ES2437875T3 - Anticuerpos humanizados que reconocen el péptido beta-amiloide - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo humanizado ß-amiloide (Aß) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprendeuna región variable de cadena ligera humanizada que tiene la secuencia de SEC ID N.º 7, en la queXaa en posición 1 es Asp o Tyr; Xaa en posición 7 es Ser o Thr; Xaa en posición 10 es Ser o Thr; Xaa en posición 15 es Leu, Ile, o Val; Xaa en posición 50 es Arg o Lys; Xaa en posición 88 es Val o Leu; y Xaa en posición 109 es Val o Leu; y una región variable pesada humanizada que tiene la secuencia de SEC ID N.º: 8, en la queXaa en posición 3 es Gln, Lys, o Arg; Xaa en posición 78 es Ser o Thr; Xaa en posición 87 es Arg o Lys; Xaa en posición 88 es Ala, Ser, o Thr; y Xaa en posición 114 es Leu, Thr, Ile, o Val en el que el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígenodel mismo incrementa los niveles de Aß plasmáticos.

Description

Anticuerpos humanizados que reconocen el péptido beta–amiloide

La presente solicitud reivindica la prioridad del documento US 60/287.539 presentado el 30 de abril de 2001.

La invención se refiere a anticuerpos humanizados útiles para tratar y prevenir enfermedades humanas asociadas con el β–amiloide (Aβ), tales como la enfermedad de Alzheimer, el síndrome de Down y la angiopatía amiloide cerebral. El anticuerpo monoclonal de ratón 3D6 ha sido ampliamente usado en procedimientos analíticos. Tras administrar el 3D6 a un grupo de ratones PDAPP transgénicos heterocigóticos de 11,5–12 meses de edad (APPV717F) a una dosis intraperitoneal semanal de aproximadamente 10 mg/kg durante seis meses, se publicó que los ratones habían reducido significativamente la carga de la placa, aunque no se reveló la ubicación específica de la reducción. [Bard, F. y cols., Nature Med. 6: 916–919 (2000); documentos WO 00/72876 y WO 00/72880, 7 de diciembre de 2000]. Se afirmó que el anticuerpo accedió al sistema nervioso central en suficientes cantidades como para “empapelar” las placas de β–amiloide. Finalmente, se afirmó que el 3D6 de ratón induce a la fagocitosis de la placa de amiloide en estudios in vitro.

En la publicación PCT W099/27944, publicada el 10 de junio de 1999, se describen procedimientos para administrar agregado de Aβ1–42 para provocar una respuesta inmunológica y reducir los depósitos de amiloide. La descripción postula que el péptido Aβ agregado de longitud completa sería un inmunógeno útil. La solicitud también indica que se podrían usar los anticuerpos que se unen al péptido Aβ como agentes terapéuticos alternativos. Sin embargo, esto parece ser una especulación, pues los datos que lo respaldan reflejan protocolos que implican inmunización activa usando, por ejemplo, Aβ1–42.

El documento WO 99/60024, publicado el 25 de noviembre de 1999, se refiere a procedimientos para la eliminación de amiloides mediante el uso de anticuerpos anti–amiloides. Sin embargo, se establece que el mecanismo utiliza la capacidad de los anticuerpos anti–Aβ para unirse a depósitos de amiloide pre–formados (es decir, placas) y da como resultado el posterior aclaramiento microglial de las placas localizadas. Este mecanismo no se probó in vivo. Esta publicación establece además que para que sean eficaces frente a las placas de Aβ, los anticuerpos anti–Aβ deben administrarse directamente en el cerebro, porque los anticuerpos no pueden atravesar la barrera hematoencefálica.

Queen y cols. describen procedimientos para humanizar anticuerpos [p. ej., las patentes estadounidenses N.ºs 5.585.089; 5.693.761; 5.693.762; 6.180.370].

Las formas humanizadas de 3D6 son necesarias para su uso en seres humanos que padecen el síndrome de Down

o la enfermedad de Alzheimer pre–clínica o clínica, o la angiopatía amiloide cerebral (AAC). Sin embargo, no se sabe si es posible humanizar los 3D6, tal que el anticuerpo humanizado conserve las propiedades de unión del anticuerpo de ratón.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona formas humanizadas de 3D6. Estos anticuerpos humanizados tienen propiedades de unión (afinidad y localización de epítopos) que son aproximadamente las mismas que las del anticuerpo 3D6 de ratón. La invención incluye anticuerpos, anticuerpos monocatenarios y fragmentos de los mismos. La invención incluye anticuerpos en los que las CDR son las del anticuerpo monoclonal de ratón 3D6 (secuencias de SEC ID N.º 1 a SEC ID N.º 6) y en los que los anticuerpos conservan aproximadamente las propiedades de unión del anticuerpo de ratón y tienen propiedades in vitro e in vivo funcionalmente equivalentes a las del anticuerpo de ratón. En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos, en los que las regiones variables tienen secuencias que comprenden la CDR del anticuerpo de ratón 3D6 y secuencias marco humanas específicas (secuencias de SEC IDN.º 7–SEC ID N.º 10), en los que los anticuerpos conservan aproximadamente las propiedades de unión del anticuerpo de ratón y tienen propiedades in vitro e in vivo funcionalmente equivalentes a las del anticuerpo de ratón 3D6. En otro aspecto, la presente invención proporciona anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos, en los que la cadena ligera es la SEC ID N.º 11 y la cadena pesada es la SEC ID N.º 12.

También forman parte de la invención las secuencias de polinucleótidos que codifican los anticuerpos humanizados

o los fragmentos de los mismos revelados anteriormente, vectores que comprenden las secuencias de polinucleótidos codificantes de los anticuerpos humanizados o los fragmentos de los mismos, células huésped transformadas con los vectores o que incorporan los polinucleótidos que expresan los anticuerpos humanizados o fragmentos de los mismos, formulaciones farmacéuticas de los anticuerpos humanizados y de los fragmentos de los mismos revelados en la presente memoria y procedimientos para elaborar y usar las mismas.

Tales anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos son útiles para, entre otras cosas, tratar y evitar enfermedades y afecciones caracterizadas por las placas de Aβ o la toxicidad del Aβ en el cerebro, tales como la enfermedad de Alzheimer, el síndrome de Down y la angiopatía amiloide cerebral en seres humanos.

La invención también incluye el uso de un anticuerpo humanizado de la presente invención para la fabricación de un medicamento, incluyendo la expresión prolongada de las secuencias recombinantes del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo en tejidos humanos, para tratar, evitar o invertir la enfermedad de Alzheimer, el síndrome de Down o la angiopatía amiloide cerebral, o para inhibir la formación de placas de amiloide o los efectos de las especies de Aβ solubles tóxicas en seres humanos.

De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención se proporciona un anticuerpo humanizado β–amiloide 5 (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, comprendiendo una región variable de cadena ligera humanizada que tiene la secuencia de SEC ID N.º 7, en la que Xaa en posición 1 es Asp o Tyr; Xaa en posición 7 es Ser o Thr; Xaa en posición 10 es Ser o Thr; 10 Xaa en posición 15 es Leu, Ile, o Val; Xaa en posición 50 es Arg o Lys; Xaa en posición 88 es Val o Leu; y Xaa en posición 109 es Val o Leu; y una región variable pesada humanizada que tiene la secuencia de SEC ID N.º: 8, en la que 15 Xaa en posición 3 es Gln, Lys, o Arg; Xaa en posición 78 es Ser o Thr; Xaa en posición 87 es Arg o Lys; Xaa en posición 88 es Ala, Ser, o Thr; y Xaa en posición 114 es Leu, Thr, Ile, o Val en el que el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno

20 del mismo incrementa los niveles de Aβ plasmáticos. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención se proporciona un fragmento de unión a antígeno obtenible por escisión enzimática del anticuerpo humanizado en la presente invención.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona un fragmento Fab o F(ab’)2 del anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2. 25 Preferentemente, el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la

presente invención es un anticuerpo monocatenario. Preferentemente, el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la presente invención es un isotipo de inmunoglobulina IgG1.

Más preferentemente, el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno de acuerdo con la presente 30 invención se producir en una células huésped seleccionada de una célula de mieloma, una célula ovárica de

hámster chino, una célula ovárica de hámster sirio y una célula de riñón embrionaria humana. De acuerdo con un cuarto aspecto de la presente invención, se proporciona un compuesto polinucleotídico, que comprende una secuencia codificante para la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo humanizado de acuerdo con la presente invención o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

35 De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un compuesto polinucleotídico, que cuando

se expresa en una célula huésped adecuada, proporciona un anticuerpo de la presente invención. Preferentemente, el polinucleótido está seleccionado de SEC ID N.º 15, SEC ID N.º 17 y es un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para la región variable de la cadena ligera dada por SEC ID N.º 7, SEC ID N.º 9, o SEC ID N.º 11.

