RU2312109C2 - Моноклональное антитело и продуцирующая его гибридома - Google Patents
Моноклональное антитело и продуцирующая его гибридома Download PDFInfo
- Publication number
- RU2312109C2 RU2312109C2 RU2005131842/13A RU2005131842A RU2312109C2 RU 2312109 C2 RU2312109 C2 RU 2312109C2 RU 2005131842/13 A RU2005131842/13 A RU 2005131842/13A RU 2005131842 A RU2005131842 A RU 2005131842A RU 2312109 C2 RU2312109 C2 RU 2312109C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hepr
- monoclonal antibody
- human
- antibody
- human epiregulin
- Prior art date
Links
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 title claims abstract description 30
- 101001056707 Homo sapiens Proepiregulin Proteins 0.000 claims abstract description 98
- 102000043415 human EREG Human genes 0.000 claims abstract description 98
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 51
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 claims abstract description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 claims description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims description 6
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 claims description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 23
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 19
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract 1
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 102000007134 Epiregulin Human genes 0.000 description 23
- 101800000155 Epiregulin Proteins 0.000 description 23
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 14
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 14
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 12
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 12
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 12
- 101500026394 Homo sapiens Epiregulin Proteins 0.000 description 10
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 8
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 6
- 101500026396 Mus musculus Epiregulin Proteins 0.000 description 6
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 4
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 3
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007299 Amphiregulin Human genes 0.000 description 2
- 108010033760 Amphiregulin Proteins 0.000 description 2
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000193764 Brevibacillus brevis Species 0.000 description 2
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 2
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 230000005861 gene abnormality Effects 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N (4S)-4-[[(4R,7S,10S,16S,19S,25S,28S,31R)-31-[[(2S)-2-[[(1R,6R,9S,12S,18S,21S,24S,27S,30S,33S,36S,39S,42R,47R,53S,56S,59S,62S,65S,68S,71S,76S,79S,85S)-47-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-3-methylbutanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)propanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-18-(4-aminobutyl)-27,68-bis(3-amino-3-oxopropyl)-36,71,76-tribenzyl-39-(3-carbamimidamidopropyl)-24-(2-carboxyethyl)-21,56-bis(carboxymethyl)-65,85-bis[(1R)-1-hydroxyethyl]-59-(hydroxymethyl)-62,79-bis(1H-imidazol-4-ylmethyl)-9-methyl-33-(2-methylpropyl)-8,11,17,20,23,26,29,32,35,38,41,48,54,57,60,63,66,69,72,74,77,80,83,86-tetracosaoxo-30-propan-2-yl-3,4,44,45-tetrathia-7,10,16,19,22,25,28,31,34,37,40,49,55,58,61,64,67,70,73,75,78,81,84,87-tetracosazatetracyclo[40.31.14.012,16.049,53]heptaoctacontane-6-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-7-(3-carbamimidamidopropyl)-25-(hydroxymethyl)-19-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-28-(1H-imidazol-4-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15,18,21,24,27,30-nonaoxo-16-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14,17,20,23,26,29-nonazacyclodotriacontane-4-carbonyl]amino]-5-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(2S)-3-carboxy-1-[[(2S)-1-[[(2S)-1-[[(1S)-1-carboxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-3-(1H-imidazol-4-yl)-1-oxopropan-2-yl]amino]-5-oxopentanoic acid Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H]3NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]4CCCN4C(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](Cc4c[nH]cn4)NC(=O)[C@H](Cc4ccccc4)NC3=O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc3ccccc3)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N3CCC[C@H]3C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc2ccccc2)NC(=O)[C@H](Cc2c[nH]cn2)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)C(C)C)C(=O)N[C@@H](Cc2c[nH]cn2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](Cc2ccc(O)cc2)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O NMWKYTGJWUAZPZ-WWHBDHEGSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008720 Bone Marrow Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000725101 Clea Species 0.000 description 1
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100031000 Hepatoma-derived growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101001083798 Homo sapiens Hepatoma-derived growth factor Proteins 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 108010030694 avidin-horseradish peroxidase complex Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000006287 biotinylation Effects 0.000 description 1
- 238000007413 biotinylation Methods 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 201000006491 bone marrow cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000005907 cancer growth Effects 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 108010034429 heregulin alpha Proteins 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004565 tumor cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57419—Specifically defined cancers of colon
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57423—Specifically defined cancers of lung
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии. Предложены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, специфичные в отношении эпирегулина человека (hEPR). Раскрыто моноклональное антитело, специфически распознающее эпирегулин человека с чувствительностью 10 пг/мл. Описаны способы специфического выявления эпирегулина человека в образце in vitro и способ выявления клеток, экспрессирующих эпирегулин человека во внеклеточной жидкости in vitro с использованием моноклонального антитела к эпирегулину человека. Использование изобретения позволяет просто и с высокой чувствительностью выявлять эпирегулин человека, что может найти применение в диагностике опухолей человека, экспрессирующих эпирегулин. 5 н. и 3 з.п. ф-лы, 7 ил.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к моноклональному антителу (MoAb), которое специфически распознает человеческий эпирегулин (hEPR), к гибридоме, которая продуцирует MoAb, и к способу иммунологического измерения для специфического выявления hEPR в образцах с использованием hEPR-поликлонального антитела (hEPR-PoAb), которое распознает hEPR и MoAb.
Предшествующий уровень техники
Было известно, что существуют определенные генные аномалии, которые возникают со специфичностью и высокой частотой в раковых клетках, и если обнаруживается белок (белки), которые вызваны генной аномалией, то такой белок может представлять собой молекулу-мишень для диагностики и лечения рака. Среди них группа молекул, которые относятся к семейству эпидермального ростового фактора (EGF), и молекулы семейства их рецепторов ErbB были молекулами-мишенями для диагностики и лечения рака, поскольку они участвуют в росте раковых клеток и связаны со злокачественностью (J. Clin. Oncol., 17, 2639-2648 (1999); Biochem. Biophys. Acta., 1198, 165-184 (1994); Science, 244, 707-712 (1989); Anticancer Res., 20:91-95 (2000); Front. Biosci., 1;6:D685-707 (2001)).
Сообщалось, что эпирегулин (EPR), член семейства EGF, имеет бифункциональный характер в том смысле, что он способствует росту нормальных клеток и ингибирует рост определенных раковых клеток in vitro, и что уровень экспрессии EPR (мРНК) в нормальных клетках крайне низок, за исключением плаценты и моноцитов, но высок в определенных раковых клетках (см., например, The Journal of Biological Chemistry, 1995, Vol. 270, p. 7495-7500; The Biochemical Journal, 1997, Vol. 326, p. 69-75).
