ES2489646T3 - Anticuerpos humanizados específicos a Fc gamma RIIB y sus métodos de uso - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo humanizado que comprende una región Fc humana y un dominio variable, en donde dicho anticuerpo se une específicamente al dominio extracelular de FcγRIIB humano a través de dicho dominio variable, en donde dicho dominio variable comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:68 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:62, o un fragmento de dicho anticuerpo que comprende dicho dominio variable y se une específicamente al dominio extracelular de FcγRIIB humano a través de dicho dominio variable.

Description

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DESCRIPCIÓN
Anticuerpos humanizados específicos a Fc gamma RIIB y sus métodos de uso
2.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con anticuerpos humanizados de FcγRIIB, fragmentos y variantes de estos que se unen a FcγRIIB humano con una afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo se une a FcγRIIA. Además la invención incluye los anticuerpos humanizados de la invención para uso en el tratamiento de cualquier enfermedad relacionada con la pérdida del equilibrio de la señalización mediada por el receptor Fc, tal como cáncer (preferentemente una malignidad de célula B, particularmente, leucemia linfocítica crónica de células B o linfoma de no Hodgkin), enfermedad autoinmunitaria, enfermedad inflamatoria o trastorno alérgico mediado por IgE. La presente invención abarca además los anticuerpos humanizados de FcγRIIB de la invención o un fragmento de unión a antígeno de este, para el uso en conjunto con otras terapias contra el cáncer. Los anticuerpos humanizados de la invención se pueden usar en métodos para mejorar el efecto terapéutico de los anticuerpos terapéuticos administrando los anticuerpos humanizados de la invención para mejorar la función efectora de los anticuerpos terapéuticos. Los anticuerpos humanizados de la invención se pueden usar en métodos para mejorar la eficacia de una composición de vacuna administrando los anticuerpos humanizados de la invención con una composición de vacuna.
3.
Antecedentes de la invención
3.1 Receptores Fc y su papel en el sistema inmunológico
La interacción de los complejos anticuerpo-antígeno con las células del sistema inmunológico resulta en una amplia matriz de respuestas, que van desde funciones efectoras tales como la citotoxicidad dependiente de anticuerpos, desgranulación de mastocitos, y fagocitosis a señales inmunomoduladoras tales como la regulación de la proliferación de linfocitos y secreción de anticuerpos. Todas estas interacciones se inician a través de la unión del dominio Fc de los anticuerpos o complejos inmunológicos a receptores especializados de superficie celular en las células hematopoyéticas. La diversidad de respuestas celulares desencadenadas por anticuerpos y complejos inmunológicos resulta de la heterogeneidad estructural de los receptores Fc. Los receptores Fc comparten dominios de unión de ligando estructuralmente relacionados que median presumiblemente la señalización intracelular.
Los receptores de Fc, miembros de la superfamilia de proteínas de genes de inmunoglobulina, son glicoproteínas de superficie que pueden unir la porción Fc de las moléculas de inmunoglobulina. Cada miembro de la familia reconoce inmunoglobulinas de uno o más isotipos a través de un dominio de reconocimiento en una cadena del receptor Fc. Los receptores Fc se definen por su especificidad para los subtipos de inmunoglobulinas. Los receptores Fc para IgG se denominan como FcγR, para IgE como FcεR, y para IgA como FcαR. Diferentes células accesorias portan receptores Fc para anticuerpos de isotipo diferente, y el isotipo del anticuerpo determina qué células accesorias participarán en una respuesta determinada (revisado por Ravetch J.V. y otros 1991, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92; Gerber J.S. y otros 2001 Microbes and Infection, 3: 131-139; Billadeau D.D. y otros 2002, The Journal of Clinical Investigation, 2(109): 161-168; Ravetch J.V. y otros 2000, Science, 290: 84-89; Ravetch J. V. y otros, 2001 Annu. Rev. Immunol. 19:275-90; Ravetch J.V. 1994, Cell, 78(4): 553-60). Los diferentes receptores Fc, las células que los expresan, y su especificidad de isotipo se resumen en la Tabla 1 (adaptado de Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 4ta edición 1999, Elsevier Science Ltd/Garland Publishing, Nueva York).
Otra técnica anterior relativa a tal materia objeto incluye WO 2006113665 la cual se dirige a moléculas de diacuerpo y sus usos en el tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos, que incluyen trastornos inmunológicos, enfermedades infecciosas, intoxicación y cáncer. Las moléculas de diacuerpo descritas en la misma comprenden dos cadenas de polipéptidos que se asocian para formar al menos dos sitios de unión al epítopo, que pueden reconocer epítopos iguales o diferentes en antígenos iguales o distintos. Además, los antígenos pueden ser de moléculas iguales o diferentes. Las cadenas individuales de polipéptido de la molécula de diacuerpo pueden estar unidas covalentemente a través de enlaces covalentes de enlace no peptídico, tales como, pero sin limitarse a, puente disulfuro de residuos de cisteína situados dentro de cada cadena de polipéptido. En modalidades particulares, las moléculas de diacuerpo de la presente invención comprenden además una región Fc, que permite la funcionalidad similar al anticuerpo para modificar en la molécula.
WO 2007021841 se relaciona con moléculas, particularmente polipéptidos, más particularmente inmunoglobulinas (por ejemplo, anticuerpos), que comprenden una variante de región Fc, en donde dicha variante de región Fc comprende al menos una modificación de aminoácidos respecto a una región Fc silvestre, cuya variante de región Fc se une a FcγRIIIA y/o FcγRIIA con una afinidad mayor, respecto a una molécula comparable que comprende la región Fc silvestre. Las moléculas descritas en las mismas son particularmente útiles al impedir, tratar, o mejorar uno o más síntomas asociados con
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una enfermedad, trastorno, o infección. Las moléculas descritas en las mismas son particularmente útiles para el tratamiento
o prevención de una enfermedad o trastorno donde se desea una eficacia mejorada de la función celular efectora (por ejemplo, ADCC) mediada por FcγR, por ejemplo, cáncer, enfermedad infecciosa, y para mejorar la eficacia terapéutica de los anticuerpos terapéuticos cuyo efecto se media por ADCC.
WO 2005115452 se relaciona con anticuerpos o fragmentos de estos que se unen específicamente a FcγRIIB, particularmente FcγRIIB humano, con afinidad mayor que con la que dichos anticuerpos o fragmentos de estos se unen a FcγRIIA, particularmente FcγRIIA humano. Se proporciona además el uso de un anticuerpo anti-FcγRIIB o un fragmento de unión al antígeno de este, como una terapia de agente único para el tratamiento, prevención, manejo, o mejora de un cáncer, preferentemente una malignidad de célula B, particularmente, leucemia linfocítica crónica de células B o linfoma de no Hodgkin, un trastorno autoinmunitario, un trastorno inflamatorio, un trastorno alérgico mediado por IgE, o uno o más de sus síntomas. Además, se proporcionan métodos para mejorar el efecto terapéutico de los anticuerpos terapéuticos administrando los anticuerpos descritos en la misma para mejorar la función efectora de los anticuerpos terapéuticos. Se describen además los métodos para mejorar la eficacia de una composición de vacuna administrando dichos anticuerpos.
Receptores Fcγ
Cada miembro de esta familia es una glicoproteína de membrana integral, que posee los dominios extracelulares relacionados a un conjunto C2 de dominios relacionados con la inmunoglobulina, un único dominio de inmunoadsorción de membrana y un dominio intracitoplasmático de longitud variable. Existen tres FcγRs conocidos, designados FcγRI(CD64), FcγRII(CD32), y FcγRIII(CD16). Los tres receptores se codifican por genes distintos; sin embargo, la extensa homología entre los tres miembros de la familia sugiere que provinieron de un progenitor común quizás por la duplicación de genes. Esta invención se centra específicamente en FcγRII(CD32).
FcγRII(CD32)
Las proteínas FcγRII son glicoproteínas integrales de membrana de 40 kDa que unen sólo la IgG acomplejada debido a una baja afinidad por el Ig monomérico (106 M-1). Este receptor FcγR es el más ampliamente expresado, presente en todas las células hematopoyéticas, que incluyen monocitos, macrófagos, células B, células NK, neutrófilos, mastocitos y plaquetas. FcγRII tiene sólo dos regiones similar a inmunoglobulina en su cadena de unión a inmunoglobulina y de ahí una afinidad mucho menor por IgG que FcγRI. Existen tres genes FcγRII humanos (FcγRII-A, FcγRII-B, FcγRII-C), todos los cuales unen IgG en agregados o complejos inmunológicos.
Las diferencias distintas dentro de los dominios citoplasmáticos de FcγRII-A (CD32A) y FcγRII-B (CD32B) crean dos respuestas funcionalmente heterogéneas para la ligación de los receptores. La diferencia fundamental es que la isoforma A inicia la señalización intracelular que conduce a la activación celular tales como fagocitosis y estallido respiratorio, mientras que la isoforma B inicia las señales inhibidoras, por ejemplo, inhibición de la activación de células B.
Señalización a través de FcγRs
Tanto las señales de activación como inhibidoras se transducen a través de los FcγRs a continuación de la ligación. Estas funciones diametralmente opuestas resultan de las diferencias estructurales entre las diferentes isoformas del receptor. Dos dominios distintos dentro de los dominios de señalización citoplásmicos del receptor llamado inmunoreceptor de tirosina basado en motivos de activación (ITAMs) o inmunoreceptor de tirosina basado en motivos inhibidores (ITIMS) justifican las diferentes respuestas. El reclutamiento de diferentes enzimas citoplasmáticas a estas estructuras dicta el resultado de las respuestas celulares mediadas por FcγR. Los complejos de FcγR que contiene ITAM incluyen FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIIA, mientras que los complejos que contienen ITIM solamente incluyen FcγRIIB.
Los neutrófilos humanos expresan el gen FcγRIIA. La agrupación FcγRIIA a través de complejos inmunológicos o reticulación de anticuerpo específico sirve para agregar ITAMs junto con las quinasas asociadas al receptor que facilitan la fosforilación de ITAM. La fosforilación de ITAM sirve como sitio de acoplamiento para la quinasa Syk, cuya activación resulta en la activación de sustratos intermedios (por ejemplo, PI3K). La activación celular conduce a la liberación de mediadores proinflamatorios.
El gen FcγRIIB se expresa en los linfocitos B; su dominio extracelular es 96% idéntico a FcγRIIA y une complejos de IgG de una manera indistinguible. La presencia de un ITIM en el dominio citoplasmático de FcγRIIB define esta subclase inhibidora de FcγR. Recientemente se estableció la base molecular de esta inhibición. Cuando se co-liga junto con un activador FcγR, el TTIM en FcγRIIB se vuelve fosforilado y atrae el dominio SH2 del inositol polifosfato 5'-fosfatasa (SHIP), que hidroliza mensajeros fosfoinositol liberados como una consecuencia de la activación de la tirosina quinasa mediada por FcyR que contiene TTAM por consiguiente impidiendo la entrada de Ca++ intracelular. Así, la reticulación de FcγRIIB hace perder la
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respuesta de activación a la ligación de FcγR e inhibe la respuesta celular. La activación de células B, la proliferación de células B y la secreción de anticuerpos así se interrumpe.
Tabla 1 Receptores para las regiones Fc de isotipos de inmunoglobulina
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Receptor
FcγRI (CD64) imagen1 FcγRII-A (CD32) FcγRII-B2 (CD32) FcγRII-BI (CD32) FcγRIII (CD16) FcεRI FcαRI (CD89)
Unión
IgG1 108 M-1 IgG1 2 x 106 M-1 IgG1 2 X 106 M-1 IgG1 2 x 106 M-1 IgG1 5 x 105 M-1 IgG1 1010 M-1 IgG1, IgA2
107 M-1
Tipo celular
Macrófagos Neutrófilos Eosinófilos Células Macrófagos Neutrófilos Eosinófilos Células Macrófagos Neutrófilos Eosinófilos Células B Mastocitos Células NK Eosinófilos Macrófagos Neutrófilos Mastocitos Eosinófilos Basófilos Macrófagos ges Neutrófilos Eosinófilos
dendríticas
dendríticas
Mastocitos ls
Plaquetas Células de
Langerhan
Efecto de Ligación
Captación Estimulación Activación estallido de Captación Liberación de gránulo Captación Inhibición de la estimulación No Captación Inhibición de la estimulación Inducción de la Muerte Secreción de gránulos Captación Inducción de la muerte
respiratorio Inducción de
la
imagen2
muerte. imagen3 imagen4 imagen5 imagen6 imagen7 imagen8
3.2 Enfermedades de relevancia
35 3.2.1 Cáncer
Una neoplasia o tumor es una masa neoplásica que resulta del crecimiento celular anormal descontrolado que puede ser benigno o maligno. Los tumores benignos generalmente permanecen localizados. Los tumores malignos se denominan colectivamente cánceres. El término "maligna" generalmente significa que el tumor puede invadir y destruir las estructuras
40 del cuerpo vecinas y propagarse a sitios distantes para causar la muerte (para revisión, ver Robbins y Angell, 1976, Basic Pathology, 2da Edición, W.B. Saunders Co., Filadelfia, págs. 68-122). El cáncer puede surgir en muchos sitios del cuerpo y se comporta de manera diferente dependiendo de su origen. Las células cancerosas destruyen la parte del cuerpo en que se originan y después se propagan a otra(s) parte(s) del cuerpo donde comienzan un nuevo crecimiento y causan más destrucción.
45 Más de 1.2 millones de estadounidenses desarrollan cáncer cada año. El cáncer es la segunda causa principal de muerte en los Estados Unidos y si las tendencias actuales continúan se espera que sea el cáncer la causa principal de la muerte en el año 2010. El cáncer de pulmón y próstata son los máximos cancerígenos para los hombres en los Estados Unidos. El cáncer de pulmón y mama son los máximos cancerígenos para las mujeres en los Estados Unidos. Uno de cada dos
50 hombres en los Estados Unidos serán diagnosticados con cáncer en algún momento durante su vida. Uno de cada tres mujeres en los Estados Unidos serán diagnosticadas con cáncer en algún momento durante su vida.
Una cura para el cáncer aún no se ha encontrado. Las opciones terapéuticas actuales, tales como cirugía, quimioterapia y tratamiento con radiación, son muchas veces ya sea ineficaces o presentan efectos secundarios graves.
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3.2.1.1 Malignidades de células B
Las malignidades de células B, que incluyen, pero sin limitarse a, linfomas de células B y leucemias, son enfermedades neoplásicas con incidencia significativa en los Estados Unidos. Existen aproximadamente 55,000 nuevos casos de linfoma
60 por año en los Estados Unidos (datos de 1998), con un estimado de 25,000 muertes por año. Esto representa el 4% de la
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incidencia de cáncer y el 4% de todas las muertes relacionadas con cáncer en la población de los Estados Unidos. La clasificación Europea-Americana de las neoplasias linfoides revisada (clasificación REAL de 1994, modificada en 1999), agrupa los linfomas basados en su origen ya sea como linfoma de linaje de células B, linfoma de linaje de células T, o linfoma de Hodgkin. El linfoma de linaje de células B es el tipo más común de linfoma de no Hodgkin (NHL) diagnosticado en Estados Unidos (Williams, Hematology 6ta edición (Beutler y otros Ed.), McGraw Hill 2001).
La leucemia linfocítica crónica (CLL) es una enfermedad neoplásica caracterizada por la acumulación de linfocitos pequeños, que aparecen maduros en la sangre, médula ósea y tejidos linfoides. CLL tiene una incidencia de 2.7 casos por cada 100,000 en los Estados Unidos. El riesgo aumenta progresivamente con la edad, especialmente en los hombres. Representa el 0.8% de todos los cánceres y es la leucemia adulta más común, responsable del 30% de todas las leucemias. En casi todos los casos (> 98%) las células enfermas pertenecen al linaje de linfocitos B. Una variante no leucémica, linfoma linfocítico pequeño, constituye el 5-10% de todos los linfomas, tiene características histológicas, morfológicas e inmunológicas indistinguibles de aquella de ganglios linfáticos implicados en pacientes con B-CLL (Williams, 2001).
La historia natural de la leucemia linfocítica crónica se divide en varias fases. En la primera fase, la leucemia linfocítica crónica es una enfermedad indolente, caracterizada por la acumulación de células B malignas, pequeñas, maduras, funcionalmente incompetentes que tienen una vida útil alargada. Eventualmente, el tiempo de duplicación de las células B malignas disminuye y los pacientes se vuelven cada vez más sintomáticos. Mientras que el tratamiento con agentes quimioterapéuticos puede proporcionar alivio sintomático, la supervivencia global de los pacientes es sólo mínimamente extendida. Las últimas etapas de la leucemia linfocítica crónica se caracterizan por anemia y/o trombocitopenia significativa. En este punto, la supervivencia media es de menos de dos años (Foon y otros, 1990, Annals Int. Medicine 113:525). Debido a la muy baja velocidad de proliferación celular, la leucemia linfocítica crónica es resistente al tratamiento con agentes quimioterapéuticos.
Recientemente, estudios de expresión génica han identificado varios genes que se pueden regular hasta en los trastornos linfoproliferativos. Una molécula que se pensó que se sobre expresa en pacientes con leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL) y en una gran fracción de pacientes de linfoma no Hodgkin es CD32B (Alizadeh y otros, 2000, Nature 403:503511; Rosenwald y otros, 2001, J. Exp. Med 184:1639-1647). Sin embargo, el papel de CD32B en B-CLL no está claro ya que un reporte demuestra que CD32B se expresó en un porcentaje bajo de células B-CLL y en una densidad baja (Damle y otros, 2002, Blood 99:4087-4093). CD32B es un antígeno de superficie del linaje de células B, cuya sobre-expresión en la neoplasia de células B lo convierte en un objetivo adecuado para los anticuerpos terapéuticos. Adicionalmente, CD32B pertenece a la categoría de receptores inhibidores, cuya ligadura entrega una señal negativa. Por lo tanto, los anticuerpos dirigidos contra CD32B pueden funcionar para eliminar las células tumorales por mecanismos que incluyen citotoxicidad dependiente de complemento (CDC), citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), sino además desencadenar una señal apoptótica. La alta homología de CD32B con su contraparte, CD32A, un receptor Fc de activación, hasta el momento ha dificultado la generación de anticuerpos que selectivamente reconocen uno pero no la otra forma de la molécula.
3.2.1.2 Terapia contra el Cáncer
En la actualidad, la terapia contra el cáncer puede implicar cirugía, quimioterapia, terapia hormonal y/o tratamiento con radiación para destruir las células neoplásicas en un paciente (Ver, por ejemplo, Stockdale, 1998, "Principles of Cancer Patient Management", en Scientific American: Medicine, vol. 3, Rubenstein y Federman, editores, Capítulo 12, Sección IV). La terapia del cáncer puede además implicar terapia biológica o inmunoterapia. Todos estos enfoques plantean inconvenientes significativos para el paciente. La cirugía, por ejemplo, se puede contraindicar debido a la salud del paciente
o puede ser inaceptable para el paciente. Además, la cirugía puede no eliminar completamente el tejido neoplásico. La radioterapia es eficaz solamente cuando el tejido neoplásico exhibe una mayor sensibilidad a la radiación que los tejidos normales, y la radioterapia puede provocar además efectos secundarios frecuentemente graves. La terapia hormonal se da raramente como un agente único y, aunque puede ser eficaz por sí sola, se usa frecuentemente para impedir o retrasar la recurrencia de cáncer después de que otros tratamientos han eliminado la mayoría de las células cancerosas. Las terapias biológicas/inmunoterapias se limitan en número y pueden producir efectos secundarios tales como erupciones o inflamaciones, síntomas parecidos a la gripe, que incluyen fiebre, escalofríos y fatiga, problemas del tracto digestivo o reacciones alérgicas.
Con respecto a la quimioterapia, existen una variedad de agentes quimioterapéuticos disponibles para el tratamiento de cáncer. Una mayoría significativa de agentes quimioterapéuticos para el cáncer actúan inhibiendo la síntesis de ADN, ya sea directamente, o indirectamente inhibiendo la biosíntesis de los precursores de desoxirribonucleótido trifosfato, para impedir la replicación del ADN y la división celular concomitante (Ver, por ejemplo, Gilman y otros, Goodman y Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Eighth Edición (Pergamom Press, Nueva York, 1990)). Estos agentes, que incluyen agentes alquilantes, tales como nitrosourea, anti-metabolitos, tales como metotrexato e hidroxiurea, y otros agentes, tales
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como etopósidos, campatecinas, bleomicina, doxorrubicina, daunorrubicina, etc., aunque no son necesariamente específicos al ciclo celular, destruyen células durante la fase S debido a su efecto sobre la replicación del ADN. Otros agentes, específicamente colchicina y los alcaloides vinca, tales como vinblastina y vincristina, interfieren con el ensamblaje de microtúbulos resultando en la detención mitótica. Generalmente los protocolos de quimioterapia implican la administración de una combinación de agentes quimioterapéuticos para aumentar la eficacia del tratamiento.
A pesar de la disponibilidad de una variedad de agentes quimioterapéuticos, la quimioterapia tiene muchos inconvenientes (Ver, por ejemplo, Stockdale, 1998, "Principles Of Cancer Patient Management" en Scientific American Medicine, vol. 3, Rubenstein y Federman, editores, ch. 12, sect. 10). Casi todos los agentes quimioterapéuticos son tóxicos, y la quimioterapia causa efectos secundarios significativos, y frecuentemente peligrosos, que incluyen náusea severa, depresión de la médula ósea, inmunosupresión, etc. Además, incluso con la administración de combinaciones de agentes quimioterapéuticos, muchas células tumorales son resistentes o desarrollan resistencia a los agentes quimioterapéuticos. De hecho, las células resistentes a los agentes quimioterapéuticos particulares usados en el protocolo de tratamiento frecuentemente resultan ser resistentes a otros fármacos, incluso aquellos agentes que actúan por mecanismos diferentes de los mecanismos de acción de los fármacos usados en el tratamiento específico; este fenómeno se denomina resistencia pleiotrópica del fármaco o múltiples fármacos. Así, debido a la resistencia a los fármacos, muchos cánceres resultan refractarios a los protocolos de tratamiento quimioterapéutico estándar.