40 Preferentemente, el polinucleótido está seleccionado de SEC ID N.º 16, SEC ID N.º 18 y es un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para la región variable de la cadena pesada dada por SEC ID N.º 8, SEC ID N.º 10, o SEC ID N.º 12.

De acuerdo con aún otro aspecto de la presente invención, se proporciona un vector de expresión para expresar el anticuerpo de la presente invención que comprende la secuencia polinucleotídica de la presente invención. 45 De acuerdo con un séptimo aspecto de la presente invención se proporciona una célula transfectada con el vector

de expresión de la presente invención.

Preferentemente, la célula está transfectada con dos vectores de expresión de la presente invención, en los que un primer vector comprende la secuencia polinucleotídica que codifica para la cadena ligera y un segundo vector comprende la secuencia que codifica para la cadena pesada.

La célula es preferentemente capaz de expresar el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno de la presente invención y está seleccionada de una célula de mieloma, una célula ovárica de hámster chino, una célula ovárica de hámster sirio y una célula de riñón embrionaria humana.

De acuerdo con un octavo aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno de la presente invención y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un anticuerpo humanizado anti-β–amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención para usar en terapia.

Preferentemente, el anticuerpo humanizado anti-β–amiloide (Aβ) o el fragmento de unión a antígeno es para usar en el tratamiento de síndrome de Down, enfermedad de Alzheimer clínica o preclínica, o angiopatía amiloide cerebral clínica o preclínica en un sujeto humano, la inhibición de la formación de placa de Aβ en el cerebro de un sujeto humano, la reducción de placa de Aβ en el cerebro de un sujeto humano.

El sujeto puede estar o puede no estar diagnosticado con enfermedad de Alzheimer clínica o preclínica, síndrome de Down, o angiopatía amiloide cerebral clínica o preclínica.

Preferentemente, el anticuerpo humanizado anti-β–amiloide (Aβ) o el fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la presente invención incrementan el Aβ soluble en el plasma en el que la enfermedad está asociada con β–amiloide.

Descripción detallada de la invención

Los inventores de la presente invención han descubierto que, sorprendentemente, los anticuerpos humanizados, en los que las CDR surgen del anticuerpo monoclonal de ratón 3D6 y las partes marco y otras partes de los anticuerpos surgen de una línea germinal humana, se unen a Aβ–40 y a Aβ1–42 al menos con la afinidad con la que el 3D6 de ratón se une al Aβ. De este modo, tienen bases razonables para creer que los anticuerpos humanizados de esta especificidad, modificados para reducir su inmunogenicidad mediante su conversión en una forma humanizada, ofrecen la oportunidad de tratar, tanto profiláctica como terapéuticamente, afecciones en seres humanos que están asociadas con la formación de placas de beta–amiloide. Estas afecciones incluyen, como se indica anteriormente, la enfermedad de Alzheimer pre–clínica y clínica, el síndrome de Down y la angiopatía amiloide cerebral pre–clínica y clínica.

Como se usa en la presente memoria, la palabra “tratar” incluye el tratamiento terapéutico, con el conocimiento de que la afección que se va a tratar ya está presente y la profilaxis -es decir, la prevención, o la mejoría, de la posible aparición en el futuro de una afección.

Por “anticuerpo” se quiere significar un anticuerpo monoclonal per se, o un fragmento inmunológicamente eficaz del mismo, tal como un fragmento Fab, Fab’ o F(ab’)2 del mismo. En algunos contextos, en la presente memoria, el término “fragmentos” se mencionará específicamente para enfatizar; no obstante, se entenderá que independientemente de si se especifican fragmentos o no, el término “anticuerpo” incluye tales fragmentos, así como las formas monocatenarias. Siempre y cuando la proteína conserve la capacidad para unirse específicamente a su diana deseada, esta está incluida en el término “anticuerpo”. También se incluyen en la definición de “anticuerpo” las formas monocatenarias. Preferiblemente, pero no necesariamente, los anticuerpos útiles en la invención se producen recombinantemente. Los anticuerpos pueden estar o no glucosilados, aunque se prefieren los anticuerpos glucosilados. Los anticuerpos están reticulados adecuadamente mediante enlaces tipo disulfuro, como es bien conocido.

Es conocido que la unidad estructural básica del anticuerpo comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto por dos pares idénticos de cadenas polipeptídicas, teniendo cada par una cadena “ligera” (de aproximadamente 25 kDa) y una cadena “pesada” (de aproximadamente 50–70 kDa). La parte amino–terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos fundamentalmente responsables del reconocimiento antigénico. La parte carboxi–terminal de cada cadena define una región constante fundamentalmente responsable de la función efectora.

Las cadenas ligeras se clasifican en kappa y lambda. Las cadenas pesadas se clasifican en gamma, mu, alfa o épsilon y definen el isótopo del anticuerpo como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro de las cadenas pesadas y ligeras, las regiones variables y constantes están unidas por una región “J” de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo además la cadena pesada una región “D” de aproximadamente 3 o más aminoácidos.

Las regiones variables de cada par de cadenas ligera/pesada forman el sitio de unión de los anticuerpos. De este modo, un anticuerpo intacto tiene dos sitios de unión. Todas las cadenas presentan la misma estructura general de regiones marco (FR) relativamente conservadas unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR de las dos cadenas de cada par están alineadas por las regiones marco, lo que permite la unión a un epítopo específico. Desde el N terminal al C terminal, tanto las cadenas ligeras como las pesadas comprenden los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de los aminoácidos a cada dominio se hace conforme a las convenciones conocidas [Rabat, “Sequences of Proteins of Immunological Interest”, Institutos Nacionales de Sanidad, Bethesda, MD, 1987 y 1991; Chothia y cols.,

J. Mol. Biol. 196: 901–917 (1987); Chothia, y cols., Nature 342: 878–883 (1989)].

“Anticuerpo humanizado” pretende significar un anticuerpo que está compuesto parcial o completamente por secuencias de aminoácidos derivadas de una línea germinal de anticuerpos humanos mediante la modificación de la secuencia de un anticuerpo que tenga regiones determinantes de la complementariedad no humanas (CDR). Una inmunoglobulina humanizada no engloba un anticuerpo quimérico que tenga una región variable de ratón y una región constante humana. Sin embargo, la región variable del anticuerpo e incluso la CDR se humanizan mediante técnicas que son por el momento conocidas por la técnica. Se sustituyen las regiones marco de las regiones variables por las correspondientes regiones marco humanas dejando la CDR no humana sustancialmente intacta. Como se menciona anteriormente, para su uso en los procedimientos de la invención basta con emplear un fragmento inmunológicamente específico del anticuerpo, incluyendo los fragmentos que representan formas monocatenarias.

Los anticuerpos humanizados tienen al menos tres posibles ventajas frente a los anticuerpos no humanos y quiméricos para su uso en una terapia en seres humanos:

1) como la parte efectora es humana, puede interactuar mejor con el resto de las partes del sistema inmune

humano (p. ej., destruir las células diana más eficazmente mediante una citotoxicidad dependiente del

complemento (CDC) o una citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC).

2) el sistema inmune humano no debería reconocer la región marco o la región C del anticuerpo humanizado

como foránea y por tanto, la respuesta del anticuerpo frente a tal anticuerpo inyectado debería ser menor que la

producida frente a un anticuerpo no humano totalmente foráneo o un anticuerpo quimérico parcialmente foráneo.

3) se ha publicado que los anticuerpos no humanos inyectados tienen una semivida en la circulación humana mucho más corta que la semivida de los anticuerpos humanos. Los anticuerpos humanizados inyectados tendrán una semivida esencialmente idéntica a los anticuerpos humanos naturales, lo que permite la administración de dosis más bajas y menos frecuentes.

El diseño de las inmunoglobulinas humanizadas puede llevarse a cabo como se explica a continuación. Como para la región marco humana, se compara una secuencia de aminoácidos de la región marco o la región variable de una inmunoglobulina no humana que proporciona una CDR con las secuencias correspondientes de una colección de secuencias de región variable de inmunoglobulina humana y se selecciona una secuencia que tenga un porcentaje elevado de aminoácidos idénticos. Cuando un aminoácido cae en la siguiente categoría, se reemplaza el aminoácido de la región marco de una inmunoglobulina humana a ser usada (inmunoglobulina aceptora) por un aminoácido de la región marco de una inmunoglobulina no humana que proporciona una CDR (inmunoglobulina donante):

(a)

el aminoácido de la región marco humana de la inmunoglobulina aceptadora es poco habitual para la inmunoglobulina humana en esa posición, mientras que el correspondiente aminoácido en la inmunoglobulina donante es común para la inmunoglobulina humana en esa posición;

(b)

la posición del aminoácido es inmediatamente adyacente a una de las CDR; o

(c)

cualquier átomo de la cadena lateral de un aminoácido de la región marco está a aproximadamente 5–6 ángstrom (de centro a centro) de cualquier átomo de un aminoácido de la CDR en un modelo de inmunoglobulina tridimensional [Queen y cols., Proc. Natl Acad. Sci. EE.UU. 86: 10029–10033 (1989) y Co y cols., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 88,2869 (1991)]. Cuando cada aminoácido de la región marco humana de la inmunoglobulina aceptora y un aminoácido correspondiente de la inmunoglobulina donante son poco habituales para la inmunoglobulina humana en esa posición, se reemplaza tal aminoácido por un aminoácido común para la inmunoglobulina humana en esa posición.

