BR112012024713B1

BR112012024713B1 - anticorpo humanizado, seus usos e composição farmacêutica que o compreende

Info

Publication number: BR112012024713B1
Application number: BR112012024713-1A
Authority: BR
Inventors: Rachel Barret; Scott Brodeur; Keith A. Canada; Tobias LITZENBURGER; Sanjaya Singh
Original assignee: Boehringer Ingelheim International Gmbh
Priority date: 2010-03-31
Filing date: 2011-03-30
Publication date: 2021-02-17
Also published as: PL2796467T3; SI3178851T1; CY1123145T1; BR112012024713A2; US20140179907A1; CL2012002737A1; JP5752865B1; US11242394B2; TWI494126B; AR081750A1; RS60612B1; UA107827C2; EP3178851B1; JP2015145383A; EP2796467B1; AP4082A; CY1120181T1; MY187990A; NO2796467T3; IL236740A

Abstract

ANTICORPO HUMANIZADO, ANTICORPO MONOCLONAL HUMANIZADO OU FRAGMENTO DE ANTICORPO, SEUS USOS, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção refere-se aos novos anticorpos anti-CD40 antagonísticos humanizados e aos métodos terapêuticos e diagnósticos e às composições para a utilização dos mesmos.

Description

ANTICORPO HUMANIZADO, SEUS USOS E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA QUE O COMPREENDE

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] Esta invenção refere-se, de um modo geral, aos anticorpos anti-CD40 humanizados para uso diagnóstico e terapêutico. Mais especificamente, divulgam-se anticorpos anti-CD40 humanizados e métodos de uso para o tratamento de diversas doenças ou distúrbios caracterizados por células que expressam a CD40. Divulgam-se também composições farmacêuticas e kits compreendendo o anticorpo anti-CD40 humanizado.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A CD40 é uma glicoproteína de membrana integral do tipo I de 48 kDa e um membro da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (TNF). A CD40 é expressa sobre uma variedade de tipos de células, incluindo as células B normais e neoplásticas, as células de interdigitação, os carcinomas, as células epiteliais (por exemplo, os ceratinócitos), os fibroblastos (por exemplo, os sinoviócitos) e as plaquetas. Ela está também presente sobre monócitos, macrófagos, algumas células endoteliais, e células dendríticas foliculares. A CD40 é expressa inicialmente na ontogenia das células B, aparecendo sobre os precursores de células B, subsequente ao aparecimento de CD10 e CD19, porém antes da expressão de CD21, CD23, CD24, e aparecimento da imunoglobulina M de superfície (sigM) (Uckun e col., 1990, Blood 15:2449). A CD40 também foi detectada sobre as células de amígdalas e plasmáticas derivadas da medula óssea (Pellat-Decounynck e col., 1994, Blood 84:2597).

[0003] O ligante da CD40 é o CD40L (também referido como CD154, gp39, e TRAP), um membro da superfamília do TNF. O CD40L é uma proteína de transmembrana expressa predominantemente sobre as células CD4+ T ativadas e um subgrupo pequeno de células CD8+ T (Revisto por Van Kooten C. e Banchereau, 2000).

[0004] A interação da CD40 com o CD40L induz as respostas imunes tanto humorais quanto mediadas por células. A CD40 regula este par de ligante-receptor para ativar as células B e outras células apresentadoras de antígenos (APC), incluindo as células dendríticas (DCs) (Revisto por Toubi e Shoenfeld, 2004); (Kiener, e col., 1995). A função da CD40 sobre as células B tem sido estudada extensamente. A ativação da CD40 sobre as células B induz a proliferação, a diferenciação em células secretoras de anticorpos e a troca de isótipos nos centros germinais de órgãos linfoides secundários. Os estudos in vitro mostraram efeitos diretos da ativação da CD40 sobre a produção de citocinas (IL-6, IL-10, TNF-α, LT-α), a expressão de moléculas de adesão e receptores coestimuladores (ICAM, CD23, CD80 e CD86), e a expressão aumentada de MHC classe I, MHC classe II, e transportador de TAP por linfócitos B (Liu, e col, 1996). Para a maior parte destes processos, a CD40 atua em harmonia com quaisquer citocinas ou outras interações entre receptor-ligante.

[0005] A sinalização da CD40 sobre monócitos e DCs resulta na sobrevivência aumentada, bem como na secreção de citocinas (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α e MIP-1α). A ligação da CD40 sobre estas APCs também resulta na suprarregulação de moléculas coestimuladoras, tais como ICAM-1, LFA-3, CD80, e CD86. A ativação dos receptores da CD40 é um dos sinais críticos que permite a maturação total da CD em APCs eficientes orientando a ativação de células T (Banchereau e Steinman, 1998) (Van Kooten C. e Banchereau, 2000).

[0006] Os estudos recentes em modelos de camundongos mostraram que a sinalização da CD40 sobre células dendríticas também desempenha um papel importante na geração de células TH17, que são consideradas como mediadoras da autoimunidade em doenças tais como a artrite e a esclerose múltipla (Iezzi, e col., 2009) (Perona-Wright, e col., 2009).

[0007] A disponibilidade de camundongos nocautes de CD40 e CD40L, bem como anticorpos anticamundongo agonísticos e antagonísticos ofereceu a possibilidade de estudar o papel das interações entre CD40-CD40L em diversos modelos de doenças. A administração de anti-CD40L de bloqueio demonstrou ser benéfica em diversos modelos de autoimunidade, incluindo as doenças espontâneas como a nefrite por lúpus em camundongos SNF1 ou a diabetes em camundongos NOD ou em formas experimentalmente induzidas de doença como a artrite induzida por colágeno (CIA) ou a encefalomielite autoimune experimental (EAE) (Toubi e Shoenfeld, 2004). A CIA nos camundongos foi inibida por um mAb anti-CD40L que bloqueou o desenvolvimento de inflamação na articulação, os títulos de anticorpos no soro para o colágeno, a infiltração de células inflamatórias no tecido subsinovial, além do desgaste de cartilagem e osso (Durie, e col., 1993). Tanto para a nefrite por lúpus quanto para a EAE, demonstrou-se que o anti-CD40L poderia também aliviar a doença em progresso, confirmando o papel de CD40-CD40L na fase efetora da doença (Kalled, e col., 1998); (Howard, e col., 1999).

[0008] O papel para as interações entre CD40-CD40L no desenvolvimento de EAE foi também estudado em camundongos deficientes de CD40L que carregavam um receptor de células T transgênicas específico para a proteína básica mielina. Estes camundongos não conseguiram desenvolver a EAE após pré-ativação com antígeno, e as células CD4+ T permaneceram inativas e não produziram nenhum INF-γ (Grewal, e col., 1996).

[0009] Além disso, os anticorpos inibidores dirigidos contra a CD40 mostraram efeitos benéficos em modelos de doenças inflamatórias, tais como a EAE. Lamann e colaboradores demonstraram que o mAb anti-CD40 humana de camundongo antagonístico mu5D12 e uma versão quimérica deste mAb efetivamente impediram a expressão clínica de EAE desmielinizante crônica em micos exogâmicos (Laman, e col., 2002); (Boon, e col., 2001). Um estudo de acompanhamento mostrou que o tratamento terapêutico com o anticorpo anti-CD40 humana quimérico reduz a inflamação detectável por MRI e retarda o aumento de lesões do cérebro preexistentes no modelo de EAE de mico (Hart, e col., 2005).

[00010] Os anticorpos anti-CD40 com atividade agonística foram testados em modelos de camundongos de artrite com alguns resultados conflitantes. Conforme esperado para um agente imunoestimulador, o mAb anti-CD40 de camundongo agonístico FGK45 foi mostrado exacerbar a doença no modelo de camundongo DBA/1 de CIA (Tellander, e col., 2000). Entretanto, em outro modelo de CIA crônica, tanto o FGK45, quanto outro mAb anti-CD40 de camundongo agonístico, 3/23, exibiram efeitos terapêuticos positivos (Mauri, e col., 2000). Postulou-se por este grupo que os anticorpos agonísticos neste regime de tratamento terapêutico têm um efeito benéfico por indução de desvio imune em relação a uma resposta de Th2, com níveis diminuídos de IFN-γ e níveis aumentados de IL-4 e IL10 (Mauri, e col., 2000).

[00011] A prevenção da rejeição do transplante por bloqueio das interações entre CD40/CD154 também foi documentada. O uso de ch5D12, um antagonista anti-CD40 quimérico, em estudos de aloenxertos renais em macacos rhesus indica que o antagonismo de CD40 é suficiente para a modificação da doença e o alongamento dos tempos de sobrevivência médios passados 100 dias. Quando o ch5D12 foi combinado com um anticorpo anti-CD86 e dado somente no início dos estudos dos aloenxertos, seguido por tratamento prolongado com ciclosporina, obtiveram-se tempos de sobrevivência médios maiores do que 4 anos, indicando que esta combinação pode potencialmente induzir a tolerância (Haanstra, e col., 2005).

[00012] Desse modo, existem estudos pré-clínicos amplos que proporcionam evidência para o papel crucial da díade CD40-CD40L em conduzir uma resposta imune dependente da célula T eficiente. O bloqueio da sinalização da CD40 é, portanto, reconhecido como uma estratégia terapêutica adequada e necessária para suprimir uma resposta autoimune patogênica em doenças tais como a RA, a esclerose múltipla ou a psoríase. Entretanto, até o momento, não há nenhum anticorpo para CD40 que tenha sido aprovado para a intervenção terapêutica de tais distúrbios, devido às descobertas que anticorpos anti-CD40 anteriormente em desenvolvimento eram mostrados terem efeitos colaterais significativos. Assim, permanece uma necessidade significativa por agentes terapêuticos que possam ser usados para interferir na ação dos CD40-CD40L e bloquear a sinalização da CD40. Esta necessidade pôde ser abordada por novos anticorpos anti-CD40 humanizados que especificamente ligam a CD40 e que mostram a especificidade de ligação ao antígeno, a afinidade, e as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas que permitem o seu uso na intervenção terapêutica dos distúrbios baseados em CD40.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[00013] A presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal humanizado, onde o dito anticorpo especificamente se liga à CD40 humana tendo uma atividade antagonística, IC50, de menos do que 1 nM e não tem nenhum agonismo até 100 g/ml na proliferação de células B e onde o dito anticorpo é adicionalmente caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem uma meia-vida in vivo em primatas não humanos que é pelo menos 10 dias.

[00014] O anticorpo monoclonal humanizado pode ser adicionalmente caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem uma meia-vida em macacos cinomolgos de mais do que 8 dias, em uma dose de menos do que 30 mg/kg.

[00015] Nas modalidades ilustrativas, o anticorpo da invenção compreende uma sequência da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em quaisquer de SEQ ID NO:1 até SEQ ID NO:4 e uma sequência da cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em quaisquer de SEQ ID NO:5 até SEQ ID NO:8.

[00016] Em outras modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo tendo a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de quaisquer de SEQ ID NO: 1 até 4, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO. 50 SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 73.

[00017] Em outras modalidades, o anticorpo é um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 5 até SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, ou SEQ ID NO:76.

[00018] Nas modalidades específicas, o anticorpo monoclonal descrito neste documento é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, onde a sequência da CDR1 da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9 até SEQ ID NO:11, uma sequência da CDR2 da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:12 até SEQ ID NO:15 e uma sequência da CDR3 da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:16 até SEQ ID NO:17; e onde a sequência da CDR1 da cadeia leve tem uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:18 até SEQ ID NO:21, uma sequência da CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO:22 até SEQ ID NO:23 e uma sequência da CDR3 da cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:24 até SEQ ID NO:25.

[00019] Nas modalidades específicas, o anticorpo monoclonal descrito neste documento é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma sequência da CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 10, uma sequência da CDR2 da cadeia pesada de SEQ ID NO:13 e uma sequência da CDR3 da cadeia pesada de SEQ ID NO:16; e onde o dito anticorpo compreende uma sequência da CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO:19, uma sequência da CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO:22 e uma sequência da CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO:24.

[00020] Em outras modalidades específicas, o anticorpo monoclonal descrito neste documento é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma sequência da CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 9, uma sequência da CDR2 da cadeia pesada de SEQ ID NO:14 e uma sequência da CDR3 da cadeia pesada de SEQ ID NO:16; e onde o dito anticorpo compreende uma sequência da CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO:20, uma sequência da CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO:22 e uma sequência da CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO:24.

[00021] Em outra modalidade específica, o anticorpo monoclonal descrito neste documento é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma sequência da CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 9, uma sequência da CDR2 da cadeia pesada de SEQ ID NO:14 e uma sequência da CDR3 da cadeia pesada de SEQ ID NO:16; e onde o dito anticorpo compreende uma sequência da CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO:20, uma sequência da CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO:22 e uma sequência da CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO:24.

[00022] Em outra modalidade específica, o anticorpo monoclonal descrito neste documento é caracterizado pelo fato de que ele compreende uma sequência da CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 11, uma sequência da CDR2 da cadeia pesada de SEQ ID NO:15 e uma sequência da CDR3 da cadeia pesada de SEQ ID NO:17; e onde o dito anticorpo compreende uma sequência da CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO:21, uma sequência da CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO:23 e uma sequência da CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO:25.

[00023] São também descritas neste documento as sequências individuais para as cadeias pesadas dos anticorpos preferidos da invenção. A invenção, por exemplo, refere-se a um anticorpo anti-CD40 compreendendo uma sequência do domínio variável da cadeia pesada de qualquer uma de SEQ ID NOs:1 até 4. O anticorpo anti-CD40 é adicionalmente caracterizado como compreendendo uma sequência do domínio variável da cadeia leve de qualquer uma de SEQ ID NO: 5 até SEQ ID NO:8.

[00024] Também é contemplado um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:29 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:37 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO: 36, respectivamente.

[00025] Em outra modalidade, a invenção se refere a um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:26, respectivamente.

[00026] Em outra modalidade, a invenção se refere a um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:26, respectivamente.

[00027] Em outra modalidade, a invenção se refere a um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:29 e SEQ ID NO:26, respectivamente.

[00028] Em outra modalidade, a invenção se refere a um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:26, respectivamente.

[00029] Em outra modalidade, a invenção se refere a um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:31, respectivamente.

[00030] Em outra modalidade, a invenção se refere a um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:31, respectivamente.

[00031] Em outra modalidade, a invenção se refere a um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:31, respectivamente.

[00032] Em outra modalidade, a invenção se refere a um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:31, respectivamente.

[00033] Em outra modalidade, a invenção se refere a um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:37 e SEQ ID NO:36, respectivamente.

[00034] Em outra modalidade, a invenção se refere a um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:36, respectivamente.

[00035] Em outra modalidade, a invenção se refere a um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:36, respectivamente.

[00036] Em outra modalidade, a invenção se refere a um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO:36, respectivamente.

[00037] Outra modalidade refere-se a um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno que especificamente se liga à CD40 humana, compreendendo um domínio variável da cadeia pesada humanizado compreendendo uma região de estrutura tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da região de estrutura da sequência de aminoácidos da cadeia pesada do domínio variável humano de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:30, e compreendendo uma sequência de aminoácidos da cadeia leve pelo menos 90% idêntica a um domínio variável da cadeia leve correspondente de SEQ ID NO:26.

[00038] Outra modalidade refere-se a um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno que especificamente se liga à CD40 humana, compreendendo um domínio variável da cadeia pesada humanizado compreendendo uma região de estrutura tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da região de estrutura da sequência de aminoácidos da cadeia pesada do domínio variável humano de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 ou SEQ ID NO:35, e compreendendo uma sequência de aminoácidos da cadeia leve pelo menos 90% idêntica a um variável da cadeia leve correspondente de SEQ ID NO:31.

[00039] Em outro aspecto, a invenção refere-se ao anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno descrito na modalidade imediatamente acima, onde a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é a SEQ ID NO:32; em outra modalidade, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é a SEQ ID NO:33; em outra modalidade, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é a SEQ ID NO:34; e em outra modalidade, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é a SEQ ID NO:35.

[00040] Também é contemplado um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno que especificamente se liga à CD40 humana, compreendendo um domínio variável da cadeia pesada humanizado compreendendo uma região de estrutura tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da região de estrutura da sequência de aminoácidos da cadeia pesada do domínio variável humano de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 ou SEQ ID NO:40, e compreendendo uma sequência de aminoácidos da cadeia leve pelo menos 90% idêntica a uma cadeia leve correspondente de SEQ ID NO:36.

[00041] Em outro aspecto, a invenção refere-se ao anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno descrito na modalidade imediatamente acima, onde a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é a SEQ ID NO:37; em outra modalidade, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é a SEQ ID NO:38; em outra modalidade, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é a SEQ ID NO:39; e em outra modalidade, a sequência de aminoácidos da cadeia pesada é a SEQ ID NO:40.

[00042] Os anticorpos da presente invenção podem ser adicionalmente caracterizados pelo fato de que os ditos anticorpos não conseguem estimular a produção de citocinas a partir de células B nesta ausência de CD40L.

[00043] Os anticorpos da presente invenção podem ser adicionalmente caracterizados pelo fato de que os ditos anticorpos se ligam à CD40 humana na presença de 50% de soro humano com uma redução na taxa de menos do que duas vezes.

[00044] Os anticorpos da presente invenção podem ser adicionalmente caracterizados pelo fato de que o dito anticorpo produz inibição da produção de IgM e IgG em um mamífero em uma concentração de 1 mg/kg.

[00045] Os anticorpos da presente invenção podem ser usados em diversos métodos terapêuticos, profiláticos, diagnósticos e outros. Por exemplo, a presente invenção descreve um método de bloquear a função da CD40 humana em um mamífero, compreendendo administrar ao dito mamífero uma composição compreendendo um anticorpo da invenção em uma quantidade suficiente para bloquear uma resposta imune mediada pela CD40 no dito mamífero.

[00046] Também é contemplado neste documento um método de tratar ou melhorar a doença do enxerto vs. hospedeiro em um mamífero, compreendendo administrar ao dito mamífero uma composição compreendendo um anticorpo da invenção, em uma quantidade suficiente para diminuir um ou mais dos sintomas da doença do enxerto vs. hospedeiro no dito animal.

[00047] A título de exemplo, a doença autoimune ou inflamatória pode incluir, porém não está limitada à artrite reumatoide, esclerose múltipla, glomerulonefrite proliferativa por lúpus, doença inflamatória do intestino (IBD), psoríase, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), Doença de Crohn e lúpus eritematoso sistêmico (SLE), tiroidite de Hashimoto, mixoedema primário, tireotoxicose/doença de Graves, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, cardite autoimune, doença de Addison, menopausa prematura, diabete melito tipo 1, síndrome de Good pasture, miastenia grave, anemia hemolítica autoimune, leucopenia idiopática, cirrose biliar primária, hepatite crônica ativa (HBs Ag negativa), cirrose criptogênica, síndrome de Sjogren, dermatomiosite, esclerodermia, doença do tecido conjuntivo misto, lúpus eritematoso discoide, e vasculite sistêmica. Nas modalidades ilustrativas, o mamífero tem artrite reumatoide.

[00048] Os métodos da invenção podem adicionalmente compreender administrar um segundo agente terapêutico selecionado a partir do grupo que consiste em um antagonista de TNF, um fármaco antirreumático modificador da doença, um antagonista de CTLA4, um mAb antirreceptor de IL-6 e um mAb anti-CD20.

[00049] Nas modalidades específicas, a doença inflamatória ou a doença autoimune é uma doença inflamatória ou doença autoimune que está associada com células que expressam tanto a CD40 quanto a CD20.

[00050] Nos métodos específicos, o tratamento envolve administrar a composição de anticorpo por uma via parenteral de administração.

[00051] Nos métodos específicos, o tratamento envolve administrar a composição de anticorpo de modo intravenoso ou subcutâneo.

[00052] Os métodos adicionais da invenção compreendem inibir a produção de anticorpos por células B em um paciente humano, compreendendo administrar ao dito paciente humano uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-CD40 da invenção.

[00053] Mais especificamente, o paciente humano tem uma doença inflamatória ou doença autoimune que está associada com as células que expressam a CD40.

[00054] Nas modalidades ilustrativas, o paciente humano está sofrendo de uma doença autoimune selecionada a partir do grupo que consiste em doença autoimune ou inflamatória, selecionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide, esclerose múltipla, glomerulonefrite proliferativa por lúpus, doença inflamatória do intestino (IBD), psoríase, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), Doença de Crohn e lúpus eritematoso sistêmico (SLE), tiroidite de Hashimoto, mixoedema primário, tireotoxicose/doença de Graves, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, cardite autoimune, doença de Addison, menopausa prematura, diabete melito tipo 1, síndrome de Good pasture, miastenia grave, anemia hemolítica autoimune, leucopenia idiopática, cirrose biliar primária, hepatite crônica ativa (HBs Ag negativa), cirrose criptogênica, síndrome de Sjogren, dermatomiosite, esclerodermia, doença do tecido conjuntivo misto, lúpus eritematoso discoide, e vasculite sistêmica.

[00055] Outro método da invenção refere-se à inibição do crescimento de células que expressam o antígeno CD40 humano, compreendendo administrar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da invenção às células, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno este que especificamente se liga ao antígeno CD40 da superfície celular humano, onde a ligação do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno ao antígeno CD40 inibe o crescimento ou a diferenciação das células.

[00056] Também é contemplado um método de tratar um paciente tendo um distúrbio associado à CD40, compreendendo administrar ao paciente o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da invenção, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno este que especificamente se liga à CD40 humana, onde a ligação do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno à CD40 inibe o crescimento ou a diferenciação das células do distúrbio associado à CD40. As células podem, porém não estão limitadas às células linfoblastoides B, pancreáticas, células de pulmão, células da mama, células ovarianas, células do cólon, células da próstata, células da pele, células da cabeça e do pescoço, células da bexiga, células do osso ou células do rim.

[00057] O método de tratamento para inibir o crescimento ou a diferenciação das células pode ser útil no tratamento para leucemia linfocítica crônica, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, um linfoma de células T, Linfoma que Não de Hodgkin, Doença de Hodgkin, macroglobulinemia de Waldenstrom ou sarcoma de Kaposi.

[00058] Também é contemplado um método para induzir a depleção de células B periféricas, compreendendo administrar às células o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno da invenção, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno este que especificamente se liga a um antígeno CD40 da superfície celular humano, onde a ligação do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno ao antígeno CD40 induz a depleção das células.

[00059] Nas modalidades específicas, o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno é administrado a um paciente tendo um distúrbio imune. Por exemplo, o distúrbio imune é a artrite reumatoide ou o lúpus eritematoso sistêmico.

[00060] Também é contemplado um método de tratar a artrite reumatoide em um paciente, compreendendo administrar ao dito paciente um anticorpo da invenção, onde o dito anticorpo é um anticorpo antagonístico que bloqueia a função da CD40 no dito paciente.

[00061] De preferência, o anticorpo é administrado em uma quantidade efetiva para inibir a diferenciação das células B e a troca de isótipo do anticorpo no dito paciente.

[00062] Em outras modalidades, o anticorpo é administrado em uma quantidade efetiva para inibir a produção de citocina e quimiocina e a suprarregulação das moléculas de adesão em células T e macrófagos no dito paciente. De preferência, o anticorpo é administrado em uma quantidade efetiva para inibir a ativação de células dendríticas no dito paciente.

[00063] Em outras modalidades, o método é adicionalmente caracterizado pelo fato de que o anticorpo é administrado em uma quantidade efetiva para inibir a produção de citocinas proinflamatórias, quimiocinas, metaloproteinases de matriz, prostaglandinas, e infrarregular as moléculas de adesão em células não imunes no dito paciente.

[00064] Nas modalidades específicas, o anticorpo é administrado em combinação com um regime compreendendo a administração de metotrexato e/ou a administração de Enbrel/Humira.

[00065] O paciente para receber a terapia é um que tenha artrite reumatoide e tenha sido não responsivo ao tratamento com metotrexato sozinho.

[00066] Nas modalidades específicas, o método compreende tratar o dito paciente com um regime compreendendo a administração de metotrexato e/ou a administração de Enbrel/Humira.

[00067] O método da invenção pode ser adicionalmente caracterizado, onde o tratamento do dito paciente com o dito anticorpo anti-CD40 antagonístico tem uma eficácia superior ao tratamento com metotrexato sozinho, Enbrel sozinho, uma combinação de Enbrel+metotrexato.

[00068] O método da invenção pode ser adicionalmente caracterizado, onde o tratamento do dito paciente com o dito anticorpo anti-CD40 antagonístico tem uma eficácia superior ao tratamento com Enbrel +MTX em pacientes que tenham tido uma resposta inadequada ao metotrexato.

[00069] Nas modalidades específicas, o anticorpo é administrado em combinação com um regime compreendendo um agente anti-TNF.

[00070] Nas modalidades específicas, o paciente é caracterizado como um que tenha artrite reumatoide e tenha sido não responsivo ao tratamento com um agente anti-TNF sozinho. Em tais modalidades, o método pode compreender tratar o dito paciente com um regime compreendendo o tratamento com um agente anti-TNF em combinação com o dito anticorpo anti-CD40 antagonístico.

[00071] Nas modalidades específicas, o tratamento do dito paciente com o dito anticorpo anti-CD40 antagonístico tem uma eficácia superior ao tratamento com um agente anti-TNF.

[00072] Ainda em outras modalidades, o método é caracterizado pelo fato de que o tratamento do dito paciente com o dito anticorpo anti-CD40 antagonístico tem uma eficácia superior ao tratamento com Orencia ou Rituxan, em pacientes que tenham tido uma resposta inadequada a um agente anti-TNF sozinho.

[00073] A presente invenção adicionalmente contempla uma composição farmacêutica compreendendo: (i) o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno como descrito neste documento; e (ii) um excipiente farmaceuticamente aceitável. Em tais composições, o anticorpo ou o seu fragmento de ligação ao antígeno pode vantajosamente ser conjugado a um segundo agente, tal como, por exemplo, um agente citotóxico, um veículo de PEG, uma enzima ou um marcador.

[00074] Também é contemplado neste documento um polinucleotídeo isolado codificando uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de quaisquer de SEQ ID NO: 1 a 4, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID. NO. 50, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 73.

[00075] Também é contemplado neste documento um polinucleotídeo isolado codificando uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de quaisquer de SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, ou SEQ ID NO:76.

[00076] A invenção adicionalmente se refere ao uso dos anticorpos descritos neste documento para a manufatura de um medicamento para o bloqueio da função da CD40 humana em um mamífero, onde o medicamento bloqueia uma resposta imune mediada pela CD40 no dito mamífero.

[00077] Em uma modalidade, a invenção refere-se à manufatura de um medicamento para tratar ou melhorar a doença do enxerto vs. hospedeiro em um mamífero.

[00078] Nas modalidades ilustrativas, o medicamento é manufaturado para o tratamento de uma doença autoimune ou inflamatória selecionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide, esclerose múltipla, glomerulonefrite proliferativa por lúpus, doença inflamatória do intestino (IBD), psoríase, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), Doença de Crohn e lúpus eritematoso sistêmico (SLE), tiroidite de Hashimoto, mixoedema primário, tireotoxicose/doença de Graves, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, cardite autoimune, doença de Addison, menopausa prematura, diabete melito tipo 1, síndrome de Good pasture, miastenia grave, anemia hemolítica autoimune, leucopenia idiopática, cirrose biliar primária, hepatite crônica ativa (HBs Ag negativa), cirrose criptogênica, síndrome de Sjogren, dermatomiosite, esclerodermia, doença do tecido conjuntivo misto, lúpus eritematoso discoide, e vasculite sistêmica.

[00079] Em algumas modalidades, o medicamento pode adicionalmente compreender um segundo agente terapêutico selecionado a partir do grupo que consiste em um antagonista de TNF, um fármaco antirreumático modificador da doença, um antagonista de CTLA4, um mAb antirreceptor de IL-6 e um mAb anti-CD20.

[00080] O medicamento pode ser manufaturado para uso em uma via parenteral de administração. O medicamento pode ser manufaturado para uso de modo intravenoso ou subcutâneo.

[00081] Outra modalidade contempla um uso dos anticorpos descritos neste documento para a manufatura de um medicamento para a inibição da produção de anticorpos por células B em um paciente humano.

[00082] Outra modalidade contempla um uso dos anticorpos descritos neste documento para a manufatura de um medicamento para a inibição do crescimento e/ou da diferenciação das células que expressam o antígeno CD40 humano.

[00083] Outra modalidade contempla um uso dos anticorpos descritos neste documento para a manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente tendo um distúrbio associado à CD40, onde a ligação do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno no dito medicamento à CD40 inibe o crescimento ou a diferenciação das células do distúrbio associado à CD40.

[00084] O medicamento pode ser manufaturado para uso no tratamento de células de um distúrbio associado à CD40 selecionadas a partir de células linfoblastoides B, pancreáticas, células de pulmão, células da mama, células ovarianas, células do cólon, células da próstata, células da pele, células da cabeça e do pescoço, células da bexiga, células do osso ou células do rim.

[00085] O medicamento pode ser manufaturado para uso no tratamento de leucemia linfocítica crônica, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, um linfoma de células T, Linfoma que Não de Hodgkin, Doença de Hodgkin, macroglobulinemia de Waldenstrom ou sarcoma de Kaposi.

[00086] Outra modalidade contempla um uso dos anticorpos da invenção na manufatura de um medicamento para induzir a depleção de células B periféricas, onde o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do medicamento especificamente se liga a um antígeno CD40 da superfície celular humano, onde a ligação do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno ao antígeno CD40 induz a depleção das células.

[00087] O medicamento pode ser manufaturado para uso no tratamento de um paciente tendo um distúrbio imune.

[00088] O medicamento pode ser manufaturado para uso no tratamento de artrite reumatoide ou lúpus eritematoso sistêmico.

[00089] Outra modalidade contempla um uso dos anticorpos da invenção na manufatura de um medicamento para o tratamento de artrite reumatoide em um paciente.

[00090] O medicamento pode ser manufaturado para uso na inibição da diferenciação das células B e da troca de isótipo do anticorpo no dito paciente.

[00091] O medicamento pode ser manufaturado para uso na inibição da produção de citocina e quimiocina e da suprarregulação das moléculas de adesão em células T e macrófagos no dito paciente.