La malignidad de células B se trata generalmente con quimioterapia de agente único, quimioterapia de combinación y/o radioterapia. Estos tratamientos pueden reducir la morbilidad y/o mejorar la supervivencia, aunque portan efectos secundarios significativos. La respuesta de las malignidades de células B a diversas formas de tratamiento se mezcla. Por ejemplo, en los casos en que es posible la presentación clínica adecuada de los linfomas no Hodgkin, la radioterapia de campo puede proporcionar tratamiento satisfactorio. Ciertos pacientes, sin embargo, no pueden responder y la recurrencia de la enfermedad con resistencia al tratamiento sucede con el tiempo, particularmente con las variantes más agresivas de la enfermedad. Cerca de la mitad de los pacientes mueren a causa de la enfermedad (Devesa y otros, 1987, J. Nat'l Cancer Inst. 79:701).
Terapias en investigación para el tratamiento de la neoplasia refractaria de células B incluyen trasplante autólogo y alogénico de células madre o médula ósea y terapias génicas. Recientemente, la inmunoterapia usando anticuerpos monoclonales para los antígenos específicos de células B objetivo se ha introducido en el tratamiento de la neoplasia de células B. El uso de anticuerpos monoclonales con radionúclidos directos, toxinas, u otros agentes terapéuticos ofrece la posibilidad de que tales agentes se pueden entregar selectivamente a los sitios tumorales, limitando así la toxicidad a los tejidos normales.
Existe una necesidad significativa de tratamientos alternativos para el cáncer, particularmente para el tratamiento del cáncer que ha demostrado ser refractario a los tratamientos estándar contra el cáncer, tal como la cirugía, radioterapia, quimioterapia, y terapia hormonal. Una alternativa prometedora es la inmunoterapia, en los que las células cancerosas se dirigen específicamente por anticuerpos específicos a antígeno de cáncer. Los esfuerzos principales se han dirigido a aprovechar la especificidad de la respuesta inmunológica, por ejemplo, la tecnología de hibridomas ha permitido el desarrollo de anticuerpos monoclonales selectivos al tumor (Ver Green M.C. y otros, 2000 Cancer Treat Rev., 26: 269-286; Weiner LM, 1999 Semin Oncol. 26(suppl. 14):43-51) y en el últimos años, la Administración de Alimentos y Medicamentos ha aprobado los primeros MAbs para la terapia contra el cáncer: Rituxin (anti-CD20) para el linfoma no Hodgkin, Campath (anti-CD52) para leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL) y Herceptin [anti-(c-erb-2/HER-2)] para el cáncer de mama metastásico (Suzanne A. Eccles, 2001, Breast Cancer Res. 3: 86-90). Sin embargo, la potencia de la función efectora de los anticuerpos, por ejemplo, para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo ("ADCC") es un obstáculo para tal tratamiento. Además, con Rituxan y Campath, al menos la mitad de los pacientes no pueden responder y una fracción de respondedores pueden ser refractarios a los tratamientos posteriores. Se necesitan así métodos para mejorar la eficacia de tal tratamiento.
Existe una necesidad de terapias alternativas para el cáncer, particularmente, malignidades de células B, especialmente para pacientes que son refractarios a tratamientos estándar contra el cáncer y nuevas inmunoterapias tales como Rituxan.
3.2.2 Enfermedades inflamatorias y enfermedades autoimmunes
La inflamación es un proceso por el cual los glóbulos blancos del cuerpo y sustancias químicas protegen nuestro cuerpo de la infección por sustancias extrañas, tales como bacterias y virus. Por lo general se caracteriza por dolor, hinchazón, calor y enrojecimiento de la zona afectada. Las sustancias químicas conocidas como citoquinas y prostaglandinas controlan este proceso, y se liberan en una cascada auto-limitante y ordenada en la sangre o tejidos afectados. Esta liberación de sustancias químicas aumenta el flujo de sangre al área de lesión o infección, y puede resultar en enrojecimiento y calor. Algunas de las sustancias químicas causan una fuga de líquido en los tejidos, resultando en la inflamación. Este proceso
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protector puede estimular los nervios y causar dolor. Estos cambios, cuando ocurren durante un período limitado en el área relevante, trabajan para el beneficio del cuerpo.
En los trastornos autoinmunitarios y/o inflamatorios, el sistema inmunológico desencadena una respuesta inflamatoria cuando no existen sustancias extrañas para combatir y normalmente el sistema inmunológico protector del cuerpo causa daño a sus propios tejidos atacándose a sí mismo por error. Existen muchos trastornos autoinmunitarios diferentes que afectan al cuerpo de diferentes maneras. Por ejemplo, el cerebro se afecta en individuos con esclerosis múltiple, el intestino se afecta en individuos con enfermedad de Crohn y la membrana sinovial, hueso y cartílago de diversas articulaciones se afectan en individuos con artritis reumatoide. Como progresan los trastornos autoinmunitarios, pueden resultar destrucción de uno o más tipos de tejidos del cuerpo, crecimiento anormal de un órgano, o cambios en la función del órgano. El trastorno autoinmunitario puede afectar a un solo órgano o tipo de tejido o puede afectar a múltiples órganos y tejidos. Los órganos y tejidos comúnmente afectados por trastornos autoinmunitarios incluyen las células rojas de la sangre, vasos sanguíneos, tejidos conectivos, glándulas endocrinas (por ejemplo, la tiroides o páncreas), músculos, articulaciones, y piel. Ejemplos de trastornos autoinmunitarios incluyen, pero sin limitarse a, tiroiditis de Hashimoto, anemia perniciosa, enfermedad de Addison, diabetes tipo 1, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, dermatomiositis, síndrome de Sjogren, esclerosis múltiple, enfermedad autoinmunitaria de oído interior, enfermedad inflamatoria del intestino, artritis, miastenia gravis, síndrome de Reiter, enfermedad de Graves, hepatitis autoinmunitaria, poliposis adenomatosa familiar y colitis ulcerativa.
La artritis reumatoide (RA) y artritis reumatoide juvenil son tipos de artritis inflamatoria. La artritis es un término general que describe la inflamación en las articulaciones. Algunos, pero no todos, los tipos de artritis son el resultado de la inflamación mal dirigida. Además de la artritis reumatoide, otros tipos de artritis asociada con la inflamación incluyen los siguientes: artritis psoriásica, síndrome de Reiter, artritis por espondilitis anquilosante, y artritis gotosa. La artritis reumatoide es un tipo de artritis crónica que ocurre en las articulaciones en ambos lados del cuerpo (tales como ambas manos, muñecas o rodillas). Esta simetría ayuda a distinguir la artritis reumatoide de otros tipos de artritis. Además de afectar a las articulaciones, la artritis reumatoide puede ocasionalmente afectar la piel, ojos, pulmones, corazón, sangre o nervios.
La artritis reumatoide afecta aproximadamente 1% de la población mundial y es potencialmente incapacitante. Existen aproximadamente 2.9 millones de incidencias de artritis reumatoide en los Estados Unidos. Se afectan de dos a tres veces más mujeres que hombres. La edad típica que ocurre la artritis reumatoide es entre 25 y 50 años. La artritis reumatoide juvenil afecta a 71,000 jóvenes norteamericanos (de dieciocho años y menores), afectando seis veces más a las chicas que a los chicos.
La artritis reumatoide es una enfermedad autoinmunitaria donde el sistema inmunológico del cuerpo identifica inadecuadamente las membranas sinoviales que secretan el líquido lubricante en las articulaciones como extraño. La inflamación resulta, y el cartílago y tejidos dentro y alrededor de las articulaciones se dañan o destruyen. En casos severos, esta inflamación se extiende al cartílago circundante y otros tejidos de la articulación, donde se puede erosionar o destruir el hueso y cartílago y conducir a deformidades de la articulación. El cuerpo sustituye el tejido dañado por tejido cicatrizal, que causan estrecharse los espacios normales dentro de las articulaciones y fusionar conjuntamente los huesos. La artritis reumatoide crea rigidez, hinchamiento, fatiga, anemia, pérdida de peso, fiebre, y con frecuencia, dolor paralizante. Algunos de los síntomas comunes de la artritis reumatoide incluyen rigidez en las articulaciones al despertar que dura una hora o más; hinchamiento en las articulaciones de un dedo específico o muñeca; hinchamiento de los tejidos blandos alrededor de las articulaciones; e hinchamiento en ambos lados de la articulación. El hinchamiento puede ocurrir con o sin dolor, y puede empeorar de forma progresiva o permanecer igual durante años antes de progresar.
El diagnóstico de la artritis reumatoide se basa en una combinación de factores, que incluyen: la localización específica y la simetría de las articulaciones dolorosas, la presencia de rigidez de las articulaciones en la mañana, la presencia de protuberancias y nódulos debajo de la piel (nódulos reumatoides), resultados de pruebas de rayos X que sugieren la artritis reumatoide, y/o los resultados positivos de una prueba de sangre llamada factor reumatoide. Muchos, pero no todas, las personas con artritis reumatoide tienen el anticuerpo del factor reumatoide en su sangre. El factor reumatoide puede estar presente en las personas que no tienen artritis reumatoide. Otras enfermedades pueden causar además que se produzca en la sangre el factor reumatoide. Es por eso que el diagnóstico de la artritis reumatoide se basa en una combinación de varios factores y no sólo la presencia del factor reumatoide en la sangre.
El curso típico de la enfermedad es uno de los síntomas articulares persistentes pero fluctuantes, y después de aproximadamente 10 años, 90% de los enfermos mostrarán daños estructurales al hueso y cartílago. Un pequeño porcentaje tendrá una corta enfermedad que desaparece por completo, y otro porcentaje pequeño tendrá enfermedad muy severa con muchas deformidades de las articulaciones, y ocasionalmente otras manifestaciones de la enfermedad. El proceso inflamatorio causa erosión o destrucción del hueso y cartílago en las articulaciones. En la artritis reumatoide, existe un ciclo autoinmunitario de presentación persistente del antígeno, estimulación de las células T, secreción de citoquinas,
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activación de las células sinoviales, y destrucción de la articulación. La enfermedad tiene un gran impacto tanto en el individuo como la sociedad, causando dolor significativo, deterioro de la función y discapacidad, así como costando millones de dólares en gastos de atención médica y pérdidas salariales (ver, por ejemplo el sitio web NIH y el sitio web de NIAID).
La terapia actualmente disponible para la artritis se centra en reducir la inflamación de las articulaciones con medicamentos antiinflamatorios o inmunosupresores: La primera línea de tratamiento de cualquier artritis es usualmente antiinflamatorios, tal como aspirina, ibuprofeno e inhibidores Cox-2 tales como celecoxib y rofecoxib. Los "fármacos de segunda línea" incluyen oro, metotrexato y esteroides. Aunque estos son tratamientos bien establecidos para la artritis, muy pocos pacientes remiten con solo estas líneas de tratamiento. Los recientes avances en la comprensión de la patogénesis de la artritis reumatoide han conducido al uso de metotrexato en combinación con anticuerpos para citocinas o receptores recombinantes solubles. Por ejemplo, los receptores recombinantes solubles y anticuerpos monoclonales para el factor de necrosis tumoral (TNF)-α se han usado en combinación con metotrexato en el tratamiento de la artritis. Sin embargo, solamente aproximadamente el 50% de los pacientes tratados con una combinación de metotrexato y agentes anti-TNF-α tales como receptores recombinantes solubles para TNF-α muestran una mejoría clínicamente significativa. Muchos pacientes siguen siendo refractarios a pesar del tratamiento. Aún quedan asuntos de tratamiento difíciles para los pacientes con artritis reumatoide. Muchos de los tratamientos actuales tienen una alta incidencia de efectos secundarios o no pueden impedir completamente la progresión de la enfermedad. Hasta ahora, ningún tratamiento es ideal, y no existe cura. Nuevas terapias se necesitan que traten más eficazmente la artritis reumatoide y otros trastornos autoinmunitarios.
3.2.3 Alergia
Las reacciones alérgicas mediadas por el sistema inmunológico (hipersensibilidad) se clasifican en cuatro tipos (I-IV) de acuerdo con los mecanismos subyacentes que conducen a la expresión de los síntomas alérgicos. Las reacciones alérgicas de tipo I se caracterizan por la liberación mediada por la IgE de sustancias vasoactivas, tales como la histamina de los mastocitos y basófilos. La liberación de estas sustancias y la posterior manifestación de síntomas alérgicos se inician por la reticulación de la IgE unida al alergeno con su receptor en la superficie de los mastocitos y basófilos. En individuos que sufren de reacciones alérgicas de tipo I, la exposición a un alergeno por una segunda vez conduce a la producción de altos niveles de anticuerpos de IgE específicos para el alergeno como un resultado de la participación de las células B y T de memoria en la interacción de 3 células requeridas para la producción de IgE. Los altos niveles de anticuerpos IgE producidos causan un aumento en la reticulación de los receptores de IgE en los mastocitos y basófilos por la IgE unida al alergeno, lo que a su vez conduce a la activación de estas células y la liberación de mediadores farmacológicos que son responsables de las manifestaciones clínicas de las enfermedades alérgicas de tipo I.
Dos receptores con diferentes afinidades para IgE se han identificado y caracterizado. El receptor de alta afinidad (FcεRI) se expresa en la superficie de los mastocitos y basófilos. El receptor de baja afinidad (FcεRII/CD23) se expresa en muchos tipos de células, que incluyen las células B, células T, macrófagos, eosinófilos y células de Langerhans. El receptor IgE de alta afinidad consiste de tres subunidades (cadenas alfa, beta y gamma). Varios estudios demuestran que solamente la cadena alfa está implicada en la unión de la IgE, mientras que se requieren las cadenas beta y gamma (que son ya sea proteínas transmembrana o citoplasmáticas) para los eventos de transducción de la señal. La identificación de las estructuras IgE requeridas para que IgE se una a FcεRI en los mastocitos y basófilos es de suma importancia en la elaboración de estrategias para el tratamiento o prevención de alergias mediadas por IgE. Por ejemplo, el esclarecimiento del sitio de unión al receptor de IgE puede conducir a la identificación de los péptidos o pequeñas moléculas que bloquean la unión de IgE a las células que portan los receptores in vivo.
Actualmente, las reacciones alérgicas mediadas por IgE se tratan con fármacos tales como antihistamínicos y corticosteroides que intentan aliviar los síntomas asociados con las reacciones alérgicas contrarrestando los efectos de las sustancias vasoactivas liberadas a partir de mastocitos y basófilos. Las dosis altas de corticosteroides y antihistamínicos tienen efectos secundarios perjudiciales (por ejemplo, alteración del sistema nervioso central, estreñimiento, etc). Así, se necesitan otros métodos para tratar reacciones alérgicas de tipo I.
Un enfoque para el tratamiento de los trastornos alérgicos de tipo I ha sido la producción de anticuerpos monoclonales que reaccionan con la IgE soluble (libre) en el suero, bloquean la IgE a partir de la unión a su receptor en los mastocitos y basófilos, y no se unen a la IgE unida al receptor (es decir, no son anafilactogénicos). Dos de tales anticuerpos monoclonales están en etapas avanzadas de desarrollo clínico para el tratamiento de reacciones alérgicas mediadas por IgE (ver, por ejemplo, Chang, T.W., 2000, Nat. Biotech. 18:157-162).
Uno de los tratamientos más prometedores para las reacciones alérgicas mediadas por IgE es la inmunización activa contra los epítopos adecuados no anafilactogénicos sobre la IgE endógena. Stanworth y otros (la patente de Estados Unidos núm. 5,601,821) describe una estrategia que implica el uso de un péptido derivado del dominio CεH4 de la IgE humana acoplada a una proteína portadora heteróloga como una vacuna para la alergia. Sin embargo, este péptido ha demostrado no inducir
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la producción de anticuerpos que reaccionan con la IgE soluble nativa. Además, Hellman (la patente de Estados Unidos núm. 5,653,980) propuso composiciones de la vacuna anti-IgE basado en la fusión de los dominios completos CεH2-CεH3 (aproximadamente 220 aminoácidos de largo) a una proteína transportadora extraña. Sin embargo, los anticuerpos inducidos por las composiciones de la vacuna anti-IgE propuestos en Hellman más probablemente resultarán en la anafilaxia ya que los anticuerpos contra algunas porciones de los dominios CεH2 y CεH3 de la molécula IgE han demostrado reticular con el receptor de IgE en la superficie de los mastocitos y basófilos y conducen a la producción de mediadores de la anafilaxia (Ver, por ejemplo, Stadler y otros, 1993, Int. Arch. Allergy and Immunology 102:121-126). Por lo tanto, continúa una necesidad de tratamiento de reacciones alérgicas mediadas por IgE que no induzcan anticuerpos anafilácticos.
La preocupación significativa sobre la inducción de la anafilaxis ha resultado en el desarrollo de otro enfoque para el tratamiento de trastornos alérgicos de tipo I consistente de mimotopos que pueden inducir la producción de anticuerpos policlonales anti-IgE cuando se administran a animales (Ver, por ejemplo, Rudolf, y otros, 1998, Journal of Immunology 160:3315-3321). Kricek y otros (publicación internacional núm. WO 97/31948), tamizaron las bibliotecas de presentación de péptidos en fagos con el anticuerpo monoclonal BSWI7 para identificar mimotopos peptídicos que pueden imitar la conformación de la unión al receptor de IgE. Estos mimotopos presumiblemente se pueden usar para inducir anticuerpos policlonales que reaccionan con la IgE nativa libre, pero no con la IgE unida al receptor, así como bloquear la unión de IgE a su receptor. Kriek y otros describen mimotopos peptídicos que no son homólogos con ninguna parte de la molécula de IgE y son así diferentes de los péptidos descritos en la presente invención.
Como se evidencia por un estudio de la técnica, continúa habiendo una necesidad para mejorar la eficacia terapéutica de los métodos actuales para tratar o impedir trastornos tales como cáncer, enfermedad autoinmunitaria, trastorno inflamatorio, o alergia. Particularmente, existe una necesidad para mejorar la función efectora, particularmente, el efecto citotóxico de anticuerpos terapéuticos usados en el tratamiento del cáncer. El estado actual de la técnica es deficiente además para tratar
o impedir trastornos alérgicos (por ejemplo, ya sea por terapia con anticuerpos o terapia con vacuna).
4. Resumen de la invención
La invención proporciona un anticuerpo humanizado que comprende una región Fc humana y un dominio variable, en donde dicho anticuerpo se une específicamente al dominio extracelular de FcγRIIB a través de dicho dominio variable, en donde dicho dominio variable comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident:. 68 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de sec. con núm. de ident.: 62, o un fragmento de dicho anticuerpo que comprende dicho dominio variable y se une específicamente al dominio extracelular de FcγRIIB humano a través de dicho dominio variable. Los anticuerpos humanizados de FcγRIIB, un anticuerpo aislado o un fragmento de este, de la invención se puede unir específicamente a FcγRIIB, particularmente FcγRIIB humano, más particularmente FcγRIIH humano nativo, con una afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo o un fragmento de este se une a FcγRIIA, particularmente FcγRIIA humano, más particularmente FcγRIIA humano nativo. Como se usa en la presente, "FcγRIIB o FcγRIIA nativo" significa FcγRIIB o FcγRIIA que se expresa de forma endógena en una célula y está presente en la superficie celular de esa célula o se expresa de forma recombinante en una célula de mamífero y está presente en la superficie celular, pero no se expresa FcγRIIB o FcγRIIA en una célula bacteriana o FcγRIIB
o FcγRIIB aislado, desnaturalizado. Se describen en la presente anticuerpos humanizados, y fragmentos de unión a antígeno de estos, derivados de anticuerpos que se unen a FcγRIIB, particularmente FcγRIIB humano, más particularmente FcγRIIB humano nativo, con una afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo o un fragmento de este se une a FcγRIIA, particularmente FcγRIIA humano, más particularmente FcγRIIA humano nativo. Se describen en la presente los anticuerpos humanizados 2B6 o 3H7 o fragmentos de estos, particularmente fragmentos de unión al antígeno de estos. Se describen además en la presente los anticuerpos humanizados 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2 y fragmentos de estos, particularmente fragmentos de unión a antígeno de estos.
Preferentemente los anticuerpos humanizados de la invención se unen al dominio extracelular de FcγRIIB humano nativo. Los anticuerpos anti-FcγRIIB humanizados descritos en la presente pueden tener una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de una CDR1 (por ejemplo, sec. con núm. de ident.:1, sec. con núm. de ident.:29, una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 31-35 como se expone en la sec. con núm. de ident.:60, o una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 31-35 como se expone en la sec. con núm. de ident.:68) y/o una CDR2 (por ejemplo, sec. con núm. de ident.:2, sec. con núm. de ident.:30, una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 50-66 como se expone en la sec. con núm. de ident.:60, o una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 50-66 como se expone en la sec. con núm. de ident.:68) y/o una CDR3 (por ejemplo, sec. con núm. de ident.:3, sec. con núm. de ident.:31, una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 99-110 como se expone en la sec. con núm. de ident.:60, o una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 99-110 como se expone en la sec. con núm. de ident.:68) y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de una CDR1 (por ejemplo, sec. con núm. de ident.:8, sec. con núm. de ident.:38, o
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una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 24-34 como se expone en la sec. con núm. de ident.:62) y/oa CDR2(por ejemplo, sec. con núm. de ident.:9, sec. con núm. de ident.:10, sec. con núm. de ident.:11, sec. con núm. de ident.:39, o una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 50-56 como se expone en la sec. con núm. de ident.:62) y/o una CDR3 (por ejemplo, sec. con núm. de ident.:12, sec. con núm. de ident.:40, o una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 89-97 como se expone en la sec. con núm. de ident.:62).
Los anticuerpos humanizados descritos en la presente pueden comprender una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de la sec. con núm. de ident.: 18, sec. con núm. de ident.:20, sec. con núm. de ident.:22, sec. con núm. de ident.:46, o sec. con núm. de ident.:62, y/o una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de sec. con núm. de ident.:24, sec. con núm. de ident.:37, sec. con núm. de ident.:60, o sec. con núm. de ident.:68 y/o variantes de secuencia de aminoácidos de estas. Los anticuerpos humanizados de la invención comprenden una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácido de sec. con núm. de ident.:62 y una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácido de sec. con núm. de ident.:68.