Далее, в клинической области указывается, что эпирегулин может представлять собой полезный маркер для диагностики рака, потому что его экспрессия высока при раке мочевого пузыря и раке поджелудочной железы (см., например, Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000, Vol.14 273 (3), p.1019-1024; AntiCancer Research, 2000, Jan-Feb, 20 1A9: p.91-95; Cancer Research, 2001, Vol.61, p.6227-6233).
До настоящего времени были сообщения о том, что полипептид EPR выявляется с использованием поликлональных антител (hEPR-PoAb), которые распознают человеческий эпирегулин (hEPR) (см., например, The Journal of Biological Chemistry, 1995, Vol.270, p.7495-7500; The Biochemical Journal, 1997, Vol.326, p.69-75), но они не представляют собой способы с высокой чувствительностью и высокой производительностью, потому что они требуют операций концентрации, метки радиоизотопами и им подобными метками, и нет сообщений о выявлении полипептида EPR в живом организме. Таким образом, разработка простого и высокочувствительного способа выявления hEPR может предоставить полезное средство в качестве способа диагностики рака для его раннего выявления.
Описание изобретения
Известно, что гомология аминокислотной последовательности между EPR и другими белками-членами семейства EGF составляет от 24 до 50% (см. The Journal of Biological Chemistry, 1995, Vol. 270, p.7495-7500). Кроме того, гомология последовательности EPR между видами очень высока, например, EPR человека и мыши отличаются только по 6 из 46 аминокислотных остатков. Способ выявления EPR c использованием описанных выше поликлональных антител требует сложных процедур и не может дифференцировать EPR человека и мыши. К тому же чувствительность обычных способов выявления составляет максимум 1 нг/мл и поэтому невозможно выявить EPR в живом организме.
Целью настоящего изобретения является предоставление простого и высокочувствительного способа выявления hEPR и использование способа для выявления опухолей человека. В частности, настоящее изобретение предоставляет простой способ выявления hEPR на пикограммовом уровне, который можно использовать для выявления опухолей и подобных целей.
Заявители провели тщательные исследования для решения описанных выше проблем и в конечном счете получили 2 гибридомы (IC3, 3E8), продуцирующие моноклональные антитела (MoAb), которые специфически распознают hEPR. Кроме того, разработан сэндвич-иммуноферментный твердофазный анализ (S-ELISA) комбинированием MoAb и hEPR-PolyAb и разработана система выявления, которая высокочувствительна и высокопроизводительна.
Таким образом, изобретение предоставляет следующее от (1) до (9).
(1) Гибридому, продуцирующую моноклональное антитело, которое специфически распознает человеческий эпирегулин hEPR.
(2) Гибридому по п.(1), которая имеет номер доступа FERM BP-08647.
(3) Гибридому по п.(1), которая имеет номер доступа FERM BP-08647.
(4) Моноклональное антитело, продуцируемое гибридомой по любому из пп.(1)-(3).
(5) Моноклональное антитело, которое распознает эпитоп, который распознается моноклональным антителом, продуцируемым гибридомой по пп.(2) или (3), и специфически распознает hEPR.
(6) Способ специфического выявления hEPR в образце in vitro, отличающийся тем, что используются моноклональное антитело по п.(4) и поликлональное антитело, которое распознает hEPR (hEPR-PoAb).
(7) Способ выявления клеток, экспрессирующих hEPR in vitro, отличающийся тем, что используется моноклональное антитело по п.(4).
(8) Способ по п.(7), при котором клетки, экспрессирующие hEPR, представляют собой опухоль человека.
(9) Набор для выявления опухоли человека, включающий моноклональное антитело по п.(4).
Содержание описания и/или чертежей заявки на патент Японии № 2003-070864, которая является основанием приоритета настоящей заявки, полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 показаны результаты измерения титра моноклонального антитела против hEPR, которое продуцируется гибридомой настоящего изобретения, способом ELISA.
На фиг.2 показаны результаты измерения титра биотинилированного поликлонального антитела против hEPR.
На фиг.3 показана чувствительность выявления системы сэндвич-ELISA (S-ELISA) с использованием поэтапного способа и одномоментного способа.
На фиг.4 показаны результаты теста специфичности настоящего способа с использованием моноклонального антитела 1С3 в качестве первого антитела. В настоящей системе моноклональное антитело не взаимодействует с молекулами семейства EGF или мышиным EPR и взаимодействует только с hEPR.
На фиг.5 показан результат анализа вестерн-блоттингом hEPR в сыворотке человека. Положения маркеров молекулярной массы (кДа) показаны слева.
На фиг.6 показано выявление hEPR в сыворотке человека S-ELISA.
На фиг.7 показано выявление hEPR в различных средах клеточных культур.
Лучший способ осуществления изобретения
Хотя настоящее изобретение подробно описано ниже, специалисты в данной области могут реализовать настоящее изобретение в различных вариантах осуществления, используя методики, известные в данной области, и настоящее изобретение не ограничено следующими вариантами осуществления.
Используемый в настоящем описании термин «hEPR» при отсутствии других указаний означает предшественник, зрелую форму или фрагмент человеческого эпирегулина. «Предшественник» означает связанную с мембраной форму перед отщеплением ферментом, а «зрелая форма» означает полипептид с 46 аминокислотными остатками (SEQ ID NO:1), высвобожденный из клеточной мембраны. Фрагмент содержит 20 аминокислотных остатков или более, или предпочтительно 30 аминокислотных остатков или более полипептида и должен содержать последовательность, специфичную для человеческого эпирегулина. Последовательность, специфичная для человеческого эпирегулина, не означает, что она ограничена, но включает, например, последовательность, содержащую 2-ю, 11-ю, 26-29-е и 39-ю аминокислоты аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1, которые, как известно, различны, когда сравниваются человеческий эпирегулин и мышиный эпирегулин. Тот факт, что аминокислоты в этих сайтах различны у человека и мыши, описан в патентной заявке WO94/29340 того же заявителя. Фрагменты, имеющие аминокислотную последовательность, содержащую эти сайты, принимают различные высшие структуры, когда сравниваются фрагменты EPR, полученные у человека и мыши. «Человеческий эпирегулин» и «мышиный эпирегулин» представляют собой полипептиды с такой же аминокислотной последовательностью, как у EPR, естественно присутствующего соответственно у человека и мыши. Однако они необязательно ограничиваются белками, экстрагированными из естественных источников, но предполагается, что они включают, например, рекомбинанты и синтетические полипептиды.
Используемый в настоящем описании термин «специфически распознает» означает, что распознается (или связывается) hEPR, но другие белки семейства EGF или нечеловеческий EPR, такой как мышиный EPR, и им подобные, по существу, не распознаются (связываются). Это означает, например, что распознается (связывается) предшественник, зрелый белок и фрагментированные полипептиды hEPR, но EGF и TGF-α, мышиный EPR и им подобные, по существу, не распознаются (не связываются). В частности, это означает, что его аффинитет связывания по сравнению с аффинитетом связывания других белков семейства EGF и нечеловеческого EPR, такого как мышиный EPR, выше в 100 раз или более предпочтительно в 1000 раз или более, предпочтительнее в 10000 раз или более.