[00092] O medicamento pode ser manufaturado para uso na inibição da ativação das células dendríticas no dito paciente.

[00093] O medicamento pode ser manufaturado para uso na inibição da produção de citocinas proinflamatórias, quimiocinas, metaloproteinases de matriz, prostaglandinas, e infrarregulação das moléculas de adesão em células não imunes no dito paciente.

[00094] Em certas modalidades, o medicamento é manufaturado como um medicamento de combinação a ser administrado em combinação com um regime compreendendo a administração de metotrexato e/ou a administração de Enbrel/Humira.

[00095] Em outras modalidades, o medicamento é manufaturado como um medicamento de combinação e o medicamento, além de compreender os anticorpos da invenção, adicionalmente compreende um agente anti-TNF.

BREVE DESCRIÇÃO DAS DIVERSAS VISTAS DOS DESENHOS

[00096] Figura 1: A. Curvas de ligação e valores de EC50 correspondentes de anticorpos humanizados sobre células HEK-293 transfectadas com CD40 medidos por citometria de fluxo. B. Comparação da ligação do Anticorpo A, do Anticorpo B e do Anticorpo C às células HEK transfectadas com CD40, medida por citometria de fluxo. O dado representativo para um experimento é mostrado.

[00097] Figura 2: Curvas de ligação e valores de EC50 correspondentes de anticorpos humanizados sobre células RAMOS, medidos por citometria de fluxo. O dado representativo para um experimento é mostrado.

[00098] Figura 3: Teste dos anticorpos de camundongos e humanizados quanto à atividade antagonística em um ensaio de proliferação de células B primárias humanas. (A) As curvas de titulação do anticorpo representativas e os valores de IC50 resultantes são representados para cada anticorpo precursor de camundongo. O dado representativo para um doador é mostrado. (B) Sobreposição das curvas de inibição representando o antagonismo de diversos anticorpos anti-CD40 humanizados em comparação com 4D11.

[00099] Figura 4: Resumo dos resultados do teste dos anticorpos humanizados quanto à atividade antagonística (IC50) e agonística (SI = índice de estímulo) em um ensaio de proliferação de células B primárias humanas. Diversos anticorpos anti-CD40, 4D11, G28.5 e 5D12, são mostrados para comparação.

[000100] Figura 5: Teste do Anticorpo B, do Anticorpo A e do Anticorpo C quanto à inibição da suprarregulação de CD86 induzida por CD40 dos ensaios de sangue integral humano. O anticorpo antiCD40 4D11 é mostrado para comparação. O controle de isótipo IgG1 não mostrou nenhum efeito neste ensaio. O dado representativo para um doador é mostrado.

[000101] Figura 6: Resumo dos resultados do teste do Anticorpo B quanto à inibição da suprarregulação de CD86 induzida por CD40 sobre células B purificadas humanas e sangue integral humano. Os dados em ambos os pontos (A) IC50 e (B) IC90 são representados. O controle de isótipo IgG1 não mostrou nenhum efeito em qualquer ensaio. Os dados para os múltiplos doadores (n = 4-5) são resumidos na tabela.

[000102] Figura 7: Teste do Anticorpo B, do Anticorpo A e do Anticorpo C quanto à inibição da suprarregulação de CD86 induzida por CD40 em ensaios de sangue integral de macaco cinomolgo. O controle de isótipo IgG1 não mostrou nenhum efeito neste ensaio. O dado representativo para um doador é mostrado.

[000103] Figura 8: Curvas de concentração no plasma tempo para o Anticorpo A (painel da esquerda) e o Anticorpo B (painel da direita) em macaco cinomolgo após a administração de 1 e 10 mg/kg de cada anticorpo. O dado é o resumo da administração em 3 animais para cada anticorpo.

[000104] Figura 9: Alteração da porcentagem de células B positivas para CD86 a partir de macacos cinomolgos antes da administração do (Anticorpo B) e do (Anticorpo A) e em 3 pontos de tempo após o tratamento com cada anticorpo. O Anticorpo B (Painéis do topo) e o Anticorpo A foram administrados a 3 animais, cada um com 1 mg/kg (painéis da esquerda) ou 10 mg/kg (painéis da direita).

[000105] Figura 10: Níveis de (A) IgG humana e (B) IgM humana em camundongos NSG em 2 semanas após a injeção de 1,25 x 106 PBMC humanas. Os camundongos foram tratados com veículo, um controle de isótipo e os anticorpos Anticorpo A, Anticorpo B e Anticorpo C, em uma dose de 1 mg/kg um dia antes da transferência das PBMC humanas.

[000106] Figura 11: Ligação de diversos anticorpos anti-CD40 humana de camundongo às plaquetas humanas.

[000107] Figura 12: Resumo dos resultados da comparação da ligação do Anticorpo B com o mAb anti-CD40 4D11 sobre células B humanas e plaquetas em sangue integral.

[000108] Figura 13: Atividade de ADCC com as construções de IgG1 do tipo selvagem e nocaute.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[000109] A sinalização mediada pela CD40 é agora reconhecida como estando envolvida em uma variedade de distúrbios alvo. Apesar da disponibilidade de uma variedade de dados pré-clínicos mostrando que a intervenção nestes distúrbios seria terapeuticamente benéfica, permanece uma necessidade por anticorpos anti-CD40 antagonísticos que possam ser usados no tratamento de doenças autoimunes. A presente invenção, nas modalidades preferidas, refere-se aos anticorpos humanizados que reconhecem a CD40. Nas modalidades específicas, a sequência destes anticorpos humanizados foi identificada com base nas sequências de certos anticorpos de camundongos de orientação.

[000110] Os termos "CD40" e "antígeno de superfície CD40" referem-se a uma glicoproteína de aproximadamente 48 kD expressa sobre a superfície de células B normais e neoplásticas, que atua como um receptor para os sinais envolvidos na proliferação e na diferenciação celular (Ledbetter e col., 1987, J. Immunol. 138:788- 785). Uma molécula de cDNA codificando a CD40 foi isolada de uma biblioteca preparada a partir da linhagem de células de linfoma de Burkitt Raji (Stamenkovic e col., 1989, EMBO J. 8:1403).

[000111] Conforme usado neste documento, uma célula que expressa endogenamente a CD40 é qualquer célula caracterizada pela expressão de superfície de CD40, incluindo, porém não limitada às células B normais e neoplásticas, células de interdigitação, células epiteliais basais, células de carcinoma, macrófagos, células endoteliais, células dendríticas foliculares, células de amígdalas, e células plasmáticas derivadas da medula óssea. Em algumas modalidades, a molécula de CD40 é uma molécula de CD40 humana.

[000112] Os anticorpos da invenção especificamente se ligam à CD40 recombinante e nativa humana. Um anticorpo monoclonal humanizado, onde o dito anticorpo especificamente se liga à CD40 humana tendo uma atividade antagonística, IC50, de menos do que 1 nM e não tem nenhum agonismo até 100 g/ml na proliferação de células B e onde o dito anticorpo é adicionalmente caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem uma meia-vida in vivo em primatas não humanos que é pelo menos 10 dias.

[000113] De preferência, o anticorpo especificamente se liga à CD40 no conjugado de CD40-Fc com uma EC50 de menos do que 1 nM e à CD40 nas células que expressam a CD40 com uma EC50 de menos do que 2,5 nM. As propriedades antagonísticas do anticorpo são definidas pelo fato de que ele tem uma atividade antagonística em células B ou célula dendrítica IC50 de menos do que 1 nM. O anticorpo adicionalmente tem propriedades farmacocinéticas superiores, tendo uma meia-vida in vivo aumentada em comparação com outros anticorpos anti-CD40 (por exemplo, o anticorpo anti-CD40 4D11).

[000114] Conforme usado neste documento, uma célula que expressa a CD40 é qualquer célula caracterizada pela expressão de superfície de CD40, incluindo, porém não limitada às células B normais e neoplásticas, células de interdigitação, células epiteliais basais, células de carcinoma, macrófagos, células endoteliais, células dendríticas foliculares, células de amígdalas, e células plasmáticas derivadas da medula óssea. Em algumas modalidades, a molécula de CD40 é uma molécula de CD40 humana.

[000115] Os anticorpos da presente invenção reconhecem o "epitopo de antígeno CD40" específico e o "epitopo de CD40". Conforme usado neste documento, estes termos referem-se a uma molécula (por exemplo, um peptídeo) ou um fragmento de uma molécula capaz de imunorreatividade com um anticorpo anti-CD40 e, por exemplo, incluem um determinante antigênico de CD40 reconhecido pelos quaisquer dos anticorpos tendo uma combinação de sequências da cadeia pesada/cadeia leve de SEQ ID NO:26 de cadeia leve com quaisquer das SEQ ID NOs: 27, 28, 29 ou 30 de cadeia pesada; ou SEQ ID NO: 31 de cadeia leve com quaisquer das SEQ ID NOs 32, 33, 34 ou 35 de cadeia pesada; ou SEQ ID NO 36 de cadeia leve com quaisquer das SEQ ID NOs 37, 38, 39 ou 40 de cadeia pesada. Os epitopos de antígeno CD40 podem estar incluídos em proteínas, fragmentos de proteínas, peptídeos ou similares. Os epitopos são mais comumente as proteínas, os oligopeptídeos curtos, os imitadores de oligopeptídeos (isto é, compostos orgânicos que imitam as propriedades de ligação ao anticorpo do antígeno CD40), ou as suas combinações.

[000116] A estrutura generalizada de anticorpos ou imunoglobulina é bastante conhecida para aqueles de habilidade na técnica, estas moléculas são glicoproteínas heterotetraméricas, tipicamente de cerca de 150.000 daltons, compostas de duas cadeias leves (L) idênticas e duas cadeias pesadas (H) idênticas. Cada cadeia leve está covalentemente ligada a uma cadeia pesada por uma ligação dissulfeto para formar um heterodímero, e a molécula heterotramérica é formada através de uma ligação dissulfeto covalente entre as duas cadeias pesadas idênticas dos heterodímeros. Embora as cadeias leve e pesada estejam ligadas conjuntamente por uma ligação dissulfeto, o número de ligações dissulfeto entre as duas cadeias pesadas varia pelo isótipo da imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também tem pontes de dissulfeto regularmente espaçadas dentro da cadeia. Cada cadeia pesada tem na extremidade de amino um domínio variável (VH), seguido por três ou quatro domínios constantes (CH1, CH2, CH3, e CH4), bem como uma região de articulação entre CH1 e CH2. Cada cadeia leve tem dois domínios, um domínio variável amino terminal (VL) e um domínio constante carbóxi terminal (CL). O domínio VL associa-se de modo não covalente com o domínio VH, enquanto o domínio CL é comumente ligado de modo covalente ao domínio CH1 por meio de uma ligação dissulfeto. Acredita-se que os resíduos de aminoácidos particulares formem uma interface entre os domínios variáveis das cadeias leve e pesada (Chothia e col., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663).

[000117] Certos domínios dentro dos domínios variáveis diferem extensivamente entre os diferentes anticorpos, isto é, são "hipervariáveis". Estes domínios hipervariáveis contêm resíduos que estão diretamente envolvidos na ligação e na especificidade de cada anticorpo particular por seu determinante antigênico específico. A hipervariabilidade, tanto na cadeia leve quanto nos domínios variáveis da cadeia pesada, está concentrada em três segmentos conhecidos como regiões determinantes da complementariedade (CDRs) ou loops hipervariáveis (HVLs). As CDRs são definidas por comparação das sequências em Kabat e col., 1991, Em: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., enquanto os HVLs são estruturalmente definidos de acordo com a estrutura tridimensional do domínio variável, conforme descrito por Chothia e Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917. Onde estes dois métodos resultarem em identificações ligeiramente diferentes de uma CDR, a definição estrutural é preferida. Conforme definido por Kabat, a CDR-L1 está posicionada em torno dos resíduos 24-34, a CDR-L2, em torno dos resíduos 50-56, e a CDR-L3, em torno dos resíduos 89-97 no domínio variável da cadeia leve; a CDR-H1 está posicionada em torno dos resíduos 31-35, a CDR-H2 em torno dos resíduos 50-65, e a CDR-H3 em torno dos resíduos 95-102 no domínio variável da cadeia pesada. A CDR1, a CDR2, a CDR3 das cadeias pesadas e leves, portanto, definem as propriedades únicas e funcionais, específicas para um dado anticorpo.

[000118] As três CDRs dentro de cada uma das cadeias pesada e leve são separadas por regiões de estrutura (FR), que contêm sequências que tendem a ser menos variáveis. A partir da extremidade de amino até a extremidade de carbóxi dos domínios variáveis das cadeias pesadas e leves, as FRs e as CDRs estão dispostas na ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FR4. A configuração predominantemente de folha  das FRs coloca as CDRs dentro de cada uma das cadeias em proximidade íntima uma com a outra, bem como com as CDRs da outra cadeia. A conformação resultante contribui para o local de ligação ao antígeno (ver Kabat e col, 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, páginas 647-669), embora nem todos os resíduos de CDR estejam necessariamente envolvidos diretamente na ligação ao antígeno.

[000119] Os resíduos de FR e os domínios constantes da Ig não estão diretamente envolvidos na ligação ao antígeno, porém contribuem para a ligação ao antígeno e/ou mediam a função efetora do anticorpo. Acredita-se que alguns resíduos de FR tenham um efeito significativo sobre a ligação ao antígeno em pelo menos três modos: ligando-se não covalentemente a um epitopo, interagindo-se com um ou mais resíduos de CDR, e afetando a interface entre as cadeias pesada e leve. Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação ao antígeno, porém mediam diversas funções efetoras da Ig, tais como a participação do anticorpo na citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), na citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e na fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP).

[000120] As cadeias leves de imunoglobulinas de vertebrados são especificadas para uma de duas classes claramente distintas, capa (k) e lambda (λ), com base na sequência de aminoácidos do domínio constante. Por comparação, as cadeias pesadas das imunoglobulinas de mamíferos são especificadas para uma de cinco classes principais, de acordo com a sequência dos domínios constantes: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. A IgG e a IgA são adicionalmente divididas em subclasses (isótipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados α, δ, ε, γ, e µ, respectivamente. As estruturas das subunidades e as configurações tridimensionais das classes de imunoglobulinas nativas são bastante conhecidas.

[000121] Os termos "anticorpo", "anticorpo anti-CD40", "anticorpo anti-CD40 humanizado" e "anticorpo anti-CD40 humanizado variante" são usados neste documento no sentido mais amplo e especificamente incluem os anticorpos monoclonais (incluindo os anticorpos monoclonais de tamanho natural), os anticorpos policlonais, os anticorpos multiespecíficos (por exemplo, os anticorpos biespecíficos), e os fragmentos de anticorpos, tais como os domínios variáveis e outras partes dos anticorpos que exibam uma atividade biológica desejada, por exemplo, a ligação à CD40.

[000122] O termo "anticorpo monoclonal" (mAb) refere-se a um anticorpo de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos; ou seja, os anticorpos individuais naquela população são idênticos, exceto por mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presentes em quantidades modestas. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único determinante antigênico, um "epitopo". Portanto, o modificador "monoclonal" é indicativo de uma população de anticorpos substancialmente homogênea dirigida para o epitopo idêntico e não é para ser interpretado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Deve ser entendido que os anticorpos monoclonais podem ser preparados por qualquer prática ou metodologia conhecida na técnica, incluindo, por exemplo, o método do hibridoma (Kohler e col., 1975, Nature 256:495), ou os métodos de DNA recombinante conhecidos na técnica (ver, por exemplo, a Pat. U.S. No. 4.816.567), ou os métodos de isolamento de monoclonal produzido de modo recombinante usando as bibliotecas de anticorpos em fagos, usando as técnicas descritas em Clackson e col., 1991, Nature 352: 624-628, e Marks e col., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597.

[000123] Os anticorpos quiméricos consistem nas regiões variáveis das cadeias pesada e leve de um anticorpo de uma espécie (por exemplo, um mamífero não humano, tal como um camundongo) e nas regiões constantes das cadeias pesada e leve de um anticorpo de outra espécie (por exemplo, o ser humano) e podem ser obtidos por ligação das sequências de DNA codificando as regiões variáveis do anticorpo da primeira espécie (por exemplo, camundongo) às sequências de DNA para as regiões constantes do anticorpo da segundo espécie (por exemplo, ser humano) e transformação de um hospedeiro com um vetor de expressão contendo as sequências ligadas para permitir que ele produza um anticorpo quimérico. Alternativamente, o anticorpo quimérico também poderia ser um no qual uma ou mais regiões ou domínios da cadeia pesada e/ou leve são idênticos com a, homólogos à, ou uma variante da, sequência correspondente em um anticorpo monoclonal a partir de outra classe ou isótipo de imunoglobulina, ou a partir de uma sequência consenso ou de linha germinativa. Os anticorpos quiméricos podem incluir os fragmentos de tais anticorpos, desde que o fragmento de anticorpo exiba a atividade biológica desejada de seu anticorpo de origem, por exemplo, a ligação ao mesmo epitopo (ver, por exemplo, a Pat. U.S. No. 4.816.567; e Morrison e col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).

[000124] Os termos "fragmento de anticorpo", "fragmento de anticorpo anti-CD40", "fragmento de anticorpo anti-CD40 humanizado", "fragmento de anticorpo anti-CD40 humanizado variante" referem-se a uma parte de um anticorpo anti-CD40 de tamanho natural, em que uma região variável ou uma capacidade funcional é conservada, por exemplo, a ligação específica ao epitopo de CD40. Os exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, porém não estão limitados a um fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv e scFv-Fc, um diacorpo, um anticorpo linear, um anticorpo de uma única cadeia, um minicorpo, um diacorpo formado a partir de fragmentos de anticorpos, e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

[000125] Os anticorpos de tamanho natural podem ser tratados com enzimas, tais como a papaína ou a pepsina, para gerar fragmentos de anticorpos úteis. A digestão com papaína é usada para produzir dois fragmentos de anticorpos idênticos que se ligam ao antígeno, chamados fragmentos "Fab", cada um com um único sítio de ligação ao antígeno, e um fragmento "Fc" residual. O fragmento Fab também contém o domínio constante da cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada. O tratamento com pepsina produz um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios de ligação ao antígeno e ainda é capaz de reticular o antígeno.

[000126] Os fragmentos Fab' diferem dos fragmentos Fab pela presença de resíduos adicionais, incluindo uma ou mais cisteínas da região de articulação do anticorpo na extremidade de C do domínio CH1. Os fragmentos de anticorpos F(ab')2 são pares de fragmentos Fab' ligados por resíduos de cisteína na região de articulação. São também conhecidos outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpos.

[000127] O fragmento "Fv" contém um sítio de reconhecimento e de ligação ao antígeno completo consistindo em um dímero de um domínio variável da cadeia pesada e um da cadeia leve em associação firme, não covalente. Nesta configuração, as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação ao antígeno sobre a superfície do dímero VH-VL. Coletivamente, as seis CDRs conferem ao anticorpo especificidade de ligação ao antígeno.

[000128] Um fragmento de anticorpo "Fv de uma única cadeia" ou "scFv" é uma variante de Fv de uma única cadeia compreendendo os domínios VH e VL de um anticorpo, onde os domínios estão presentes em uma única cadeia polipeptídica. O Fv de uma única cadeia é capaz de reconhecer e ligar o antígeno. O polipeptídeo de scFv pode opcionalmente também conter um ligador polipeptídico posicionado entre os domínios VH e VL, para facilitar a formação de uma estrutura tridimensional desejada para a ligação ao antígeno pelo scFv (ver, por exemplo, Pluckthun, 1994, Em The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova York, págs. 269-315).

[000129] Os outros fragmentos de anticorpos reconhecidos incluem aqueles que compreendem um par de segmentos de Fd em série (VH-CH1-VH-CH1) para formar um par de regiões de ligação aos antígenos. Estes "anticorpos lineares" podem ser biespecíficos ou monoespecíficos, conforme descrito, por exemplo, em Zapata e col. 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062.

[000130] Um anticorpo humanizado ou um fragmento de anticorpo humanizado é um tipo específico de anticorpo quimérico que inclui uma variante da sequência de aminoácidos da imunoglobulina, ou o seu fragmento, que é capaz de ligar-se a um antígeno predeterminado e que compreende uma ou mais FRs tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e uma ou mais CDRs tendo substancialmente a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina não humana. Esta sequência de aminoácidos não humana, frequentemente referida como uma sequência de "importação", é tipicamente obtida de um domínio do anticorpo de "importação", particularmente um domínio variável. Em geral, um anticorpo humanizado inclui pelo menos as CDRs ou os HVLs de um anticorpo não humano, inseridas entre as FRs de um domínio variável da cadeia pesada ou leve humano. A presente invenção descreve anticorpos anti-CD40 humanizados específicos que contêm CDRs derivadas dos anticorpos monoclonais murinos mostrados nas Tabelas 3 e 4, inseridas entre as FRs dos domínios variáveis das cadeias pesadas e leves de sequências de linhas germinativas humanas. Será entendido que certos resíduos de FR murinos podem ser importantes para a função dos anticorpos humanizados e, portanto, certos dos resíduos dos domínios variáveis das cadeias pesadas e leves de sequências de linhas germinativas humanas são modificados para serem iguais àqueles da sequência de rato correspondente.

[000131] Em outro aspecto, um anticorpo anti-CD40 humanizado compreende substancialmente todos os, pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis (tais como contidos, por exemplo, nos fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, e Fv), em que todas, ou substancialmente todas, as CDRs correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana, e especificamente neste documento, todas as CDRs são sequências de ratos como detalhadas nas Tabelas 1 até 4 aqui abaixo, e todas, ou substancialmente todas, as FRs são aquelas de uma sequência consenso ou de linha germinativa da imunoglobulina humana. Em outro aspecto, um anticorpo anti-CD40 humanizado também inclui pelo menos uma parte de uma região Fc da imunoglobulina, tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Normalmente, o anticorpo conterá tanto a cadeia leve quanto pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir uma ou mais das regiões CH1, de articulação, CH2, CH3, e/ou CH4 da cadeia pesada, conforme apropriado.

[000132] Um anticorpo anti-CD40 humanizado pode ser selecionado a partir de qualquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, e qualquer isótipo, incluindo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Por exemplo, o domínio constante pode ser um domínio constante de fixação de complemento onde for desejado que o anticorpo humanizado exiba atividade citotóxica, e o isótipo é tipicamente a IgG1. Onde tal atividade citotóxica não for desejável, o domínio constante pode ser de outro isótipo, por exemplo, IgG2. Um anticorpo anti-CD40 humanizado alternativo pode compreender sequências de mais do que uma classe ou isótipo de imunoglobulina, e a seleção de domínios constantes particulares para otimizar as funções efetoras desejadas está dentro da habilidade comum na técnica. Nas modalidades específicas, a presente invenção proporciona anticorpos que são anticorpos IgG1 e, mais particularmente, são anticorpos IgG1 nos quais há um nocaute das funções efetoras.

[000133] As FRs e as CDRs, ou os HVLs, de um anticorpo anti-CD40 humanizado não necessitam corresponder exatamente às sequências parentais. Por exemplo, um ou mais resíduos na CDR, ou HVL, de importação ou na sequência da FR consenso ou de linha germinativa podem ser alterados (por exemplo, mutagenizados) por substituição, inserção ou remoção, de modo tal que o resíduo de aminoácido resultante não mais seja idêntico ao resíduo original na posição correspondente, em qualquer sequência parental, porém o anticorpo, apesar disso, conserva a função de ligação à CD40. Tal alteração tipicamente não será extensa e serão alterações conservativas. Normalmente, pelo menos 75% dos resíduos de anticorpos humanizados corresponderão àqueles das sequências da FR consenso ou de linha germinativa e da CDR de importação parentais, mais frequentemente pelo menos 90%, e mais frequentemente ainda mais do que 95%, ou mais do que 98% ou mais do que 99%.

[000134] Os resíduos de imunoglobulina que afetam a interface entre as regiões variáveis das cadeias pesadas e leves ("a interface VL-VH") são aqueles que afetam a proximidade ou a orientação das duas cadeias em relação uma à outra. Certos resíduos que podem estar envolvidos nas interações entre as cadeias incluem os resíduos de VL 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96, e 98 e os resíduos de VH 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100, e 103 (utilizando o sistema de numeração apresentado em Kabat e col., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)). A Pat. U.S. No. 6.407.213 também discute que os resíduos, tais como os resíduos de VL 43 e 85, e os resíduos de VH 43 e 60, também podem estar envolvidos nesta interação. Embora estes resíduos sejam indicados para a IgG humana somente, eles são aplicáveis através das espécies. Os resíduos de anticorpos importantes, que são razoavelmente esperados estarem envolvidos nas interações entre as cadeias, são selecionados para a substituição na sequência consenso.

[000135] Os termos "sequência consenso" e "anticorpo consenso" referem-se a uma sequência de aminoácidos que compreende o resíduo de aminoácido que mais frequentemente ocorre em cada posição em todas as imunoglobulinas de qualquer classe, isótipo, ou estrutura da subunidade particular, por exemplo, um domínio variável da imunoglobulina humana. A sequência consenso pode ser baseada em imunoglobulinas de uma espécie particular ou de muitas espécies. Uma sequência, estrutura, ou anticorpo "consenso" é entendido incluir uma sequência humana consenso, como descrita em certas modalidades, e referir-se a uma sequência de aminoácidos que compreende os resíduos de aminoácidos que mais frequentemente ocorrem em cada posição em todas as imunoglobulinas humanas de qualquer classe, isótipo, ou estrutura da subunidade particular. Desse modo, a sequência consenso contém uma sequência de aminoácidos tendo em cada posição um aminoácido que está presente em uma ou mais imunoglobulinas conhecidas, porém que pode não exatamente duplicar a sequência de aminoácidos inteira de qualquer imunoglobulina individual. A sequência consenso da região variável não é obtida a partir de qualquer anticorpo ou imunoglobulina naturalmente produzida. Kabat e col., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., e suas variants. As FRs das sequências consenso das cadeias pesadas e leves, e as suas variantes, proporcionam sequências úteis para a preparação de anticorpos antiCD40 humanizados. Ver, por exemplo, as Pats. U.S. Nos. 6.037.454 e 6.054.297.

[000136] As sequências da linha germinativa humana são encontradas naturalmente na população humana. Uma combinação daqueles genes da linha germinativa gera a diversidade de anticorpos. As sequências dos anticorpos da linha germinativa para a cadeia leve do anticorpo originam-se dos genes v e genes j capa e lambda da linha germinativa humana conservada. Similarmente, as sequências para as cadeias pesadas originam-se dos genes v, d e j da linha germinativa (LeFranc, M-P, e LeFranc, G, "The Immunoglobulin Facts Book" Academic Press, 2001).

[000137] Conforme usados neste documento, "variante", "variante anti-CD40", "variante anti-CD40 humanizada" ou "anti-CD40 humanizado variante", cada um, referem-se a um anticorpo anti-CD40 humanizado tendo pelo menos uma CDR de rato variável da cadeia pesada a partir de quaisquer das sequências de SEQ ID NO: 1 até 4 ou uma sequência da CDR de rato da cadeia leve derivada do anticorpo monoclonal de rato, como mostrada em quaisquer das SEQ ID NO:5 até SEQ ID NO:8, e as sequências da FR derivadas de sequências consenso humanas. As variantes incluem aquelas tendo uma ou mais alterações de aminoácidos em um ou em ambos os domínios variáveis da cadeia leve ou da cadeia pesada, desde que a alteração do aminoácido não prejudique substancialmente a ligação do anticorpo à CD40. Os anticorpos humanizados ilustrativos, produzidos neste documento, incluem aqueles designados como Anticorpo A, Anticorpo B e Anticorpo C, e as diversas sequências das cadeias pesadas e leves do mesmos são mostradas em SEQ ID NOs 26 até SEQ ID NO:40.

[000138] Um anticorpo "isolado" é um que tenha sido identificado e separado e/ou recuperado de um componente de seu ambiente natural. Os componentes contaminantes do ambiente natural do anticorpo são aqueles materiais que possam interferir com os usos diagnósticos ou terapêuticos do anticorpo, e podem ser enzimas, hormônios, ou outros solutos proteináceos ou não proteináceos. Em um aspecto, o anticorpo será purificado até pelo menos mais do que 95% de isolamento por peso de anticorpo.

[000139] Um anticorpo isolado inclui um anticorpo in situ dentro das células recombinantes nas quais ele é produzido, visto que pelo menos um componente do ambiente natural do anticorpo não estará presente. Normalmente, entretanto, um anticorpo isolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação na qual o material celular recombinante é removido.

[000140] O termo "desempenho do anticorpo" refere-se aos fatores que contribuem para o reconhecimento pelo anticorpo do antígeno ou a eficácia de um anticorpo in vivo. As alterações na sequência de aminoácidos de um anticorpo podem afetar as propriedades do anticorpo, tais como o dobramento, e podem influenciar os fatores físicos, tais como a taxa inicial de ligação do anticorpo ao antígeno (ka), a constante de dissociação do anticorpo do antígeno (kd), a constante de afinidade do anticorpo pelo antígeno (Kd), a conformação do anticorpo, a estabilidade da proteína, e a meia-vida do anticorpo.

[000141] O termo "marcado com epitopo", quando usado neste documento, refere-se a um anticorpo anti-CD40 fundido a uma "marca de epitopo". Uma "marca de epitopo" é um polipeptídeo tendo um número suficiente de aminoácidos para proporcionar um epitopo para a produção do anticorpo, contudo é projetada de modo tal que ela não interfira com a atividade desejada do anticorpo anti-CD40 humanizado. A marca de epitopo é normalmente suficientemente única, de modo tal que um anticorpo criado contra a marca de epitopo não reaja cruzado substancialmente com outros epitopos. Os polipeptídeos marcas adequados geralmente contêm pelo menos 6 resíduos de aminoácidos e normalmente contêm cerca de 8 a 50 resíduos de aminoácidos, ou cerca de 9 a 30 resíduos. Os exemplos de marcas de epitopos e do anticorpo que liga o epitopo incluem o polipeptídeo marca flu HA e o seu anticorpo 12CA5 (Field e col., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165); a marca c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 para ela (Evan e col., 1985, Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616); e a marca de glicoproteína D (gD) do Vírus simples da herpes e o seu anticorpo (Paborsky e col. 1990, Protein Engineering 3(6): 547-553). Em certas modalidades, a marca de epitopo é um "epitopo de ligação ao receptor de recuperação". Conforme usado neste documento, o termo "epitopo de ligação ao receptor de recuperação" refere-se a um epitopo da região Fc de uma molécula de IgG (tal como IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4) que é responsável pelo aumento da meia-vida no soro in vivo da molécula de IgG.