En particular, se describe en la presente un anticuerpo humanizado que se une inmunoespecíficamente al dominio extracelular del FcγRIIB humano nativo, dicho anticuerpo que comprende (o alternativamente, consistente de) una VH CDR1 y una VL CDR1; una VH CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2 y una VL CDR1; VH CDR2 y VL CDR2; una VH CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR3 y una VH CDR1; una VH CDR3 y una VL CDR2; una VH CDR3 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2 y una VL CDR1; una VH CDR1, una VH CDR2 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR2; una VH CDR2, una VH CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR1; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VL CDR1, una VL CDR2, y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR3, una VL CDR1, una VL CDR2, y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1, una VL CDR2, y una VL CDR3; o cualquier combinación de éstas de las VH CDR y VL CDR descritas en la presente.
Se describe en la presente un anticuerpo 2B6 humanizado, en donde la región VH consiste de los segmentos FR del segmento VH1-18 y JH6 de VH de la línea germinal humana, y las regiones CDR de 2B6 VH con la secuencia de aminoácido de sec. con núm. de ident.: 24. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo humanizado 2B6 en donde la región VH comprende la secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.: 60.La invención proporciona un anticuerpo humanizado 2B6 en donde una región VH comprende la secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.:68. Se describe en la presente un anticuerpo humanizado 2B6 en donde la región VL consiste de los segmentos FR del segmento VK-A26 y JK4 de VL de la línea germinal humana y las regiones CDR de 2B6 VL, con una secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 18, sec. con núm. de ident.: 20, o sec. con núm. de ident.: 22. La invención proporciona un anticuerpo humanizado 2B6 en donde la región VL comprende la secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.:62.
Se describe en la presente un anticuerpo humanizado 3H7, en donde una región VH consiste de los segmentos FR a partir de un segmento VH de la línea germinal humana y las regiones CDR de 3H7 VH, con la secuencia de aminoácido de sec. con núm. de ident.: 37. En otro caso, el anticuerpo humanizado 3H7 comprende además una región VL, que consiste en los segmentos de FR del segmento VL de la línea germinal humana y las regiones CDR de 3H7 VL, con una secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:46.
Se describen en la presente moléculas de anticuerpo humanizado específicas para FcγRIIB en la que una o más regiones de una o más CDR de las regiones variables de cadena pesada y/o cadena ligera de un anticuerpo humano (el anticuerpo receptor) se han sustituido por partes análogas de una o más CDR de un anticuerpo monoclonal donador que se une específicamente a FcγRIIB con una afinidad mayor que a FcγRIIA, por ejemplo, del anticuerpo monoclonal producido por el clon 2B6 o 3H7 que se unen a FcγRIIB, con número de acceso ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente, o un anticuerpo monoclonal producido por el clon 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2, con números de acceso ATCC PTA-5958, PTA5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente. En el caso más preferido, el anticuerpo humanizado se puede específicamente unir al mismo epítopo como el anticuerpo murino donador. Se apreciará por una persona con experiencia en la técnica que la descripción abarca generalmente el injerto de CDR de anticuerpos. Así, los anticuerpos donador y aceptor se pueden derivar de animales de la misma especie y aun la misma clase o subclase de anticuerpos. Más
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generalmente, sin embargo, los anticuerpos donador y receptor se derivan de animales de especies diferentes. Típicamente el anticuerpo donador es un anticuerpo no humano, tal como un MAb de roedor, y el anticuerpo aceptor es un anticuerpo humano.
En algunos casos, al menos una CDR del anticuerpo donador se injerta en el anticuerpo humano. En otros casos, al menos dos y preferentemente todas las tres CDR de cada una de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera se injertan en el anticuerpo humano. Las CDR pueden comprender las CDR de Kabat, las CDRs del bucle estructural ("CDRs Chothia") o una combinación de estas. En algunos casos, la descripción abarca un anticuerpo FcγRIIB humanizado que comprende al menos una cadena pesada injertada con CDR y al menos una cadena ligera injertada con CDR.
En un caso preferido, las regiones CDR del anticuerpo humanizado específico a FcγRIIB se derivan de un anticuerpo murino contra FcγRIIB. En algunos casos, los anticuerpos humanizados descritos en la presente comprenden alteraciones, que incluyen, pero sin limitarse a, deleciones, inserciones y modificaciones de aminoácidos del anticuerpo aceptor, es decir, regiones marco del dominio variable de la cadena pesada y/o ligera que son necesarias para retener y/o alterar y/o mejorar la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal donador. Tales modificaciones pueden modificar la secuencia de aminoácido de la región marco que corresponde con la región marco del donador, por ejemplo anticuerpo murino. La invención abarca un anticuerpo humanizado con fenilalanina en el aminoácido número 21 de la región 1 marco del dominio variable de la cadena ligera (correspondiente con el aminoácido número 21 de sec. con núm. de ident.:62). Se describe en la presente un anticuerpo humanizado con una o más de una isoleucina en el aminoácido número 13 de la región 2 marco del dominio variable de la cadena pesada (por ejemplo, correspondiente al aminoácido número 48 de sec. con núm. de ident.:60), una valina en el aminoácido número 6 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, correspondiente al aminoácido número 72 de sec. con núm. de ident.: 60), una valina en el aminoácido número 7 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, correspondiente al aminoácido número 73 de sec. con núm. de ident.:60), una valina en el aminoácido número 8 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, correspondiente al aminoácido número 74 de sec. con núm. de ident.:60), o cualquier combinación de éstos. La invención abarca un anticuerpo humanizado con una o más de una isoleucina en el aminoácido número 13 de la región 2 marco del dominio variable de cadena pesada (correspondiente con el aminoácido número 48 de sec. con núm. de ident.:68), una valina en el aminoácido número 6 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada (correspondiente al aminoácido número 72 de sec. con núm. de ident.:68), un ácido aspártico en el aminoácido número 7 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada (correspondiente al aminoácido número 73 de sec. con núm. de ident.:68), una treonina en el aminoácido número 8 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada (correspondiente al aminoácido número 74 de sec. con núm. de ident.:68), o cualquier combinación de éstos. En algunos casos, los anticuerpos humanizados comprenden al menos una modificación de aminoácidos (por ejemplo, inserción, deleción, sustitución) en una o más de las regiones marco del dominio variable de la cadena ligera. En ciertas modalidades, la invención abarca un anticuerpo humanizado que comprende una modificación en el aminoácido 21 de la región 1 marco del dominio variable de la cadena ligera (correspondiente al aminoácido número 21 en la sec. con núm. de ident.: 62) cuya modificación es preferentemente una sustitución con fenilalanina. En otros casos, los anticuerpos humanizados comprenden al menos una modificación de aminoácidos (por ejemplo, inserción, deleción, sustitución) en una o más de las regiones marco del dominio variable de la cadena pesada. En ciertas modalidades, la invención abarca un anticuerpo humanizado que comprende una modificación en el aminoácido 13 de la región 2 marco del dominio variable de cadena pesada, cuya modificación es preferentemente una sustitución con isoleucina (correspondiente al aminoácido número 48 en la sec. con núm. de ident.:68), y/o una modificación en el aminoácido 6 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada, cuya modificación es preferentemente una sustitución con valina ( correspondiente al aminoácido número 72 en la sec. con núm. de ident.:68), y/o una modificación en el aminoácido 7 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada, cuya modificación es preferentemente una sustitución con ácido aspártico (correspondiente al aminoácido número 73 en la sec. con núm. de ident.:68), y/o una modificación en el aminoácido 8 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada, cuya modificación es preferentemente una sustitución con treonina (correspondiente al aminoácido número 74 en la sec. con núm. de ident.:68). En otro caso un anticuerpo humanizado se describe en la presente que comprende una modificación en el aminoácido 13 de la región 2 marco del dominio variable de cadena pesada, cuya modificación es preferentemente una sustitución con isoleucina (por ejemplo, correspondiente al aminoácido número 48 en la sec. con núm. de ident.:60), y/o una modificación en el aminoácido 6 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada, cuya modificación es preferentemente una sustitución con valina (por ejemplo, correspondiente al aminoácido número 72 en la sec. con núm. de ident.:60), y/o una modificación en el aminoácido 7 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada, cuya modificación es preferentemente una sustitución con valina (por ejemplo, correspondiente al aminoácido número 73 en la sec. con núm. de ident.:60), y/o una modificación en el aminoácido 8 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada, cuya modificación es preferentemente una sustitución con valina (por ejemplo, correspondiente al aminoácido número 74 en la sec. con núm. de ident.:60). Los ejemplos no limitantes de secuencias de aminoácidos de dominios variables de cadena pesada y cadena ligera de 2B6 humanizado se exponen en la Figura 2A y la Figura 2B, respectivamente. Se describe en la presente cualquier combinación de las modificaciones anteriores de aminoácidos y las regiones marco del dominio variable de la cadena pesada y o ligera. En algunos casos, las regiones marco de los
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anticuerpos humanizados descritos en la presente no necesariamente consisten de la secuencia de aminoácidos precisa de la región marco de una región variable del anticuerpo humano de origen natural, pero contienen varias alteraciones, que incluyen, pero sin limitarse a, deleciones, inserciones, modificaciones de aminoácidos que alteran la propiedad del anticuerpo humanizado, por ejemplo, mejora de las propiedades de unión de una región del anticuerpo humanizado que es específica para el mismo objetivo que el anticuerpo murino específico a FcγRIIB. En los casos más preferidos, un número mínimo de alteraciones se hacen a la región marco para evitar introducciones a gran escala de residuos del marco no humano y para asegurar inmunogenicidad mínima del anticuerpo humanizado en los humanos. En algunos casos, los residuos del marco se derivan del segmento VH1-18 y JH6 de VH de la línea germinal humana y/o el segmento VK-A26 y JK4 de VL de la línea germinal humana. En algunos casos, no existen alteraciones hechas en las regiones marco. En modalidades específicas, el anticuerpo monoclonal donador de la presente invención es un anticuerpo monoclonal producido por el clon 2B6 que se une a FcγRIIB, con el número de acceso ATCC PTA-4591.
Los anticuerpos humanizados de la presente invención incluyen moléculas de anticuerpo completas con las cadenas pesadas y ligeras completas, o cualquier fragmento de estas, tales como los fragmentos Fab o (Fab')2, un dímero de cadena pesada y cadena ligera, o cualquier fragmento mínimo de este tal como un Fv, un SCA (anticuerpo de cadena sencilla), que exhibe unión inmunoespecífica para el FcγRIIB.
En ciertas modalidades, la región Fc comprende al menos una modificación de aminoácido respecto a una región Fc silvestre, tal que la región Fc modificada tiene una afinidad de unión alterada para un receptor de Fc. En una modalidad específica, la modificación de aminoácido de las regiones Fc de los anticuerpos humanizados de la invención respecto a la región Fc silvestre comprende una sustitución en la posición 243, 292, 300, 305 y 396. En una cierta modalidad, la modificación de aminoácido de las regiones Fc de los anticuerpos humanizados de la invención respecto a una región Fc silvestre comprende una sustitución en la posición 243 con leucina, en la posición 292 con prolina, en la posición 300 con leucina, en la posición 305 con isoleucina y en la posición 396 con leucina. En otras modalidades, el dominio Fc del anticuerpo o fragmento de este tiene una afinidad de unión aumentada a FcγRIIB y/o FcγRIII respecto a la del anticuerpo silvestre.
En una modalidad específica, la región Fc del anticuerpo humanizado de la invención comprende una leucina en la posición 243, una prolina en la posición 292, una leucina en la posición 300, una isoleucina en la posición 305 y una leucina en la posición 396.
En una modalidad específica, un anticuerpo humanizado 2B6 de la invención comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.:64. En otra modalidad específica, el anticuerpo humanizado 2B6 de la invención comprende una cadena pesada con la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.:70. En aún otras modalidades, el anticuerpo humanizado 2B6 comprende una cadena ligera con la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.:66. En una modalidad preferida, el anticuerpo humanizado 2B6 de la invención comprende una cadena pesada que contiene la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident:. 70 y una cadena ligera que contiene la sec. con núm. de ident.:66. En un aspecto específico de la invención, el plásmido pMGx0675 comprende las secuencias de nucleótidos sec. con núm. de ident.:69 y sec. con núm. de ident.:65 que codifican la secuencia de aminoácido de la cadena pesada sec. con núm. de ident.:70 y la secuencia de aminoácido de la cadena ligera sec. con núm. de ident.:66, respectivamente. El plásmido pMGx0675 se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo (10801 Universidad Blvd., Manassas, Virginia. 20110-2209) el 23 de Mayo, 2006 bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimientos de Patentes, y se le asignó el número de acceso PTA7609.
En una modalidad particular, la invención se relaciona con un anticuerpo aislado o un fragmento de este que se une específicamente a FcγRIIB a través del dominio variable con una afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo o un fragmento de este se une a FcγRIIA, y el dominio constante de dicho anticuerpo tiene además una afinidad mejorada para al menos uno o más receptores de activación de Fc con respecto a un anticuerpo de control de isotipo. Todavía en otra forma de modalidad específica, dicho receptor de activación de Fc es FcγRIIIA o FcγRIIA.
Se describen en la presente métodos para la producción de anticuerpos de la invención o fragmentos de estos, particularmente para la producción de anticuerpos humanizados específicos anti-FcγRIIB, tal que los anticuerpos específicos a FcγRIIB tienen una especificidad mejorada para FcγRIIB respecto a FcγRIIA. La descripción abarca cualquier método conocido en la técnica útil para la producción de polipéptidos, por ejemplo, síntesis in vitro, producción de ADN recombinante. Preferentemente, los anticuerpos humanizados se producen por la tecnología de ADN recombinante. Los anticuerpos humanizados específicos a FcγRIIB de la invención se pueden producir usando tecnología para la expresión de inmunoglobulinas recombinantes. Métodos ilustrativos para la producción de anticuerpos humanizados recombinantes de la invención pueden comprender lo siguiente: a) construir, por métodos convencionales de biología molecular, un vector de expresión que comprende un operón que codifica una cadena pesada de anticuerpo en la que se requieren las CDR y una
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porción mínima del marco de la región variable para mantener la especificidad de unión del anticuerpo donador que se derivan de una inmunoglobulina no humana, tal como el anticuerpo monoclonal murino específico a FcγRIIB, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal producido por el clon 2B6 o 3H7 que se une a FcγRIIB, con números de accesos ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente, o el anticuerpo monoclonal producido por el clon 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2 con números de accesos ATCC PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente, y el resto del anticuerpo se deriva de una inmunoglobulina humana, produciendo de ese modo un vector para la expresión de una cadena pesada de anticuerpo humanizado, por ejemplo, el plásmido pMGx0675 que comprende la secuencia de ácido nucleico sec. con núm. de ident.:69 que codifica la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 70, dicho plásmido con el número de acceso ATCC PTA-7609, depositado el 23 de mayo de 2006; b) construir, por métodos convencionales de biología molecular, un vector de expresión que comprende un operón que codifica una cadena ligera de anticuerpo en la que se requiere las CDR y una porción mínima del marco de la región variable para mantener la especificidad de unión del anticuerpo donador que se derivan de la inmunoglobulina no-humana, tal como el anticuerpo monoclonal murino de FcγRIIB, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal producido por el clon 2B6 o 3H7 que se une a FcγRIIB, con números de acceso ATCC PTA-4591 y PTA-4592, respectivamente, o el anticuerpo monoclonal producido por el clon 1D5, 2E1, 2H9, 2D11 o 1F2 con número de acceso ATCC PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960 y PTA-5959, respectivamente, y el resto del anticuerpo se deriva de una inmunoglobulina humana, produciendo de ese modo un vector para la expresión de la cadena ligera del anticuerpo humanizado, por ejemplo, el plásmido pMGx0675 que comprende la secuencia de ácido nucleico sec. con núm. de ident.: 65 que codifica la secuencia de aminoácido sec. con núm. de ident.: 66, dicho plásmido con el número de acceso ATCC PTA7609, depositado el 23 de mayo de 2006; c) transferir los vectores de expresión a una célula huésped por métodos convencionales de biología molecular para producir una célula huésped transfectada para la expresión de anticuerpos humanizados anti-FcγRIIB; d) cultivar la célula transfectada por técnicas convencionales de cultivo celular para producir anticuerpos humanizados anti-FcγRIIB; y e) recuperar los anticuerpos anti-FcγRIIB del cultivo por medios convencionales. Las células huésped se pueden cotransfectar con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector contiene un operón que codifica un polipéptido derivado de la cadena pesada y el segundo que contiene un operón que codifica un polipéptido derivado de la cadena ligera. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables diferentes pero, son preferentemente idénticos, con la excepción de las secuencias que codifican la cadena pesada y ligera. Este procedimiento prevé la expresión igual de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Alternativamente, un solo vector se pueden usar, que codifica tanto los polipéptidos de cadena pesada como ligera por ejemplo, el plásmido pMGx0675, con número de acceso ATCC PTA-7609, depositado el 23 de mayo 2006 que comprende las secuencias de ácido nucleico sec. con núm. de ident.: 69 y sec. con núm. de ident.: 65 que codifican las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo humanizado 2B6 (es decir, sec. con núm. de ident.:70 y sec. con núm. de ident.:66, respectivamente). Las secuencias codificantes para las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico o ambos. La célula huésped usada para expresar el anticuerpo recombinante de la invención puede ser ya sea una célula bacteriana tal como Escherichia coli, o, preferentemente, una célula eucariota. Preferentemente, se puede usar una célula de mamífero tal como una célula de ovario de hámster chino o HEK-293. La elección del vector de expresión depende de la elección de la célula huésped, y se puede seleccionar para tener las características de expresión y regulación deseadas en la célula huésped seleccionada. Los métodos generales para la construcción del vector de la invención, la transfección de las células para producir la célula huésped de la invención, cultivo de células para producir el anticuerpo de la invención son todos métodos convencionales de biología molecular. Del mismo modo, una vez producidos, los anticuerpos recombinantes de la invención se pueden purificar por procedimientos estándar de la técnica, que incluyen la filtración de flujo cruzado, precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de afinidad por columna, electroforesis en gel y similares.
En algunos casos, los métodos de fusión celular para preparar anticuerpos monoclonales se pueden usar en los métodos de la invención, tales como aquellos descritos en la patente de Estados Unidos núm. 5,916,771. En resumen, de acuerdo con este método, el ADN que codifica la cadena pesada deseada (o un fragmento de la cadena pesada) se introduce en la primera célula huésped de mamífero, mientras que el ADN que codifica la cadena ligera deseada (o un fragmento de la cadena ligera) se introduce en la segunda célula huésped de mamífero. La primera célula huésped transformada y la segunda célula huésped transformada se combinan después por fusión celular para formar una tercera célula. Antes de la fusión de la primera y segunda células, las células transformadas se pueden seleccionar para las características deseadas específicamente, por ejemplo, altos niveles de expresión. Después de la fusión, la célula híbrida resultante contiene y expresa tanto el ADN que codifica la cadena pesada deseada como el DNA que codifica la cadena ligera deseada, resultando en la producción del anticuerpo multimérico.
La invención abarca el uso de los anticuerpos humanizados de la presente invención junto con, o unido a, otros anticuerpos
o fragmentos de estos, tales como anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. Estos otros anticuerpos pueden ser reactivos con otros marcadores (epítopos) característicos de la enfermedad contra la que los anticuerpos de la invención se dirigen o puede tener diferentes especificidades elegidas, por ejemplo, reclutar moléculas o células del sistema inmunológico humano a las células enfermas. Los anticuerpos de la invención (o partes de estos) se pueden administrar con dichos anticuerpos (o partes de estos) como composiciones administradas por separado o como una sola composición con los dos agentes unidos por métodos biológicos moleculares o química convencional. Además, el valor diagnóstico y
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terapéutico de los anticuerpos de la invención se puede aumentar marcando los anticuerpos humanizados con marcadores que producen una señal detectable (ya sea in vitro o in vivo) o con un marcador que tiene una propiedad terapéutica. Algunos marcadores, por ejemplo, radionúclidos pueden producir una señal detectable y tener una propiedad terapéutica. Los ejemplos de marcadores radionúclidos incluyen I125, I131, C14. Los ejemplos de otros marcadores detectables incluyen un cromóforo fluorescente tal como fluoresceína, ficobiliproteína o tetraetilo de rodamina para microscopía de fluorescencia; una enzima que produce una fluorescencia o producto coloreado para la detección por fluorescencia, absorbancia, color visible o aglutinación, o que produce un producto denso de electrones para la demostración por microscopía electrónica; o una molécula densa de electrones tal como la ferritina, peroxidasa o perlas de oro para la visualización microscópica de electrones directa o indirecta. Los marcadores que tienen propiedades terapéuticas incluyen los fármacos para el tratamiento de cáncer, como el metotrexato.
