JP2006271390A - 短縮型ミッドカイン(tMK)タンパク質特異的モノクローナル抗体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】短縮型ミッドカインタンパク質と反応するが、ミッドカインタンパク質とは反応しないモノクローナル抗体又はその結合性断片を製造する方法であって:請求項2に記載の組換えタンパク質抗原で免疫化したマウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させて、前記モノクローナル抗体又はその結合性断片を産生するハイブリドーマ株を樹立することと;該ハイブリドーマ株を培養して前記モノクローナル抗体又はその結合性断片を産生させることと;産生された前記モノクローナル抗体又はその結合性断片を回収することを含んでなる方法。
【選択図】なし
Description
(1) 短縮型ミッドカイン(tMK)タンパク質とは反応するが、ミッドカイン(MK)タンパク質とは反応しない、モノクローナル抗体又はその断片。
(2) 短縮型ミッドカイン(tMK)タンパク質が、ミッドカイン(MK) タンパク質の完全長アミノ酸配列から第3エキソン部分にコードされるアミノ酸配列を除いたアミノ酸配列からなることを特徴とする、上記(1)のモノクローナル抗体又はその断片。
(4) 上記(1) のモノクローナル抗体又はその断片を用いて腫瘍細胞に特異的に発現している短縮型ミッドカイン(tMK)タンパク質を検出することを特徴とする、短縮型ミッドカイン(tMK)タンパク質の検出方法。
(6) 上記(1) のモノクローナル抗体又はその断片を含むことを特徴とする、短縮型ミッドカイン(tMK)タンパク質を検出するためのキット。
(7) 上記(1) のモノクローナル抗体又はその断片により特異的に認識される、短縮型ミッドカイン(tMK)タンパク質及びその相同体。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のtMK タンパク質特異的モノクローナル抗体は、次の各工程を経て製造される。
(1) 動物の免疫及び抗体産生細胞の採取1.で得られた組換えtMK タンパク質を抗原として、3〜10週齢、好ましくは4週齢のマウスに投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内、皮下、腹腔内に適当なアジュバンド、例えば市販のフロイント完全アジュバンド、フロイントの不完全アジュバンド、BCG、水酸化アルミニウムゲル、百日咳菌ワクチン等とともに注入するのが好ましい。免疫の間隔は特に限定されないが、例えば1〜2週間おきに、2〜5回免疫すればよい。抗原の免疫量は例えば1回にマウス1匹当たり、10〜500μg 用いればよい。
[実施例]
〔実施例1〕(組み換えtMK タンパク質の調製)
tMKmRNA[T. Kaname et al., Biochemical and Biophysical Reseach Communications vol.219, pp.256-260 (1996)] の情報に基づき、ヒトMKの断片アミノ酸配列 (60-121)のN-末端に4 つの付加的アミノ酸(Met-Lys-Lys-Lys) を導入することによって、tMK 発現用プラスミドを構築した。まず、MK配列を含むプラスミドベクター(pUC118-MK vector) 上で、センスプライマー; 5'-GCC CAT GGG GATGAA AAA GAA AGC CGA CTG-3'(配列番号1)(CC CAT GGの部位はNcoI制限酵素部位) 、アンチセンスプライマー;5'-CCC AAG CTT AGT CCT TTC CCT TCC CTT TCT-3'(配列番号2)(AAG CTTの部位はHind III制限酵素部位) を用いたPCRを行うことによって、tMK タンパクをコードするDNA断片を調製した。PCRサイクルは、30サイクル行った(94℃、1分 →55℃、1分 →72℃、30秒) 。PCR 産物(217bp) の配列は、TA配列ベクター(Novagen, USA)を用いる自動DNA配列解析装置(DSQ-1000, Shimadzu, Japan) によって確認した。そのDNA配列を配列番号3に、またそれに対応するアミノ酸配列を配列番号4に示す。
(1) 抗tMK特異的抗体産生細胞の作製実施例1で調製した組換えtMKタンパク質を抗原として用いて7週齢BALB/C系雌マウスに2週間おきに合計3回免疫した。初回免疫、追加免疫にはそれぞれFCA(フロイント完全アジュバンド)、FICA(フロイント不完全アジュバンド) を等量混合し、乳状化したものを皮下接種した。最終免疫には、同量の抗原を尾静脈より接種した。最終免疫3日後、脾細胞とマウスミエローマ細胞P3X63-AG8.653を5:1の比率でPEGを用いて融合し、HAT選択培地中で培養しハイブリドーマのみを選択培養した。得られたハイブリドーマを限界希釈法によって0.5 cell/ ウェルで、96ウェルプレートに播き、ウェル中に単一コロニーとして発育したハイブリドーマのみクローンとし、この限界希釈法を2度繰り返すことによりクローニングを行った。クローン化されたハイブリドーマの培養上清を下記の抗tMK特異的抗体の検出法を用いて試験し、抗tMK特異的抗体を産生するハイブリドーマを樹立した。
