JPWO2009057664A1 - 抗体及びその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
ASD2 → rpASD2
ASD3 → rpASD3
MASD1 → mASD1
MASD2 → mASD2
MASD3 → mASD3
(1) アミロスフェロイドに対する反応性が、アミロイド前駆蛋白質に対する反応性よりも高く、かつ以下の何れか1以上の特徴を有する抗体。
(i)アミロスフェロイドに対する反応性が、アミロイドβ線維に対する反応性よりも高い;
(ii)アミロスフェロイドに対する反応性が、アミロイドβモノマー蛋白質に対する反応性よりも高い;
(iii)アミロスフェロイドによる神経細胞死誘導に対する阻害活性を有する。
(3) 抗体のアミロスフェロイド及びアミロイドβ線維に対する反応性を同一の抗体濃度及び抗体量並びに同一の抗原蛋白質濃度及び抗原蛋白質量を用いて比較する系において、抗体のアミロスフェロイドに対する反応性がアミロイドβ線維に対する反応性の5倍以上である、(1)又は(2)に記載の抗体。
(5) 抗体のアミロスフェロイド及びアミロイドβモノマー蛋白質に対する反応性を同一の抗体濃度及び抗体量並びに同一の抗原蛋白質濃度及び抗原蛋白質量を用いて比較する系において、抗体のアミロスフェロイドに対する反応性がアミロイドβモノマー蛋白質に対する反応性の500倍以上である、(1)から(4)の何れかに記載の抗体。
(6) アミロスフェロイドを抗原として得られる、(1)から(5)の何れかに記載の抗体。
(8) アミロスフェロイドに対する解離定数が10-9以下である、(7)に記載の抗体。
(9) ヒト正常組織への有意な交叉反応性を示すことなく、アルツハイマー病脳に特異的に反応する(1)から(8)の何れかに記載の抗体。
(10) アミロスフェロイドの立体構造特異的なエピトープを認識する(1)から(9)の何れかに記載の抗体。
(11) ハムスター由来の抗体である、(1)から(10)の何れかに記載の抗体。
(12) 受託番号FERM BP−10871またはFERM BP−10872を有するハイブリドーマにより産生される、(1)から(11)のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
3つの重鎖相補性決定領域(CDRs)がそれぞれ以下のアミノ酸配列を有し:
重鎖CDR1:Asp Tyr Phe Met Ser (配列番号11);
重鎖CDR2:Gly Ile Glu Ile Lys Ser Tyr Phe Tyr Ala Thr Tyr Tyr Phe Gly Ser Val Lys Gly (配列番号12);及び
重鎖CDR3:Asn Arg Glu Val Gly Gly Leu Asp Asn (配列番号13):
3つの軽鎖相補性決定領域(CDRs)がそれぞれ以下のアミノ酸配列を有する:
軽鎖CDR1:Thr Leu Arg Ser Gly Ile Ser Val Gly Gly Lys Asn Ile Tyr(配列番号14);
軽鎖CDR2:Tyr Ser Ser Tyr Ser Asn Lys Gln Leu Gly Pro (配列番号15);及び
軽鎖CDR3:Ser Ile His Glu Ser Asn Ala Tyr Val (配列番号16):
(13)に記載のヒト化抗体またはその断片。
および、以下のアミノ酸配列(配列番号18)を含む軽鎖可変領域:
を含む、(13)に記載のヒト化抗体またはその断片。
(17) 被験物質と(1)から(16)の何れかに記載の抗体とをアミロスフェロイドに接触させ、被験物質のアミロスフェロイドへの結合性を指標として候補物質を選択することを含む、アルツハイマー病の治療及び/又は予防薬のスクリーニング方法。
(18) アルツハイマー病の疑いのある個体から取得した生体試料を(1)から(16)の何れかに記載の抗体と接触させ、該サンプル中の該抗体と反応する物質の有無を測定することを含む、アルツハイマー病個体の検出方法。
(20) (1)から(16)の何れかに記載の抗体を含む、アルツハイマー病の検出のための試薬。
(21) (1)から(16)の何れかに記載の抗体を含む、医薬。
(22) (1)から(16)の何れかに記載の抗体を含む、アルツハイマー病の治療及び/または予防薬。
(24) (7)又は(8)に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
(25) 受託番号FERM BP−10871またはFERM BP−10872を有するハイブリドーマ。