[000142] Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem ser conjugados a um agente citotóxico. Este é qualquer substância que iniba ou impeça a função das células e/ou cause a destruição das células. O termo é pretendido incluir os isótopos radioativos (tais como I131, I125, Y90, e Re186), os agentes quimioterápicos, e as toxinas, tais como as toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal, ou animal, e os seus fragmentos. Tais agentes citotóxicos podem ser acoplados aos anticorpos humanizados da presente invenção usando procedimentos padrões, e usados, por exemplo, para tratar um paciente indicado para a terapia com o anticorpo.

[000143] Um "agente quimioterápico" é um composto químico útil no tratamento de câncer. Existem diversos exemplos de agentes quimioterápicos que poderiam ser conjugados com os anticorpos terapêuticos da presente invenção. Os exemplos de tais agentes quimioterápicos incluem os agentes alquilantes, tais como um tiotepa e a ciclofosfamida; os sulfonatos de alquila, tais como o bussulfano, o improssulfano, e o pipossulfano; as aziridinas, tais como a benzodopa, a carboquona, a meturedopa, e uredopa; as etileniminas e as metilamelaminas, incluindo a altretamina, a trietilenomelamina, a trietilenofosforamida, a trietilenotiofosforamida, e a trimetilolomelamina; as acetogeninas (especialmente a bulatacina e a bulatacinona); a camptotecina (incluindo o análogo sintético topotecano); a briostatina; a calistatina; o CC-1065 (incluindo os seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina, e bizelesina); as criptoficinas (particularmente a criptoficina 1 e a criptoficina 8); a dolastatina, as auristatinas, (incluindo os análogos monometil-auristatina E e monometil-auristatina F); a duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 e CBI-TMI); a eleuterobina; a pancratistatina; a sarcodictiína; a espongistatina; as mostardas nitrogenadas, tais como o clorambucil, a clomafazina, a colofosfamida, a estramustina, a ifosfamida, a mecloretamina, o cloridrato de óxido de mecloretamina, o melfalano, a novembiquina, a fenesterina, a prednimustina; a trofosfamida, a mostarda de uracila; as nitrosureias, tais como a carmustina, a clorozotocina, a fotemustina, a lomustina, a nimustina, a ranimustina; os antibióticos, tais como os antibióticos de enediína (por exemplo, a caliqueamicina, especialmente a caliquemicina gama1I e a caliqueamicina phiI1, ver, por exemplo, Agnew, Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186; a dinemicina, incluindo a dinemicina A; os bisfosfonatos, tais como o clodronato; a esperamicina; bem como o cromóforo de neocarzinoestatina e os cromóforos antibióticos da cromoproteína enediína relacionados), as aclacinomisinas, a actinomicina, a autramicina, a azaserina, as bleomicinas, a cactinomicina, a carabicina, a caminomicina, a carzinofilina, as cromomicinas, a dactinomicina, a daunorrubicina, a detorrubicina, a 6-diazo-5-oxo-Lnorleucina, a doxorrubicina (Adriamycin®) (incluindo a morfolinodoxorrubicina, a cianomorfolino-doxorrubicina, a 2-pirrolinodoxorrubicina, e a desoxidoxorrubicina), a epirrubucina, a esorrubicina, a idarrubicina, a marcelomicina, as mitomicinas, tais como a mitomicina C, o ácido micofenólico, a nogalamicina, as olivomicinas, a peplomicina, a potfiromicina, a puromicina, a quelamicina, a rodorrubicina, a estreptonigrina, a estreptozocina, a tubercidina, o ubenimex, a zinostatina, a zorrubicina; os antimetabólitos, tais como o metotrexato e o 5-fluorouracil (5-FU); os análogos de ácido fólico, tais como a denopterina, o metotrexato, a pteropterina, o trimetrexato; os análogos de purina, tais como a fludarabina, a 6-mercaptopurina, a tiamiprina, a tioguanina; os análogos de pirimidina, tais como a ancitabina, a azacitidina, a 6-azauridina, o carmofur, a citarabina, a didesoxiuridina, a doxifluridina, a enocitabina, a floxuridina; os andrógenos, tais como a calusterona, o propionato de dromostanolona, o epitiostanol, o mepitiostano, a testolactona; os antiadrenais, tais como a aminoglutetimida, o mitotano, o trilostano; o supridor de ácido fólico, tal como o ácido frolínico; a aceglatona; o glicosídeo de aldofosfamida; o ácido aminolevulínico; o eniluracil; a ansacrina; o bestrabucil; o bisantreno; o edatraxato; a defofamina; a democolcina; a diaziquona; a elfomitina; o acetato de eliptínio; uma epotilona; o etoglucid; o nitrato de gálio; a hidroxiureia; o lentinano; a lonidamina; os maytansinoides, tais como a maytansina e as ansamitocinas; a mitoguazona, a mitoxantrona; o mopidamol; a nitracrina; a pentostatina; o fenamet; a pirarrubicina; a losoxantrona; o ácido podofilínico; a 2-etilidrazida; a procarbazina; o PSK®; o razoxano; a rizoxina; o sizofurano; o espirogermânio; o ácido tenuazônico; a triaziquona; a 2,2',2''-triclorotrietilamina; os tricotecenos (especialmente a toxina T-2, a verracurina A, a roridina A e a anguidina); a uretana; a vindesina; a dacarbazina; a manomustina; o mitabronitol; o mitolactol; o pipobromano; a gacitosina; o arabinosídeo ("Ara-C"); a ciclofosfamida; o tiotepa; os taxoides, por exemplo, o paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) e o doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, França); o clorambucil; a gencitabina (Gemzar®); a 6-tioguanina; a mercaptopurina; o metotrexato; os análogos de platina, tais como a cisplatina e a carboplatina; a vimblastina; a platina; a etoposida (VP16); a ifosfamida; a mitoxantrona; a vincristina; a vinorrelbina Navelbine®); a novantrona; o teniposídeo; o edatrexato; a daunomicina; a aminopterina; a xeloda; o ibandronato; o CPT-11; o inibidor da topoisomerase RFS 2000; a difluormetilornitina (DMFO); os retinoides, tais como o ácido retinoico; a capecitabina; e os sais farmaceuticamente aceitáveis, os ácidos, ou os derivados de quaisquer dos acima mencionados. Também estão incluídos nesta definição os agentes anti-hormonais que atuam para regular ou inibir a ação do hormônio sobre os tumores, tais como os antiestrogênios e os moduladores seletivos do receptor de estrogênio (SERMs), incluindo, por exemplo, o tamoxifeno (incluindo o Nolvadex®), o raloxifeno, o droloxifeno, o 4-hidroxitamoxifeno, o trioxifeno, o queoxifeno, o LY117018, a onapristona, e o toremifeno (Fareston®); os inibidores da aromatase que inibem a enzima aromatase, a qual regula a produção de estrogênio nas glândulas adrenais, tais como, por exemplo, os 4(5)- imidazóis, a aminoglutetimida, o acetato de megestrol (Megace®), o exemestano, o formestano, o fadrozol, o vorozol (Rivisor®), o letrozol (Femara®), e o anastrozol (Arimidex®); e os antiandrogênios, tais como a flutamida, a nilutamida, a bicalutamida, o leuprolídeo, e a goserelina; e os sais farmaceuticamente aceitáveis, os ácidos, ou os derivados de quaisquer dos acima descritos. Qualquer um ou mais destes agentes podem ser conjugados aos anticorpos humanizados da presente invenção para proporcionar um agente terapêutico útil para o tratamento de diversos distúrbios.

[000144] Os anticorpos também podem ser conjugados aos profármacos. Um "profármaco" é uma forma de precursor ou derivado de uma substância farmaceuticamente ativa que é menos citotóxica para as células de tumor em comparação com o fármaco de origem e é capaz de ser enzimaticamente ativada ou convertida na forma mais ativa. Ver, por exemplo, Wilman, 1986, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Em Biochemical Society Transactions, 14, págs. 375- 382, 615th Meeting Belfast e Stella e col., 1985, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Em: "Directed Drug Delivery, Borchardt e col., (ed.), págs. 247-267, Humana Press. Os profármacos úteis incluem, porém não estão limitados aos profármacos contendo fosfato, profármacos contendo tiofosfato, profármacos contendo sulfato, profármacos contendo peptídeos, profármacos modificados com D-aminoácido, profármacos glicosilados, profármacos contendo - lactam, profármacos contendo fenoxiacetamida opcionalmente substituída, e profármacos contendo fenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorcitosina e outros profármacos de 5-fluoruridina que possam ser convertidos no fármaco livre citotóxico mais ativo. Os exemplos de fármacos citotóxicos que podem ser derivados em uma forma de profármaco incluem, porém não estão limitados àqueles agentes quimioterápicos descritos acima.

[000145] Para propósitos de monitoramento diagnóstico, bem como terapêutico, os anticorpos da invenção também podem ser conjugados a uma marca, ou uma marca sozinha ou uma marca e um segundo agente adicional (profármaco, agente quimioterápico e similar). Uma marca, conforme distinguida dos outros segundos agentes, refere-se a um agente que é um composto ou composição detectável e pode ser conjugada direta ou indiretamente a um anticorpo humanizado da presente invenção. A marca pode, ela própria, ser detectável (por exemplo, marcas de radioisótopos ou marcas fluorescentes) ou, no caso de uma marca enzimática, pode catalisar a alteração química de um composto ou composição de substrato que seja detectável. O anticorpo anti-CD40 humanizado marcado pode ser preparado e usado em diversas aplicações, incluindo os diagnósticos in vitro e in vivo.

[000146] Os anticorpos da presente invenção podem ser formulados como parte de uma preparação lipossômica, para efetuar a sua liberação in vivo. Um "lipossomo" é uma pequena vesícula composta de diversos tipos de lipídios, fosfolipídios, e/ou tensoativo. Os lipossomos são úteis para a liberação para um mamífero de um composto ou formulação, tal como um anticorpo anti-CD40 humanizado divulgado neste documento, opcionalmente, acoplado a, ou em combinação com, um ou mais agentes farmaceuticamente ativos e/ou marcas. Os componentes do lipossomo são comumente arranjados em uma formação de bicamada, similar ao arranjo lipídico das membranas biológicas.

[000147] Certos aspectos da presente invenção relacionam-se aos ácidos nucleicos isolados que codificam um ou mais domínios dos anticorpos humanizados da presente invenção. Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula de ácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma molécula de ácido nucleico contaminante com a qual ela está normalmente associada na origem natural do ácido nucleico do anticorpo. Uma molécula de ácido nucleico isolada é distinguida da molécula de ácido nucleico visto que ela existe em células naturais.

[000148] Em diversos aspectos da presente invenção, um ou mais domínios dos anticorpos humanizados serão expressos de modo recombinante. Tal expressão recombinante pode empregar uma ou mais sequências de controle, isto é, sequências de polinucleotídeos necessárias para a expressão de uma sequência de codificação operavelmente ligada em um organismo hospedeiro particular. As sequências de controle, adequadas para uso em células procarióticas, incluem, por exemplo, as sequências de promotor, operador, e sítio de ligação ao ribossomo. As sequências de controle eucarióticas incluem, porém não estão limitadas aos promotores, sinais de poliadenilação, e reforçadores. Estas sequências de controle podem ser utilizadas para a expressão e a produção de anticorpo anti-CD40 humanizado em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas.

[000149] Uma sequência de ácidos nucleicos está "operavelmente ligada" quando ela for colocada em uma relação funcional com outra sequência de ácidos nucleicos. Por exemplo, uma pré-sequência de ácidos nucleicos ou líder secretória está operavelmente ligada a um ácido nucleico codificando um polipeptídeo se ela for expressa como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou reforçador está operavelmente ligado a uma sequência de codificação se ele afetar a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação ao ribossomo está operavelmente ligado a uma sequência de codificação se ele estiver posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "operavelmente ligado(a)" significa que as sequências de DNA que estão sendo ligadas são contíguas, e, no caso de uma líder secretória, contíguas e estão no quadro de leitura. Entretanto, os reforçadores são opcionalmente contíguos. A ligação pode ser efetuada por ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existirem, podem ser usados adaptadores ou ligadores de oligonucleotídeos sintéticos.

[000150] Conforme usadas neste documento, as expressões "célula", "linhagem celular" e "cultura de células" são usadas de modo intercambiável e todas as tais designações incluem a sua progênie. Desse modo, os "transformantes" e as "células transformadas" incluem a célula exposta primária e as culturas derivadas dela, sem consideração pelo número de transferências.

[000151] O termo "mamífero", para os propósitos de tratamento, refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo os seres humanos, os animais domesticados e da fazenda, e os animais de zoológicos, para esportes, ou de estimação, tais como os cães, os cavalos, os gatos, as vacas, e similares. De preferência, o mamífero é o ser humano.

[000152] Um "distúrbio", conforme usado neste documento, é qualquer condição que se beneficiaria do tratamento com um anticorpo anti-CD40 humanizado descrito aqui. Isto inclui os distúrbios ou as doenças crônicas e agudas, incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio em questão. Os exemplos não limitativos dos distúrbios a serem tratados neste documento incluem o câncer, as malignidades hematológicas, os tumores benignos e malignos, as leucemias e as malignidades linfoides e os distúrbios inflamatórios, angiogênicos, autoimunes e imunológicos.

[000153] Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se à, ou descrevem a, condição fisiológica nos mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento da célula desregulado. Os exemplos de câncer incluem, porém não estão limitados ao carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia.

[000154] Conforme usado neste documento, o termo "distúrbio associado à CD40" ou "doença associada à CD40" refere-se a uma condição na qual é indicada a modificação ou a eliminação de células que expressam a CD40. Estas incluem as células que expressam a CD40 demonstrando proliferação anormal ou as células que expressam a CD40 que estão associadas com o crescimento canceroso ou maligno. Os exemplos mais particulares de cânceres que demonstram expressão anormal do antígeno CD40 incluem as células linfoblastoides B, o linfoma de Burkitt, o mieloma múltiplo, os linfomas de células T, o sarcoma de Kaposi, o osteossarcoma, os tumores epidérmicos e endoteliais, os cânceres pancreáticos, do pulmão, mama, ovarianos, do cólon, próstata, cabeça e pescoço, pele (melanoma), bexiga, e rim. Tais distúrbios incluem, porém não estão limitados às leucemias, linfomas, incluindo o linfoma de células B e o linfoma que não de Hodgkin, mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom; tumores sólidos, incluindo os sarcomas, tais como o osteossarcoma, o sarcoma de Ewing, o melanoma maligno, o adenocarcinoma, incluindo o adenocarcinoma ovariano, o sarcoma de Kaposi/tumor de Kaposi e o carcinoma de células escamosas.

[000155] Um distúrbio associado à CD40 também inclui as doenças e os distúrbios do sistema imune, tais como os distúrbios autoimunes e os distúrbios inflamatórios. Tais condições incluem, porém não estão limitadas à artrite reumatoide (RA), lúpus eritematoso sistêmico (SLE), esclerodermia, síndrome de Sjogren, esclerose múltipla, psoríase, doença inflamatória do intestino (por exemplo, colite ulcerativa e doença de Crohn), inflamação pulmonar, asma, e púrpura trombocitopênica idiopática (ITP).

[000156] A expressão "para o crescimento de" ou "inibitório do crescimento", quando usada neste documento, refere-se à inibição do crescimento ou da proliferação de uma célula, especialmente um tipo de célula neoplástica expressando o antígeno CD40. Desse modo, a inibição do crescimento, por exemplo, reduz significativamente a porcentagem de células neoplásticas na fase S.

[000157] O termo "infusão intravenosa" refere-se à introdução de um agente na veia de um paciente animal ou humano, durante um período de tempo maior do que aproximadamente 15 minutos, geralmente entre aproximadamente 30 a 90 minutos.

[000158] O termo "bolo intravenoso" ou "compressão ("push") intravenosa" refere-se a uma administração de fármaco em uma veia de um animal ou ser humano, de modo tal que o corpo receba o fármaco em aproximadamente 15 minutos ou menos, geralmente 5 minutos ou menos.

[000159] O termo "administração subcutânea" refere-se à introdução de um agente sob a pele de um paciente animal ou humano, de preferência dentro de uma cavidade entre a pele e o tecido subjacente, por liberação relativamente lenta, contínua, a partir de um receptáculo de fármaco. Apertar ou puxar a pele para cima e para fora do tecido subjacente pode criar a cavidade.

[000160] O termo "infusão subcutânea" refere-se à introdução de um fármaco sob a pele de um paciente animal ou humano, de preferência dentro de uma cavidade entre a pele e o tecido subjacente, por liberação relativamente lenta, contínua, a partir de um receptáculo de fármaco, por um período de tempo que inclui, porém não limitado a 30 minutos ou menos, ou 90 minutos ou menos. Opcionalmente, a infusão pode ser feita por implantação subcutânea de uma bomba de liberação de fármaco, implantada sob a pele do paciente animal ou humano, onde a bomba libera uma quantidade predeterminada de fármaco, por um período de tempo predeterminado, tal como 30 minutos, 90 minutos, ou um período de tempo ultrapassando a duração do regime de tratamento.

[000161] O termo "bolo subcutâneo" refere-se à administração do fármaco abaixo da pele de um paciente animal ou humano, onde a liberação do fármaco em bolo é menos do que aproximadamente 15 minutos; em outro aspecto, menos do que 5 minutos, e ainda em outro aspecto, menos do que 60 segundos. Também mesmo em outro aspecto, a administração é dentro de uma cavidade entre a pele e o tecido subjacente, onde a cavidade pode ser criada apertando ou puxando a pele para cima e para fora do tecido subjacente.

[000162] O termo "quantidade terapeuticamente efetiva" é usado para referir-se a uma quantidade de um agente ativo que alivia ou melhora um ou mais dos sintomas do distúrbio que está sendo tratado. Ao fazer isso, é esta quantidade que tem um resultado benéfico no paciente, por exemplo, um efeito de parada do crescimento ou causa a eliminação da célula. Em um aspecto, a quantidade terapeuticamente efetiva tem atividade apoptótica, ou é capaz de induzir a morte da célula. Em outro aspecto, a quantidade terapeuticamente efetiva refere-se a uma concentração de soro alvo que tenha sido mostrada ser efetiva em, por exemplo, diminuir a progressão da doença. A eficácia pode ser medida nos modos convencionais, dependendo da condição a ser tratada. Por exemplo, nas doenças ou nos distúrbios neoplásticos, caracterizados por células expressando a CD40, a eficácia pode ser medida avaliando-se o tempo até a progressão da doença, ou determinando-se as taxas de respostas.

[000163] Os termos "tratamento" e "terapia" e similares, como usados neste documento, são pretendidos incluir as medidas terapêuticas, bem como profiláticas, ou supressivas, para uma doença ou distúrbio, resultando em qualquer efeito clinicamente desejável ou benéfico, incluindo, porém não limitado ao alívio ou redução de um ou mais sintomas, regressão, redução ou cessação da progressão da doença ou do distúrbio. Desse modo, por exemplo, o termo tratamento inclui a administração de um agente antes do, ou após o, início de um sintoma de uma doença ou distúrbio, com isso impedindo ou removendo um ou mais sinais da doença ou do distúrbio. Como outro exemplo, o termo inclui a administração de um agente após a manifestação clínica da doença, para combater os sintomas da doença. Ademais, a administração de um agente após o início e após os sintomas clínicos terem se desenvolvido, onde a administração afeta os parâmetros clínicos da doença ou do distúrbio, tais como o grau de lesão do tecido ou a quantidade ou a extensão da metástase, quer o tratamento resulte ou não na melhora da doença, compreende o "tratamento" ou a "terapia" como usada neste documento. Ademais, desde que as composições da invenção, sozinhas ou em combinação com outro agente terapêutico, aliviem ou melhorem pelo menos um sintoma de um distúrbio que está sendo tratado, em comparação com aquele sintoma na ausência de uso da composição de anticorpo para CD40 humanizado, o resultado deve ser considerado um tratamento efetivo do distúrbio básico, não obstante se todos os sintomas do distúrbio forem aliviados ou não.

[000164] O termo "bula" é usado para referir-se às instruções normalmente incluídas nas embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informação sobre as indicações, o uso, a administração, as contraindicações e/ou as advertências referentes ao uso de tais produtos terapêuticos.

Anticorpos

[000165] São descritos e divulgados neste documento os anticorpos anti-CD40 humanizados, e as composições e os artigos de manufatura compreendendo um ou mais anticorpos anti-CD40 humanizados da presente invenção. Também são descritos os agentes de ligação que incluem um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo antiCD40 humanizado. Os anticorpos anti-CD40 humanizados e os agentes de ligação podem parar o crescimento das células, causar a eliminação das células que expressam a CD40 ou, caso contrário, induzir ou causar um efeito citotóxico ou citostático sobre as células alvo. Os anticorpos anti-CD40 humanizados e os agentes de ligação podem ser usados no tratamento de uma variedade de doenças ou distúrbios caracterizados pela proliferação de células que expressam o antígeno de superfície CD40. Um anticorpo anti-CD40 humanizado e um agente de ligação à CD40, cada um, incluem pelo menos uma parte que especificamente reconhece um epitopo de CD40 (isto é, um fragmento de ligação ao antígeno).

[000166] Na caracterização inicial, foram selecionados anticorpos murinos com base na caracterização da ligação à CD40.

[000167] A partir destes estudos iniciais, foram selecionados anticorpos murinos que tinham as seguintes regiões variáveis da cadeia pesada mostradas na Tabela 1 e as regiões variáveis da cadeia leve mostradas na Tabela 2:

[000168] Foram selecionadas sequências da estrutura humana para cada um dos líderes de camundongo, com base na homologia da estrutura, na estrutura da CDR, nos resíduos principais conservados, nos resíduos de agrupamento da interface conservados e em outros parâmetros.

[000169] As CDRs da cadeia pesada e da cadeia leve de ratos dos diversos anticorpos murinos selecionados são mostradas na Tabela 3 e na Tabela 4, respectivamente:

[000170] A H-CDR1 listada acima está utilizando a sequência que usa o sistema de numeração de Chothia (Al-Lazikani e col., (1997) JMB 273,927-948). A numeração de Kabat para as sequências é indicada pelo texto em itálico em negrito, e a numeração de IMGT é mostrada pelo texto sublinhado dos resíduos na tabela acima mencionada para CDR1 e CDR2. As sequências para a H-CDR3 para cada um de 2H11, 10F2 e 19B10 é TTSYYVGTYGY (SEQ ID NO:77) e para 20E2 é ARQDGYRYAMDY (SEQ ID NO:78).

[000171] Novamente, o sistema de numeração de Chothia é usado na Tabela 4, com a numeração de Kabat para as sequências sendo indicada pelo texto em itálico, em negrito, e a numeração de IMGT é mostrada pelo texto sublinhado.

[000172] Os Fabs que mostraram ligação melhor ou igual comparados ao Fab de origem quimérico foram selecionados para a conversão em IgG. Os clones a partir da série 20E2 foram convertidos em dois formatos diferentes de IgG: a) a IgG4DM (mutante duplo ("double mutante") tem duas mutações na região Fc / articulação, Ser228Pro, que reduz a formação de semimoléculas, e Leu235Glu, que reduz adicionalmente a ligação ao FcγR. b) a IgG1KO (nocaute ("knock-out") das funções efetoras) tem duas mutações na região Fc, Leu234Ala e Leu235Ala, que reduzem a função efetora, tal como a ligação ao FcγR e ao complemento. Ambos os formatos de IgG são descritos na literatura. O Exemplo 1 descreve a humanização de três candidatos em mais detalhe. Os resultados de tal humanização resultaram em sequências de anticorpos humanizados, que têm as sequências das cadeias pesadas e leves mostradas abaixo:

[000173] Em algumas modalidades, o fragmento de ligação ao antígeno pode, por exemplo, bloquear a proliferação ou, de outro modo, parar o crescimento de uma célula ou causar a sua depleção, morte, ou então a sua eliminação, por exemplo, através da ligação do antígeno de superfície CD40. Por exemplo, nas malignidades de células T e B, frequentemente resultam efeitos antitumor (por exemplo, parada do crescimento, com ou sem eliminação ou apoptose) quando as células malignas são expostas a estímulos que resultam na ativação dos linfócitos normais. Esta parada do crescimento induzida por ativação tem sido observada com sinais através dos receptores de antígenos ou dos receptores coestimuladores (ver, por exemplo, Ashwell e col., 1987, Science 237:61; Bridges e col., 1987, J. Immunol. 139:4242; Page e Defranco, 1988, J. Immunol. 140:3717; e Beckwith e col., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:501). O estímulo de CD40, como resultado da ligação específica por anticorpo ou ligante solúvel, inibe o crescimento de linfomas de células B (ver, por exemplo, Funakoshi e col., 1994, Blood 83:2787-2794). Os agentes que inibem o crescimento de células malignas neste modo e que são dirigidos contra o antígeno de superfície CD40 são exemplos de agentes apropriados.

[000174] Os agentes específicos para CD40 incluem um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-CD40 humanizado que se liga à CD40 (por exemplo, a CD40 humana ou uma variante dela). Os agentes específicos para CD40 e os anticorpos podem ser opcionalmente conjugados com, ou fundidos a, um agente citotóxico ou quimioterápico. Nos aspectos onde o anticorpo humanizado se liga ao antígeno de superfície CD40 e causa a eliminação dos tipos de células que expressam a CD40, a ligação é geralmente caracterizada guiando-se para a célula de antígeno de superfície CD40 in vivo. Os agentes de ligação adequados ligam o antígeno CD40 com afinidade e/ou avidez suficientes, de modo tal que o agente específico para CD40 seja útil como um agente terapêutico alvejando especificamente uma célula expressando o antígeno.

[000175] Em alguns aspectos, o anticorpo humanizado diminui a ligação do ligante de CD40 à CD40 em pelo menos 45%, em pelo menos 50%, em pelo menos 60% ou em pelo menos 75% ou pelo menos 80%, ou pelo menos 90%, ou pelo menos 95%.

[000176] Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD40 humanizados, incluindo os seus fragmentos de ligação ao antígeno, tais como os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves, compreendem uma sequência de aminoácidos dos resíduos derivados das CDRs de Anticorpo A (sequência da cadeia pesada = SEQ ID NO:27; SEQ ID NO:28; SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:30; sequência da cadeia leve = SEQ ID NO:26), Anticorpo B (sequência da cadeia pesada = SEQ ID NO:32; SEQ ID NO:33; SEQ ID NO:34; ou SEQ ID NO:35; sequência da cadeia leve = SEQ ID NO:31) e Anticorpo C (sequência da cadeia pesada = SEQ ID NO:37; SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39 ou SEQ ID NO:40; sequência da cadeia leve = SEQ ID NO:36;) descritos aqui acima e resíduos de aminoácidos derivados de regiões de estrutura de uma imunoglobulina humana. Os anticorpos anti-CD40 humanizados opcionalmente incluem substituições de aminoácidos específicas nas regiões de estrutura de consenso ou de linha germinativa.

[000177] A substituição específica de resíduos de aminoácidos nestas posições da estrutura pode melhorar diversos aspectos do desempenho do anticorpo, incluindo a afinidade de ligação e/ou a estabilidade, sobre aquele demonstrado nos anticorpos humanizados formados por "troca direta" de CDRs ou HVLs nas regiões de estrutura da linha germinativa humana, conforme mostrado nos exemplos abaixo.

[000178] Em algumas modalidades, a presente invenção descreve outros anticorpos monoclonais com sequências da cadeia pesada (VH) de SEQ ID NO:1 até SEQ ID NO:4 e sequências da cadeia leve (VL) de SEQ ID NO:5 a SEQ ID NO:8 (ver as Tabelas 1 e 2 acima). A sequência da CDR destes anticorpos murinos é mostrada nas Tabelas 3 e 4 colocando tais CDRs nas FRs dos domínios variáveis das cadeias pesadas e leves de consenso humanos produzirá os anticorpos humanizados úteis da presente invenção.

[000179] Em algumas modalidades específicas, os anticorpos anti-CD40 humanizados divulgados neste documento compreendem pelo menos um domínio variável da cadeia pesada ou leve compreendendo as CDRs ou os HVLs dos anticorpos monoclonais murinos, como mostrado nas Tabelas 1 até 4 acima, e as FRs dos domínios variáveis das cadeias pesadas e leves da linha germinativa humana. Nas modalidades ilustrativas, os anticorpos humanizados criados neste documento são: Anticorpo A, Anticorpo B e Anticorpo C, e as diversas sequências das cadeias pesadas e leves dos mesmos são mostradas em SEQ ID NOs 26 até SEQ ID NO:40.

[000180] Nas modalidades específicas, são contemplados anticorpos que tenham uma sequência da cadeia pesada de qualquer de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:30 em combinação com uma sequência da cadeia leve de SEQ ID NO:26. Os anticorpos alternativos incluem aqueles que têm uma sequência da cadeia pesada de SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 ou SEQ ID NO SEQ ID NO:35, em combinação com uma sequência da cadeia leve de SEQ ID NO:31. Nas modalidades ainda adicionais, proporcionam-se anticorpos humanizados que têm uma sequência da cadeia pesada de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39 ou SEQ ID NO: 40, em combinação com uma sequência da cadeia leve de SEQ ID NO:36.

[000181] As CDRs destas sequências são mostradas nas Tabelas 3 e 4. Nas modalidades específicas, contempla-se que os anticorpos quiméricos com as regiões CDR trocadas (isto é, por exemplo, trocando uma ou duas CDRs do Anticorpo A pela CDR análoga do Anticorpo C) entre estas imunoglobulinas ilustrativas podem produzir anticorpos úteis.