(1) G401細胞上清の調製ウィルムス腫瘍由来G401細胞をMcCoy's5A培地に10% FBSを添加した培地を用いて90mmシャーレ上でコンフルエントまで培養し、その培養上清をHeparin-Sepharose column で精製したものを用いた。
上記 (1)の培養上清を抗原として、ELISA用96ウェルプレートに固相化した。プレートのウェルに一次抗体として抗tMK-MiStMK-V3抗体を、対照として抗MK抗体を分注してインキュベートし、洗浄後、二次抗体としてPOD標識抗マウスIgG、POD標識抗ラットIgGを分注してインキュベートした。洗浄後、発色基質としてABTSを用い、415nmの吸光度を測定した。結果を表2に示す。表2より明らかなように、G401細胞培養上清中にtMKの存在を確認できた。
上記(1) 培養上清をSchaggerらの方法に準じてTricin SDS-PAGEを行い、泳動後Towbinらの方法に準じてPVDF膜に転写した。この時対照として、実施例1で作成したtMKタンパク質についても同様の処理を行った。
(1) 固定サンプルの調製カバーガラス上にてG401細胞を培養し、PLP液(periodate-lysine-paraformaldehyde) にて固定した。
(1) 遺伝子組換えによる抗tMK抗体断片 (抗tMK-scFV断片) の作製前記の抗tMK-MiStMK-V3抗体を産生するハイブリドーマ株MiStMK-V3より市販のキットを用いてmRNAを分離し、cDNAライブラリーを作製した。次に、VH : 5'-CGG AAT TCG GTG CAG CTG CAG CAG TCT GG-3' (5’末端;配列番号5)、5'-CGGCTC GAG TGA GGA GAC GGT GAC TGA GG-3'(3’末端;配列番号6)、VL : 5'-GCG GAT CCT GAT GTT TTG ATG ACC CAA-3'(5’末端;配列番号7)、5'-CCC AAG CTT TTC CAA TTT GGT GCC CGC TCC GG-3'(3’末端;配列番号8)プライマーを用いてPCR を行い、VH、VL領域を複製し、間にliner:(GGC GGC GGT GGC TCG)3をVL-liner-VH となるように結合させ、発現ベクターpET-22b(+)に組み込んだ。このベクターをE.coli BL21 に形質転換し、0.1mM IPTGを含む2 ×YT培地で培養することで、抗tMK-scFV断片の発現を誘導し、ニッケルキレートカラムを用いて精製した。
Claims (6)
- 宿主細胞内において組換え型の短縮型ミッドカインタンパク質を発現させるための遺伝子であって、配列番号3に記載の塩基配列からなる遺伝子。
- 短縮型ミッドカインタンパク質と反応するが、ミッドカインタンパク質とは反応しないモノクローナル抗体又はその結合性断片を製造するための組換えタンパク質抗原であって:
請求項1に記載の遺伝子を含むベクターで宿主細胞を形質転換し、該形質転換された宿主細胞内で前記該DNAから前記抗原タンパク質を発現させ、該発現した抗原タンパク質を回収することにより得られた組換えタンパク質抗原。 - 短縮型ミッドカインタンパク質と反応するが、ミッドカインタンパク質とは反応しないモノクローナル抗体又はその結合性断片を製造する方法であって:
請求項2に記載の組換えタンパク質抗原で免疫化したマウス脾細胞とマウス骨髄腫細胞とを融合させて、前記モノクローナル抗体又はその結合性断片を産生するハイブリドーマ株を樹立することと;
該ハイブリドーマ株を培養して前記モノクローナル抗体又はその結合性断片を産生させることと;
産生された前記モノクローナル抗体又はその結合性断片を回収することを含んでなる方法。 - 請求項3に記載の方法により得られたモノクローナル抗体又はその結合性断片を用いて、腫瘍細胞に特異的に発現している短縮型ミッドカインタンパク質を検出することを特徴とする、短縮型ミッドカインタンパク質の検出方法。
- 請求項3に記載の方法により得られたモノクローナル抗体又はその結合性断片を用いて、腫瘍細胞に特異的に発現している短縮型ミッドカインタンパク質を検出することを特徴とする、腫瘍細胞の検出方法。
- 請求項3に記載の方法により得られたモノクローナル抗体又はその結合性断片を具備する、短縮型ミッドカインタンパク質を検出するためのキット。
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