JP4225487B2 - メグシン中和モノクローナル抗体 - Google Patents

Description

技術分野
本発明は、特定のセルピン（セリンプロテアーゼインヒビター）、すなわちメグシン（Ｍｅｇｓｉｎ）の反応性ループ領域に対して選択的に結合するモノクローナル抗体とその製造法、および該モノクローナル抗体を用いるメサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療、および／または予防のための組成物の治療、および／または予防のための組成物に関する。
背景技術
腎不全は、腎疾患患者が最終的に至る病態である。その原因や経歴は一様ではなく、薬物中毒、感染症、悪性腫瘍、糖尿病、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）などの本来腎臓以外の病変により、腎障害が発症し、腎不全に至る場合も数多くみられる。
腎臓の血液濾過作用や解毒作用が全く機能しない末期腎不全においては、腎移植が唯一の治療手段であるが、我が国においては、移植腎の供給体制が十分に整備されているとは言い難い。また、移植療法自体に対する社会的認知も進んでいない。我が国の腎移植例は、年間７００余症例に過ぎず、この数値はここ数年増加していない。ゆえに腎代用療法としては透析療法が唯一の治療法であるのが現状である。
現在、我が国の末期腎不全透析患者は推定約２１万人を数え、人口あたりの患者数では世界第一位である。一人当たりの平均的な治療費は年間約６００万円を必要とし、医療保険制度を圧迫する大きな原因のひとつとされている。また、毎週２〜３日、１日４〜６時間を透析治療のために拘束されることから、患者本人の社会復帰も難しい。
さらに、近年の人口の高齢化に伴い透析患者年齢も上昇しつつある。このため、腎疾患を早期に治療し、腎不全への進展を防ぐ薬剤の必要性が認識されている。しかし、腎疾患領域は、創薬のための標的分子などの情報研究基盤に乏しく、有効な医薬品が誕生しないのが現状である。
メサンギウム細胞は腎臓以外では見られない臓器特異的な細胞で、腎糸球体の構造や機能保持に重要な役割を担っていることはよく知られている。また糸球体障害時にはメサンギウム細胞自身の増殖やメサンギサム細胞から分泌される細胞外マトリックスの増加などが認められることから、疾患の発症および進展にも深く関与する細胞であると推測されている。これらのことから糸球体障害の分子メカニズムを解明するには、まずメサンギウム細胞の生物学的特性を解明することが不可欠と考えられる。しかし、メサンギウム細胞に関する遺伝子レベルの特異性は明らかにされていなかった。
ヒトの生体内には約６０兆個もの細胞が存在し、これらは同一のゲノムＤＮＡを有しているが、個々の細胞、ひいては臓器が異なった生物学的性質を有するのは各細胞や臓器に特異的に発現する遺伝子によるものと考えられている。本発明者らは、メサンギウム細胞に発現する遺伝子群のプロファイルを明らかにすれば、メサンギウム細胞に特異的な高発現遺伝子群を検出することが可能であると考えた。そして、その中から糸球体腎炎の状態に関与する遺伝子群を決定することもでき、糸球体障害の分子メカニズムを解明する糸口も見つかり、それに基づいた新しい糸球体腎炎の治療法の開発も可能になると考えた。
そこで、本発明者らは、メサンギウム細胞の遺伝子発現パターンを明らかにし、その細胞特性を遺伝子レベルで解析することを試みた。
まず本発明者らは、メサンギウム細胞に発現する遺伝子を定量的に解析することを目的として、培養ヒトメサンギウム細胞からｍＲＮＡを抽出して、３’−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃＤＮＡライブラリーを作製した。そして、クローンに挿入された遺伝子断片の大規模ＤＮＡ配列決定およびデータベース解析を施行した［Ｙａｓｕｄａ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．：Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，５３：１５４−１５８，１９９８］。
その結果、メサンギウム細胞で特に強く発現する遺伝子として、メグシンと命名した全長２，２４９ｂｐからなる遺伝子を単離した。そして、メグシンの全長ｃＤＮＡクローンがコードする３８０個のアミノ酸からなる新規タンパク質であるメグシンタンパク質を単離、取得することに成功した。更に、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアミノ酸配列データベースを用いてＦＡＳＴＡプログラムによるアミノ酸ホモロジー検索を行った。そして、メグシンタンパク質のアミノ酸配列中にセリンプロテアーゼインヒビター（セルピン：ＳＥＲＰＩＮ）スーパーファミリー［Ｃａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．：Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１０：２０，１９８５；Ｃａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，５２：５２７，１９８７；Ｋｒｕｉｔｈｏｆ，Ｅ．Ｋ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｌｏｏｄ，８６，４００７，１９９５；Ｐｏｔｅｍｐａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１５９５７，１９９４；Ｒｅｍｏｌｄ−Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，Ｅ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，３１５：１０５，１９９３］の生理活性中心部位として重要な反応性ループ領域（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｌｏｏｐ ｓｉｔｅ）内のコンセンサス配列（ＥＥＧＴＥＡＡＡＡＴ／配列番号：２）に類似の配列（ＥＥＧＴＥＡＴＡＡＴ／配列番号：３）が存在していることを見出した。すなわち、メグシンは、セルピンの構造的特徴を有し、他のセルピンと同様に活性部位である反応性ループ領域（Ｐ１７−Ｐ５’：ＥＥＧＴＥＡＴＡＡＴＧＳＮＩＶＥＫＱＬＰＱＳ／配列番号：１）が存在する［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２：８２８−８３６，１９９８］。
これらのことより、ヒトメグシンタンパク質が、セルピンに属するタンパク質であることを明らかにした［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２０：８２８−８３６，１９９８］。そしてこれらの知見を特許出願した（ＷＯ ９９／１５６５２）。
セルピンには、アンチトロンビンやプラスミノーゲン活性化因子阻害物質（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ：ＰＡＩ）、オボアルブミン等が知られている。これらのセルピン分子は互いに高い相同性を有し、三次元構造も極めてよく似ている。セルピンは、それぞれ対象とするセリンプロテアーゼと複合体を形成し、酵素活性を阻害することが知られている。プロテアーゼの活性部位に結合するのは、セルピンの柔軟な反応性ループ領域（ｒｅａｃｔｉｖｅ ｌｏｏｐ ｓｉｔｅ）である。
複合体からセルピンが解離する際に、そのポリペプチド鎖がプロテアーゼによりループの中央で切断され、やがて分子が分解される。セルピンには活性状態と切断された状態の他に、ポリペプチド鎖は完全だが機能的には不活性で、プロテアーゼに結合しないという伏在的な状態がある。現在では、セルピンのこれら３種類の状態すべてについて、Ｘ線結晶解析により構造が決定されている［Ｈｕｂｅｒ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８：８９５１，１９８９；Ｂａｕｍａｎｎ，Ｕ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１８：５９５，１９９１；Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．，３１：７５６０，１９９２；Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．，９：２２５，１９９１；Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ），３５５：２７０，１９９２；Ｓｃｈｒｅｕｄｅｒ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２９：２４９，１９９３］。
セルピン型折りたたみは、部分的にαヘリックスで覆われた３つの逆平行βシートＡ、Ｂ、Ｃが作る密な構造からなる。切断されていないオボアルブミンの構造はセルピンの基準形であると考えられ、シートＡが５本のストランドを含む。柔軟なループは、βシートＡのストランド５の端から始まり、続いてαヘリックスが分子の外側にあり、さらにβシートＣの端にあるストランド（β１６）が続き、βシートに含まれるストランド（β１７）の開始点に達する。ループ中央のαヘリックス領域にセルピンが分断される部位があり、ここは分子の外側にハンドルのように突き出ている。
活性型アンチトロンビンの柔軟なループ領域は、オボアルブミンと同じく一般的な位置にあるが、ループの始まりに近いいくつかの残基が、βシートＡのβ５とβ１５の間に６番目の短いβストランドを形成している。そのうえ、分子の主要部分から出ているループにはαヘリックスがなく、そのままトロンビンの活性部位に挿入できる。
すなわち、活性状態のセルピンでは、セリンプロテアーゼの活性部位と結合できるように、ループ領域は、セルピン分子の主要部分から突き出した形となっている（図１（ａ））。
α１アンチトリプシンの切断型では、ループ領域の始まりから切断部位までの半分は完全なβストランドを形成し、それがβシートＡのストランドβ５とβ１５の間に差し込まれている。
つまり、プロテアーゼ阻害の結果、セルピン分子は、活性部位であるループ領域の突出部で切断される。切断状態のセルピンでは、ループ領域のＮ末端部がβストランド５と１５の間に入り込み、βシートの中央で長いβストランドを形成している（図１（ｂ））。
ループ領域の後半部は活性型アンチトロンビンの場合とほぼ同じ位置を占めている。分断によって生じた２つの新しい末端（活性型ではつながっていた）はそれぞれ分子の両端にあって、約７０Å離れている。
最後に、ＰＡＩの伏在状態では、α１アンチトリプシンの切断型と同じくβシートＡにβストランドが加わっているが、柔軟なループ領域の残り部分は分子の外部でループを構成してβシートＢのβストランドにつながっており、βシートＣの端のストランドはない。
この最も安定で活性を持たない伏在状態では、切断された状態と同じくループ領域のＮ末端部分がβシート中に差し込まれたβストランドの形をとる。残りの残基は、βシートの反対側の端でループを形成する（図１（ｃ））［Ｃａｒｒｅｌｌ，Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２：２５７−２７０，１９９４］。
すなわち、セルピンの活性部位であるループ領域は、「活性型」、「切断された状態」、および「伏在状態」の３種類の形態をとり得る。
