JP2003180345A - 遊離型肝細胞増殖因子受容体の測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 血液等の体液中の肝細胞増殖因子受容体（遊
離型HGFR）を認識する抗体、及び同抗体を用いて遊離型
HGFRを検出、測定する方法を提供する。 【解決手段】 可溶型肝細胞増殖因子受容体を認識する
抗体であって、下記性質を有する抗体の１種又は複数種
を用いて、臓器炎症、癌、肝疾患、心筋梗塞、狭心症、
または血栓症疾患等のの疑いのある患者から採取された
生体成分中の遊離型HGFRを免疫学的方法により測定する
ことにより、前記疾患を検出する。 （ａ）体液中で観察される可溶型肝細胞増殖因子受容体
（遊離型肝細胞増殖因子受容体）を認識し、（ｂ）還元
条件下で変性した可溶型肝細胞増殖因子受容体を認識し
ない。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、体液中で観察され
る可溶型肝細胞増殖因子受容体（遊離型肝細胞増殖因子
受容体）を認識する抗体、同抗体を用いて遊離型肝細胞
増殖因子受容体を検出又は測定する方法及びキットに関
する。さらに、遊離型肝細胞増殖因子受容体を指標にし
た疾患状態の患者、特に癌、肝疾患、炎症性腸疾患、心
筋梗塞等の臓器障害の検出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】肝細胞増殖因子（Hepatocyte Growth Fa
ctor；以下「HGF」と略す） は、もともと肝細胞におい
て、細胞分裂を誘導促進する物質（マイトジェン）とし
て同定された物質であるが（Michalopoulosら, Cancer
Res. , 44: 4414-4419 (1984)）、現在では、メラニン
細胞、内皮細胞、上皮細胞などの細胞に対しても、増殖
因子としての機能を持つことが知られる（J. S. Rubin
ら, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 88: 415 (199
1)）。

【０００３】一方、肝細胞増殖因子受容体（Hepatocyte
Growth Factor Receptor；以下「HGFR」と略する）
は、HGFの高アフィニティー受容体である。HGFRはもと
もと、トランスフォーミング活性を指標にして、発ガン
性化学物質で処理したヒト骨肉腫細胞から単離した原癌
遺伝子c-Metの産物として同定された(CooperらNature,
311: 29-33 (1984))。このHGFRは、通常c-Metまたはp19
0^Metとして表されている。天然型のHGFRは、50kDaのα
サブユニットと145kDaのβサブユニットからなる190kDa
のヘテロ二量体であり、βサブユニットは細胞内領域に
チロシンキナーゼドメインを有している（Parkら, Pro
c. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84: 6379-6383(198
7)）。一方、in vitroにおいては、そのＣ末端部分が切
除された形態のものが数種見つかっている（Pratら, Mo
l. Cell. Biol., 11: 5954-5962 (1991)）。そのうちの
一種は、ヒト胃癌細胞株GTL-16の細胞培養上清中から検
出されたものであり、分子量130kDの可溶性タンパク質
（以下「p130MET」と略する）であることが分かってい
る。本明細書においては、このような可溶性のHGFRを
「可溶型HGFR」と呼ぶ。

【０００４】しかし、上記の細胞培養上清中から検出さ
れたHGFRは、可溶性のHGFRであっても、あくまでin vit
roで検出されたものであり、in vivoにおける、即ち、
ヒトの血液等の体液中に存在している可溶性HGFRについ
ての報告は未だなされていない。本発明においては、こ
のようなin vivoで検出される可溶性のHGFRを「遊離型H
GFR」と呼ぶこととする。

【０００５】HGFおよびHGFRに関しては、様々な疾患と
の関係が示唆されている。HGFは、肝機能不全の患者の
血漿内でその濃度が上昇することが知られる （Gohda
ら, J. Clin. Invest. , 81: 414-419 (1988)）。ま
た、HGFは、NBT-II膀胱ガン腫細胞の運動性と侵入性を
促進するとの報告もある（Bellusciら, Oncogene, 9: 1
091-1099 (1994)）。

【０００６】一方、HGFR（c-Met）は、その細胞表面上
での過剰発現が、胃、腸を含む消化器癌（Ponzettoら,
Oncogene , 6: 553-559 (1991)）、甲状腺癌（Renzo
ら, Oncogene, 7: 2549-2553 (1992)）、膵癌（Renzo
ら, Cancer res. , 55: 1129-1138(1995)）、肝癌（Uek
i ら, Hepatology. 25, 3: 619-623 (1997)）等の癌細
胞株、又は患者組織において観測されており、癌の進展
と関連する可能性が示唆されている。そのため、HGFRを
上記疾患の治療・診断に応用すべく、以下に示すように
HGFRを認識する抗体を作製する試みがなされてきた。

【０００７】（ｉ）Pratらは、HGFR細胞外ドメインに特
異的ないくつかのモノクローナル抗体を記述している。
それらは、HGFRを大量発現している完全に生育したGTL-
16を用いてBalb/cマウスを免疫した後、ハイブリドーマ
をスクリーニングして得られたものである。その中から
選択されたDL-21、DN-30、DN-31、DO-24の４種のモノク
ローナル抗体は、完全長HGFRおよびp140METと呼ばれる
切除型のHGFRを認識する。この内、DO-24抗体はGTL-16
およびA549細胞株において培養上清中に存在する可溶型
HGFR（p130MET）を認識する。また、DO-24及びDL-21抗
体は、還元条件下のSDS-PAGEにより泳動されたHGFRをWe
stern-blotで認識する（Mol. Cell. Biol., 11: 5954-5
962 (1991)）。またPratらは、DO-24抗体を使用して、
ヒト正常組織と癌組織におけるHGFRの局在を検出してい
る（Int. J. Cancer, 49: 323-328(1991)）。

【０００８】（ii）特表平11-506327号は、HGFRに特異
的に結合することができるHGF受容体拮抗剤としてのモ
ノクローナル抗体5D5.11.6について記述している。この
抗体は、HAD-MB-435ヒト胸部癌腫細胞に対するHGFのマ
イトジェン反応を阻害する。また、ヒト乳房上皮細胞
（Clonetics Corp., No. CC-2551）に対するHGF作用剤
効果を示す1A3.3.13についても記述している。これらの
抗体は、HGFR-IgG融合タンパク質（ヒトIgG1H鎖に融合
したHGFRの細胞外ドメインを含んでいる）を免疫抗原と
し、Balb/cマウスを免疫した後ハイブリドーマをスクリ
ーニングし得られたものである。またこれら２種の抗体
は、HGFR-IgG融合蛋白質と組み換えヒトHGFとの結合を
阻害することが、ELISA阻害アッセイにより示されてい
る。

【０００９】尚、特表平11-506327号に記載のモノクロ
ーナル抗体は、HGFのHGFRに対する結合を阻害すると考
えられており、HGFとHGFRの複合体を認識しないと推定
される。

【００１０】（iii）特許第2598362号は、HGFRの細胞質
ドメインを特異的に認識するモノクローナル抗体等を記
述している。また、それらの抗体を、肝炎、癌などの特
定の患者から採取した生物学的サンプルからHGFRを検出
することにも利用しうると記載されている。

【００１１】上記のように、細胞外ドメイン又は細胞質
ドメインを認識するモノクローナル抗体又はポリクロー
ナル抗体はいくつか報告されている。また、特表平11-5
06327号には、HGFRとして可溶型HGFRをも意図している
ことが示されている。しかし、HGFRを認識する抗体を使
用して、免疫測定方法により、実際に遊離型HGFRを検出
した例はこれまで報告されていない。