Los métodos de la invención abarcan polinucleótidos además que codifican los anticuerpos humanizados de la invención o fragmentos de estos. En una modalidad, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio variable de la cadena pesada y/o el dominio variable de la cadena ligera de un anticuerpo de la invención. En un caso específico un ácido nucleico aislado comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio variable de la cadena pesada con la secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.:60. El ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio variable de la cadena pesada, secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.:60, puede por ejemplo, comprender la secuencia de nucleótidos sec. con núm. de ident.:59. En una modalidad específica, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el dominio variable de la cadena pesada con la secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.:68. De acuerdo con esta modalidad, el ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio variable de cadena pesada, secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.:68, puede, por ejemplo, comprender la secuencia de nucleótidos de sec. con núm. de ident.:67. En aún otras modalidades, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio variable de la cadena ligera con la secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.:62. De acuerdo con estas modalidades, el ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el dominio variable de la cadena ligera, secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.:62, puede, por ejemplo, comprender la secuencia de nucleótidos sec. con núm. de ident.:61. En aún otras modalidades, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de este de la invención que específicamente se une a FcγRIIB con afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo o un fragmento de este se une a FcγRIIA. En otra modalidad, la invención proporciona un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada o una cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de este que se une específicamente a FcγRIIB y bloquea el dominio de unión a Fc de FcγRIIB. Se describe además en la presente, un vector que comprenden dicho ácido nucleico. El vector puede comprender una primera molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena pesada y una segunda molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena ligera, siendo dicha cadena pesada y cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de este que se une específicamente a FcγRIIB con afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo o un fragmento de este se une a FcγRIIA. El vector puede ser un vector de expresión. Se describen en la presente células huésped que contienen los vectores o secuencias de nucleótidos que codifican los anticuerpos de la invención, las secuencia de nucleótidos pueden codificar las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos producidos por los clones de hibridoma depositados con números de acceso ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, o porciones y/o variantes/derivados de estos (por ejemplo, CDRs, dominios variables, etc. y versiones humanizadas de estos). En un caso específico se describe en la presente la secuencia de nucleótidos sec. con núm. de ident.:63, que codifica una cadena pesada de h2B6, secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.:64. En otro caso específico, se describe en la presente la secuencia de nucleótidos sec. con núm. de ident.:69, que codifica una cadena pesada de h2B6, secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.:70. En aún otro caso específico, se describe en la presente la secuencia de nucleótidos sec. con núm. de ident.:65, que codifica una cadena ligera de h2B6, secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.:66. La secuencia de nucleótidos puede codificar una cadena pesada y/o cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:70 y sec. con núm. de ident.:66, respectivamente.
Se describe el uso de los anticuerpos humanizados para detectar la presencia de FcγRIIB específicamente y (es decir, FcγRIIB yno FcγRIIA) en una muestra biológica.
Los receptores de Fc de activación e inhibidores, por ejemplo, FcγRIIA y FcγRIIB, son críticos para la función de equilibrio de estos receptores y las respuestas inmunitarias celulares adecuadas. Se describe además el uso de los anticuerpos humanizados para el tratamiento de cualquier enfermedad relacionada con la pérdida de tal equilibrio y control regulado en la vía de señalización del receptor de Fc. Así, los anticuerpos humanizados de FcyRIIB de la invención tienen usos para regular la respuesta inmunitaria, por ejemplo, para inhibir la respuesta inmunitaria en conexión con enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias o respuesta alérgica. Los anticuerpos humanizados de FcyRIIB de la invención se pueden
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usar además para alterar ciertas funciones efectoras para mejorar, por ejemplo, la citotoxicidad mediada por anticuerpos terapéuticos.
Los anticuerpos humanizados de la invención son útiles para la prevención o tratamiento del cáncer, por ejemplo, en una modalidad, como una terapia de agente único. En una modalidad de la invención, los anticuerpos humanizados de la invención son útiles para la prevención o el tratamiento de las malignidades de células B, particularmente el linfoma no Hodgkin o leucemia linfocítica crónica. En modalidades particulares, el cáncer del sujeto es refractario a una o más terapias estándar o experimentales, particularmente, al tratamiento con Rituxan. Los anticuerpos humanizados de la invención se pueden usar para el tratamiento, manejo, prevención, o mejora de las enfermedades de células B, tales como, leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL), linfoma no-Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular con áreas de linfoma difuso de células B grandes, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de células del manto, y linfoma difuso de células pequeñas hendidas.
Los anticuerpos de la invención se pueden usar en conjunto con un régimen de tratamiento estándar o experimental para malignidades de células B (por ejemplo, quimioterapia, radioinmunoterapia, o radioterapia). Tal terapia de combinación puede mejorar la eficacia del tratamiento estándar o experimental. Los ejemplos de agentes terapéuticos que son particularmente útiles en conjunto con un anticuerpo específico a FcγRIIB o un fragmento de unión a antígeno de este, para la prevención, tratamiento, manejo, o mejora de malignidades de células B, incluyen, pero sin limitarse a, Rituxan, interferónalfa, y agentes anti-cáncer. Los agentes quimioterapéuticos que se pueden usar en conjunto con un anticuerpo específico a FcγRIIB o un fragmento de unión a antígeno de este, incluyen, pero sin limitarse a agentes alquilantes, antimetabolitos, productos naturales, y hormonas. Las terapias de combinación de la invención permiten dosis más bajas de un anticuerpo anti-FcγRIIB o un fragmento de unión a antígeno de este y/o administración menos frecuente de anticuerpo anti-FcγRIIB o un fragmento de unión a antígeno de este a un sujeto con una malignidad de células B, para lograr un efecto terapéutico o profiláctico.
El uso de un anticuerpo humanizado de FcγRIIB o un fragmento de unión a antígeno de este prolonga la supervivencia de un sujeto diagnosticado con una malignidad de células B.
En una modalidad preferida, los anticuerpos humanizados de la invención se usan para el tratamiento y/o prevención del melanoma. En otra modalidad, los anticuerpos humanizados son útiles para la prevención y/o tratamiento de cáncer, particularmente para potenciar la actividad citotóxica de anticuerpos terapéuticos específicos al antígeno de cáncer con actividad citotóxica para mejorar la muerte de célula tumoral y/o mejorar la actividad citotóxica celular dependiente de anticuerpo ("ADCC"), actividad citotóxica dependiente de complemento ("CDC"), o fagocitosis de los anticuerpos terapéuticos.
Se describe además un método para tratar el cáncer en un paciente que tiene un cáncer caracterizado por un antígeno de cáncer, dicho método que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un primer anticuerpo humanizado o un fragmento de este que se une específicamente a FcγRIIB con afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo o fragmento de este se une a FcγRIIA, y un segundo anticuerpo que se une específicamente a dicho antígeno de cáncer y es citotóxico. Se describe además un método para tratar cáncer en un paciente que tiene un cáncer caracterizado por un antígeno de cáncer, dicho método que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humanizado o un fragmento de este que se une específicamente a FcγRIIB, particularmente FcγRIIB humano nativo, con afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo o un fragmento de este se une a FcγRIIA, preferentemente FcγRIIA humano nativo, y el dominio constante del cual tiene además una afinidad aumentada para uno o más receptores de Fc de activación, cuando el anticuerpo es monomérico, tal como FcγRIIIA, y un anticuerpo que se une específicamente a dicho antígeno de cáncer y es citotóxico. En una modalidad particular, dicho receptor de activación de Fc es FcγRIIIA.
En algunas modalidades, la invención abarca anticuerpos que comprenden variantes de regiones Fc que se unen a FcRn con una afinidad mejorada, lo que resulta en una vida media aumentada del anticuerpo, por ejemplo, una vida media mayor de 15 días, preferentemente mayor de 20 días, mayor de 25 días, mayor de 30 días, mayor de 35 días, mayor de 40 días, mayor de 45 días, mayor de 2 meses, mayor de 3 meses, mayor de 4 meses, o mayor de 5 meses. Aunque no pretende estar limitado por un mecanismo de acción particular el receptor neonatal Fc (FcRn) juega un papel importante para regular las vidas medias en el suero de anticuerpos IgG. Se ha establecido una correlación entre la afinidad de unión dependiente del pH de anticuerpos de IgG a FcRn y sus vidas medias en el suero en ratones. Las vidas medias aumentadas de los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de estos en un mamífero, preferentemente un humano, resulta en un título de suero más alto de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en el mamífero, y así, reduce la frecuencia de la administración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y/o reduce la concentración que se administra de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos de estos con vidas medias in vivo aumentadas se pueden generar modificando (por ejemplo, sustitución, deleción o adición) residuos de aminoácidos
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identificados como los involucrados en la interacción entre el dominio Fc y el receptor FcRn. Por ejemplo, la invención abarca anticuerpos que comprenden variantes de regiones Fc con al menos uno o más que modificaciones que mejoran la afinidad a FcRn, por ejemplo, una modificación de uno o más residuos aminoácido 251-256, 285-290, 308-314, 385-389, y 428-436, o una modificación en las posiciones 250 y 428, ver, por ejemplo, Hinton y otros, 2004, J. Biol. Chem. 279(8): 6213-6; publicación del PCT núm. WO 97/34631; y WO 02/060919.
Se describe un método para regular la activación celular mediada por el complejo inmunitario en un paciente, dicho método que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo o fragmento de este que se une específicamente al dominio extracelular de FcγRIIB humano y bloquea el sitio de unión a FcγRIIB humano. Preferentemente, la administración del anticuerpo o fragmento de este resulta en una respuesta inmunitaria mejorada, tal como un aumento en una respuesta celular dependiente de anticuerpo. Adicionalmente se prefiere que la activación de células mediadas por el complejo inmunitario es la activación de células B, activación de mastocitos, activación de células dendríticas o activación de macrófagos.
Adicionalmente se describe un método para romper la tolerancia a un antígeno en un paciente, dicho método que comprende administrar a un paciente que lo necesita (1) un complejo antígeno-anticuerpo que comprende dicho antígeno y
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un anticuerpo o fragmento de este que se une específicamente al dominio extracelular de FcγRIIB humano y bloquea el sitio de unión Fc de FcγRIIB humano, de ese modo rompiendo la tolerancia en dicho paciente a dicho antígeno. El anticuerpo o fragmento de este se pueden administrar antes de, simultáneamente con, o después de la administración de dicho complejo antígeno-anticuerpo.
Se describe además un método para mejorar un efecto citotóxico mediado por anticuerpo en un sujeto que se trata con un anticuerpo citotóxico, dicho método que comprende administrar a dicho paciente un anticuerpo humanizado de la invención,
o un fragmento de este, en una cantidad suficiente para mejorar el efecto citotóxico de dicho anticuerpo citotóxico. Un método para aumentar un efecto citotóxico mediado por anticuerpos en un sujeto que se trata con un anticuerpo citotóxico se describe además, dicho método que comprende administrar a dicho paciente un anticuerpo humanizado de la invención,
o un fragmento de este, que tiene además una afinidad mejorada para un receptor inhibidor Fc, cuando es monomérico, en una cantidad suficiente para mejorar el efecto citotóxico de dicho anticuerpo citotóxico. El método puede comprender además la administración de uno o más terapias contra el cáncer.
Los anticuerpos humanizados discutidos se pueden usar en conjunto con cualquier anticuerpo terapéutico que media su efecto terapéutico a través de la muerte celular para potenciar la actividad terapéutica del anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos humanizados potencian la actividad terapéutica del anticuerpo mejorando la función efectora mediada por anticuerpos, los anticuerpos humanizados potencian la actividad terapéutica del anticuerpo citotóxico mejorando la fagocitosis y opsonización de las células tumorales específicas, los anticuerpos humanizados potencian la actividad terapéutica del anticuerpo mejorando la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos ("ADCC") en la destrucción de las células tumorales específicas. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se usan en conjunto con las proteínas de fusión Fc para mejorar la ADCC.
Aunque no pretende estar limitado por un mecanismo de acción particular, la combinación de un anticuerpo humanizado de la invención en conjunto con un anticuerpo terapéutico tiene un efecto terapéutico mejorado debido, en parte, a la capacidad citotóxica del anticuerpo humanizado específico a FcγRIIB para eliminar macrófagos que expresan los receptores inhibidores Crib. Por lo tanto, existe una concentración más alta de células que expresan receptores activadores Fig que permanecen por dosis del anticuerpo terapéutico.
En algunas modalidades, los anticuerpos humanizados de la invención se pueden usar en conjunto con un anticuerpo terapéutico que no media su efecto terapéutico a través de la muerte celular para potenciar la actividad terapéutica del anticuerpo. En una modalidad específica, los anticuerpos humanizados de la invención se pueden usar en conjunto con un anticuerpo terapéutico inductor de la apoptosis con actividad agonista, por ejemplo, anticuerpo anti-Fas. La apoptosis terapéutica que inducen los anticuerpos puede ser específica para cualquier receptor de muerte conocido en la técnica para la modulación de la vía apoptótica, por ejemplo, miembro de la familia del receptor TNFR o un miembro de la familia TRAIL.
Los anticuerpos humanizados de la invención se pueden usar para bloquear la progresión celular del tumor mediada por macrófago y metástasis. Los anticuerpos humanizados de la invención son útiles en el tratamiento particular de tumores sólidos, donde ocurre la infiltración de macrófago. Los anticuerpos humanizados antagónicos de la invención son particularmente útiles para controlar por ejemplo, reducir o eliminar, metástasis de la célula tumoral, reduciendo o eliminando la población de macrófagos que se localizan en el sitio del tumor. La invención abarca además anticuerpos humanizados que reducen eficazmente o eliminan células efectoras inmunitarias distintas de los macrófagos que expresan FcγRIIB, por ejemplo, células dendríticas. La reducción eficaz o eliminación de las células efectoras inmunitarias usando los
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anticuerpos de la invención se puede extender de una reducción de la población de las células efectoras por 50%, 60%, 70%, 80%, preferentemente 90% y con la máxima preferencia 99%.
En algunas modalidades, los anticuerpos humanizados de la invención se pueden usar en conjunto con anticuerpos terapéuticos que se unen inmunoespecíficamente a los antígenos tumorales que no se expresan en las mismas células tumorales, sino más bien en las células no malignas que sostienen al tumor y reactivas circundantes, que comprenden el estroma tumoral. En una modalidad preferida, un anticuerpo humanizado de la invención se usa en conjunto con un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente al antígeno tumoral en una célula de fibroblasto, por ejemplo, proteína de activación de fibroblastos (FAP).
Se discute además un método para tratar un trastorno autoinmunitario en un paciente que lo necesita, dicho método que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos humanizados de la invención. Se proporciona además un método para tratar un trastorno autoinmunitario en un paciente que lo necesita, dicho método que comprende además administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más agentes anti-inflamatorios, y/o uno o más agentes inmunomoduladores. Se discuten además métodos para tratar o mejorar los síntomas de enfermedades autoinmunitarias que incluyen, pero sin limitarse a, Diabetes Tipo I, psoriasis, artritis reumatoide, lupus (particularmente, cutáneo), enfermedad inflamatoria del intestino (IBD), enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, esclerosis múltiple. Los métodos se pueden usar en sujetos con enfermedad de etapa temprana para frenar o reducir el daño de la autoinmunidad y mantener un alto nivel de funcionalidad y/o reducir la necesidad de o evitar un aumento en el nivel de otra terapia, por ejemplo, administraciones de un inmunosupresor o un anti-inflamatorio.
Se describe un método para tratar un trastorno inflamatorio en un paciente que lo necesita, dicho método que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos humanizados de la invención. Adicionalmente se proporciona un método para tratar un trastorno inflamatorio en un paciente que lo necesita, dicho método que comprende además administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más agentes antiinflamatorios, y/o uno o más agentes inmunomoduladores.
Se proporciona además un método para mejorar una respuesta inmunitaria a una composición de vacuna en un sujeto, dicho método que comprende administrar a dicho sujeto un anticuerpo humanizado o un fragmento de unión a antígeno de este que se une específicamente a FcγRIIB con afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo o un fragmento de este se une a FcγRIIA, y una composición de vacuna, tal que dicho anticuerpo o un fragmento de este se administra en una cantidad eficaz para mejorar la respuesta inmunitaria a dicha composición de vacuna en dicho sujeto. Los anticuerpos humanizados de la invención se pueden usar para mejorar una respuesta mediada por la célula y/o humoral contra el antígeno(s) de la composición de vacuna. Los anticuerpos de la invención se pueden usar en combinación con cualquier vacuna conocida en la técnica. Se analiza además el uso de los anticuerpos humanizados de la invención ya sea para evitar
o tratar un trastorno particular, donde una respuesta inmunitaria mejorada contra un antígeno o antígenos en particular es eficaz para tratar o evitar la enfermedad o trastorno.
Se describe además un método para mejorar la terapia inmunitaria para un agente infeccioso en donde los anticuerpos humanizados de la invención se administran a un paciente que ya está infectado por un patógeno, tales como VIH, VHC o HSV para mejorar la opsonización y fagocitosis de las células infectadas. Adicionalmente se describen los métodos para tratar la sepsis o shock séptico usando anticuerpos humanizados de la invención. El papel de FcγRIIB en la sepsis se ha descrito en Clatworthy y otros, 2004, J Exp Med 199:717-723; incorporado en la presente como referencia en su totalidad.
Un método para tratar enfermedades con señalización mediada por apoptosis deficiente, por ejemplo, cáncer, enfermedad autoinmunitaria se describe, por ejemplo, un método para tratar una enfermedad con apoptosis mediada por Fas deficiente, dicho método que comprende administrar un anticuerpo humanizado de la invención en conjunto con un anticuerpo anti-Fas.
Se analiza además un método para tratar o evitar un trastorno alérgico mediado por IgE en un paciente que lo necesita, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de los anticuerpos agonistas humanizados de la invención. Se proporciona adicionalmente un método para tratar o evitar un trastorno alérgico mediado por IgE en un paciente que lo necesita, que comprende administrar a dicho paciente de los anticuerpos humanizados de la invención en combinación con otros anticuerpos terapéuticos o composiciones de vacuna usadas para el tratamiento o la prevención de trastornos alérgicos mediados por IgE.
Se discute además el uso de un anticuerpo específico de FcγRIIB conjugado con un agente terapéutico o fármaco. Ejemplos de agentes terapéuticos que se pueden conjugar con un anticuerpo anti-FcγRIIB o un fragmento de unión a antígeno de este incluyen, pero sin limitarse a, citoquinas, toxinas, elementos radiactivos, y antimetabolitos.
La invención proporciona un método de diagnóstico de una enfermedad autoinmunitaria en un sujeto que comprende: (i)
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contactar una muestra biológica de dicho sujeto con una cantidad eficaz de un anticuerpo humanizado de la invención; y (ii) detectar la unión de dicho anticuerpo humanizado o un fragmento de este, en donde la detección de dicho marcador detectable por encima del nivel estándar o de fondo indica que dicho sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria.
La invención proporciona además una composición farmacéutica que comprende (i) una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humanizado o un fragmento de este que se une específicamente a FcγRIIB con afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo o un fragmento de este se une a FcγRIIA; y (ii) un portador farmacéuticamente aceptable. La invención proporciona adicionalmente una composición farmacéutica que comprende (i) una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo humanizado de la invención; (ii) un anticuerpo citotóxico que se une específicamente a un antígeno de cáncer; y
(iii) un portador aceptable farmacéuticamente. En una modalidad específica, el anticuerpo o fragmento de este se une específicamente al dominio extracelular de FcγRIIIB humana bloquea el sitio de unión Fc de FcγRIIB humano, y además bloquea la reticulación de FcγRIIB a un receptor Fc. En una modalidad específica, la región Fc del anticuerpo de la invención comprende una o más de una alanina en la posición 265, una glutamina en posición 297, leucina en la posición 243, una prolina en la posición 292, una leucina en la posición 300, una isoleucina en la posición 305, o una leucina en la posición 396. En aún otra modalidad, el anticuerpo o fragmento de este que se une específicamente al dominio extracelular de FcγRIIB humano y bloquea el sitio de unión Fc de FcγRIIB humano comprende una región Fc que comprende al menos una modificación de aminoácido con respecto a una región Fc silvestre, tal que la región Fc modificada tiene una afinidad de unión alterada al receptor Fc. En una modalidad específica, la modificación de aminoácido comprende la sustitución en la posición 265 o 297, preferentemente una sustitución en la posición 265 con alanina o una sustitución en la posición 297 con glutamina. En otra modalidad, la modificación de aminoácido comprende una sustitución en la posición 243, 292, 300, 305 y 396, preferentemente una sustitución en 243 con leucina, una sustitución en la posición 292 con prolina, una sustitución en la posición 300 con leucina, una sustitución en la posición 305 con isoleucina, y una sustitución en la posición 396 con leucina.
Se describen además los métodos de terapia de combinación. Los métodos descritos en la presente se pueden llevar a cabo en combinación con cualquier tratamiento estándar para la indicación particular, por ejemplo, en el caso del tratamiento de cáncer, quimioterapia estándar y/o agentes anti-angiogénicos y, en el caso del tratamiento de un trastorno autoinmunitario, inmunosupresor estándar y/o tratamientos anti-inflamatorios. Los anticuerpos y/o composiciones de la invención se pueden administrar con otras terapias tales como agentes anti-inflamatorios, terapias esteroideas (por ejemplo, pero sin limitarse a, glucocorticoides, dexametasona, cortisona, hidrocortisona, prednisona, prednisolona, triamcinolona, azulfidina, etc.), antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDS) (por ejemplo, pero sin limitarse a, inhibidores COX-2, aspirina, ibuprofeno, diclofenaco, etodolaco, fenoprofeno, indometacina, ketoloraco, oxaprozin, nabumetona, sulindaco, tolmetina, naproxeno, cetoprofeno, etc.), beta-agonistas, agentes anticolinérgicos, agentes inmunomoduladores (por ejemplo, pero sin limitarse a, moduladores de receptores de células T, moduladores de receptores de citoquinas, agentes de reducción de células T, antagonistas de citoquinas, agonistas de monocinas, inhibidores de linfocinas, etc.), inmunosupresores (tales como, pero sin limitarse a, metotrexato o ciclosporina), agentes anti-angiogénicos (por ejemplo, angiostatina y TNF-alfa, antagonistas y/o inhibidores (por ejemplo, pero sin limitarse a, etanercept e infliximab)), dapsona y psoralenos. Los sujetos que se han vuelto refractarios a los tratamientos convencionales se tratan usando métodos descritos en la presente.
En ciertas modalidades de la invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas para el uso de acuerdo con los métodos de la invención, dichas composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo FcγRIIB humanizado o un fragmento de unión a antígeno de este, en una cantidad eficaz para evitar, tratar, manejar o mejorar una malignidad de células B, o uno o más de sus síntomas, y un portador farmacéuticamente aceptable. La invención proporciona además las composiciones farmacéuticas para el uso de acuerdo con los métodos de la invención, dichas composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo de FcγRIIB humanizado o un fragmento de unión a antígeno de este, un agente profiláctico o terapéutico distinto de un antagonista de FcγRIIB, y un portador farmacéuticamente aceptable.