活性型から伏在型への転換が起こると、ループは長いβストランドに変わりβシートの中央に挿入される。既に構成されている安定なβシートにβストランドを挿入するような大きな構造変化を起こすには、βシート中の隣り合ったストランドがまず離れなければならない。このことは、密な構造をとるために分子内部につくられた多数の疎水的な接触を組み換えるだけでなく、多数の水素結合が切れることを意味している。新たに形成される水素結合や充填のための接触は、余分なβストランドが挿入されてからつくり直さなければならない。β構造に起こるこのような大きな変化は、セルピンの構造決定以前にはまったく予想もされなかったし、これ以外の系ではまだ観察されていない［Ｂｒａｎｄｅｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．：Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９９］。
発明の開示
本発明の目的は、メサンギウム細胞に関連する疾病の治療等に有効なメグシン中和抗体を提供することである。また、本発明は、メグシンの反応性ループ領域に対して選択的に結合するモノクローナル抗体とその製造法、および該モノクローナル抗体を用いるメサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療、および／または予防のための組成物の提供を課題とする。
メグシンは、セリンプロテアーゼインヒビター（ＳＥＲＰＩＮ）の構造的特徴を有し、他のセルピンと同様に活性部位である反応性ループ領域（Ｐ１７−Ｐ５’：ＥＥＧＴＥＡＴＡＡＴＧＳＮＩＶＥＫＱＬＰＱＳ／配列番号：１）が存在する［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２：８２８，１９９８］。
一方、メグシンのトランスジェニックマウスが進行性のメサンギウム基質の拡大、メサンギウム細胞の増殖、および免疫複合体沈着物の増加を示すことから、そのセルピン活性により腎炎が惹起されている可能性が強く示唆される［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０９，５８５，２００２］。
メグシンがセルピンスーパーファミリーに属する糸球体高発現遺伝子であることから、この遺伝子が糸球体における機能遺伝子で、糸球体腎炎の発症／進展に関連性を有すると考えられる。そしてメグシンタンパク質がセルピンスーパーファミリーに特有のｒｅａｃｔｉｖｅ ｌｏｏｐ ｓｉｔｅを有することから、ある種のセリンプロテアーゼに対する抑制因子として働くことが考えられる。
プロテアーゼ活性はプロテアーゼとそれに対する抑制因子間の活性のバランスによって一定に保たれており、その変動は組織／細胞の機能や病態に著しく影響を及ぼすことが知られている。事実、糸球体硬化時には、細胞外マトリックス蛋白のプロテアーゼによる分解能低下がみられる。また別の例として、セルピンの一種であるＰＡＩ−１（メグシンタンパク質とのアミノ酸相同性は２７．７％）の高発現マウスでは野生マウスに比し、ブレオマイシン反応性線維症が高率に誘発されるが、逆にＰＡＩ−１欠損マウスでは線維症が起こりにくいという研究結果も報告されている［Ｅｉｔｓｍａｎ，Ｄ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：２３２，１９９６］。
さらに近年、セルピンはセリンプロテアーゼ活性を抑制するのみならず、血液凝固、線維素溶解、炎症反応、細胞分化／増殖、アポトーシスにも関与し、その生理機構や病態生理学的意義が多岐にわたることが報告されている［Ｋｒｕｉｔｈｏｆ，Ｅ．Ｋ．Ｏ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｌｏｏｄ，８６，Ｉ：４００７，１９９５；Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ｆ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，７４：１７２，１９９５；Ｔｓｕｊｉｍｏｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１５３７３，１９９７；Ｂｉｒｄ，Ｐ．Ｉ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒ．，２４：６３，１９９８；Ｐｏｔｅｍｐａ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：１５９５７，１９９４］。
更に、様々な組織および細胞をノーザンブロットおよび逆転写ポリメラーゼ連鎖反応で分析したところ、メグシンは、ヒト繊維芽細胞、平滑筋細胞、内皮細胞、ケラチノサイトでは発現が弱く、メサンギウム細胞で特に強く発現していることが判った。即ち、メグシン遺伝子の発現はメサンギウム細胞に特異性を有する。これらの知見はさらにｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２：８２８，１９９８；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，１０：２６０６，１９９９］およびメグシン抗体を用いた免疫組織化学法［Ｉｎａｇｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８６：１０９８，２００１］により確認された。
また、ＩｇＡ腎症患者や糖尿病性腎症患者と健常人とで腎臓組織中のメグシンの発現量を比較すると、ＩｇＡ腎症患者や糖尿病性腎症患者においてメグシンの発現量が有意に多い［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２：８２８，１９９８；Ｓｕｚｕｋｉ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，１０：２６０６，１９９９］。また、ラットを用いた実験的メサンギウム増殖性糸球体腎炎モデル（Ｔｈｙ−１腎炎モデル）において、同様なメグシン発現量の上昇が認められた［Ｎａｎｇａｋｕ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ．，６０：６４１，２００１］。このことからメグシンの発現がメサンギウム細胞の機能異常に伴い変化し、疾患の発症／進展に深く関与していることが明らかになった。
メサンギウムの機能におけるメグシンの役割をさらに理解するために、我々はマウスゲノムでヒトメグシンのｃＤＮＡを過剰発現させた。２系統のメグシントランスジェニックマウスが得られ、それらは、進行性のメサンギウム基質の拡大、メサンギウム細胞の増殖、および免疫複合体沈着物の増加を示した［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０９，５８５，２００２、ＷＯ ０１／２４６２８］。これらの知見は、メグシンが、メサンギウムの機能に生物学的に重要な影響を及ぼすことを示している。興味深いことに、メグシンの単一遺伝子操作は、実験的およびヒト糸球体腎炎に存在する初期的なメサンギウム病変を発生させることができる。このように、動物個体においても、メグシンはメサンギウム増殖性糸球体腎炎の発症に関与することが報告されている。
従って、メグシンに対し、その作用を中和し得る活性を有する物質、とりわけ特異性に優れた中和抗体（モノクローナル抗体）を見出し、特定することは、メサンギウム細胞の生物学的性質の解明、メサンギウム細胞に関連する疾患の原因の究明、ひいては、メサンギウム細胞に関連する疾病の治療、診断等に有効である。
本発明者らは、組換えメグシンを用いて、メグシンに対し中和活性を有する抗体を精査した結果、特定の領域を認識するモノクローナル抗体が、メグシンの活性を中和しうることを見出し、本発明を完成した。メグシンに対するモノクローナル抗体は知られていたが（ＷＯ ００／５７１８９）、メグシンの反応性ループ領域（Ｐ１７−Ｐ５’：ＥＥＧＴＥＡＴＡＡＴＧＳＮＩＶＥＫＱＬＰＱＳ／配列番号：１）内のエピトープと特異的に結合する抗体についての知見は確認されていなかった。また、メグシンの作用を中和する抗体も知られていなかった。本発明によるモノクローナル抗体は、メグシンとメグシンに対するリガンドの一つであるプラスミンとの反応を中和することができる。すなわち、本発明は以下のモノクローナル抗体、ならびにその用途に関する。
〔１〕メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体。
〔２〕配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体。
〔３〕請求項１または請求項２に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
〔４〕ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４９として寄託されたハイブリドーマＭＳ１８ａ。
〔５〕ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４９として寄託されたハイブリドーマＭＳ１８ａが産生するモノクローナル抗体。
〔６〕ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４９として寄託されたハイブリドーマＭＳ１８ａを培養し、培養物に含まれるイムノグロブリンを回収する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
〔７〕次の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分の有効量を含有するメサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療、および／または予防のための組成物。
（ａ）メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｂ）配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｃ）ハイブリドーマＭＳ１８ａ株により産生されるモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｄ）（ａ）−（ｃ）のいずれかに記載の可変領域を構成する相補性決定領域を含む抗体またはその可変領域
〔８〕次の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分をメグシンに接触させる工程を含む、メグシンの活性中和方法。
（ａ）メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｂ）配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｃ）ハイブリドーマＭＳ１８ａ株により産生されるモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｄ）（ａ）−（ｃ）のいずれかに記載の可変領域を構成する相補性決定領域を含む抗体またはその可変領域
〔９〕次の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分を有効成分として含有する、メグメグシンの活性中和剤。
（ａ）メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｂ）配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｃ）ハイブリドーマＭＳ１８ａ株により産生されるモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｄ）（ａ）−（ｃ）のいずれかに記載の可変領域を構成する相補性決定領域を含む抗体またはその可変領域