[000182] Em certas modalidades, o anticorpo anti-CD40 humanizado é um fragmento de anticorpo. Os diversos fragmentos de anticorpos foram, em geral, discutidos acima e existem técnicas que foram desenvolvidas para a produção de fragmentos de anticorpos. Os fragmentos podem ser derivados por meio de digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto e col., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117; e Brennan e col., 1985, Science 229:81). Alternativamente, os fragmentos podem ser produzidos diretamente em células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos Fab'-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e acoplados quimicamente para formar fragmentos F(ab')2 (ver, por exemplo, Carter e col., 1992, Bio/Technology 10:163-167). Por outra abordagem, os fragmentos F(ab')2 podem ser isolados diretamente de cultura de células hospedeiras recombinantes. As outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpos serão aparentes para o profissional versado.

[000183] Certas modalidades incluem um fragmento F(ab')2 de um anticorpo anti-CD40 humanizado compreendendo uma sequência da cadeia pesada de qualquer de SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:30 em combinação com uma sequência da cadeia leve de SEQ ID NO:26. Os anticorpos alternativos incluem aqueles que têm uma sequência da cadeia pesada de SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 ou SEQ ID NO:35, em combinação com uma sequência da cadeia leve de SEQ ID NO:31. Nas modalidades ainda adicionais, proporcionam-se anticorpos humanizados que têm uma sequência da cadeia pesada de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:38; SEQ ID NO:39 ou SEQ ID NO: 40, em combinação com uma sequência da cadeia leve de SEQ ID NO:36. Tais modalidades podem incluir um anticorpo intacto compreendendo tal F(ab')2.

[000184] Em algumas modalidades, o anticorpo ou o fragmento de anticorpo inclui uma região constante que media a função efetora. A região constante pode proporcionar respostas de citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC) contra uma célula alvo que expressa a CD40. O(s) domínio(s) efetor(es) pode(m) ser, por exemplo, uma região Fc de uma molécula de Ig. Tipicamente, o agente de ligação à CD40 recruta e/ou ativa leucócitos citotóxicos (por exemplo, as células exterminadoras naturais (NK), as células fagocitóticas (por exemplo, os macrófagos), e/ou os componentes do complemento do soro).

[000185] O domínio efetor de um anticorpo pode ser a partir de qualquer espécie de animal vertebrado e isótipos adequados. Os isótipos de diferentes espécies de animais diferem nas capacidades de mediar as funções efetoras. Por exemplo, a capacidade da imunoglobulina humana de mediar a CDC e a ADCC/ADCP é geralmente na ordem de IgG1≈IgG3>IgG2/IgM/IgG4, respectivamente. As imunoglobulinas de ratos mediam a CDC e a ADCC/ADCP geralmente na ordem de IgM≈IgG3>>IgG2b>IgG2a>>IgG1 e IgG2b>IgG2a>IgG1>>IgG3 de ratos, respectivamente. Em outro exemplo a IgG2a de rato media a ADCC, enquanto ambas IgG2a e IgM de ratos mediam a CDC.

Modificações dos Anticorpos

[000186] Os anticorpos anti-CD40 humanizados e os agentes podem incluir modificações do anticorpo anti-CD40 humanizado ou do seu fragmento de ligação ao antígeno. Por exemplo, pode ser desejável modificar o anticorpo em relação à função efetora, de modo a aumentar a eficácia do anticorpo no tratamento do câncer. Tal modificação é a introdução de resíduo(s) de cisteína na região Fc, com isso permitindo a formação de ligação de dissulfeto entre as cadeias nesta região. O anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade de internalização melhorada e/ou morte celular mediada por complemento e/ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) aumentadas. Ver, por exemplo, Caron e col., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195; e Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922. Os anticorpos homodiméricos tendo atividade antitumor aumentada podem também ser preparados usando reticuladores heterobifuncionais, conforme descritos em Wolff e col., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565. Alternativamente, um anticorpo pode ser engenheirado para conter regiões de Fc duplas, aumentando a lise do complemento e as capacidades de ADCC do anticorpo. Ver Stevenson e col., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230.

[000187] Os anticorpos com capacidade melhorada de suportar a ADCC têm sido gerados por modificação do padrão de glicosilação de sua região Fc. Isto é possível visto que a glicosilação do anticorpo no resíduo de asparagina, N297, no domínio CH2 está envolvida na interação entre os receptores de IgG e Fc, pré-requisito para a ADCC. As linhagens de células hospedeiras têm sido engenheiradas para expressar anticorpos com glicosilação alterada, tal como Nacetilglicosamina de bissecção aumentada ou fucose reduzida. A redução da fucose proporciona maior aumento para a atividade de ADCC do que faz o aumento da presença de N-acetilglicosamina de bissecção. Além disso, o aumento da ADCC por anticorpos com pouca fucose é independente do polimorfismo de FcγRIIIa V/F.

[000188] A modificação da sequência de aminoácidos da região Fc dos anticorpos é uma alternativa para a engenharia de glicosilação para aumentar a ADCC. O sítio de ligação sobre a IgG1 para os receptores de Fcγ foi determinado por análise mutacional extensa. Isto resultou na geração de anticorpos IgG1 humanizados com mutações de Fc que aumentam a afinidade de ligação pelo FcγRIIIa e aumentam a ADCC in vitro. Adicionalmente, foram obtidas variantes de Fc com muitas permutações diferentes das propriedades de ligação, por exemplo, ligação melhorada a receptores FcγR específicos com ligação inalterada ou diminuída a outros receptores FcγR.

[000189] Outro aspecto inclui os imunoconjugados compreendendo o anticorpo humanizado ou os seus fragmentos conjugados a um agente citotóxico, tal como um agente quimioterápico, uma toxina (por exemplo, uma toxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fúngica, vegetal, ou animal, ou os seus fragmentos), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).

[000190] Os agentes quimioterápicos úteis na geração de tais imunoconjugados foram descritos acima. As toxinas enzimaticamente ativas e os seus fragmentos que podem ser usados para formar imunoconjugados úteis incluem a cadeia de difteria A, os fragmentos ativos de não ligação da toxina diftérica, a cadeia da exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa), a cadeia de ricina A, a cadeia de abrina A, a cadeia de modecina A, a alfa-sarcina, as proteínas de Aleurites fordii, as proteínas diantina, as proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), o inibidor de Momordica charantia, a curcina, a crotina, o inibidor de Sapaonaria officinalis, a gelonina, a mitogelina, a restrictocina, a fenomicina, a enomicina, os tricotecenos, e similares. Uma variedade de radionuclídeos está disponível para a produção de anticorpos anti-CD40 humanizados radioconjugados. Os exemplos incluem 212Bi, 131I, 131In, 90Y, e 186Re.

[000191] Os conjugados do anticorpo anti-CD40 humanizado e o agente citotóxico ou quimioterápico podem ser preparados por métodos conhecidos, usando uma variedade de agentes de acoplamento de proteínas bifuncionais, tais como o proprionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), o iminotiolano (IT), os derivados bifuncionais de imidoésteres (tais como o adipimidato de dimetila HCL), os ésteres ativos (tais como o suberato de dissuccinimidila), os aldeídos (tais como o glutaraldeído), os compostos de bis-azido (tais como a bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), os derivados de bisdiazônio (tais como a bis-(p-diazoniobenzoil)-etilenodiamina), os diisocianatos (tais como o 2,6-diisocianato de tolueno), e os compostos de flúor bis-ativos (tais como o 1,5-diflúor-2,4- dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta e col., 1987, Science 238:1098. O ácido 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno triaminopentacético (MX-DTPA) marcado com carbono 14 é um agente quelante ilustrativo para a conjugação do radionuclídeo ao anticorpo. Os conjugados também podem ser formados com um ligador que possa ser clivado.

[000192] Em outra modalidade, o anticorpo pode ser conjugado a um "receptor" (tal como a estreptavidina) para a utilização no préalvejamento do tumor. Neste procedimento, o conjugado de anticorporeceptor é administrado a um paciente, seguido por remoção do conjugado não ligado da circulação usando um agente depurador e então administração de um "ligante" que seletivamente liga o receptor (por exemplo, a avidina), o ligante estando conjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionuclídeo).

[000193] Os anticorpos anti-CD40 humanizados divulgados neste documento podem também ser formulado como imunolipossomos. Os lipossomos contendo o anticorpo são preparados por métodos conhecidos na técnica, tal como descrito em Epstein e col., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688; Hwang e col., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030; e nas Pats. U.S. Nos. 4.485.045 e 4.544.545. Os lipossomos tendo tempo de circulação aumentado são divulgados, por exemplo, na Pat. U.S. No. 5.013.556.

[000194] Lipossomos particularmente úteis podem ser gerados pelo método de evaporação em fase reversa, com uma composição lipídica compreendendo fosfatidilcolina, colesterol e fosfatidiletanolamina derivada por PEG (PEG-PE). Os lipossomos são extrudados através de filtros de tamanho de poro definido, para produzir lipossomos com o diâmetro desejado. Os fragmentos Fab' de um anticorpo divulgado neste documento podem ser conjugados aos lipossomos conforme descrito em Martin e col., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288, por meio de uma reação de troca de dissulfeto. Um agente quimioterápico (tal como a doxorrubicina) está opcionalmente contido no lipossomo. Ver, por exemplo, Gabizon e col., 1989, J. National Cancer Inst. 81(19):1484.

[000195] Os anticorpos descritos e divulgados neste documento podem também ser usados em procedimentos de ADEPT (Terapia de Profármaco com Enzima Dirigida para o Anticorpo) conjugando o anticorpo a uma enzima ativadora de profármaco que converte um profármaco (por exemplo, um agente quimioterápico de peptidila) em um fármaco anticâncer ativo. Ver, por exemplo, o WO 81/01145, o WO 88/07378, e a Pat. U.S. No. 4.975.278. O componente de enzima do imunoconjugado, útil para a ADEPT, é uma enzima capaz de atuar sobre um profármaco de tal maneira a convertê-lo em sua forma citotóxica, mais ativa. As enzimas específicas que são úteis na ADEPT incluem, porém não estão limitadas à fosfatase alcalina para converter os profármacos contendo fosfato em fármacos livres, arilsulfatase para converter profármacos contendo sulfato em fármacos livres; citosina desaminase para converter a 5-fluorcitosina não tóxica no fármaco anticâncer, 5-fluorouracil; proteases, tais como serratia protease, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases, e catepsinas (tais como as catepsinas B e L), para converter profármacos contendo peptídeos em fármacos livres; D-alanilcarboxipeptidases, para converter profármacos contendo substituintes de D-aminoácidos; enzimas que clivam carboidratos, tais como β-galactosidase e neuraminidase, para converter os profármacos glicosilados em fármacos livres; β-lactamase, para converter os fármacos derivados com β-lactams nos fármacos livres; e penicilina amidase, tais como a penicilina V amidase ou a penicilina G amidase, para converter os fármacos derivados nos seus nitrogênios da amina com grupos fenoxiacetila ou fenilacetila, respectivamente, em fármacos livres. Alternativamente, os anticorpos tendo atividade enzimática ("abzimas") podem ser usados para converter os profármacos em fármacos ativos livres (ver, por exemplo, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). Os conjugados de anticorpoabzima podem ser preparados por métodos conhecidos para a liberação da abzima para uma população de células de tumor, por exemplo, ligando covalentemente a enzima ao anticorpo anti-CD40 humanizado/reagentes reticuladores heterobifuncionais discutidos acima. Alternativamente, as proteínas de fusão compreendendo pelo menos a região de ligação ao antígeno de um anticorpo divulgado neste documento, ligada a pelo menos uma parte funcionalmente ativa de uma enzima como descrita acima podem ser construídas usando técnicas de DNA recombinante (ver, por exemplo, Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608).

[000196] Em certas modalidades, pode ser desejável usar um fragmento de anticorpo anti-CD40, em vez de um anticorpo intacto, para aumentar a penetração no tumor, por exemplo. Pode ser desejável modificar o fragmento de anticorpo para aumentar a sua meia-vida no soro. Isto pode ser obtido, por exemplo, através de incorporação de um epitopo de ligação ao receptor de recuperação no fragmento de anticorpo. Em um método, a região apropriada do fragmento de anticorpo pode ser alterada (por exemplo, mutada), ou o epitopo pode ser incorporado em uma marca de peptídeo que é então fundida ao fragmento de anticorpo na extremidade ou no meio, por exemplo, através de síntese de DNA ou de peptídeo. Ver, por exemplo, o WO 96/32478.

[000197] Em outras modalidades, estão também incluídas as modificações covalentes do anticorpo anti-CD40 humanizado. As modificações covalentes incluem a modificação de resíduos de cisteinila, resíduos de histidila, resíduos de lisinila e amino terminais, resíduos de arginila, resíduos de tirosila, grupos laterais de carboxila (aspartila ou glutamila), resíduos de glutaminila e asparaginila, ou resíduos de serila, ou treonila. Outro tipo de modificação covalente envolve acoplar química ou enzimaticamente glicosídeos no anticorpo. Tais modificações podem ser feitas por síntese química ou por clivagem enzimática ou química do anticorpo, se aplicável. Outros tipos de modificações covalentes do anticorpo podem ser introduzidos na molécula por reação de resíduos de aminoácidos alvejados do anticorpo com um agente de derivação orgânico que seja capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou os resíduos amino ou carbóxi terminais.

[000198] A remoção de quaisquer porções de carboidratos presentes sobre o anticorpo pode ser efetuada química ou enzimaticamente. A desglicosilação química é descrita por Hakimuddin e col., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52 e por Edge e col., 1981, Anal. Biochem., 118:131. A clivagem enzimática das porções de carboidratos sobre os anticorpos pode ser obtida pelo uso de uma variedade de endo- e exoglicosidases, conforme descrito por Thotakura e col., 1987, Meth. Enzymol 138:350.

[000199] Outro tipo de modificação covalente útil compreende a ligação do anticorpo a um de uma variedade de polímeros não proteináceos, por exemplo, polietileno glicol, polipropileno glicol, ou polioxialquilenos, no modo apresentado em uma ou mais de Pat. U.S. No. 4.640.835, Pat. U.S. No. 4.496.689, Pat. U.S. No. 4.301.144, Pat. U.S. No. 4.670.417, Pat. U.S. No. 4.791.192 e Pat. U.S. No. 4.179.337.

Humanização e Variantes das Sequências de Aminoácidos

[000200] As variantes das sequências de aminoácidos do anticorpo anti-CD40 podem ser preparadas por introdução de alterações de nucleotídeos apropriadas no DNA do anticorpo anti-CD40, ou por síntese de peptídeo. Tais variantes incluem, por exemplo, as remoções de, e/ou as inserções em e/ou as substituições de, resíduos dentro das sequências de aminoácidos dos anticorpos anti-CD40 dos exemplos contidos aqui. Qualquer combinação de remoções, inserções, e substituições é feita para chegar à construção final, desde que a construção final possua as características desejadas. As alterações dos aminoácidos também podem alterar os processos póstraducionais do anticorpo anti-CD40 humanizado ou variante, tal como alterando o número ou a posição dos sítios de glicosilação.

[000201] Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiões do anticorpo anti-CD40 que são posições preferidas para a mutagênese é chamado "mutagênese de varredura de alanina", conforme descrito por Cunningham e Wells (Science, 244:1081-1085 (1989)). Aqui, um resíduo ou grupo de resíduos alvos é identificado (por exemplo, resíduos carregados, tais como arg, asp, his, lys, e glu) e substituído por um aminoácido neutro ou negativamente carregado (tipicamente a alanina), para afetar a interação dos aminoácidos com o antígeno CD40. Estas posições dos aminoácidos demonstrando sensibilidade funcional às substituições então são refinadas por introdução de variantes adicionais ou outras variantes nos, ou para os, sítios de substituição. Assim, embora o sítio para a introdução de uma variação da sequência de aminoácidos seja predeterminado, a natureza da mutação per se não necessita ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho de uma mutação em um dado sítio, a mutagênese de varredura de alanina ou aleatória é conduzida no códon ou região alvo e as variantes do anticorpo anti-CD40 expressas são examinadas quanto à atividade desejada.

[000202] As inserções das sequências de aminoácidos incluem as fusões amino e/ou carboxila terminais que variam no comprimento a partir de um resíduo até polipeptídeos contendo cem ou mais resíduos, bem como as inserções dentro das sequências de resíduos de aminoácidos individuais ou múltiplos. Os exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo anti-CD40 fundido a uma marca de epitopo. As outras variantes de inserção da molécula de anticorpo antiCD40 incluem uma fusão na extremidade de N ou C do anticorpo antiCD40 de uma enzima ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida no soro do anticorpo.

[000203] Outro tipo de variante é uma variante de substituição de aminoácido. Estas variantes têm pelo menos um resíduo de aminoácido na molécula de anticorpo anti-CD40 removido e um resíduo diferente inserido em seu lugar. Os sítios de maior interesse para a mutagênese por substituição incluem as regiões hipervariáveis, porém as alterações da FR são também contempladas. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 5 sob o título de "substituições preferidas". Se tais substituições resultarem em uma alteração na atividade biológica, então mais alterações substanciais, denominadas "substituições ilustrativas", ou como adicionalmente descrito abaixo em referência às classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos examinados.

[000204] Na química de proteína, geralmente é aceito que as propriedades biológicas do anticorpo possam ser realizadas selecionando substituições que difiram significativamente em seu efeito sobre manter (a) a estrutura da cadeia principal de polipeptídeos na área da substituição, por exemplo, como uma conformação de folha ou helicoidal, (b) a carga ou a hidrofobicidade da molécula no sítio alvo, ou (c) o tamanho da cadeia lateral. Os resíduos que ocorrem naturalmente são divididos em grupos com base nas propriedades comuns das cadeias laterais:

(1) hidrofóbicos: norleucina, met, ala, val, leu, ile;
(2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: asn, gin, his, lys, arg;
(5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia: gly, pro; e
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.

[000205] As substituições não conservativas implicarão trocar um membro de uma destas classes por outra classe.

[000206] Qualquer resíduo de cisteína não envolvido em manter a conformação apropriada do anticorpo anti-CD40 humanizado ou variante também pode ser substituído, geralmente pela serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula, impedir a reticulação anormal, ou proporcionar pontos estabelecidos de conjugação a um composto citotóxico ou citostático. Inversamente, pode(m) ser adicionada(s) ligação(ões) de cisteína ao anticorpo para melhorar a sua estabilidade (particularmente onde o anticorpo for um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento Fv).

[000207] Um tipo de variante de substituição envolve substituir um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo de origem (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s), selecionada(s) para o desenvolvimento adicional, terá(ão) propriedades biológicas melhoradas em relação ao anticorpo de origem a partir do qual ela(s) é(são) gerada(s). Um modo conveniente para gerar tais variantes de substituição é a maturação por afinidade usando a exposição em fagos. Resumidamente, diversos sítios da região hipervariável (por exemplo, 6-7 sítios) são mutados para gerar todas as substituições de amino possíveis em cada sítio. As variantes de anticorpos assim geradas são expostas em um modo monovalente a partir de partículas de fagos filamentosas como fusões ao produto de gene III de M13 acondicionado dentro de cada partícula. As variantes expostas nos fagos são então examinadas quanto à sua atividade biológica (por exemplo, afinidade de ligação). Para identificar sítios da região hipervariável candidatos para a modificação, a mutagênese de varredura de alanina pode ser efetuada para identificar os resíduos da região hipervariável que contribuem significativamente com a ligação ao antígeno. Alternativamente, ou além disso, pode ser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo de antígenoanticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e a CD40 humana. Tais resíduos de contato e os resíduos próximos são candidatos para a substituição de acordo com as técnicas elaboradas neste documento. Assim que tais variantes forem geradas, o painel de variantes é submetido a exame, conforme descrito neste documento, e os anticorpos com propriedades superiores em um ou mais ensaios relevantes podem ser selecionados para desenvolvimento adicional.

[000208] Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o padrão de glicosilação original do anticorpo. Por "alterar" pretende-se remover uma ou mais porções de carboidratos encontradas no anticorpo, e/ou adicionar um ou mais sítios de glicosilação que não estejam presentes no anticorpo.

[000209] Em algumas modalidades, pode ser desejável modificar os anticorpos da invenção para adicionar sítios de glicosilação. A glicosilação dos anticorpos é tipicamente ligada ao N ou ligada ao O. Ligada ao N refere-se à união da porção de carboidrato à cadeia lateral de um resíduo de asparagina. As sequências de tripeptídeos asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido, exceto a prolina, são as sequências de reconhecimento para a união enzimática da porção de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Desse modo, a presença de quaisquer destas sequências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilação potencial. A glicosilação ligada ao O refere-se à união de um dos açúcares N-acetilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, mais comumente a serina ou a treonina, embora a 5-hidroxiprolina ou a 5-hidroxilisina possa também ser usada. Desse modo, para glicosilar uma dada proteína, por exemplo, um anticorpo, a sequência de aminoácidos da proteína é engenheirada para conter uma ou mais das sequências de tripeptídeos acima descritas (para os sítios de glicosilação ligada ao N). A alteração pode também ser feita pela adição de, ou substituição por, um ou mais resíduos de serina ou treonina à sequência do anticorpo original (para os sítios de glicosilação ligada ao O).

[000210] As moléculas de ácidos nucleicos codificando as variantes das sequências de aminoácidos do anticorpo anti-CD40 são preparadas por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Estes métodos incluem, porém não estão limitados ao isolamento de uma fonte natural (no caso das variantes das sequências de aminoácidos que ocorrem naturalmente) ou preparação por mutagênese oligonucleotídeo-mediada (ou sítio-dirigida), mutagênese por PCR, e mutagênese por cassete de uma variante preparada com antecedência ou uma versão não variante do anticorpo anti-CD40.

Polinucleotídeos, Vetores, Células Hospedeiras, e Métodos Recombinantes

[000211] As outras modalidades incluem os polinucleotídeos isolados que compreendem uma sequência codificando um anticorpo anti-CD40 humanizado, os vetores, e as células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos, e as técnicas recombinantes para a produção do anticorpo humanizado. Os polinucleotídeos isolados podem codificar qualquer forma desejada do anticorpo anti-CD40, incluindo, por exemplo, os anticorpos monoclonais de tamanho natural, os fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, e Fv, os diacorpos, os anticorpos lineares, as moléculas de anticorpos de uma única cadeia, e os anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

[000212] Algumas modalidades incluem os polinucleotídeos isolados compreendendo as sequências que codificam um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de quaisquer de SEQ ID NO: 1 a 4, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, ou SEQ ID NO: 40. Algumas modalidades incluem os polinucleotídeos isolados compreendendo sequências que codificam um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo a sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve de SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, ou SEQ ID NO:36.

[000213] Em um aspecto, a(s) sequência(s) dos polinucleotídeos isolados codifica(m) um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:29 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:37 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO: 36, respectivamente.

[000214] O(s) polinucleotídeo(s) que compreende(m) uma sequência codificando um anticorpo anti-CD40 humanizado ou um fragmento ou cadeia dele pode(m) ser fundido(s) a uma ou mais sequências reguladoras ou de controle, como se sabe na técnica, e pode(m) estar contido(s) em vetores de expressão ou célula hospedeira apropriada, conforme se sabe na técnica. Cada uma das moléculas de polinucleotídeos codificando os domínios variáveis das cadeias pesada ou leve pode ser independentemente fundida a uma sequência de polinucleotídeos codificando um domínio constante, tal como um domínio constante humano, capacitando a produção de anticorpos intactos. Alternativamente, os polinucleotídeos, ou partes deles, podem ser fundidos conjuntamente, proporcionando um molde para a produção de um anticorpo de uma única cadeia.

[000215] Para a produção recombinante, um polinucleotídeo codificando o anticorpo é inserido em um vetor replicável para a clonagem (amplificação do DNA) ou para a expressão. Estão disponíveis muitos vetores adequados para expressar o anticorpo recombinante. Os componentes do vetor geralmente incluem, porém não estão limitados a um ou mais dos que seguem: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes de marcadores, um elemento reforçador, um promotor, e uma sequência de terminação da transcrição.

[000216] Os anticorpos anti-CD40 humanizados podem também ser produzidos como polipeptídeos de fusão, em que o anticorpo está fundido com um polipeptídeo heterólogo, tal como uma sequência sinal ou outro polipeptídeo tendo um sítio de clivagem específico na extremidade amino da proteína ou do polipeptídeo maduro. A sequência sinal heteróloga selecionada é tipicamente uma que seja reconhecida e processada (isto é, clivada por uma peptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para as células hospedeiras procarióticas que não reconhecem e processam o anticorpo anti-CD40 humanizado sequência sinal, a sequência sinal pode ser substituída por uma sequência sinal procariótica. A sequência sinal pode ser, por exemplo, a fosfatase alcalina, a penicilinase, a lipoproteína, as líderes de enterotoxina estável ao calor II, e similares. Para a secreção de levedura, a sequência sinal nativa pode ser substituída, por exemplo, por uma sequência líder obtida do fator alfa da invertase de levedura (incluindo as líderes do fator  de Saccharomyces e Kluyveromyces), ácido fosfatase C, glicoamilase de albicans, ou pelo sinal descrito em WO90/13646. Nas células mamíferas, as sequências sinais mamíferas, bem como as líderes secretórias virais, por exemplo, o sinal de herpes simples gD, podem ser usadas. O DNA para tal região precursora está ligado no quadro de leitura ao DNA codificando o anticorpo anti-CD40 humanizado.

[000217] Os vetores de expressão e clonagem contêm uma sequência de ácidos nucleicos que capacita o vetor de replicar em uma ou mais células hospedeiras selecionadas. Geralmente, nos vetores de clonagem esta sequência é uma que capacita o vetor de replicar independentemente do DNA cromossômico do hospedeiro, e inclui as origens de replicação ou as sequências que se replicam autonomamente. Tais sequências são bastante conhecidas para uma variedade de bactérias, leveduras, e vírus. A origem de replicação do plasmídio pBR322 é adequada para a maior parte das bactérias Gramnegativas, a origem do plasmídio 2-. é adequada para a levedura, e as diversas origens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV, e BPV) são úteis para clonar vetores em células mamíferas. Geralmente, o componente de origem de replicação não é necessário para os vetores de expressão de mamíferos (a origem de SV40 pode tipicamente ser usada somente porque ela contém o promotor inicial).

[000218] Os vetores de expressão e clonagem podem conter um gene que codifica um marcador selecionável para facilitar a identificação da expressão. Os genes de marcadores selecionáveis típicos codificam proteínas que conferem resistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, ou tetraciclina, ou alternativamente, são deficiências auxotróficas do complemento, ou em outras alternativas, suprem nutrientes específicos que não estão presentes em meios complexos, por exemplo, o gene codificando a D-alanina racemase para Bacilli.

[000219] Um exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para parar o crescimento de uma célula hospedeira. Estas células que são transformadas com êxito com um gene heterólogo produzem uma proteína que confere resistência a fármacos e, desse modo, sobrevivem ao regime de seleção. Os exemplos de tal seleção dominante utilizam os fármacos neomicina, ácido micofenólico, e higromicina. Os marcadores selecionáveis comuns para as células mamíferas são aqueles que capacitam a identificação de células competentes para absorver um ácido nucleico codificando um anticorpo anti-CD40 humanizado, tais como a DHFR (diidrofolato redutase), a timidina cinase, a metalotioneína I e II (tal como os genes de metalotioneína de primata), a adenosina desaminase, a ornitina descarboxilase, e similares. As células transformadas com o gene de seleção de DHFR são primeiramente identificadas cultivando-se todos os transformantes em um meio de cultura que contém o metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando a DHFR do tipo selvagem for empregada é a linhagem de células do ovário de hamster chinês (CHO), deficiente na atividade de DHFR (por exemplo, DG44).

[000220] Alternativamente, as células hospedeiras (particularmente os hospedeiros do tipo selvagem que contêm a DHFR endógena) transformadas ou co-transformadas com as sequências de DNA codificando o anticorpo anti-CD40, a proteína DHFR do tipo selvagem, e outro marcador selecionável, tal como a aminoglicosídeo 3'- fosfotransferase (APH), podem ser selecionadas por crescimento celular em meio contendo um agente de seleção para o marcador selecionável, tal como um antibiótico aminoglicosídico, por exemplo, canamicina, neomicina, ou G418. Ver, por exemplo, a Pat. U.S. No. 4.965.199.

[000221] Onde a produção recombinante for efetuada em uma célula de levedura como uma célula hospedeira, o gene de TRP1 presente no plasmídio de levedura YRp7 (Stinchcomb e col., 1979, Nature 282: 39) pode ser usado como um marcador selecionável. O gene de TRP1 proporciona um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura que não tem a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12). A presença da lesão de trp1 no genoma da célula hospedeira de levedura então proporciona um ambiente efetivo para detectar a transformação por crescimento na ausência de triptofano. Similarmente, as cepas de levedura deficientes de Leu2p, tais como ATCC 20.622 e 38.626, são complementadas por plasmídios conhecidos contendo o gene de LEU2.

[000222] Além disso, os vetores derivados do plasmídio circular de 1,6 µm pKD1 podem ser usados para a transformação de leveduras de Kluyveromyces. Alternativamente, um sistema de expressão para a produção em grande escala de quimosina de bezerro recombinante foi descrito por K. lactis (Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135). Os vetores de expressão de múltiplas cópias estáveis para a secreção de soro albumina humana recombinante madura por cepas industriais de Kluyveromyces também foram divulgados (Fleer e col., 1991, Bio/Technology 9:968-975).

[000223] Os vetores de expressão e clonagem normalmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e está operavelmente ligado à molécula de ácido nucleico codificando um anticorpo anti-CD40 ou a sua cadeia de polipeptídeos. Os promotores adequados para uso com os hospedeiros procarióticos incluem o promotor de phoA, os sistemas de promotores de β-lactamase e lactose, a fosfatase alcalina, o sistema de promotores de triptofano (trp) e os promotores híbridos, tais como o promotor de tac. Outros promotores bacterianos conhecidos são também adequados. Os promotores para uso nos sistemas bacterianos também conterão uma sequência de Shine-Dalgamo (S.D.) operavelmente ligada ao DNA codificando o anticorpo anti-CD40 humanizado.