(27) (13)から(16)のいずれかに記載のヒト化抗体または断片を発現するための発現ベクターであって、該抗体または断片をコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
(i)アミロスフェロイドに対する反応性が、アミロイドβ線維に対する反応性よりも高い;
(ii)アミロスフェロイドに対する反応性が、アミロイドβモノマー蛋白質に対する反応性よりも高い;
(iii)アミロスフェロイドによる神経細胞死誘導に対する阻害活性を有する。
本発明の抗アミロスフェロイド特異抗体は、アミロスフェロイドに対する反応性が、アミロイド前駆蛋白質に対する反応性よりも高い抗体であることを特徴とし、さらに以下の態様を示す。
本発明の抗体は、以下の性質を有するアミロスフェロイドを抗原として得ることができる。本発明においてアミロスフェロイドとは、アミロイドβ蛋白質が自己会合し、粒状の形態を有するものである。「粒状の形態」とは粒状を呈していればいかなる形状でもよく、顆粒状、細粒状、結晶、凝集塊等をすべて含む。粒径は、通常約10〜約20nm、好ましくは約10〜約15nm、より好ましくは約10〜約12nm、特に好ましくは約12nm付近である。また、アミロスフェロイドは蛋白質濃度約1μg/ml以下、好ましくは約0.45μg/ml以下で神経系細胞に細胞死を誘導する高い神経細胞死活性を有する。また、かかる物性を有するアミロスフェロイドは、グリセロール密度勾配遠心法により分画したときに、グリセロール濃度が約15%以上の画分に得られる。
上記(2)に記載のアミロスフェロイドを抗原とした抗体を取得する方法は、 アミロスフェロイドに対する反応性が、アミロイド前駆蛋白質に対する反応性よりも高く、かつ以下の何れか1以上の特徴を有する抗体が得られる方法であれば特に制限はない。具体的には、以下に詳細に記載する方法が好ましく用いられる。
(i)アミロスフェロイドに対する反応性が、アミロイドβ線維に対する反応性よりも高い;
(ii)アミロスフェロイドに対する反応性が、アミロイドβモノマー蛋白質に対する反応性よりも高い;
(iii)アミロスフェロイドによる神経細胞死誘導に対する阻害活性を有する。
1)エフェクター部分がヒトであるので、ヒト体内の免疫反応における他の因子との相互作用が良好である。例えば、補体依存性細胞障害性(CDC)または抗体依存性細胞障害性(ADCC)により、効率的に標的細胞を破壊する。
2)ヒト免疫系は、ヒト化抗体のフレームワークまたは定常領域を外来物として認識しないと考えられる。したがって本ヒト化抗体をヒト体内に投与した場合の抗原抗体反応は、非ヒト抗体またはキメラ抗体に対するものより低くなると考えられる。
3)投与された非ヒト抗体は、ヒトの循環系において、半減期がヒト抗体のそれよりも短いことが報告されている。ヒト化抗体が投与された場合は、天然のヒト抗体本質的に同一の半減期を有することが期待され、投与量および投与頻度をより少なくできると考えられる。
本発明の抗アミロスフェロイド特異抗体の抗原に対する反応性を測定するためのELISA、ドットブロッティングの具体的方法の例を以下に説明する。ELISAとして、例えば、固相ELISA、液相ELISAなどが挙げられる。また、本発明の抗アミロスフェロイド特異抗体の抗原に対する解離定数を測定してもよい。抗体の解離定数の測定は、BIACore(BIACORE社製)等の機器を用いてまたはそれに準じた方法により行うことができる。
アミロスフェロイドを被覆した固相担体を用いて、抗アミロスフェロイド特異抗体の抗原に対する反応性を測定することにより、抗アミロスフェロイド特異抗体を検出することができる。ここで固相担体としては、ポリスチレン、ポリプロピレン等のプラスチック製の球状、棒状、プレート状等の担体が挙げられるが、プラスチック製プレートが好ましい。固相担体にアミロスフェロイドを被覆させるには、常法例えば吸着法、架橋化剤を用いる方法等が挙げられるが、簡便性からアミロスフェロイドを物理的に吸着させる吸着法を用いるのが好ましい。
アミロスフェロイドと、アミロスフェロイドに対する抗体を含む検体、たとえばハイブリドーマ培養上清を、室温1時間以上混和し反応させる。あらかじめ、適当量のウサギ抗アミロスフェロイド IgGをコートし、例えば、牛血清アルブミン/PBSでブロッキングしたELISAプレートに、一定量の上記混合液を添加して室温1時間以上反応させる。その後、さらに洗浄した後に二次抗体として検体中の免疫グロブリンと反応する抗体、例えば抗マウスIgG抗体、抗マウスIgM、抗マウス免疫グロブリン、を接触させる。同様に洗浄後、プレートに結合している該二次抗体を標識化物質の活性等を指標として検出する。このような標識化物質の活性は、例えばELISAプレートリーダー等を用いて測定することができる。