Un anticuerpo humanizado preferido es una forma humanizada del anticuerpo de ratón 3D6. Las CDR del 3D6 humanizado tienen las siguientes secuencias de aminoácidos:

Una región variable de la cadena ligera preferida de un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene la siguiente secuencia de aminoácidos, en la que la región marco se originó del segmento de Vk DPK19 y del segmento de J Jk4 de la línea germinal humana:

en la que: el Xaa de la posición 1 es Asp o Tyr; el Xaa de la posición 7 es Ser o Thr;

5 el Xaa de la posición 10 es Ser o Thr; el Xaa de la posición 15 es Leu, IIe o Val; el Xaa de la posición 50 es Arg o Lys; el Xaa de la posición 88 es Val o Leu; y el Xaa de la posición 109 es Val o Leu.

10 Una región variable de la cadena pesada preferida de un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene la siguiente secuencia de aminoácidos, en la que la región marco se originó del segmento de VH DP–45 y del segmento de J JH4 de una línea germinal humana, con varias sustituciones de aminoácidos con respecto a los aminoácidos consenso del mismo subgrupo humano para reducir la inmunogenicidad potencial: en la que:

el Xaa de la posición 3 es Gln, Lys o Arg;

el Xaa de la posición 78 es Ser o Thr;

5 el Xaa de la posición 87 es Arg o Lys;

el Xaa de la posición 88 es Ala, Ser o Thr; y

el Xaa de la posición 114 es Leu, Thr, lle o Val.

Una región variable de la cadena ligera particularmente preferida de un anticuerpo humanizado de la presente

invención tiene la siguiente secuencia de aminoácidos, en la que la región marco se originó del segmento de Vk 10 DPK19 y del segmento de J Jk4 de la línea germinal humana:

Una región variable de la cadena pesada particularmente preferida de un anticuerpo humanizado de la presente

invención tiene la siguiente secuencia de aminoácidos, en la que la región marco se originó del segmento de VH DP–45 y del segmento de J JH4 de la línea germinal humana:

Una cadena ligera preferida para un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos:

Una cadena pesada preferida para un anticuerpo humanizado de la presente invención tiene la secuencia de aminoácidos:

Hay otras secuencias posibles para las cadenas ligeras y pesadas para el 3D6 humanizado. Las inmunoglobulinas pueden tener dos pares de complejos de cadena ligera/cadena pesada, comprendiendo al menos una de las cadenas una o más regiones determinantes de la complementariedad de ratón unidas funcionalmente a los

5 segmentos de la región marco humana.

En otro aspecto, la presente invención se refiere a polinucleótidos recombinantes codificantes de anticuerpos que, cuando se expresan, comprenden las CDR de las cadenas pesadas y ligeras procedentes de un anticuerpo de la presente invención. En la presente memoria, se ofrecen polinucleótidos ejemplares, que al ser expresados codifican las cadenas polipeptídicas que comprenden las CDR de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo monoclonal 10 3D6. Debido a la degeneración de los codones, se pueden sustituir fácilmente otras secuencias de polinucleótidos por aquellas secuencias. Los polinucleótidos particularmente preferidos de la presente invención codifican anticuerpos, que cuando se expresan, comprenden las CDR de las SEC ID N.º 1–SEC ID N.º 6, o cualquiera de las regiones variables de SEC ID N.º 7–SEC ID N.º 10, o las cadenas ligeras y pesadas de SEC ID N.º 11 y SEC ID N.º

12.

15 Los polinucleótidos incluirán además comúnmente una secuencia de polinucleótidos de control de la expresión ligada operativamente a las secuencias codificantes de inmunoglobulina humanizada, incluyendo las regiones promotoras asociadas de manera natural o heterólogas. Preferiblemente, las secuencias de control de la expresión serán sistemas promotores eucariotas de vectores capaces de transformar o transfectar células huésped eucariotas, pero también se pueden usar secuencias control para huéspedes procariotas. Una vez que se ha incorporado el

20 vector en la línea celular huésped apropiada, se propaga la célula huésped en condiciones adecuadas para la expresión de las secuencias de nucleótidos y si se desea, se puede proseguir con la recogida y la purificación de las cadenas ligeras, las cadenas pesadas, los dímeros o los anticuerpos intactos de cadena ligera/pesada, los fragmentos de unión u otras formas de inmunoglobulina.

Es posible formar las secuencias de ácidos nucleicos de la presente invención capaces de expresar en última

25 instancia los anticuerpos humanizados deseados a partir de una variedad de polinucleótidos diferentes (ADN genómico o ADNc, ARN, oligonucleótidos sintéticos, etc.) y componentes (p. ej., regiones V, J, D y C), usando cualquiera de una variedad de técnicas conocidas. La unión de secuencias genómicas y sintéticas apropiadas es un procedimiento de producción común, pero también se pueden utilizar secuencias de ADNc.

A continuación, se presenta una secuencia de ADNc (SEC ID N.º 17), a partir de la que se puede expresar la cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 19.

A continuación, se presenta una secuencia de ADNc (SEC ID N.º 18), a partir de la que se puede expresar la cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 20.

A continuación, se presenta la secuencia completa de un gen de la cadena ligera de 3D6 humanizado con intrones (localizada entre los sitios Mlul y BamHI, como en pVk–Hu3D6) (SEC ID N.º 15). El número de nucleótido indica su posición en pVk–Hu3D6. Los exones Vk y Ck están traducidos en un código de una sola letra; el punto indica el codón de terminación de la traducción. La cadena ligera madura comienza en el ácido aspártico doblemente subrayado (D). La secuencia del intrón está en cursiva. La señal de poli(A) está subrayada. La cadena ligera expresada corresponde a SEC ID N.º 11 cuando madura.

A continuación, se presenta la secuencia completa de un gen de la cadena pesada de 3D6 humanizado con intrones (localizada entre los sitios Mlul y BamHI, como en pVg1–Hu3D6) (SEC ID N.º 16). El número de nucleótido indica su posición en pVg1–Hu3D6. Los exones VH y CH están traducidos en un código de una sola letra; el punto indica el codón de terminación de la traducción. La cadena pesada madura comienza en la glutamina doblemente subrayada (Q). Las secuencias de los intrones están en cursiva. La señal de poli(A) está subrayada. La cadena pesada expresada corresponde a SEC ID N.º 12 cuando madura.

Es posible aislar las secuencias de ADN de la región constante humana según procedimientos conocidos a partir de una variedad de células humanas, pero preferiblemente, a partir de células–B inmortalizadas. Las células fuente adecuadas para las secuencias de polinucleótidos y las células huésped para la expresión y la secreción de

5 inmunoglobulinas se pueden obtener a partir de un número de fuentes conocidas en la técnica.

Además de las inmunoglobulinas humanizadas descritas específicamente en la presente memoria, se pueden diseñar y fabricar otras inmunoglobulinas modificadas “sustancialmente homólogas” utilizando diversas técnicas de ADN recombinante conocidas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las regiones marco pueden variar con respecto a las secuencias nativas en el nivel de estructura primaria mediante varias sustituciones de aminoácidos, 10 adiciones y eliminaciones terminales e intermedias y similares. Además, se puede usar una variedad de diferentes regiones marco humanas individualmente o en combinación como una base para las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención. En general, las modificaciones de los genes se pueden realizar fácilmente mediante una

diversidad de técnicas conocidas, tales como mutagénesis de sitio dirigida.

Alternativamente, se pueden producir fragmentos polipeptídicos que solamente comprendan una parte de la estructura primaria del anticuerpo; fragmentos que poseen una o más actividades de la inmunoglobulina (p. ej., actividad de fijación de complementos). Se pueden producir estos fragmentos polipeptídicos mediante la escisión proteolítica de anticuerpos intactos mediante procedimientos conocidos en la técnica, o insertando codones de terminación en las localizaciones deseadas de los vectores usando una mutagénesis de sitio dirigida, tal como detrás de CH1 para producir fragmentos Fab o detrás de la región bisagra para producir fragmentos F(ab’)2. Se pueden producir anticuerpos monocatenarios uniendo VL y VH con un engarce de ADN.