Используемый в настоящем описании термин «по существу не распознаются (не связываются)» означает, что связывание не подтверждено средством выявления, в целом используемым в данной области, или настоящего изобретения. В частности, он означает, что предшественник - зрелый белок и фрагментированный полипептид hEPR - проявляет положительную реакцию на способ сэндвич-ELISA (S-ELISA), способ вестерн-блоттинга или им подобные, но EGF и TGF-α семейства EGF, и EPR, полученный у млекопитающих, кроме человека, таких как мышь, не проявляют реакцию (не выявляются).
Используемый в настоящем описании термин «антитело» означает поликлональное антитело (PoAb) или моноклональное антитело (MoAb), которое специфически связывается с молекулой hEPR полной длины или фрагментом hEPR, или частичный фрагмент этих антител (например, фрагменты (Fab или F(ab')2 или Fab'), полученные расщеплением папаином или пепсином, или им подобными ферментами, и их можно получить способами продукции, описанными ниже.
Гибридомы и моноклональные антитела настоящего изобретения можно получить следующим образом. Кроме того, специалисты в данной области могут использовать подходящим образом измененные способы на основании следующего описания и методик, известных в данной области.
(1) Получение антигена
Аминокислотная последовательность антигена hEPR и нуклеотидная последовательность, которая кодирует его, описаны в WO94/29340. Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность показаны соответственно в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2. Кроме того, EPR описан в качестве фактора, ингибирующего рост опухолевых клеток, в WO94/29340.
Рекомбинантный человеческий EPR можно получить, как описано в WO94/29340, конструированием вектора экспрессии, который содержит фрагмент ДНК (SEQ ID NO:2), кодирующей hEPR, и введением и экспрессией вектора в клетках-хозяевах, например, не ограничиваясь, но предпочтительно Bacillus brevis. После экспрессии с использованием Bacillus brevis культуральную среду концентрируют в 20 раз, используя ультрафильтрационную мембрану (1000 кДа), рН доводят до 7,4 с помощью 1 М Tris-HCl (рН 8,0), и очистку проводят, используя анионно-обменную колонку, например колонку из Q-сефарозы. В этом случае рН, прошедшую через мембрану фракции, доводят до 5,0 и далее очищают катионно-обменной колонкой, например колонкой из Q-сефарозы. Затем проводят очистку колоночной хроматографией в обращенной фазе (колонка С4) с тем, чтобы получить одну полосу при электрофорезе.
hEPR можно также синтезировать химически твердофазным способом (Merrifield, J. Am. Chem. Soc., Vol. 85, p.2185 (1963)) на основании аминокислотной последовательности, показанной в SEQ ID NO:1. Химический синтез твердофазным способом обычно проводят стандартным способом, используя автоматический пептидный синтезатор.
(2) Получение поликлональных антител
Теплокровное животное иммунизируют всего 4-6 раз одним раствором пептидного антигена или вместе с носителями и разбавителями. Примеры используемых теплокровных животных включают, например, кроликов, собак, морских свинок, мышей, крыс и им подобных животных. Предпочтительно измерять титр антител взятием образцов крови после третьей подкожной иммунизации. Измерение титра антител в сыворотке проводят иммобилизацией пептида, используемого в качестве антигена, на 96-луночной титровочной микропланшете с выполнением способа ELISA. После подтверждения того, что титр антител поднялся достаточно высоко, берут цельную кровь и антитело выделяют и очищают стандартным способом. Способы очистки включают, например, осаждение сульфатом аммония, ионообменную хроматографию с использованием анионного обменника, такого как DEAE (диэтиламиноэтанол)-целлюлоза и подобной ей, гель-фильтрацию, аффинную хроматографию с активным абсорбентом, таким как белок A/G и ему подобные и другие способы очистки. Кроме того, специфичность в отношении hEPR можно увеличить очисткой с использованием колонки, в которой hEPR иммобилизован на твердой фазе.
(3) Получение моноклональных антител
Клетки, продуцирующие моноклональные антитела, получают отбором из иммунизированных теплокровных животных отдельного животного, у которого возрос титр антител, взятием селезенки или лимфатического узла через 2-5 д после последней иммунизации, слиянием продуцирующих моноклональные антитела клеток, присутствующих в этих органах, с клетками миеломы и выбором гибридом, продуцирующих MoAb. Слияние проводят в соответствии с известным способом, таким как способ Kohler at al. (Nature, 256, 495 (1975)). Клетки миеломы включают, но не ограничиваются, например, PAI, P3U1 (Health Science Research Resources Bank; HSRRB), Япония, номера по каталогу JCRB0113 и JCRB0708) и подобные им. Средства, промотирующие слияние, включают полиэтиленгликоль (PEG) и вирус Сендаи (HJB), но предпочтительно PEG с молекулярной массой от 1000 до 6000. Эффективное слияние клеток можно достичь добавлением промотирующего средства в концентрации примерно от 10 до 80% и инкубацией при 20-40°С.
Выбор моноклонального антитела можно проводить в соответствии с известным способом. В целом он проводится в среде клеточной культуры для клеток животных с добавкой НАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин). Среды для отбора и роста могут включать, например, среду PRMI1640, содержащую от 10 до 20% телячьей фетальной сыворотки и ей подобные. Клетки в целом культивируются в атмосфере 5% газообразного СО2 при температуре 20-40°С в течение периода от 5 д до 3 нед.
Надосадочные жидкости собирают из лунок, в которых культивируются клетки гибридомы, и антитела, реагирующие с антигенным пептидом, можно выбрать способом ELISA. Сначала антигенный пептид иммобилизуют на 96-луночных планшетах и затем блокируют телячьей сывороткой. После взаимодействия надосадочной жидкости гибридом с мышиными иммуноглобулинами/HRP (Amersham-Pharmacia) при 37°С в течение 1 ч возникает окрашивание при использовании тетраметилбензидинового микропланшетного пероксидазного субстрата (TMB, Funakoshi) в качестве субстрата. После окончания реакции с кислотой измеряют спектральную поглощательную способность 450/540. Отбирают антитела со спектральной поглощательной способностью примерно 3, и клонирование проводят способом конечного разведения.
Полученные таким образом клетки-мишени гибридомы культивируют, и моноклональное антитело можно получить из культуральной среды. Альтернативно клетки гибридомы можно инокулировать внутрибрюшинно, например мыши (Balb/c), и моноклональное антитело можно получить из асцитной жидкости.
Очистку моноклонального антитела можно проводить аналогичным образом в виде описанного выше обычного разделения и очистки PoAb.