N末端にビオチンが結合したアミロイドβモノマー蛋白質あるいはC末端にビオチンが結合したアミロイドβモノマー蛋白質と、抗体を含む検体、例えばハイブリドーマ培養上清を混合し室温1時間以上反応させる。この混合液をあらかじめ牛血清アルブミン/PBSでブロッキングしたストレプトアビジンELISAプレートに添加し室温30分以上反応させる。その後、洗浄した後に二次抗体として検体中の免疫グロブリンと反応する抗体、例えば抗マウスIgG抗体、抗マウスIgM、抗マウス免疫グロブリン、を接触させる。同様に洗浄後、プレートに結合している該二次抗体を標識化物質の活性等を指標として検出する。このような標識化物質の活性は、例えばELISAプレートリーダー等を用いて測定することができる。
本発明の抗アミロスフェロイド特異抗体の抗原に対する反応性を測定するためのドットブロッティングの具体的方法の例を以下に説明する。まず、Bio Rad社製等の市販のブロッター等を用いて、上記(2)で調製したアミロスフェロイドをニトロセルロース膜等に適当量ブロットする。この場合、溶媒はアミロスフェロイドを脱会合させないものであれば如何なるものでもよいが、例えばPBS(-)が好ましく用いられる。ブロッティングは、アミロスフェロイド以外にも、対照として、アミロイドβモノマー蛋白質またはその部分ペプチドや、溶媒のみについても行うことが好ましい。この膜を適当な緩衝液、例えばリン酸緩衝液(Phosphate buffered saline:PBS)等により洗浄し、スキムミルク/TTBS(Tween-Tris buffered saline)等でブロッキングした後に、上記で得られた抗体と膜を接触させ、その後、さらにTTBS等で洗浄した後に、二次抗体として免疫動物の免疫グロブリンと反応する抗体を接触させ、これも同様に洗浄した後、膜に結合している該二次抗体を標識化物質の活性等を指標として検出する。対照として、アミロイドβモノマー蛋白質に反応する抗体を用いることが好ましい。このような抗体としては、例えば、「6E10」(Senetek社製)等が上げられる。
本発明の抗アミロスフェロイド特異抗体が有する、アミロスフェロイドによる神経細胞死誘導を阻害する活性(以下、これを「神経細胞毒性中和活性」または「神経細胞死誘導阻害活性」と称することがある)の解析方法の例を以下に説明する。
アミロスフェロイドは、神経系の培養細胞に添加すると該細胞を死に至らしめることができることから、アルツハイマー病においては、同様にアミロイドβ蛋白質が自己会合したアミロスフェロイドが神経変性を誘導していると考えられている。
アミロスフェロイドは、神経系の培養細胞に添加すると該細胞を死に至らしめることができることから、アルツハイマー病においては、同様にアミロイドβモノマー蛋白質が自己会合したアミロスフェロイドが神経変性を誘導していると考えられている。本発明の抗アミロスフェロイド特異抗体は、このアミロスフェロイドに対する高い反応性を有するので、該抗体を用いて生体試料中にアミロスフェロイドを検出することによりアルツハイマー病個体の検出を行うことができる。
(1)アミロイドβ40(配列番号1)樹脂の製造
Fmoc-Val樹脂342mg(アミン含量0.73mmol/g樹脂)をパーキンエルマーアプライドバイオシステムズ社製A433型自動ペプチド合成機にセットし、これにFmoc-Val-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Met-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Ile-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Asn(Trt)-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Leu-OH,Fmoc-Lys(Boc)-OH,Fmoc-Gln(Trt)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Val-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Tyr(tBu)-OH,Fmoc-Gly-OH,Fmoc-Ser(tBu)-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OH,Fmoc-His(Trt)-OH,Fmoc-Arg(Pmc)-OH,Fmoc-Phe-OH,Fmoc-Glu(OtBu)-OH,Fmoc-Ala-OH,Fmoc-Asp(OtBu)-OHを供給し、HBTU[2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate]を縮合剤として順次縮合させて側鎖保護アミロイドβ40樹脂1.515gを得た。