Según lo afirmado anteriormente, los polinucleótidos serán expresados en huéspedes después de que las secuencias se hayan ligado operativamente a (es decir, se hayan colocado para garantizar el funcionamiento de) una secuencia de control de la expresión. Estos vectores de expresión son comúnmente duplicables en los organismos huésped bien como episomas o bien como una parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, p. ej., tetraciclina o neomicina, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

E. coli es un huésped procariota particularmente útil para la clonación de los polinucleótidos de la presente invención. Otros huéspedes microbianos adecuados para su uso incluyen bacilos, tales como Bacillus subtilus y otras enterobacteriáceas tales como Salmonella, Serratia y diversas especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procariotas, es posible hacer también vectores de expresión, que comúnmente contendrán las secuencias de control de la expresión compatibles con la célula huésped (p. ej., un origen de replicación). Además, puede estar presente cualquiera de entre un número de promotores conocidos, tales como el sistema promotor de la lactosa, un sistema promotor del triptófano (trp), un sistema promotor de la beta–lactamasa o un sistema promotor del fago Lambda. Los promotores controlarán comúnmente la expresión, opcionalmente, con una secuencia operadora y tendrán secuencias de sitio de unión al ribosoma y similares, para iniciar y completar la transcripción y la traducción.

También se pueden usar para la expresión otros microbios tales como la levadura. Saccharomyces es un huésped preferido, con vectores adecuados que tienen secuencias de control de la expresión, tales como promotores, incluyendo la 3–fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glicolíticas y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares según lo deseado.

Además de microorganismos, también se puede usar cultivo celular de tejido de mamíferos para expresar y producir los polipéptidos de la presente invención. Las células eucariotas son las realmente preferidas, porque se ha desarrollado un número de líneas celulares huéspedes adecuadas capaces de secretar inmunoglobulinas intactas en la técnica, e incluyen las líneas celulares CHO, diversas líneas celulares COS, las líneas de células de ovario de hámster sirio, las células HeLa, preferiblemente líneas celulares de mieloma, las células B transformadas, las líneas celulares de riñón embrionario humano, o hibridomas. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de la expresión, tales como un origen de replicación, un promotor, un potenciador y los sitios de procesamiento de la información necesarios tales como los sitios de unión al ribosoma, los sitios de corte y empalme del ARN, los sitios de poliadenilación y las secuencias de terminación de la transcripción. Las secuencias de control de la expresión preferidas son promotores derivados de genes de inmunoglobulinas, SV40, adenovirus, virus del papiloma bovino, citomegalovirus y similares.

Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés (p. ej., las secuencias codificantes de las cadenas pesadas y ligeras y las secuencias de control de la expresión) se pueden transferir a la célula huésped mediante procedimientos bien conocidos, que varían en función del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro de calcio se utiliza comúnmente para las células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato de calcio o la electroporación se pueden usar para otros huéspedes celulares.

Una vez expresados, los anticuerpos se pueden purificar de acuerdo con procedimientos estándar, incluyendo precipitación en sulfato de amonio, intercambio iónico, afinidad, fase reversa, cromatografía en columna mediante interacción hidrófoba, la electroforesis en gel y similares. Se prefieren las inmunoglobulinas sustancialmente puras de una homogeneidad de al menos aproximadamente el 90 al 95 %, siendo lo más preferido una homogeneidad del 98 al 99 % o más, para usos farmacéuticos. Una vez purificados, parcialmente o hasta su homogeneidad según lo deseado, ya se pueden usar los polipéptidos terapéuticamente o profilácticamente, como se indica en la presente memoria.

Se administran los anticuerpos (incluyendo los fragmentos inmunológicamente reactivos) a un sujeto en riesgo de presentar o que presenta síntomas o una patología relacionados con el Aβ tales como la enfermedad de Alzheimer clínica o pre–clínica, el síndrome de Down o la angiopatía amiloide clínica o pre–clínica, usando técnicas de administración estándar, preferiblemente, periféricamente (es decir, no mediante una administración en el sistema nervioso central) mediante administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual o mediante supositorio. Aunque los anticuerpos se pueden administrar directamente en el sistema ventricular, el fluido espinal o el parénquima cerebral y las técnicas para acceder a estas zonas se conocen bien en la técnica, no es necesario utilizar estos procedimientos tan complejos. Los anticuerpos de la invención son eficaces cuando se administran mediante las técnicas más simples basadas en el sistema

circulatorio periférico. Las ventajas de la presente invención incluyen la capacidad del anticuerpo para ejercer sus efectos beneficiosos incluso aunque no se proporcione directamente al propio sistema nervioso central. De hecho, se ha demostrado que la cantidad de anticuerpo que atraviesa la barrera hematoencefálica es ≤ 0,1 % de los niveles en plasma.

Las composiciones farmacéuticas para administración están diseñadas para que sean apropiadas para el modo de administración seleccionado y se usan según lo apropiado excipientes farmacéuticamente aceptables tales como, tampones, tensioactivos, conservantes, agentes solubilizantes, agentes isotónicos, agentes estabilizantes y similares. “Remington's Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton PA, última edición, proporciona un compendio de técnicas de formulación conocidas por los profesionales en general.

La concentración del anticuerpo humanizado en las formulaciones puede variar de una concentración tan baja como el 0,1 % hasta una tan elevada como el 15 o el 20 % en peso y se seleccionará fundamentalmente en base a los volúmenes de fluidos, las viscosidades de fluidos y así sucesivamente, según el modo de administración particular seleccionado. De este modo, una composición farmacéutica para inyección podría ser elaborada para contener en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato de 1 a 100 mg del anticuerpo humanizado de la presente invención. La formulación podría ser filtrada en condiciones estériles tras su elaboración, o convertida en microbiológicamente aceptable de otro modo. Una composición típica para una infusión intravenosa podría tener un volumen de tanto como 250 ml de fluido, tal como la solución de Ringer estéril y 1–100 mg por ml o más de concentración de anticuerpo. Los agentes terapéuticos de la invención se pueden congelar o liofilizar para su almacenamiento y pueden reconstituirse en un vehículo estéril adecuado antes de su uso. La liofilización y la reconstitución pueden conducir a grados variables de pérdida de actividad del anticuerpo (p. ej., con globulinas inmunes convencionales, los anticuerpos IgM tienden a tener una mayor pérdida de actividad que los anticuerpos IgG). Puede que sea necesario ajustar las dosis para compensar. El pH de la formulación se seleccionará para equilibrar la estabilidad de los anticuerpos (química y física) y para la comodidad del paciente cuando se administre. Generalmente, se tolera un pH de entre 4 y 8.

Aunque los siguientes procedimientos parecen ser los más convenientes y más apropiados para la administración de proteínas tales como los anticuerpos humanizados, mediante una adaptación adecuada, se pueden emplear otras técnicas de administración, tales como la administración transdérmica y la administración oral, siempre y cuando el diseño de la formulación sea el adecuado. Además, puede ser deseable emplear formulaciones de liberación controlada usando películas y matrices biodegradables, o mini–bombas osmóticas, o sistemas de administración basados en perlas de dextrano, alginato o colágeno. En resumen, hay formulaciones disponibles para la administración de los anticuerpos de la invención y se conocen bien en la técnica y pueden elegirse entre una variedad de opciones. Es posible optimizar los niveles de dosificación más comunes usando técnicas clínicas estándar y dependerá del modo de administración y del estado del paciente.

Los siguientes ejemplos se desean para ilustrar pero no para limitar la invención. Debido a que los ejemplos de la presente memoria describen experimentos llevados a cabo en sistemas murinos, el uso de anticuerpos monoclonales murinos resulta satisfactorio. Sin embargo, en los procedimientos de tratamiento de la invención destinados al uso humano, se prefieren las formas humanizadas de los anticuerpos con la inmunoespecificidad correspondiente a la del anticuerpo 3D6.

Ejemplo 1

Síntesis del anticuerpo humanizado 3D6

Células y anticuerpos. Se obtuvo línea celular de mieloma de ratón Sp2/0 de ATCC (Manassas, VA) y se mantuvo en medio de DME que contenía SBF al 10 % (n.º de cat. SH30071.03, HyClone, Logan, UT) en una incubadora de CO2 a 37°C. Primero se cultivaron células de hibridoma de 3D6 de ratón en medio RPMI–1640 que contenía SBF al 10 % (HyClone), HEPES 10 mM, glutamina 2 mM; aminoácidos no esenciales 0,1 mM; piruvato de sodio 1 mM; y 25 μg/ml de gentamicina y luego se expandieron en medio libre de suero (SFM de hibridoma, n.º de cat. 12045–076, Life Technologies, Rockville, MD) que contenía SBF de Ig bajo al 2 % (n.º de cat. 30151.03, HyClone) hasta un volumen de 1,5 litros en frascos rotativos. Se purificó el anticuerpo monoclonal de ratón 3D6 (Mu3D6) a partir del sobrenadante del cultivo mediante cromatografía de afinidad usando una columna de sefarosa–proteína G. Se preparó Mu3D6 biotinilado usando Sulfo–NHS–LC–LC–Biotina EZ–Link (n.º de cat. 21338ZZ, Pierce, Rockford, IL).