【００１２】この理由としては、既存の抗体は細胞表面
上のHGFRは認識できるが血液や尿などの生体成分中に存
在しているような遊離型HGFRを認識できないか、既存の
抗体はその認識する部位がある部分に偏っているため、
２種以上の抗体の組み合わせからなるサンドイッチ高感
度測定系には適さず、生体成分中の遊離型HGFRを検出で
きない、等が考えられる。

【００１３】

【発明が解決しようとする課題】遊離型HGFRの生体成分
（例えば、血液、尿）中の濃度と病態との関連について
はまだ明らかにはされていないが、遊離型以外のHGFRに
関する知見から、遊離型HGFRは腫瘍および臓器障害等に
おいて、その血中動態が疾患の状態を表す指標になる可
能性があると考え、生体成分中の遊離型HGFR濃度と特定
の疾患との関係を明らかにすることを企図した。そのた
めには、遊離型HGFRを定量的に測定できる方法が必要と
なる。そこで、本発明は、遊離型HGFRを認識する抗体を
作製し、それを用いた遊離型HGFR高感度測定技術を確立
することを課題とする。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは鋭意研究を
重ねた結果、遊離型HGFRを認識する高親和性抗体を取得
し、そのなかから互いに他の認識部位を競合しない抗体
の組み合わせを選別し、遊離型HGFRの高感度測定系に供
し得る抗体を得た。この高感度測定系において使用され
るモノクローナル抗体の好適な例は、「9-C5」、「4-11
A」である。

【００１５】次に本発明者らは、ヒト病態における遊離
型HGFRの血中濃度と各種ヒト疾患との関連を解析するた
め、上記モノクローナル抗体9-C5、4-11Aの２種を用い
た酵素標識抗体測定系（enzyme-linked immunosorbent
assay；以下「ELISA測定系」と略す）を構築し、健常人
や臓器疾患をはじめとする種々の疾患患者の血液（血漿
または血清）に対して、遊離型HGFR濃度の測定を行っ
た。その結果、本発明の遊離型HGFR特異的高感度測定方
法およびそのキットを使用することにより、遊離型HGFR
の健常人の血中濃度域をはじめて明らかにし、肝炎をは
じめとする臓器障害の患者や癌患者、血栓症患者の血液
中に存在する遊離型HGFR量が健常人と比較して多いこと
をはじめて見い出した。

【００１６】本発明は上記の知見からなされたものであ
り、その要旨は以下のとおりである。 （１）可溶型肝細胞増殖因子受容体を認識する抗体であ
って、下記性質を有する抗体； （ａ）体液中で観察される可溶型肝細胞増殖因子受容体
（遊離型肝細胞増殖因子受容体）を認識し、（ｂ）還元
条件下で変性した可溶型肝細胞増殖因子受容体を認識し
ない。 （２）モノクローナル抗体である(1)に記載の抗体。 （３）肝細胞増殖因子受容体の細胞外ドメインからなる
ポリペプチドを認識し、同ポリペプチドに対する解離定
数が、１×１０^-8Ｍ以下である(1)又は(2)に記載の抗
体。 （４）肝細胞増殖因子と肝細胞増殖因子受容体との複合
体を認識する(1)〜(3)のいずれかに記載の抗体。 （５）受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８５８２、又はＦＥＲ
Ｍ Ｐ−１８５８３であるハイブリドーマにより産生さ
れる(2)に記載の抗体。 （６）(2)〜(5)に記載の抗体を生産するハイブリドーマ
細胞系。 （７）(1)〜(5)のいずれかに記載の抗体の１種又は複数
種を用いて、遊離型肝細胞増殖因子受容体を免疫学的方
法により測定することを特徴とする、遊離型肝細胞増殖
因子受容体の測定方法。 （８）遊離型肝細胞増殖因子受容体を測定する検体が、
疾患の疑いのある被検者または被検動物から採取された
生体成分である(7)に記載の方法。 （９）前記疾患が、臓器炎症、癌、肝疾患、炎症性腸疾
患、血液疾患、心筋梗塞、狭心症、または血栓症である
(8)に記載の方法。 （１０）前記生体成分が血液又はその分画物もしくは処
理物である(8)又は(9)に記載の方法。 （１１）前記生体成分が血漿もしくは血清である(10)に
記載の方法。 （１２）前記生体成分が尿である(8)又は(9)に記載の方
法。 （１３）疾患の疑いのある被検者から採取された生体成
分中の遊離型肝細胞増殖因子受容体を検出または測定す
ることを特徴とする疾患の検出方法。 （１４）前記疾患が、臓器炎症、癌、肝疾患、炎症性腸
疾患、血液疾患、心筋梗塞、狭心症、または血栓症であ
る(13)に記載の方法。 （１５）前記生体成分が血液又はその分画物もしくは処
理物である(13)又は(14)に記載の方法。 （１６）前記生体成分が血漿もしくは血清である(15)に
記載の方法。 （１７）前記生体成分が尿である(13)又は(14)に記載の
方法。 （１８）(1)〜(5)のいずれかに記載の抗体の１種又は複
数種を含み、遊離型肝細胞増殖因子受容体を検出または
測定するためのキット。 （１９）遊離型肝細胞増殖因子受容体上の異なるエピト
ープを認識する少なくとも２種のモノクローナル抗体を
含む(18)に記載のキット。 （２０）臓器炎症、癌、肝疾患、炎症性腸疾患、血液疾
患、心筋梗塞、狭心症、または血栓症の診断に用いられ
る(18)又は(19)に記載のキット。 （２１）疾患の疑いのある患者から採取された生体成分
中の遊離型肝細胞増殖因子受容体を測定することを特徴
とする(18)〜(20)に記載のキット。

【００１７】本明細書において、「遊離型HGFRを認識す
る」とは、抗原抗体反応により遊離型HGFRに結合するこ
とをいう。尚、前記したように、本明細書においては、
可溶性のHGFR、例えば培養細胞の培養上清中から検出さ
れるようなin vitroで検出される可溶性のHGFRを「可溶
型HGFR」と呼び、可溶型HGFRの中でも、ヒトの血液等の
体液中に存在している、すなわちin vivoで検出される
可溶性のHGFRを「遊離型HGFR」と呼ぶ。このように本明
細書では、検出される対象に応じて便宜上名称を区別し
ているが、可溶型HGFRと遊離型HFGRの構造は明らかでは
なく、各々の名称が異なることは各々の構造が異なるこ
とを前提としているわけではない。したがって、本発明
の抗体は、少なくとも遊離型HGFRに結合するものであ
り、遊離型HGFR以外の可溶型HGFRに結合するか否かは問
わない。尚、本発明の抗体の好ましい形態は、HGFRの細
胞外ドメインからなるポリペプチドを認識するものであ
る。

【００１８】また、「還元条件下で変性したHGFRを認識
しない」とは、抗原抗体反応により還元条件下で変性し
たHGFRに実質的に結合しないことをいう。例えば、還元
条件下のSDS-PAGEにより泳動されたHGFRを転写した膜を
用いたウエスタンプロッティングにおいて、本発明の抗
体によりHGFRが検出されない場合は、還元条件下で変性
したHGFRを認識しないことに該当する。

【００１９】

【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。

【００２０】＜１＞遊離型HGFRを認識する抗体作製用の
免疫抗原およびスクリーニング抗原 免疫抗原またはモノクローナル抗体のスクリーニング等
に使用するHGFRは、ヒトのHGFRが好ましい。HGFR全長で
もよく、細胞外ドメイン又はその一部のペプチドであっ
てもよい。遊離型HGFRを認識する抗体を効率よく取得す
るためには、HGFRの細胞外ドメイン又はその一部のペプ
チドを用いることが好ましい。尚、免疫抗原とモノクロ
ーナル抗体のスクリーニング等に使用するHGFRの少なく
とも一方は、細胞外ドメイン又はその一部のペプチドで
あることが好ましい。