上記(1)で得た側鎖保護アミロイドβ40樹脂中の304mgを採取し、これにフェノール0.75mlとチオアニソール0.5mlとトリフルオロ酢酸8.25mlとエタンジチオール0.25mlと蒸留水0.5mlを加え、氷冷下5分、続いて室温で1.5時間反応させた。反応終了後、氷冷したジエチルエーテル200mlを加えてペプチドを沈殿させた。全内容物をグラスフィルターで濾取し、冷ジエチルエーテルで洗浄した後、35%のアセトニトリルを含む0.1%トリフルオロ酢酸(約200ml)で抽出処理してH-Asp-Ala-Glu-Phe-Arg-His-Asp-Ser-Gly-Tyr-Glu-Val-His-His-Gln-Lys-Leu-Val-Phe-Phe-Ala-Glu-Asp-Val-Gly-Ser-Asn-Lys-Gly-Ala-Ile-Ile-Gly-Leu-Met-Val-Gly-Gly-Val-Val-OHで表される粗ペプチド191mgを得た。
この粗ペプチドを35%のアセトニトリルを含む0.1%トリフルオロ酢酸(40ml)に溶解しODS(オクタデシルシラン)をシリカに結合した逆相系のカラム(内径2cm、長さ25cm)を用いたHPLCにより精製した。溶出は0.1%トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル濃度を22%から42%へ直線的に20分間で上昇させることにより行った。精製物の収量は35mgであった。本物質の構造はMALDI-TOF質量分析により確認された。測定値[M+H]+4330.99に対して、計算値は(C194H295N53O58S1+H)4330.89であった。なお、アミロイドβ42については、上記の方法に準じて合成・生成を行ったものと、Bachem社より購入したものの双方を以降の実験に供した。
上記(3)で精製を行った10nmolのアミロイドβ40を1.5ml容量のエッペンドルフチューブに入れ、これに500μlの超純水と500μlのダルベッコリン酸緩衝液(-)(ニッスイ社製;以下、PBS(−)と称する)を順次加え、アミロイドβ蛋白質を完全に溶解させた。このアミロイドβ蛋白質水溶液の入ったエッペンドルフチューブをダックローター(TAITEC社製、ローター:RT50)に取り付け、37℃において35rpmの速度で7日間回転させ、アミロスフェロイド40を調製した。アミロイドβ42(上記(3)で精製を行ったものまたはBachem社製)についても、上記の方法に準じ、約10時間回転させ、アミロスフェロイド42を調製した。
PBS中で調製したアミロスフェロイド42と等量の完全フロイントアジュバント(WAKO社製)を混合して乳化し、アルメニアハムスター背部皮下に、0.2 mlを免疫した(16 μg/0.2 ml/hamster)。2週間おきに不完全フロイントアジュバント(Sigma-Aldrich社製)で乳化したアミロスフェロイドを同様に免疫した。5回免疫後に頚動脈から採血して血漿を調製した。1%牛血清アルブミン(BSA, fraction V;Sigma-Aldrich社製)溶液(PBS(-)中)で血漿を連続希釈し、下記のアミロスフェロイド固相ELISA法アミロスフェロイドに対する反応性を測定した。
(1)アミロスフェロイド固相ELISA法 (アミロスフェロイドとの反応性の確認)
96穴ELISAプレート(Nunc社製マキシソープ)に1/2濃度PBS(-)中で1 μg/mlに希釈したアミロスフェロイド42を 50μl添加し、4℃一晩コートした。1%牛血清アルブミン(BSA, fraction V;Sigma-Aldrich社製)溶液(PBS(-)中)を室温1時間以上添加して、非特異的結合部位をブロックしたのち、水でプレートを洗浄した。1%牛血清アルブミン溶液(PBS(-)中)で希釈した抗血清あるいはハイブリドーマ培養上清50 μlを添加して室温1時間以上反応させた。プレートを0.05% Tween20を含む生理食塩液で5回洗浄したのち同様に1 μg/mlに希釈したペルオキシダーゼ標識2次抗体[抗ハムスターIgG抗体(ROCKLAND社製)]を添加して室温1時間反応させた。5回洗浄後、基質溶液を添加して一定時間発色させ、プレートリーダーにて吸光度を測定した。