あるいは本発明は、上記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分の有効量を投与する工程を含む、メサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療、および／または予防のための方法に関する。更に本発明は、上記（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分の、メサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療、および／または予防のための組成物の製造における使用に関する。
本発明は、メグシンの作用を中和するモノクローナル抗体を提供する。本発明において、メグシンの作用の中和とは、メグシンのセルピン活性の中和作用を意味する。またセルピン活性とは、セリンプロテアーゼのプロテアーゼ活性に対する阻害作用である。本発明において、中和とは、セルピン活性の完全な抑制のみならず、部分的な抑制を含む。
モノクローナル抗体がメグシンの作用を中和することは、たとえば実施例２に記載の方法によって確認することができる。すなわち、セリンプロテアーゼとしてプラスミンを用い、そのプロテアーゼ活性のメグシンによる阻害における、モノクローナル抗体の抑制効果を指標として、その中和活性を確認することができる。プロテアーゼ活性は、たとえば蛍光基質の消化を観察することにより測定することができる。
本発明者らは、メグシンの反応性ループ領域を認識するモノクローナル抗体が、メグシンの中和作用を有することを見出した。すなわち本発明は、メグシンの反応性ループ領域を認識するモノクローナル抗体に関する。メグシンの反応性ループ領域とは、メグシンのアミノ酸配列中、特に配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる領域を言う。したがって本発明のモノクローナル抗体は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体である。中でもアミノ酸配列ＮＩＶＥＫＱ（配列番号：４）を認識するモノクローナル抗体は、メグシンのセルピン活性を効果的に抑制することができる望ましいモノクローナル抗体である。
モノクローナル抗体が、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるペプチドによって構成されるエピトープを認識することは、エピトープマッピングによって確認することができる。たとえば実施例３においては、様々なアミノ酸配列からなるペプチドを用いて、モノクローナル抗体が認識するエピトープを特定している。
メグシンに対するモノクローナル抗体は、ヒトのメグシンまたはそのドメインペプチドを免疫原として、公知の方法によって得ることができる。モノクローナル抗体の取得方法は、後に具体的に述べる。得られたモノクローナル抗体を、上記のような評価方法に基づいて選択することによって、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。
本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマとして、たとえばハイブリドーマＭｓ１８ａ細胞を示すことができる。ハイブリドーマＭｓ１８ａは、メグシンの反応性ループを構成するアミノ酸配列中、ＮＩＶＥＫＱ（配列番号：４）を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。ハイブリドーマＭｓ１８ａが産生するモノクローナル抗体Ｍｓ１８ａは、メグシンの中和活性を有する。
ハイブリドーマＭｓ１８ａは、２００２年４月１日付け（原奇託日）で日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号中央第６に所在の独立行政法人産業技術総合研究所内特許生物寄託センターに対して、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４９として寄託されている。
このハイブリドーマＭｓ１８ａ細胞株が産生するモノクローナル抗体のアイソタイプは、Ｈ鎖はＩｇＧ１、Ｌ鎖はκであった。本発明はまた、上記抗体のクラススイッチ変異体、例えば、アイソタイプＩｇＧ３、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ａおよびその他の免疫グロブリンサブクラスに属する変異体等を包合し、その様な変異体は、Ｍａｒｔｉｎらの方法により作成することができる（Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．，１４５：１１１８，１９９１）。
メグシンに対するモノクローナル抗体の作製には、免疫原性抗原として使用できるメグシンが必要である。抗原としてのメグシンは、培養細胞、例えばメグシン産生細胞を用いて得ることができる。メグシン産生細胞としては、例えばヒト腎由来細胞等が挙げられる。このメグシン産生細胞は、当該分野で知られた、あるいはそれらと実質的に同様な培地や培養方法を用いて培養し、培養上清中に産生されるメグシンを例えばイオン交換クロマトグラフィーおよび／またはポリクローナル抗体を使用したアフィニティークロマトグラフィーにより精製することができる。
また、組換えメグシンも用いることができる。具体的には、メグシンのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含む遺伝子断片を含む組換えベクターにより宿主細胞を形質転換した後、この形質転換宿主を培養して、メグシンのアミノ酸配列を含むポリペプチドを製造し、該ポリペプチドを免疫原として使用するものである。メグシンのｃＤＮＡを含む組換えベクターは、通常の遺伝子組換え手法により、例えばプラスミドベクターに挿入することによって作製される。ベクターとしては、プラスミドやファージの他に、ワクシニアウィルス、バキュロウィルス等のウィルスも使用できる。
宿主としては、例えば大腸菌、枯草菌、放線菌等の原核生物、ならびに各種細胞、例えば動物細胞、ＣＨＯ細胞等の市販の細胞株ならびに酵母、植物細胞、昆虫細胞等の真核生物を用いることができる。また、原核生物に使用できるプロモーターとしては、例えばトリプトファン合成酵素オペロン、ラクトースオペロン等を用いることができる。真核生物に使用できるプロモーターとしては、例えば、ウィルスプロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼに対するプロモーター、解糖系酵素に対するプロモーター等がある。また、マルチクローニングサイト、プロモーター、耐性遺伝子、複製開始点、ターミネーター、リポソーム結合部位等を有する市販のベクターあるいはプラスミドも使用することができる。耐性遺伝子には、テトラサイクリン、アンピシリン、ネオマイシンに対するもの等がある。この様にして調製されたメグシンは、更に免疫原性コンジュゲートとしてもよいが、そのまま適当なアジュバントと混合して動物を免疫するのに使用できる。
このように、抗原は、各種原料、例えば培養細胞、培養組織、形質転換細胞等の抗原産生原料から従来公知の方法、例えば硫酸アンモニウム沈殿法等の塩析、セファデックス等によるゲル濾過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、色素ゲルクロマトグラフィー法、電気泳動法、透析、限外濾過法、アフィニティークロマトグラフィー法および高速液体クロマトグラフィー法等により精製して得ることができる。
さらに、メグシンは、それを断片化したもの、あるいはクローニングされ、配列決定されたｃＤＮＡ配列から推定されるアミノ酸配列に基づき特徴的な配列領域を選び、ポリペプチドをデザインして化学合成し、得られたポリペプチド断片であってもよく、その断片を適当な縮合剤を介して種々の担体蛋白質類と結合させてハプテン−蛋白質の免疫コンジュゲートとし、これを用いて特定の配列のみを認識できるモノクローナル抗体をデザインすることもできる。デザインされるポリペプチドには予めシステイン残基等を付加し、免疫原性コンジュゲートの調製を容易にできるようにすることができる。
本発明ではメグシンに特異的に結合する少なくとも１種のモノクローナル抗体を提供する。本発明にかかるモノクローナル抗体は、組換えメグシンを免疫原として動物を免役した後、ミエローマ細胞と抗体産生細胞との細胞融合、ハイブリドーマの選択およびモノクローン化、モノクローナル抗体の製造、必要に応じて腹水化といった工程で作製できる。
動物の免疫は、例えば次のように行う。公知の方法［Ｍｉｙａｔａ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２０：８２８，１９９８］に従って精製したヒトメグシンタンパク質をラット、マウスなどの哺乳類動物に免疫する。哺乳類動物は細胞融合する際の相手の永久増殖性細胞と同系統の動物を用いるのが好ましい。動物の週令は、例えばマウスでは８〜１０週令が好適である。性は雌雄何れでも構わない。
免疫動物として、イムノグロブリン遺伝子をヒトの遺伝子に組み換えたトランスジェニック動物を用いることにより、ヒトのイムノグロブリンを産生させることもできる。イムノグロブリン遺伝子をヒトの遺伝子に組み換えたトランスジェニック動物を用いて、目的とする反応性を有する抗体を得る方法は公知である。このようにして得ることができるイムノグロブリンは、動物から得られたものながら、完全にヒトのイムノグロブリン分子である。
免疫の方法は、精製したヒトメグシンタンパク質を適当なアジュバント（例えばフロイント完全アジュバントまたは水酸化アルミニウムゲル−百日咳菌ワクチンなど）と混合しエマルジョンとした後、動物の皮下、腹腔内、静脈内などに投与する。以後、この免疫操作を１〜２週間間隔で２〜５回行う。最終免疫は、０．５〜２μｇのヒトメグシンタンパク質を動物の腹腔内に投与することにより行う。
このようにして免疫した動物の体液からは、ポリクローナル抗体が得られる。各免疫操作後３〜７日後に眼底静脈叢より採血し、その血清の抗体価を測定し、抗体価が充分上昇したとき、抗体または抗体産生細胞を採取する。メグシンに対する抗体価は、ＥＬＩＳＡ等の手法によって測定することができる。抗体価を測定するためのＥＬＩＳＡは、メグシンをコートしたプレートに血清を加え、更に免疫動物のＩｇＧに対する標識抗体を加えることにより実施することができる。
抗原と共に用いられるアジュバントとしては、例えばフロイント完全アジュバント、リビアジュバント、百日咳ワクチン、ＢＣＧ、リポソーム、水酸化アルミニウム、シリカゲル等が挙げられる。免疫は、例えばＢａｌｂ／ｃマウス、ＦＩマウス等のマウスをはじめとする動物を使用することができる。
上記のようにヒトメグシンタンパク質で免疫した動物から抗体産生細胞を採取する。抗体産生細胞は、脾臓、リンパ節、末梢血などから得ることができるが、特に脾臓が好ましい。例えば、最終免疫の３〜４日後に脾臓を無菌的に摘出し、Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）培地（日水製薬製）中で細断し、ピンセットで解し、１，２００ｒｐｍ×５分間の条件で遠心分離させた後、上清を除き、トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７．６５）で１〜２分間処理して赤血球を除去し、さらにＭＥＭ培地で３回洗浄して細胞融合用脾臓細胞を得る。