Clonación de ADNc de la región variable. Se extrajo ARN total de aproximadamente 107 células de hibridoma usando reactivo de TRIzol (n.º de cat. 15596–026 Life Technologies) y se aisló ARN de poli(A)+ con el sistema de aislamiento de ARNm PolyATract (n.º de cat. Z5310, Promega, Madison, WI) según los protocolos del proveedor. Se sintetizó ADNc bicatenario usando el equipo de amplificación de ADNc SMARTTMRACE (n.º de cat. K1811–1, Clontech, Palo Alto, CA), siguiendo el protocolo del proveedor. Se amplificaron los ADNc de las regiones variables para las cadenas ligeras y pesadas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores 3’ que se aparearon respectivamente con las regiones constantes de la cadena kappa y gamma de ratón y un cebador universal 5’ proporcionado en el equipo de amplificación de ADNc SMARTTMRACE. Para la PCR de las VL, el cebador 3’ tiene la secuencia:

50 5'–TATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC–3' [SEC ID N.º 13]

con los residuos 17–46 en hibridación con la región Ck de ratón. Para la PCR de las VH, los cebadores 3’ tienen la secuencia:

con los residuos 17–50 en hibridación con la región CH1 de la cadena gamma de ratón. Se subclonaron los ADNc de las VL y VH en el vector pCR4Blunt–TOPO (n.º de cat. 45–0031, Invitrogen, Carlsbad, CA) para la determinación secuencial. La secuenciación del ADN se llevó a cabo mediante reacciones de secuenciación de ciclos de PCR con terminadores de cadena dideoxi fluorescentes (Applied Biosystems, Foster City, CA) según las instrucciones del fabricante. Se analizaron las reacciones de secuenciación sobre un secuenciador de ADN modelo 377 (Applied Biosystems).

Construcción de regiones variables de 3D6 humanizado (Hu3D6). La humanización de las regiones V del anticuerpo de ratón se llevó a cabo como se explica resumidamente en Queen y cols., (1989), op. cit. Se eligió el marco de la región V humana usado como aceptor para las CDR de Mu3D6 en base a la homología secuencial. Se usaron los programas informáticos ABMOD y ENCAD [Levitt, M., J. Mol. Biol. 168: 595–620 (1983)] construyendo un modelo molecular de las regiones variables. Se sustituyeron los aminoácidos en las regiones V humanizadas de los que se predijo que estaban en contacto con las CDR por los residuos correspondientes de Mu3D6. Esto se hizo en los residuos 49, 73 y 98 de la cadena pesada y en el residuo 41 de la cadena ligera. Los aminoácidos de la región V humanizada que se encontraron poco comunes en el mismo subgrupo de la región V fueron cambiados a los aminoácidos consenso eliminando una posible inmunogenicidad. Esto se hizo en los residuos 6 y 91 de la cadena pesada.

Se construyeron los genes de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas y se amplificaron usando ocho oligonucleótidos sintéticos solapantes con una longitud variable de aproximadamente 65 a 80 bases [He, X. Y. y cols., J. Immunol. 160: 029–1035 (1998)]. Se aparearon los oligonucleótidos por parejas y se prolongaron con el fragmento de Klenow de la ADN polimerasa I, produciendo cuatro fragmentos bicatenarios. Se desnaturalizaron los fragmentos resultantes, se aparearon por parejas y se prolongaron con Klenow, produciendo dos fragmentos. Se desnaturalizaron estos fragmentos, se aparearon por parejas y se prolongaron una vez más, produciendo un gen de longitud completa. Se amplificó el producto resultante mediante PCR usando el sistema de PCR de alta fidelidad Expand (n.º de cat. 1 732 650, Roche Molecular Biochemicals, Indianápolis, IN). Se purificaron sobre gel los fragmentos amplificados mediante PCR y se clonaron en el vector pCR4Blunt–TOPO. Tras la confirmación secuencial, se digirieron los genes de VL y VH con Mlul y Xbal, se purificaron sobre gel y se subclonaron respectivamente en vectores de expresión de cadenas ligeras y pesadas formando pVk–Hu3D6 y pVg1–Hu3D6 [Co,

M. S. y cols., J. Immunol. 148: 1149– 1154 (1992)]. El anticuerpo 3D6 humanizado maduro expresado a partir de estos plásmidos tiene la cadena ligera de SEC ID N.º 11 y la cadena pesada de SEC ID N.º 12.

Transfección estable. Se realizó una transfección estable a una línea celular de mieloma de ratón Sp2/0 mediante electroporación usando un aparato Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) a 360 V y 25 μF según lo descrito (Co y cols., 1992, op. cit.). Antes de transfección, se linealizaron los ADN de los plásmidos pVk–Hu3D6 y pVg1–Hu3D6 usando Fsp1 y BstZ171, respectivamente. Se transfectaron aproximadamente 107 células Sp2/0 con 20 μg de pVk– Hu3D6 y 40 μg de pVg1–Hu3D6. Se suspendieron las células transfectadas en medio de DME que contenía SBF al 10 % y se plaquearon en varias placas de 96 pocillos. Tras 48 h, se aplicó medio de selección (medio de DME que contenía FBS al 10 %, complemento de medio de HT; 0,3 mg/ml de xantina y 1 μg/ml de ácido micofenólico). Se analizaron los sobrenadantes de los cultivos en cuanto a la producción de anticuerpo mediante ELISA aproximadamente 10 días después del inicio de la selección, como se muestra a continuación. Se prolongaron los clones de producción elevada en medio de DME que contenía SBF al 10 % y se analizaron una vez más en cuanto a la expresión de anticuerpo. Entonces se adaptaron los clones seleccionados al cultivo en SFM de hibridoma.

Medición de la expresión de anticuerpo mediante ELISA. Se revistieron pocillos de una placa para ELISA de 96 pocillos (placa Nunc–Immuno, n.º de cat. 439454, NalgeNunc, Naperville, IL) con 100 μl de 1 μg/ml IgG de cabra anti–humana, Fc y fragmento específico, anticuerpos policlonales (n.º de cat. 109–005–098, Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) en tampón de bicarbonato–carbonato de sodio 0,2 M (pH 9,4) durante una noche a 4°C. Tras lavar con tampón de lavado (PBS que contenía Tween 20 al 0,1 %), se bloquearon los pocillos con 400 μl de tampón de bloqueo Superblock (n.º de cat. 37535, Pierce) durante 30 min y luego se lavaron con tampón de lavado. Se diluyeron adecuadamente las muestras que contenían Hu3D6 en tampón de ELISA (PBS que contenía ASB al 1 % y Tween 20 al 0,1 %) y se aplicaron sobre placas de ELISA (100 μl por pocillo). Como anticuerpo monoclonal IgG1 anti–CD33 humanizado estándar, se usó HuM195 (Co y cols., 1992, op. cit.). Se incubó la placa de ELISA durante 2 h a temperatura ambiente y se lavaron los pocillos con tampón de lavado. Luego se aplicaron a cada pocillo 100 μl de anticuerpos policlonales kappa anti–humanos de cabra conjugados con HRP diluidos 1/1.000 (n.º de cat. 1050–05, Southern Biotechnology, Birmingham, AL) en tampón de ELISA. Tras incubar durante 1 h a temperatura ambiente y lavar con tampón de lavado, se añadieron a cada pocillo 100 μl de sustrato de ABTS (n.º de cat. 507602 y 506502, Kirkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD). Se detuvo el desarrollo

5 del color añadiendo 100 μl de ácido oxálico al 2 % por pocillo. Se leyó la absorbancia a 415 nm usando un lector de microplacas OPTImax (Molecular Devices, Menlo Park, CA).

Purificación de Hu3D6. Se adaptó uno de los transfectantes estables de Sp2/0 que expresaban Hu3D6 (clon n.º 40) al cultivo en SFM de hibridoma y se amplió hasta 2 litros en frascos rotativos. Se cosechó el sobrenadante del cultivo agotado cuando la viabilidad de las células alcanzó el 10 % o menos y se cargó sobre una columna de sefarosa– 10 proteína A. Se lavó la columna con PBS antes de eluir el anticuerpo con clorhidrato de glicina 0,1 M (pH 2,5) y NaCl 0,1 M. Se sometió a diálisis la proteína eluida frente a 3 cambios de 2 litros de PBS y se filtró a través de un filtro de 0,2 μm antes de su almacenamiento a 4 °C. Se determinó la concentración de anticuerpo midiendo la absorbancia a 280 nm (1 mg/ml = 1,4 A280). Se realizó una electroforesis en gel de poliacrilamida–SDS en tampón de tris–glicina según los procedimientos estándar sobre un gradiente de gel del 4–20 % (n.º de cat. EC6025, Novex, San Diego,

15 CA). Se reduce el anticuerpo 3D6 humanizado purificado y se ejecuta sobre un gel de electroforesis en gel de poliacrilamida–SDS. El anticuerpo entero muestra dos bandas de pesos moleculares aproximados de 25 kDa y 50 kDa. Estos resultados coinciden con los pesos moleculares de la cadena ligera y la cadena pesada, o con el peso molecular de las cadenas que comprenden un fragmento, calculados a partir de las composiciones de sus aminoácidos.