Los anticuerpos y/o composiciones de la invención se pueden administrar por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular o subcutánea, o, alternativamente, se pueden administrar por vía oral. Los anticuerpos y/o composiciones de la invención se pueden administrar además como una formulación de liberación sostenida.
4.1 Definiciones
Como se usa en la presente, el término "se une específicamente a FcyRIIB" y términos análogos se refiere a los anticuerpos
o fragmentos de estos (o cualquier otra molécula de unión a FcγRIIB) que se unen específicamente a FcyRIIB o un fragmento de este y que no se unen específicamente a otros receptores Fc, particularmente a FcyRIIA. Además, se entiende por uno con experiencia en la técnica, que un anticuerpo que se une específicamente a FcyRIIB, puede unirse a través del dominio variable o el dominio constante del anticuerpo. Si el anticuerpo que se une específicamente a FcyRIIB se une a través de su dominio variable, se entiende por uno con experiencia en la técnica que no está agregado, es decir, es monomérico. Un anticuerpo que se une específicamente a FcyRIIB puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con afinidad
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más baja, como se determinó, por ejemplo, por inmunoensayos, BIAcore u otros ensayos conocidos en la técnica. Preferentemente, los anticuerpos o fragmentos de estos que se unen específicamente a FcyRIIB o un fragmento de este no presentan reacción cruzada con otros antígenos. Los anticuerpos o fragmentos que se unen específicamente a FcyRIIB se pueden identificar, por ejemplo, mediante inmunoensayos, BIAcore u otras técnicas conocidas por los expertos en la técnica. Un anticuerpo o un fragmento de este se une específicamente a un FcyRIIB mientras se une a FcyRIIB con una afinidad más alta que a cualquier antígeno de reacción cruzada, como se determinó usando técnicas experimentales, tales como transferencias por western, radioinmunoensayos (RIA) y ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA). Ver, por ejemplo, Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Segunda Edición, Raven Press, Nueva York en las páginas 332-336 para una discusión sobre la especificidad de los anticuerpos.
Como se usa en la presente, el término "FcγRIIB nativo" se refiere a FcγRIIB el cual se expresa de forma endógena y está presente en la superficie de una célula. En algunas modalidades "FcγRIIB nativo" abarca una proteína que se expresa de forma recombinante en una célula de mamífero. Preferentemente, el FcγRIIB nativo no se expresa en una célula bacteriana, es decir, E. coli. Con la máxima preferencia el FcγRIIB nativo no está desnaturalizado, es decir, está en su conformación biológicamente activa.
Como se usa en la presente, el término "endógeno" en el contexto de una proteína celular se refiere a la proteína de origen natural y/o expresada por la célula en ausencia de manipulación recombinante; como consecuencia, los términos "proteína expresada de forma endógena" o "proteína endógena" excluye las proteínas celulares expresadas por medio de tecnología recombinante.
Como se usa en la presente, los términos "anticuerpo" y "anticuerpos" se refieren a anticuerpos monoclonales, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos sintéticos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos camelizados, Fv de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs unidos por puentes disulfuro (sdFv), intracuerpos y anticuerpos anti-idiotípicos (anti-Id) (que incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-Id y anti-anti-Id para los anticuerpos de la invención) y fragmentos de unión a epítopo de cualquiera de los anteriores. Particularmente, los anticuerpos incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA y IgY), clases (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.
A menos que se indique de cualquier otra forma, cuando se refieren a los anticuerpos (como se define en general en la presente), la referencia a dominios de anticuerpos y/o posiciones de aminoácido dentro de anticuerpos, o fragmentos de estos, está de acuerdo con la definición y asignación de aminoácidos a cada dominio en Kabat y otros, SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5ta Edición Servicio Público de Salud (Instituto Nacional de salud, Bethesda, Maryland, 1987 y 1991). Los aminoácidos de las regiones variables de las cadenas pesada y ligera maduras de inmunoglobulinas se designan por la posición de un aminoácido en la cadena. Kabat describe numerosas secuencias de aminoácidos para los anticuerpos, una secuencia consenso de aminoácidos identificada para cada subgrupo, y se les asigna un número al residuo para cada aminoácido. El esquema de numeración de Kabat es extensible a los anticuerpos no incluidos en su compendio alineando el anticuerpo en cuestión con una de las secuencias consenso en Kabat como referencia a los aminoácidos conservados. Este método para asignar los números al residuo se ha convertido en estándar en el campo y fácilmente identifica los aminoácidos en las posiciones equivalentes en diferentes anticuerpos, que incluyen variantes quiméricos o humanizados. Por ejemplo, un aminoácido en la posición 50 de una cadena ligera de anticuerpo humano ocupa la posición equivalente a un amino ácido en la posición 50 de una cadena ligera del anticuerpo de ratón. Así, como se usa en la presente en el contexto de los anticuerpos humanizados, una referencia tal como "en la posición 297 de la región Fc" se refiere a la posición del aminoácido en una cadena de inmunoglobulina, región de una cadena de inmunoglobulina, o región de un polipéptido derivado de una cadena de inmunoglobulina, correspondiente a la posición 297 de la inmunoglobulina humana correspondiente.
Como se usa en la presente, los términos "malignidades de células B" y "malignidad de células B" se refiere a cualquier trastorno linfoproliferativo de células B. Las malignidades de células B incluyen los tumores de origen de células B. Las malignidades de células B incluyen, pero sin limitarse a, linfomas, leucemias linfocíticas crónicas, leucemias linfoblásticas agudas, mieloma múltiple, enfermedad de Hodgkin y de no Hodgkin, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular con áreas de linfoma difuso de células B grandes, linfoma linfocítico pequeño, linfoma de células del manto, y linfoma difuso de células pequeñas hendidas.
Como se usa en la presente, el término "derivado" en el contexto de un polipéptido o proteína, por ejemplo un anticuerpo, se refiere a un polipéptido o proteína que comprende una secuencia de aminoácido que se ha alterado por la introducción de sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos. El término "derivado" como se usa en la presente se refiere además a un polipéptido o proteína que se ha modificado, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de
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molécula al anticuerpo. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, un polipéptido o proteína se puede modificar, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína, etc. Un polipéptido o proteína derivado se puede producir por modificaciones químicas usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica que incluyen, pero sin limitarse a escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un polipéptido o proteína derivado posee una función similar o idéntica a la del polipéptido o proteína a partir de la que se derivó.
El término "derivado", como se usa en la presente en el contexto de un anticuerpo de FcγRIIB se refiere a un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de FcγRIIB o un fragmento de anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de FcγRIIB, que ha sido alterado por la introducción de uno o más sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácido (es decir, mutaciones) en una o más regiones/dominios del anticuerpo (por ejemplo, CDRs, región Fc, región bisagra, regiones marco). El derivado de anticuerpo puede tener sustancialmente la misma unión, mejor unión, o peor unión cuando se compara con el anticuerpo no derivado. En modalidades específicas, uno, dos, tres, cuatro, o cinco residuos de aminoácidos de la CDR y/o región Fc se sustituyen, eliminan o añaden (es decir, mutan). El término "derivado" como se usa en la presente junto con FcγRIIB se refiere además con un anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de FcγRIIB, o un fragmento de anticuerpo que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de FcγRIIB que ha sido modificado, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al polipéptido. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, se puede modificar por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína. Un anticuerpo derivado o fragmento de anticuerpo se pueden modificar por modificaciones químicas usando técnicas conocidas por los expertos en la técnica que incluyen, pero sin limitarse a escisión química específica, acetilación, formulación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, un derivado de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo puede contener uno o más aminoácidos no clásicos. En una modalidad, un anticuerpo derivado posee una función similar o idéntica como el anticuerpo parental. En otra modalidad, un derivado de un anticuerpo, o fragmento de anticuerpo tiene una actividad alterada cuando se compara con un anticuerpo inalterado. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento de este se puede unir a su epítopo más fuertemente o ser más resistentes a la proteólisis.
Como se usan en la presente, los términos "trastorno" y "enfermedad" se usan de manera intercambiable para referirse a una afección en un sujeto. Particularmente, el término "enfermedad autoinmunitaria" se usa de manera intercambiable con el término "trastorno autoinmunitario" para referirse a una afección en un sujeto caracterizada por una lesión celular, tisular y/o de órgano provocada por una reacción inmunológica del sujeto frente a sus propias células, tejidos y/o órganos. El término "enfermedad inflamatoria" se usa de manera intercambiable con el término "trastorno inflamatorio" para referirse a una afección en un sujeto caracterizada por la inflamación, preferentemente inflamación crónica. Los trastornos autoinmunitarios pueden o no estar asociados con la inflamación. Además, la inflamación puede o no ser provocada por un trastorno autoinmunitario. Así, ciertos trastornos se pueden caracterizar como ambos trastornos autoinmunitarios e inflamatorios.
Como se usa en la presente, el término "cáncer" se refiere a una neoplasia o un tumor resultante de un crecimiento no controlado anormal de células. Como se usa en la presente, el cáncer incluye explícitamente, leucemias y linfomas. El término "cáncer" se refiere a una enfermedad que implica las células que tienen el potencial de producir metástasis en sitios distales y exhiben rasgos fenotípicos que difieren de las células no cancerosas, por ejemplo, formación de colonias en el sustrato tridimensional tal como agar blando o la formación de redes tubulares o matrices de banda continua en una membrana basal tridimensional o preparación de matriz extracelular. Las células no cancerosas no forman colonias en agar blando y forman distintas estructuras de tipo esfera en la membrana basal tridimensional o preparaciones de matriz extracelular. Las células cancerosas adquieren el conjunto característico de capacidades funcionales durante su desarrollo, aunque a través de diversos mecanismos. Tales capacidades incluyen evadir la apoptosis, autosuficiencia en las señales de crecimiento, insensibilidad a las señales anti-crecimiento, invasión/metástasis de tejidos, potencial ilimitado explicativo, y angiogénesis sostenida. El término "célula cancerosa" denota abarcar tanto las células cancerosas pre-malignas como malignas. En algunas modalidades, cáncer se refiere a un tumor benigno, que ha permanecido localizado. En otras modalidades, el cáncer se refiere a un tumor maligno, que ha invadido y destruido estructuras vecinas del cuerpo y propagado a sitios distantes. En otras modalidades, el cáncer se asocia con un antígeno específico de cáncer.
Como se usa en la presente, el término "agente inmunomodulador " y variaciones de estos que incluyen, pero sin limitarse a, agentes inmunomoduladores, se refieren a un agente que modula el sistema inmunológico de un huésped. En ciertas modalidades, un agente inmunomodulador es un agente inmunosupresor. En otras ciertas modalidades, un agente inmunomodulador es un agente inmunoestimulador. Los agentes inmunoestimuladores incluyen, pero sin limitarse a, moléculas pequeñas, péptidos, polipéptidos, proteínas de fusión, anticuerpos, moléculas inorgánicas, agentes miméticos, y moléculas orgánicas.
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Como se usa en la presente, el término "epítopo" se refiere a un fragmento de una proteína o polipéptido que tiene actividad antigénica o inmunogénica en un animal, preferentemente en un mamífero, y con la máxima preferencia en un humano. Un epítopo que tiene actividad inmunogénica es un fragmento de un polipéptido o proteína que provoca una respuesta de anticuerpo en un animal. Un epítopo que tiene actividad antigénica es un fragmento de un polipéptido o proteína al cual un anticuerpo se une inmunoespecíficamente como se determinó por cualquier método bien conocido por un experto en la técnica, por ejemplo, por inmunoensayos. Los epítopos antigénicos no necesitan necesariamente ser inmunogénicos.
Como se usa en la presente, el termino "fragmento" se refiere a un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 5 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 10 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 15 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 20 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 25 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 40 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 50 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 60 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 70 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 80 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 90 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 100 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 125 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 150 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 175 residuos de aminoácidos contiguos, al menos 200 residuos de aminoácidos contiguos, o al menos 250 residuos de aminoácidos contiguos de la secuencia de aminoácido de otro polipéptido. En una modalidad específica, un fragmento de un polipéptido mantiene al menos una función del polipéptido. Preferentemente, los fragmentos de anticuerpos son fragmentos de unión a epítopo.
Como se usa en la presente, el término "anticuerpo humanizado" se refiere a una inmunoglobulina que comprende la región marco humana y una o más CDR de una inmunoglobulina no humana (por lo general un ratón o rata). La inmunoglobulina no humana que proporciona las CDR se llama el "donador" y la inmunoglobulina humana que proporciona el marco se llama el "aceptor". Las regiones constantes no necesitan estar presentes, pero si lo están, deben ser sustancialmente idénticas a las regiones constantes de inmunoglobulina humana, es decir, al menos aproximadamente 85-90%, preferentemente aproximadamente 95% o más idénticos. Por lo tanto, todas las partes de una inmunoglobulina humanizada, excepto posiblemente las CDR, son sustancialmente idénticas a las partes correspondientes de las secuencias de inmunoglobulina humana natural. Un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que comprende una inmunoglobulina con una cadena ligera humanizada y una cadena pesada humanizada. Por ejemplo, un anticuerpo humanizado podría no abarcar un anticuerpo quimérico típico, ya que, por ejemplo, toda la región variable de un anticuerpo quimérico no es humana. El término "humanización" se refiere al proceso de creación del anticuerpo humanizado. Se espera unir el anticuerpo humanizado resultante al mismo antígeno como el anticuerpo donador que proporciona las CDR. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de la región hipervariable del receptor se sustituyen por los residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador), tales como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseada. En algunos casos, los residuos de la Región Marco (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todas o sustancialmente todas las regiones hipervariables corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas de las FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente comprenderá además al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente esa de una inmunoglobulina humana que se une inmunoespecíficamente a un polipéptido de FcγRIIB, que ha sido alterado por la introducción de sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos (es decir, mutaciones). En algunas modalidades, el anticuerpo humanizado es un derivado. Un anticuerpo humanizado de ese tipo comprende sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos en una o más CDR no humanas. El derivado de anticuerpo humanizado puede tener sustancialmente la misma unión, mejor unión, o peor unión cuando se compara con el anticuerpo humanizado no derivado. En modalidades específicas, uno, dos, tres, cuatro, o cinco residuos de aminoácidos de la CDR se han sustituido, delecionado o añadido (es decir, mutado). Para detalles adicionales de los anticuerpos humanizantes, ver las patentes europeas núms. EP 239,400, EP 592,106, y EP 519,596; las publicaciones internacionales núms. WO 91/09967 y WO 93/17105; las patentes de Estados Unidos núms. 5,225,539, 5,530,101, 5,565,332, 5,585,089, 5,766,886, y 6,407,213; y Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka y otros, 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; Roguska y otros, 1994, PNAS 91:969-973; Tan y otros, 2002, J. Immunol. 169:1119-25; Caldas y otros, 2000, Protein Eng. 13:353-60; Morea y otros, 2000, Methods 20:267-79; Baca y otros, 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84; Roguska y otros, 1996, Protein Eng. 9:895-904; Couto y otros, 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s; Couto y otros, 1995, Cancer Res. 55:1717-22; Sandhu, 1994, Gene 150:409-10; Pedersen y otros, 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73; Jones y otros, 1986, Nature 321:522-525; Reichmann y otros, 1988, Nature 332:323-329; y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596.
Como se usa en la presente, el término "región hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que
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son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (es decir, residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada de acuerdo con Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o los residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia y Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917. "Región Marco" o residuos "FR" son los residuos del dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable como se define en la presente.
Como se usa en la presente, los términos "Fv de cadena sencilla" o "scFv" se refieren a los fragmentos de anticuerpo que comprende los dominios VH y VL del anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una cadena polipeptídica sencilla. Generalmente, el polipéptido de Fv comprende además un polipéptido enlazador entre los dominios VH y VL que permite que el scFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds. Springer-Verlag, Nueva York, págs. 269-315 (1994); incorporada en la presente como referencia en su totalidad. En modalidades específicas, scFvs incluye scFvs biespecíficos y scFvs humanizados.
Como se usa en la presente, los términos "ácidos nucleicos" y "secuencia de nucleótidos" incluyen moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genónimo), moléculas ARN (por ejemplo, ARNm), combinaciones de moléculas de ADN y ARN o moléculas de ADN/ARN híbrido, y análogos de moléculas ADN o ARN. Tales análogos se pueden generar usando, por ejemplo, análogos de nucleótidos, que incluyen, pero sin limitarse a, inosina o bases tritiladas. Tales análogos pueden comprender además moléculas de ADN o ARN que comprenden cadenas principales modificadas que proporcionan atributos beneficiosos para las moléculas tales como, por ejemplo, resistencia a nucleasa o una capacidad aumentada para atravesar membranas celulares. Las secuencia de nucleótidos o ácidos nucleicos pueden ser de cadena sencilla, de cadena doble, puede contener tanto cadena sencilla como porciones de cadena doble, y puede contener porciones de cadena triple, pero preferentemente es ADN de cadena doble.
Como se usa en la presente, los términos "sujeto" y "paciente" se usan de manera intercambiable. Como se usa en la presente, el sujeto es preferentemente un mamífero, tal como un no-primate (por ejemplo, vacas, cerdos, caballos, gatos, perros, ratas, etc.) y un primate (por ejemplo, mono y humano), con la máxima preferencia un humano.
Como se usa en la presente, los términos "trata", "tratar" y "tratamiento" se refieren a la erradicación, reducción o mejora de los síntomas de una enfermedad o trastorno relacionado con la pérdida de la regulación de la vía de señalización del receptor Fc o para mejorar la eficacia terapéutica de otra terapia, por ejemplo, un anticuerpo terapéutico, terapia con vacuna
o profilaxis. En algunas modalidades "tratamiento se refiere a a erradicación, eliminación, modificación, o el control de tejido de cáncer primario, regional o metastásico que resulta de la administración de uno o más agentes terapéuticos. En ciertas modalidades, dichos términos se refieren a la minimización o retraso de la propagación del cáncer resultante de la administración de uno o más agentes terapéuticos a un sujeto con una enfermedad de ese tipo. En otras modalidades, tales términos se refieren a la eliminación de las células causantes de enfermedades.
Como se usa en la presente, la frase "efectos secundarios" abarca efectos no deseados y adversos de un agente profiláctico
o terapéutico. Los efectos adversos son siempre efectos no deseados, pero los efectos no deseados no son necesariamente efectos adversos. Un efecto adverso de un agente profiláctico o terapéutico podría ser dañino o incómodo o riesgoso. Los efectos secundarios de la quimioterapia incluyen, pero sin limitarse a, toxicidad gastrointestinal tales como, pero sin limitarse a, diarrea y flatulencia de formación tarde y temprano, náusea, vómito, anorexia, leucopenia, anemia, neutropenia, astenia, retortijón abdominal, fiebre, dolor, pérdida de peso, deshidratación, alopecia, disnea, insomnio, mareos, mucositis, xerostomía e insuficiencia renal, así como estreñimiento, efectos en nervios y músculos, daño temporal o permanente a los riñones y vejiga, síntomas parecidos a la gripe, retención de líquido, e infertilidad temporal o permanente. Los efectos secundarios de la radioterapia incluyen pero no sin limitarse a la fatiga, sequedad de boca, y pérdida de apetito. Los efectos secundarios de las terapias biológicas/inmunoterapias incluyen, pero sin limitarse a erupciones o hinchazón en el sitio de administración, síntomas parecidos a la gripe, como fiebre, escalofríos y fatiga, problemas del tracto digestivo y reacciones alérgicas. Los efectos secundarios de las terapias hormonales incluyen pero sin limitarse a náuseas, problemas de fertilidad, depresión, pérdida de apetito, problemas en los ojos, dolor de cabeza, y fluctuación del peso. Efectos indeseados adicionales típicamente experimentados por los pacientes son numerosos y conocidos en la técnica, ver, por ejemplo, el Physicians' Desk Reference (56.o ed., 2002).
Como se usa en la presente, una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad del agente terapéutico suficiente para tratar o manejar una enfermedad o trastorno asociado con FcyRIIB y cualquier enfermedad relacionada con la pérdida de regulación en la vía de señalización del receptor Fc o para mejorar la eficacia terapéutica de otra terapia, por ejemplo, anticuerpo terapéutico, terapia con vacuna, o profilaxis etc. Una cantidad terapéuticamente eficaz se puede referir a
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la cantidad de agente terapéutico suficiente para retardar o minimizar la aparición de la enfermedad, por ejemplo, retardar o minimizar la propagación del cáncer. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede referirse además a la cantidad del agente terapéutico que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o el manejo de una enfermedad. Además, una cantidad terapéuticamente eficaz con respecto a un agente terapéutico de la invención significa la cantidad de agente terapéutico solo, o en conjunto con otras terapias, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o el manejo de una enfermedad, por ejemplo, suficiente para mejorar la eficacia terapéutica de un anticuerpo terapéutico suficiente para tratar o manejar una enfermedad. Usado en conexión con una cantidad de anticuerpo de FcyRIIB de la invención, el término puede abarcar una cantidad que mejora el tratamiento en general, reduce o evita efectos no deseados o mejora la eficacia terapéutica de o hace sinergia con otro agente terapéutico.
Como se usan en la presente, los términos "agente profiláctico" y "agentes profilácticos" se refieren a cualquier agente(s) que se puede(n) usar en la prevención de un trastorno, o prevención de recurrencia o la propagación de un trastorno. Una cantidad profilácticamente eficaz se puede referir a la cantidad de agente profiláctico suficiente para evitar la recurrencia o propagación de la enfermedad hiperproliferativa, particularmente cáncer, o la aparición de ella en un paciente, que incluyen, pero sin limitarse a los predispuestos a enfermedad hiperproliferativa, por ejemplo, los genéticamente predispuestos al cáncer o expuestos anteriormente a carcinógenos. Una cantidad profilácticamente eficaz se puede referir además a la cantidad del agente profiláctico que proporciona un beneficio profiláctico en la prevención de la enfermedad. Además, una cantidad profilácticamente eficaz con respecto a un agente profiláctico de la invención significa la cantidad de agente profiláctico solo, o en conjunto con otros agentes, que proporciona un beneficio para evitar la enfermedad. Usado en conexión con una cantidad de un anticuerpo de FcyRIIB de la invención, el término puede abarcar una cantidad que mejora la profilaxis en general o mejora la eficacia profiláctica de o hace sinergia con otro agente profiláctico, tal como, pero sin limitarse a un anticuerpo terapéutico. En ciertas modalidades, el término "agente profiláctico" se refiere a un anticuerpo agonista específico a FcγRIIB. En otras modalidades, el término "agente profiláctico" se refiere a un anticuerpo antagonista específico a FcγRIIB. En otras ciertas modalidades, el término "agente profiláctico" se refiere a la quimioterapéuticos del cáncer, radioterapia, terapia hormonal, terapia biológica (por ejemplo, inmunoterapia), y/o anticuerpos de FcγRIIB de la invención. En otras modalidades, más de un agente profiláctico se pueden administrar en conjunto.