ブロッター(BioRad社製)を用い、溶媒である1,1,1,3,3,3,−hexafluoro−2−propanol(Sigma−Aldrich社製)に溶かしたアミロイドβ40または42モノマー蛋白質と実施例1で調製したアミロスフェロイド40、または42含有液と、アミロイドβ40から調製したAβ線維および市販のアミロイド前駆蛋白質sAPPα(シグマ社製)をそれぞれ5ngずつニトロセルロース膜(Schleicher&Schuell,0.2μ)にブロットし、この膜をPBS(−)にて洗浄後、ブロッターよりはずした。
BIACore3000(BIAcore社製)のCM5センサーチップに、50 mM酢酸緩衝液中で10μg/ml アミロスフェロイド(42ASPD)、アミロイドβモノマー(42Aβ、40Aβ)、40Aβから調製したAβ線維(fibril)をカップリングした。10 mM HEPES, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Surfactant P20中で、最高濃度100 nMから連続2倍希釈した抗体溶液を用いて、結合速定数及び解離速度定数を求めた。これら定数より次式により解離定数を計算した。
解離定数 = 解離速度定数/結合速度定数
ハムスターモノクローナル抗アミロスフェロイド特異抗体はマウスモノクローナル抗アミロスフェロイド抗体同様、ASPDに対して強い親和性(Kd 10-11〜10-9M)を有し、かつアミロイドβモノマーや線維に対するよりも(1オーダーから2オーダー)高い選択性を示した。
(1)抗アミロスフェロイド抗体の抗原決定部位(エピトープ)
抗アミロスフェロイド抗体のエピトープを決定する目的で、アミロイドβモノマー蛋白質の部分配列をN端より5残基ずつ順次化学合成することで、38通りのアミロイドβ5残基部分配列ペプチド(今後、本実施例の中でAβと略し、N端側からAβ1-5, Aβ2-6, Aβ3-7,・・・・Aβ38-42と呼ぶことにする。)を得た。AβはHPLCによって単一ピークになるまで精製した後、一定量ごとに凍結乾燥を行い、使用直前まで-20℃にて保存した。
(1)モノクローナル抗アミロスフェロイド抗体によるアミロスフェロイド毒性の中和
実施例2で得た各モノクローナル抗アミロスフェロイド抗体を用いて、アミロスフェロイド毒性の中和活性を評価した。評価方法としては、ラット海馬初代培養神経細胞を用いて行った。海馬の初代培養は基本的にWO2006/016644の実施例5に記載された前脳基底野の場合と同様に調製を行ったが、培養密度は1.0 x 105cells/cm2に播種した。アミロスフェロイドは、実施例1に記載した方法に従い調製したアミロスフェロイド42を用いた。なお、実験条件は以下の通りである。
アミロスフェロイド42の濃度:1.25μM
アミロスフェロイド暴露時間:45時間
細胞:ラット海馬ニューロン
PI染色にて検出
(1)Western blot
アルツハイマー病のモデル動物であり、ヒト型APP(hAPP)を脳に過剰発現するTg2576マウス(Science 1996 Oct 4; 274 (5284):99-102)の脳抽出物をサンプルとしてwestern blotを行い、ASPD抗体および6E10の反応性を調べた。具体的には、Tg2576マウス(15ヶ月齢)の大脳皮質および海馬のTBS(Tris buffered saline)可溶性画分をNuPAGE LDS Sample bufferで処理し、約50μgのサンプルをNuPAGE Novex Bis-Tris Gel (4-12%)にアプライし、電気泳動(200V)を行った。その後、ニトロセルロース膜に転写(30V, 60分間)し、転写された膜を、5%スキンミルクを含むTTBS(0.05% Tween 20を含むTBS)でブロッキングした(室温、2時間)。次に、同溶液で希釈した各抗体(1μg/ml)と反応(4℃、一晩)し、洗浄後、HRP-標識2次抗体で検出した(SuperFemto)。
ASPDを固相化したELISAプレートにおいて、各ASPD抗体および6E10による競合ELISAを行った。予め別プレートで、ASPDまたはsAPPα(Sigma)と各抗体を反応させ(室温、1時間)、これを、ASPD固相化プレート(1% BSAでブロッキング済み)に添加した。次に、室温で1時間反応し、洗浄後、HRP標識2次抗体で検出を行った。
抗体の正常ヒト組織に対する反応性を評価した。