Кроме того, заявители депонировали 2 вида гибридом 25 сентября 2002 г. в Международном депозитарии запатентованных организмов Национального института перспективной промышленной науки и технологии (AIST) (Центр № 6, 1-1-1 Hagashi, Tsukuba City, Ibaragi-Ken) с номерами доступа FERM P-19033 и FERM P-19034. Позднее они были перемещены 27 февраля 2004 г. в международный депозитарий на основании Будапештского договора по Международному признанию депозита микроорганизмов в целях патентной процедуры, с номерами доступа FERM BP-08647 и FERM BP-08648.
Кроме того, моноклональные антитела настоящего изобретения включают моноклональные антитела, которые специфически распознают эпитоп, который распознается моноклональными антителами, продуцируемыми описанной выше гибридомой, особенно гибридомой с номерами доступа FERM BP-08647 и FERM BP-08648, а также распознают hEPR. Эпитоп, который распознается этими моноклональными антителами, содержит аминокислотные остатки, которые включены в уникальную последовательность описанного выше hEPR.
Настоящее изобретение предоставляет способ специфического выявления hEPR, отличающийся тем, что используются описанные выше моноклональные антитела и поликлональные антитела настоящего изобретения, которые распознают hEPR (hEPR-PoAb). Образец включает кровь, биологические жидкости, тканевые экстракты и им подобные материалы, взятые у индивидуумов. Хотя определенных ограничений нет, но предпочтительным способом является способ анализа S-ELISA, включающий этап контакта образца, который может содержать антиген hEPR, с моноклональным антителом настоящего изобретения и этап контакта комплекса антиген-антитело, который генерируется на первом, с поликлональным антителом. Описанные выше этапы можно проводить последовательно (поэтапный способ) или одновременно (одномоментный способ). Способ S-ELISA описан, например, в публикации «Моноклональное антитело, гибридома и ELISA» (Iwasaki, Tatsuo et al. Kodansha Scientific), и специалисты в данной области могут осуществить способ настоящего изобретения на основании настоящего описания. Поскольку способ выявления настоящего изобретения является очень чувствительным и способен выявить hEPR при концентрации 10 пкг/мл или выше, то концентрация hEPR, экспрессированная в живом организме (примерно 20-30 пкг/мл), достаточно высокая для выявления.
Настоящее изобретение также предоставляет способ выявления in vitro клеток, экспрессирующих hEPR, в частности опухолей человека, отличающийся тем, что используются описанные выше моноклональные антитела настоящего изобретения. Поскольку hEPR секретируется из клеточной мембраны после экспрессии в клетках, то hEPR может быть выявлен во внеклеточных жидкостях, и нет необходимости в том, чтобы образец содержал клетки.
Описанный выше способ включает этап контакта образца, полученного у человека, и моноклонального антитела настоящего изобретения, и этап выявления присутствия hEPR определением того, связывается ли моноклональное антитело с hEPR в качестве индикатора или нет. Человеческие опухоли-мишени включают, например, рак легких, толстой кишки, мочевого пузыря, матки, ободочной кишки и им подобные, но не ограничиваются ими.
Поскольку способ выявления настоящего изобретения характеризуется высокой чувствительностью, выявление можно легко и быстро проводить без необходимости в таких манипуляциях с образцом, как концентрация и ему подобные. В настоящем способе образцы, содержащие hEPR в концентрации 10 пкг/мл или более, можно выявить способом S-ELISA и ему подобными, но для надежного выявления предпочтительно, чтобы образец содержал 25 пкг/мл или более.
Используя способ выявления настоящего изобретения, можно определить то, экспрессируют ли hEPR специфические опухолевые клетки или им подобные, или нет, и если да, то каков уровень экспрессии. Далее, он может способствовать выяснению связи между экспрессией hEPR и механизмом канцерогенеза. Кроме того, на основании данных об опухолевых клетках, которые экспрессируют hEPR на высоком уровне, и об уровне экспрессии у нормальных клеток можно выявить присутствие опухоли у конкретного индивидуума.
Настоящее изобретение также предоставляет набор для выявления опухоли человека, включающий моноклональное антитело настоящего изобретения.
Набор настоящего изобретения может целесообразно включать, кроме описанного выше моноклонального антитела настоящего изобретения, поликлональные антитела, буфер, красящее вещество, метящий реагент, разбавитель и им подобные вещества. Предпочтительно набор настоящего изобретения представляет собой набор для выполнения S-ELISA.
Как будет показано ниже, настоящее изобретение конкретнее объясняется вариантами осуществления, но, как описано выше, настоящее изобретение не ограничивается этими примерами.
Пример 1 Получение гибридом
100 мкл рекомбинантного hEPR (1 мг/мл) (полученного способом, описанным в WO94/29340) в солевом растворе смешивают с равным объемом полного адъюванта Фрейнда, эмульгируют и инокулируют в спину мыши (Balb/c, в возрасте 6 нед.). Через 2 нед. мышь повторно иммунизируют смесью 50 мкл солевого раствора антигенного пептида (hEPR, 1 мг/мл) и неполного адъюванта Фрейнда, эмульгируют обработкой ультразвуком и после этого еженедельно проводят дополнительные иммунизации. Через 40 д после иммунизации удаляют селезенку, лимфоциты собирают в среду PRMI1640 (с добавкой пенициллина и стрептомицина) и обрабатывают 0,17 М хлоридом аммония для удаления эритроцитов. Выделенные лимфоциты сливают со штаммом P3U1 клеток миеломы, полученных из опухоли костного мозга мышей полиэтиленгликолевым способом (PEG4000) для получения клеток гибридомы. Полученные таким способом клетки гибридомы суспендируют в среде НАТ с клетками фидера и затем распределяют на 96-луночные планшеты и культивируют в течение 15 д.
Пример 2. Скрининг для выявления моноклонального антитела
Надосадочную жидкость культуральной среды извлекают из лунок, в которых культивировались клетки гибридомы, полученные в примере 1, и способом ELISA выбирают MoAb, которые взаимодействуют с антигенным пептидом.
Сначала 100 мкл антигенного пептида в концентрации 10 мкг/мл добавляют в каждую лунку 96-луночных планшет, иммобилизуют в твердую фазу после выдерживания при 4°С в течение ночи и блокируют 200 мкл 10% телячьей сыворотки при 37°С в течение ночи. 100 мкл надосадочной жидкости культуральной среды клеток гибридомы добавляют в каждую лунку, проводят реакцию при 37°С в течение 2 ч, а затем добавляют антимышиное антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP) (Amersham-Pharmacia), которое разводят в 1000 раз, и проводят реакцию при 37°С в течение 1 ч. Окрашивание получают, используя тетраметилбензидиновый микропланшетный пероксидазный субстрат (ТМВ, Funakoshi) в качестве субстрата.