Como se usa en la presente, los términos "manejar", "manejando" y "manejo" se refieren a los efectos beneficiosos que un sujeto deriva de la administración de un agente profiláctico o terapéutico, que no resulta en una cura de la enfermedad. En ciertas modalidades, a un sujeto se administra uno o más agentes profilácticos o terapéuticos para "manejar" una enfermedad para evitar la progresión o empeoramiento de la enfermedad.
Como se usa en la presente, los términos "evitar", "evitando" y "prevención" se refieren a la prevención de la ocurrencia y/o recurrencia o aparición de uno o más síntomas de un trastorno en un sujeto resultante de la administración de un agente profiláctico o terapéutico.
Como se usa en la presente, el término "en conjunto" se refiere al uso de más de un agentes profiláctico y/o terapéutico. El uso del término "en conjunto" no restringe el orden en el que los agentes profilácticos y/o terapéuticos se administran a un sujeto con un trastorno, por ejemplo, trastorno celular hiperproliferativo, especialmente cáncer. Un primer agente profiláctico
o terapéutico puede administrase antes de (por ejemplo, 1 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas antes), conjuntamente con, o posteriormente a (por ejemplo, 1 minuto, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, o 12 semanas después) la administración de un segundo agente profiláctico o terapéutico a un sujeto que tuvo, tiene, o es susceptible a un trastorno. Los agentes profilácticos o terapéuticos se administran a un sujeto en una secuencia y dentro de un intervalo de tiempo tal que el agente de la invención puede actuar junto con el otro agente para proporcionar un beneficio aumentado que si se administran de cualquier otra forma. Cualquier agente profiláctico o terapéutico adicional se puede administrar en cualquier orden con otros agentes profilácticos o terapéuticos adicionales.
5. Breve descripción de las figuras
Figuras 1A y B. A. ALINEACIONES DE AMINOÁCIDOS. La alineación de las secuencias de aminoácidos de 2B6 VH de ratón, 2B6 VH-1 humanizado, VH1-18 y JH6 humana se muestra en la Figura 1A. B. ALINEACIONES DE AMINOÁCIDOS. Esta figura muestra la alineación de las secuencias aminoácidos de 2B6 VL murino, 2B6 VL-1 humano, 2B6 VL-2 humano; 2B6 VL-3 humano, y Jκ4 humano. Figura 2A y 2B A. ALINEACIONES DE AMINOÁCIDOS. La alineación de las secuencias de aminoácidos de 2B6 VH-1 humanizado y 2B6 VH 3 humanizado (sec. con núm. de ident.: 68) se muestra en la Figura. 2A. B. ALINEACIONES DE AMINOÁCIDOS. Esta figura muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de 2B6 VL-1, 2B6 VL-2, 2B6 VL-3, y
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2B6 VL-5 humanizado (sec. con núm de ident: 62). Para las Figuras 2A y 2B, las CDR se indican por subrayado, y las diferencias en la secuencia de aminoácidos se indican por letra negrita. Figura 3. UNIÓN DE hu2B6HC/ch2B6LC mAb Y ch2B6 mAb A FcγRIIB. La unión a FcγRIIB-Fc dimérico soluble se determinó por ELISA. El anticuerpo monoclonal hu2B6HC/ch2B6LC se unió al receptor con una afinidad similar al anticuerpo monoclonal ch2B6. Figura 4. UNIÓN DE ch2B6 mAb, h2B6 (v3.5) mAb y h2B6 (v1.1) mAb a FcγRIIB. La unión a FcγRIIB-Fc dimérico soluble se determinó por ELISA. Un anticuerpo monoclonal hu2B6 (v3.5) se unió al receptor con una afinidad similar al anticuerpo monoclonal ch2B6. Anticuerpo Figura 5. UNIÓN DE hu2B6LC/ch2B6HC mAB, ch2B6LC/hu2B6HC, Y ch2B6 mAb A FcγRIIB. La unión a FcγRIIB-Fc dimérico soluble se determinó por ELISA. hu2B6HC/ch2B6LC mAb y ch2B6HC/hu2B6LC mAb se unieron al receptor con afinidad similar al ch2B6 mAb. Figura 6. UNIÓN DE VARIANTES DE hu2B6 A FcγRIIB. La unión de Hu2B6N50Y; Hu2B6N50Y, V51A; Ch2B6, y Hu2B6 a FcγRIIb-Fc dimérico soluble se determinó por ELISA. Todos los mAbs se unen al receptor con una afinidad similar. Figura 7. UNIÓN DE VARIANTES DE hu2B6 A FcγRIIA. La unión de Hu2B6N50Y; Hu2B6N50Y, V51A; Ch2B6 y Hu2B6 a FcγRIIa-Fc dimérico soluble se determinó por ELISA. Los 2B6 mAb humanizados se unen selectivamente a CD32B. Todos los puntos sólidos de los datos caen uno encima del otro y sólo se muestran como un cuadrado sólido.
Figuras 8A y 8B. ESTIMADO DEL PESO DE TUMOR EN RATONES TRATADOS CON h2B6 SILVESTRE o MUTANTE Fc. Ratones desnudos Balb/c se inocularon por vía subcutánea con células Daudi y administraron dosis de 25 µg, 2.5 µg o 0.25 µg semanalmente ya sea de h2B6 silvestre (A) o a una variante h2B6 que comprende un dominio Fc con una leucina en la posición 243, una prolina en la posición 292, una leucina en la posición 300, una isoleucina en la posición 305, y una leucina en la posición 396; (B). Los ratones administrados con tampón solo se usaron como control. Se calculó el peso del tumor basado en el volumen estimado del tumor subcutáneo de acuerdo con la fórmula (ancho2 X longitud)/2.
Figuras 9A y 9B. SUPERVIVENCIA EN RATONES PORTADORES DE TUMOR TRATADOS CON h2B6 SILVESTRE
o MUTANTE Fc. Ratones desnudos se inocularon con células Daudi y administraron con dosis de 25 µg, 2.5 µg o 0.25 µg, semanalmente ya sea de h2B6 silvestre (A) o una variante h2B6 que comprende un dominio Fc con 243L, 292P, 300L, 305I, y 396L; (B). Los ratones administrados con tampón solo se usaron como control.
6. Descripción de las modalidades preferidas
6.1 Anticuerpos específicos a FcγRIIB
La presente invención abarca anticuerpos humanizados (preferentemente anticuerpos monoclonales humanizados) o fragmentos de estos que se unen específicamente a FcγRIIB, preferentemente FcγRIIB humano, con mayor preferencia FcγRIIB humano nativo con una afinidad mayor que con la que dichos anticuerpos o fragmentos de estos se unen a FcγRIIA, preferentemente FcγRIIA humano, con mayor preferencia FcγRIIA humano nativo. Preferentemente, los anticuerpos humanizados de la invención se unen al dominio extracelular de FcγRIIB humano nativo. En ciertas modalidades, los anticuerpos humanizados o fragmentos de estos se unen a FcγRIIB con una afinidad mayor de dos veces, cuatro veces, 6 veces, 10 veces, 20 veces, 50 veces, 100 veces, 1000 veces, 104 veces, 105 veces, 106 veces, 107 veces, o 108 veces que con la que dichos anticuerpos o fragmentos de estos se unen a FcγRIIA. En una modalidad particular, el anticuerpo humanizado de la invención se deriva de un anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 2B6, con el número de acceso ATCC PTA-4591. Los anticuerpos humanizados descritos en la presente se pueden derivar de un anticuerpo monoclonal de ratón producido por el clon 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2, con números de acceso ATCC PTA5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente. Los hibridomas que producen los anticuerpos 2B6 y 3H7 se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipo (10801 Universidad Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209) el 13 de agosto de 2002 bajo las disposiciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimientos de Patentes, y se les asignó los números de acceso PTA-4591 (para el hibridoma que produce 2B6) y PTA-4592 (para el hibridoma que produce 3H7), respectivamente. Los hibridomas que producen 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, y 1F2 se depositaron bajo las disposiciones del Tratado de Budapest en la Colección Americana de Cultivos Tipo (10.801 Universidad Blvd., Manassas, Virginia. 20110-2209) el 7 de mayo de 2004, y se les asignó los números de acceso PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959.
Todavía en otras modalidades, la invención abarca anticuerpos humanizados de FcγRIIB que se unen exclusivamente a FcγRIIB y no tienen afinidad por FcγRIIA usando métodos estándar conocidos en la técnica y descritos en la presente.
Se describe en la presente un anticuerpo humanizado, que comprenden las CDR de 2B6 o de 3H7. Particularmente, un anticuerpo humanizado con el dominio variable de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 24, sec. con núm. de ident.:60 o sec. con núm. de ident.:68 y el dominio variable de cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 18, sec. con núm. de ident.: 20, sec. con núm. de ident.: 22, sec. con núm. de ident.: 62. En un caso específico, un anticuerpo humanizado con el dominio variable de cadena pesada con la secuencia de
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aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 37 y el dominio variable de cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 46. La invención abarca un anticuerpo humanizado con el dominio variable de cadena pesada con la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:68 y el dominio variable de cadena ligera con la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:62. Todavía en otra modalidad preferida, los anticuerpos humanizados de la invención además no se unen a los receptores de activación Fc, por ejemplo, FcγIIIA, FcγIIIB, etc.En una modalidad, el anticuerpo humanizado específico a FcγRIIB de acuerdo con la invención no se deriva del anticuerpo monoclonal denominado KB61, como se describe en Pulford y otros, 1986 (Immunology, 57: 71-76) o el anticuerpo monoclonal designado MAbII8D2 como se describe en Weinrich y otros, 1996, (Hybridoma, 15(2):109-6). En una modalidad específica, el anticuerpo específico a FcγRIIB de la invención no se une al mismo epítopo y/o no compite con la unión con el anticuerpo monoclonal KB61 o II8D2. Preferentemente, los anticuerpos humanizados específicos a FcγRIIB de la invención no se unen a la secuencia de aminoácidos SDPNFSI correspondiente a las posiciones 135-141 de la isoforma FcγRIIb2.
Los dominios constantes de los anticuerpos humanizados de la invención se pueden seleccionar con respecto a la función propuesta del anticuerpo, particularmente con respecto a la función efectora que se pueda requerir. En algunas modalidades, los dominios constantes de los anticuerpos humanizados de la invención son los dominios de IgA , IgE, IgG o IgM humana. En una modalidad específica, se usan los dominios constantes de IgG humana, especialmente de los isotipos IgG1 e IgG3, especialmente cuando los anticuerpos humanizados de la invención se pretenden para usos terapéuticos y se necesitan funciones efectoras de anticuerpos. En modalidades alternativas, se usan isotipos IgG2 e IgG4 cuando el anticuerpo humanizado de la invención se pretende para propósitos terapéuticos y no se requiere la función efectora del anticuerpo. En otras modalidades, la invención abarca anticuerpos humanizados que comprenden una o más modificaciones de aminoácido en la región Fc tal como las descritas en las publicaciones internacionales núms. WO 04/063351, WO 04/029207, WO 04/029092, WO 04/028564, WO 99/58572, WO 99/51642, WO 98/23289. WO 89107142, WO 88/07089; publicaciones de las solicitudes de patente de Estados Unidos núms. 2005/0037000; y 2005/0064514 y las solicitudes de patente de Estados Unidos núms. 5,843,597 y 5,642,821; las solicitudes de patente de Estados Unidos núms. 10/902,588 (US 20050064514) (presentada el 28 de julio de 2004) y 11/271,140 (US 20060134709) (presentada el 10 de noviembre de 2005); las solicitudes de patente de Estados Unidos núms. WO 2007/021 841 60/707,419 y WO 2007/106 7017 y las solicitudes de patente de Estados Unidos núms. 5,6251,821 y 5,648,260 y la patente europea núm. EP 0 307 434. En una modalidad específica, la modificación de aminoácido de las regiones Fc de los anticuerpos humanizados de la invención con respecto a la región Fc silvestre comprende una sustitución en la posición 243, 292, 300, 305 y 396. En una modalidad preferida, la modificación de aminoácidos de las regiones Fc de los anticuerpos humanizados de la invención con respecto a la región Fc silvestre comprende una sustitución en la posición 243 con leucina, en la posición 292 con prolina, en la posición 300 con leucina, en la posición 305 con isoleucina y en la posición 396 con leucina.
Preferentemente, los anticuerpos humanizados de la invención se unen al dominio extracelular de FcγRIIB humano nativo que se expresa endógenamente en la superficie de la célula. Los anticuerpos anti-FcγRIIB humanizados descritos en la presente pueden tener una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de una CDR1 (por ejemplo, sec. con núm. de ident.:1, sec. con núm. de ident.:29, una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 31-35 como se expone en la sec. con núm. de ident.:60, o una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 31-35 como se expone en la sec. con núm. de ident.:68) y/o una CDR2 (por ejemplo, sec. con núm. de ident.:2, sec. con núm. de ident.:30, una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 50-66 como se expone en la sec. con núm. de ident.:60, o una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 50-66 como se expone en la sec. con núm. de ident.:68) y/o una CDR3 (por ejemplo, sec. con núm. de ident.:3, sec. con núm. de ident.:31, una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 99-110 como se expone en la sec. con núm. de ident.:60, o una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 99-110 como se expone en la sec. con núm. de ident.:68) y/o una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de una CDR1 (por ejemplo, sec. con núm. de ident.:8, sec. con núm. de ident.:38, o una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 24-34 como se expone en la sec. con núm. de ident.:62) y/o una CDR2 (por ejemplo, sec. con núm. de ident.:9, sec. con núm. de ident.:10, sec. con núm. de ident.:11, sec. con núm. de ident.:39, o una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 50-56 como se expone en la sec. con núm. de ident.:62) y/o una CDR3 (por ejemplo, sec. con núm. de ident.:12, sec. con núm. de ident.:40, o una secuencia de aminoácidos correspondiente a los aminoácidos 90-98 como se expone en la sec. con núm. de ident.:62).
Se describe en la presente un anticuerpo humanizado 2B6, en donde la región VH consiste de los segmentos FR del segmento VH1-18 de VH de la línea germinal humana (Matsuda y otros, 1998, J. Exp. Med 188:2151062) y JH6 (Ravetch y otros, 1981, Cell 27(3 Pt. 2): 583-91), y una o más regiones CDR de 2B6 VH, con la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 1, sec. con núm. de ident.: 2, o sec. con núm. de ident.: 3. El 2B6 VH puede tener la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 24, sec. con núm. de ident.:60, o sec. con núm. de ident.:68. El anticuerpo 2B6 humanizado puede comprender además una región VL, que consiste de los segmentos FR del segmento VK-A26 de VL de la línea germinal humana (Lautner-Rieske y otros, 1992, Eur. J. Immunol. 22:1023-1029) y JK4 (Hieter y otros, 1982, J. Biol. Chem. 257:1516-22), y una o más regiones CDR de 2B6 VL, con la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 8,
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sec. con núm. de ident.: 9, sec. con núm. de ident.: 10, sec. con núm. de ident.: 11, y sec. con núm. de ident.: 12. En un caso, 2B6 VL tiene la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.: 18; sec. con núm. de ident.: 20, sec. con núm. de ident.: 22, o sec. con núm. de ident.:62. El anticuerpo 2B6 de la invención comprende un VL que comprende la secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.:62 y un VH que comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:68.
Se describe además en la presente un anticuerpo humanizado 3H7, en donde la región VH consiste de los segmentos FR del segmento VH de la línea germinal humana y las regiones CDR de la 3H7 VH , con la secuencia de amino ácido de sec. con núm. de ident.: 37. En otra modalidad específica, el anticuerpo humanizado 3H7 comprende además regiones VL, que consisten de los segmentos FR de un segmento VL de la línea germinal humana y las regiones CDR de 3H7 VL con la secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.: 46.
Se describe en la presente un anticuerpo humanizado que se une inmunoespecíficamente al dominio extracelular del FcγRIIB humano nativo, dicho anticuerpo que comprende (o alternativamente, que consiste de) de las secuencias de CDR de 2B6 o 3H7, en cualquiera de las siguientes combinaciones: una VH CDR1 y una VL CDR1; una VH CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2 y una VL CDR1; VH CDR2 y VL CDR2; una VH CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR3 y una VH CDR1; una VH CDR3 y una VL CDR2; una VH CDR3 y una VL CDR3; una VH1 CDR1, una VH CDR2 y una VL CDR1; una VH CDR1, una VH CDR2 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR2; una VH CDR2, una VH CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR1; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR2 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR2; una VH CDR1, una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1 y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR2, una VL CDR1, una VL CDR2, y una VL CDR3; una VH CDR1, una VH CDR3, una VL CDR1, una VL CDR2, y una VL CDR3; una VH CDR2, una VH CDR3, una VL CDR1, una VL CDR2, y una VL CDR3; o cualquier combinación de éstas de las VH CDR y VL CDR descritas en la presente.
La presente invención proporciona moléculas de anticuerpo humanizado específico para FcγRIIB en la que una o más regiones de una o más CDR de las regiones variables de cadena pesada y/o cadena ligera de un anticuerpo humano (el anticuerpo receptor) se han sustituido por partes análogas de una o más CDR de un anticuerpo monoclonal donador que se une específicamente a FcγRIIB, con una afinidad mayor que FcγRIIA, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal producido por el clon 2B6 o 3H7, con números de acceso ATCC PTA-4591, y PTA-4592, respectivamente, o un anticuerpo monoclonal producido por el clon 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2, con números de acceso ATCC, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA5960, y PTA-5959, respectivamente. En otras modalidades, los anticuerpos humanizados de la invención se unen al mismo epítopo como 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2 . En una modalidad más preferida, el anticuerpo humanizado se une específicamente al mismo epítopo que el anticuerpo donador murino. Se apreciará por una persona con experiencia en la técnica que la invención abarca generalmente el injerto de CDR de anticuerpos. Así, los anticuerpos donador y aceptor se pueden derivar de animales de la misma especie e incluso de la misma clase o sub-clase de anticuerpo. Más usualmente, sin embargo, los anticuerpos donador y aceptor se derivan de animales de diferentes especies. Típicamente, el anticuerpo donador es un anticuerpo no humano, tal como un MAb de roedor, y el anticuerpo aceptor es un anticuerpo humano.
En algunos casos, al menos una CDR del anticuerpo donador se injerta en el anticuerpo humano. En otros casos, al menos dos y preferentemente las tres CDR de cada una de las regiones variables de cadena pesada y/o ligera se injertan en el anticuerpo humano. Las CDR pueden comprender las CDR de Kabat, bucle estructural de las CDR o una combinación de estos. En algunas modalidades, la invención abarca un anticuerpo humanizado de FcγRIIB que comprende al menos una cadena pesada injertada con CDR y al menos una cadena ligera injertada con CDR.
En una modalidad preferida, las regiones CDR del anticuerpo humanizado específico a FcγRIIB se derivan de un anticuerpo murino específico para FcγRIIB. En algunos casos, los anticuerpos humanizados descritos en la presente comprenden alteraciones, que incluyen pero sin limitarse a deleciones, inserciones, modificaciones de aminoácidos del anticuerpo aceptor, es decir, regiones marco del dominio variable de cadena ligera y/o pesada humana que son necesarias para mantener la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal donador. En algunas modalidades, las regiones marco de los anticuerpos humanizados descritos en la presente no necesariamente consisten de la secuencia de aminoácido precisa de la región marco de una región variable del anticuerpo humano de origen natural, pero contiene varias alteraciones, que incluyen pero sin limitarse a deleciones, inserciones, modificaciones de aminoácidos, que alteran la propiedad del anticuerpo
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humanizado, por ejemplo, mejoran las propiedades de unión de una región del anticuerpo humanizado que es específica para el mismo objetivo que el anticuerpo murino específico a FcγRIIB. En las modalidades más preferidas, se hacen un número mínimo de alteraciones a la región marco para evitar las introducciones a gran escala de residuos marco no humanos y para asegurar inmunogenicidad mínima del anticuerpo humanizado en los humanos. El anticuerpo monoclonal donador es preferentemente un anticuerpo monoclonal producido por los clones 2B6 y 3H7 (con números de acceso ATCC PTA-4591, y PTA-4592, respectivamente) que se unen a FcγRIIB o un anticuerpo monoclonal producido por el clon 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2 (con números de acceso ATCC, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente).
Se describen en la presente anticuerpo injertado con CDR que se une específicamente a FcγRIIB con una afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo se une a FcγRIIA, en donde el anticuerpo injertado con CDR comprende un dominio de la región variable de cadena pesada que comprende los residuos marco del anticuerpo receptor y residuos del anticuerpo monoclonal donador, que se une específicamente a FcγRIIB con una afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo se une a FcγRIIA, por ejemplo, anticuerpo monoclonal producido a partir de los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2. En un caso específico, el dominio variable de cadena pesada de los anticuerpos comprende la sec. con núm. de ident.:60. El dominio variable de cadena pesada de los anticuerpos de la invención comprende la secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.:68. En otras modalidades, la invención abarca un anticuerpo injertado con CDR que se une específicamente a FcγRDB con una afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo se une a FcγRIIA, en donde el anticuerpo injertado con CDR comprende un dominio de la región variable de cadena ligera que comprende residuos marco del anticuerpo receptor y residuos de anticuerpo monoclonal donador, que se une específicamente a FcγRIIB con una afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo se une a FcγRIIA, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal producido a partir de los clones 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2. El dominio variable de cadena ligera de los anticuerpos de la invención comprende la secuencia de aminoácidos sec. con núm. de ident.:62.