マウス抗体を用いた免疫染色では、ヒト組織凍結切片をアセトン固定し、DAKO社Envisionキット中のPeroxidase blocking溶液と5分間反応させた。0.5%カゼイン、1%ウシ血清アルブミン、1.5%正常ヤギ血清、2%正常ヒト免疫グロブリン、1 mg/mL熱変性ヒト免疫グロブリンを含む蛋白質ブロッキング溶液と20分間反応させた後、1%ウシ血清アルブミンを含むPBS中で2あるいは10 mg/mLの濃度に希釈した抗体を添加して、室温1時間反応させた。DAKO社Envisionキット中のPeroxidase labeled polymerを30分間反応させた後に、DAKO社Envisionキット中のDAB溶液を添加して8分間反応させた。以上のすべてのステップの終了後は、次のステップに移る前にPBSで標本を洗浄した。免疫染色終了後、標本を水道水で洗浄し、ヘマトキシリンでカウンター染色した。
ASPDないしは線維状のβアミロイド会合体を生理的溶媒環境において、10μg/mlのハムスター抗体haASD1と反応させた。反応は1.5 mlチューブあるいは、カーボン蒸着をしたフォルムバールグリッド上で直接行った。その後、6 nmの金コロイドが結合した二次抗体とさらに反応させ、酢酸ウランによってネガティブ染色を行い、電子顕微鏡観察を行った。
図9に示したとおり、ハムスター抗体は線維状の会合体には反応せず、アミロスフェロイドに結合した。
10名のアルツハイマー病である個体(年齢80.4±9.2歳、脳重量964±82 g、罹患期間10.1±5.5年)由来と、7名の対照健常個体(年齢71.3±15.2歳、脳重量1226±96 g)由来の、optiumum cutting temperature compoundに埋め込んだ冷凍脳の凍結切片又はパラフィンに埋め込んだホルマリン固定脳の10μm厚の切片を用い、定法に従って免疫組織化学分析を行った。アミロスフェロイドを認識する抗体として、マウスモノクローナル抗体mASD3、ハムスターモノクローナル抗体haASD1、ウサギポリクローナル抗体rpASD2を用いた。また抗アミロイドβ抗体として、アミロイドβ蛋白質(Aβ1-42)のC末端を認識する市販の抗アミロイドβ抗体「IBL18582」(IBL社製)及びAβ8-17を認識する市販の抗アミロイドβモノクローナル抗体「6F/3D」を用いた(DAKO社製)。
(1) ヒト化抗体取得
実施例2にて得られた、ハムスターモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマhaASD2から、QIAGEN製RNeasy mini kit (Cat.No. 74106) を用いてRNAを取得した。このRNAを鋳型にして、GE Life Sciences製1st strand cDNA synthesis kit (Cat.No. 27-9261-01) を用いてcDNAを合成した。軽鎖可変領域は、プライマーhaVK1とhaCK およびFinnzymes製Phusion High-Fidelity PCR Master Mix (Cat.No. F-531S)を用いてcDNAを増幅しInvitrogen製Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit (Cat.No. 450245)のpCR-Blunt II-TOPOベクターに連結した。重鎖可変領域は、プライマーhaVHf とMHCG3 およびClontech製AdvantageR-HF 2 PCR Kit (Cat.No. 639123)を用いてcDNAを増幅しInvitrogen製TOPO-TA cloning kit (Cat.No. 450641)のpCR2.1-TOPOベクターに連結した。これらを大腸菌コンピテントセルInvitrogen製TOP10 (Cat.No. 404003)に導入後、目的の大きさの挿入DNA (VH:約730bp、VL:約850 bp)をもつクローンについてGATC Biotech社に委託して塩基配列解析し、DNA配列を決定した。
配列表の配列番号6及び7、並びに図11に、ヒト化抗体huASD2の軽鎖可変領域のDNAおよびアミノ酸配列を示す。図11中にCDR1,2,3それぞれの位置を示した。
ヒト化抗体RHB/RLBもヒト化抗体huASD2と同様に、重鎖および軽鎖それぞれを発現するプラスミドを作成し、それらを動物細胞にコトランスフェクトして発現させることにより得ることができる。
配列表の配列番号9および図13に、ヒト化抗体RHB/RLBの軽鎖可変領域のアミノ酸配列を示す。図13中にCDR1,2,3それぞれの位置を示した。