[000224] São conhecidas muitas sequências de promotores eucarióticos. Praticamente todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do sítio onde a transcrição é iniciada. Outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT, onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade de 3' da maior parte dos genes eucarióticos está a sequência AATAAA que pode ser o sinal para a adição da extremidade de poli A à extremidade de 3' da sequência de codificação. Todas estas sequências são adequadamente inseridas nos vetores de expressão eucarióticos.

[000225] Os exemplos de sequências promotoras adequadas, para uso com os hospedeiros de leveduras, incluem os promotores para a 3-fosfoglicerato cinase ou outras enzimas glicolíticas, tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfofrutocinase, glicose-6-fosfato isomerase, 3- fosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triosefosfato isomerase, fosfoglicose isomerase, e glicocinase.

[000226] Os promotores induzíveis têm a vantagem adicional de transcrição controlada por condições de crescimento. Estes incluem as regiões de promotores de leveduras para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, ácido fosfatase, enzimas de derivados associadas com o metabolismo do nitrogênio, metalotioneína, gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase, e enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Os vetores e os promotores adequados, para uso na expressão de levedura, são adicionalmente descritos em EP 73.657. Os reforçadores de leveduras também são vantajosamente usados com os promotores de leveduras.

[000227] A transcrição do anticorpo anti-CD40 humanizado a partir de vetores em células hospedeiras mamíferas é controlada, por exemplo, através de promotores obtidos a partir dos genomas de vírus, tais como o poliomavírus, o vírus do epitelioma contagioso, o adenovírus (tal como o Adenovírus 2), o papilomavírus bovino, o vírus do sarcoma aviário, o citomegalovírus, um retrovírus, o vírus da hepatite B e o Vírus Símio 40 (SV40), a partir de promotores mamíferos heterólogos, por exemplo, o promotor de actina ou um promotor de imunoglobulina, ou a partir de promotores do choque térmico, desde que tais promotores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

[000228] Os promotores iniciais e tardios do vírus SV40 são convenientemente obtidos como um fragmento de restrição de SV40 que também contém a origem de replicação viral de SV40. O promotor inicial imediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como um fragmento de restrição de HindIII E. Um sistema para expressar o DNA em hospedeiros mamíferos usando o papilomavírus bovino como um vetor é divulgado na Pat. U.S. No. 4.419.446. Uma modificação deste sistema é descrita na Pat. U.S. No. 4.601.978. Ver também Reyes e col., 1982, Nature 297:598-601, divulgando a expressão de cDNA de p-interferon humano em células de camundongos sob o controle de um promotor de timidina cinase a partir do vírus simples da herpes. Alternativamente, a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de rous pode ser usada como o promotor.

[000229] Outro elemento útil que pode ser usado em um vetor de expressão recombinante é uma sequência reforçadora, a qual é usada para aumentar a transcrição de um DNA codificando um anticorpo antiCD40 humanizado por eucariotos superiores. Muitas sequências reforçadoras são agora conhecidas a partir de genes de mamíferos (por exemplo, globina, elastase, albumina, α-fetoproteína, e insulina).
Tipicamente, entretanto, utiliza-se uma sequência reforçadora a partir de um vírus de célula eucariótica. Os exemplos incluem a sequência reforçadora de SV40 sobre o lado posterior da origem de replicação (bp 100-270), a sequência reforçadora do promotor inicial de citomegalovírus, a sequência reforçadora de polioma sobre o lado posterior da origem de replicação, e as sequências reforçadoras de adenovírus. Ver também Yaniv, 1982, Nature 297:17-18 quanto a uma descrição dos elementos reforçadores para a ativação de promotores eucarióticos. A sequência reforçadora pode ser emendada no vetor em uma posição 5' ou 3' à sequência de codificação do anticorpo antiCD40 humanizado, porém está preferivelmente localizada em um sítio 5' a partir do promotor.

[000230] Os vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas (células de leveduras, fungos, insetos, plantas, animais, seres humanos, ou nucleadas a partir de outros organismos multicelulares) podem também conter sequências necessárias para a terminação da transcrição e para estabilizar o mRNA. Tais sequências estão comumente disponíveis a partir das regiões 5' e, ocasionalmente, 3', não traduzidas, de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na parte não traduzida do mRNA codificando o anticorpo anti-CD40. Um componente de terminação da transcrição útil é a região de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino. Ver WO94/11026 e o vetor de expressão divulgado nele. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CD40 humanizados podem ser expressos usando o sistema CHEF. (Ver, por exemplo, a Pat. U.S. No. 5.888.809; cuja divulgação é incorporada por referência neste documento.)

[000231] As células hospedeiras adequadas para clonar ou expressar o DNA nos vetores aqui contidos são as células de procariotos, leveduras, ou eucariotos superiores descritas acima. Os procariotos adequados para este propósito incluem as eubactérias, tais como os organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae, tais como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, bem como Bacilli, tais como B. subtilis e B. licheniformis (por exemplo, B. licheniformis 41 P dvulgado em DD 266.710, publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas, tais como P. aeruginosa, e Streptomyces. Um hospedeiro de clonagem de E. coli preferido é E. coli 294 (ATCC 31.446), embora outras cepas, tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), e E. coli W3110 (ATCC 27.325), sejam adequadas. Estes exemplos são ilustrativos, em vez de limitativos.

[000232] Além dos procariotos, os micróbios eucarióticos, tais como os fungos filamentosos ou as leveduras, são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para os vetores de codificação do anticorpo anti-CD40 humanizado. A Saccharomyces cerevisiae, ou a levedura de padeiro comum, é a mais comumente usada entre os microorganismos hospedeiros eucarióticos inferiores. Entretanto, diversos outros gêneros, espécies, e cepas estão comumente disponíveis e são úteis neste documento, tais como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros de Kluyveromyces , tais como, por exemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Pichia pastors (EP 183.070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces, tal como Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos, tais como, por exemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, e hospedeiros de Aspergillus, tais como A. nidulans e A. niger.

[000233] As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpo anti-CD40 humanizado glicosilado são derivadas de organismos multicelulares. Os exemplos de células de invertebrados incluem as células de plantas e insetos, incluindo, por exemplo, as diversas cepas baculovirais e as variantes, e as células hospedeiras de insetos facultativas correspondentes de hospedeiros tais como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca-das-frutas), e Bombyx mori (bicho-da-seda). Uma variedade de cepas virais para a transfecção está publicamente disponível, por exemplo, a variante L-1 de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e tais vírus podem ser usados, particularmente para a transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[000234] As culturas de células de plantas de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, e tabaco podem também ser utilizadas como hospedeiros.

[000235] Em outro aspecto, a expressão do anti-CD40 humanizado é realizada em células de vertebrados. A propagação das células de vertebrados na cultura (cultura de tecido) tornou-se procedimento de rotina e as técnicas estão amplamente disponíveis. Os exemplos das linhagens de células hospedeiras de mamíferos úteis são a linhagem do rim do macaco CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), a linhagem do rim embriônico humano (293 ou células 293 subclonadas para o crescimento em cultura de suspensão, (Graham e col., 1977, J. Gen Virol. 36: 59), as células do rim de hamster jovem (BHK, ATCC CCL 10), as células do ovário de hamster chinês/-DHFR1 (CHO, Urlaub e col., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; por exemplo, DG44), as células de sertoli de camundongos (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251), as células dos rins de macacos (CV1 ATCC CCL 70), as células dos rins de macacos verdes africanos (VERO-76, ATCC CRL-1587), as células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2), as células dos rins caninos (MDCK, ATCC CCL 34), as células do fígado de ratos em búfalos (BRL 3A, ATCC CRL 1442), as células do pulmão humano (W138, ATCC CCL 75), as células do fígado humano (Hep G2, HB 8065), o tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51), as células TR1 (Mather e col., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68), as células MRC 5, as células FS4, e a linhagem de hepatoma humano (Hep G2).

[000236] As células hospedeiras são transformadas com os vetores de expressão ou clonagem descritos acima, para a produção de anticorpos anti-CD40 humanizados, e cultivadas em meios nutrientes convencionais, modificados conforme apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes, ou amplificar os genes que codificam as sequências desejadas.

[000237] As células hospedeiras usadas para produzir um anticorpo anti-CD40 humanizado descrito neste documento podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Os meios comercialmente disponíveis, tais como F10 de Ham (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, Mo.), Meio Essencial Mínimo ((MEM), (Sigma-Aldrich Co.), RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.), e Meio de Eagle Modificado da Dulbecco ((DMEM), Sigma-Aldrich Co.), são adequados para cultivar as células hospedeiras. Além disso, quaisquer dos meios descritos em um ou mais de Ham e col., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes e col., 1980, Anal. Biochem. 102: 255, Pat. U.S. No. 4.767.704, Pat. U.S. No. 4.657.866, Pat. U.S. No. 4.927.762, Pat. U.S. No. 4.560.655, Pat. U.S. No. 5.122.469, WO 90/103430, e WO 87/00195 pode ser usado como meios de culturas para as células hospedeiras. Quaisquer destes meios podem ser suplementados, conforme necessário, com hormônios e/ou outros fatores do crescimento (tais como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como gentamicina), microelementos (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Outros suplementos podem também ser incluídos em concentrações apropriadas, que seriam conhecidas para aqueles versados na técnica. As condições de cultura, tais como a temperatura, o pH, e similar, são aquelas previamente usadas com a célula hospedeira selecionada para a expressão, e serão aparentes para o técnico comumente versado.

[000238] Quando se utiliza as técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido de modo intracelular, no espaço periplásmico, ou diretamente secretado no meio. Se o anticorpo for produzido de modo intracelular, as células podem ser rompidas para liberar a proteína, como uma primeira etapa. Os resíduos de particulados, células hospedeiras ou fragmentos lisados, podem ser removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Carter e col., 1992, Bio/Technology 10:163-167, descrevem um procedimento para isolar os anticorpos que são secretados para o espaço periplásmico de E. coli. Resumidamente, a pasta de células é descongelada na presença de acetato de sódio (pH 3,5), EDTA, e fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), durante cerca de 30 minutos. Os resíduos de células podem ser removidos por centrifugação. Onde o anticorpo for secretado no meio, os sobrenadantes de tais sistemas de expressão são, em geral, primeiramente concentrados usando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor da protease, tal como o PMSF, pode ser incluído em quaisquer das etapas precedentes para inibir a proteólise e os antibióticos podem ser incluídos para impedir o crescimento de contaminantes estranhos. Uma variedade de métodos pode ser usada para isolar o anticorpo da célula hospedeira.

[000239] A composição de anticorpo preparada a partir das células pode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia em hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, e cromatografia por afinidade, com a cromatografia por afinidade sendo uma técnica de purificação típica. A adequabilidade da proteína A como um ligante de afinidade depende da espécie e do isótipo de qualquer domínio de Fc da imunoglobulina que esteja presente no anticorpo. A proteína A pode ser usada para purificar os anticorpos que forem baseados nas cadeias pesadas gama1, gama2, ou gama4 humanas (ver, por exemplo, Lindmark e col., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13). A proteína G é recomendada para todos os isótipos de camundongos e para a gama3 humana (ver, por exemplo, Guss e col., 1986 EMBO J. 5:1567- 1575). Uma matriz à qual um ligante de afinidade esteja unido é mais frequentemente a agarose, porém outras matrizes estão disponíveis. As matrizes mecanicamente estáveis, tais como o vidro de poro controlado ou o poli(estirenodivinil)benzeno, permitem vazões mais rápidas e tempos de processamento mais curtos do que podem ser obtidos com a agarose. Onde o anticorpo compreender um domínio CH3, a resina Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) é útil para a purificação. Outras técnicas para a purificação de proteínas, tais como o fracionamento sobre uma coluna trocadora iônica, a precipitação com etanol, a HPLC de fase reversa, a cromatografia sobre sílica, a cromatografia sobre heparina SEPHAROSE®, a cromatografia sobre uma resina trocadora de ânion ou cátion (tal como uma coluna de poli(ácido aspártico)), a cromatofocalização, a SDS-PAGE, e a precipitação com sulfato de amônio, estão também disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.

[000240] Após qualquer(quaisquer) etapa(s) de purificação preliminar(es), a mistura compreendendo o anticorpo de interesse e os contaminantes pode ser submetida à cromatografia por interação hidrofóbica em baixo pH, usando um tampão de eluição, em um pH entre cerca de 2,5-4,5, tipicamente efetuada em baixas concentrações de sais (por exemplo, de cerca de 0-0,25 M de sal).

[000241] Estão também incluídos os ácidos nucleicos que hibridizam sob condições severas baixas, moderadas, e altas, como definidas neste documento, com toda a, ou uma parte (por exemplo, a parte que codifica a região variável) da, sequência de nucleotídeos representada por sequência(s) de polinucleotídeos isolados que codifica(m) um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:29 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:37 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO: 36, respectivamente. A porção de hibridização do ácido nucleico que hibridiza é tipicamente pelo menos 15 (por exemplo, 20, 25, 30 ou 50) nucleotídeos de comprimento. A porção de hibridização do ácido nucleico que hibridiza é pelo menos 80%, por exemplo, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98% idêntica à sequência de uma parte de, ou todo o, ácido nucleico codificando um polipeptídeo anti-CD40 (por exemplo, uma região variável da cadeia pesada ou cadeia leve), ou o seu complemento. Os ácidos nucleicos de hibridização do tipo descrito neste documento podem ser usados, por exemplo, como uma sonda de clonagem, um iniciador, por exemplo, um iniciador de PCR, ou uma sonda diagnóstica.

[000242] Algumas modalidades incluem os polinucleotídeos isolados incluindo sequências que codificam um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada que é pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica com a sequência de aminoácidos de quaisquer de SEQ ID NO: 1 a 4, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, ou SEQ ID NO: 40. Algumas modalidades incluem os polinucleotídeos isolados incluindo sequências que codificam um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo a sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve que é pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de quaisquer de SEQ ID NO: 5 a 8, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, ou SEQ ID NO:36.

[000243] Em um aspecto, a(s) sequência(s) de polinucleotídeos isolados codifica(m) um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, cada uma incluindo uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:29 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:37 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:36, respectivamente SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO: 36, respectivamente.

[000244] Em outro aspecto, a invenção refere-se a um polinucleotídeo na modalidade descrita imediatamente acima, onde o domínio variável da cadeia pesada e a região variável da cadeia leve do anticorpo ou do fragmento de anticorpo codificado incluem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos de um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de, em uma modalidade, SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:26, respectivamente; em outra modalidade, SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:26, respectivamente; em outra modalidade, SEQ ID NO:29 e SEQ ID NO:26, respectivamente; em outra modalidade, SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:26, respectivamente; em outra modalidade, SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:31, respectivamente; em outra modalidade, SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:31, respectivamente; em outra modalidade, SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:31, respectivamente; em outra modalidade, SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:31, respectivamente; em outra modalidade, SEQ ID NO:37 e SEQ ID NO:36, respectivamente; em outra modalidade, SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:36, respectivamente; em outra modalidade, SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:36, respectivamente; e em outra modalidade, SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO: 36, respectivamente.

[000245] Conforme usados neste documento, os termos "idênticas" ou "porcentagem de identidade", no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos que são iguais, quando comparadas e alinhadas para a correspondência máxima. Para determinar a porcentagem de identidade, as sequências são alinhadas para propósitos de comparação ótima (por exemplo, podem ser introduzidos espaços na sequência de uma primeira sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos para o alinhamento ótimo com uma segunda sequência de aminoácidos ou ácidos nucleicos). Os resíduos de aminoácidos ou os nucleotídeos em posições de aminoácidos ou posições de nucleotídeos correspondentes são então comparados. Quando uma posição na primeira sequência for ocupada pelo mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeo que a posição correspondente na segunda sequência, então as moléculas são idênticas nesta posição. A porcentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % de identidade = # de posições idênticas/# total de posições (por exemplo, posições de sobreposição) x 100). Em algumas modalidades, as duas sequências que são comparadas são de mesmo comprimento após os espaços serem introduzidos nas sequências, conforme apropriado (por exemplo, excluindo a sequência adicional que se estende para além das sequências que estão sendo comparadas). Por exemplo, quando as sequências das regiões variáveis forem comparadas, as sequências líder e/ou do domínio constante não são consideradas. Para comparações de sequências entre duas sequências, uma CDR "correspondente" refere-se a uma CDR na mesma posição em ambas as sequências (por exemplo, CDR-H1 de cada sequência).

[000246] A determinação da porcentagem de identidade ou porcentagem de similaridade entre duas sequências pode ser efetuada usando um algoritmo matemático. Um exemplo não limitativo, preferido, de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências é o algoritmo de Karlin e Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul e col., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. As buscas de nucleotídeos por BLAST podem ser efetuadas com o programa NBLAST, pontuação=100, comprimento da palavra=12, para obter sequências de nucleotídeos homólogas a um ácido nucleico codificando uma proteína de interesse. As buscas de proteínas por BLAST podem ser efetuadas com o programa XBLAST, pontuação=50, comprimento da palavra=3, para obter sequências de aminoácidos homólogas à proteína de interesse. Para obter alinhamentos com espaços para propósitos de comparação, o Gapped BLAST pode ser utilizado, conforme descrito em Altschul e col., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, o PSI-Blast pode ser usado para efetuar uma busca repetida que detecta relações distantes entre as moléculas (Id.). Quando se utiliza os programas BLAST, Gapped BLAST, e PSI-Blast, os parâmetros preestabelecidos dos programas respectivos (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Outro exemplo não limitativo, preferido, de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, CABIOS (1989). Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), o qual é parte do pacote de software de alinhamento da sequência GCG. Quando se utiliza o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, podem ser usadas uma tabela de resíduo ponderal PAM120, uma penalidade do comprimento do espaço de 12, e uma penalidade de espaço de 4. Algoritmos adicionais para a análise da sequência são conhecidos na técnica e incluem o ADVANCE e o ADAM, como descritos em Torellis e Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; e o FASTA, descrito em Pearson e Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8. Dentro do FASTA, ktup é uma opção de controle que ajusta a sensibilidade e a velocidade da busca. Se ktup=2, regiões similares nas duas sequências que estão sendo comparadas são encontradas considerando pares de resíduos alinhados; se ktup=1, aminoácidos alinhados individuais são examinados. ktup pode ser ajustado para 2 ou 1 para as sequências de proteínas, ou de 1 a 6 para as sequências de DNA. O padrão se ktup não for especificado é 2 para as proteínas e 6 para o DNA. Alternativamente, o alinhamento da sequência de proteínas pode ser realizado usando o algoritmo CLUSTAL W, conforme descrito por Higgins e col., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402.

Usos Não Terapêuticos

[000247] Os anticorpos descritos neste documento são úteis como agentes de purificação por afinidade. Neste processo, os anticorpos são imobilizados sobre uma fase sólida, tal como uma resina de Proteína A, usando métodos bastante conhecidos na técnica. O anticorpo imobilizado é contatado com uma amostra contendo a proteína CD40 (ou o seu fragmento) a ser purificada e, após isso, o suporte é lavado com um solvente adequado que removerá substancialmente todo o material na amostra, exceto a proteína CD40, que está ligada ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente adequado que liberará a proteína CD40 do anticorpo.

[000248] Os anticorpos anti-CD40 humanizados são também úteis em ensaios diagnósticos para detectar e/ou quantificar a proteína CD40, por exemplo, detectando a expressão de CD40 em células, tecidos ou soro específico.

[000249] Será vantajoso em algumas modalidades, por exemplo, para propósitos diagnósticos, marcar o anticorpo com uma porção detectável. Estão disponíveis diversas marcas detectáveis, incluindo os radioisótopos, as marcas fluorescentes, as marcas de enzima substrato e similares. A marca pode ser indiretamente conjugada com o anticorpo usando diversas técnicas conhecidas. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com a biotina e quaisquer das três categorias amplas de marcas mencionadas acima podem ser conjugadas com a avidina, ou vice-versa. A biotina seletivamente se liga à avidina e, assim, a marca pode ser conjugada com o anticorpo neste modo indireto. Alternativamente, para obter a conjugação indireta da marca com o anticorpo, o anticorpo pode ser conjugado com um pequeno hapteno (tal como a digoxina) e um dos diferentes tipos de marcas mencionadas acima é conjugado com um anticorpo anti-hapteno (por exemplo, o anticorpo anti-digoxina). Desse modo, a conjugação indireta da marca com o anticorpo pode ser obtida.

[000250] As marcas de radioisótopos ilustrativas incluem 35S, 14C, 125I, 3H, e 131I. O anticorpo pode ser marcado com o radioisótopo, usando as técnicas descritas, por exemplo, em Current Protocols in Immunology, Volumes 1 e 2, 1991, Coligen e col., Ed. Wiley-Interscience, Nova York, N.Y., Pubs. A radioatividade pode ser medida, por exemplo, por contagem de cintilação.

[000251] As marcas fluorescentes ilustrativas incluem as marcas derivadas de quelatos de terras raras (quelatos de európio) ou a fluoresceína e os seus derivados, a rodamina e os seus derivados, a dansila, a Lissamina, a ficoeritrina, e o Vermelho Texas estão disponíveis. As marcas fluorescentes podem ser conjugadas ao anticorpo por meio de técnicas conhecidas, tais como aquelas divulgadas em Current Protocols in Immunology, supra, por exemplo. A fluorescência pode ser quantificada usando um fluorímetro.

[000252] Existem diversas marcas de enzima-substrato bem caracterizadas, conhecidas na técnica (ver, por exemplo, a Pat. U.S. No. 4.275.149 quanto a uma revisão). A enzima geralmente catalisa uma alteração química do substrato cromogênico que pode ser medida usando diversas técnicas. Por exemplo, a alteração pode ser uma troca de cor em um substrato que pode ser medida espectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar a fluorescência ou a quimioluminescência do substrato. As técnicas para quantificar uma alteração na fluorescência são descritas acima. O substrato quimioluminescente torna-se eletronicamente excitado por uma reação química e pode então emitir luz que pode ser medida, usando um quimioluminômetro, por exemplo, ou doa energia para um receptor fluorescente.

[000253] Os exemplos de marcas enzimáticas incluem as luciferases, tais a luciferase do vagalume e a luciferase bacteriana (Pat. U.S. No. 4.737.456), a luciferina, as 2,3-diidroftalazinadionas, a malato desidrogenase, a urease, a peroxidase, tal como a peroxidase da raiz forte (HRPO), a fosfatase alcalina, a β-galactosidase, a glicoamilase, a lisozima, a oxidase de sacarídeos (tais como a glicose oxidase, a galactose oxidase, e a glicose-6-fosfato desidrogenase), as oxidases heterocíclicas (tais como a uricase e a xantina oxidase), a lactoperoxidase, a microperoxidase, e similares. As técnicas para conjugar as enzimas aos anticorpos são descritas, por exemplo, em O'Sullivan e col., 1981, Methods for the Preparation of EnzymeAntibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, em Methods in Enzym. (J. Langone e H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y., 73: 147-166.

[000254] Os exemplos de combinações de enzima-substrato incluem, por exemplo: a Peroxidase da raiz forte (HRPO) com a hidrogênio peroxidase como um substrato, onde a hidrogênio peroxidase oxida um precursor de corante, tal como a ortofenileno diamina (OPD) ou o cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB); a fosfatase alcalina (AP) com o Fosfato de para-nitrofenila como substrato cromogênico; e a β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogênico, tal como a p-nitrofenil-β-D-galactosidase ou o substrato fluorogênico 4-metilumbeliferil-β-D-galactosidase.

[000255] Diversas outras combinações de enzima-substrato estão disponíveis para aqueles versados na técnica. Quanto a uma revisão geral destas, ver a Pat. U.S. No. 4.275.194 e a Pat. U.S. No. 4.318.980.

[000256] Em outra modalidade, o anticorpo anti-CD40 humanizado é usado não marcado e detectado com um anticorpo marcado que liga o anticorpo anti-CD40 humanizado.

[000257] Os anticorpos descritos neste documento podem ser empregados em qualquer método de ensaio conhecido, tal como os ensaios de ligação competitiva, os ensaios de encaixe direto e indireto, e os ensaios de imunoprecipitação. Ver, por exemplo, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, págs. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Kits Diagnósticos

[000258] Um anticorpo anti-CD40 humanizado pode ser usado em um kit diagnóstico, isto é, uma combinação acondicionada de reagentes em quantidades predeterminadas, com instruções para efetuar o ensaio diagnóstico. Onde o anticorpo for marcado com uma enzima, o kit pode incluir substratos e cofatores requeridos pela enzima, tais como um precursor de substrato que proporciona o cromóforo ou o fluoróforo detectável. Além disso, outros aditivos podem ser incluídos, tais como estabilizantes, tampões (por exemplo, um tampão de bloqueio ou tampão de lise), e similares. As quantidades relativas dos diversos reagentes podem ser variadas amplamente para proporcionar concentrações em solução dos reagentes que substancialmente otimizam a sensibilidade do ensaio. Os reagentes podem ser proporcionados como pós secos, normalmente liofilizados, incluindo os excipientes que, na dissolução, proporcionarão uma solução de reagente tendo a concentração apropriada.

Usos Terapêuticos

[000259] Em outra modalidade, um anticorpo anti-CD40 humanizado divulgado neste documento é útil no tratamento de diversos distúrbios associados com a expressão de CD40, conforme descrito neste documento.

[000260] O anticorpo anti-CD40 humanizado ou agente é administrado por qualquer meio adequado, incluindo a administração parenteral, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, e, se desejado para ao tratamento imunossupressor local, intralesional (incluindo a perfusão ou, de outro modo, o contato do enxerto com o anticorpo antes da transplantação). O anticorpo anti-CD40 humanizado ou o agente pode ser administrado, por exemplo, como uma infusão ou como um bolo. As infusões parenterais incluem a administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, ou subcutânea. Além disso, o anticorpo anti-CD40 humanizado é adequadamente administrado por infusão de pulso, particularmente com doses declinantes do anticorpo. Em um aspecto, a dosagem é dada por injeções, mais preferivelmente injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte de se a administração for curta ou crônica.

[000261] Para a prevenção ou o tratamento da doença, a dosagem apropriada de anticorpo dependerá de uma variedade de fatores, tais como o tipo de doença a ser tratada, como definido acima, a gravidade e o curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, a terapia prévia, a história clínica do paciente e a resposta ao anticorpo, e o critério do médico responsável. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente em uma vez ou durante uma série de tratamentos.

[000262] Dependendo do tipo e da gravidade da doença, cerca de 1 µg/kg a 20 mg/kg (por exemplo, 0,1-15 mg/kg) de anticorpo é uma dosagem candidata inicial para a administração ao paciente, quer seja, por exemplo, por uma ou mais administrações separadas, quer seja por infusão contínua. Uma dosagem diária típica poderia variar de cerca de 1 µg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para as administrações repetidas durante diversos dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é continuado até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. Entretanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais. Um regime de dosagem ilustrativo é aquele divulgado em WO 94/04188.

[000263] O termo "supressão" é usado neste documento no mesmo contexto que "melhora" e "alívio" para significar uma diminuição de uma ou mais características da doença.

[000264] A composição de anticorpo será formulada, dosada, e administrada em um modo consistente com a boa prática médica. Os fatores para consideração neste contexto incluem o distúrbio particular que está sendo tratado, o mamífero particular que está sendo tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa do distúrbio, o local da liberação do agente, o método de administração, o programa de administração, e outros fatores conhecidos para os médicos. A "quantidade terapeuticamente efetiva" do anticorpo a ser administrado será governada por tais considerações, e é a quantidade mínima necessária para impedir, melhorar, ou tratar o distúrbio associado com a expressão de CD40.

[000265] O anticorpo não necessita ser, porém é opcionalmente, formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade efetiva de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo anti-CD40 humanizado presente na formulação, do tipo de distúrbio ou tratamento, e dos outros fatores discutidos acima. Estes são geralmente usados nas mesmas dosagens e com as vias de administração como usadas mais acima ou cerca de 1 a 99% das dosagens empregadas antes.

Distúrbios Associados à CD40

[000266] Os anticorpos anti-CD40 ou os agentes são úteis para tratar ou prevenir um câncer que expressa a CD40 ou um distúrbio imunológico caracterizado por expressão da CD40, por exemplo, por ativação inadequada das células imunes (por exemplo, linfócitos ou células dendríticas). Tal expressão da CD40 pode ser devida, por exemplo, aos níveis aumentados de proteína CD40 sobre a superfície celular e/ou à antigenicidade alterada da CD40 expressa. O tratamento ou a prevenção do distúrbio imunológico, de acordo com os métodos descritos neste documento, é atingida administrando a um paciente que necessita de tal tratamento ou prevenção uma quantidade efetiva do anticorpo anti-CD40 ou agente, pelo que o anticorpo (i) se liga às células imunes ativadas que expressam a CD40 e que estão associadas com o estado de doença e (ii) exerce um efeito citotóxico, citostático, ou imunossupressor sobre as células imunes ativadas.

[000267] As doenças imunológicas que são caracterizadas por ativação inadequada das células imunes e que podem ser tratadas ou prevenidas pelos métodos descritos neste documento podem ser classificadas, por exemplo, pelo(s) tipo(s) de reação(ões) de hipersensibilidade que forma(m) a base do distúrbio. Estas reações são tipicamente classificadas em quatro tipos: reações anafiláticas, reações citotóxicas (citolíticas), reações do complexo imune, ou reações de imunidade mediada por células (CMI) (também referidas como reações de hipersensibilidade do tipo retardado (DTH)). (Ver, por exemplo, Fundamental Immunology (William E. Paul ed., Raven Press, N.Y., 3a ed. 1993).)