20 Ejemplo 2

Propiedades de unión in vitro del anticuerpo 3D6 humanizado

Se comparó la eficacia de unión del anticuerpo 3D6 humanizado, sintetizado y purificado según lo descrito anteriormente, con el anticuerpo 3D6 de ratón usando anticuerpo 3D6 de ratón biotinilado en un ELISA comparativo. Se revistieron pocillos de una placa para ELISA de 96 pocillos (placa Nunc–Immuno, n.º de cat. 439454, NalgeNunc)

25 con 100 μl de péptido β–amiloide (1–42) en tampón de bicarbonato–carbonato de sodio 0,2 M (pH 9,4) (0,3 μg/ml) durante una noche a 4°C.

Tras lavar los pocillos con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía Tween 20 al 0,1 % (tampón de lavado) usando un lavador de placas de ELISA, se bloquearon los pocillos añadiendo 300 μl de reactivo SuperBIock (Pierce) por pocillo. Tras 30 minutos de bloqueo, se lavaron los pocillos con tampón de lavado y se retiró el exceso

30 de líquido.

Se añadieron por triplicado una mezcla de Mu3D6 biotinilado (0,2 μg/ml de concentración final) y anticuerpo competidor (Mu3D6 o Hu3D6; partiendo de una concentración final de 300 μg/ml y haciendo diluciones en serie por triplicado) en tampón de ELISA en un volumen final de 100 μl por pocillo. Como un control no competidor, se añadieron 100 μl de 0,2 μg/ml de Mu3D6 biotinilado. Como un control de fondo, se añadieron 100 μl de tampón de 35 ELISA. Se incubó la placa de ELISA a temperatura ambiente durante 90 min. Tras lavar los pocillos con tampón de lavado, se añadieron a cada pocillo 100 μl de 1 μg/ml de estreptavidina conjugada con HRP (n.º de cat. 21124, Pierce). Se incubó la placa a temperatura ambiente durante 30 min y se lavó con tampón de lavado. Para el desarrollo del color, se añadieron 100 μl/pocillo de sustrato de peroxidasa ABTS (Kirkegaard & Perry Laboratories). Se detuvo el desarrollo del color añadiendo 100 μl/pocillo de ácido oxálico al 2 %. Se leyó la absorbancia a 415 nm.

40 Se representaron las absorbancias frente al logaritmo de la concentración de competidor, se ajustaron las curvas hasta los puntos de datos (usando Prism) y se determinó la CI50 para cada anticuerpo usando procedimientos conocidos en la técnica.

La CI50 media para el 3D6 de ratón fue de 2,7 μg/ml (tres experimentos separados, desviación estándar = 0,6 μg/ml) y para el 3D6 humanizado fue de 3,3 μg/ml (tres experimentos separados, desviación estándar = 0,8 μg/ml). Se llevó 45 a cabo una segunda serie de tres experimentos, esencialmente según lo descrito anteriormente y se determinó que la CI50 media para el 3D6 de ratón era 3,97 μg/ml (DE = 0,15 μg/ml) y para el 3D6 humanizado, se determinó que la CI50 era 3,97 μg/ml (DE = 0,20 μg/ml). En base a estos resultados, se concluye que el 3D6 humanizado tiene propiedades de unión que son muy similares a las del anticuerpo 3D6 de ratón. Por lo tanto, se espera que el 3D6 humanizado tenga actividades in vitro e in vivo muy similares en comparación con el 3D6 de ratón y que presente en

50 seres humanos los mismos efectos demostrados en ratones con el 3D6 de ratón.

Ejemplo 3

Propiedades de unión in vitro del anticuerpo 3D6 de ratón y humanizado

Se determinó la afinidad de los anticuerpos (KD = Kd/Ka) usando un biosensor 2000 de BIAcore y se analizaron los datos con el programa informático BIAevaluation (v. 3.1). Se acopló un anticuerpo de captura (IgG de conejo anti– 55 ratón o anti–humano) por los grupos amino libres a los grupos carboxilo sobre una celda de flujo 2 de un chip biosensor (CM5) usando N–etil–N–dimetilaminopropil carbodiimida y N–hidroxisuccinimida (EDC/NHS). Se acopló una IgG de conejo inespecífica a la celda de flujo 1 como control de fondo. Se capturaron los anticuerpos

monoclonales hasta producir 300 unidades de resonancia (UR). Se hizo fluir entonces beta–amiloide 1–40 o 1–42 (Biosource International, Inc.) sobre el chip a concentraciones decrecientes (KD de 1.000 a 0,1 veces). Regenerando el chip, se eluyó anticuerpo anti–Aβ unido desde el chip usando un lavado con glicinaHCl (pH 2). Una inyección de control que no contenía nada de beta–amiloide sirvió como control para la sustracción de línea de base. Los diagramas del sensor que demostraban las fases de asociación y disociación se analizaron determinando la Kd y la Ka. Se determinó la afinidad (KD) del anticuerpo de ratón 3D6 por el Aβ 1–42 en 2,4 nM y la afinidad del 3D6 humanizado, preparado esencialmente según lo descrito en el ejemplo 1, se determinó en 2,3 nM.

Ejemplo 4

Mapeado de epítopos de 3D6 humanizado y de ratón

El BIAcore es un sistema biosensor automatizado para medir las interacciones moleculares [Karlsson R. y cols. J. Immunol. Methods 145: 229–240 (1991)]. La ventaja del BIAcore frente a otros análisis de unión es que se puede medir la unión del antígeno sin tener que marcar ni inmovilizar el antígeno (es decir, el antígeno mantiene una configuración más nativa). La metodología BIAcore se usó evaluando la unión de diversos fragmentos de péptido beta–amiloide con bien 3D6 de ratón o bien 3D6 humanizado (preparados sustancialmente según lo descrito en el ejemplo 1). Todas las diluciones se realizaron con solución salina tamponada con HEPES que contenía Tween 20. Se usó una sola concentración de una variedad de fragmentos de Aβ humano o Aβ 1–40 de ratón (BioSource International). Los fragmentos de beta–amiloide humano 1–10 y 1–20 se unieron con el 3D6 de ratón y con el 3D6 humanizado, mientras que los fragmentos de Aβ humano 10–20 y 16–25 no se unieron con ningún anticuerpo. Ni el 3D6 de ratón ni el 3D6 humanizado se unieron con el Aβ 1–40 de ratón. Mediante el uso de esta metodología, el epítopo de unión tanto para el 3D6 de ratón como para el 3D6 humanizado parece estar entre los aminoácidos 1 y 10 del Aβ humano.

Ejemplo 5

Efectos de la administración de 3D6

A no ser que se indique lo contrario, todos los estudios usaron ratones transgénicos APPV717F (PDAPP) y todas las inyecciones fueron i.p. En general, un grupo control de ratones recibió inyecciones de solución salina.

Seis semanas de inyección semanal de 360 μg de 3D6 en ratones viejos, hemicigóticos (24 meses) disminuyeron el Aβtotal insoluble en el hipocampo en un 10 % y el Aβ 1–42 en un 1 % (N.S., no significativo estadísticamente) en 9 animales por grupo de control y 10 animales por grupo de anticuerpo. En el córtex, el Aβtotal insoluble medio se redujo en un 33 % y el Aβ 1–42 en un 47 % (p < 0,05), mientras que el Aβ1–40 aumentó en un 100 %.

En ratones hemicigóticos, de 4 meses de edad, la administración de 360 μg de 3D6 por animal: 1) aumentó los niveles promedio de Aβ 1–40 y Aβ 1–42 en plasma aproximadamente 6 veces más y 9 veces más, respectivamente, a las 24 horas de la administración; y 2) no tuvo un efecto significativo sobre el Aβ 1–40 soluble en el córtex tras 24 horas en comparación con el control de solución salina (5 animales por grupo). En otro estudio con ratones hemicigóticos, de 3 meses de edad, la administración de 360 μg de 3D6 por animal aumentó los niveles promedio de Aβ 1–42 en plasma en aproximadamente 8 veces más a las 24 horas de la administración.