ヒト化抗体huASD2、RHB/RLBおよびRHC/RLCの重鎖可変領域および軽鎖可変領域アミノ酸配列を比較した図が図15である。図中、ヒト化抗体huASD2の重鎖可変領域配列をASD2RHA、軽鎖可変領域配列をASD2RLA、ヒト化抗体RHB/RLBの重鎖可変領域配列をASD2RHB、軽鎖可変領域配列をASD2RLB、およびヒト化抗体RHC/RLCの軽鎖可変領域配列をASD2RLCとして記した。ヒト化抗体RHC/RLCの重鎖可変領域のアミノ酸配列は、ヒト化抗体huASD2の重鎖可変領域アミノ酸配列(図15のASD2RHA)と同一であるため、図15では省略した。
(1) 解離定数測定
実施例3(3)と同様の手順で、CM5センサーチップに、42ASPD、40Aβ(Aβモノマー)および、42Aβから調製したAβ線維(42fibril)をカップリングし、ハムスター抗体haASD2、ヒト化抗体huASD2および抗Aβ抗体3D6(US20030165496A1)の上記蛋白質に対する解離定数を測定した。抗Aβ抗体3D6は、US20030165496A1に記載のマウス抗体軽鎖可変領域3d6vl.aaおよび同重鎖可変領域3d6vh.aaに対応する合成遺伝子を既存の方法で作製し、同特許の情報に基づき、既知のマウス抗体の軽鎖定常領域および重鎖定常領域にそれぞれ連結して、マウスIgG2b/κ分子として作製した。
実施例4と同様の方法を用いて、ヒト化抗体huASD2がどのAβ5残基ペプチドに結合するか調査した。その結果、ヒト化抗体huASD2はハムスター抗体haASD2と同様にアミロイドβモノマー蛋白質のN末端のペプチド(Aβ1-5)によってもっとも強く競合阻害がかかることが明らかとなった。
妊娠17日齢のラット(SD、日本チャールスリバー)より胎児を取り出し、これの脳より海馬を摘出した。海馬初代培養神経細胞はWO2006/016644の実施例5の記載と同様に調製を行った。具体的には、海馬神経細胞を神経細胞培養液(SUMILON)にて5日間培養した(37℃、5%CO2)。ASPDとしては、公知の方法に従い(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100, 6370-6375 (2003))得られたものを用い、これをDF-ASPDと称する。DF-ASPD(0.35μM)と、haASD2またはhuASD2(7.5、25および75μg/ml)を共に室温2時間インキュベーションした後、これを培養液に直接添加し、24および45時間培養した。コントロールとしては、抗体を含まないPBS(-)を用いた。その後、神経細胞死をcell death ELISA(ロシュ)およびPropidium Iodide(PI)染色により検出した。
Claims (27)
- アミロスフェロイドに対する反応性が、アミロイド前駆蛋白質に対する反応性よりも高く、かつ以下の何れか1以上の特徴を有する抗体。
(i)アミロスフェロイドに対する反応性が、アミロイドβ線維に対する反応性よりも高い;
(ii)アミロスフェロイドに対する反応性が、アミロイドβモノマー蛋白質に対する反応性よりも高い;
(iii)アミロスフェロイドによる神経細胞死誘導に対する阻害活性を有する。 - 抗体のアミロスフェロイド及びアミロイドβ線維に対する反応性を同一抗体濃度及び抗体量並びに同一の抗原蛋白質濃度及び抗原蛋白質量を用いて比較する系において、抗体のアミロスフェロイドに対する反応性がアミロイドβ線維に対する反応性の3倍以上である、請求項1に記載の抗体。
- 抗体のアミロスフェロイド及びアミロイドβ線維に対する反応性を同一の抗体濃度及び抗体量並びに同一の抗原蛋白質濃度及び抗原蛋白質量を用いて比較する系において、抗体のアミロスフェロイドに対する反応性がアミロイドβ線維に対する反応性の5倍以上である、請求項1又は2に記載の抗体。
- 抗体のアミロスフェロイド及びアミロイドβモノマー蛋白質に対する反応性を同一の抗体濃度及び抗体量並びに同一の抗原蛋白質濃度及び抗原蛋白質量を用いて比較する系において、抗体のアミロスフェロイドに対する反応性がアミロイドβモノマー蛋白質に対する反応性の50倍以上である、請求項1から3の何れかに記載の抗体。
- 抗体のアミロスフェロイド及びアミロイドβモノマー蛋白質に対する反応性を同一の抗体濃度及び抗体量並びに同一の抗原蛋白質濃度及び抗原蛋白質量を用いて比較する系において、抗体のアミロスフェロイドに対する反応性がアミロイドβモノマー蛋白質に対する反応性の500倍以上である、請求項1から4の何れかに記載の抗体。