После прекращения реакции добавлением 100 мкл 4N серной кислоты измеряют спектральную поглощательную способность при 450-540 нм и отбирают MoAb, IC3 и 3Е8, которые проявляют спектральную поглощательную способность примерно 3, и клонируют способом ограниченного разведения.
Мышей (Balb/c), которым за 7 д и 3 д до этого внутрибрюшинно инъецировали 0,5 мл пристина, внутрибрюшинно инокулируют отобранными клетками гибридомы IC3 и 3Е8, продуцирующими MoAb, и асцитическую жидкость собирают примерно через 10 д. Собранную асцитическую жидкость держат при комнатной температуре в течение 30 мин при 4°С в течение ночи и центрифугируют при 15000 об/мин в течение 10 мин, а затем извлекают надосадочную жидкость.
Титры отобранных 2 видов MoAb измеряют способом ELISA, и результаты показаны на фиг.1. Количество рекомбинантного hEPR, показанное на горизонтальной оси, иммобилизируют на микролуночной планшете, добавляют IC3 или 3Е8 (1 мкг/мл) и после взаимодействия возникает окрашивание при использовании антимышиного антитела, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) и ТМВ. Результаты указывают на то, что оба MoAb взаимодействуют зависимым от концентрации образом.
Далее, гибридомы, которые продуцируют MoAb IC3 и 3Е8, были депонированы 25 сентября 2002 г. в Международном депозитарии запатентованных организмов Национального института перспективной промышленной науки и технологии (AIST) (Центр № 6, 1-1-1 Hagashi, Tsukuba City, Ibaragi-Ken) с номерами доступа FERM P-19033 и FERM P-19034.
Пример 3. Получение поликлональных антител
1 мл рекомбинантного hEPR в солевом растворе (1 мг/мл) и 1 мл полного адъюванта Фрейнда (Difco) смешивают и эмульгируют обработкой ультразвуком и иммунизируют введением в спину кроликов (японских белых, массой 2,7 кг, самок, от Japan Clea) в 10 отдельных мест или более. Через 1 мес 0,5 мл рекомбинантного hEPR в солевом растворе (1 мг/мл) и 0,5 мл неполного адъюванта Фрейнда (Sigma) смешивают и эмульгируют обработкой ультразвуком и иммунизируют второй раз аналогичным образом, как при первой иммунизации. После второй иммунизации дополнительные иммунизации проводили еженедельно 1 мл рекомбинантного hEPR в солевом растворе (1 мг/мл) и 1 мл неполного адъюванта Фрейнда, которые эмульгируют обработкой ультразвуком. Образцы крови берут через 1 нед. после иммунизации, держат при комнатной температуре в течение 1 ч после перемешивания пастеровской пипеткой, оставляют при 4°С на ночь и центрифугируют при 5000×g в течение 10 мин для получения антисыворотки.
Антисыворотку осаждают 40% сульфатом аммония, диализируют против 50 мМ Tris-HCl (рН 8,0) в течение ночи на колонке с Protein-G (Amersham-Pharmacia) для получения фракции IgG. Для дальнейшей очистки антител колонку готовят в соответствии с обычным способом на основании описания изготовителя связыванием 1 мг рекомбинантного hEPR примерно с 1 мл активированной NHS (нормальной человеческой сывороткой) Sepharose 4 Fast Flow (Amersham-Pharmacia). рН фракции IgG, полученной, как описано выше, доводят до 8,0 и культивируют посредством этой колонки в течение 10 ч или дольше, и антитела, связанные с колонкой, элюируют с 50 мМ глицина-HCl (рН 2,5)/0,15 М NaCl. рН элюированных антител сразу доводили до нейтрального уровня 1 М Tris и снова диализировали против 50 мМ фосфатного буфера (рН 7,4)/0,15 М для получения специфических антител против hEPR.
Специфические антитела биотинилируют обычным способом, используя реагент для биотинилирования (Amersham-Pharmacia). Титр биотинилированных hEPR-PoAb измеряют следующим способом. Раствор hEPR самой высокой концентрации 200 нг/мл разводят в 5 раз и иммобилизуют на 96-луночной микропланшете (100 мкл/лунку). После блокирования 25% Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co., 200 мкл/лунку) добавляют биотинилированное антитело hEPR-PoAb (0,125 мкг/мл (разбавленное 50% Block Ace (Dainippon Pharmaceutical Co.), 100 мкл/лунку) и проводят реакцию при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем добавляют Avidin-HRP (Amersham-Pharmacia), разведенный в 1000 раз в концентрации 100 мкл/лунку, и проводят реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин. После добавления ТВМ реакцию проводят при комнатной температуре в течение 30 мин и прекращают 4N серной кислотой. Спектральную поглощательную способность измеряют при 450-540 нм, и титр против антигена, иммобилизованного на твердой фазе, получают, как в примере 2. Результаты указывают на то, что все из них демонстрируют реакции, зависимые от концентрации антигена, подтверждая то, что они имеют титры, которые можно использовать (фиг.2)
Пример 4. Система сэндвич-ELISA
Систему ELISA конструируют, используя моноклональное антитело, полученное в примере 2, и поликлональные антитела, полученные в примере 3.
Моноклональное антитело, IC3, в концентрации 1 мкг/мл добавляют в микроплашету в количестве 100 мкл/планшету и инкубируют при 4°С в течение 24 ч для иммобилизации к твердой фазе. Лунки промывают 3 раза 200 мкл/планшету 50 мМ Tris-HCl, рН 7,5, содержащим 0,1% Tween 20 (TBST). Блокирование проводят добавлением 25% Block Ace в количестве 200 мкл/планшету и инкубацией при 4°С в течение 24 ч.
В поэтапном способе лунки промывают 3 раза TBST в количестве 200 мкл/планшету, добавляют hEPR, серийно разведенный в 2 раза, начиная с 1 нг/мл, и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем добавляют биотинилированное антитело hEPR-PoAb (1 мкг/мл, 100 мкл/лунку) и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч.
В одномоментном способе антиген hEPR и биотинилированное антитело hEPR-PoAb добавляют одновременно и проводят реакцию при комнатной температуре в течение 2 ч.
После промывания лунок 5 раз TBST добавляют авидин-HPR (Amersham-Pharmacia), разведенный в 1000 раз, в количестве 100 мкл/лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию прекращают добавлением 4N серной кислоты и спектральную поглощательную способность измеряют при 450/540 нм. Результаты указывают на то, что нет различия чувствительности выявления между поэтапным способом и одномоментным способом, и оба способа имеют достаточную чувствительность (25 пкг/мл) для измерения количества в живом организме (фиг.3). В аналогичном тесте, проведенном с использованием 3Е8 в качестве первичного антитела, результаты были такие же.
Пример 5. Специфичность системы сэндвич-ELISA
Специфичность настоящей системы была подтверждена способом, показанным в примере 4 (одномоментный метод).