細胞融合前には、まず使用される腫瘍細胞株の調製をしておく必要がある。細胞融合前に使用される腫瘍細胞株は、たとえば免疫グロブリンを産生しない細胞株から選択することができる。融合される相手方の永久増殖性細胞には、永久増殖性を有する任意の細胞を用いることができるが、一般的には骨髄腫細胞（ミエローマ）が用いられる。永久増殖性細胞は抗体産生細胞と同種の動物由来のものを用いるのが望ましい。
例えばマウスの場合、８−アザグアニン耐性マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）由来骨腫瘍細胞株として次のような細胞株が知られている。
Ｐ３−Ｘ６３Ａｇ８−Ｕ１（Ｐ３−Ｕ１）［Ｃｕｒｒｅｎｔ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，８１：１，１９７８］
Ｐ３／ＮＳ１／１−Ａｇ４−１（ＮＳ−１）［Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１，１９７６］
ＳＰ２／０−Ａｇ１４（ＳＰ−２）［Ｎａｔｕｒｅ，２７６：２６９，１９７８］
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８６５３（６５３）［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２３：１５４８，１９７９］
Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）［Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５，１９７５］
これらの永久増殖性細胞株は、８−アザグアニン培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地にグルタミン（１．５ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（５×１０^−５Ｍ）、ゲンタマイシン（１０μｇ／ｍＬ）およびウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＣＬＳ製）（１０％）を加えた正常培地に、さらに８−アザグアニン（１５μｇ／ｍＬ）を加えた培地）で継代培養し、細胞融合の３〜４日前に正常培地に継代し、融合当日２×１０^７個以上の細胞数を確保する。
抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合は例えば次のように行う。上記で得られた抗体産生細胞および永久増殖性細胞をＭＥＭ培地またはＰＢＳでよく洗浄し、細胞数が５〜１０：１の比になるように混合する。１，２００ｒｐｍ×５分間遠心分離した後、上清を除き、沈殿した細胞群をよく解した後、攪拌しながら３７℃に保ちつつ、細胞融合剤としてポリエチレングリコール−１０００（ＰＥＧ−１０００）１〜４ｇ、ＭＥＭ培地１〜４ｍＬおよび細胞融合促進剤としてジメチルスルホキシド０．５〜１．０ｍＬの混液０．１〜１．０ｍＬ／１０^８個細胞を加えて細胞融合を起こさせる。
その後、１０分毎にＭＥＭ培地３ｍＬを数回添加し、ＭＥＭ培地を全量が５０ｍＬになるように加えて希釈し、細胞融合を停止させる。次に、遠心分離（１，５００ｒｐｍ×５分間）して上清を除去し、緩やかに細胞を解した後、正常培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地、１０％ＦＣＳ）１００ｍＬを加え、メスピペットによるピペッティングで緩やかに細胞を懸濁する。
この懸濁液を９６ウエルの培養用プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌずつ分注し、５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で３〜５日間培養する。培養プレートに１００μＬ／ｗｅｌｌのＨＡＴ培地（正常培地にヒポキサンチン（１０^−４Ｍ）、チミジン（１．５×１０^−５Ｍ）およびアミノプテリン（４×１０^−７Ｍ）を添加した培地）を加え、さらに３日間培養する。以後３日間毎に培養上清の半容量を除去し、新たに同量のＨＡＴ培地を加え、５％ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で約２週間培養する。
融合細胞がコロニー状に生育しているのが認められるウエルについて、上清の半容量を除去し、ＨＴ培地（ＨＡＴ培地からアミノプテリンを除いたもの）を同量加え、４日間培養する。培養上清の一部を採取し、前述のＥＬＩＳＡによりメグシンタンパク質に対する抗体価を測定する。
より具体的には、例えばメグシンタンパク質抗原を直接又は担体と共に吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、次に放射性物質や酵素などで標識した抗免疫グロブリン抗体を加え、標識を測定することによって抗体価を測定することができる。固相には、マイクロプレート等が用いられる。また抗免疫グロブリン抗体としては、細胞融合に用いられる細胞がマウスの場合、抗マウス免疫グロブリン抗体が用いられる。
その他、標識抗体に代えて、プロテインＡを加え、固相に結合した抗メグシンタンパク質モノクローナル抗体を検出することもできる。更に、抗免疫グロブリン抗体またはプロテインＡを吸着させた固相にハイブリドーマ培養上清を添加し、放射性物質や酵素などで標識したメグシンタンパク質を加えることによって、抗体価を測定することもできる。
メグシンタンパク質に反応する抗体の産生が観察されたウエルにつき、限界希釈法によりクローニングを４回繰り返し、安定したメグシンタンパク質の抗体価を示すものを抗メグシンタンパク質モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
上記のようにして得られたハイブリドーマをｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで培養することによりモノクローナル抗体を産生させる。所望のモノクローナル抗体を、ＦＣＳ含有ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の適当な培地中で培養し、その培養上清から得ることができる。ハイブリドーマのｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養は、好ましくは無血清培地中で行われ、至適量の抗体をその上清に与える。
ｉｎ ｖｉｖｏで培養する場合、任意の動物にハイブリドーマを移植する。移植のための宿主動物は、細胞融合に用いた脾臓細胞を採取した動物と同種の動物を使用するのが好ましい。例えば、プリスタン処理をした８〜１０週令のＢａｌｂ／ｃ雌マウスに上記で得られた抗メグシンタンパク質モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞の２〜４×１０^６個／匹腹腔内投与する。プリスタン処理は、たとえば２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン−プリスタン−０．５ｍＬを腹腔内投与し、２週間飼育することにより行われる。
２〜３週間でマウスの腹腔内にモノクローナル抗体を高濃度に含んだ腹水が貯留し腹部が肥大してくる。このマウスから腹水を採取し、遠心分離（３，０００ｒｐｍ×５分間）して固形分を除去し、ＩｇＧを精製する。
腹水や培養上清を５０％硫酸アンモニウムを用いて塩析し、ＰＢＳで１〜２週間透析する。この透析画分をプロテインＡセファロースカラムに通し、ＩｇＧ画分を集め、精製モノクローナル抗体を得る。このモノクローナル抗体は、メグシンとメグシンに対するリガンドの一つであるプラスミンとの反応を中和することができる
抗体のアイソタイプは、市販のキット（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ製、Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ Ｋｉｔ等）を用いるか、またはオクタロニィ（二重免疫拡散）法（免疫学実験入門，生物化学実験法１５，学会出版センター刊，７４頁，１９８１年）により決定した。タンパク質量は、フォーリン法および２８０ｎｍにおける吸光度（１．４（ＯＤ_２８０）イムノグロブリン１ｍｇ／ｍＬ）により算出する。
大量のモノクローナル抗体を得るにはハイブリドーマの腹水化を利用することができる。この場合、ミエローマ細胞由来の動物と同系の組織適合性のある動物の腹腔内に各ハイブリドーマを移植し、増殖させるか、あるいはヌードマウスなどに各ハイブリドーマを移植し、腹水中に産生されたモノクローナル抗体を得ることができる。
動物は、ハイブリドーマを移植する前にプリスタンなどの鉱物油を腹腔内に投与しておくことができる。腹水液はそのままあるいは常法により精製することができる。例えば、硫酸アンモニウム沈殿法などの塩析、セファデックス等によるゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、透析、限外濾過法、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー法等により精製することができる。
上記のようにして得られたモノクローナル抗体の特性は、例えば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）等により明らかにすることができる。
本発明のモノクローナル抗体は、ヒトメグシンの反応性ループ領域と特異的に結合し、メグシンとメグシンに対するリガンドの一つであるプラスミンとの反応を中和することができる。したがって本発明のモノクローナル抗体は、メグシンの活性中和方法、あるいは活性中和剤として有用である。すなわち本発明は、次の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分をメグシンに接触させる工程を含む、メグシンの活性中和方法を提供する。あるいは本発明は次の（ａ）−（ｄ）のいずれかに記載の成分を有効成分として含有するメグシンの活性中和剤に関する。
（ａ）メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｂ）配列番号：１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドによって構成されるエピトープを認識するモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｃ）ハイブリドーマＭＳ１８ａ株により産生されるモノクローナル抗体またはその可変領域
（ｄ）（ａ）−（ｃ）のいずれかに記載の可変領域を構成する相補性決定領域を含む抗体またはその可変領域
メグシンがメサンギムウム細胞の増殖を誘導する作用を有することは既に述べたとおりである。本発明のモノクローナル抗体はメグシンの活性を中和することから、メグシンによってもたらされている病態を改善する作用が期待できる。このため、本発明のモノクローナル抗体をヒト化した抗体は、メサンギウム細胞が増殖する疾患において、その治療に有効であると考えられる。このようなヒト化抗体は、通常、薬理学的に許容される１種あるいはそれ以上の担体と混合し、公知の製剤学的手法により製造された医薬組成物として提供するのが好ましい。
本発明のモノクローナル抗体をメグシンに関連する疾患の治療目的でヒトに投与する場合、ヒトに対する抗原性を最小限にする方法を採ることもできる。すなわち、本発明のモノクローナル抗体を公知の方法でキメラ抗体もしくはヒト化抗体とすることにより実施でき、本発明のモノクローナル抗体には、これらのヒトに対する抗原性を少なくした抗体も含まれる。