【００２１】特に、HGFR特異的高親和性抗体を取得する
ためには、高純度のHGFRを調製することが好ましい。こ
のような目的から、ここで使用するHGFRとしては、HGFR
cDNAを使用した組換え蛋白質が望ましい。例えば、Par
kら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:6379-6383 (198
7)）に記載されているようなHGFR cDNAを使用し、その
全長または一部を適当な発現ベクターに挿入し、これを
大腸菌などの微生物、昆虫細胞、酵母、動物細胞または
動物に導入し、組換え蛋白質として産生させることによ
り、組換えHGFRを取得することができる。ここでは、そ
の純度を高めるためにタグあるいはキャリアー蛋白質を
付加した形で融合蛋白質を発現させ、タグあるいはキャ
リアー蛋白質に対して高い親和性を持つリガンドを用い
たアフィニティークロマトグラフィーによって精製する
方法が望まれる。例えば、FLAG-tag法では８個のアミノ
酸かるなるペプチドのタグをHGFRのN末端あるいはC末端
部位に導入し、融合蛋白をモノクローナル抗体カラムで
アフィニティ精製することができる。このような融合蛋
白質からエンテロキナーゼ処理を行うことによりFLAG配
列を切断除去し、精製抗原として使用することができ
る。また、HGFRを発現している培養細胞又は形質転換細
胞の培養上清もしくは細胞抽出物、又はHGFRを含む組織
もしくは体液より精製操作を実施して、HGFRを得ること
も可能である。HGFRを発現している培養細胞としては、
ヒト胃癌細胞株MKN45が挙げられる。また、細胞系を使
用することなく、Rapid Translation System RTS500（R
oshe Diagnostics社）などを使用した試験管内での転写
・翻訳システムにより、目的とするHGFRを作製すること
も可能である。さらには、HGFRの部分配列を化学合成に
より作製したペプチドも利用することが可能である。

【００２２】精製純度の高いHGFRは、免疫原として重要
であるだけでなく、HGFR特異的なポリクローナル抗体を
アフィニテイー精製により選別したり、HGFR特異的な高
親和性モノクローナル抗体をスクリーニングする際に、
極めて重要な材料となる。また、定量測定時の標準品HG
FRとしても重要である。

【００２３】＜２＞遊離型HGFRを認識する抗体の作製 遊離型HGFRを検出する抗体は、上記組み換え蛋白質HGFR
を免疫抗原として使用し、通常行われる免疫学的方法で
取得すればよい。用いるHGFRは、上述の通りである。

【００２４】免疫に使用する動物は特に限定されないが
ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、モルモット、
ニワトリ等はいずれも使用できる。免疫用抗原の動物へ
の接種は、皮下、筋肉内、腹腔内に完全フロイントアジ
ュバントや不完全フロイトアジュバントとよく混和して
行う。接種は２〜５週間ごとに実施し、抗原に対する免
疫動物の抗体価が充分に上昇するまで続ける。この後、
免疫動物に対して抗原のみの静脈注射を行い３〜７日後
に血清を取得する。

【００２５】上記のようにして得られた血清からポリク
ローナル抗体を精製する方法は、通常の免疫グロブリン
精製法を用いれば良く、例えば、硫安分画法、ポリエチ
レン分画法、エタノール分画法、陰イオン交換クロマト
グラフィー、HGFRもしくはその断片、又はプロテインＡ
もしくはプロテインＧが結合したアフィニティークロマ
トグラフィー等により実施することが出来る。

【００２６】得られたポリクローナル抗体が遊離型HGFR
を認識することの確認は、例えば、遊離型HGFRを含む肝
炎、心筋梗塞等の患者血液に対して、健常者の血液より
も反応性が高いことを確認すること等によって、行うこ
とができる。

【００２７】一方、モノクローナル抗体を取得する際
は、免疫を行った動物より抗体産生細胞を含むと考えら
れる脾臓又はリンパ節を採取し、この脾臓細胞又はリン
パ細胞を腫瘍細胞と細胞融合を行う。この後、細胞融合
して不死化した抗体産生細胞（ハイブリドーマ）を単離
する。ここで使用する腫瘍細胞は一般的に免疫を行った
動物から調製される脾臓細胞もしくはリンパ細胞と同一
種のものであることが望ましいが、異種動物間でも可能
である。

【００２８】例えば腫瘍細胞の例として、P3（p3/x63-A
g8）、P3-U1、NS-1、MPC-11、SP2/0、FO、x63.6.5.3、S
194、R210等の骨髄腫細胞が使用される。細胞融合は一
般に行われている方法、例えば「単クローン抗体実験マ
ニュアル」（講談社サイエンティフィック1987年出版）
に記載の方法に従って実施すればよい。細胞融合促進剤
としてはセンダイウイルスや平均分子量1000〜6000のポ
リエチレングリコールなどが挙げられる。この際、更に
融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助
剤やIL-6等のサイトカインを添加することも出来る。免
疫を行った脾臓細胞またはリンパ細胞に対する腫瘍細胞
の混合比は、例えば腫瘍細胞に対し、脾臓細胞もしくは
リンパ細胞を約１〜１０倍程度用いればよい。

【００２９】上記融合培地としてはERDF培地、RPMI-164
0培地、MEM培地等の通常の各種培地を使用することが出
来、融合時は通常、牛胎児血清(FCS)等の血清を抜いて
おくのがよい。融合は上記の免疫を行った脾臓細胞もし
くはリンパ細胞と腫瘍細胞との所定量を上記培地内でよ
く混合し、予め37℃程度に加温しておいたポリエチレン
グリコール溶液を20〜50％程度加え、好ましくは30〜37
℃で1〜10分程度反応させることによって実施する。以
降、適当な培地を逐次添加して遠心し、上清を除去する
操作を繰り返す。

【００３０】目的とするハイブリドーマは、通常の選択
培地、例えばHAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン及びチミジンを含む培地）で培養する。このHAT培地
での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞（未
融合細胞等）が死滅するのに充分な時間、通常数日〜数
週間行えばよい。さらに得られたハイブリドーマの選別
は、前述した方法により得たHGFRなどの材料を用い、種
々の免疫化学的方法で解析することにより可能となる。
例えば、HGFRをスクリーニング用抗原として用い、これ
らのスクリーニング用抗原とハイブリドーマ培養上清中
に分泌されるモノクローナル抗体との結合を、ＥＬＩＳ
Ａ法などの酵素免疫測法、またはウエスタンブロッティ
ング法などで解析して、目的とするハイブリドーマを選
択することが出来る。

【００３１】具体的には、HGFRをスクリーニングプレー
トなどに付着させ、ＢＳＡ等でブロッキングしたものに
対して、上記ハイブリドーマの培養上清を添加して、HG
FRを認識する抗体を分泌しているハイブリドーマを選別
する。例えば、選択するハイブリドーマの培養上清をHG
FRが付着したＥＬＩＳＡ法用のプレートに添加して反応
させ、十分な洗浄操作後、標識抗マウスＩｇＧポリクロ
ーナル抗体を添加してさらに反応させる。洗浄操作後に
標識の検出を行い、HGFRを付着したプレートに反応性が
ある培養上清を有するハイブリドーマを選択する。標識
としては、後述する各種酵素、蛍光物質、化学発光物
質、ラジオアイソトープ、ビオチンまたはアビジン等が
用いられる。

【００３２】尚、最終的には、ハイブリドーマ培養上清
中に、遊離型HGFRを含む肝炎、心筋梗塞等の患者血液に
対して、健常者の血液よりも反応性が高いモノクローナ
ル抗体が含まれていることを確認することによって、遊
離型HGFRを認識するモノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマを選択することができる。