Un anticuerpo humanizado específico a FcγRIIB puede comprender sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donador) y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Preferentemente, un anticuerpo humanizado de la invención comprende además al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente esa de una inmunoglobulina humana. Los dominios constantes de los anticuerpos humanizados de la invención se pueden seleccionar con respecto a la función propuesta del anticuerpo, particularmente, la función efectora que se puede requerir. En algunas modalidades, los dominios constantes de los anticuerpos humanizados de la invención son dominios de IgA , IgE, IgG o IgM humana. En una modalidad específica, se usan los dominios constantes de IgG humana, especialmente de los isotipos IgG1 e IgG3, cuando los anticuerpos humanizados de la invención se pretenden para usos terapéuticos y se necesitan funciones efectoras de anticuerpos. En modalidades alternativas, se usan isotipos IgG2 e IgG4 cuando el anticuerpo humanizado de la invención se pretende para usos terapéuticos y no se requieren la función efectora del anticuerpo. La invención abarca dominios constantes Fc que comprenden una o más modificaciones aminoácidos que alteran las funciones efectoras de los anticuerpos tales como las descritas en las publicaciones de las solicitudes de patentes de Estados Unidos núms. 2005/0037000 y 2005/0064514; la publicación de solicitud de patente WO 2004/063351. En una modalidad específica, el anticuerpo de la invención comprende un dominio Fc con una leucina en posición 243, una prolina en la posición 292, una leucina en la posición 300, una isoleucina en la posición 305 y una leucina en la posición 396. En otra modalidad, el anticuerpo de la invención comprende la (s) modificación (es) de aminoácido (s) de la Fc región con respecto a la región Fc silvestre, modificación que comprende una sustitución en la posición 243, 292, 300, 305 y 396, preferentemente una sustitución en la posición 243 con leucina, en la posición 292 con prolina, en la posición 300 con leucina, en la posición 305 con isoleucina y en la posición 396 con leucina.
En algunas modalidades, el anticuerpo humanizado de la invención contiene tanto la cadena ligera, así como al menos el dominio variable de la cadena pesada. En otras modalidades, el anticuerpo humanizado de la invención puede comprender además uno o más de las regiones CH1, bisagra, CH2, CH3, y CH4 de la cadena pesada. El anticuerpo humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de inmunoglobulinas, que incluyen IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, y cualquier isotipo, que incluyen IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. En algunas modalidades, el dominio constante es un dominio constante de fijación al complemento donde se desea que el anticuerpo humanizado exhibe actividad citotóxica, y la clase es típicamente IgG1. En otras modalidades, cuando dicha actividad citotóxica no es deseable, el dominio constante puede ser de la clase IgG 2. El anticuerpo humanizado de la invención puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo, y seleccionar dominios constantes determinados particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas está dentro de la experiencia ordinaria en la técnica.
Las regiones marco y CDR de un anticuerpo humanizado no necesitan corresponder con precisión a las secuencias parentales por ejemplo, el CDR o el marco consenso del donador se pueden mutagenizar por sustitución, inserción o deleción de al menos un residuo de manera que el residuo del CDR o marco en el sitio no correspondan ya sea al consenso
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o al anticuerpo donador. Tales mutaciones, sin embargo, preferentemente no son extensas. Por lo general, al menos el 75% de los residuos del anticuerpo humanizado corresponderán a los de la región marco parental (FR) y las secuencias CDR, más frecuentemente 90%, y con la máxima preferencia mayor de 95%. Los anticuerpos humanizados se pueden producir usando variedad de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen, pero sin limitarse a, injerto de CDR (patente europea núm. EP 239,400; publicación internacional núm. WO 91/09967; y las patentes de Estados Unidos núms. 5,225,539, 5,530,101, y 5,585,089), recubrimiento o mejora de la superficie (patentes europeas núms. EP 592,106 y EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka y otros, 1994, Protein Engineering 7(6):805-814; y Roguska y otros, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91:969-973), intercambio de cadenas (patente de Estados Unidos núm. 5,565,332), y técnicas descritas en, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos núms. 6,407,213, 5,766,886, 5,585,089, publicación internacional núm. WO 9317105, Tan y otros, 2002, J. Immunol. 169:1119-25, Caldas y otros, 2000, Protein Eng. 13:353-60, Morea y otros, 2000, Methods 20:267-79, Baca y otros, 1997, J. Biol. Chem. 272:10678-84, Roguska y otros, 1996, Protein Eng. 9:895-904, Couto y otros, 1995, Cancer Res. 55 (23 Supp):5973s-5977s, Couto y otros, 1995, Cancer Res. 55:1717-22, Sandhu, 1994, Gene 150:409-10, Pedersen y otros, 1994, J. Mol. Biol. 235:959-73, Jones y otros, 1986, Nature 321:522-525, Riechmann y otros, 1988, Nature 332:323, y Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596. Frecuentemente, los residuos marco en las regiones marco serán sustituidos con el residuo correspondiente del anticuerpo donador de CDR para alterar, preferentemente mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones marco se identifican por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por el modelado de las interacciones de las CDR y los residuos marco para identificar los residuos marco importantes para la unión del antígeno y la comparación de secuencia para identificar los residuos marco inusuales en posiciones particulares. (Ver, por ejemplo, Queen y otros, la patente de Estados Unidos núm. 5,585,089; las publicaciones de Estados Unidos núms. 2004/0049014 y 2003/0229208; las patentes de Estados Unidos núms. 6,350,861; 6,180,370; 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089; y 5,530,101 y Riechmann y otros, 1988, Nature 332:323).
En una modalidad particular, los anticuerpos humanizados de la invención, o fragmentos de estos, agonizan al menos una actividad de FcγRIIB. En una modalidad de la invención, dicha actividad es la inhibición de la señalización mediada por el receptor de células B. En otra modalidad, los anticuerpos agonistas humanizados de la invención inhiben la activación de las células B, proliferación de células B, producción de anticuerpos, entrada de calcio intracelular de las células B, progresión del ciclo celular, o la actividad de una o más moléculas de señalización corriente abajo en la vía de transducción de la señal de FcγRIIB. Todavía en otra modalidad, los anticuerpos agonistas humanizados de la invención mejoran la fosforilación de FcγRIIB o el reclutamiento SHIP. En una modalidad adicional de la invención, los anticuerpos agonistas humanizados inhiben la actividad de la quinasa MAP o el reclutamiento Akt en la vía de señalización mediada por el receptor de la célula
B. En otra modalidad, los anticuerpos agonistas humanizados de la invención agonizan la inhibición mediada por FcγRIIB de la señalización de FcεRI. En una modalidad particular, dichos anticuerpos humanizados inhiben la activación de mastocitos inducida por el FcεRI, movilización de calcio, desgranulación, producción de citoquinas, o liberación de serotonina. En otra modalidad, los anticuerpos agonistas humanizados de la invención estimulan la fosforilación de FcγRIIB, estimulan el reclutamiento de SHIP, estimulan la fosforilación de SHIP, y su asociación con Shc, o inhiben la activación de los miembros de la familia MAP quinasa (por ejemplo, Erk1, Erk2, JNK, p38, etc.). En otra modalidad, los anticuerpos agonistas humanizados de la invención mejoran la fosforilación de la tirosina de p62dok y su asociación con SHIP y rasGAP. En otra modalidad, los anticuerpos agonistas humanizados de la invención inhiben la fagocitosis mediada por FcγR en monocitos o macrófagos.
En otra modalidad, los anticuerpos humanizados de la invención, o fragmentos de estos, antagonizan al menos una actividad de FcγRIIB. En una modalidad, dicha actividad es la activación de la señalización mediada por el receptor de células B. En una modalidad particular, los anticuerpos humanizados antagonistas de la invención mejoran la actividad de células B, proliferación de células B, producción de anticuerpos, entrada de calcio intracelular, o actividad de una o más moléculas de señalización corriente abajo en la vía de transducción de señal de FcγRIIB. Todavía en otra modalidad particular, los anticuerpos humanizados antagonistas de la invención disminuyen la fosforilación de FcγRIIB o el reclutamiento de SHIP. En una modalidad adicional de la invención, los anticuerpos humanizados antagonistas mejoran la actividad quinasa de MAP o el reclutamiento de Akt en la vía de señalización mediada por el receptor de células B. En otra modalidad, los anticuerpos humanizados antagonistas de la invención antagonizan la inhibición mediada por FcγRIIB de la señalización de FcεRI. En una modalidad particular, los anticuerpos humanizados antagonistas de la invención mejoran la activación de los mastocitos inducidos por FcεRI, movilización del calcio, desgranulación, producción de citoquinas, o liberación de serotonina. En otra modalidad, los anticuerpos humanizados antagonistas de la invención inhiben la fosforilación de FcγRIIB, inhiben el reclutamiento de SHIP, inhiben la fosforilación de SHIP y su asociación con Shc, mejoran la activación de los miembros de la familia MAP quinasa (por ejemplo, Erk1, Erk2, JNK, p38, etc.). Todavía en otra modalidad, los anticuerpos humanizados antagonistas de la invención inhiben la fosforilación de la tirosina de p62dok y su asociación con SHIP y rasGAP. En otra modalidad, los anticuerpos humanizados antagonistas de la invención mejoran la fagocitosis mediada por FcγR en monocitos o macrófagos. En otra modalidad, los anticuerpos humanizados antagonistas de la invención evitan la fagocitosis, depuración de partículas opsonizadas por los macrófagos esplénicos.
Los anticuerpos de la invención incluyen, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos sintéticos, anticuerpos
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producidos de forma recombinante, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos camelizados, Fvs de cadena sencilla (scFv), anticuerpos de cadena sencilla, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), y Fvs unidos por disulfuro (sdFv), intracuerpos, fragmentos de unión a epítopos de cualquiera de los anteriores. Particularmente, los anticuerpos usados en los métodos de la presente invención incluyen moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une inmunoespecíficamente a FcγRIIB con afinidad mayor que con la que dicha molécula de inmunoglobulina se une a FcγRIIA y/o se une inmunoespecíficamente a FcγRIIB y bloquea el dominio de unión a Fc de FcγRIIB. Los análogos de anticuerpos pueden incluir además receptores de células T específicos a FcγRIIB, por ejemplo, receptores de células T quiméricas (ver, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2004/0043401), un receptor de células T de cadena sencilla enlazada a un anticuerpo de cadena sencilla (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,534,633), y las proteínas andamios (ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 6,818,418). En ciertas modalidades, un anticuerpo análogo de la invención no es un anticuerpo monoclonal.
Los anticuerpos humanizados usados en los métodos de la invención pueden ser de cualquier origen animal, que incluyen aves y mamíferos (por ejemplo, humano, primate no humano, murino, burro, oveja, conejo, carnero, conejillo de indias, camello, caballo o pollo). Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales humanos o humanizados. Como se usa en la presente, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bibliotecas de inmunoglobulina humana o bibliotecas de secuencias codificantes de inmunoglobulina humana sintética o de ratones que expresan anticuerpos de genes humanos.
Los anticuerpos humanizados usados en los métodos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos o de mayor multiespecificidad. Los anticuerpos multiespecíficos se pueden unir inmunoespecíficamente a diferentes epítopos de FcγRIIB o se unen inmunoespecíficamente tanto a un epítopo de FcγRIIB, así como a un epítopo heterólogo, tal como un polipéptido heterólogo o material de soporte sólido. Ver, por ejemplo, las publicaciones internacionales núms. WO 93/17715, WO 92/08802, WO 91/00360, y WO 92/05793; Tutt, y otros, 1991, J. Immunol. 147:6069; las patentes de Estados Unidos núms. 4,474,893, 4,714,681, 4,925,648, 5,573,920, y 5,601,819; y Kostelny y otros, 1992, J. Immunol. 148:1547-1553; Todorovska y otros, 2001 Journal of Immunological Methods, 248:47-66. En modalidades particulares, los anticuerpos humanizados de la invención son multiespecíficos con especificidades para FcγRIIB y para un antígeno de cáncer o cualquier otro marcador de superficie celular específico para una célula (por ejemplo, una célula inmunitaria tal como una célula T o célula B), diseñado para que se muera, por ejemplo, para tratar o evitar una enfermedad
o trastorno en particular, o para otros receptores Fc, por ejemplo, FcγRIIIA, FcγRIIIB, etc.
Un anticuerpo usado en los métodos descritos en la presente puede ser un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno de este (por ejemplo, que comprende una o más regiones determinantes de complementariedad (CDRs), preferentemente todos los 6 CDRs) del anticuerpo producido por el clon 2B6, 3H7, 1D5, 2E1, 2H9, 2D11, o 1F2, con los números de acceso a la ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente (por ejemplo, CD3 de la cadena pesada). Un anticuerpo usado en los métodos descritos en la presente se pueden unir al mismo epítopo como el anticuerpo monoclonal de ratón producido a partir del clon 2B6, 3H7, ID5, 2E1, 2H9, 2D11, o IF2, con los números de acceso a la ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente y/o compite con el anticuerpo monoclonal de ratón producido a partir del clon 2B6, 3H7, ID5, 2E1, 2H9, 2D11, o IF2, con los números de acceso a la ATCC PTA-4591, PTA-4592, PTA-5958, PTA-5961, PTA-5962, PTA-5960, y PTA-5959, respectivamente como se determinó, por ejemplo, en un ensayo ELISA u otro inmunoensayo competitivo adecuado, y se une además a FcγRIIB con una afinidad mayor que con la que dicho anticuerpo o un fragmento de este se une a FcγRIIA.
Los anticuerpos humanizados de la invención incluyen derivados que se modifican, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo algo semejante a esa unión covalente. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados del anticuerpo incluyen anticuerpos que se han modificado, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína etc. Cualquiera de numerosas modificaciones químicas se pueden llevar a cabo por técnicas conocidas que incluyen, pero sin limitarse a escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica de tunicamicina, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Para algunos usos, que incluyen el uso in vivo de anticuerpos humanizados en humanos y ensayos de detección in vitro, puede ser preferible usar anticuerpos humanos, quiméricos, o humanizados. Los anticuerpos completamente humanos son particularmente deseables para el tratamiento terapéutico de los sujetos humanos. Los anticuerpos humanos se pueden hacer por una variedad de métodos conocidos en la técnica que incluyen métodos de presentación en fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticuerpos derivados de secuencias de inmunoglobulina humana. Ver además las patentes de Estados Unidos núms. 4,444,887 y 4,716,111; y las publicaciones internacionales núms. WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, y WO 91/10741.
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Los anticuerpos humanos se pueden producir además usando ratones transgénicos que son incapaces de expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que pueden expresar genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos de genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera humana se pueden introducir por recombinación homóloga o aleatoriamente en células madre embrionarias de ratón. Alternativamente, la región variable, región constante, y región de diversidad humana se pueden introducir en células madre embrionarias de ratón adicionalmente a los genes de cadena pesada y ligera humana. Los genes de inmunoglobulina de la cadena pesada y ligera de ratón pueden ser dados no funcional por separado o simultáneamente con la introducción de loci de inmunoglobulina humana por recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigótica del gen de la región JH evita la producción de anticuerpos endógenos. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y microinyectan en blastocistos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos se reproducen después para producir crías homocigotas que expresan anticuerpos humanos. Los ratones transgénicos se inmunizan usando metodologías convencionales con un antígeno seleccionado, por ejemplo, la totalidad o una porción de un polipéptido de la invención. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se pueden obtener de los ratones transgénicos inmunizados, usando tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana contenidos por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de células B, y posteriormente experimentan cambio de clase y mutación somática. Así, usando una técnica de ese tipo, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Para una visión general de esta tecnología para producir anticuerpos humanos, ver Lonberg y Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para una discusión detallada de esta tecnología para producir anticuerpos humanos y anticuerpos humanos monoclonales y los protocolos para producir tales anticuerpos, ver, por ejemplo, las publicaciones internacionales núms. WO 98/24893, WO 96/34096, y WO 96/33735; y las patentes de Estados Unidos núms. 5,413,923, 5,625,126, 5,633,425, 5,569,825, 5,661,016, 5,545,806, 5,814,318, y 5,939,598. Adicionalmente, compañías tales como Abgenix, Inc. (Freemont, CA) y Medarex (Princeton, NJ) se pueden contratar para proporcionar anticuerpos humanos dirigidos contra un antígeno seleccionado usando tecnología similar a la que se describió anteriormente.
Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones del anticuerpo se derivan de diferentes moléculas de inmunoglobulina, tales como anticuerpos que tienen una región variable derivada de un anticuerpo no humano y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica. Ver por ejemplo, Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi y otros, 1986, BioTechniques 4:214; Gillies y otros, 1989, J. Immunol. Methods 125:191-202; y las patentes de Estados Unidos núms. 6,311,415, 5,807,715, 4,816,567, y 4,816,397. Los anticuerpos quiméricos que comprenden una o más CDR de una especie no-humana y regiones marco de una molécula de inmunoglobulina humana pueden producirse usando una variedad de técnicas conocidas en la técnica que incluyen, por ejemplo, injerto de la CDR (EP 239,400; publicación internacional núm. WO 91/09967; y las patentes de Estados Unidos núms. 5,225,539, 5,530,101, y 5,585,089), recubrimiento o mejora de la superficie (EP 592,106; EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology 28(4/5):489-498; Studnicka y otros, 1994, Protein Engineering 7:805; y Roguska y otros, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:969), e intercambio de cadenas (patente de Estados Unidos núm. 5,565,332).
Además, los anticuerpos de la invención se pueden, a su vez, utilizar para generar anticuerpos anti-idiotipo usando técnicas bien conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. (Ver, por ejemplo, Greenspan & Bona, 1989, FASEB J. 7:437444; y Nissinoff, 1991, J. Immunol. 147:2429-2438. La invención proporciona métodos que emplean el uso de polinucleótidos que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican un anticuerpo de la invención o un fragmento de este.
Se describen en la presente anticuerpos de dominio sencillo, que incluyen anticuerpos de dominio sencillo camelizado (Ver por ejemplo, Muyldermans y otros, 2001, Trends Biochem. Sci. 26:230; Nuttall y otros, 2000, Cur. Pharm. Biotech. 1:253; Reichmann y Muyldermans, 1999, J. Immunol. Meth. 231:25; las publicaciones internacionales núms. WO 94/04678 y WO 94/25591; la patente de Estados Unidos núm. 6,005,07). Además se describen unos anticuerpos de dominio sencillo que comprenden dos dominios VH con modificaciones tal que se forman los anticuerpos de dominio sencillo.
Los métodos de la presente invención abarcan además el uso de anticuerpos humanizados o fragmentos de estos que tienen vidas medias (por ejemplo, vidas medias en suero) en un mamífero, preferentemente un humano, de más de 15 días, preferentemente mayor de 20 días, mayor de 25 días, mayor de 30 días, mayor de 35 días, mayor de 40 días, mayor de 45 días, mayor de 2 meses, mayor de 3 meses, mayor de 4 meses o mayor de 5 meses. Las vidas medias aumentadas de los anticuerpos humanizados de la presente invención o fragmentos de estos en un mamífero, preferentemente un humano, resulta en un título de suero más alto de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos en el mamífero, y así, reduce la frecuencia de la administración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos y/o reduce la concentración que se administra de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. Los anticuerpos o fragmentos de estos con vidas medias in vivo aumentadas se pueden generar por técnicas conocidas por aquellos con experiencia en la técnica. Por ejemplo, anticuerpos o fragmentos de estos con vidas medias in vivo aumentadas se pueden generar modificando (por ejemplo, sustitución, deleción o adición) residuos de aminoácidos identificados como involucrados en la interacción entre el dominio
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Fc y el receptor FcRn. Los anticuerpos humanizados de la invención se pueden modificar por ingeniería genética por los métodos descritos en Ward y otros para aumentar las vidas medias biológicas (Ver la patente de Estados Unidos núm. 6,277,375 B1). Por ejemplo, los anticuerpos humanizados de la invención se pueden modificar por ingeniería genética en el dominio de la bisagra con Fc para tener vidas medias en suero o in vivo aumentadas.
Los anticuerpos o fragmentos de estos con vidas medias in vivo aumentadas se pueden generar por la fijación de moléculas de polímero tales como polietilenglicol de alto peso molecular (PEG) a dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos. El PEG se puede unir a dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con o sin un enlazador multifuncional, ya sea a través de la conjugación específica al sitio del PEG al N-o C-terminal de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos o a través de los grupos amino épsilon presentes en los residuos de lisina. La derivatización del polímero lineal o ramificado que resulta en la pérdida mínima de actividad biológica se podrá usar. El grado de conjugación se controlará estrechamente por SDS PAGE y espectrometría de masas para garantizar la conjugación adecuada de las moléculas de PEG a los anticuerpos. El PEG sin reaccionar se puede separar de los conjugados anticuerpo-PEG por, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iónico.
Los anticuerpos humanizados de la invención se pueden además modificar por los métodos y agentes de acoplamiento descritos por Davis y otros (Ver la patente de Estados Unidos núm. 4,179,337) para proporcionar composiciones que se pueden inyectar en el sistema circulatorio de los mamíferos sin sustancialmente respuesta inmunogénica.
La presente invención además abarca el uso de anticuerpos humanizados o fragmentos de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los anticuerpos de la invención con mutaciones (por ejemplo, una o más sustituciones de aminoácidos) en regiones marco o CDR. Preferentemente, las mutaciones en estos anticuerpos humanizados mantienen o mejoran la avidez y/o afinidad de los anticuerpos para CD32B al que se unen inmunoespecíficamente. Las técnicas convencionales conocidas por aquellos con experiencia en la técnica (por ejemplo, inmunoensayos) se pueden usar para ensayar la afinidad de un anticuerpo para un antígeno particular.