MoAb IC3 (1 мкг/мл, 100 пкл/мл) иммобилизуют на лунках микролуночной планшеты в качестве первичного антитела и после блокировки 25% Block Ace (200 мкг/лунку) добавляют группу молекул члена семейства EGF, к которой относится EPR (6 факторов: эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста α (TGF-α), связывающий гепарин фактор роста, подобный EGF (HB-EGF), бетацеллюлин (BTC), амфирегулин (AR), герегулин-α (HRG-α), все закупленные у R&D Co. или Sigma Co.), мышиный EPR (полученный таким же путем как человеческий EPR), или человеческий EPR в количестве, показанном по горизонтальной оси, вместе с биотинилированным hEPR-PoAb (2 мкг/мл, 500 мкл/лунку; конечная концентрация 1 мкг/мл). 6 членов семейства EGF и мышиный EPR серийно разводят в 4 этапа, в 5 раз на каждом этапе, начиная с концентрации 200 нг/мл, и добавляют в количестве 200 мкл/лунку. Аналогичным образом человеческий EPR разводят в 4 этапа, в 5 раз на каждом этапе, начиная с концентрации 200 нг/мл. После реакции с авидином-HPR окрашивание получают, используя TMB.
Как показано на фиг.4, hEPR выявлялся с высокой чувствительностью, но другие молекулы, которые представляли собой молекулы семейства EGF, и мышиный EPR невозможно было выявить в концентрациях, которые выше в 1000 раз, подтверждая специфичность настоящее системы сэндвич-ELISA. Такие же результаты были получены в аналогичном тесте при использовании 3Е8 в качестве первичного антитела.
Пример 6. Анализ вестерн-блоттингом человеческого EPR в сыворотке человека
Человеческую сыворотку (Rockland INC.) разводят в 10 раз, используя 50 мМ буфер Tris-HCl при рН 7,4 (Gibco BRL). Рекомбинантный hEPR добавляют к разведенной человеческой сыворотке для получения тестируемых образцов в 5 раз серийным разведением, так что конечная концентрация была в полосе 1:0 пкг/мл, в полосе 2:8 пкг/мл, в полосе 3:40 пкг/мл, в полосе 4:200 пкг/мл, в полосе 5:1000 пкг/мл. Полученный таким способом тестируемые образцы подвергают электрофорезу на SDS (додецилсульфат натрия) полиакриламидном геле (SDS-PAGE), переносят на мембрану PVDF (Daiichi Pure Chemical Co.), а затем анализируют способом иммуно-блоттингом (J. Biol. Chem., 270, 7459-7500), используя антитела, такие как анти-hEPR-PoAb, MoAb1C3 и 3Е8 (пкг/мл), которые распознают hEPR. Результаты указывают на то, что каждое антитело специфически выявляет hEPR в области от 3,7 до 8,2 кДа (фиг.5). Хотя полоса примерно 28 кДа была выявлена PoAb и MoAb IC3, ее рассматривали как неспецифичную полосу, потому что такая же полоса была выявлена в полосе антигена (-).
Пример 7. Выявление человеческого EPR способом ELISA
Моноклональное антитело, 1С3 или 3Е8, добавляет в лунки микропланшеты в количестве 100 мкл/лунку и иммобилизировали к твердой фазе инкубацией при 4°С в течение 24 ч. Планшету промывают 3 раза 200 мкл/лунку 50 мМ Tris-HCl при рН 7,5, содержащим 0,1% Tween 20 (TBST), и блокируют добавлением 200 мкл/лунку Block Ace и инкубируют при 4°С в течение 24 ч. После промывания лунок 3 раза 200 мкл/лунку TBST в двукратно разведенной человеческой сыворотке hEPR серийно разбавляют в 2 раза, начиная с 400 пкг/мл, и добавляют по 50 мкл/лунку и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. После промывания 5 раз TBST добавляли разведенный в 1000 раз авидин-HPR (Amersham-Pharmacia) в количестве 100 мкл/лунку и проводят реакцию при комнатной температуре в течение 30 мин. Реакцию прекращают добавлением 4N серной кислоты, окрашивание получают, используя TMB, и спектральную поглощательную способность измеряют при 450/540 нм. Результаты показаны на фиг.6, которые указывают на то, что hEPR в концентрации 25 пкг/мл можно в достаточной степени выявить любым из 1С3 и 3Е8.
Пример 8. Выявление EPR, продуцируемого культивируемыми клетками рака человека
Различные культуры клеток, полученных от мыши (IC38, RAW264,7, NIH3T3, клон Т7, MoAb3) и человека (Т-24, А-549, НСТ116, colo205, colo210, HeLa, NB69, A431, SK-BR-3, MDA-MB-468, KB, TR-13), культивируют в течение 3 д в культуральной среде, содержащей 10% телячьей сыворотке, начиная с 106 клеток/10 мл/чашку, и культуральные среды подвергают выявлению hEPR методом S-ELISA.
MoAb IC3 (1 мкг/мл) иммобилизируют к твердой фазе в концентрации 100 мкл/лунку и после блокировки в лунку одновременно добавляют 50 мкл различных сред культуры клеток и 50 мкл биотинилированного hEPR-PoAb (2 мкг/мл) и инкубируют при комнатной температуре в течение 2 ч. После этого операции были аналогичны операциям в примере 4. В качестве контролей аналогичные операции проводили на сыворотках с дополнительным добавлением или без добавления hEPR (10% FBS (фетальной телячьей сыворотки), сыворотка человека, 0,1% BSA (hEPR 1 нг/мл), сыворотка человека (EPR 1 нг/мл).
Результаты указывают на то, что А450 нм не наблюдается в культуральных средах из клеток мышей, таких как NIH3T3, клон Т7, продуцирующий мышиный EPR и другие, в то время как продукция hEPR подтверждается в раковых клетках человека, таких как А-549 (клетки рака легких человека), НСТ116 (рак толстой кишки человека), colo201 (рак толстой кишки человека), colo205 (рак толстой кишки человека) и Т-24 (рак мочевого пузыря человека) (фиг.7), подтверждая то, что hEPR можно специфически обнаружить в культуральных средах. Однако hEPR нельзя выявить в таких раковых клетках человека как HeLa (рак шейки матки человека), NB69 (нейробластома человека), КВ (эпидермальная карцинома (ротовой полости) человека)), А431 (эпидермальная карцинома (эпидермиса) человека)), SK-BR-3 (рак молочной железы человека) и TR-13 (рак почки человека).
Промышленная применимость
В соответствии с настоящим изобретением становится возможным предоставление системы, которая с высокой специфичностью и чувствительностью выявляет hEPR в крови, тканях и других материалах, полученных из организма человека, и ее можно использовать для диагностики рака и других опухолевых заболеваний для выявления опухолевых клеток, экспрессирующих hEPR. Кроме того, ожидается, что применение способа настоящего изобретения будет способствовать выявлению присутствия или отсутствия экспрессии hEPR и связи между экспрессией hEPR и механизмом канцерогенеза.