【００３３】上記の様な方法で目的とする抗体産生能を
確認した後、例えば限界希釈法により単一のモノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを得ること
が出来る。このハイブリドーマクローンは、あらかじめ
FCS中に含まれるウシ抗体(IgG)を除いたFBSを1〜5％程
度加えた培地を用いて培養を行い、得られた培養上清を
目的のモノクローナル抗体を精製する原料とする。もし
くは得られたハイブリドーマクローンをあらかじめプリ
ステンを投与したBalb/Cマウス又はBalb/c(nu/nu)マウ
スの腹腔内に移植し、10〜14日後にモノクローナル抗体
を高濃度に含む腹水を採取し、目的のモノクローナル抗
体を精製する原料としてもよい。

【００３４】ハイブリドーマの培養上清又は腹水よりモ
ノクローナル抗体を精製する際は、前記のポリクローナ
ル抗体の精製と同様に、通常の免疫グロブリン精製法を
用いればよく、例えば、硫安分画法、ポリエチレン分画
法、エタノール分画法、陰イオン交換クロマトグラフィ
ー、HGFRもしくはその断片、又はプロテインＡもしくは
プロテインＧが結合したアフィニティークロマトグラフ
ィー等により実施することが出来る。

【００３５】本発明のモノクローナル抗体を、２抗体サ
ンドイッチアッセイ法を用いたELISA測定系による遊離
型HGFRの測定に用いる場合には、エピトープが異なる少
なくとも２種類のモノクローナル抗体が必要となる。そ
の場合は、上記したハイブリドーマの選別に際し、エピ
トープの異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリ
ドーマを２種又は３種以上選別する。

【００３６】本発明の抗体は、上記にようにして得られ
る遊離型HGFRを認識する抗体であって、さらに、還元条
件下で変性したHGFRを認識しない抗体であることを特徴
とする。このような抗体は、例えば、HGFRを認識する抗
体のうち、還元条件下のSDS-PAGEにより泳動されるHGFR
に対して反応性を有すモノクローナル抗体を選択するこ
とによって、取得することができる。こうして得られる
抗体は、HGFRの３次元構造を認識すると考えられる。後
記実施例に示すように、還元条件下のSDS-PAGEにより泳
動されるHGFRに対して反応性を有すモノクローナル抗体
「2-2D」は、ELISA測定系でのHGFRへの反応性が極めて
微弱なものであった。一方、還元条件下のSDS-PAGEによ
り泳動されるHGFRに対して反応性を示さないモノクロー
ナル抗体である「9-C5」及び「4-11A」は、ELISA測定系
でHGFRに対して鋭敏な反応性を示した。この結果から、
HGFRのELISA法を用いた高感度な検出には、その３次元
構造を認識するモノクローナル抗体が適していると考え
られる。

【００３７】遊離型HGFRを高感度に測定するためには、
遊離型HGFRに対する親和性の高いモノクローナル抗体を
用いることが好ましい。高親和性抗体は、例えば、上記
のように遊離型HGFRを認識し、還元条件下で変性したHG
FRを認識しない抗体を選択することによって、取得する
ことができる。本発明の抗体のHGFRに対する親和性は、
本発明の抗体とHGFRとの解離定数を測定することによっ
て確認することができる。本発明の抗体の遊離型HGFRに
対する好ましい解離定数は、後記実施例に示すBIACORE
X（ビアコア社）を用いた速度論的解析により測定され
る解離定数として、１×１０^-8以下である。実施例に示
す速度論的解析において算出された、上記「9-C5」及び
「4-11A」抗体の、HGFRの細胞外ドメインからなるポリ
ペプチドに対する解離定数は、それぞれ6.86×10^-9Ｍ、
8.97×10^-9Ｍであった。

【００３８】また、本発明の抗体は、遊離型HGFRを認識
することに加えて、HGFとHGFRとの複合体を認識するも
のであってもよい。このような抗体と、HGFRは認識する
がHGFとHGFRとの複合体を認識しない抗体を組み合わせ
て使用すると、HGFR単体のみの量や、複合体のみの量、
又は単体と複合体との比率等を算出することができる。
これらの値を算出することによって、特定の疾患の検出
をより詳細に行うことができることが期待される。

【００３９】実施例で得られた「9-C5」、「4-11A」抗
体は、HGFRを過剰発現する低分化型ヒト胃癌細胞株MKN4
5の培養上清を用い、HGFとのELISA結合アッセイを行っ
たところ、HGFとHGFRの結合を阻害することなく、HGF-H
GFR複合体を認識した。このことより、前記抗体は、HGF
RにおけるHGFとの結合サイトを認識するものではなく、
HGFに対する拮抗剤的効果あるいはHGFRへの作用剤的効
果は持ち合わせていないことが示唆される。ここで用い
られている「拮抗剤的」なる語は、HGFの生物学的活性
またはHGFR活性化を直接間接に実質的にうち消すことが
できる効果を示す。また、「作用剤的」なる語は、生物
学的活性またはHGFR活性化を直接間接に実質的に促進で
きる効果を示す。

【００４０】＜３＞遊離型HGFRを検出又は測定する方法 本方法は、上記のようにして得られた遊離型HGFRを認識
する抗体を使用して、生体試料中の遊離型HGFRを検出又
は測定する方法である。ここで、「検出」とは遊離型HG
FRの存在を知ることを意味し、測定とは、好ましくは定
量的に遊離型HGFRの量を決定することをいう。本方法
は、生体試料中の遊離型HGFRを検出又は測定する様々な
診断方法、測定方法、アッセイ方法に用いることが可能
である。その方法としては、本発明の抗体を使用し遊離
型HGFRを検出する目的であれば特に限定されない。例え
ば、競合的結合アッセイ方法、または直接的または間接
的サンドイッチアッセイ法、２抗体サンドイッチアッセ
イ法などが挙げられる。また検出方法としては、酵素免
疫測定法、ラジオイムノアッセイ、蛍光イムノアッセ
イ、化学発光免疫測定法、イムノブロッティング法、イ
ムノクロマト法、ラテックス凝集法などが挙げられる。

【００４１】イムノブロッティングの応用例としては、
遊離型HGFRを認識する抗体をマイクロアレイやチップに
添加もしくは固定したものも含まれる。また遊離型HGFR
を認識する抗体を蛍光ラベル化し、蛍光偏向解消法、蛍
光相関分散法を用いて遊離型HGFRとの相互作用を検出す
ることも可能である。表面プラズモン共鳴装置を利用し
て遊離型HGFRを認識する抗体と、遊離型HGFRとの相互作
用を測定することも可能である。例えば、この抗体をセ
ンサーチップ上に結合させた後、このチップをとりつけ
た表面プラズモン共鳴装置に遊離型HGFRを含む生体試料
を流し、応答シグナルの時間変化を追跡することによ
り、生体成分中の遊離型HGFRを定量することが可能であ
る。

【００４２】遊離型HGFRを検出又は測定する方法で使用
される抗体、例えば遊離型HGFRを認識する抗体は、その
まま用いてもよいし、定法であるパパイン処理によって
得られるＦａｂもしくはペプシン処理によって得られる
Ｆ（ａｂ'）₂またはＦ（ａｂ'）の形態を持った抗体を
用いても良い。また遊離型HGFRを認識する抗体の断片
も、本発明に含まれる。例えば、遊離型HGFRを認識する
抗体のＨ鎖とＬ鎖の両可変ドメイン内の相補性決定領域
（ＣＤＲ）または超可変領域などを含む断片がこれに含
まれる。