La invención abarca la modificación de residuos marco de los anticuerpos humanizados de la invención. Los residuos marco en las regiones marco se pueden sustituir con el correspondiente residuo del anticuerpo donador de CDR para alterar, preferentemente mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones del marco se identifican por métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por modelado de las interacciones de las CDR y residuos marco para identificar los residuos marco importantes para la unión al antígeno y la comparación de secuencia para identificar los residuos marco inusuales en posiciones particulares. (Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 5,585,089; y Riechmann y otros, 1988, Nature 332:323). La invención abarca un anticuerpo humanizado que tiene fenilalanina en el aminoácido número 21 de la región 1 marco del dominio variable de la cadena ligera (correspondiente al aminoácido número 21 de sec. con núm. de ident.:62). En otros casos se describe en la presente un anticuerpo humanizado que tiene una o más de una isoleucina en el aminoácido número 13 de la región 2 marco del dominio variable de la cadena pesada (por ejemplo, correspondiente al aminoácido número 48 de la sec. con núm. de ident.:60), una valina en el aminoácido número 6 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada(por ejemplo, correspondiente al aminoácido número 72 de la sec. con núm. de ident.:60), una valina en el aminoácido número 7 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, correspondiente al aminoácido número 73 de la sec. con núm. de ident.:60), una valina en el aminoácido número 8 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada (por ejemplo, correspondiente al aminoácido número 74 de la sec. con núm. de ident.:60), o cualquier combinación de éstas. La invención abarca un anticuerpo humanizado que tiene una o más de una isoleucina en el aminoácido número 13 de la región 2 marco del dominio variable de cadena pesada (correspondiente al aminoácido número de 48 de la sec. con núm. de ident.:68), una valina en el aminoácido número 6 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada (correspondiente al aminoácido número 72 de la sec. con núm. de ident.:68), un ácido aspártico en el aminoácido número 7 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada (correspondiente al aminoácido número 73 de la sec. con núm. de ident.:68), una treonina en el aminoácido número 8 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada (correspondiente al aminoácido número 74 de la sec. con núm. de ident.:68). En algunos casos se describen en la presente anticuerpos humanizados, que comprenden al menos una modificación de aminoácidos (por ejemplo, inserción, deleción, sustitución) en una o más de las regiones marco del dominio variable de la cadena ligera. La invención abarca un anticuerpo humanizado que comprende una modificación en el aminoácido 21 de la región 1 marco del dominio variable de cadena ligera, cuya modificación es preferentemente una sustitución con fenilalanina (correspondiente al aminoácido número 21 en la sec. con núm. de ident.:62). En otros casos existen se describen en la presente anticuerpos humanizados que comprende al menos una modificación de aminoácidos (por ejemplo, inserción, deleción, sustitución) en una o más de las regiones marco del dominio variable de la cadena pesada. En unos ejemplos específicos de acuerdo con este caso, se describen en la presente un anticuerpo humanizado que comprende una modificación en el aminoácido 13 de la región 2 marco del dominio variable de cadena pesada, cuya modificación es una sustitución con isoleucina (por ejemplo, correspondiente al aminoácido número 48 en la sec. con núm. de ident.:60), y/o una modificación en el aminoácido 6 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada cuya modificación es una sustitución con valina (por ejemplo, correspondiente al aminoácido número 72 en la sec. con núm. de
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ident.:60), y/o una modificación en el aminoácido 7 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada, cuya modificación es una sustitución con valina (por ejemplo, correspondiente al aminoácido número 73 en la sec. con núm. de ident.:60), y/o una modificación en el aminoácido 8 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada, cuya modificación es una sustitución con valina (por ejemplo, que corresponde al aminoácido número 74 en la sec. con núm. de ident.:60). La invención abarca un anticuerpo humanizado que comprende una modificación en el aminoácido 13 de la región 2 marco del dominio variable de cadena pesada cuya modificación es una sustitución con isoleucina (correspondiente al aminoácido número 48 en la sec. con núm. de ident.:68), y/o una modificación en el aminoácido 6 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada, cuya modificación es una sustitución con valina (correspondiente al aminoácido número 72 en la sec. con núm. de ident.:68), y/o una modificación en el aminoácido 7 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada cuya modificación es una sustitución con ácido aspártico (correspondiente al aminoácido número 73 en la sec. con núm. de ident.:68), y/o una modificación en el aminoácido 8 de la región 3 marco del dominio variable de cadena pesada cuya modificación es una sustitución con treonina (correspondiente al aminoácido número 74 en la sec. con núm. de ident.:68). Se describe además en la presente cualquier combinación de las modificaciones de aminoácidos anteriores en las regiones marco del dominio variable de la cadena pesada o ligera.
La presente invención abarca anticuerpos humanizados que comprenden modificaciones preferentemente, en la región Fc que modifica la afinidad de unión del anticuerpo a uno o más FcrγR. Los métodos para modificar anticuerpos con unión modificada a uno o más FcγR se conocen en la técnica, ver, por ejemplo, las publicaciones internacionales núms. WO 04/063351, WO 04/029207, WO 04/029092, WO 04/028564, WO 99/58572, WO 99/51642, WO 98/23289, WO 89/07142, WO 88/07089; Publicación de Estados Unidos con núms. de serie 2005/0037000; y 2005/0064514 y las patentes de Estados Unidos núms. 5,843,597 y 5,642,821. La invención abarca cualquiera de las mutaciones descritas en las publicaciones internacionales núms. WO 04/063351, WO 04/029207, WO 04/029092, WO 04/028564, WO 99/58572, WO 99/51642, WO 98/23289, WO 89/07142, WO 88/07089; las publicaciones de las solicitudes de patente de Estados Unidos núms. 2005/0037000; y 2005/0064514 y las patentes de Estados Unidos núms. 5,843,597 y 5,642,821. La invención abarca además cualquiera de las mutaciones descritas en las solicitudes de patente de Estados Unidos núms. 10/902,588 (US 20050064514) (presentada el 28 de julio de 2004) y 11/271,140 (US 20060134709) (presentada el 10 de noviembre de 2005), y la publicación de la solicitud de patente núm. US 2007/021841. En algunas modalidades, la invención abarca anticuerpos que tienen alterada la afinidad por un FcγR de activación, por ejemplo, FcγRIIIA. Preferentemente, tales modificaciones además tienen una función efectora alterada mediada por Fc. Las modificaciones que afectan la función efectora mediada por Fc son bien conocidas en la técnica (Ver la patente de Estados Unidos núm. 6,194,551). En una modalidad específica, los aminoácidos que se puede modificar de acuerdo con el método de la invención incluyen, pero sin limitarse a, Prolina 329, Prolina 331, y Lisina 322. En ciertas modalidades, Prolina 329, Prolina 331 y Lisina 322 se sustituyen con alanina; sin embargo, se contempla la sustitución con cualquier otro aminoácido. Ver la publicación internacional núm.: WO 00/42072 y la patente de Estados Unidos núm. 6,194,551. En modalidades preferidas, los aminoácidos que se modifican de acuerdo con los métodos de la invención comprenden los aminoácidos en las posiciones 243, 292, 300, 305 y 396; en un ejemplo específico de acuerdo con esta modalidad, los aminoácidos que se modifican son fenilalanina 243, arginina 292, tirosina 300, valina 305 y prolina 396, y se sustituyen preferentemente con leucina, prolina, leucina, isoleucina y leucina, respectivamente.
En una modalidad particular, la modificación de la región Fc comprende una o más mutaciones en la región Fc. Una o más mutaciones en la región Fc pueden resultar en un anticuerpo con una función efectora mediada por anticuerpos alterada, una unión alterada a otros receptores Fc (por ejemplo, receptores de activación Fc), una actividad ADCC alterada, una actividad de unión a C1q alterada, una actividad de citotoxicidad dependiente del complemento alterada, una actividad fagocítica alterada, o cualquier combinación de estas.
La invención proporciona además anticuerpos humanizados con contenido de oligosacáridos alterado. Los oligosacáridos, como se usan en la presente, se refieren a los carbohidratos que contienen dos o más azúcares simples y los dos términos se pueden usar de manera intercambiable en la presente. Las porciones de carbohidrato de la presente invención serán descritas con referencia a la nomenclatura usada comúnmente en la técnica. Para una revisión de la química de los carbohidratos, ver, por ejemplo, Hubbard y otros, 1981 Ann. Rev. Biochem., 50: 555-583, la cual se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Esta nomenclatura incluye, por ejemplo, Man que representa manosa; GlcNAc que representa 2 N-acetilglucosamina; Gal que representa galactosa; Fuc para fucosa y Glc para glucosa. Los ácidos siálicos se describen por la notación abreviada NeuNAc para el ácido 5-N-acetilneuramínico, y NeuNGc para 5-glicolneuramínico.
Generalmente, los anticuerpos contienen porciones de carbohidrato en las posiciones conservadas en la región constante de la cadena pesada, y hasta 30% de las IgG humanas tienen una región Fab glicosilada. La IgG tiene una estructura sencilla de carbohidratos biantenario con enlace N en Asn 297 el cual radica en el dominio CH2 (Jefferis y otros, 1998, Immunol. Rev. 163: 59-76; Wright y otros, 1997, Trends Biotech 15: 26-32). La IgG humana típicamente tiene un carbohidrato de la siguiente estructura; GlcNAc (fucosa)-GlcNAc-Man-(ManGlcNAc)2. Sin embargo variaciones entre las IgG en el contenido de carbohidratos ocurren lo que conduce a la función alterada, ver, por ejemplo, Jassal y otros, 2001
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Biochem. Biophys. Res. Commun. 288: 243-9; Groenink y otros, 1996 J. Immunol. 26: 1404-7; Boyd y otros, 1995 Mol. Immunol. 32: 1311-8; Kumpel y otros, 1994, Human Antibody Hybridomas, 5: 143-51. La invención abarca anticuerpos humanizados que comprenden una variación en la porción de carbohidrato que se une a Asn 297. En una modalidad, la porción de carbohidrato tiene una galactosa y/o galactosa-ácido siálico en una o ambas GlcNAc terminal y/o un tercer brazo GlcNAc (GlcNAc bisectados).
En algunas modalidades, los anticuerpos humanizados de la invención están sustancialmente libres de uno o más grupos seleccionados de azúcar, por ejemplo, uno o más residuos de ácido siálico, uno o más residuos de galactosa, uno o más residuos de fucosa. Un anticuerpo que está sustancialmente libre de uno o más grupos de azúcar seleccionados se puede preparar usando métodos comunes conocidos por uno con experiencia en la técnica, que incluyen, por ejemplo, producción de forma recombinante de un anticuerpo de la invención en una célula huésped que es defectuosa en la adición de los grupo(s) de azúcar seleccionado(s) para la porción de carbohidrato del anticuerpo, tal que aproximadamente 90-100% del anticuerpo en la composición carece del grupo(s) azúcar seleccionado(s) unido a la porción de carbohidrato. Los métodos alternativos para preparar tales anticuerpos incluyen, por ejemplo, cultivar células bajo condiciones que evitan o reducen la adición de uno o más grupos de azúcar seleccionados o eliminación post-traduccional de uno o más grupos de azúcar seleccionados.
Se describe en la presente un método para producir una preparación de anticuerpo sustancialmente homogénea, en donde aproximadamente 80-100% del anticuerpo en la composición carece de fucosa en su porción de carbohidrato por ejemplo, la unión de carbohidrato en Asn 297. El anticuerpo se puede preparar, por ejemplo, por (a) el uso de una célula huésped modificada por ingeniería genética que es deficiente en el metabolismo de fucosa tal que tiene una capacidad reducida para las proteínas fucosiladas expresadas en la misma; (b) cultivo de las células en condiciones que evitan o reducen la fusosilación; (c) eliminación post-traduccional de fucosa, por ejemplo, con una enzima fucosidasa; o (d) purificación del anticuerpo para seleccionar el producto que no se fucosila. Con la máxima preferencia, un ácido nucleico que codifica el anticuerpo deseado se expresa en una célula huésped que tiene una capacidad reducida para fucosilar el anticuerpo expresado en la misma. Preferentemente, la célula huésped es una célula de ovario de hámster chino deficiente en dihidrofolato reductasa (CHO), por ejemplo, una célula CHO Lec 13 (línea celular mutante CHO resistente a lectina, (ver, por ejemplo, la publicación de la solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2003/0115614; la publicación PCT núm. WO 00/61739; la solicitud de patente Europea EP 1 229 125; Ribka & Stanley, 1986, Somatic Cell & Molec. Gen. 12(1): 51-62; Ripka y otros, 1986 Arch. Biochem. Biophys. 249(2): 533-45), o una célula CHO-K1, una célula DUX-B11, una célula CHO-DP12 o una célula CHO-DG44, la que se ha modificado de manera que el anticuerpo no se fucosile sustancialmente. Así, la célula puede mostrar expresión y/o actividad alterada de la enzima fucosiltransferasa, u otra enzima o sustrato implicado en la adición de fucosa al oligosacárido con enlace N de manera que la enzima tiene una actividad disminuida y/o nivel de expresión reducido en la célula. Para los métodos de producir anticuerpos con un contenido alterado de fucosa, ver, por ejemplo, WO 03/035835 y Shields y otros, 2002, J. Biol. Chem. 277(30): 26733-40.
En algunas modalidades, las modificaciones de carbohidratos alterados modulan uno o más de lo siguiente: solubilización del anticuerpo, facilitación del transporte subcelular y secreción del anticuerpo, promoción del ensamblaje de anticuerpos, integridad conformacional y función efectora mediada por anticuerpo. En una modalidad específica las modificaciones de carbohidratos alterados mejoran la función efectora mediada por anticuerpo respecto al anticuerpo que carece de la modificación de carbohidrato. Las modificaciones de carbohidrato que conducen a la función efectora alterada mediada por anticuerpo son bien conocidas en la técnica (por ejemplo, ver Shields R.L. y otros, 2001, J. Biol. Chem. 277(30): 26733-40; Davies J. y otros, 2001, Biotechnology & Bioengineering, 74(4): 288-294. En otra modalidad específica, las modificaciones de carbohidratos alterados mejoran la unión de los anticuerpos de la invención al receptor FcγRIIB. Alterar las modificaciones de carbohidrato de acuerdo con los métodos de la invención incluye, por ejemplo, aumentar el contenido de carbohidrato del anticuerpo o disminuir el contenido de carbohidrato del anticuerpo. Los métodos para alterar los contenidos de carbohidrato son conocidos por aquellos con experiencia en la técnica, ver, por ejemplo, Wallick y otros, 1988, Journal of Exp. Med 168(3): 1099-1109; Tao y otros, 1989 Journal of Immunology, 143(8): 2595-2601; Routledge y otros, 1995 Transplantation, 60(8): 847-53; Elliott y otros 2003; Nature Biotechnology, 21: 414-21; Shields y otros 2002 Journal of Biological Chemistry, 277(30): 26733-40.
En algunas modalidades, la invención abarca anticuerpos humanizados que comprenden uno o más sitios de glicosilación, de manera que una o más porciones de carbohidrato se unen covalentemente al anticuerpo. En otras modalidades, la invención abarca anticuerpos humanizados que comprenden uno o más sitios de glicosilación y una o más modificaciones en la región Fc, tales como las descritas arriba y las conocidas por uno con experiencia en la técnica. En modalidades preferidas, una o más modificaciones en la región Fc mejoran la afinidad del anticuerpo para un FcγR de activación, por ejemplo, FcγRIIIA, respecto al anticuerpo que comprende las regiones Fc silvestre. Los anticuerpos humanizados de la invención con uno o más sitios de glicosilación y/o una o más modificaciones en la región Fc tienen una función efectora mediada por anticuerpo mejorada, por ejemplo, actividad ADCC mejorada. En algunas modalidades, la invención comprende además los anticuerpos humanizados que comprenden una o más modificaciones de aminoácidos que

Claims (19)

  1. Reivindicaciones
    1. Un anticuerpo humanizado que comprende una región Fc humana y un dominio variable, en donde dicho anticuerpo se une específicamente al dominio extracelular de FcγRIIB humano a través de dicho dominio variable,
    5 en donde dicho dominio variable comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:68 y un dominio variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de sec. con núm. de ident.:62, o un fragmento de dicho anticuerpo que comprende dicho dominio variable y se une específicamente al dominio extracelular de FcγRIIB humano a través de dicho dominio variable.
  2. 2.
    El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en donde el dominio Fc comprende al menos una modificación de aminoácidos en el dominio de Fc.
  3. 3.
    El anticuerpo humanizado de la reivindicación 2, en donde al menos dicha una modificación de aminoácidos comprende una sustitución en la posición 243, una sustitución en la posición 292, una sustitución en la posición
    15 300, una sustitución en la posición 305, y una sustitución en la posición 396 y en donde dichas posiciones están de acuerdo con Kabat.
  4. 4.
    El anticuerpo humanizado de la reivindicación 3, en donde la sustitución en la posición 243 es una sustitución con leucina, la sustitución en la posición 292 es una sustitución con prolina, la sustitución en la posición 300 es una sustitución con leucina, la sustitución en la posición 305 es una sustitución con isoleucina, y la sustitución en la posición 396 es una sustitución con leucina y en donde dichas posiciones están de acuerdo con Kabat.
  5. 5.
    El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo o fragmento de este es un fragmento F(ab')2 o un fragmento F(ab).
  6. 6.
    El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo o fragmento de este es un anticuerpo de cadena sencilla.
  7. 7.
    El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo está operativamente enlazado a un polipéptido heterólogo.
  8. 8.
    El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo está conjugado a un agente terapéutico.
    25
    35 9. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 8, en donde dicho agente terapéutico es una citotoxina.
  9. 10.
    Un ácido nucleico aislado que comprende uan secuencia de nucleótidos que codifica el dominio variable de la cadena pesada o dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo de la reivindicación 1.
  10. 11.
    El uso del anticuerpo humanizado de la reivindicación 1 en la preparación de una medicamento para el tratamiento del cáncer, en donde dicho medicamento es para el uso en conjunto con un anticuerpo secundario que se une específicamente a un antígeno de cáncer y es citotóxico y en donde dicho cáncer está caracterizado por dicho antígeno de cáncer.
    45 12. Una composición farmacéutica que comprende (i) una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo humanizado de la reivindicación 1; (ii) un anticuerpo citotóxico que une específicamente un antígeno de cáncer; y (iii) un portador farmacéuticamente aceptable.
  11. 13.
    La composición farmacéutica de la reivindicación 12 para uso en el tratamiento del cáncer.
  12. 14.
    El uso de acuerdo con la reivindicación 11, o la composición de acuerdo con la reivindicación 12 o composición para uso de acuerdo con la 13, en donde dicho antígeno de cáncer es el antígeno pancarcinoma KS ¼, antígeno del carcinoma ovárico (CA125), fosfato de ácido prostático, antígeno específico de próstata, antígeno asociado a melanoma p97, antígeno de melanoma gp75, antígeno de melanoma de alto peso molecular (HMWMAA), antígeno
    55 de membrana específico de próstata, antígeno carcinoembrionario (CEA), TAG-72, GICA 19-9, CTA-1, LEA, antígeno 38.13 de linfoma de Burkitt, CD19, CD20, CD33, GD2, GD3, GM2, GM3, un antígeno de superficie celular de tipo trasplante específico de tumor (TSTA), L6 humano, L20 humano, EGFR, o HER2/neu.
    91
  13. 15. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, o la composición de acuerdo con la reivindicación 12 o composición para el uso de acuerdo con la 13, en donde dicho antígeno de cáncer es un antígeno de carcinoma de mama, ovario, próstata, cervical, o pancreático.
    5 16. El uso del anticuerpo humanizado de la reivindicación 1 en la preparación de una medicamento para el tratamiento de un trastorno autoinmunitario.
  14. 17. El uso del anticuerpo humanizado de la reivindicación 1 en la preparación de una medicamento para el tratamiento
    o prevención de un trastorno alérgico mediado por IgE, en donde dicho trastorno es asma, rinitis alérgica, una 10 alergia gastrointestinal, eosinofilia, conjuntivitis, dermatitis atópica, urticaria, anafilaxis, o nefritis glomerular.
  15. 18. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1 para usar en
    (i) el tratamiento de un trastorno autoinmunitario;
    15 (ii) el tratamiento o prevención de un trastorno alérgico mediado por IgE, en donde dicho trastorno es asma, rinitis alérgica, una alergia gastrointestinal, eosinofilia, conjuntivitis, dermatitis atópica, urticaria, anafilaxis, o nefritis glomerular;
  16. 19. Un método para el diagnóstico de una enfermedad autoinmunitario en un sujeto que comprende:
    20
    (a)
    contactar una muestra biológica de dicho sujeto con una cantidad eficaz del anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, y
    (b)
    detectar la unión de dicho anticuerpo,
    25 en donde dicha detección por encima de un nivel de base o estándar indica que dicho sujeto tiene una enfermedad autoinmunitaria.
  17. 20. El uso del anticuerpo humanizado de la reivindicación 1 en la preparación de un medicamento para mejorar la
    presentación de antígeno o procesamiento de antígeno de un antígeno, de ese modo mejorar una respuesta 30 inmune a la composición vacunal en un sujeto.
  18. 21. El uso del anticuerpo humanizado de la reivindicación 1 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer y la reducción en la población de células cancerosas que expresan FcγRIIB en un paciente, en donde dicho cáncer está caracterizado por un antígeno de cáncer.
    35
  19. 22. El uso del anticuerpo humanizado de la reivindicación 21 en la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer y la eliminación de las células cancerosas que expresan FcγRIIB en un paciente, en el que dicho cáncer está caracterizado por un antígeno de cáncer, que es el antígeno pancarcinoma KS ¼, antígeno del carcinoma ovárico (CA125), fosfato de ácido prostático, antígeno específico de próstata, antígeno asociado a melanoma p97,
    40 antígeno de melanoma gp75, antígeno de melanoma de alto peso molecular (HMWMAA), antígeno de membrana específico de próstata, antígeno carcinoembrionario (CEA), TAG-72, GICA 19-9, CTA-1, LEA, antígeno 38.13 de linfoma de Burkitt, CD19, CD20, CD33, GD2, GD3, GM2, GM3, un antígeno de superficie celular de tipo trasplante específico de tumor (TSTA), L6, L20, EGFR, o HER2/neu.
    92
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