌と良性の前立腺の病期とを識別する方法であって、該被 験者の生物学的液体中のPSA−α2−マクログロブリン複合体の存在を測定 する工程を含み、該複合体の存在が前立腺癌の存在を表すことを特徴とする方 法。 23.被験者中の前立腺癌を検出する方法であって、 a) α2−M PSA複合体を含有する、前記被験者からの生物学的液体 の試料を、該複合体に特異的に結合する第一の結合タンパク質と接触させ、 b) 該複合体に結合した第一の結合タンパク質の量を測定し、それによっ て、該試料中の該複合体の量を測定し、ここで、該複合体の量が前立腺癌を表 す各工程を含むことを特徴とする方法。 24.前記方法が、工程(a)の前に、前記被験者から単離した体液試料を界面活性 剤と混合する工程を含むことを特徴とする請求の範囲第23項記載の方法。 25.前記界面活性剤が洗浄剤であることを特徴とする請求の範囲第24項記載の方 法。 26.前記洗浄剤がドデシル硫酸ナトリウムであることを特徴とする請求の範囲第 25項記載の方法。 27.工程(a)において、前記結合タンパタ質が抗体であることを特徴とする請求 の範囲第23項記載の方法。 28.前記抗体が単クローン性抗体であることを特徴とする請求の範囲第27項記載 の方法。 29.前記結合タンパク質が前記複合体中でα2−Mと結合していることを特徴と する請求の範囲第23項記載の方法。 30.前記結合タンパク質が前記複合体中でPSAと結合していることを特徴とす る請求の範囲第23項記載の方法。 31.工程(a)において、前記結合タンパク質が検出可能な部位によりラベルされ ていることを特徴とする請求の範囲第23項記載の方法。 32.前記検出可能な部位が化学発光トレースであることを特徴とする請求の範囲 第31項記載の方法。 33.前記検出された複合体の量が前記癌の病期を表すことを特徴とする請求の範 囲第23項記載の方法。 34.個体中の前立腺癌を検出する方法であって、 a) 該個体から単離された体液試料に、PSA−α2−M複合体中のPS Aに結合する固体支持体上に固定化された第一の結合タンパク質を接触させ、 b) 前記体液試料から、該第一の結合タンパク質に結合した前記PSA− α2−M複合体を単離し、 c) 該単離した複合体を、該複合体中のα2−Mに結合する第二の結合タ ンパク質と接触させ、 d) 前記複合体に結合した第二の結合タンパタ質の量を測定し、それによ って、該複合体の量を測定し、ここで、該複合体の量が前立腺癌を表す各工程 を含むことを特徴とする方法。 35.個体中の前立腺癌を検出する方法であって、 a) 該個体から単離された体液試料に、PSA−α2−M複合体中のα2 −Mに結合する固体支持体上に固定化された第一の結合タンパク質を接触させ 、 b) 前記体液試料から、該第一の結合タンパク質に結合した前記PSA− α2−M複合体を単離し、 c) 該単離した複合体を、該複合体中のPSAに結合する第二の結合タン パク質と接触させ、 d) 前記複合体に結合した第二の結合タンパク質の量を測定し、それによ って、該複合体の量を測定し、ここで、該複合体の量が前立腺癌を表す各工程 を含むことを特徴とする方法。 36.工程(a)において、前記第一の結合タンパク質が抗体であることを特徴とす る請求の範囲第34項または第35項記載の方法。 37.工程(a)において、前記抗体が単クローン性抗体であることを特徴とする請 求の範囲第36項記載の方法。 38.工程(a)において、前記固体支持体が粒子であることを特徴とする請求の範 囲第34項または第35項記載の方法。 39.工程(c)において、前記第二の結合タンパク質が抗体であることを特徴とす る請求の範囲第34項または第35項記載の方法。 40.工程(c)において、前記抗体が単クローン性抗体であることを特徴とする請 求の範囲第39項記載の方法。 41.工程(c)において、前記結合タンパク質が検出可能な部位を含むことを特徴 とする請求の範囲第34項または第35項記載の方法。 42.工程(d)において、前記複合体に結合した第二の結合タンパタ質の量の指標 として、前記検出可能な部位の量を測定する工程を含むことを特徴とする請求 の 範囲第41項記載の方法。 43.工程(a)の前に、前記体液試料を界面活性剤と混合する追加の工程を含むこ とを特徴とする請求の範囲第34項記載の方法。 44.工程(c)の前に、前記体液試料を界面活性剤と混合する追加の工程を含むこ とを特徴とする請求の範囲第35項記載の方法。 45.前記界面活性剤が洗浄剤であることを特徴とする請求の範囲第3項または第 44項記載の方法。 46.前記洗浄剤がドデシル硫酸ナトリウムであることを特徴とする請求の範囲第 45項記載の方法。 47.被験者中の前立腺癌の存在を、該被験者の生物学的液体中のPSA−α2− マクログロブリン複合体の存在を測定することにより検出するキットであって 、該キットが、 a) (i)PSA特異的結合タンパク質、および(ii)分離可能なタグを含む 第一の接合体、および b) (i)α2−マクログロブリンに特異的な結合タンパク質、および(ii) 検出可能なラベルを含む第二の接合体を含むことを特徴とするキット。 48.前記分離可能なタグが磁気ビーズを含むことを特徴とする請求の範囲第47項 記載のキット。 49.前記検出可能なラベルが、化学発光化合物または放射性材料を含むことを特 徴とする請求の範囲第47項記載のキット。 50.前記PSA特異的結合タンパク質がF5−A−1/22.8.13(ACT T No.HB8051)を含むことを特徴とする請求の範囲第47項記載のキ ット。 51.前記α2−マクログロブリン抗体が親和性精製抗体であることを特徴とする 請求の範囲第47項記載のキット。 52.前記生物学的液体が血清を含むことを特徴とする請求の範囲第47項記載のキ ット。 53.前記血清を前処理する試薬を含むことを特徴とする請求の範囲第52項記載の キット。 54.前記試薬がドデシル硫酸ナトリウムを含むことを特徴とする詰求の範囲第53 項記載のキット。 55.PSA−α2−Mアッセイのための校正溶液中のα2−Mに結合したPSA の濃度を測定する方法であって、 a) (1)タンパク質緩衝溶液および(2)正常な女性の血清中の精製した遊離 PSAの同一の希釈物を調製し、 b) 48時間に亘りインキュベーション後、全PSAを測定し、 c) これら二つの溶液間の全PSAの差を測定し、該差が前記女性の血清 中のα2−Mと複合体を形成したPSAの量を示す各工程を含むことを特徴と する方法。 56.PSA−α2−Mの濃度に関してアッセイすべき血清試料を前処理する方法 であって、 a) 前記試料のpHを、ある量の酸を加えることにより、約pH1.5-3.0 に調節し、 b) pHの調節された該試料を約1時間に亘り室温に保持し、 c) その1時間後に、該試料のpHを、ある量の塩基を加えることにより 、約5.8-7.0に調節する各工程を含むことを特徴とする方法。 57.前記酸が5NのHClであり、前記塩基が6Nの水酸化ナトリウムであるこ とを特徴とする請求の範囲第56項記載の方法。 58.工程(a)において、前記粒子が磁気粒子であることを特徴とする請求の範囲 第38項記載の方法。
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