１９７５年にＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎが細胞融合とクローニング技術によるモノクローナル抗体の産生法（ハイブリドーマ法）を報告して以来、ハイブリドーマ細胞を培養することによって標的に対する高い特異性と親和性を持つ均一な抗体（モノクローナル抗体）が大量に得られるようになった［Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．：Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７，１９７５］。１９８０年にはマウスモノクローナル抗体を用いたリンパ腫の治療が報告された［Ｎａｄｌｅｒ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．：Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４０：３１４７−３１５４，１９８０］。
しかしながら、このような抗体はマウス由来の異種血清であったため、ヒト体内では異物として認識され、体内においてマウス由来のモノクローナル抗体に対する抗体（ヒト抗マウス抗体：Ｈｕｍａｎ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ：ＨＡＭＡ）が産生される。その結果、マウス抗体のエフェクター機能（補体依存性の細胞障害活性：ＣＤＣ、抗体依存性の細胞障害活性：ＡＤＣＣ）がヒト体内では減弱し、有効濃度の維持が困難となるという問題点があった。
また、抗体投与を繰り返すとアナフィラキシーなどのショック症状を呈する危険性があり、反復投与が困難であるという問題点も知られている［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２：８８１，１９８４；Ｂｌｏｏｄ，６５：１３４９，１９８５；Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８０：９３２，１９８８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：１２４２，１９８５；Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，２６：１０１１，１９８５；Ｂｌｏｏｄ，６５：１３４９，１９８５；Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．，８０：９３７，１９８８；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：１５３０，１９８５；Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４６：６４８９，１９８６］。
しかし、近年の遺伝子組換え技術の目覚ましい進歩に伴い、これらの問題は解決されつつある。まず、抗体の免疫原性を改良するため、マウス抗体のＦｃ部分を含むＨ鎖、Ｌ鎖の定常領域をヒト抗体と置換したヒト型キメラ抗体が創製された。キメラ抗体とはマウス抗体とヒト抗体のキメラ分子をいう。
ヒト型キメラ抗体は、抗体可変領域（Ｖ領域）がヒト以外の動物抗体由来で抗体定常領域（Ｃ領域）がヒト抗体由来である抗体である［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１，１９８４］。ヒト抗原をマウスに免疫し、そのマウスモノクローナル抗体の遺伝子から抗原と結合する抗体可変領域（Ｖ領域）を切り出し、ヒト由来の抗体定常領域（Ｃ領域）遺伝子と結合してキメラ遺伝子を作製する。
このキメラ遺伝子を宿主細胞で発現させれば、ヒト・マウス・モノクローナル抗体が産生できる。キメラ抗体はヒトに対する抗原性が少ないため、ヒトに投与した場合、ヒト以外の動物由来のモノクローナル抗体に対する抗体はほとんど惹起されず、血中半減期が６倍延長することが報告されている［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６：４２２０，１９８９］。
キメラ抗体よりもさらに免疫原性を低下させるため、可変領域中の抗原結合領域（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ：ＣＤＲ、相補性決定領域）の遺伝子配列のみをヒト抗体のＣＤＲ部位に移植（ＣＤＲグラフティング）し、抗体分子のＣＤＲを除いた全分子をヒト化したヒト化抗体が作製された［Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２，１９８６］。ヒト化抗体はヒト・マウス・キメラ抗体よりマウスの抗体部分が少ないため、抗原性は一層少なく安全性が高い。サルを用いた実験では、マウス抗体に比べ免疫原性が低下し、血中半減期が４〜５倍伸びることが報告されている［Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：１３５２，１９９１］。
上記に示した方法等を用いることにより、本発明の抗体をヒト化することができ、ヒトに投与する場合には非常に有用である。
また本発明において、抗体の可変領域とは、抗体の抗原との結合に必要な領域と定義される。したがって、酵素的な消化によって得ることができるＦａｂなどの抗体断片のみならず、抗原結合領域をコードするＤＮＡを単離し、適当な宿主ベクター系で発現させることによって得ることができる抗体断片も可変領域に含まれる。更に本発明の抗体可変領域は、重鎖と軽鎖の抗原結合領域を１本のペプチド鎖に連結させたｓｃＦｖを含む。
本発明の医薬組成物の投与方法として、経口投与、静脈内投与以外に、経粘膜投与、経皮投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸内投与等が適宜選択でき、その投与方法に応じて、種々の製剤として用いることができる。以下に、各製剤について記載するが、本発明において用いられる剤型はこれらに限定されるものではなく、医薬製剤分野において通常用いられる各種製剤として用いることができる。
＜全身投与製剤＞
メサンギウム増殖性糸球体腎炎に対する治療および／または予防のために用いる場合には、ヒト化抗体の経口投与量は、０．１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇの範囲が好ましく、より好ましくは、１μｇ／ｋｇ〜１０μｇ／ｋｇである。
経口投与を行う場合の剤型として、散剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤およびシロップ剤等があり、適宜選択することができる。また、それら製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる。また、口腔内局所投与を行う場合の剤型として、咀嚼剤、舌下剤、バッカル剤、トローチ剤、軟膏剤、貼布剤、液剤等があり、適宜選択することができる。また、それら製剤について徐放化、安定化、易崩壊化、難崩壊化、腸溶性化、易吸収化等の修飾を施すことができる。
上記の各剤型について、公知のドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）の技術を採用することができる。本明細書に言うＤＤＳ製剤とは、徐放化製剤、局所適用製剤（トローチ、バッカル錠、舌下錠等）、薬物放出制御製剤、腸溶性製剤および胃溶性製剤等、投与経路、バイオアベイラビリティー、副作用等を勘案した上で、最適の製剤形態にした製剤を言う。
ＤＤＳの構成要素には基本的に薬物、薬物放出モジュール、被包体および治療プログラムから成り、各々の構成要素について、特に放出を停止させた時に速やかに血中濃度が低下する半減期の短い薬物が好ましく、投与部位の生体組織と反応しない被包体が好ましく、さらに、設定された期間において最良の薬物濃度を維持する治療プログラムを有するのが好ましい。薬物放出モジュールは基本的に薬物貯蔵庫、放出制御部、エネルギー源および放出孔または放出表面を有している。これら基本的構成要素は全て揃っている必要はなく、適宜追加あるいは削除等を行い、最良の形態を選択することができる。
ＤＤＳに使用できる材料としては、高分子、シクロデキストリン誘導体、レシチン等がある。高分子には不溶性高分子（シリコン、エチレン・酢酸ビニル共重合体、エチレン・ビニルアルコール共重合体、エチルセルロース、セルロースアセテート等）、水溶性高分子およびヒドロキシルゲル形成高分子（ポリアクリルアミド、ポリヒドロキシエチルメタクリレート架橋体、ポリアクリル架橋体、ポリビニルアルコール、ポリエチレンオキシド、水溶性セルロース誘導体、架橋ポロキサマー、キチン、キトサン等）、徐溶解性高分子（エチルセルロース、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体の部分エステル等）、胃溶性高分子（ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルメロースナトリウム、マクロゴール、ポリビニルピロリドン、メタアクリル酸ジメチルアミノエチル・メタアクリル酸メチルコポリマー等）、腸溶性高分子（ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、酢酸フタルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、カルボキシメチルエチルセルロース、アクリル酸系ポリマー等）、生分解性高分子（熱凝固または架橋アルブミン、架橋ゼラチン、コラーゲン、フィブリン、ポリシアノアクリレート、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリβヒドロキシ酢酸、ポリカプロラクトン等）があり、剤型によって適宜選択することができる。
特に、シリコン、エチレン・酢酸ビニル共重合体、エチレン−ビニルアルコール共重合体、メチルビニルエーテル・無水マレイン酸共重合体の部分エステルは薬物の放出制御に使用でき、セルロースアセテートは浸透圧ポンプの材料として使用でき、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロースは徐放性製剤の膜素材として使用でき、ポリアクリル架橋体は口腔粘膜あるいは眼粘膜付着剤として使用できる。
また、製剤中にはその剤形（経口投与剤、注射剤、座剤等の公知の剤形）に応じて、溶剤、賦形剤、コーティング剤、基剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、粘稠剤、乳化剤、安定剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、保存剤、矯味剤、芳香剤、着色剤等の添加剤を加えて製造することができる。
これら各添加剤について、それぞれ具体例を挙げて例示するが、これらに特に限定されるものではない。溶剤としては、精製水、注射用水、生理食塩液、ラッカセイ油、エタノール、グリセリン等を挙げることができる。賦形剤としては、デンプン類、乳糖、ブドウ糖、白糖、結晶セルロース、硫酸カルシウム、炭酸カルシウム、タルク、酸化チタン、トレハロース、キシリトール等を挙げることができる。
コーティング剤としては、白糖、ゼラチン、酢酸フタル酸セルロースおよび上記記載した高分子等を挙げることができる。基剤としては、ワセリン、植物油、マクロゴール、水中油型乳剤性基剤、油中水型乳剤性基剤等を挙げることができる。