【００４３】生体成分中の遊離型HGFRを定量する２抗体
サンドイッチアッセイ法とは、例えば、遊離型HGFRを特
異的に測定する方法であって、（１）遊離型HGFRを認識
する抗体の一種または複数を含むものからなる試薬を、
検体中の遊離型HGFRと反応させ、免疫反応物を生成させ
る工程、（２）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中
の遊離型HGFRを認識する標識抗体と反応させる工程、及
び（３）免疫反応物に結合した標識抗体を測定する工程
を含む方法、または、遊離型HGFRを特異的に測定する方
法であって、（１）遊離型HGFRと遊離型HGFRを認識する
一種または複数を第一次抗体として含むものからなる試
薬を、検体中の遊離型HGFRと反応させ、免疫反応物を生
成させる工程、（２）免疫反応物を分離した後、免疫反
応物中の遊離型HGFRを認識する第二次抗体と反応させ、
免疫反応物を生成させる工程、（３）免疫反応物を分離
した後、免疫反応物中の第二次抗体を認識する標識抗体
を反応させる工程、及び（４）免疫反応物に結合した標
識抗体を測定する工程を含む方法、が挙げられる。

【００４４】具体的には、マイクロタイターウェルやマ
イクロ磁気ビーズなどの固相に対して遊離型HGFRを認識
する抗体を、定法により一次抗体として固相化する。次
に、この固相表面の過剰な蛋白質結合部位を、ウシ血清
アルブミン、スキムミルクまたはゼラチン等でブロッキ
ングする。この後、遊離型HGFRを含む生体成分を添加し
て固相上で免疫反応物を形成させた後に洗浄する。次に
遊離型HGFRを認識する標識ポリクローナル抗体または標
識モノクローナル抗体を二次抗体として添加して反応さ
せる。この際、一次抗体としてモノクローナル抗体を用
いた場合は、一次抗体とエピトープが異なる、遊離型HG
FRを認識するモノクローナル抗体を標識したものを二次
抗体として使用する。さらに洗浄後、標識抗体量を測定
することにより、生体成分中の遊離型HGFR量を測定する
ことが出来る。

【００４５】ここで使用するポリクローナル抗体または
モノクローナル抗体の標識とは、アルカリホスファター
ゼ、西洋わさびペルオキシターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼなどの酵素で
もよいし、フルオレッセイン誘導体やローダミン誘導体
などの蛍光物質でもよい。またユーロピウムもしくはユ
ーロピウム錯体などの時間分解蛍光測定が可能な希土類
もしくは希土類錯体であってもよい。さらに、アクリジ
ニウムエステル等の化学発光物質であってもよいし、
¹²⁵Ｉ、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐなどのラジオアイソトープでも
よい。すなわち、発色、蛍光、時間分解蛍光、化学発
光、電気化学発光、放射活性を測定する方法を用いて生
体成分中のHGFR量を定量することが本発明に含まれる。
また、二次抗体をビオチン化標識し、アビジンと複合体
を形成しているアルカリホスファターゼ、西洋わさびペ
ルオキシターゼ、β―ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、
グルコースオキシダーゼ、フルオレッセイン誘導体、ロ
ーダミン誘導体、希土類錯体、アクリジニウムエステル
等の化学発光物質、¹²⁵Ｉ、³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐなどのラジ
オアイソトープを検出することも本発明に含まれる。

【００４６】＜４＞遊離型HGFRを検出又は測定するキッ
ト 遊離型HGFRを検出又は測定するキットとは、遊離型HGFR
を測定又は検出することを特徴とする、疾患の診断キッ
トである。遊離型HGFRを測定することにより、疾患状態
にある患者、例えば肝炎、腸炎、胃炎、炎症性腸疾患を
はじめとする臓器炎症の患者、癌患者、肝疾患をはじめ
とする臓器の線維化を伴う患者、または狭心症、心筋梗
塞などをはじめとする血栓症の患者、及び血液疾患の患
者の診断が可能であることが本発明により初めて判明し
た。したがって、遊離型HGFRを測定または検出すること
により、前記のような各種疾患を検出することができ
る。本発明においては、疾患を診断することを目的と
し、遊離型HGFRを検出又は測定するキットであるなら
ば、そのキットを構成する材料、方法には限定されな
い。

【００４７】具体的には、例えば、電気遊動法、ＨＰＬ
Ｃ法、各種カラムクロマトグラフィー法、各種アレー、
チップ、表面プラズモン共鳴装置等を用い、遊離型HGFR
を検出又は測定することにより、疾患を診断するキット
などが挙げられる。より具体的には、抗体を用いた免疫
学的方法により遊離型HGFRを検出または測定するキット
が挙げられる。抗体としては、前記の遊離型HGFRを認識
する抗体の少なくとも一つ以上が用いられる。

【００４８】例えば、本発明のキットが２抗体サンドイ
ッチアッセイ法によるものである場合には、遊離型HGFR
を検出又は測定するキットであって、（１）遊離型HGFR
と遊離型HGFRを認識する抗体の一種または複数を含むも
のからなる試薬を、検体中の遊離型HGFRと反応させ、免
疫反応物を生成させる工程、（２）免疫反応物を分離し
た後、免疫反応物中の遊離型HGFRを認識する標識抗体と
反応させる工程、及び（３）免疫反応物に結合した標識
抗体を測定する工程を含んだキット、または、遊離型HG
FRを検出又は測定するキットであって、（１）遊離型HG
FRと遊離型HGFRを認識する抗体の一種または複数を第一
次抗体として含むものからなる試薬を検体中の遊離型HG
FRと反応させ、免疫反応物を生成させる工程、（２）免
疫反応物を分離した後、免疫反応物中の遊離型HGFRを認
識する第二次抗体と反応させ、免疫反応物を生成させる
工程、（３）免疫反応物を分離した後、免疫反応物中の
第二次抗体を認識する標識抗体を反応させる工程、及び
（４）免疫反応物に結合した標識抗体を測定する工程を
含んだキット、が挙げられる。

【００４９】このキットは、少なくとも遊離型HGFRを認
識するモノクローナル抗体さらに、遊離型HGFRを検出ま
たは測定する操作に必要な構成要素が含まれていてもよ
い。その構成要素の例として、標準蛋白質としてのHGFR
又はその断片、酵素および基質等が挙げられる。キット
に含まれるモノクローナル抗体は、酵素などの標識物質
が結合した状態でもよいし、これらの抗体を認識する標
識抗体が含まれていてもよい。また適切な各種緩衝液、
抗原希釈液、反応希釈液、基質溶液、反応停止液等が含
まれていてもよい。本キットにはラベルが付き、遊離型
HGFR検出又は測定に必要な材料が封入された容器が含ま
れていてもよい。適した容器としては、例えばガラス、
ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ナ
イロン、テフロン（登録商標）などの各種プラスチック
を材質とした容器が挙げられる。キットには、好ましく
は、上述した遊離型HGFRを検出または測定するのに必要
な材料、容器とともに、遊離型HGFRを検出または測定す
る方法が記載された説明書が含まれる。

【００５０】本発明によるキットを用いることにより、
疾患状態にある患者から採取された生体成分中の遊離型
HGFRを検出することが出来、また定量することも可能で
ある。遊離型HGFRを検出する生体材料は特に限定され
ず、組織、血清、血漿、尿、漿液、髄液、組織の抽出液
等、いずれの生体材料も適切な前処理を行うことによっ
て適応可能である。疾患状態にある患者の生体材料中に
存在する遊離型HGFRを検出または測定することにより、
その疾患の診断、予知、経過を判断することが可能であ
る。疾患の例として、肝炎、腸炎、胃炎などをはじめと
する臓器炎症、癌、肝疾患、炎症性腸疾患、血液疾患、
および心筋梗塞、狭心症をはじめとする血栓症などが挙
げられる。また、癌とはグリオーマ、甲状腺癌、肺癌、
乳癌、胃癌、膵臓癌、大腸癌、腎臓癌、膀胱癌、卵巣
癌、前立腺癌、メラノーマ、骨肉腫、リンパ腫、白血病
等を意味する。これらの疾患の検出に本測定キットは有
利に用いることができる。