La administración de 360 μg de 3D6 por animal (5 animales por grupo, control de solución salina): aumentó los niveles promedio de Aβ 1–40 y Aβ 1–42 en plasma aproximadamente 92 veces más y 32 veces más, respectivamente, a las 24 horas de la administración (p < 0,05); descendió el Aβ 1–40 insoluble cortical en un 42 % (p < 0,05) y el Aβ 1–42 en un 27 % (N.S.), pero aumentó el Aβtotal en un 35 % (N.S.); no tuvo ningún efecto constante

o significativo sobre el Aβ 1–40, el Aβ 1–42 o el Aβtotal solubles o insolubles en el hipocampo tras 24 horas; en el cerebelo, aumentó el Aβ 1–42 soluble en un 80 % (p < 0,001) y el Aβtotal en un 68 % (N.S.), pero descendió el Aβ 1– 40 soluble en un 6 % (N.S.); y en el cerebelo, descendió el Aβ 1–40, el Aβ 1–42 y el Aβtotal insoluble en un 35 % (p<0,01), en un 21 % (N.S.) y en un 12 % (N.S.), respectivamente.

En ratones jóvenes, la administración de 360 μg de 3D6 por animal (5 por grupo): 1) aumentó los niveles medios de Aβ 1–42 en plasma aproximadamente 3 veces más a las 24 horas de la administración; y 2) en el córtex, descendió el Aβ 1–40 insoluble en aproximadamente el 10 % y aumentó el Aβ 1–42 insoluble en aproximadamente el 12 %.

Se realizaron estudios evaluando los efectos del 3D6 sobre la formación de complejos de Aβ:anticuerpo estables en fluidos biológicos, las concentraciones de Aβ en plasma exactamente después de la administración, el rendimiento cognitivo tras una administración aguda o crónica y la deposición de Aβ extraído con guanidina y detectado inmunohistoquímicamente (en el cerebro) tras la administración crónica.

Se inyectaron 360 μg de 3D6 a ratones (de 3 meses de edad). Veinticuatro horas después de la administración del anticuerpo, se recogió plasma y se resdisolvieron las proteínas mediante electroforesis en gel en condiciones nativas (no desnaturalizantes) sobre un gel de poliacrilamida. Tras la transferencia de proteínas partidas a una matriz sólida, se inmunodetectaron los complejos con anticuerpo biotinilado y se visualizaron con un aumento de la quimioluminiscencia. A diferencia de otros ciertos anticuerpos anti–Aβ, no se detectó ningún complejo con 3D6.

Se inyectó 3D6 a ratones jóvenes (de 2–3 meses de edad). Se recogió plasma en diversos momentos posteriores a la administración del anticuerpo y se determinaron diversas especies de Aβ mediante un ELISA de tipo sándwich. La administración de 3D6 dio como resultado un aumento dependiente de la dosis y del tiempo en los niveles de Aβ en plasma. Los niveles de Aβ1–40 aumentaron hasta un mayor grado que los niveles de Aβ1–42 tras la administración de 3D6. En un estudio adicional, se trataron ratones tg APPV717F jóvenes con 360 μg de 3D6 y se midieron los niveles de Aβ en plasma a las 0,5, 3, 6 y 24 h de la inyección. El 3D6 aumentó los niveles de Aβ en plasma de una manera dependiente del tiempo.

APPV717F

Se ha realizado una amplia caracterización del comportamiento de los ratones tgusando varios paradigmas de la memoria (presión de la barra, laberinto radial de 8 brazos, reconocimiento de objetos). Estos ratones tienen dañadas varias tareas de aprendizaje y de la memoria y los déficits en la tarea de reconocimiento de objetos (RO) empeoran con la edad. Por lo tanto, se ha usado la tarea de RO evaluando el aprendizaje y la memoria en ratones tg APPV717F. El rendimiento de la tarea de RO depende preferiblemente de la integridad del lóbulo temporal medio (cortezas perirrinal y entorrinal). El análisis del RO se basa en la tendencia espontánea de los roedores para explorar preferiblemente un objeto nuevo frente a uno conocido.

En el primer día de la prueba, se dejó que los ratones se habituaran a una cámara de campo abierto durante 50 minutos. El día siguiente, se volvieron a colocar los ratones en el campo abierto para dos pruebas de 10 min. Durante la prueba uno, se dejó que los ratones exploraran el campo abierto en presencia de un objeto (p. ej., una canica o un dado). Tras un intermedio entre los ensayos de 3 horas, se volvieron a colocar los ratones en el campo abierto con el objeto conocido (el mismo objeto explorado anteriormente durante la prueba 1), así como con un objeto nuevo. Se registró el tiempo empleado en explorar el objeto nuevo así como el empleado en el objeto conocido y se calculó un índice de reconocimiento para cada ratón (la proporción del tiempo empleado en explorar el objeto nuevo x 100/tiempo total empleado en explorar los dos objetos). La administración de 360 μg de 3D6 por animal 24 horas antes de la sesión de habituación en ratones tg APPV717F de 11–12 meses de edad mejoró el rendimiento del RO en 2 de los 8 ratones analizados (p < 0,05).

Se administraron inyecciones semanales de PBS y de 72, 217 y 360 μg de una IgG inespecífica o 3D6 (n = 19–30) durante 5 meses a ratones homocigotos en tg (de 5–6 meses de edad). En necropsia, se extirparon los cerebros y se procesaron para los ensayos de ELISA de Aβ y los análisis inmunohistoquímicos de la carga de Aβ parenquimal. Se homogeneizaron los tejidos corticales y del hipocampo en PBS. Se extrajo posteriormente Aβ insoluble en PBS de los sedimentos mediante la homogenización en guanidina-HCl 5,5 M. Tras la homogenización, se sometieron las muestras a un ligero movimiento de rotación durante al menos 24 horas antes de la centrifugación y la recogida del extracto de guanidina. Se almacenaron las preparaciones de tejido solubles en PBS y extraídas con guanidina a 80°C para las posteriores determinaciones del Aβ mediante ELISA. Se llevó a cabo un análisis inmunohistoquímico (IHC) de la carga de Aβ parenquimal como se explica a continuación. Se marcaron ocho (8) μm de tejidos fijados en paraformaldehído incluidos en parafina con anticuerpo anti–Aβ policlonal de conejo (frente a Aβ 15–30) y seguido por la detección fluorescente de IgG anti–conejo. Se examinaron ocho (8) secciones de cerebro (7 IHC, 1 control) de cada animal. El tratamiento con 3D6 (360 μg) redujo notable y significativamente el Aβ1–42 extraído con guanidina cortical (mediante ELISA) y la carga de la placa de Aβ cortical y del hipocampo (mediante IHC), pero no se observó ningún efecto a dosis inferiores de 3D6. Aunque no se observó ningún efecto sobre el Aβ1–42 extraído con guanidina a dosis inferiores de 3D6, estas dosis redujeron significativamente la carga de la placa de Aβ cortical y del hipocampo (mediante IHC).

Se administró 3D6 radiomarcado (15 μCi/ratón; 0,5 mg/ratón) a ratones ICR (no transgénicos) evaluando las cinéticas y la distribución cerebral del anticuerpo tras su administración por vía intravenosa. Las cinéticas en plasma de la inmunorreactividad del 3D6 demostraron una semivida de eliminación de aproximadamente 5 días. La radiactividad precipitable en TCA fue mayor del 95 % de los recuentos en plasma totales realizados durante el estudio y descendió en el compartimento plasmático con una semivida terminal de 3–4 días. La observación de que la radiactividad plasmática permaneciera predominantemente precipitable en TCA a lo largo del estudio sugiere que el anticuerpo radiomarcado no se degradó significativamente proteolíticamente y que el marcador de 125–I no se escindió del anticuerpo en el transcurso del estudio. Las formas de los perfiles de concentración frente a tiempo medidos mediante ELISA y la radiactividad fueron generalmente similares, con algunas diferencias en las fases terminales. No se produjo ninguna acumulación aparente del radiomarcador en ningún tejido, incluyendo el cerebro. La distribución de la radiactividad hacia el cerebro fue mínima. No es posible distinguir claramente la cantidad de radiactividad asociada con las muestras cerebrales en este experimento de la contaminación generada por el compartimento sanguíneo durante el procesamiento de los tejidos o del anticuerpo asociado con las células endoteliales de la vasculatura cerebral.

Ratones hemicigóticos, de nueve meses de edad, recibieron PBS, una IgG inespecífica o 3D6 (500 μg/semana) mediante una inyección semanal durante seis meses (PBS, 11 animales, IgG, 13 animales; y 3D6, 14 animales). Se observó un descenso del Aβ débil, pero estadísticamente significativo, en el córtex (en comparación con la IgG) y en el hipocampo (en comparación con la IgG o con los controles con PBS/IgG combinados). El análisis inmunohistoquímico (IHC) mostró fuertes reducciones en la carga de la placa de Aβ en el córtex y en el hipocampo de los ratones tratados con 3D6 (reducciones del 94 % y del 85 %, respectivamente, frente al control de PBS; p < 0,05 y p < 0,01, respectivamente).