- アミロスフェロイドを抗原として得られる、請求項1から5の何れかに記載の抗体。
- モノクローナル抗体である、請求項1から6の何れかに記載の抗体。
- アミロスフェロイドに対する解離定数が10-9以下である、請求項7に記載の抗体。
- ヒト正常組織への有意な交叉反応性を示すことなく、アルツハイマー病脳に特異的に反応する請求項1から8の何れかに記載の抗体。
- アミロスフェロイドの立体構造特異的なエピトープを認識する請求項1から9の何れかに記載の抗体。
- ハムスター由来の抗体である、請求項1から10の何れかに記載の抗体。
- 受託番号FERM BP−10871またはFERM BP−10872を有するハイブリドーマにより産生される、請求項1から11のいずれかに記載のモノクローナル抗体。
- 受託番号FERM BP−10871またはFERM BP−10872を有するハイブリドーマにより産生されるハムスターモノクローナル抗体をヒト化することにより得られるヒト化抗体。
- 受託番号FERM BP−10872を有するハイブリドーマにより産生されるハムスターモノクローナル抗体由来の3つの重鎖相補性決定領域(CDRs)およびヒト免疫グロブリン重鎖由来の重鎖可変領域フレームワーク配列を含むヒト化重鎖;並びに受託番号FERM BP−10872を有するハイブリドーマにより産生されるハムスターモノクローナル抗体由来の3つの軽鎖相補性決定領域(CDRs)およびヒト免疫グロブリン軽鎖由来の軽鎖可変領域フレームワーク配列を含むヒト化軽鎖を含み、
3つの重鎖相補性決定領域(CDRs)がそれぞれ以下のアミノ酸配列を有し:
重鎖CDR1:Asp Tyr Phe Met Ser (配列番号11);
重鎖CDR2:Gly Ile Glu Ile Lys Ser Tyr Phe Tyr Ala Thr Tyr Tyr Phe Gly Ser Val Lys Gly (配列番号12);及び
重鎖CDR3:Asn Arg Glu Val Gly Gly Leu Asp Asn (配列番号13):
3つの軽鎖相補性決定領域(CDRs)がそれぞれ以下のアミノ酸配列を有する:
軽鎖CDR1:Thr Leu Arg Ser Gly Ile Ser Val Gly Gly Lys Asn Ile Tyr(配列番号14);
軽鎖CDR2:Tyr Ser Ser Tyr Ser Asn Lys Gln Leu Gly Pro (配列番号15);及び
軽鎖CDR3:Ser Ile His Glu Ser Asn Ala Tyr Val (配列番号16):
請求項13に記載のヒト化抗体またはその断片。 - 以下のアミノ酸配列(配列番号17)を含むヒト化重鎖可変領域:
および、以下のアミノ酸配列(配列番号18)を含む軽鎖可変領域:
を含む、請求項13に記載のヒト化抗体またはその断片。 - 配列番号5に記載のアミノ酸配列の重鎖可変領域及び、配列番号7に記載のアミノ酸配列の軽鎖可変領域を有する、請求項15に記載のヒト化抗体またはその断片。
- 被験物質と請求項1から16の何れかに記載の抗体とをアミロスフェロイドに接触させ、被験物質のアミロスフェロイドへの結合性を指標として候補物質を選択することを含む、アルツハイマー病の治療及び/又は予防薬のスクリーニング方法。
- アルツハイマー病の疑いのある個体から取得した生体試料を請求項1から16の何れかに記載の抗体と接触させ、該サンプル中の該抗体と反応する物質の有無を測定することを含む、アルツハイマー病個体の検出方法。
- 請求項1から16の何れかに記載の抗体を含む、神経細胞保護剤。
- 請求項1から16の何れかに記載の抗体を含む、アルツハイマー病の検出のための試薬。
- 請求項1から16の何れかに記載の抗体を含む、医薬。
- 請求項1から16の何れかに記載の抗体を含む、アルツハイマー病の治療及び/または予防薬。
- アミロスフェロイドを被覆してなることを特徴とする、請求項1から16の何れかに記載の抗体を検出するための固相担体。
- 請求項7又は8に記載の抗体を産生するハイブリドーマ。
- 受託番号FERM BP−10871またはFERM BP−10872を有するハイブリドーマ。
- 請求項13から16のいずれかに記載のヒト化抗体の重鎖あるいは軽鎖をコードする配列またはその断片を含む核酸。
- 請求項13から16のいずれかに記載のヒト化抗体または断片を発現するための発現ベクターであって、該抗体または断片をコードするヌクレオチド配列を含むベクター。
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