[000268] Os exemplos específicos de tais doenças imunológicas incluem os seguintes: artrite reumatoide, doenças desmielinizantes autoimunes (por exemplo, esclerose múltipla, encefalomielite alérgica), oftalmopatia endócrina, uveoretinite, lúpus eritematoso sistêmico, miastenia grave, doença de Grave, glomerulonefrite, distúrbio hepatológico autoimune, doença inflamatória do intestino (por exemplo doença de Crohn ou colite ulcerativa), anafilaxia, reação alérgica, síndrome de Sjogren, diabete melito tipo I, cirrose biliar primária, granulomatose de Wegener, fibromialgia, polimiosite, dermatomiosite, miosite inflamatória, insuficiência endócrina múltipla, síndrome de Schmidt, uveíte autoimune, doença de Addison, adrenalite, tireoidite, tireoidite de Hashimoto, doença da tireoide autoimune, anemia perniciosa, atrofia gástrica, hepatite crônica, hepatite lupoide, aterosclerose, lúpus eritematoso cutâneo subagudo, hipoparatiroidismo, síndrome de Dressler, trombocitopenia autoimune, púrpura trombocitopênica idiopática, anemia hemolítica, pênfigo vulgar, pênfigo, dermatite herpetiforme, alopecia em áreas, penfigoide, esclerodermia, esclerose sistêmica progressiva, síndrome de CREST (calcinose, fenômeno de Raynaud, dismotilidade esofágica, esclerodactilia), e telangiectasia), infertilidade autoimune masculina e feminina, espondilite ancilosante, colite ulcerativa, doença do tecido conjuntivo misto, poliarterite nodosa, vasculite necrotizante sistêmica, dermatite atópica, rinite atópica, síndrome de Goodpasture, doença de Chagas, sarcoidose, febre reumática, asma, aborto recorrente, síndrome antifosfolipídio, pulmão do fazendeiro, eritema multiforme, síndrome pós-cardiotomia, síndrome de Cushing, hepatite ativa crônica autoimune, pulmão dos aviários, necrólise epidérmica tóxica, síndrome de Alport, alveolite, alveolite alérgica, alveolite fibrosante, doença do pulmão intersticial, eritema nodoso, piodermia gangrenosa, reação à transfusão, arterite de Takayasu, polimialgia reumática, arterite temporal, esquistossomíase, arterite de células gigantes, ascaríase, aspergilose, síndrome de Sampter, eczema, granulomatose linfomatoide, doença de Behcet, síndrome de Calan, doença de Kawasaki, dengue, encefalomielite, endocardite, fibrose endomiocárdica, endoftalmite, eritema elevado e diutino, psoríase, eritroblastose fetal, faciíte eosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filaríase, ciclite, ciclite crônica, ciclite heterocrônica, ciclite de Fuch, nefropatia por IgA, púrpura de Henoch-Schonlein, doença do enxerto versus hospedeiro, rejeição ao transplante, cardiomiopatia, síndrome de Eaton-Lambert, policondrite recidivante, crioglobulinemia, macroglobulemia de Waldenstrom, síndrome de Evan, síndrome de angústia respiratória de adulto, inflamação pulmonar, osteoporose, hipersensibilidade do tipo retardada e insuficiência gonadal autoimune.

[000269] Consequentemente, os métodos descritos neste documento incluem o tratamento de distúrbios de linfócitos B (por exemplo, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome de Goodpasture, artrite reumatoide, e diabetes tipo I), linfócitos Th1 (por exemplo, artrite reumatoide, esclerose múltipla, psoríase, síndrome de Sjorgren, tireoidite de Hashimoto, doença de Grave, cirrose biliar primária, granulomatose de Wegener, tuberculose, ou doença do enxerto versus hospedeiro), ou linfócitos Th2 (por exemplo, dermatite atópica, lúpus eritematoso sistêmico, asma atópica, rinoconjuntivite, rinite alérgica, síndrome de Omenn, esclerose sistêmica, ou doença do enxerto versus hospedeiro crônica). Geralmente, os distúrbios envolvendo as células dendríticas envolvem os distúrbios de linfócitos Th1 ou linfócitos Th2.

[000270] A artrite reumatoide (RA) é uma das doenças autoimunes inflamatórias mais comuns, afetando aproximadamente 1% da população. Embora estejam disponíveis tratamentos eficazes (por exemplo, o MTX e os agentes anti-TNF), existe uma grande necessidade médica não atendida, especialmente para aqueles pacientes que não respondem adequadamente às terapias anti-TNF (aproximadamente 30% dos pacientes). Além disso, até 50% dos pacientes interrompem o tratamento com antagonista de TNF dentro de 5 anos, principalmente devido a eventos adversos, porém também porque um número cada vez mais reconhecido de pacientes perde o benefício terapêutico. Desse modo, é importante estabelecer terapias efetivas que alvejem a inflamação e a destruição das articulações na RA, porém não se apoiem somente na inibição direta do TNF. Uma abordagem muito atrativa é alvejar as vias das células coestimuladoras. Um dos pares chaves de receptor-ligante na coestimulação é CD40/CD40L. Este sistema permite interações entre células imunes, e entre células imunes e não imunes, todas as quais são importantes na patogênese da RA. O bloqueio de CD40 com um anticorpo antagonístico da presente invenção pode ter um ou mais dos seguintes efeitos na RA:

1) Inibir a diferenciação das células B e a troca de isótipo do anticorpo;
2) Inibir a produção de citocina e quimiocina e a suprarregulação de moléculas de adesão em células T e macrófagos;
3) Inibir a ativação de células dendríticas e
4) Inibir a produção de citocinas proinflamatórias, quimiocinas, metaloproteinases de matriz, prostaglandinas, e infrarregular as moléculas de adesão em células não imunes (por exemplo, células epiteliais, endoteliais e mesenquimais).

[000271] Os métodos de atingir um ou mais dos efeitos acima mencionados são expressamente contemplados neste documento. Além da RA, as composições da presente invenção serão particularmente úteis nos métodos de tratamento de Esclerose Múltipla, Psoríase (incluindo a Artrite Psoriática), Artrite Reumatoide Juvenil, Doença Inflamatória do Intestino, Lúpus Eritematoso Sistêmico, e Transplante de Órgão Sólido.

[000272] A Artrite Reumatoide (RA) é uma doença autoimune sistêmica, crônica, com um predomínio de aproximadamente 1% em adultos. A doença continua a causar morbidade significativa e mortalidade prematura (a mortalidade é predominantemente devida à doença cardiovascular acelerada). Foi agora identificado que o dano à articulação ocorre muito cedo no curso da doença, com até 30% dos pacientes mostrando evidência radiográfica de desgaste ósseo na hora do diagnóstico, aumentando para 60% após 1 ano. As diretrizes atuais recomendam iniciar a terapia com fármacos antirreumáticos modificadores da doença (DMARDs) tradicionais dentro de 3 meses após um diagnóstico definitivo ter sido estabelecido. Os DMARDS têm o potencial de reduzir ou prevenir o dano na articulação e conservar a função da articulação. Atualmente, os reumatologistas selecionam o metotrexato (MTX) como a terapia de DMARD inicial para a maior parte dos pacientes.

[000273] Os antagonistas de TNF etanercept (Enbrel®), infliximab (Remicade®), adalimumab (Humira®), o antagonista de CTLA4 abatacept (Orencia®), o mAb antirreceptor de IL-6 tocilizumab e o mAb anti-CD20 rituximab (Rituxan®) são eficazes no tratamento de RA. As diretrizes atuais geralmente recomendam utilizar os DMARDs biológicos para o tratamento de RA ativa após uma resposta inadequada aos DMARDs tradicionais.

[000274] Os estudos recentes em pacientes com RA agressiva inicial, sem tratamento prévio com MTX, mostraram que a combinação de MTX com um antagonista de TNF era superior a cada um quando usado como monoterapia. O resultado mais extraordinário foi o benefício radiológico significativo da terapia de combinação. Desse modo, a combinação de MTX e inibidores de TNF deve ser usada em pacientes em risco maior de doença agressiva e fenótipo agressivo (por exemplo, pontuação de atividade alta, deterioração funcional, soropositividade para o fator reumatoide (RF) ou anticorpo antipeptídeo citrulinado cíclico (CCP), CRP elevado, desgastes radiográficos). Entretanto, nós antecipamos que, na prática clínica, será raro que os antagonistas de TNF sejam usados como uma terapia de primeira linha. Um levantamento dos reumatologistas dos EU conduzido em abril de 2005 mostrou que os fatores que mais influenciam a decisão de usar um antagonista de TNF eram: falha do MTX ou dos DMARDs múltiplos, avaliação global do médico, deterioração funcional, e piora ou desgastes radiográficos. Atualmente, uns 20% estimados de pacientes com RA recebem a terapia de inibidor de TNF nos EU.

[000275] Uma porcentagem substancial de pacientes com RA não é adequadamente assistida com os tratamentos atuais, incluindo as terapias biológicas, por causa da intolerância e da toxicidade do fármaco ou da ausência de resposta. Até 50% dos pacientes interrompem o tratamento com antagonista de TNF dentro de 5 anos, principalmente devido aos eventos adversos, porém também porque um número cada vez mais reconhecido de pacientes perde a sua resposta.

[000276] Em algumas modalidades, o distúrbio imunológico é um distúrbio imunológico mediado por células T, tal como um distúrbio de células T, no qual as células T ativadas, associadas com o distúrbio, expressam a CD40. Os anticorpos anti-CD40 ou os agentes podem ser administrados para reduzir tais células T ativadas que expressam a CD40. Em uma modalidade específica, a administração de anticorpos anti-CD40 ou agente pode reduzir as células T ativadas que expressam a CD40, enquanto as células T restantes não são substancialmente reduzidas pelo anti-CD40 ou pelo agente. Neste contexto, "não são substancialmente reduzidas" significa que menos do que cerca de 60%, ou menos do que cerca de 70% ou menos do que cerca de 80% das células T restantes não são reduzidas.

[000277] Os anticorpos anti-CD40 e os agentes como descritos neste documento são também úteis para tratar ou prevenir um câncer que expressa a CD40. O tratamento ou a prevenção de um câncer que expressa a CD40, de acordo com os métodos descritos neste documento, é atingido por administração a um paciente que necessita de tal tratamento ou prevenção de uma quantidade efetiva do anticorpo anti-CD40 ou do agente, pelo que o anticorpo (i) se liga às células de câncer que expressam a CD40 e (ii) exerce um efeito citotóxico ou citostático para reduzir ou inibir a proliferação das células de câncer que expressam a CD40.

[000278] Os cânceres que expressam a CD40 que podem ser tratados ou prevenidos pelos métodos descritos neste documento incluem, por exemplo, a leucemia, tal como a leucemia aguda, a leucemia linfocítica aguda, a leucemia mielocítica aguda (por exemplo, mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, ou eritroleucemia), a leucemia crônica, a leucemia mielocítica (granulocítica) crônica, ou a leucemia linfocítica crônica; a Policitemia rubra; o Linfoma (por exemplo, a doença de Hodgkin ou a doença que Não de Hodgkin); o mieloma múltiplo, a macroglobulinemia de Waldenstrom; a doença da cadeia pesada; os tumores sólidos, tais como os sarcomas e os carcinomas (por exemplo, fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico, osteossarcoma, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, carcinoma colorretal, câncer pancreático, câncer da mama, câncer ovariano, câncer da próstata, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma da glândula sudorípara, carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, câncer cervical, câncer uterino, tumor testicular, carcinoma do pulmão, carcinoma do pulmão de células pequenas, carcinoma do pulmão que não de células pequenas, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma, retinoblastoma, carcinoma nasofaríngeo, ou carcinoma esofágico).

Composições Farmacêuticas e Sua Administração

[000279] Uma composição compreendendo um agente de ligação à CD40 (por exemplo, um anticorpo anti-CD40) pode ser administrada a um paciente tendo, ou correndo o risco de ter, um distúrbio imunológico ou um câncer que expressa a CD40. A invenção adicionalmente proporciona o uso de um agente de ligação à CD40 (por exemplo, um anticorpo anti-Cd40) na manufatura de um medicamento para a prevenção ou o tratamento de um câncer que expressa a CD40 ou um distúrbio imunológico. O termo "paciente", conforme usado neste documento, significa qualquer paciente mamífero ao qual possa ser administrado o agente de ligação à CD40, incluindo, por exemplo, os seres humanos e os mamíferos não humanos, tais como os primatas, os roedores, e os cães. Os pacientes especificamente pretendidos para o tratamento usando os métodos descritos neste documento incluem os seres humanos. Os anticorpos ou os agentes podem ser administrados sozinhos ou em combinação com outras composições na prevenção ou no tratamento do distúrbio imunológico ou do câncer que expressa a CD40.

[000280] Os anticorpos preferidos para uso em tais composições farmacêuticas são aqueles que compreendem o anticorpo humanizado ou o fragmento de anticorpo tendo a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de quaisquer de SEQ ID NO: 1 a 4, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, ou SEQ ID NO: 40.

[000281] Algumas modalidades incluem os polinucleotídeos isolados compreendendo as sequências que codificam um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo a sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve de SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, ou SEQ ID NO:36. As composições de anticorpos humanizados particularmente preferidas compreendem um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:29 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:37 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO:36, respectivamente. São contemplados dentro da presente invenção os polinucleotídeos isolados que codificam quaisquer das sequências das cadeias pesadas de SEQ ID NO: 1 a 4, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 73. As outras modalidades são dirigidas aos ácidos nucleicos isolados que codificam uma sequência da cadeia leve de quaisquer das sequências de SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, ou SEQ ID NO:76.

[000282] Em certas modalidades, onde o tratamento da RA for contemplado, as composições da invenção podem ser usadas nos métodos para reduzir os sinais e os sintomas, induzir uma resposta clínica principal e reduzir a progressão do dano estrutural em pacientes com RA moderada ou gravemente ativa que não respondem adequadamente ao MTX sozinho. Tal terapia ilustrativa atual é: Enbrel/Humira (Os dados com Humira e Enbrel foram obtidos em duas populações diferentes de pacientes). As composições da presente invenção podem ser usadas em vez de uma terapia de Enbrel/Humira ou em combinação com a terapia de Enbrel/Humira para pacientes que não respondem ao MTX sozinho. De preferência, em tais modalidades, as composições da invenção terão uma eficácia superior ao Enbrel +MTX em pacientes que tenham tido uma resposta inadequada ao metotrexato, como determinada, por exemplo, por: ACR20 em 6 meses >85% para o composto mais MTX (GS: Enbrel +MTX 71% vs. Placebo + MTX 27%, Humira + MTX em 12 meses 59% vs. Placebo + MTX 24%)*. Os critérios adicionais para a eficácia superior das composições da invenção podem incluir: Inibição da progressão do dano estrutural durante um período de um ano similar ao Enbrel (após 52 semanas, pontuação de Sharp modificada média Humira + MTX 0,1 vs. Placebo + MTX 2,7)*. Ainda em outras modalidades, as composições produzem uma "Resposta Clínica Principal" superior ao Enbrel em pacientes que tenham tido uma resposta inadequada ao metotrexato, como medida por ACR70 (20% para Humira + MTX, 4% para Placebo + MTX)*.

[000283] Em outras modalidades, as composições da invenção podem ser indicadas para reduzir os sinais e os sintomas, induzir uma resposta clínica principal e reduzir a progressão do dano estrutural em pacientes com RA moderada a gravemente ativa que tenham tido uma resposta inadequada aos agentes anti-TNF. O padrão de Gold atual: terapia biológica que não anti-TNF. De preferência, em tais pacientes, as composições da invenção possuem eficácia não inferior, comparadas à biológica que não anti-TNF (por exemplo, Orencia, Rituxan), por comparação histórica em pacientes que tenham tido uma resposta inadequada a um agente anti-TNF: ACR20 em 6 meses >50% para o composto mais DMARD (GS: Orencia + DMARD 50% vs. placebo + DMARD 20%). Ainda em outras modalidades, as composições da invenção inibem a progressão do dano estrutural durante um período de um ano avaliado, por métodos de pontuação de raios X aceitos para o desgaste da articulação e o estreitamento do espaço da articulação, similar ao Rituxan (após 52 semanas, pontuação de Sharp modificada média Rituxan + MTX 1,0 vs. Placebo + MTX 2,31).

[000284] Diversos sistemas de distribuição são conhecidos e podem ser usados para administrar o agente de ligação à CD40. Os métodos de introdução incluem, porém não estão limitados às vias intradérmicas, intramusculares, intraperitoneais, intravenosas, subcutâneas, intranasais, epidurais, e orais. O agente de ligação à CD40 pode ser administrado, por exemplo, através de infusão, bolo ou injeção, e pode ser administrado juntamente com outros agentes biologicamente ativos, tais como os agentes quimioterápicos. A administração pode ser sistêmica ou local. Nas modalidades preferidas, a administração é por injeção subcutânea. As formulações para tais injeções podem ser preparadas, por exemplo, em seringas pré-abastecidas que possam ser administradas uma vez, semana sim, semana não.

[000285] As características de segurança dos anticorpos da invenção serão determinadas e preferivelmente incluem uma ou mais características tais como: nenhuma interação adversa clinicamente significativa com as outras medicações comumente usadas para tratar Artrite Reumatoide (por exemplo, DMARDs, Esteroides, NSAIDs); Nenhuma taxa de descontinuação maior devida a questões de segurança ou tolerabilidade em comparação com o Enbrel; Taxa de infecções sérias não maior do que os agentes anti-TNF ou outros agentes biológicos comumente usados; Frequência e/ou gravidade de reações no local da injeção ou reação de infusão similar ao Enbrel; Nenhum desenvolvimento ou um desenvolvimento mínimo de resistência ao fármaco (menos do que 5%) nos ciclos repetidos de terapia; Nenhum anticorpo neutralizador ou anticorpos neutralizadores mínimos; Nenhuma evidência de agregação/ativação de plaquetas aumentada que pudesse resultar em eventos tromboembólicos in vivo ou plaqueta/disfunção endotelial que pudesse resultar em sangramento.

[000286] Nas modalidades específicas, a composição de agente de ligação à CD40 é administrada por injeção, por meio de um cateter, por meio de um supositório, ou por meio de um implante, o implante sendo de um material poroso, não poroso, ou gelatinoso, incluindo uma membrana, tal como uma membrana sialástica, ou uma fibra. Tipicamente, quando se administra a composição, são usados materiais aos quais o anticorpo anti-CD40 ou o agente não absorve.

[000287] Em outras modalidades, o anticorpo anti-CD40 ou o agente é liberado em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada (ver, por exemplo, Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald e col., 1980, Surgery 88:507; Saudek e col., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). Em outra modalidade, podem ser usados materiais poliméricos. (Ver, por exemplo, Medical Applications of Controlled Release (Langer e Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen e Ball eds., Wiley, Nova York, 1984); Ranger e Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61. Ver também Levy e col., 1985, Science 228:190; During e col., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard e col., 1989, J. Neurosurg. 71:105.) Os outros sistemas de liberação controlada são discutidos, por exemplo, em Langer, supra.

[000288] Um agente de ligação à CD40 (por exemplo, um anticorpo anti-CD40) pode ser administrado como composições farmacêuticas compreendendo uma quantidade terapeuticamente efetiva do agente de ligação e um ou mais ingredientes farmaceuticamente compatíveis.

[000289] Nas modalidades típicas, a composição farmacêutica é formulada, de acordo com procedimentos de rotina, como uma composição farmacêutica adaptada para a administração intravenosa ou subcutânea aos seres humanos. Tipicamente, as composições para a administração por injeção são soluções em tampão aquoso isotônico estéril. Onde necessário, a substância farmacêutica pode também incluir um agente solubilizante e um anestésico local, tal como a lignocaína, para suavizar a dor no local da injeção. Geralmente, os ingredientes são proporcionados separadamente ou misturados conjuntamente na forma de dosagem de unidade, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado sem água, em um recipiente hermeticamente vedado, tal como uma ampola ou sachê indicando a quantidade de agente ativo. Onde a substância farmacêutica for para ser administrada por infusão, ela pode ser administrada com um frasco de infusão contendo água ou solução salina, grau farmacêutico, estéril. Onde a substância farmacêutica for administrada por injeção, uma ampola de água estéril para injeção ou solução salina pode ser proporcionada, de modo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

[000290] Ademais, a composição farmacêutica pode ser proporcionada como um kit farmacêutico compreendendo (a) um recipiente contendo um agente de ligação à CD40 (por exemplo, um anticorpo anti-CD40) na forma liofilizada e (b) um segundo recipiente contendo um diluente farmaceuticamente aceitável (por exemplo, água estéril) para injeção. O diluente farmaceuticamente aceitável pode ser usado para a reconstituição ou a diluição do anticorpo anti-CD40 ou agente liofilizado. Pode estar opcionalmente associado com tal(is) recipiente(s) um aviso na forma prescrita por um órgão governamental que rgula a manufatura, o uso ou a venda de substâncias farmacêuticas ou produtos biológicos, aviso este que reflete a aprovação pelo órgão da manufatura, do uso ou da venda para a administração humana.

[000291] A quantidade do agente de ligação à CD40 (por exemplo, o anticorpo anti-CD40) que é efetiva no tratamento ou na prevenção de um distúrbio imunológico ou um câncer que expressa a CD40 pode ser determinada por técnicas clínicas padrões. Além disso, os ensaios in vitro podem opcionalmente ser empregados para auxiliar a identificar as faixas de dosagens ótimas. A dose exata a ser empregada na formulação também dependerá da via de administração, e do estágio do distúrbio imunológico ou do câncer que expressa a CD40, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do médico e as circunstâncias de cada paciente. As doses efetivas podem ser extrapoladas a partir de curvas de resposta à dose derivadas de sistemas de testes in vitro ou em modelos de animais.

[000292] Por exemplo, a toxicidade e a eficácia terapêutica do anticorpo anti-CD40 ou do agente podem ser determinadas em culturas de células ou animais experimentais, por procedimentos farmacêuticos padrões, para determinar a ED50 (a dose terapeuticamente efetiva em 50% da população). Prefere-se um agente de ligação à CD40 (por exemplo, um anticorpo anti-CD40) que exiba um grande índice terapêutico. Onde o agente de ligação à CD40 exibir efeitos colaterais tóxicos, pode ser usado um sistema de distribuição que alveje o agente de ligação à CD40 para o local do tecido afetado, para minimizar o dano potencial a células que não expressam a CD40 e, com isso, reduzir os efeitos colaterais.

[000293] Os dados obtidos a partir dos ensaios de culturas de células e dos estudos com animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para uso em seres humanos. A dosagem do agente de ligação à CD40 tipicamente situa-se em uma faixa de concentrações circulantes que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administração utilizada. Para qualquer agente de ligação à CD40 usado no método, a dose terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de culturas de células. Uma dose pode ser formulada em modelos de animais para atingir uma faixa de concentrações circulantes no plasma que inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto de teste que atinge uma inibição semimáxima dos sintomas), como determinada na cultura de células. Tal informação pode ser usada para determinar mais acuradamente as doses úteis em seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho, ELISA e similar.

[000294] Geralmente, a dosagem de um anticorpo anti-CD40 ou agente de ligação à CD40 administrado a um paciente com um distúrbio imunológico ou câncer que expressa a CD40 é tipicamente cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso do corpo do paciente. A dosagem administrada a um paciente é cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, ou cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg de peso do corpo do paciente.

[000295] As doses ilustrativas incluem, porém não estão limitadas a, de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 100 mg/kg de peso do corpo do paciente. A dosagem administrada a um paciente é cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, ou cerca de 1 mg/kg a cerca de 10 mg/kg de peso do corpo do paciente. A dose pode ser administrada, por exemplo, diariamente, uma vez por semana (semanalmente), duas vezes por semana, três vezes por semana, quatro vezes por semana, cinco vezes por semana, seis vezes por semana, bissemanalmente ou mensalmente, a cada dois meses, ou a cada três meses. Nas modalidades específicas, a dose é cerca de 0,5 mg/kg/semana, cerca de 1 mg/kg/semana, cerca de 2 mg/kg/semana, cerca de 3 mg/kg/semana, cerca de 4 mg/kg/semana, cerca de 5 mg/kg/semana, cerca de 6 mg/kg/semana, cerca de 7 mg/kg/semana, cerca de 8 mg/kg/semana, cerca de 9 mg/kg/semana, cerca de 10 mg/kg/semana, cerca de 11 mg/kg/semana, cerca de 12 mg/kg/semana, cerca de 13 mg/kg/semana, cerca de 14 mg/kg/semana, cerca de 15 mg/kg/semana ou cerca de 16 mg/kg/semana. Em algumas modalidades, a dose varia de cerca de 1 mg/kg/semana a cerca de 15 mg/kg/semana.

[000296] Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas compreendendo o agente de ligação à CD40 pode adicionalmente compreender um agente terapêutico, conjugado ou não conjugado ao agente de ligação. O anticorpo anti-CD40 ou o agente de ligação à CD40 pode ser coadministrado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos, para o tratamento ou a prevenção de distúrbios imunológicos ou cânceres que expressam a CD40. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um agente citostático, citotóxico, ou imunossupressor. A terapia de combinação pode também incluir, por exemplo, a administração de um agente que alveje um receptor ou complexo de receptor que não a CD40 sobre a superfície de linfócitos ativados, células dendríticas ou células de câncer que expressam a CD40. Um exemplo de tal agente inclui um segundo anticorpo que não para CD40 que se liga a uma molécula na superfície de um linfócito ativado, célula dendrítica ou célula de câncer que expressa a CD40. Outro exemplo inclui um ligante que alveja tal receptor ou complexo de receptor. Tipicamente, tal anticorpo ou ligante se liga a um receptor da superfície celular sobre os linfócitos ativados, as células dendríticas ou a célula de câncer que expressa a CD40 e aumenta o efeito citotóxico ou citostático do anticorpo anti-CD40 por liberação de um sinal citostático ou citotóxico para o linfócito ativado, a célula dendrítica ou a célula de câncer que expressa a CD40.

[000297] Tal administração da terapia de combinação pode ter um efeito aditivo ou sinérgico sobre os parâmetros da doença (por exemplo, a gravidade de um sintoma, o número de sintomas, ou a frequência de recidiva).

[000298] Em relação aos regimes terapêuticos para a administração por combinação, em uma modalidade específica, um anticorpo antiCD40 ou agente de ligação à CD40 é administrado simultaneamente com um agente terapêutico. Em outra modalidade específica, o agente terapêutico é administrado antes da, ou subsequente à, administração do anticorpo anti-CD40 ou do agente de ligação à CD40, por pelo menos uma hora e até diversos meses, por exemplo, pelo menos uma hora, cinco horas, 12 horas, um dia, uma semana, um mês, ou três meses antes da, ou subsequente à, administração do anticorpo antiCD40 ou do agente de ligação à CD40.

[000299] As classes úteis de agentes citotóxicos ou imunossupressores incluem, por exemplo, os agentes antitubulina, as auristatinas (por exemplo, MMAE, ou MMAF), os ligantes de sulcos ("groove") secundários de DNA, os inibidores da replicação de DNA, os agentes alquilantes (por exemplo, os complexos de platina, tais como a cis-platina, a mono(platina), a bis(platina) e os complexos de platina trinucleares e a carboplatina), as antraciclinas, os antibióticos, os antifolatos, os antimetabólitos, os sensibilizadores de quimioterapia, as duocarmicinas, as etoposidas, as pirimidinas fluoradas, os ionóforos, as lexitropsinas, as nitrosoureias, os platinóis, os compostos pré-formadores, os antimetabólitos de purina, as puromicinas, os sensibilizadores de radiação, os esteroides, os taxanos, os inibidores da topoisomerase, os alcaloides vinca, ou similares.

[000300] Os agentes citotóxicos ou imunossupressores individuais incluem, por exemplo, um androgênio, a antramicina (AMC), a asparaginase, a 5-azacitidina, a azatioprina, a bleomicina, o bussulfano, a butionina sulfoximina, a camptotecina, a carboplatina, a carmustina (BSNU), o CD-1065, o clorambucil, a cisplatina, a colquicina, a ciclofosfamida, a citarabina, o citidina arabinosídeo, a citocalasina B, a dacarbazina, a dactinomicina (anteriormente actinomicina), a daunorrubicina, a decarbazina, o docetaxel, a doxorrubicina, um estrogênio, a 5-fluordesoxiuridina, o 5-fluorouracil, a gramicidina D, a hidroxiureia, a idarrubicina, a ifosfamida, o irinotecano, a lomustina (CCNU), a mecloretamina, o melfalano, a 6- mercaptopurina, o metotrexato, a mitramicina, a mitomicina C, a mitoxantrona, o nitroimidazol, o paclitaxel, a plicamicina, a procarbizina, a estreptozotocina, o tenoposídeo, a 6-tioguanina, a tioTEPA, o topotecano, a vimblastina, a vincristina, a vinorrelbina, o VP-16 e o VM-26.

[000301] Em algumas modalidades típicas, o agente terapêutico é um agente citotóxico. Os agentes citotóxicos adequados incluem, por exemplo, as dolastatinas (por exemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB ou AVB), os ligantes de sulcos secundários de DNA (por exemplo, enediínas e lexitropsinas), as duocarmicinas, os taxanos (por exemplo, o paclitaxel e o docetaxel), as puromicinas, os alcaloides vinca, o CC-1065, o SN-38, o topotecano, a morfolino-doxorrubicina, a rizoxina, a cianomorfolino-doxorrubicina, a equinomicina, a combrestastatina, a netropsina, a epotilona A e B, a estramustina, as criptofisinas, a cemadotina, os maitansinoides, a discodermolida, a eleuterobina, ou a mitoxantrona.

[000302] Em algumas modalidades, o agente citotóxico é um quimioterápico convencional, tal como, por exemplo, a doxorrubicina, o paclitaxel, o melfalano, os alcaloides vinca, o metotrexato, a mitomicina C ou a etoposida. Além disso, agentes potentes, tais como os análogos de CC-1065, a caliqueamicina, a maitansina, os análogos de dolastatina 10, a rizoxina, e a palitoxina, podem ser ligados aos anticorpos anti-CD40 ou agentes deles.

[000303] Nas modalidades específicas, o agente citotóxico ou citostático é a auristatina E (também conhecida na técnica como dolastatina-10) ou um seu derivado. Tipicamente, o derivado de auristatina E é, por exemplo, um éster formado entre a auristatina E e um ceto ácido. Por exemplo, a auristatina E pode ser reagida com o ácido para-acetil benzoico ou o ácido benzoilvalérico, para produzir AEB e AEVB, respectivamente. Os outros derivados de auristatina típicos incluem AFP, MMAF, e MMAE. A síntese e a estrutura da auristatina E e de seus derivados são descritas, por exemplo, nas Publicações de Pedidos de Patentes U.S. Nos. 2004-0157782 A1 e 2005-0238649; no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US03/24209, no Pedido de Patente Internacional No. PCT/US02/13435, e nas Pats. U.S. Nos. 6.884.869; 6.323.315; 6.239.104; 6.034.065; 5.780.588; 5.665.860; 5.663.149; 5.635.483; 5.599.902; 5.554.725; 5.530.097; 5.521.284; 5.504.191; 5.410.024; 5.138.036; 5.076.973; 4.986.988; 4.978.744; 4.879.278; 4.816.444; e 4.486.414; cujas divulgações são incorporadas por referência neste documento.