【００５１】

【実施例】以下に実施例を挙げ本発明を具体的に説明す
るが、 本発明はこれらに限定されるものではない。

【００５２】

【実施例１】遊離型HGFRを認識するモノクローナル抗体
及びポリクローナル抗体の作製 免疫抗原、スクリーニング抗原、及びHGFR測定系におけ
る標準抗原として用いたHFGRは、前記した方法と同様に
して、HGFR cDNAを使用して製造した組換え蛋白質を用
いた。HGFR cDNAは、Parkら（ Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 84: 6379-6383 (1987)）に記載されているcDN
Aのうち、１位から９４８位のアミノ酸残基（すなわち
ヌクレオクド番号１〜２８４４）の細胞外ドメインに相
当する部分を使用し、これをCHO細胞に導入し、発現さ
せた蛋白質を取得した。得られた組換えHGFRを、以下の
実験で使用した。

【００５３】HGFR 100μgを含む溶液を、同容量のフロ
イント完全アジュバントとともに、Balb/cマウスの腹腔
内に２週間間隔で５回投与した。マウスの血清中に抗体
が産生していることを確認後、100μgのHGFRを含む溶液
を尾静脈内に投与した。３日後に脾臓を取り出し、「単
クローン抗体実験マニュアル」（講談社サイエンティフ
ィック 1987年出版）に従い、ポリエチレングリコール
を使用して脾臓細胞をミエローマ細胞P3U1と細胞融合さ
せた後、96ウェルプレートに注入後ＨＡＴ培地を添加し
て１４日間の培養を行った。

【００５４】この後、HGFRを認識するモノクローナル抗
体を培地中に産生するハイブリドーマの選別を行った。
すなわちHGFRを固相化し、ＢＳＡでブロッキングをおこ
なったHGFRスクリーニング用ＥＬＩＳＡプレートに対し
て、選択するハイブリドーマの培養上清を添加し、培養
上清に存在するモノクローナル抗体の反応性を解析し
た。スクリーニング用ＥＬＩＳＡプレートに対し、選択
するハイブリドーマの培養上清を100μl/ウェルにて添
加した後１時間以上反応させた。

【００５５】この後、0.05% Tween20を含むPBS(-)液
（以下「PBST液」と略す）を用いて十分な洗浄を行な
い、HRP（西洋わさびペルオキシターゼ）標識ヤギ抗マ
ウスIgG・Fcポリクローナル抗体（ＩＣＮ社）１μg/mlお
よび１％ BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加
し、さらに室温で１時間反応させた。PBST液で充分に洗
浄操作を行った後、0.4mg/mlオルトフェニレンジアミン
（OPD、Sigma社 P-9029）および0.015〜0.03%過酸化水
素溶液を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）を添加
して室温にて反応させ、発色を行なった。この後１Ｎ H
₂SO₄溶液を添加して反応を止め、測定波長490nm、リフ
ァレンス波長650nmにて測定を行なった。

【００５６】こうして、ハイブリドーマ、「9-C5」、
「4-11A」、「2-2D」が選択された。ハイブリドーマ「9
-C5」、「4-11A」は、２００１年１１月２日に、独立行
政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
（〒305-8566、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１
中央第６）に寄託され、それぞれ順に受託番号 FERMP
-18582、及びFERM P-18583が付与されている。尚、「9-
C5」、「4-11A」抗体は、IgGのクラスに属し、サブクラ
スはそれぞれIgG2a、IgG2bであった。

【００５７】次に、得られたHGFRに対して反応する各ハ
イブリドーマは、限界希釈法による３回のクローニング
操作後、培養上製を回収してプロテインＡが結合したア
フィニティークロマトグラフィー（アマシャムファルマ
シアバイオテク製）により、モノクローナル抗体の精製
を行った。

【００５８】一方、HGFRに対するポリクローナル抗体
は、次のようにして作製した。HGFRを100μg含む溶液を
同容量のフロイント完全アジュバントとともに、ウサギ
皮下へ２週間間隔で５回投与した。血清中に抗体が産生
していることを確認後、100μgの抗原を脈内に投与し、
３日後に抗血清を取得してさらに定法の精製操作により
抗HGFRポリクローナル抗体を作製した。次に得られたHG
FRポリクローナル抗体を上記と同様にペルオキシダーゼ
標識することにより標識抗HGFRポリクローナル抗体を調
製した。

【００５９】

【実施例２】ウエスタン・ブロッティングによる、還元
条件下で変性したHGFRに対する反応性の解析 この方法は、タウビンらの方法に準じて行った（Towbin
ら., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 76, 4350-4354(19
79)）。即ち、還元条件下で胃癌細胞株MKN45の培養上清
をSDS-PAGE後、ゲルをPVDF膜と合わせ、ゲルのある側を
−極、PVDF膜のある側を＋極として電流を流し、ゲル上
で泳動された蛋白質をPVDF膜にブロットした。ブロット
されたPVDF膜を６％ BSA含有PBS液に浸してブロッキン
グを行った後、一次抗体として上記で取得したモノクロ
ーナル抗体又はポリクローナル抗体を反応させた。膜を
PBST液洗浄後、二次抗体として標識ヤギ抗マウスIgG・Fc
ポリクローナル抗体（ＩＣＮ社製）を添加して、１％ B
SA含有PBS液中で反応させた。さらにPBST液で洗浄後、
ワーキング溶液を加えて発色させ、その反応性を確認し
た。この試験により、「2-2D」は還元条件下で変性した
HGFRに結合したが、「9-C5」、「4-11A」抗体は、還元
条件下で変性したHGFRに対して反応性をもたないことが
示された（図１）。

【００６０】

【実施例３】高親和性抗体の選別 実施例１で作製した種々の抗HGFRモノクローナル抗体
を、10μg/mlの濃度になるように0.1M炭酸−重炭酸緩衝
液（pH9.3）に溶解して一次抗体溶液を調製した。一次
抗体溶液を96ウェルプレートのウェルに添加し、４℃に
て一昼夜（12時間程度以上）おいた。このようにして得
られた一次抗体付着プレートより一次抗体溶液を除き、
6% BSAを含むPBS(-)をウェルに添加して４℃にて一昼夜
（12時間程度）以上おくことにより、ブロッキング操作
を行った。

【００６１】次に、実施例１で作製したHGFR/Fcを、0.4
M NaCl、0.1% BSA、0.05% Tween 20を含む50mMリン酸緩
衝液（pH7.5）に種々の濃度で溶解したものを、先にブ
ロッキングを行ったプレートからブロッキング溶液を除
いたウェルに添加し、室温で2時間反応させた。次に0.5
M NaCl、0.05% Tween 20を含む20mMトリス緩衝液（pH7.
5）（以下、「ELISA洗浄液」と略す）を用いて洗浄を行
った後、標識抗HGFRモノクローナル抗体又は標識抗HGFR
ポリクローナル抗体１μg/mlおよび１％ BSAを含むPBS
(-) をウェルに添加し、さらに３７℃で１時間反応させ
た。再びELISA洗浄液で洗浄操作を行った後、0.4mg/ml
オルトフェニレンジアミン （OPD、Sigma社P-9029） お
よび0.015〜0.03%過酸化水素溶液を含むクエン酸−リン
酸緩衝液（pH5.0）を添加して室温にて充分反応させ、
発色を行った。この後1N H₂SO₄溶液を添加して反応を止
め、測定波長490nm、リファレンス波長650nmにて測定を
行い、その活性よりHGFRの高感度測定可能なモノクロー
ナル抗体の選別を行った。この結果により、上記還元条
件下で変性したHGFRに反応性を示さない「9-C5」、「4-
11A」抗体は、ELISA測定系でHGFRに高い反応性を持つこ
とが示された （図２）。