Все публикации, патенты и патентные заявки, ссылки на которые приведены в настоящем описании, включены в него в качестве ссылки.
Claims (8)
1. Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело, которое специфически распознает человеческий эпирегулин (hEPR), депонированная в Международном депозитарии запатентованных организмов Национального института перспективной промышленной науки и технологии (AIST) под номером FERM ВР-08647.
2. Гибридома, продуцирующая моноклональное антитело, которое специфически распознает человеческий эпирегулин (hEPR), депонированная в Международном депозитарии запатентованных организмов Национального института перспективной промышленной науки и технологии (AIST) под номером FERM BP-08648.
3. Моноклональное антитело, которое специфически распознает человеческий эпирегулин (hEPR) с чувствительностью 10 пг/мл или более.
4. Моноклональное антитело по п.3, продуцируемое гибридомой, имеющей депозитарный номер FERM ВР-08647.
5. Моноклональное антитело по п.3, продуцируемое гибридомой, имеющей депозитарный номер FERM BP-08648.
6. Способ специфического выявления hEPR в образце in vitro, отличающийся тем, что моноклональное антитело по п.3 используется в качестве первого антитела, и поликлональное антитело, которое распознает hEPR (hEPR-PoAb), используется в качестве второго антитела.
7. Способ выявления клеток, экспрессирующих hEPR или hEPR во внеклеточной жидкости in vitro, отличающийся тем, что используется моноклональное антитело по п.3.
8. Способ по п.7, при котором клетки, экспрессирующие hEPR, представляют собой клетки рака толстой кишки человека.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2003070864 | 2003-03-14 | ||
| JP2003-070864 | 2003-03-14 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2005131842A RU2005131842A (ru) | 2006-02-10 |
| RU2312109C2 true RU2312109C2 (ru) | 2007-12-10 |
Family
ID=32984673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2005131842/13A RU2312109C2 (ru) | 2003-03-14 | 2004-03-15 | Моноклональное антитело и продуцирующая его гибридома |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7435590B2 (ru) |
| EP (1) | EP1607404A4 (ru) |
| JP (1) | JPWO2004081047A1 (ru) |
| KR (1) | KR20050108389A (ru) |
| CN (1) | CN1761682A (ru) |
| AU (1) | AU2004220156B2 (ru) |
| CA (1) | CA2519105A1 (ru) |
| MX (1) | MXPA05009751A (ru) |
| NO (1) | NO20054351L (ru) |
| RU (1) | RU2312109C2 (ru) |
| WO (1) | WO2004081047A1 (ru) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2625014C2 (ru) * | 2010-04-09 | 2017-07-11 | Критикал Кэа Дайэгностикс, Инк. | Антитела против растворимого st-2 человека и способы анализа |
| RU2634383C2 (ru) * | 2011-12-28 | 2017-10-26 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Гуманизированное анти-эпирегулин-антитело и противораковый терапевтический агент, содержащий указанное антитело, в качестве активного ингредиента |
| US10005832B2 (en) | 2009-05-29 | 2018-06-26 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for treating a disease originated from receptor activation by EREG and TGFα |
| RU2715642C2 (ru) * | 2011-04-28 | 2020-03-02 | ЭсБиАй БАЙОТЕК КО., ЛТД. | АНТИТЕЛО ПРОТИВ ПРОТЕИНТИРОЗИНФОСФАТАЗЫ σ РЕЦЕПТОРНОГО ТИПА ЧЕЛОВЕКА |
Families Citing this family (26)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100600550B1 (ko) * | 2000-10-20 | 2006-07-13 | 에자이 가부시키가이샤 | 질소 함유 방향환 유도체 |
| JPWO2004080462A1 (ja) * | 2003-03-10 | 2006-06-08 | エーザイ株式会社 | ｃ−Ｋｉｔキナーゼ阻害剤 |
| CN101337930B (zh) * | 2003-11-11 | 2010-09-08 | 卫材R&D管理有限公司 | 脲衍生物的制备方法 |
| ATE428421T1 (de) * | 2004-09-17 | 2009-05-15 | Eisai R&D Man Co Ltd | Medizinische zusammensetzung mit verbesserter stabilität und reduzierten gelierungseigenschaften |
| WO2007015569A1 (ja) * | 2005-08-01 | 2007-02-08 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | 血管新生阻害物質の効果を予測する方法 |
| WO2007015578A1 (ja) * | 2005-08-02 | 2007-02-08 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | 血管新生阻害物質の効果を検定する方法 |
| WO2007052849A1 (ja) | 2005-11-07 | 2007-05-10 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | 血管新生阻害物質とc-kitキナーゼ阻害物質との併用 |
| US20090247576A1 (en) * | 2005-11-22 | 2009-10-01 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | Anti-tumor agent for multiple myeloma |
| CN101443009A (zh) * | 2006-05-18 | 2009-05-27 | 卫材R&D管理有限公司 | 针对甲状腺癌的抗肿瘤剂 |
| US20090203693A1 (en) * | 2006-06-29 | 2009-08-13 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | Therapeutic agent for liver fibrosis |
| KR101472600B1 (ko) * | 2006-08-28 | 2014-12-15 | 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 | 미분화형 위암에 대한 항종양제 |
| KR101493779B1 (ko) * | 2006-10-12 | 2015-02-16 | 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤 | 항 ｅｒｅｇ 항체를 이용하는 암의 진단 및 치료 방법 |
| AU2012261543B2 (en) * | 2006-10-12 | 2016-05-26 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Diagnosis and treatment of cancer using anti-EREG antibody |
| WO2008093855A1 (ja) * | 2007-01-29 | 2008-08-07 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | 未分化型胃癌治療用組成物 |
| CA2704000C (en) | 2007-11-09 | 2016-12-13 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Combination of anti-angiogenic substance and anti-tumor platinum complex |
| CA2713930A1 (en) * | 2008-01-29 | 2009-08-06 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | Combined use of angiogenesis inhibitor and taxane |
| ES2831573T3 (es) | 2009-04-27 | 2021-06-08 | Becton Dickinson Co | Dispositivo de preparación de muestras y método asociado |
| KR101677790B1 (ko) | 2010-06-25 | 2016-11-18 | 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 | 키나제 저해 작용을 갖는 화합물의 병용에 의한 항종양제 |