結合剤としては、デンプンおよびその誘導体、セルロースおよびその誘導体、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、トラガント、アラビアゴム等の天然高分子化合物、ポリビニルピロリドン等の合成高分子化合物、デキストリン、ヒドロキシプロピルスターチ等を挙げることができる。
滑沢剤としては、ステアリン酸およびその塩類、タルク、ワックス類、小麦デンプン、マクロゴール、水素添加植物油、ショ糖脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。崩壊剤としては、デンプンおよびその誘導体、寒天、ゼラチン末、炭酸水素ナトリウム、セルロースおよびその誘導体、カルメロースカルシウム、ヒドロキシプロピルスターチ、カルボキシメチルセルロースおよびその塩類ならびにその架橋体、低置換型ヒドロキシプロピルセルロース等を挙げることができる。
溶解補助剤としては、シクロデキストリン、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等を挙げることができる。懸濁化剤としては、アラビアゴム、トラガント、アルギン酸ナトリウム、モノステアリン酸アルミニウム、クエン酸、各種界面活性剤等を挙げることができる。粘稠剤としては、カルメロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアルコール、トラガント、アラビアゴム、アルギン酸ナトリウム等を挙げることができる。
乳化剤としては、アラビアゴム、コレステロール、トラガント、メチルセルロース、各種界面活性剤、レシチン等を挙げることができる。安定剤としては、亜硫酸水素ナトリウム、アスコルビン酸、トコフェロール、キレート剤、不活性ガス、還元性物質等を挙げることができる。
緩衝剤としては、リン酸水素ナトリウム、酢酸ナトリウム、ホウ酸等を挙げることができる。等張化剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖等を挙げることができる。無痛化剤としては、塩酸プロカイン、リドカイン、ベンジルアルコール等を挙げることができる。
保存剤としては、安息香酸およびその塩類、パラオキシ安息香酸エステル類、クロロブタノール、逆性石けん、ベンジルアルコール、フェノール、チロメサール等を挙げることができる。矯味剤としては、白糖、サッカリン、カンゾウエキス、ソルビトール、キシリトール、グリセリン等を挙げることができる。芳香剤としては、トウヒチンキ、ローズ油等を挙げることができる。着色剤としては、水溶性食用色素、レーキ色素等を挙げることができる。
上記したように、医薬品を徐放化製剤、腸溶性製剤または薬物放出制御製剤等のＤＤＳ製剤化することにより、薬物の有効血中濃度の持続化、バイオアベイラビリティーの向上等の効果が期待できる。しかし、ヒト化抗体は生体内で失活化または分解され、その結果、所望の効果が低下または消失する可能性がある。従って、ＤＤＳを失活化または分解する物質を阻害する物質をメサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療および／または予防のための医薬組成物と併用することにより、成分の効果をさらに持続化させ得る。これらは製剤中に配合してもよく、または別々に投与してもよい。当業者は適切に、ＤＤＳを失活化または分解する物質を同定し、これを阻害する物質を選択し、配合あるいは併用することができる。
製剤中には、上記以外の添加物として通常の組成物に使用されている成分を用いることができ、これらの成分の添加量は、本発明の効果を妨げない範囲で通常量とすることができる。
その他本発明のモノクローナル抗体は、免疫染色、例えば組織あるいは細胞染色、免疫沈降、イムノブロット、イムノアッセイ、例えば競合型または非競合型イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ラテックス凝集法、蛋白精製、アフィニティーカラム等にも使用することができる。ＥＬＩＳＡ法による場合は好ましくはサンドイッチ型アッセイがよい。なお、イムノアッセイには、免疫組織学的検討、イムノブロット、免疫沈降等の免疫反応を利用した方法全てを含有する。
本発明のモノクローナル抗体は、イムノアッセイに用いるために標識抗体とすることができる。抗体を標識化するものとして、酵素、酵素基質、補酵素、酵素前駆体、アポ酵素、蛍光物質、色素物質、化学ルミネッセンス化合物、発光物質、発色物質、磁気物質、金属粒子、放射性物質等を用いることができる。標識するには、チオール基とマレイミド基の反応、ピリジルジスルフィド基とチオール基の反応、アミノ基とアルデヒド基の反応等を利用することができる。
本発明のモノクローナル抗体を使用するイムノアッセイは、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液、非流体試料等を検体または試料とすることができる。たとえば生体由来の試料、具体的には、血液、血漿、関節液、脳脊髄液、唾液、羊水、尿、その他体液、細胞培養液、組織培養液、組織ホモジネート、生検試料、細胞、組織、脳組織、脳由来細胞系、神経細胞系、神経由来細胞系、乳腺由来細胞系、乳腺組織、卵巣由来細胞系、卵巣組織、癌細胞系、癌組織等が挙げられる。
従って、本発明は、この様なハイブリドーマ細胞系、イムノアッセイおよび検査キットをも提供する。さらに、本発明はメグシンを特異的に認識するモノクローナル抗体、この抗体を用いることを特徴とするメグシンの検出ならびに定量のためのイムノアッセイ、およびこのイムノアッセイを実施するための検査キットを提供する。
また、本発明により得られたモノクローナル抗体は、メグシンに対する特異性が高く、メグシンの検出ならびに定量において、非常に有用である。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例に基づいて本発明を更に具体的に説明する。
〔実施例１〕
ａ．免疫原の調製（組換えメグシン）
公知の方法［Ｉｎａｇｉ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８６：１０９８−１１０６，２００１］に準じ、ヒトのメグシンｃＤＮＡをトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養上清から組換えヒトメグシンを得た。
培養上清２Ｌに１００ｍＬの１Ｍ酢酸ナトリウムを加えてｐＨ４．５に調整した後、５０ｍＭ酢酸ナトリウムを加え、２倍に希釈した。希釈液をイオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ １６／１０ ＳＰ ＸＬ：アマシャム・バイオサイエンス製）に供した（溶出条件：５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．５）、ＮａＣｌ ０〜１Ｍリニアグラジエント；溶出容積：２０×カラムベッドボリューム）。溶出液をゲル濾過によりバッファー交換を行い（ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ、２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．８））、続いてハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー（ＨＴ−１：Ｂｉｏ−Ｒａｄ製）に供した（溶出条件：２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．８）、リン酸カリウム２０〜４００ｍＭリニアグラジエント；溶出容積：３０×カラムベッドボリューム）。溶出液を再度ゲル濾過によりバッファー交換を行い（ＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ、５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ）、イオン交換クロマトグラフィー（ＭｏｎｏＳ ＨＲ５／５：アマシャム・バイオサイエンス製）に供した（溶出条件：５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ５．５）、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ＮａＣｌ ５０〜１００ｍＭリニアグラジエント；溶出容積：４０×カラムベッドボリューム）。溶出液をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ １０（ミリポア製）を用いて遠心濃縮し（３，０００ｇ）、ダルベッコＰＢＳ（−）緩衝液（日水製薬製）にバッファー交換した。遠心濃縮とバッファー交換を３回繰り返し、精製組換えメグシンを得た。クロマトグラフィー装置は、ＡＫＴＡｅｘｐｌｏｒｅｒ １０ｓ（アマシャム・バイオサイエンス製）を用い、操作は全て４℃で行った。
ｂ．免疫処置
８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウス３匹に対し、免疫用抗原溶液をフロイント完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製）と１：１で混和しエマルジョン化したものを、メグシンタンパク質が約５０μｇ／匹となるよう皮下注射した。以後、ほぼ２週間毎に、免疫用抗原溶液をフロイント不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製）と１：１で混和しエマルジョン化したものをメグシンタンパク質が約５０μｇ／匹となるよう調製し、２回皮下注射し追加免疫を行った。２回目の追加免疫の３日後に眼底静脈より採血し、血清中の抗体価をＥＬＩＳＡ法により測定した。高い抗体価を有していたマウスについて、２回目の追加免疫の２週間後免疫用抗原溶液をフロイント不完全アジュバント（ＤＩＦＣＯ製）と１：１で混和しエマルジョン化したものをメグシンタンパク質が約５０μｇ／匹となるよう調製、皮下注射にて追加免疫し、その３日後に免疫したマウスの脾臓細胞を細胞融合に用いた。
ｃ．ＥＬＩＳＡ法（直接固相法）
免疫用抗原と同様の方法で調製したメグシンタンパク質のタンパク質溶液をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに４℃、一夜吸着させた。洗浄液（０．０５％ｔｗｅｅｎ２０（和光純薬製）を含むＰＢＳ）で３回洗浄後、ＰＢＳで４倍に希釈したブロックエース（雪印乳業製）でブロッキングを行った。その後洗浄し、上記ｂで得られた血清を抗体希釈液（１０倍希釈したブロックエースを含むＰＢＳ）で５０００倍に希釈し、１００μＬ／ウェルずつ加え、室温で２時間反応させた。
プレートを洗浄後、５０００倍に希釈したペルオキシダーゼ標識マウスＩｇＧ抗体（ケミコン製）を１００μＬ／ウェルずつ加え、室温で２時間反応させた。Ｏ−フェニレンジアミン（ナカライテスク製）を基質反応液（０．２μＬ／ｍＬ過酸化水素水（和光純薬製）を含むクエン酸−リン酸緩衝液ｐＨ５．０））に０．４ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、基質溶液を調製した。洗浄液で５回プレートを洗浄し、該基質溶液を１００μＬ／ウェルとなるように加えた。該基質溶液と３０分間反応させた後、１００μＬ／ウェルの２Ｎの硫酸を加え反応を停止させ、４９０ｎｍの吸光度を測定した。
ｄ．細胞融合、ハイブリドーマの作製