[000304] Nas modalidades específicas, o agente citotóxico é um agente de ligação de sulco secundário de DNA. (Ver, por exemplo, a Pat. U.S. No. 6.130.237.) Por exemplo, em algumas modalidades, o agente de ligação de sulco secundário é um composto de CBI. Em outras modalidades, o agente de ligação de sulco secundário é uma enediína (por exemplo, a caliqueamicina).

[000305] Os exemplos de agentes antitubulina incluem, porém não estão limitados aos taxanos (por exemplo, Taxol® (paclitaxel), Taxotere® (docetaxel)), T67 (Tularik), alcaloides vinca (por exemplo, vincristina, vimblastina, vindesina, e vinorrelbina), e dolastatinas (por exemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB). Os outros agentes antitubulina incluem, por exemplo, os derivados de bacatina, os análogos de taxano (por exemplo, epotilona A e B), o nocodazol, a colquicina e o colcimid, a estramustina, as criptofisinas, a cemadotina, os maitansinoides, as combretastatinas, a discodermolida, e a eleuterobina.

[000306] Em algumas modalidades, o agente citotóxico é um maitansinoide, outro grupo de agentes antitubulina. Por exemplo, nas modalidades específicas, o maitansinoide é a maitansina ou o DM-1 (ImmunoGen, Inc.; ver também Chari e col., 1992, Cancer Res. 52:127-131).

[000307] Em algumas modalidades, o agente terapêutico não é um radioisótopo.

[000308] Em algumas modalidades, o agente citotóxico ou imunossupressor é um antimetabólito. O antimetabólito pode ser, por exemplo, um antagonista de purina (por exemplo, azotioprina ou micofenolato mofetil), um inibidor da diidrofolato redutase (por exemplo, metotrexato), aciclovir, gangciclovir, zidovudina, vidarabina, ribavarina, azidotimidina, citidina arabinosídeo, amantadina, didesoxiuridina, iododesoxiuridina, poscamet, ou trifluridina.

[000309] Em outras modalidades, o agente citotóxico ou imunossupressor é o tacrolimus, a ciclosporina ou a rapamicina. Nas modalidades adicionais, o agente citotóxico é aldesleucina, alentuzumab, alitretinoína, alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozol, trióxido arsênico, bexaroteno, bexaroteno, calusterona, capecitabina, celecoxib, cladribina, Darbepoetina alfa, Denileucina diftitox, dexrazoxano, propionato de dromostanolona, epirrubicina, Epoetina alfa, estramustina, exemestano, Filgrastim, floxuridina, fludarabina, fulvestrant, gencitabina, gentuzumab ozogamicina, goserelina, idarrubicina, ifosfamida, mesilato de imatinib, Interferon alfa-2a, irinotecano, letrozol, leucovorina, levamisol, mecloretamina ou mostarda nitrogenosa, megestrol, mesna, metotrexato, metoxsaleno, mitomicina C, mitotano, fempropionato de nandrolona, oprelvecina, oxaliplatina, pamidronato, pegademase, pegaspargase, pegfilgrastim, pentostatina, pipobromano, plicamicina, porfimer sódico, procarbazina, quinacrina, rasburicase, revlimid, Sargramostim, estreptozocina, tamoxifeno, temozolomida, teniposida, testolactona, tioguanina, toremifeno, Tositumomab, Trastuzumab, tretinoína, mostarda de uracil, valrrubicina, vimblastina, vincristina, vinorrelbina e zoledronato.

[000310] Nas modalidades adicionais, o fármaco é um anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado; o RITUXAN (rituximab; Genentech, Inc., South San Francisco, Calif.); um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico); o OVAREX (AltaRex Corporation, MA); o PANOREX (Glaxo Wellcome, NC; um anticorpo IgG2a de rato); o Cetuximab Erbitux (Imclone Systems Inc., NY; um anticorpo quimérico IgG anti-EGFR); a Vitaxina (MedImmune, Inc., MD); o Campath I/H (Leukosite, MA; um anticorpo IgG1 humanizado); o Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA; um anticorpo IgG anti-CD33 humanizado); o LymphoCide (Immunomedics, Inc., NJ; um anticorpo IgG anti-CD22 humanizado); o Smart ID10 (Protein Design Labs, Inc., CA; um anticorpo anti-HLA-DR humanizado); o Oncolym (Techniclone, Inc., CA; um anticorpo anti-HLA-Dr10 de rato radiomarcado); o Allomune (BioTransplant, CA; um mAb anti-CD2 humanizado); a Avastina (Genentech, Inc., CA; um anticorpo humanizado anti-VEGF); o Epratuzamab (Immunomedics, Inc., NJ e Amgen, CA; um anticorpo anti-CD22); e o CEAcide (Immunomedics, NJ; um anticorpo anti-CEA humanizado).

[000311] Os outros anticorpos adequados incluem, porém não estão limitados aos anticorpos contra os seguintes antígenos: CA125, CA15- 3, CA19-9, L6, Lewis Y, Lewis X, alfa fetoproteína, CA 242, fosfatase alcalina placentária, antígeno específico da próstata, ácido fosfatase prostática, fator de crescimento epidérmico, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, receptor anti transferrina, p97, MUC1-KLH, CEA, gp100, MART1, Antígeno Específico da Próstata, receptor de IL-2, CD20, CD52, CD33, CD22, gonadotropina coriônica humana, CD38, mucina, P21, MPG, e produto de oncogene Neu.

[000312] Em algumas modalidades, o agente terapêutico é um agente imunossupressor. O agente imunossupressor pode ser, por exemplo, o ganciclovir, o etanercept, o tacrolimus, a ciclosporina, a rapamicina, a ciclofosfamida, a azatioprina, o micofenolato mofetil ou o metotrexato. Alternativamente, o agente imunossupressor pode ser, por exemplo, um glicocorticoide (por exemplo, cortisol ou aldosterona) ou um análogo de glicocorticoide (por exemplo, prednisona ou dexametasona).

[000313] Os inibidores de cicloxigenase adequados incluem o ácido meclofenâmico, o ácido mefenâmico, o carprofeno, o diclofenac, o diflunisal, o fembufeno, o fenoprofeno, o ibuprofeno, a indometacina, o cetoprofeno, a nabumetona, o naproxeno, o sulindac, o enoxicam, a tolmetina, e o ácido acetilsalicílico.

[000314] Os inibidores da lipoxigenase adequados incluem os inibidores da redox (por exemplo, os derivados de catecol butano, o ácido nordiidroguaiarético (NDGA), o masoprocol, a fenidona, o Ianopaleno, as indazolinonas, o nafazatrom, o benzofuranol, a alquilidroxilamina), e os inibidores que não sejam da redox (por exemplo, hidroxitiazóis, metoxialquiltiazóis, benzopiranos e seus derivados, metoxitetraidropirano, ácidos boswélicos e derivados acetilados de ácidos boswélicos, e ácidos quinolinametoxifenilacéticos substituídos com radicais cicloalquila), e os precursores dos inibidores da redox

[000315] Os outros inibidores da lipoxigenase adequados incluem os antioxidantes (por exemplo, fenóis, galato de propila, flavonoides e/ou substratos que ocorrem naturalmente contendo flavonoides, derivados hidroxilados das flavonas, flavonol, diidroquercetina, luteolina, galangina, orobol, derivados de calcona, 4,2',4'-triidroxicalcona, ortoaminofenóis, N-hidroxiureias, benzofuranóis, ebseleno e espécies que aumentam a atividade das selenoenzimas redutoras), os agentes quelantes de ferro (por exemplo, ácidos hidroxâmicos e seus derivados, N-hidroxiureias, 2-benzil-1-naftol, catecóis, hydroxilaminas, carnosol trolox C, catecol, naftol, sulfassalazina, zyleuton, ácido 5- hidroxiantranílico e ácidos 4-(ômega-arilalquil)fenilalcanoicos), os compostos contendo imidazol (por exemplo, cetoconazol e itraconazol), as fenotiazinas, e os derivados de benzopirano.

[000316] Ainda outros inibidores da lipoxigenase adequados incluem os inibidores de eicosanoides (por exemplo, os ácidos octadecatetraenoico, eicosatetraenoico, docosapentaenoico, eicosaexaenoico e docosaexaenoico e os seus ésteres, a PGE1 (prostaglandina E1), a PGA2 (prostaglandina A2), o viprostol, os ácidos 15-monoidroxieicosatetraenoico, 15-monoidróxi-eicosatrienoico e 15-monoidroxieicosapentaenoico, e os leucotrienos B5, C5 e D5), os compostos que interferem com os fluxos de cálcio, as fenotiazinas, as difenilbutilaminas, o verapamil, o fuscosídeo, a curcumina, o ácido clorogênico, o ácido cafêico, o ácido 5,8,11,14-eicosatetraienoico (ETYA), a hidroxifenilretinamida, o lonapaleno, a esculina, a dietilcarbamazina, a fenantrolina, a baicaleína, o proxicromil, os tioéteres, o sulfeto de dialila e o sulfeto de di-(1-propenila).

[000317] Os antagonistas do receptor de leucotrienos incluem o calcitriol, o ontazolast, o Bay-x-1005 da Bayer, o CGS-25019C da Ciba-Geigy, o ebseleno, o ETH-615 da Leo Denmark, o LY-293111 da Lilly, o ONO-4057 da Ono, o TMK-688 da Terumo, o BI-RM-270 da Boehringer Ingleheim, o LY 213024 da Lilly, o LY 264086 da Lilly, o LY 292728 da Lilly, o ONO LB457 da Ono, o 105696 da Pfizer, o PF 10042 da Perdue Frederick, o RP 66153 da Rhone-Poulenc Rorer, o SB-201146 da SmithKline Beecham, o SB-201993 da SmithKline Beecham, o SB-209247 da SmithKline Beecham, o SC-53228 da Searle, o SM 15178 da Sumitamo, o WAY 121006 da American Home Products, o Bay-o-8276 da Bayer, o CI-987 da Warner-Lambert, o CI987BPC-15LY 223982 da Warner-Lambert, o LY 233569 da Lilly, o LY255283 da Lilly, o MNX-160 da MacroNex, o MK-591 da Merck and Co., o MK-886 da Merck and Co., o ONO-LB-448 da Ono, o PF-5901 da Purdue Frederick, o RG 14893 da Rhone-Poulenc Rorer, o RP 66364 da Rhone-Poulenc Rorer, o RP 69698 da Rhone-Poulenc Rorer, o S-2474 da Shionoogi, o SC-41930 da Searle, o SC-50505 da Searle, o SC-51146 da Searle, o SC-52798 da Searle, o SK e F-104493 da SmithKline Beecham, o SR-2566 da Leo Denmark, o T-757 da Tanabe e o TEI-1338 da Teijin.

Artigos de Manufatura

[000318] Em outro aspecto, inclui-se um artigo de manufatura contendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios descritos acima. O artigo de manufatura compreende um recipiente e um rótulo. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, as garrafas, os frascos pequenos, as seringas e os tubos de teste. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como o vidro ou o plástico. O recipiente comporta uma composição que é efetiva para tratar a condição e pode ter um orifício de acesso estéril. Por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco pequeno tendo uma tampa rompível por uma agulha de injeção hipodérmica. O agente ativo na composição é o anticorpo anti-CD40 humanizado. O rótulo sobre, ou associado com, o recipiente indica que a composição é usada para tratar a condição de escolha. O artigo de manufatura pode adicionalmente compreender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como uma solução salina tamponada com fosfato, uma solução de Ringer, e uma solução de dextrose. Ele pode adicionalmente incluir outros materiais desejáveis a partir de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e bulas com instruções para uso.

[000319] A invenção é adicionalmente descrita nos exemplos que se seguem, os quais não são pretendidos para limitar o escopo da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Produção de Anticorpo Anti-CD40 Humanizado

[000320] Os anticorpos de ratos 20E2, e 2H11 são mostrados nas Tabelas 1 e 2 aqui contidas acima. Completou-se a humanização dos clones 20E2, e 2H11. Uma biblioteca foi feita, onde os resíduos de seres humanos e de ratos foram variados em um modo tal que em qualquer posição dada pudesse haver um resíduo de ser humano ou de rato. Tal biblioteca foi feita para os aminoácidos que eram diferentes entre a linha germinativa humana e o anticorpo de rato. Somente os clones que conservam a função do anticorpo de rato de origem foram selecionados.

[000321] Neste modo, o Anticorpo a, o Anticorpo B e o Anticorpo C eram anticorpos humanizados derivados do anticorpo de camundongo 20E2 (Anticorpo A e Anticorpo B) ou 2H11 (Anticorpo C) clonado em uma IgG1-KO (KO = nocaute) humana/cadeia principal capa. A IgG1- KO tem duas mutações na região Fc, Leu234Ala e Leu235Ala, para reduzir a ligação ao FcγR e ao complemento.

[000322] Os resultados de tal humanização resultaram em diversas sequências variáveis das cadeias pesadas e leves humanizadas, mostradas abaixo:
SEQ ID NO: 41 (sequência da cadeia leve variável):
DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 42 (sequência da cadeia pesada variável):
EVQLVKSGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:43 (sequência da cadeia leve variável)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 44 (sequência da cadeia pesada variável)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWAQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 45 (sequência da cadeia leve variável)
DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGAGTKVEIK
SEQ ID NO: 46 (sequência da cadeia pesada variável)
EVQLVESGGGLVKPGGSRRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSS.
SEQ ID NO: 47 (sequência da cadeia leve variável)
DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 48 (sequência da cadeia pesada variável)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 49 (sequência da cadeia leve variável)
DIVMTQSPDSLAVSLGERVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGAGTKVEIK
SEQ ID NO: 50 (sequência da cadeia leve variável)
EVQLVESGGGLVKPGGSRRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 51 (sequência da cadeia leve variável)
DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTMNCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDLAVYYCQNDYTYPLTFGAGTKVEIK.
SEQ ID NO: 52 (sequência da cadeia leve variável)
DIVMTQSPDSLAVSLGEKVTINCKSSQSLLNSGNQKNYLTWHQQKPGQPPKLLIYWTSTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQNDYTYPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 53 (sequência da cadeia pesada variável)
EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYGMHWVRQAPGKGLEWVAYISSGNRIIYYADTVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQDGYRYAMDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO: 54 (sequência da cadeia leve variável)
QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:55 (sequência da cadeia leve variável)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:56 (sequência da cadeia leve variável)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMLWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO:57 (sequência da cadeia pesada variável)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS.
SEQ ID NO:58 (sequência da cadeia pesada variável)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:59 (sequência da cadeia pesada variável)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS.
SEQ ID NO:60 (sequência encontrada pesada variável)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEWIGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:61 (sequência pesada variável)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQAPGQGLEWMGRIDPEDGDSKYAPKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:62 (sequência pesada variável):
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRIDPEDGDTKFAPKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:63 (sequência pesada variável)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQRPGQGLEWMGRIDPEDGDTKFAPKFQGKVTMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:64 (sequência pesada variável)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEWIGRIDPEDGDTKFAPKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:65 (sequência pesada variável)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNIKDYYVHWVKQAPGQGLEWMGRIDPEDGDTKFAPKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:66 (sequência pesada variável)
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCTASGFNITDYYVHWVKQAPGQGLEWMGRIDPEDGDTKFAPKFQGKATMTADTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:67 (sequência pesada variável)
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYDPKFQGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:68 (sequência pesada variável)
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYDPKFQGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:69 (sequência pesada variável)
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYDPKFQGKVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:70 (sequência pesada variável)
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQAPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYDPKFQGKATMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:71 (sequência pesada variável)
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQRPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYDPKFQGKATMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:72 (sequência pesada variável)
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCTVSGFNIKDYYIHWVKQAPGKGLEWIGRIDPEDGDTKYDPKFQGKATMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:73 (sequência pesada variável)
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGFNIKDYYIHWVQQAPGKGLEWMGRIDPEDGDTKYDPKFQGRVTMTADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCTTSYYVGTYGYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:74 (sequência leve variável) 1 a partir do anticorpo 10F2Hum:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYILWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPY TFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 75 (sequência leve variável) 2 a partir do anticorpo 10F2Hum:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYILWFQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO: 76 (sequência leve variável)
QIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSATSSVSYILWFQQKPGKAPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQRTFYPYTFGGGTKVEIK

[000323] Os anticorpos humanizados ilustrativos da presente invenção são aqueles que têm as sequências das cadeias pesadas e leves, apresentadas na tabela a seguir. As sequências em negrito sublinhadas na tabela a seguir são os domínios variáveis, enquanto as sequências normais, não sublinhadas, são os domínios constantes:

[000324] As regiões variáveis foram subclonadas em um ou dois vetores de expressão de IgG adequados diferentes:

A) um formato de IgG1-KO (nocaute) humana/capa com uma mutação dupla de Leu234Ala, Leu235Ala na região Fc, para reduzir a função efetora, tal como a ligação ao FcγR e ao complemento
b) um formato de IgG4-DM (mutante duplo) humana/capa com uma mutação de Ser228Pro na região de articulação, para reduzir a ocorrência de semimoléculas de IgG4, e uma mutação de Leu235Glu para reduzir adicionalmente a ligação ao FcγR

[000325] Os dois candidatos, Anticorpo A e Anticorpo B, foram purificados e avaliados pelos seguintes critérios:

- Aspecto de CCF (turvação)
- Propriedades de filtração de CCF
- Rendimento sobre rProteínaA
- Turvação na eluição e na neutralização
- Agregados solúveis (SEC)
- Padrão de pureza / contaminação (SDS)
- Padrão de carga (IEF)

Exemplo 2: Dados in vitro

[000326] O Anticorpo A, o Anticorpo B e o Anticorpo C foram caracterizados juntamente com os anticorpos 4D11 (Kirin/ Astellas) e PG-102 (PanGenetics), os quais foram produzidos com base em sequências publicadas. Os dados para o Anticorpo A, o Anticorpo B, o Anticorpo C e o 4D11 são mostrados abaixo. O PG-102 mostrou atividade agonística e somente inibição incompleta da proliferação das células B (não mostrado). A Tabela 2.2 resume os dados obtidos. Uma descrição mais detalhada dos dados segue a Tabela 2.2.
Tabela 2.2. Resumo dos dados in vitro do anticorpo anti-CD40 Anticorpo A, Anticorpo B e Anticorpo C e 4D11 da Kirin.

* SI, Índice de Estímulo; ** Razão > 1 significa ligação aumentada ao Cyno em comparação com o Humano

A. Ligação dos anticorpos humanizados à proteína CD40 celular e CD40 recombinante

[000327] A ligação específica dos anticorpos humanizados à CD40 celular foi analisada por citometria de fluxo, usando as células HK293 transfectadas com CD40 humanas. A ligação dependente da concentração do Anticorpo A, do Anticorpo B, e do Anticorpo C foi observada. Os anticorpos mostraram um perfil de ligação similar, mostrado na Figura 1B. Os valores de EC50 dos anticorpos da presente invenção e do anticorpo 4D11 da Kirin estão todos na mesma faixa de ~1 nM, que está mais provavelmente no limite de sensibilidade do ensaio devido aos altos níveis de CD40 nas células transfectadas. A ligação específica dos anticorpos humanizados à CD40 celular sobre as células Ramos humanas também demonstrou a ligação dependente da concentração. Os anticorpos mostraram um perfil de ligação ligeiramente diferente (mostrado na Figura 2) e valores de EC50 entre 0,21-1,22 nM. Nenhuma ligação foi detectada sobre as células CD40 negativas, tais como as células HEK293 não transfectadas ou a linhagem de células T HSB-2, assim confirmando a ligação seletiva à CD40 (dados não mostrados).

[000328] A afinidade de ligação do Anticorpo A, do Anticorpo B e do Anticorpo C à proteína CD40-Fc humana foi medida por meio de ForteBio Octet e revelou constantes de dissociação (KD) de <100 pM. Devido à avidez da bivalência de anticorpo e CD40-Fc, os efeitos impedem as Kds abaixo de 100 pM de serem determinadas acuradamente. Além disso, a ligação à CD40-Fc foi analisada na ausência e na presença de 50% de soro humano e nenhum efeito significativo do soro sobre a ligação foi observado (dados não mostrados).

B. Atividade dos anticorpos humanizados em ensaios de ativação/ proliferação de células B

[000329] A atividade dos anticorpos humanizados foi testada em um ensaio de proliferação de células B, no qual as células B humanas derivadas do sangue periférico são estimuladas com o CD40L recombinante, na presença de IL-2 e IL-4. O Anticorpo B e o Anticorpo C mostraram inibição potente da proliferação de células B (mostrada nas Figuras 3A e 3B). A comparação com as curvas de inibição e os valores de IC50 dos anticorpos BI's e do anticorpo 4D11 da Kirin indica que o anticorpo 4D11 tem uma potência maior (Figuras 3B e 4) quando testado através de múltiplos doadores. Quando testado quanto à atividade agonística na ausência de CD40L, os anticorpos, Anticorpo B Anticorpo A e Anticorpo C, não induziram nenhuma proliferação de células B acima dos níveis de base em concentrações até 10 g/ml (67 nM) (mostrado na Figura 4), similar ao anticorpo 4D11.

[000330] O anticorpo competidor 4D11 pareceu ser ligeiramente mais potente, com uma IC50 média de ~0,02 nM e ausência de efeitos agonísticos. Os dados para os três anticorpos BI e o 4D11 são resumidos na Figura 4 e na Tabela 2.2 acima descrita. Outro anticorpo competidor, PG-102 (derivado do clone 5D12), também testado neste ensaio, mostrou efeitos de agonista significativos, estimulando a proliferação de células B na ausência de CD40L (Figura 4). Portanto, a ausência de atividade agonística de nossos candidatos de liderança claramente diferencia-os do PG-102.

[000331] Em um segundo ensaio, os anticorpos foram testados quanto à inibição da suprarregulação de CD86 em células B humanas. Nesta situação, o ensaio pode ser efetuado com o sangue integral humano ou em células B purificadas, ambos na presença de CD40L exógeno. De acordo com os dados de proliferação de células B, o Anticorpo B, o Anticorpo A e o Anticorpo C testados no sangue integral humano mostraram inibição potente da suprarregulação de CD86 mediada por CD40, como medida por citometria de fluxo (mostrado na Figura 5). O Anticorpo C mostrou potência similar ao 4D11 neste ensaio, enquanto a potência do Anticorpo B e do Anticorpo A era algo mais fraca. A comparação de Anticorpo B e 4D11 sobre as células B purificadas ou no sangue integral mostra que a potência do Anticorpo B (valores de IC50 e IC90) está relativamente inalterada para as células B purificadas, em comparação com as células B na presença de outras células ou soro contendo CD40, enquanto o 4D11 sofre uma mudança dramática na potência nas condições de sangue integral (mostrada na Figura 6).

[000332] Foram desenvolvidos dados similares quando o Anticorpo B, o Anticorpo A e o Anticorpo C foram testados quanto à inibição da suprarregulação de CD86 sobre as células B de macaco cinomolgo, quando efetuados com amostras de sangue integral (mostrado na Figura 7). O Anticorpo B, o Anticorpo A e o Anticorpo C, testados no sangue integral de macaco cinomolgo, mostraram inibição potente da suprarregulação de CD86 mediada por CD40, como medida por citometria de fluxo. Todos estes anticorpos, portanto, mostram reatividade cruzada funcional à CD40 de macaco cinomolgo, com potência similar à CD40 humana.

[000333] A atividade do Anticorpo B IgG1KOb e do Anticorpo B IgG1WT foi avaliada quanto à capacidade de mediar a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (Figura 13). Neste ensaio, as células RAMOS foram incubadas com as PBMCs humanas, em uma razão de célula efetora para alvo de 50:1. O Anticorpo B IgG1KOb e o Anticorpo B IgG1WT foram titulados a partir de 20 ug/ml e a extensão da morte celular é monitorada por liberação de LDH. Os dados mostrados são de um experimento representativo. Os dados mostram que o Anticorpo A IgG1Wt 20E2-12-RIgG1WT é um mediador efetivo de ADCC e que o Anticorpo B IgG1KOb contendo as mutações que eliminam a função efetora não tem atividade de ADCC.

Exemplo 3: Estudos Farmacocinéticos/ Farmacodinâmicos A. Administração IV de uma única dose de Anticorpo A e Anticorpo B a 1 ou 10 mg/kg em Macacos Cinomolgos

[000334] O Anticorpo A e o Anticorpo B foram dosados, cada um, a 1 e 10 mg/kg IV em macacos cinomolgos machos (N = 3)/dose. As amostras de sangue foram coletadas de 0-504 h (3 semanas), o soro foi recuperado, e as amostras foram armazenadas a -20°C até a análise. As amostras foram analisadas por ELISA de encaixe, conforme descrito acima. Os perfis de concentração no soro/tempo de ambos os anticorpos nos macacos, após ambas as doses IV, e os parâmetros farmacocinéticos são resumidos na Figura 8 e nas Tabelas 2.7.1 (Anticorpo A) e 2.7.2 (Anticorpo B) mostradas abaixo. Ambos os anticorpos mostraram farmacocinética dependente da dose, sugerindo que, em baixa dose, a depuração é predominantemente atribuível a consistente com a disposição mediada pelo alvo, enquanto em dose mais elevada, o anticorpo é depurado principalmente pelo catabolismo. Foram observados perfis farmacocinéticos dependentes das doses similares para outros MAbs alvejando alvos associados com a membrana (por exemplo, CD19, CD20, EGFR, CD146 e HER2). A depuração para o Anticorpo A foi 0,8 e 0,1 mL/h/kg para as doses de 1 e 10 mg/kg, respectivamente. A depuração para o Anticorpo B foi 0,7 e 0,1 mL/h/kg para as doses de 1 e 10 mg/kg, respectivamente. Similarmente, a meia-vida do Anticorpo A foi 1 e 13 dias para as doses de 1 e 10 mg/kg, respectivamente, e a meia-vida do Anticorpo B foi 2 e 13 dias para as mesmas doses respectivas. Embora o Anticorpo B tivesse uma meia-vida marginalmente mais longa na dose menor, em relação à mesma dose para o Anticorpo A, esta diferença não seria esperada converter-se em exposição mais contínua com a administração crônica. A AUC para ambos os compostos era supraproporcional e o volume de distribuição (Vss) para ambos os compostos aproximou-se daquele do volume de plasma (~40 mL/kg), exibindo a distribuição de tecido limitada tipicamente vista para as substâncias terapêuticas de proteínas polares, grandes. No todo, não houve nenhuma diferença apreciável nos parâmetros farmacocinéticos entre os dois anticorpos.
Tabela 2.7.1: Parâmetros farmacocinéticos do Anticorpo A em macacos cinomolgos, machos (N = 3)/dose após as doses IV individuais de 1 e 10 mg/kg.

Tabela 2.7.2: Parâmetros farmacocinéticos do Anticorpo B em macacos cinomolgos, machos (N = 3)/dose após as doses IV individuais de 1 e 10 mg/kg.

B. Estudo Farmacodinâmico ex vivo

[000335] Como parte do estudo PK descrito acima, nós analisamos os efeitos farmacodinâmicos dos anticorpos anti-CD40. Para esta finalidade, as amostras de sangue integral foram incubadas com o CD40L recombinante durante a noite e o aumento da expressão de CD86 sobre as células B foi determinado por citometria de fluxo. As amostras foram analisadas no dia 0 (pré-tratamento), dia 2, 7 e 14 após a dosagem. Embora o aumento na expressão de CD86 seja relativamente pequeno (~5-20-%), foi observado um efeito dependente da dose (mostrado na Figura 9). No grupo de animais dosados com 10 mg/kg de Anticorpo A e Anticorpo B, a indução de CD86 foi completamente inibida em 2, 7 e 14 dias, consistente com a exposição contínua nesta dose. Os animais dosados com 1 mg/kg mostraram inibição completa no dia 2, inibição parcial no dia 7 e nenhuma inibição no dia 14. A perda do efeito farmacodinâmico ao longo do tempo correlaciona-se com a depuração mais rápida do anticorpo no grupo de dose baixa.

Exemplo 4: Estudos relacionados à toxicidade: CD40 sobre plaquetas

[000336] A CD40 é constitutivamente expressa sobre as plaquetas humanas (Henn, e col., 2001) e (Inwald, e col., 2003), enquanto o CD40L é rápida e transientemente expresso sobre a superfície celular de plaquetas ativadas (Henn, e col., 2001). Embora os anticorpos anti-CD40 sem a ligação ao FcR não fossem esperados ter efeitos sobre as plaquetas, é importante demonstrar diretamente que este é o caso. Os estudos de citometria de fluxo foram efetuados para demonstrar a ligação dos candidatos de liderança anti-CD40 às plaquetas humanas e de cinomolgos.

[000337] Antes, tinha sido demonstrado por citometria de fluxo que o G28.5 e o mAb anti-CD40 mAb 89 se ligam às plaquetas humanas em repouso (Henn, e col., 2001). Isto foi confirmado usando o anticorpo G28.5 marcado com FITC. As diluições em série de 5 vezes de G28.5 foram preparadas e uma faixa de 0,5 µg/ml a 0,32 ng/ml foi incubada em uns 100 µl de plaquetas obtidas de seres humanos (2 doadores) ou macacos cinomolgos (3 doadores), por 30 minutos, na temperatura ambiente. Além disso, o mAb anti-CD45 marcado com APC foi usado para identificar as plaquetas ligadas a outros tipos de células CD40+, de modo a excluir estas células da análise. Após a coloração do anticorpo, as plaquetas foram lavadas e fixadas com Optilyse C e a citometria de fluxo foi efetuada. A intensidade de fluorescência média (MFI) foi determinada como uma medida da ligação do anticorpo às plaquetas de CD45.