| RU2580609C2 (ru) | 2011-04-18 | 2016-04-10 | Эйсай Ар Энд Ди Менеджмент Ко., Лтд. | Противоопухолевое терапевтическое средство |
| EP3444363B1 (en) | 2011-06-03 | 2020-11-25 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Biomarkers for prediciting and assessing responsiveness of thyroid and kidney cancer subjects to lenvatinib compounds |
| KR20150098605A (ko) | 2012-12-21 | 2015-08-28 | 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 | 퀴놀린 유도체의 비정질 형태 및 그의 제조방법 |
| SG11201509278XA (en) | 2013-05-14 | 2015-12-30 | Eisai R&D Man Co Ltd | Biomarkers for predicting and assessing responsiveness of endometrial cancer subjects to lenvatinib compounds |
| SI3524595T1 (sl) | 2014-08-28 | 2022-10-28 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Derivat kinolina visoke čistosti in postopek njegove proizvodnje |
| WO2016136745A1 (ja) | 2015-02-25 | 2016-09-01 | エーザイ・アール・アンド・ディー・マネジメント株式会社 | キノリン誘導体の苦味抑制方法 |
| KR102662228B1 (ko) | 2015-03-04 | 2024-05-02 | 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 | 암을 치료하기 위한 pd-1 길항제 및 vegfr/fgfr/ret 티로신 키나제 억제제의 조합 |
| CA2988707C (en) | 2015-06-16 | 2023-10-10 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Combination of cbp/catenin inhibitor and immune checkpoint inhibitor for treating cancer |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100313736B1 (ko) * | 1993-06-04 | 2002-03-21 | 우에하라 아끼라 | 사람유래종양세포증식저해인자 |
| JP2001149079A (ja) * | 1999-11-26 | 2001-06-05 | Japan Science & Technology Corp | 新規の増殖因子タンパク質および該タンパク質をコードする遺伝子 |
| AU2001236631A1 (en) | 2000-02-24 | 2001-09-03 | Incyte Genomics, Inc. | Secretory molecules |
| CA2411278A1 (en) * | 2000-06-09 | 2001-12-20 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer |
| CA2471431A1 (en) * | 2002-01-02 | 2003-07-17 | Genentech, Inc. | Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor |
-
2004
- 2004-03-15 AU AU2004220156A patent/AU2004220156B2/en not_active Ceased
- 2004-03-15 KR KR1020057017073A patent/KR20050108389A/ko not_active Application Discontinuation
- 2004-03-15 RU RU2005131842/13A patent/RU2312109C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2004-03-15 US US10/548,591 patent/US7435590B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-03-15 MX MXPA05009751A patent/MXPA05009751A/es active IP Right Grant
- 2004-03-15 CN CNA2004800069196A patent/CN1761682A/zh active Pending
- 2004-03-15 WO PCT/JP2004/003424 patent/WO2004081047A1/ja active IP Right Grant
- 2004-03-15 CA CA002519105A patent/CA2519105A1/en not_active Abandoned
- 2004-03-15 JP JP2005503621A patent/JPWO2004081047A1/ja active Pending
- 2004-03-15 EP EP04720764A patent/EP1607404A4/en not_active Withdrawn
-
2005
- 2005-09-20 NO NO20054351A patent/NO20054351L/no not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| TOYODA, H. et al., "Distribution of mRNA for human epiregulin a differentially expressed member of the epidermal growth factor family", Biochem. J., 1997, Vol.326, стр.69-75. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10005832B2 (en) | 2009-05-29 | 2018-06-26 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for treating a disease originated from receptor activation by EREG and TGFα |
| RU2625014C2 (ru) * | 2010-04-09 | 2017-07-11 | Критикал Кэа Дайэгностикс, Инк. | Антитела против растворимого st-2 человека и способы анализа |
| RU2715642C2 (ru) * | 2011-04-28 | 2020-03-02 | ЭсБиАй БАЙОТЕК КО., ЛТД. | АНТИТЕЛО ПРОТИВ ПРОТЕИНТИРОЗИНФОСФАТАЗЫ σ РЕЦЕПТОРНОГО ТИПА ЧЕЛОВЕКА |
| RU2634383C2 (ru) * | 2011-12-28 | 2017-10-26 | Чугаи Сейяку Кабусики Кайся | Гуманизированное анти-эпирегулин-антитело и противораковый терапевтический агент, содержащий указанное антитело, в качестве активного ингредиента |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1761682A (zh) | 2006-04-19 |
| EP1607404A1 (en) | 2005-12-21 |
| WO2004081047A1 (ja) | 2004-09-23 |
| CA2519105A1 (en) | 2004-09-23 |
| KR20050108389A (ko) | 2005-11-16 |
| US20060252105A1 (en) | 2006-11-09 |
| EP1607404A4 (en) | 2008-01-23 |
| MXPA05009751A (es) | 2005-10-26 |
| AU2004220156B2 (en) | 2007-04-19 |
| NO20054351L (no) | 2005-11-28 |
| AU2004220156A1 (en) | 2004-09-23 |
| US7435590B2 (en) | 2008-10-14 |
| NO20054351D0 (no) | 2005-09-20 |
| JPWO2004081047A1 (ja) | 2006-06-29 |
| RU2005131842A (ru) | 2006-02-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| RU2312109C2 (ru) | Моноклональное антитело и продуцирующая его гибридома | |
| US20200325215A1 (en) | COMPOSITIONS AND METHODS OF USE FOR DETERMINATION OF HE4a | |
| KR20160065876A (ko) | 췌장 종양의 검출 방법, 항체 및 췌장 종양 검출용 키트 | |
| JP2959837B2 (ja) | 癌関連ハプトグロビン | |
| KR101338517B1 (ko) | 인간 간-카르복실에스터라제 １을 특이적으로 인식하는 단일클론 항체, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주 및 이의 용도 | |
| EP1780221A1 (en) | Anti-synoviolin antibody | |
| JPWO2009044561A1 (ja) | 抗ｐｒｏＮＴ／ＮＭＮモノクローナル抗体 | |
| JP3920556B2 (ja) | 短縮型ミッドカイン（ｔＭＫ）タンパク質特異的モノクローナル抗体及びその用途 | |
| JP3888695B2 (ja) | ヒトｌｅｃｔ２に対する抗体、それを産生する細胞、その測定法及び測定用キット | |
| EP2187216B1 (en) | Novel liver cancer marker | |
| JP4829961B2 (ja) | プロスタシン部分ペプチド及び抗プロスタシン抗体 | |
| US20040214246A1 (en) | Antibodies against particular forms of propsa and use thereof in immunoassays | |
| JP2004198313A (ja) | 甲状腺腫瘍の診断用キット | |
| CN117063070A (zh) | 恶性胰腺囊性肿瘤的判定辅助方法和判定辅助用试剂盒 | |
| JP5585587B2 (ja) | ５．９ｋＤａペプチドの免疫学的測定方法 | |
| JP2006271390A (ja) | 短縮型ミッドカイン（ｔＭＫ）タンパク質特異的モノクローナル抗体の製造方法 | |
| JP2003180345A (ja) | 遊離型肝細胞増殖因子受容体の測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20110316 |