上記ＥＬＩＳＡ法の結果によりメグシンタンパク質に対する抗体価の上昇が認められたマウス３匹から最終免疫の３日後に脾臓を摘出し、常法により脾細胞を調製した。細胞融合時の親株は、事前に２０μｇ／ｍｌの８−アザグアニンを含む培地で選択し、ヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）欠損株であることを確認したＢａｌｂ／ｃマウス由来ミエローマＳＰ２細胞株を用いた。ＳＰ２細胞２×１０^７個と脾細胞１×１０^８個をあわせ、ポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ４０００；Ｍｅｒｃｋ製）を細胞融合促進剤として使用し、常法に従い細胞融合を行った。
融合後の細胞は脾細胞換算で３．０×１０^８個／ｍＬになるようにエスクロン培地（三光純薬製）にヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジンを加えた培地（ＨＡＴ培地）に懸濁し、９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）に１００μＬ／ウェルずつ分注した。該融合細胞をＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）で３〜５日毎に半量ずつ培地交換を行いながら培養した。ＨＡＴ培地で培養可能なハイブリドーマのみ選択培養した。
ｅ．ハイブリドーマのスクリーニング
コロニー形成の確認されたウェルについて、培養上清中のメグシンタンパク質に対する抗体の有無を確認するために、ｃ．で示したのと同じＥＬＩＳＡ法でスクリーニングを行い、メグシンタンパク質に対して強く反応するコロニーを選択し、クローニングに供した。
ｆ．ハイブリドーマのクローニング
メグシンタンパク質に対して結合する抗体を産生するハイブリドーマについて限界希釈法によるクローニングを３回繰り返し行い、メグシンタンパク質に対して特異的に結合する抗体を産生し、且つ安定した増殖能を有するハイブリドーマＭＳ１８ａ細胞株が得られた。これらの各ハイブリドーマ細胞は、２００２年４月１日付け（原寄託日）で日本国茨城県つくば市東１丁目１番１号 中央第６に所在の行政独立法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに対して、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−８３４９（生命研条寄第８３４９号）として寄託された。
ｇ．モノクローナル抗体のタイピング
上記で得られたハイブリドーマＭＳ１８ａ細胞株の培養上清０．５ｍＬを用いてＭｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ製）を用いてアイソタイプを調べた。ハイブリドーマＭＳ１８ａ細胞株が産生するモノクローナル抗体のアイソタイプは、Ｈ鎖はＩｇＧ１、Ｌ鎖はκであった。
ｈ．モノクローナル抗体（ＭＳ１８ａ）の調製と精製
８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスに０．５ｍｌ／匹のプリスタンを腹腔内投与し、その１０日後に上記ｄのクローニングで得られたハイブリドーマＭＳ１８ａ細胞株を１匹あたり約１０^７細胞数／０．５ｍＬ／匹で腹腔内に注入した。１０日後頃からマウスの腹部肥大を認めたため、開腹して腹水を採取した。採取した腹水は、１０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心分離し、その上清を３７℃、３０分間放置した後、４℃で一晩静置した。１２０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離後、得られた上清をアフィニティーカラムＳｅｐｈａｒｏｓｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ（アマシャム・バイオサイエンス製）を用いてモノクローナル抗体（ＭＳ１８ａ）を精製した。この抗体溶液の２６０、２８０、３２０ｎｍにおける吸光度を測定し、Ｗｅｒｂｕｌｇ−Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ法により抗体濃度を測定した。
ｉ．ウエスタンブロッティング法によるメグシンタンパク質との反応性の確認
免疫用抗原と同様の方法で調製したメグシンタンパク質のタンパク質溶液をＰＢＳで４０ｎｇ／レーンに調整し、等量の２×ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（第一化学製）と混合し、沸騰浴中で５分間加熱したものをサンプル溶液とした。該サンプル溶液をＳＤＳ電気泳動装置（第一化学製）およびトリス−グリシン緩衝液（第一化学社製）を用いて１０−２０％ポリアクリルアミドゲル（第一化学製）で電気泳動した。
一方、泳動中、ブロット用に３ＭＭ濾紙（Ｗｈａｔｔｍａｎ製）を緩衝液Ａ（第一化学製）に２枚、緩衝液Ｂ（第一化学製）に１枚、緩衝液Ｃ（第一化学製）に３枚浸した。またポリビニリデンジフルオライド膜（ＰＶＤＦ膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製）をメタノールに浸した後、精製水に浸し水になじませた。タンパク質のＰＶＤＦ膜への転写は、電気泳動後ゲルを装置から取り出し、ブロッター（ファルマシア製）に陽極側から緩衝液Ａに浸した２枚の濾紙、緩衝液Ｂに浸した１枚の濾紙、ＰＶＤＦ膜、ゲル、および緩衝液Ｃに浸した３枚の濾紙を記載の順に置き、８０ｍＶで１．５時間で行った。転写後、ＰＶＤＦ膜をブロックエース（雪印乳業製）で室温で１時間振とうする事でブロッキングした。
その後、該膜をモノクローナル抗体ＭＳ１８ａを抗体希釈液で希釈したものと４℃で一晩反応させた。その後、アルカリフォスファターゼ標識マウスＩｇＧ抗体を加え、室温で１時間反応後、ＮＢＴ−ＢＣＩＰ溶液で発色させた。結果を図２に示す。
レーン１はメグシンタンパク質のリガンドのひとつであるプラスミン、レーン２はメグシンタンパク質、レーン３はメグシンタンパク質とプラスミン混合物を示す。（ａ）は中和活性を有さないモノクローナル抗体との反応結果、（ｂ）は本発明のモノクローナル抗体ＭＳ１８ａとの反応結果である。
（ａ）のレーン３ではプラスミン−メグシンタンパク質複合体のバンドが確認されるのに対し、モノクローナル抗体ＭＳ１８ａでは認められなかった。このことは、モノクローナル抗体ＭＳ１８ａがメグシンタンパク質単独とは反応するが、メグシンタンパク質とメグシンタンパク質のリガンドのひとつであるプラスミンとの複合体とは反応しないことを示した。
〔実施例２〕メグシンタンパク質のプラスミン酵素活性阻害作用に対する中和活性
メグシンとメグシンリガンドの一つであるプラスミンとの反応に対する中和活性を指標にして、モノクローナル抗体ＭＳ１８ａのメグシンタンパク質のプラスミン酵素活性阻害作用に対する中和活性を検討した。比較のためにメグシンの活性に影響を与えないことが確認されているモノクローナル抗体を用いた。
免疫用抗原と同様の方法で調製したメグシンタンパク質のタンパク質溶液を緩衝液Ｐ（０．０５％ｔｗｅｅｎ２０を含む０．１Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８））で０．５ｍｇ／ｍＬに調整し、９６ウェルブラックマイクロプレート（ＮＵＮＣ製）に１μＬ／ウェル加え、実施例１のｈ．で精製したＭＳ１８ａ抗体１ｍｇ／ｍＬを２：１、１：１および１：２（モル比）になるように混和し、ＰＢＳを加え、全量４μＬ／ウェルとした。室温、１時間反応後、ｂｕｆｆｅｒＰで３９μｇ／ｍＬに調製したプラスミン（ＳＩＧＭＡ製）溶液を１μＬ／ウェル加え混和し、さらに、３７℃、３０分間反応させた。基質溶液（０．５２６ｍＭ Ｂｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ（ペプチド研究所製）を含むｂｕｆｆｅｒＰ）を９５μＬ／ウェル加え、室温、１時間反応させた後、蛍光強度（Ｅｘ ３８０ｎｍ、Ｅｍ ４６０ｎｍ）を測定した。
なお、プラスミンのみ、プラスミンとメグシン、プラスミンとＭＳ１８ａおよびプラスミンとメグシンとＭＳ１８ａの蛍光強度から基質溶液のみ（ブランク）の蛍光強度を引いたものを、それぞれＦＰ、ＦＰＭｅｇ、ＦＰ１８、およびＦＰＭｅｇ１８とし、下記のようにして中和活性を求めた。図３に示すように、モノクローナル抗体ＭＳ１８ａはメグシンタンパク質のプラスミン酵素活性阻害作用を中和した。
ＩＭｅｇ＝（１−ＦＰＭｅｇ／ＦＰ）×１００
Ｉ１８＝（１−ＦＰＭｅｇ１８／ＦＰ１８）×１００
中和活性（％）＝（１−Ｉ１８／ＩＭｅｇ）×１００
〔実施例３〕ＭＳ１８ａ抗体エピトープマッピング
ａ．ＥＬＩＳＡ法による検討
免疫用抗原と同様の方法で調製したメグシンタンパク質のタンパク質溶液をＰＢＳで１μｇ／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルでＥＬＩＳＡプレートに４℃、一夜吸着させた。洗浄液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０／ＰＢＳ）で３回洗浄後、ＰＢＳで４倍に希釈したブロックエースでブロッキングを行った。別にメグシンタンパク質の反応性ループ領域（Ｐ１７−Ｐ５’：ＥＥＧＴＥＡＴＡＡＴＧＳＮＩＶＥＫＱＬＰＱＳ／配列番号：１）の切断部位（Ｐ１−Ｐ１’）を中心にして、９〜１７残基のペプチドを常法により合成した（表１）。
これらのペプチド各２００μｇ／ｍＬと上記ｈ．で精製した１μｇ／ｍＬのモノクローナル抗体ＭＳ１８ａを１：１で混合し室温、３０分反応後、反応液１００μＬ／ウェルずつ加え、室温で、２時間反応させた。プレートを洗浄後、５０００倍に希釈したアルカリフォスファターゼ標識マウスＩｇＧ抗体（ケミコン製）を１００μＬ／ウェルずつ加え、室温で２時間反応させた。
ｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム（ＳＩＧＭＡ １０４ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｔａｂｌｅｔｓ）を基質反応液（０．５ｍＭ塩化マグネシウムを含む９．６％ジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．７））に２ｍｇ／ｍＬの濃度になるよう溶解し、基質溶液を調製した。洗浄液で５回プレートを洗浄し、該基質溶液を１００μＬ／ウェルとなるように加えた。該基質溶液と３０分間反応させた後、１００μＬの３ＮのＮａＯＨを加え反応を停止させ、４０５ｎｍの吸光度を測定した。ペプチド無添加およびエピトープに無関係のペプチドを加えたものを対照とした。高い吸光度は、抗体がペプチドと反応していないことを示している。結果を表１に示す。

ｂ．モノクローナル抗体ＭＳ１８ａのメグシン阻害活性による抗体エピトープおよび中和活性の検討
表１で示したペプチドのうち、吸光度に大きな変化が認められたＭ１０７〜Ｍ１１２のペプチドのうち、Ｍ１０７、Ｍ１０８、Ｍ１１１およびＭ１１２をＰＢＳで１ｍｇ／ｍＬに調整し、９６ウエルブラックマイクロプレート（ＮＵＮＣ製）に１．５μＬ／ウエル加え、プロテインＡで精製したモノクローナル抗体ＭＳ１８ａ（１ｍｇ／ｍＬ、１．５μＬ／ウエル）と混和した。室温で１時間反応後、精製メグシンタンパク質のタンパク質溶液をｂｕｆｆｅｒ Ｐで０．５ｍｇ／ｍＬに調整し、１μＬ／ウエル加えて混和した。室温で１時間反応後、ｂｕｆｆｅｒＰで３９μｇ／ｍＬに調製したプラスミン（ＳＩＧＭＡ製）溶液を１μＬ／ウエル加え混和し、さらに３７℃で３０分間反応させた。