[000338] O 5c3 comercialmente disponível e os anticorpos selecionados da invenção mAb de camundongo anti-CD40 foram marcados com FITC. A ligação às células Ramos foi confirmada. O número de moléculas de FITC por molécula de anticorpo variou de 2 a 4 FITC por molécula de anticorpo. As diluições em série de cinco vezes do mAb comercial e anti-CD40 candidato foram preparadas variando de 0,5 µg/ml a 0,32 ng/ml e incubadas com plaqueta humana (3 doadores) e de cinomolgos (2 doadores) por 30 minutos, na temperatura ambiente.

[000339] Um gráfico representativo demonstrando a ligação do mAb anti-CD40 candidato de camundongo às plaquetas humanas é mostrado na Figura 11. Os quatro anticorpos monoclonais candidatos mostraram ligação específica às plaquetas humanas, em comparação com o anticorpo de controle de isótipo marcado com FITC. O 10F2, o 2H11, o 19B10 e o 20E2 demonstraram ligação comparável às plaquetas. Foi observada uma tendência similar para as plaquetas de cinomolgos (dados não mostrados).

[000340] Além desses estudos, o Anticorpo B diretamente marcado e o 4D11 foram comparados quanto à sua capacidade de ligar as plaquetas e as células B em amostras de sangues integrais humanas e de macacos cinomolgos (mostrado na Figura 12) O 4D11 mostrou ligação similar (conforme exemplificado por EC50) tanto às células B quanto às plaquetas nas amostras de sangue humanas e de macacos cinomolgos. O Anticorpo B mostrou um padrão similar, porém com uma potência de ligação muito mais fraca.

Exemplo 5: Estudos de farmacologia in vivo no modelo de camundongo NSG

[000341] A eficácia dos anticorpos humanizados, Anticorpo A, foi avaliada em um modelo de produção de anticorpo, onde as PBMC's humanas foram injetadas em camundongos NSG imunodeficientes para gerar uma resposta do enxerto vs. hospedeiro. A produção significativa de IgM (hIgM) e IgG (hIgG) humanas pode ser detectada começando 2 semanas após o enxerto. O tratamento com o Anticorpo A em doses de 5 e 1 mg/kg significativamente inibiu a resposta de hIgG e hIgM nas semanas 2 e 3 após o enxerto. Um anticorpo comparador (4D11) foi avaliado em uma única dose de 5 mg/kg e também demonstrou anulação da resposta. Em um segundo estudo, todos os anticorpos, Anticorpo A, Anticorpo B e Anticorpo C, foram testados em uma única dose de 1 mg/kg e mostraram inibição completa da resposta de IgM e IgG na semana 2 (Figura 10).

Exemplo 6: Análise do biomarcador Suprarregulação dos receptores

[000342] A suprarregulação dos receptores induzida pelo CD40L pode ser medida por citometria de fluxo. O sangue integral humano pode ser estimulado com concentração otimizada de CD40L solúvel e a porcentagem total de células CD20+Receptor+ pode ser medida por citometria de fluxo. A alteração na porcentagem de expressão de CD86 sobre as células positivas para CD20 foi medida em paralelo com o estudo pk de cyanomologous avaliando os Anticorpos A e B (Figura 9). O dado mostra a inibição da suprarregulação de CD86 em pontos de tempo consistentes com a exposição dos anticorpos.

Proteômica alvejada:

[000343] A secreção aumentada de proteínas com a estimulação de CD40 no sangue integral pode ser usada como biomarcador(es) potencial(is). Uma concentração otimizada de CD40L solúvel e o tempo de estimulação foram estabelecidos usando uma plataforma de glóbulos Luminex multiplex que detectam MDC/CCL22 e diversas outras proteínas secretadas. As amostras clínicas serão avaliadas a partir do sangue integral humano na faixa total de doses de mAb anti-CD40.

Ocupação do receptor:

[000344] A ocupação do receptor de CD40 pode ser determinada em um ensaio in vitro ou ex vivo com base na análise citométrica de fluxo das células B no sangue integral humano. Os candidatos atuais, Anticorpo da presente invenção e anticorpo anti-CD40 não competidor 5C3, serão usados para quantificar o ensaio de ocupação do receptor.

Exemplo 7: Atividade Antitumor do Anticorpo Anti-CD40 Humanizado

[000345] Em algumas situações, pode ser desejável determinar as propriedades antitumor dos anticorpos da presente invenção. Tal determinação pode ser feita testando a atividade antitumor do anticorpo anti-CD40 humanizado em um modelo de xenoenxerto de linfoma de camundongo SCID. Tal modelo de SCID pode ser injetado com células de câncer para apresentar um tumor, por exemplo, 5 x 106 milhões de células de tumor podem ser injetadas de modo subcutâneo nos camundongos SCID (10/grupo), treze dias antes de começar o tratamento com o fármaco. Os anticorpos anti-CD40 de ratos da presente invenção ou uma comparação (por exemplo, um anticorpo humanizado de controle ou outro) é dada de modo intraperitoneal 3 vezes por semana (4 mg/kg/dose), com 8 ou 5 doses administradas. O desenvolvimento e o crescimento dos tumores são monitorados no camundongo e o volume do tumor pode ser medido semanalmente durante o período de estudo selecionado, por exemplo, período de estudo de 14 dias. De preferência, os resultados mostrarão um aumento de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais vezes no crescimento dos tumores nos camundongos de controle, em comparação com os camundongos tratados com os anticorpos da presente invenção. De preferência, durante o período de tratamento, o crescimento do tumor nos camundongos tratados com os anticorpos da invenção será insignificante. Tais dados podem confirmar que o anticorpo humanizado que está sendo testado é efetivo na supressão do crescimento do tumor neste modelo de xenoenxerto de linfoma b.

Exemplo 8: Sobrevivência prolongada pelo Anticorpo Anti-CD40 Humanizado

[000346] A eficácia do anticorpo anti-CD40 humanizado sobre a sobrevivência de camundongos contendo tumor, tais como aqueles descritos acima, pode ser testada em um modelo de xenoenxerto de linfoma de camundongo SCID. Os camundongos SCID (10/grupo) são inoculados intravenosamente com 1 x 106 milhões de células de tumor, três dias antes do tratamento com o anticorpo. Os camundongos são então tratados com os anticorpos anti-CD40 de ratos ou humanizados da presente invenção ou um controle de Ig, administrados de modo intraperitoneal, duas vezes por semana (4 mg/kg/dose), para um total de cinco doses. Os alojamentos dos camundongos podem então ser examinados diariamente quanto à mortalidade, para determinar o nível de eficácia dos anticorpos em prolongar a sobrevivência de um paciente tendo câncer.

[000347] Diversas referências, incluindo os pedidos de patentes, as patentes, e as publicações científicas, são citadas neste documento, cujas divulgações são incorporadas aqui por referência em suas totalidades. A citação ou a identificação de qualquer referência neste documento não será interpretada como uma admissão que tal referência está disponível como técnica anterior à presente invenção.

[000348] Os aspectos preferidos da presente invenção podem ser descritos de acordo com as modalidades nos parágrafos a seguir:

[000349] Parágrafo 1. Um anticorpo monoclonal humanizado, onde o dito anticorpo especificamente se liga à CD40 humana tendo uma atividade antagonística IC50 de menos do que 1 nM e não tem nenhum agonismo até 100 µg/ml na proliferação de células B e onde o dito anticorpo é adicionalmente caracterizado pelo fato de que o anticorpo tem uma meia-vida in vivo em primatas não humanos que é pelo menos 10 dias.

[000350] Parágrafo 2. O anticorpo monoclonal humanizado do Parágrafo 1, onde o dito anticorpo tem uma meia-vida em macacos cinomolgos de mais do que 8 dias, em uma dose de menos do que 30 mg/kg.

[000351] Parágrafo 3. O anticorpo do Parágrafo 1, onde o anticorpo compreende uma sequência da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em quaisquer de SEQ ID NO:1 até SEQ ID NO:4 e uma sequência da cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em quaisquer de SEQ ID NO:5 até SEQ ID NO:8.

[000352] Parágrafo 4. O anticorpo do Parágrafo 1, onde o dito anticorpo é um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo tendo a sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de quaisquer de SEQ ID NO: 1 até 4, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO. 50 SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 73.

[000353] Parágrafo 5. O anticorpo do Parágrafo 1, onde o dito anticorpo é um anticorpo humanizado ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo que compreende uma sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 5 até SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, ou SEQ ID NO:76.

[000354] Parágrafo 6. O anticorpo monoclonal do Parágrafo 1, onde o dito anticorpo compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, onde a sequência da CDR1 da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 9 até SEQ ID NO:11, uma sequência da CDR2 da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:12 até SEQ ID NO:15 e uma sequência da CDR3 da cadeia pesada selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:16 até SEQ ID NO:17; e onde a sequência da CDR1 da cadeia leve tem uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:18 até SEQ ID NO:21, uma sequência da CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO:22 até SEQ ID NO:23 e uma sequência da CDR3 da cadeia leve selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:24 até SEQ ID NO:25.

[000355] Parágrafo 7. O anticorpo monoclonal do Parágrafo 1, onde o dito anticorpo compreende uma sequência da CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 10, uma sequência da CDR2 da cadeia pesada de SEQ ID NO:13 e uma sequência da CDR3 da cadeia pesada de SEQ ID NO:16 e onde o dito anticorpo compreende uma sequência da CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO:19, uma sequência da CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO:22 e uma sequência da CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO:24.

[000356] Parágrafo 8. O anticorpo monoclonal do Parágrafo 1, onde o dito anticorpo compreende uma sequência da CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 9, uma sequência da CDR2 da cadeia pesada de SEQ ID NO:14 e uma sequência da CDR3 da cadeia pesada de SEQ ID NO:16 e onde o dito anticorpo compreende uma sequência da CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO:20, uma sequência da CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO:22 e uma sequência da CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO:24.

[000357] Parágrafo 9. Um anticorpo anti-CD40 compreendendo uma sequência do domínio variável da cadeia pesada de qualquer uma de SEQ ID NOs:1 até 4.

[000358] Parágrafo 10. Um anticorpo anti-CD40 compreendendo uma sequência do domínio variável da cadeia leve de qualquer uma de SEQ ID NO: 5 até SEQ ID NO:8.

[000359] Parágrafo 12. Um anticorpo humanizado ou fragmento de anticorpo tendo um domínio variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:28 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:29 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:30 e SEQ ID NO:26, respectivamente; SEQ ID NO:32 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:33 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:34 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:31, respectivamente; SEQ ID NO:37 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:38 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:39 e SEQ ID NO:36, respectivamente; SEQ ID NO:40 e SEQ ID NO: 36, respectivamente.

[000360] Parágrafo 13. Um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno que especificamente se liga à CD40 humana, compreendendo um domínio variável da cadeia pesada humanizado compreendendo uma região de estrutura tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da região de estrutura da sequência de aminoácidos da cadeia pesada do domínio variável humano de SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 ou SEQ ID NO:30, e compreendendo uma sequência de aminoácidos da cadeia leve pelo menos 90% idêntica a um domínio variável da cadeia leve correspondente de SEQ ID NO:26.

[000361] Parágrafo 14. Um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno que especificamente se liga à CD40 humana, compreendendo um domínio variável da cadeia pesada humanizado compreendendo uma região de estrutura tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da região de estrutura da sequência de aminoácidos da cadeia pesada do domínio variável humano de SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34 ou SEQ ID NO:35, e compreendendo uma sequência de aminoácidos da cadeia leve pelo menos 90% idêntica a um variável da cadeia leve correspondente de SEQ ID NO:31.

[000362] Parágrafo 15. Um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno que especificamente se liga à CD40 humana, compreendendo um domínio variável da cadeia pesada humanizado compreendendo uma região de estrutura tendo uma sequência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à sequência de aminoácidos da região de estrutura da sequência de aminoácidos da cadeia pesada do domínio variável humano de SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39 ou SEQ ID NO:40, e compreendendo uma sequência de aminoácidos da cadeia leve pelo menos 90% idêntica a uma cadeia leve correspondente de SEQ ID NO:36.

[000363] Parágrafo 16. O anticorpo do Parágrafo 1, onde os ditos anticorpos não conseguem estimular a produção de citocinas a partir de células B nesta ausência de CD40L.

[000364] Parágrafo 17. O anticorpo do Parágrafo 1, onde os ditos anticorpos se ligam à CD40 humana na presença de 50% de soro humano com uma redução na taxa de menos do que duas vezes.

[000365] Parágrafo 18. O anticorpo do Parágrafo 1, onde o dito anticorpo produz inibição da produção de IgM e IgG em um mamífero em uma concentração de 1 mg/kg.

[000366] Parágrafo 19. Um método de bloquear a função da CD40 humana em um mamífero, compreendendo administrar ao dito mamífero uma composição compreendendo um anticorpo do Parágrafo 1 em uma quantidade suficiente para bloquear uma resposta imune mediada pela CD40 no dito mamífero.

[000367] Parágrafo 20. Um método de tratar ou melhorar a doença do enxerto vs. hospedeiro em um mamífero, compreendendo administrar ao dito mamífero uma composição compreendendo um anticorpo do Parágrafo 1, em uma quantidade suficiente para diminuir um ou mais dos sintomas da doença do enxerto vs. hospedeiro no dito animal.

[000368] Parágrafo 21. O método do Parágrafo 20, onde o dito mamífero tem uma doença autoimune ou inflamatória selecionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide, esclerose múltipla, glomerulonefrite proliferativa por lúpus, doença inflamatória do intestino (IBD), psoríase, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), Doença de Crohn e lúpus eritematoso sistêmico (SLE), tiroidite de Hashimoto, mixoedema primário, tireotoxicose/doença de Graves, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, cardite autoimune, doença de Addison, menopausa prematura, diabete melito tipo 1, síndrome de Good pasture, miastenia grave, anemia hemolítica autoimune, leucopenia idiopática, cirrose biliar primária, hepatite crônica ativa (HBs Ag negativa), cirrose criptogênica, síndrome de Sjogren, dermatomiosite, esclerodermia, doença do tecido conjuntivo misto, lúpus eritematoso discoide, e vasculite sistêmica.

[000369] Parágrafo 22. O método do Parágrafo 19, onde o dito mamífero tem artrite reumatoide.

[000370] Parágrafo 23. O método do Parágrafo 20, adicionalmente compreendendo administrar um segundo agente terapêutico selecionado a partir do grupo que consiste em um antagonista de TNF, um fármaco antirreumático modificador da doença, um antagonista de CTLA4, um mAb antirreceptor de IL-6 e um mAb anti-CD20.

[000371] Parágrafo 24. O método de acordo com o Parágrafo 20, onde a dita doença inflamatória ou doença autoimune é uma doença inflamatória ou doença autoimune que está associada com células que expressam tanto a CD40 quanto a CD20.

[000372] Parágrafo 25. O método do Parágrafo 19, onde o dito anticorpo anti-CD40 é administrado por uma via parenteral de administração.

[000373] Parágrafo 26. O método do Parágrafo 19, onde o dito anticorpo anti-CD40 é administrado de modo intravenoso ou subcutâneo.

[000374] Parágrafo 27. Um método de inibir a produção de anticorpos por células B em um paciente humano, compreendendo administrar ao dito paciente humano uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-CD40 do Parágrafo 1.

[000375] Parágrafo 28. O método do Parágrafo 27, onde o dito paciente humano tem uma doença inflamatória ou doença autoimune que está associada com as células que expressam a CD40.

[000376] Parágrafo 29. O método do Parágrafo 27, onde o dito paciente humano está sofrendo de uma doença autoimune selecionada a partir do grupo que consiste em doença autoimune ou inflamatória, selecionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide, esclerose múltipla, glomerulonefrite proliferativa por lúpus, doença inflamatória do intestino (IBD), psoríase, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), Doença de Crohn e lúpus eritematoso sistêmico (SLE), tiroidite de Hashimoto, mixoedema primário, tireotoxicose/doença de Graves, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, cardite autoimune, doença de Addison, menopausa prematura, diabete melito tipo 1, síndrome de Good pasture, miastenia grave, anemia hemolítica autoimune, leucopenia idiopática, cirrose biliar primária, hepatite crônica ativa (HBs Ag negativa), cirrose criptogênica, síndrome de Sjogren, dermatomiosite, esclerodermia, doença do tecido conjuntivo misto, lúpus eritematoso discoide, e vasculite sistêmica.

[000377] Parágrafo 30. Um método para a inibição do crescimento de células que expressam o antígeno CD40 humano, compreendendo administrar o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do Parágrafo 1 às células, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno este que especificamente se liga ao antígeno CD40 da superfície celular humano, onde a ligação do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno ao antígeno CD40 inibe o crescimento ou a diferenciação das células.

[000378] Parágrafo 31. Um método para tratar um paciente tendo um distúrbio associado à CD40, compreendendo administrar ao paciente o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do Parágrafo 1, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno este que especificamente se liga à CD40 humana, onde a ligação do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno à CD40 inibe o crescimento ou a diferenciação das células do distúrbio associado à CD40.

[000379] Parágrafo 32. O método do Parágrafo 31, onde as células do distúrbio associado à CD40 são as células linfoblastoides B, as pancreáticas, as células de pulmão, as células da mama, as células ovarianas, as células do cólon, as células da próstata, as células da pele, as células da cabeça e do pescoço, as células da bexiga, as células do osso ou as células do rim.

[000380] Parágrafo 33. O método do Parágrafo 31, onde o distúrbio associado à CD40 é a leucemia linfocítica crônica, o linfoma de Burkitt, o mieloma múltiplo, um linfoma de células T, o Linfoma que Não de Hodgkin, a Doença de Hodgkin, a macroglobulinemia de Waldenstrom ou o sarcoma de Kaposi.

[000381] Parágrafo 34. Um método para induzir a depleção de células B periféricas, compreendendo administrar às células o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do Parágrafo 1, anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno este que especificamente se liga a um antígeno CD40 da superfície celular humano, onde a ligação do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno ao antígeno CD40 induz a depleção das células.

[000382] Parágrafo 35. O método do Parágrafo 34, onde o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno é administrado a um paciente tendo um distúrbio imune.

[000383] Parágrafo 36. O método do Parágrafo 34, onde o distúrbio imune é a artrite reumatoide ou o lúpus eritematoso sistêmico.

[000384] Parágrafo 37. Um método de tratar a artrite reumatoide em um paciente, compreendendo administrar ao dito paciente um anticorpo do Parágrafo 1, onde o dito anticorpo é um anticorpo antagonístico que bloqueia a função da CD40 no dito paciente.

[000385] Parágrafo 38. O método do Parágrafo 37, onde o dito anticorpo é administrado em uma quantidade efetiva para inibir a diferenciação das células B e a troca de isótipo do anticorpo no dito paciente.

[000386] Parágrafo 39. O método do Parágrafo 37, onde o dito anticorpo é administrado em uma quantidade efetiva para inibir a produção de citocina e quimiocina e a suprarregulação das moléculas de adesão em células T e macrófagos no dito paciente.

[000387] Parágrafo 40. O método do Parágrafo 37, onde o dito anticorpo é administrado em uma quantidade efetiva para inibir a ativação de células dendríticas no dito paciente.

[000388] Parágrafo 41. O método do Parágrafo 37, onde o dito anticorpo é administrado em uma quantidade efetiva para inibir a produção de citocinas proinflamatórias, quimiocinas, metaloproteinases de matriz, prostaglandinas, e infrarregular as moléculas de adesão em células não imunes no dito paciente.

[000389] Parágrafo 42. O método do Parágrafo 37, onde o dito anticorpo é administrado em combinação com um regime compreendendo a administração de metotrexato e/ou a administração de Enbrel/Humira.

[000390] Parágrafo 43. O método do Parágrafo 37, onde o dito paciente é um paciente que tenha artrite reumatoide e tenha sido não responsivo ao tratamento com metotrexato sozinho.

[000391] Parágrafo 44. O método do Parágrafo 43, onde o dito método compreende tratar o dito paciente com um regime compreendendo a administração de metotrexato e/ou a administração de Enbrel/Humira.

[000392] Parágrafo 45. O método do Parágrafo 37, onde o tratamento do dito paciente com o dito anticorpo anti-CD40 antagonístico tem uma eficácia superior ao tratamento com metotrexato sozinho, Enbrel sozinho, uma combinação de Enbrel+metotrexato.

[000393] Parágrafo 46. O método do Parágrafo 43, onde o tratamento do dito paciente com o dito anticorpo anti-CD40 antagonístico tem uma eficácia superior ao tratamento com Enbrel +MTX em pacientes que tenham tido uma resposta inadequada ao metotrexato.

[000394] Parágrafo 47. O método do Parágrafo 37, onde o dito anticorpo é administrado em combinação com um regime compreendendo um agente anti-TNF.

[000395] Parágrafo 48. O método do Parágrafo 37, onde o dito paciente é um paciente que tenha artrite reumatoide e tenha sido não responsivo ao tratamento com um agente anti-TNF sozinho.

[000396] Parágrafo 49. O método do Parágrafo 48, onde o dito método compreende tratar o dito paciente com um regime compreendendo o tratamento com um agente anti-TNF em combinação com o dito anticorpo anti-CD40 antagonístico.

[000397] Parágrafo 50. O método do Parágrafo 37, onde o tratamento do dito paciente com o dito anticorpo anti-CD40 antagonístico tem uma eficácia superior ao tratamento com um agente anti-TNF.

[000398] Parágrafo 51. O método do Parágrafo 48, onde o tratamento do dito paciente com o dito anticorpo anti-CD40 antagonístico tem uma eficácia superior ao tratamento com Orencia ou Rituxan, em pacientes que tenham tido uma resposta inadequada a um agente anti-TNF sozinho.

[000399] Parágrafo 52. Uma composição farmacêutica compreendendo: (i) o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do Parágrafo 8; e (ii) um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[000400] Parágrafo 53. Uma composição farmacêutica do Parágrafo 52, onde o dito anticorpo ou o seu fragmento de ligação ao antígeno é conjugado a um segundo agente.

[000401] Parágrafo 54. A composição farmacêutica do Parágrafo 53, onde o dito segundo agente é um agente citotóxico, um veículo de PEG, uma enzima ou um marcador.

[000402] Parágrafo 55. Um polinucleotídeo isolado codificando uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada de quaisquer de SEQ ID NO: 1 a 4, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID. NO. 50, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, ou SEQ ID NO: 73.

[000403] Parágrafo 56. Um polinucleotídeo isolado codificando uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve de quaisquer de SEQ ID NO: 5 a SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SEQ ID NO:56, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, ou SEQ ID NO:76.

[000404] Parágrafo 57. Um uso de um anticorpo do Parágrafo 1 na manufatura de um medicamento para o bloqueio da função da CD40 humana em um mamífero, onde o medicamento bloqueia uma resposta imune mediada pela CD40 no dito mamífero.

[000405] Parágrafo 58. Um uso de um anticorpo do Parágrafo 1 para a manufatura de um medicamento para tratar ou melhorar a doença do enxerto vs. hospedeiro em um mamífero.

[000406] Parágrafo 59. O uso do Parágrafo 58, onde o dito medicamento é manufaturado para o tratamento de uma doença autoimune ou inflamatória selecionada a partir do grupo que consiste em artrite reumatoide, esclerose múltipla, glomerulonefrite proliferativa por lúpus, doença inflamatória do intestino (IBD), psoríase, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), Doença de Crohn e lúpus eritematoso sistêmico (SLE), tiroidite de Hashimoto, mixoedema primário, tireotoxicose/doença de Graves, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, cardite autoimune, doença de Addison, menopausa prematura, diabete melito tipo 1, síndrome de Good pasture, miastenia grave, anemia hemolítica autoimune, leucopenia idiopática, cirrose biliar primária, hepatite crônica ativa (HBs Ag negativa), cirrose criptogênica, síndrome de Sjogren, dermatomiosite, esclerodermia, doença do tecido conjuntivo misto, lúpus eritematoso discoide, e vasculite sistêmica.

[000407] Parágrafo 60. Um uso de acordo com o Parágrafo 58, onde o dito medicamento adicionalmente compreende um segundo agente terapêutico selecionado a partir do grupo que consiste em um antagonista de TNF, um fármaco antirreumático modificador da doença, um antagonista de CTLA4, um mAb antirreceptor de IL-6 e um mAb anti-CD20.

[000408] Parágrafo 61. Um uso de acordo com o Parágrafo 57, onde o dito medicamento é manufaturado para uso em uma via parenteral de administração.

[000409] Parágrafo 62. Um uso de acordo com o Parágrafo 57, onde o dito medicamento é manufaturado para uso de modo intravenoso ou subcutâneo.

[000410] Parágrafo 63. Um uso de um anticorpo do Parágrafo 1 na manufatura de um medicamento para a inibição da produção de anticorpos por células B em um paciente humano.

[000411] Parágrafo 64. Um uso de um anticorpo do Parágrafo 1 para a manufatura de um medicamento para a inibição do crescimento e/ou da diferenciação das células que expressam o antígeno CD40 humano.

[000412] Parágrafo 65. Um uso de um anticorpo do Parágrafo 1 para a manufatura de um medicamento para o tratamento de um paciente tendo um distúrbio associado à CD40, onde a ligação do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno no dito medicamento à CD40 inibe o crescimento ou a diferenciação das células do distúrbio associado à CD40.

[000413] Parágrafo 66. Um uso de acordo com o Parágrafo 65, onde o medicamento é usado para o tratamento de células de um distúrbio associado à CD40 selecionadas a partir de células linfoblastoides B, pancreáticas, células de pulmão, células da mama, células ovarianas, células do cólon, células da próstata, células da pele, células da cabeça e do pescoço, células da bexiga, células do osso ou células do rim.

[000414] Parágrafo 67. O uso de acordo com o Parágrafo 65, onde o medicamento é usado para o tratamento de leucemia linfocítica crônica, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, um linfoma de células T, Linfoma que Não de Hodgkin, Doença de Hodgkin, macroglobulinemia de Waldenstrom ou sarcoma de Kaposi.

[000415] Parágrafo 68. Um uso de um anticorpo do Parágrafo 1 na manufatura de um medicamento para induzir a depleção de células B periféricas, onde o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno do medicamento especificamente se liga a um antígeno CD40 da superfície celular humano, onde a ligação do anticorpo ou do fragmento de ligação ao antígeno ao antígeno CD40 induz a depleção das células.

[000416] Parágrafo 69. O uso de acordo com o Parágrafo 68, onde o medicamento é para o tratamento de um paciente tendo um distúrbio imune.

[000417] Parágrafo 70. O uso de acordo com o Parágrafo 68, onde o medicamento é para o tratamento de artrite reumatoide ou lúpus eritematoso sistêmico.

[000418] Parágrafo 71. Um uso de um anticorpo do Parágrafo 1 para a manufatura de um medicamento para o tratamento de artrite reumatoide em um paciente.

[000419] Parágrafo 72. O uso de acordo com o Parágrafo 71, onde o medicamento é para a inibição da diferenciação das células B e da troca de isótipo do anticorpo no dito paciente.

[000420] Parágrafo 73. O uso de acordo com o Parágrafo 71, onde o medicamento é para a inibição da produção de citocina e quimiocina e da suprarregulação das moléculas de adesão em células T e macrófagos no dito paciente.

[000421] Parágrafo 74. O uso de acordo com o Parágrafo 71, onde o medicamento é para a inibição da ativação das células dendríticas no dito paciente.

[000422] Parágrafo 75. O uso de acordo com o Parágrafo 71, onde o medicamento é para a inibição da produção de citocinas proinflamatórias, quimiocinas, metaloproteinases de matriz, prostaglandinas, e infrarregulação das moléculas de adesão em células não imunes no dito paciente.

[000423] Parágrafo 76. O uso de acordo com o Parágrafo 71, onde o medicamento é um medicamento de combinação para ser administrado em combinação com um regime compreendendo a administração de metotrexato e/ou a administração de Enbrel/Humira.

[000424] Parágrafo 77. O uso de acordo com o Parágrafo 71, onde o medicamento adicionalmente compreende um agente anti-TNF.

[000425] A aplicação dos ensinamentos divulgados neste documento não é para estar limitada no escopo pelas modalidades específicas descritas aqui. Na realidade, diversas modificações estarão dentro das capacidades de alguém tendo habilidade comum na técnica, considerando os ensinamentos contidos neste documento e nos exemplos que acompanham. Tais modificações são pretendidas incidir no escopo das reivindicações em anexo.

Claims

Anticorpo humanizado, caracterizado pelo fato de que apresenta uma cadeia pesada e uma cadeia leve compreendendo as sequências de aminoácido de SEQ ID NO:35 e SEQ ID NO:31, respectivamente.
Uso de um anticorpo, como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição para tratar ou melhorar uma doença ou distúrbio em um mamífero.
Uso, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a doença ou o distúrbio é selecionado a partir do grupo que consiste em: doença do enxerto vs. hospedeiro, doença autoimune ou inflamatória, e câncer que expressa CD40.
Uso de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a doença autoimune ou inflamatória é selecionada do grupo consistindo em artrite reumatoide, esclerose múltipla, glomerulonefrite proliferativa por lúpus, doença inflamatória do intestino (IBD), psoríase, púrpura trombocitopênica idiopática (ITP), Doença de Crohn e lúpus eritematoso sistêmico (SLE), tiroidite de Hashimoto, mixoedema primário, tireotoxicose/doença de Graves, anemia perniciosa, gastrite atrófica autoimune, cardite autoimune, doença de Addison, menopausa prematura, diabete melito tipo 1, síndrome de Good pasture, miastenia grave, anemia hemolítica autoimune, leucopenia idiopática, cirrose biliar primária, hepatite crônica ativa (HBs Ag negativa), cirrose criptogênica, síndrome de Sjogren, dermatomiosite, esclerodermia, doença do tecido conjuntivo misto, lúpus eritematoso discoide, e vasculite sistêmica.
Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um segundo agente terapêutico selecionado.
Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo o anticorpo é administrada por uma via parenteral, via intravenosa ou via subcutânea de administração.
Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um anticorpo como definido na reivindicação 1; e (ii) um excipiente farmaceuticamente aceitável; sendo que o anticorpo ou o seu fragmento de ligação ao antígeno é opcionalmente conjugado a um segundo agente.