【００６２】

【実施例４】抗HGFRモノクローナル抗体「9-C5」、「4-
11A」の解離定数測定 実施例１にて作製・精製された抗HGFRモノクローナル抗
体「9-C5」、「4-11A」の解離定数を測定した。測定に
あたっては、BIACORE X（ビアコア社）を使用した。

【００６３】HGFRの固定化はセンサーチップCM5（ビア
コア社）に対して行った。固定化方法は、CMデキストラ
ン中のカルボキシル基をNHS/EDC混合液により活性化さ
せ、HGFR中のアミノ基と結合させるアミンカップリング
法で行った。ここでHGFRのチップへの固定化量は、約50
0RU＝0.5ng/mm²とした。

【００６４】次に、HGFR固定化チップを用い、各抗体と
の相互作用測定を行った。測定に使用するランニング緩
衝液として、 0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005% Tween20
を含む10mM HEPES緩衝液（pH7.4）を使用した。このラ
ンニング緩衝液に「9-C5」、「4-11A」抗体を、それぞ
れ数〜数十μg/ml程度の濃度になるように溶解し、流速
30μl/分でHGFRと抗体の相互作用を測定した。結合相は
100〜280sec 、解離相は280〜520secである。そのよう
にして得られた相互作用曲線を、解析プログラムBIAeva
luation version 3.0（ビアコア社）を用い、線形ある
いは非線形解析を行った（図３）。そのようにして算出
された「9-C5」抗体、「4-11A」抗体の解離定数は、そ
れぞれ６．８６×１０^-9Ｍ、８．９７×１０^-9Ｍであっ
た。

【００６５】

【実施例５】「9-C5」、「4-11A」抗体の抗原認識部位
のアッセイ 「9-C5」、「4-11A」抗体について、HGFとHGFRの複合体
を認識しうるか否かを確かめるために、ELISA結合アッ
セイを実施した。

【００６６】Naka等（J. Biol. Chem., 267: 20114-201
19 (1992)）による方法を用いて、CHO細胞内で生産され
た組換えヒトHGF (rhHGF) を10μg/mlの濃度になるよう
にPBS（pH7.4）に溶解してrhHGF溶液を調製した。rhHGF
溶液を96ウェルプレートのウェルに添加し、４℃にて一
昼夜 （12時間程度以上） おいた。このようにして得ら
れたrhHGF付着プレートよりrhHGF溶液を除き、6% BSAを
含むPBS(-)をウェルに添加して４℃にて一昼夜（12時間
程度）以上おくことにより、ブロッキング操作を行っ
た。

【００６７】次に、胃癌細胞株MKN45の培養上清を1% BS
Aを含むPBS(-)で段階希釈したものを、ブロッキング溶
液を除いたウェルに添加し、室温で２時間反応させた。
次にELISA洗浄液を用いて洗浄を行った後、標識抗「9-C
5」、「4-11A」抗体１μg/mlおよび１％ BSAを含むPBS
(-)をウェルに添加し、さらに３７℃で１時間反応させ
た。再びELISA洗浄液で洗浄操作を行った後、0.4mg/ml
オルトフェニレンジアミン（OPD、Sigma社P-9029）およ
び0.015〜0.03%過酸化水素溶液を含むクエン酸−リン酸
緩衝液（pH5.0）を添加して、室温にて充分反応させ発
色を行った。この後、１N H₂SO₄溶液を添加して反応を
止め、測定波長490nm、リファレンス波長650nmにて測定
を行った（図４）。

【００６８】この測定において、胃癌細胞株MKN45培養
上清中のHGFRの濃度依存的な活性が得られた。このこと
より、「9-C5」、「4-11A」抗体のHGFRへの認識部位
は、HGFとの結合に関与しないことが示された。

【００６９】

【実施例６】HGFR定量測定系の構築 実施例１で作製したハイブリドーマクローン「4-11A」
及び「9-C5」のモノクローナル抗体を使用して、２抗体
サンドイッチアッセイ法によるELISA測定系を構築し
た。「4-11A」抗体を固定化抗体（一次抗体）とし、「9
-C5」を標識二次抗体とした。

【００７０】「4-11A」モノクローナル抗体を20μg/ml
の濃度になるように0.05M炭酸−重炭酸緩衝液（pH9.6）
に溶解し、100μl/ウェルにて９６ウェルプレートへ添
加し、４℃にて一昼夜（12時間程度以上）または37℃に
て２時間以上おいた。この一次抗体付着プレートより一
次抗体溶液を除いた後、1% BSAを含むPBS(-)を250〜300
μl/ウェルずつ添加し、４℃にて一昼夜（12時間程度）
または37℃にて２時間以上おいた。このプレートからブ
ロッキング溶液を除き、0.4M NaCl、0.1% BSA、0.05% T
ween 20、及び50μg/mlマウスIgGを含む 50mMリン酸ナ
トリウム緩衝液（pH7.5）を50μlずつウェルに添加し、
更に0.15M NaCl、0.05% Tween20、1% BSA、20mMリン酸
ナトリウム緩衝液（pH7.5）に溶解させた種々の濃度のH
GFRを50μlずつ添加し、室温にて１時間反応させた。

【００７１】この後、500mM NaCl、0.05% Tween 20、20
mM Tris-HCl（pH7.5）を組成とする洗浄液を使用して十
分な洗浄を行なった後、実施例１で作製したハイブリド
ーマクローン「9-C5」のモノクローナル抗体をビオチン
標識したものを２次抗体とし、これを10μg/mlおよび１
％BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、室温
にて１時間反応させた。

【００７２】次に上記の洗浄液を使用して十分な洗浄を
行ない、HRP標識ストレプトアビジン（アマシャムファ
ルマシアバイオテク、コードRPN1231）を２０００倍希
釈した１％ BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加
し、さらに室温で１時間反応させた。洗浄液液で充分に
洗浄操作を行った後、0.4mg/mlオルトフェニレンジアミ
ン（OPD、Sigma社 P-9029）および0.015〜0.03%過酸化
水素溶液を含むクエン酸−リン酸緩衝液（pH5.0）を100
μl/ウェルずつ添加して室温にて反応させ、発色を行な
った。

【００７３】この後１Ｎ H₂SO₄溶液を100μl/ウェルず
つ添加して反応を止め、測定波長490nm、リファレンス
波長650nmにて測定を行なった。この結果を図５に示
す。図５には、HGFRの濃度、0〜50ng/mlの範囲で記載し
た。また、図６には、この測定系において、HGFRを緩衝
液に溶解させた場合と健常人ヒト血清に溶解させた場合
の測定値をそれぞれ示した。その結果、本発明のモノク
ローナル抗体は、健常人ヒト血清に溶解させたHGFRに対
しても、緩衝液に溶解させたときと同等の反応性を示し
た。これらのことより、この測定系においてヒト血清中
のHGFRを定量的に検出可能であることが推測された。

【００７４】

【実施例７】健常人血液中おける遊離型HGFR量の測定 実施例６で作製したHGFR定量測定系を用いて、健常人12
7人の血清を測定した。健常人血清は採取後に凍結して
保存され、本実験の直前に解凍して使用した。まず、実
施例１で作製した「4-11A」抗体付着後にブロッキング
操作を行った９６ウェルプレートに対し、あらかじめ0.
4M NaCl、0.1% BSA、0.05% Tween 20、及び50μg/mlマ
ウスIgGを含む 50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）
を50μlずつウェルに添加し、さらに健常人の血清また
は標準HGFR（0、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、200
ng/ml）を50μlずつ添加した。