Ejemplo 6 Administración de 3D6 humanizado

Se administró una preparación de anticuerpo anti–Aβ que comprendía una cadena ligera que tenía la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 11 y una cadena pesada que tenía la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 12 (un 3D6 humanizado) como una sola inyección de bolo intravenoso a dos grupos de 12 monos titíes macho a dosis de 1 y 10 mg/kg. Las concentraciones de anticuerpo anti–Aβ inmunorreactivo descendieron con una semivida de eliminación de aproximadamente 4 días. Los parámetros de Cmáx y ABC aumentaron proporcionalmente entre los niveles de dosis de 1 y 10 mg/kg. La administración de 3D6 humanizado a los monos titíes dio como resultado un aumento de 18 o 29 veces de la inmunorreactividad de Aβ1–40 en plasma tras 8 horas, en comparación con las concentraciones de las dosis anteriores de los grupos de dosis de 1 y 10 mg/kg, respectivamente. Los animales a ambos niveles de dosis presentaron concentraciones de inmunorreactividad de Aβ1–40 por encima de los niveles de la línea de base hasta 2 semanas después de la administración del anticuerpo. El análisis cinético de las concentraciones de inmunorreactividad de Aβ1–40 mostró que la semivida de eliminación de la inmunorreactividad del Aβ1–40 era comparable a la del anticuerpo (~4 días). También se evaluaron las farmacocinéticas del 3D6 humanizado en macacos de Java macho tras una sola administración intravenosa de 1 mg/kg. El análisis de la inmunorreactividad mostró que el 3D6 humanizado se eliminó del plasma con una semivida de aproximadamente 11–12 días.

Listado de secuencias

<110> Eli Lilly y Compañía

<120> Anticuerpos humanizados

<130> X14958

<150> 60/287539

<151> 30–04–2001

<160> 20

<170> Patentln version 3.1

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 1

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 2

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 3

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 4

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 5

<210> 6

<211> 10

<212> PRT

<213> Mus sp.

<400> 6

<210> 7

<211> 113

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> anticuerpo humanizado

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1)

<223> Xaa = Asp o Tyr <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (7)..(7)

<223> Xaa = Ser o Thr 5 <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (10)..(10)

<223> Xaa = Ser o Thr

<220> 10 <221> MISC_FEATURE

<222> (15)..(15)

<223> Xaa = Leu, lle o Val

<220>

<221> MISC_FEATURE 15 <222> (50)..(50)

<223> Xaa = Arg o Lys

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (88)..(88) 20 <223> Xaa = Val o Leu

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (109)..(109)

<223> Xaa = Val o Leu 25 <400> 7

<210> 8

<211> 119

<212> PRT 5 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> anticuerpo humanizado

<220>

<221> MISC_FEATURE 10 <222> (3)..(3)

<223> Xaa = Gln, Lys o Arg

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (78)..(78) 15 <223> Xaa = Ser o Thr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (87)..(87)

<223> Xaa = Arg o Lys 20 <220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (88)..(88)

<223> Xaa = Ala, Ser o Thr

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (114)..(114)

<223> Xaa = Leu, Thr, lle o Val

<400> 8

<210> 9 10 <211> 113

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> anticuerpo humanizado 15 <400> 9

<210> 10

<211> 119

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> anticuerpo humanizado

<400> 10

<210> 11

<211> 219

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> anticuerpo humanizado

<400> 11

<210> 12

<211> 449

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> anticuerpo humanizado

<400> 12

<210> 13

<211> 46 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador de ADN

5 <400> 13 tatagagctc aagcttggat ggtgggaaga tggatacagt tggtgc 46

<210> 14

<211> 50

<212> ADN 10 <213> Secuencia artificial

<220>

<223> cebador de ADN

<400> 14

tatagagctc aagcttccag tggatagach gatggggstg tygttttggc 50 15 <210> 15

<211> 1.953

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 20 <223> anticuerpo humanizado

<400> 15

<210> 16

<211> 3.244

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<230>

<223> anticuerpo humanizado

<400> 16

<210> 17

<211> 717

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> anticuerpo humanizado

<400> 17

<210> 18

<211> 1.404

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> anticuerpo humanizado

<400> 18

<210> 19

<211> 239

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> anticuerpo humanizado

<400> 19

<210> 20

<211> 468

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> anticuerpo humanizado

<400> 20

Claims (25)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un anticuerpo humanizado β–amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera humanizada que tiene la secuencia de SEC ID N.º 7, en la que Xaa en posición 1 es Asp o Tyr; 5 Xaa en posición 7 es Ser o Thr; Xaa en posición 10 es Ser o Thr; Xaa en posición 15 es Leu, Ile, o Val; Xaa en posición 50 es Arg o Lys; Xaa en posición 88 es Val o Leu; y 10 Xaa en posición 109 es Val o Leu; y una región variable pesada humanizada que tiene la secuencia de SEC ID N.º: 8, en la que Xaa en posición 3 es Gln, Lys, o Arg; Xaa en posición 78 es Ser o Thr; Xaa en posición 87 es Arg o Lys;

   15 Xaa en posición 88 es Ala, Ser, o Thr; y Xaa en posición 114 es Leu, Thr, Ile, o Val en el que el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno del mismo incrementa los niveles de Aβ plasmáticos.
2. 2. Un fragmento de unión a antígeno obtenible por escisión enzimática del anticuerpo humanizado de la reivindicación 1.

   20 3. Un fragmento de Fab o F(ab’)2 del anticuerpo humanizado de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

3. 4.

   Un fragmento de F(ab’)2 de acuerdo con la reivindicación 3.

4. 5.

   Un fragmento de Fab de acuerdo con la reivindicación 3.

5. 6. Un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de 25 las reivindicaciones 1 a 5 que es un anticuerpo de cadena simple.

6. 7.

   Un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 que es un isotipo de inmunoglobulina IgG1.

7. 8.

   Un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a anticuerpo del mismo se produce en una

   30 célula huésped a partir de una célula de mieloma, una célula de ovario de hámster chino, una célula de ovario de hámster sirio y una célula renal embrionaria humana.
8. 9. Un compuesto polinucleotídico, que comprende una secuencia que codifica para la cadena ligera y la cadena pesada del anticuerpo humanizado de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8, o un fragmento de unión a antígeno del mismo.

   35 10. Una secuencia polinucleotídica, que cuando se expresa en una célula huésped adecuada, proporciona un anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
9. 11. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 seleccionado de SEC ID N.º 15, SEC ID N.º 17 y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para la región variable de cadena ligera dado por SEC ID N.º 7, SEC ID N.º 9, o SEC ID N.º 11.

   40 12. Un polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10 seleccionado de SEC ID N.º 16, SEC ID N.º 18 y un polinucleótido que comprende una secuencia que codifica para la región variable de cadena pesada dado por SEC ID N.º 8, SEC ID N.º 10, o SEC ID N.º 12.
10. 13. Un vector de expresión para expresar el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 que comprende la secuencia de polinucleótidos de una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12.

11. 14.

    Una célula transfectada con el vector de expresión de la reivindicación 13.

12. 15.

    Una célula transfectada con dos vectores de expresión de la reivindicación 13, en la que un primer vector comprende la secuencia polinucleotídica que codifica para la cadena ligera y un segundo vector comprende la secuencia que codifica para la cadena pesada.

13. 16.

    Una célula que es capaz de expresar el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

14. 17.

    Una célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en la que la célula se selecciona de una célula de mieloma, una célula de ovario de hámster chino, una célula de ovario de hámster sirio y una célula renal embrionaria humana.

15. 18.

    Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo humanizado o el fragmento de unión a antígeno de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

16. 19.

    Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en terapia.

17. 20.

    Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en el tratamiento de síndrome de Down, enfermedad de Alzheimer clínica o preclínica, o angiopatía amiloide cerebral clínica o preclínica en un sujeto humano.

18. 21.

    Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en la inhibición de la formación de placa de Aβ en el cerebro de un sujeto humano.

19. 22.

    Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para su uso en la reducción de la placa de Aβ en el cerebro de un sujeto humano.

20. 23.

    Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) para su uso de acuerdo con la reivindicación 21 o la reivindicación 22, en el que el sujeto está diagnosticado con enfermedad de Alzheimer clínica o preclínica, síndrome de Down, o angiopatía amiloide cerebral clínica o preclínica.

21. 24.

    Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) para su uso de acuerdo con la reivindicación 21 o la reivindicación 22, en el que el sujeto no está diagnosticado con enfermedad de Alzheimer clínica o preclínica, síndrome de Down, o angiopatía amiloide cerebral clínica o preclínica.

22. 25.

    Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de enfermedad de Alzheimer clínica o preclínica, síndrome de Down, o angiopatía amiloide cerebral clínica o preclínica.

23. 26.

    Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de enfermedad de Alzheimer.

24. 27.

    Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en el tratamiento de una enfermedad humana asociada con amiloide β, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo incrementa Aβ soluble en el plasma.

25. 28.

    Un anticuerpo humanizado anti-β-amiloide (Aβ) o un fragmento de unión a antígeno del mismo de acuerdo con la reivindicación 27, en el que la enfermedad humana es Alzheimer preclínico, síndrome de Down, o angiopatía amiloide cerebral preclínica.