基質溶液（０．５２６ｍＭのＢｏｃ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ＭＣＡ（ペプチド研究所製）を含むｂｕｆｆｅｒＰ）を９５μＬ／ウエル加えて室温で１時間反応後、蛍光強度（Ｅｘ ３８０ｎｍ、Ｅｍ ４６０ｎｍ）を測定した。なお、プラスミンのみ、プラスミン＋メグシン、プラスミン＋モノクローナル抗体ＭＳ１８ａ、およびプラスミン＋メグシン＋モノクローナル抗体ＭＳ１８ａの蛍光強度から基質溶液のみ（ブランク）の蛍光強度を引いたものを、それぞれＦＰ、ＦＰＭｅｇ、ＦＰ１８、およびＦＰＭｅｇ１８とし、実施例２と同様にして中和活性を求めた（図４）。
表１および図４からＭ１０７およびＭ１１２との反応では中和活性が低下した。これは抗体がメグシンと反応せず、ペプチドと反応したことを示している。Ｍ１０７およびＭ１１２に共通するエピトープはＮＩＶＥＫＱ（配列番号：４）である。そこで、ペプチドＮＩＶＥＫＱ（配列番号：４）についてＭ１０７、Ｍ１０８、Ｍ１１１およびＭ１１２と同様に操作したところ、中和活性は低下した。故に本発明のモノクローナル抗体ＭＳ１８ａが認識するエピトープはＮＩＶＥＫＱ（配列番号：４）であることが判った。
〔実施例４〕モノクローナル抗体ＭＳ１８ａの特異性
本発明のモノクローナル抗体ＭＳ１８ａのメグシンタンパク質に対する特異性を確認するために、セルピンのひとつであるＰＡＩ−１とモノクローナル抗体ＭＳ１８ａの反応性について検討した。
０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）で０．２ｍｇ／ｍＬに調整したＰＡＩ−１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ製）を９６ウェルマイクロプレート（ＮＵＮＣ製）に２μＬ／ウェル加え、０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）で５ｍｇ／ｍＬに調整したＰＡＩ−１抗体（Ｂｉｏｐｏｏｌ製）６μＬまたは０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）で４ｍｇ／ｍＬに調整したモノクローナル抗体ＭＳ１８ａ ７μＬを混和した。室温、１時間反応後、０．２Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８）で０．１ｍｇ／ｍＬに調整したｔ−ＰＡ（Ｂｉｏｐｏｏｌ製）溶液０．９μＬを加え混和し、さらに、３７℃、３０分間反応させた。合成基質溶液（１．２５ｍＭ Ｈ−Ｄ−イソロイシル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリン二塩酸塩（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ製）２００μＬを加え、室温で反応させ、吸光度（４０５ｎｍ）にてｔ−ＰＡ酵素活性を経時的に測定した。結果を図５に示す。
ＰＡＩ−１にモノクローナル抗体ＭＳ１８ａを加えた試料は発色が認められなかった。即ち、ＰＡＩ−１抗体はＰＡＩ−１のｔ−ＰＡ活性阻害能を中和するが、モノクローナル抗体ＭＳ１８ａはＰＡＩ−１に対して中和活性を示さず、ＰＡＩ−１がｔ−ＰＡと反応したことが示された。
〔実施例５〕中和活性を持たない抗メグシンモノクローナル抗体ＭＳ４４ｂ及び４Ｆ３のエピトープマッピング
（１）以下に示す大腸菌発現断片化メグシンを作製した。
断片 ：アミノ酸配列 ４−９ ：２６７〜３２１
全 長 ： １〜３８０ ５−１０：３２２〜３８０
１−６ ： １〜１００ ２−１０：１０１〜３８０
２−７ ：１０１〜１６８ ３−１０：１６９〜３８０
３−８ ：１６９〜２６６ ４−１０：２６７〜３８０
（２）ウエスタンブロティング
（１）で作製した断片化メグシンを電気泳動し、ウエスタンブロットを行い、モノクローナル抗体ＭＳ４４ｂ及び４Ｆ３に反応するバンドを確認した。結果は表２に示した。表中、○はモノクローナル抗体が反応したバンドが観察されたことを、×は観察されなかったことを示す。

（３）プレートを用いたＥＬＩＳＡ
断片化大腸菌メグシンのデータを元にペプチドを合成し、プレート（コバリンクＮＨモジュール、ヌンク製）に固相化し、以下のようにＥＬＩＳＡを行った。
合成ペプチドをアミンカップリング法にてプレートに固相した。洗浄液で２回洗浄後、ＰＢＳで４倍希釈したブロックエースを加え、ブロッキングする。プレートに希釈した抗体１００μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で２時間反応させる。さらに洗浄液で４回洗浄後、ＴＭＢを１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で３０分反応させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果は表３に示した。

（４）競合法を用いたＥＬＩＳＡ
メグシンを９６ウエルＥＬＩＳＡ用プレートに固相する。洗浄液で２回洗浄後、ＰＢＳで４倍希釈したブロックエースを加えブロッキングする。洗浄液で４回洗浄後、抗体（１００ｎｇ／ｍＬ）とペプチド（２μｇ／ｍＬ）を混合し、各ウエルに１００μＬ／ｗｅｌｌ加え、室温で２時間反応させる。４回洗浄後、プレートに希釈した抗マウスＩｇＧ抗体１００μＬ／ｗｅｌｌを加え、室温で２時間反応させた。さらに、洗浄液で４回洗浄後、ＴＭＢを加え室温で３０分反応後、２Ｎ硫酸を加え反応を停止し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。結果は表４に示した。

（５）ｂｉａｃｏｒｅ（商標）による測定
ＣＭ５チップにアミンカップリング法にてペプチドを固相し、ｂｉａｃｏｒｅによって抗体との反応性を測定した。結果は表５に示した。

上記の結果よりモノクローナル抗体４Ｆ３は２４５−２６０、モノクローナル抗体ＭＳ４４ｂは２９１−３０５の範囲にエピトープが存在することが判った。中和活性を有する本発明のモノクローナル抗体が配列番号：４に記載のアミノ酸配列（メグシンのアミノ酸配列における３４３−３４８に相当）をエピトープとして認識するのに対して、中和活性を有しないモノクローナル抗体は、２４５−２６０あるいは２９１−３０５などの、配列番号：４以外の領域をエピトープとして認識していることが確認された。
産業上の利用の可能性
本発明により、メグシンの活性を中和するモノクローナル抗体が提供された。また本発明により、メグシンの反応性ループ領域に結合する抗体が、メグシンの活性を中和し得ることが確認された。メグシンは、糸球体において、メサンギウム基質の拡大、メサンギウム細胞の増殖、免疫複合体の沈着の原因となる分子である。これらの病変は、ヒトのメサンギウム増殖性糸球体腎炎に特徴的な病理像である。メサンギウム基質の拡大は、メサンギウム増殖性の腎炎をはじめとする多くの腎臓障害における重要な病変である。したがって、メグシンの活性を中和するモノクローナル抗体は、メサンギウム基質の拡大を伴う疾患の治療において有用である。
また本発明は、メグシンの活性を中和するモノクローナル抗体、その可変領域、あるいはその相補性決定領域を含む抗体可変領域を有効成分として含有する、メサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療および／または予防のための組成物を提供する。既に述べたように、メグシンは、メサンギウム増殖性糸球体腎炎を引き起こす。したがって、メグシンを中和する抗体は、メサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療または予防に有用である。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１は、セルピンの活性部位である反応性ループ領域の、３種類の状態における構造の違いを示す模式図。（ａ）：活性型、（ｂ）：切断された状態、（ｃ）：伏在状態を表す。
図２は、本発明のモノクローナル抗体ＭＳ１８ａによるウエスタンブロット法の結果を示す染色像の写真。
図３は、本発明のモノクローナル抗体ＭＳ１８ａによる、メグシンタンパク質のプラスミン酵素活性阻害作用に対する中和活性を示す。図中、縦軸はモノクローナル抗体によって中和された酵素活性の割合（％）を、横軸はモノクローナル抗体の種類とメグシンとの混合比を示す。
図４は、メグシンの反応性ループ領域ペプチドがモノクローナル抗体ＭＳ１８ａ中和活性に及ぼす影響を示す。図中、縦軸はモノクローナル抗体によって中和された酵素活性の割合（％）を、横軸はモノクローナル抗体の吸収に用いた合成ペプチドの種類を示す。
図５は、モノクローナル抗体ＭＳ１８ａとＰＡＩ−１の反応性を示す。（■）はｔ−ＰＡのみ、（●）はｔ−ＰＡ＋ＰＡＩ−１＋ＰＡＩ−１抗体、（▲）はｔ−ＰＡ＋ＰＡＩ−１、（◆）はｔ−ＰＡ＋ＰＡＩ−１＋モノクローナル抗体ＭＳ１８ａの吸光度の経時変化（ＯＤ）を示す。

Claims (8)

1. 配列番号：４に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドによって構成される
   エピトープを認識し、メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体。
2. 請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系。
3. FERM BP-8349として寄託されたハイブリドーマMS18a。
4. FERM BP-8349として寄託されたハイブリドーマMS18aが産生するモノクローナル抗体。
5. FERM BP-8349として寄託されたハイブリドーマMS18aを培養し、培養物に含まれるイムノグロブリンを回収する工程を含む、モノクローナル抗体の製造方法。
6. 次の（a）−（ c ）のいずれかに記載の成分の有効量を含有するメサンギウム増殖性糸球体腎炎の治療、および／または予防のための組成物。
   （ a ）配列番号：４に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドによって構成されるエピトープを認識し、メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体またはその可変領域
   （ b ）ハイブリドーマMS18a株により産生されるモノクローナル抗体またはその可変領域
   （ c ）（a）−（ b ）のいずれかに記載の可変領域を構成する相補性決定領域を含む抗体またはその可変領域
7. 次の（a）−（ c ）のいずれかに記載の成分をメグシンに接触させる（ただし、人間の体内を除く）工程を含む、メグシンの活性中和方法。
   （ a ）配列番号：４に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドによって構成されるエピトープを認識し、メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体またはその可変領域
   （ b ）ハイブリドーマMS18a株により産生されるモノクローナル抗体またはその可変領域
   （ c ）（a）−（ b ）のいずれかに記載の可変領域を構成する相補性決定領域を含む抗体またはその可変領域
8. 次の（a）−（ c ）のいずれかに記載の成分を有効成分として含有する、メグシンの活性中和剤。
   （ a ）配列番号：４に記載されたアミノ酸配列からなるペプチドによって構成されるエピトープを認識し、メグシン中和活性を有するモノクローナル抗体またはその可変領域
   （ b ）ハイブリドーマMS18a株により産生されるモノクローナル抗体またはその可変領域
   （ c ）（a）−（ b ）のいずれかに記載の可変領域を構成する相補性決定領域を含む抗体またはその可変領域

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