【００７５】この後、室温にて１時間反応させ、500mM
NaCl、0.05% Tween 20、20mM Tris-HCl (pH7.5)を組成
とする洗浄液を使用して十分な洗浄を行なった後、実施
例１で作製した「9-C5」モノクローナル抗体をビオチン
標識したものを２次抗体とし、これを１０μg/mlおよび
１％ BSAを含むPBS(-)を100μlずつウェルに添加し、室
温にて１時間反応させた。次に上記の洗浄液を使用して
十分な洗浄を行ない、HRP標識ストレプトアビジン（ア
マシャムファルマシアバイオテク、コードRPN1231）を
２０００倍希釈した１％ BSAを含むPBS(-)を100μlずつ
ウェルに添加し、さらに室温で１時間反応させた。

【００７６】洗浄液液で充分に洗浄操作を行った後、0.
4mg/mlオルトフェニレンジアミン（OPD、Sigma社 P-902
9）および0.015〜0.03%過酸化水素溶液を含むクエン酸
−リン酸緩衝液（pH5.0）を100μl/ウェルずつ添加して
室温にて反応させ、発色を行なった。この後1N H₂SO₄溶
液を100μl/ウェルずつ添加して反応を止め、測定波長4
90nm、リファレンス波長650nmにて測定を行なった。こ
の後、標準HGFR濃度とその発色量による検量線を作製
し、健常人血清中の濃度を算出した。この結果を図７に
示す。健常人血清（検体数127）においては、0 ng/mlか
ら9 ng/mlまでの範囲を示し、平均は3.3 ng/mlであっ
た。

【００７７】

【実施例８】各種ヒト疾患患者血液中におけるHGFR量の
測定 実施例６で作製したHGFR特異的測定系を用い、実施例７
の方法に従って各種ヒト疾患患者血清中のHGFRを測定し
た。患者数は、各血清は採取後に凍結して保存され、本
実験の直前に解凍して使用した。その結果を表１に示
す。肝炎、心筋梗塞の患者血液中には、健常人（検体数
127、平均値3.3ng/ml）と比較してHGFRの濃度が高値で
あることが判った。

【００７８】

【表１】 表１ ──────────────────────────────── 症例 患者１ 患者２ 患者３ 患者４ 患者５ ──────────────────────────────── 肝炎 11.1 9.6 18.0 11.1 12.0 心筋梗塞 18.0 10.9 16.8 14.2 12.7 ────────────────────────────────

【００７９】

【発明の効果】本発明により、遊離型HGFRに特異的に結
合するモノクローナル及びポリクローナル抗体が提供さ
れる。本発明の抗体は、遊離型HGFRの特異的かつ高感度
な測定、検出に用いることができる。

【００８０】本発明の遊離型HGFRの測定法は、遊離型HG
FRの血中濃度に反映される各種疾患の診断に利用するこ
とができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】 HGFRを認識する抗体を用いたウエスタン・ブ
ロットの結果を示す写真。

【図２】 ELISA測定系における各抗体のHGFRへの反応
性を示した図。 （Ａ）標識抗HGFRポリクローナル抗体を用いた場合。 （Ｂ）標識抗HGFRモノクローナル抗体を用いた場合。

【図３】 BIACOREを用いた測定における「9-C5」、「4
-11A」抗体のHGFRへの反応曲線の一例を示す図。結合相
は100〜280sec 、解離相は280〜520secである。

【図４】 HGFに対するHGFR結合アッセイにおける各抗
体で得られた反応性を示した図。

【図５】 HGFR測定系における標準HGFRの反応性を示し
た図。

【図６】 健常人ヒト血清に溶解させた標準HGFRの反応
性を示した図。

【図７】 健常人血清中における遊離型HGFR量のヒスト
グラムを示した図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 仲 大地 神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地 三菱化学株式会社内 (72)発明者 山岸 俊哉 神奈川県横浜市青葉区鴨志田町1000番地 三菱化学株式会社内 Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA45 GA05 HA15 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13 4B065 AA90X AA93Y AB05 AC14 BA08 CA25 CA46 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 CA40 DA76 EA50 FA74

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 可溶型肝細胞増殖因子受容体を認識する
   抗体であって、下記性質を有する抗体； （ａ）体液中で観察される可溶型肝細胞増殖因子受容体
   （遊離型肝細胞増殖因子受容体）を認識し、（ｂ）還元
   条件下で変性した可溶型肝細胞増殖因子受容体を認識し
   ない。
2. 【請求項２】 モノクローナル抗体である請求項１に記
   載の抗体。
3. 【請求項３】 肝細胞増殖因子受容体の細胞外ドメイン
   からなるポリペプチドを認識し、同ポリペプチドに対す
   る解離定数が、１×１０^-8Ｍ以下である請求項１又は２
   に記載の抗体。
4. 【請求項４】 肝細胞増殖因子と肝細胞増殖因子受容体
   との複合体を認識する請求項１〜３のいずれか一項に記
   載の抗体。
5. 【請求項５】 受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８５８２、又
   はＦＥＲＭ Ｐ−１８５８３であるハイブリドーマによ
   り産生される請求項２に記載の抗体。
6. 【請求項６】 請求項２〜５に記載の抗体を生産するハ
   イブリドーマ細胞系。
7. 【請求項７】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗
   体の１種又は複数種を用いて、遊離型肝細胞増殖因子受
   容体を免疫学的方法により測定することを特徴とする、
   遊離型肝細胞増殖因子受容体の測定方法。
8. 【請求項８】 遊離型肝細胞増殖因子受容体を測定する
   検体が、疾患の疑いのある被検者または被検動物から採
   取された生体成分である請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 前記疾患が、臓器炎症、癌、肝疾患、炎
   症性腸疾患、血液疾患、心筋梗塞、狭心症、または血栓
   症である請求項８に記載の方法。
10. 【請求項１０】 前記生体成分が血液又はその分画物も
    しくは処理物である請求項８又は９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 前記生体成分が血漿もしくは血清であ
    る請求項１０に記載の方法。
12. 【請求項１２】 前記生体成分が尿である請求項８又は
    ９に記載の方法。
13. 【請求項１３】 疾患の疑いのある被検者から採取され
    た生体成分中の遊離型肝細胞増殖因子受容体を検出また
    は測定することを特徴とする疾患の検出方法。
14. 【請求項１４】 前記疾患が、臓器炎症、癌、肝疾患、
    炎症性腸疾患、血液疾患、心筋梗塞、狭心症、または血
    栓症である請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】 前記生体成分が血液又はその分画物も
    しくは処理物である請求項１３又は１４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 前記生体成分が血漿もしくは血清であ
    る請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 前記生体成分が尿である請求項１３又
    は１４に記載の方法。
18. 【請求項１８】 請求項１〜５のいずれか一項に記載の
    抗体の１種又は複数種を含み、遊離型肝細胞増殖因子受
    容体を検出または測定するためのキット。
19. 【請求項１９】 遊離型肝細胞増殖因子受容体上の異な
    るエピトープを認識する少なくとも２種のモノクローナ
    ル抗体を含む請求項１８に記載のキット。
20. 【請求項２０】 臓器炎症、癌、肝疾患、炎症性腸疾
    患、血液疾患、心筋梗塞、狭心症、または血栓症の診断
    に用いられる請求項１８又は１９に記載のキット。
21. 【請求項２１】 疾患の疑いのある患者から採取された
    生体成分中の遊離型肝細胞増殖因子受容体を測定するこ
    とを特徴とする請求項１８〜２０のいずれか一項に記載
    のキット。