KR20210027436A - 자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 항-cd40 항체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간화된 길항작용성 신규한 인간화된 항-CD40 항체, 및 이를 사용한 치료 및 진단 방법, 및 조성물에 관한 것이다.

Description

자가면역 질환을 치료하는데 사용하기 위한 항-CD40 항체

본 발명은 일반적으로 진단 및 치료용의 인간화된 항-CD40 항체에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 인간화된 항-CD40 항체, 및 CD40을 발현하는 세포를 특징으로 하는 다양한 질병 또는 장애의 치료 방법이 개시된다. 인간화된 항-CD40 항체를 포함하는 약제학적 조성물 및 키트도 개시된다.

CD40은 48 kDa의 I형 내재성 막 당단백질로서, 종양 괴사 인자(TNF) 수용체 상과의 구성원이다. CD40은 정상 및 신생물성 B 세포, 감입(interdigitating) 세포, 암종, 상피 세포(예를 들면, 각질세포), 섬유아세포(예를 들면, 활막세포) 및 혈소판을 비롯한 각종 세포 유형에서 발현된다. 또한, 이들은 단핵구, 대식세포, 일부의 내피 세포 및 여포성 수지상 세포 상에도 존재한다. CD40은 B 세포 개체발생의 초기에 발현되어, CD10 및 CD19이 출현한 이후에 CD21, CD23, CD24의 발현 및 표면 면역글로불린 M(sIgM)의 출현 이전에 B 세포 전구체 상에 나타난다 (Uckun et al., 1990, Blood 15:2449). CD40은 편도선 및 골수 유래의 형질 세포 상에서도 검출되었던 바 있다 (Pellat-Decounynck et al., 1994, Blood 84:2597).

CD40의 리간드는 TNF 상과 구성원인 CD40L (CD154, gp39 및 TRAP로도 칭함)이다. CD40L은 활성화된 CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포의 작은 아형군(subset)에서 주로 발현되는 막관통 단백질이다 (문헌 [Van Kooten C. and Banchereau, 2000]에서 개괄됨).

CD40과 CD40L의 상호작용은 체액성 및 세포 매개성 면역 반응을 모두 유도한다. CD40은 이러한 리간드-수용체 쌍을 조절하여 B 세포, 및 수지상 세포(DC)를 비롯한 다른 항원 제시 세포(APC)를 활성화시킨다 (문헌 [Toubi and Shoenfeld, 2004]; [Kiener, et al., 1995]에서 개괄됨). B 세포에 대한 CD40의 기능은 광범위하게 연구되어 왔다. B 세포에 대한 CD40의 활성화는 증식, 항체 분비 세포로의 분화 및 2차 림프 기관의 배중심에서의 동형 전환(isotype switching)을 유도한다. 시험관내 연구는 사이토카인 생산 (IL-6, IL-10, TNF-α, LT-α), 부착 분자 및 보조자극 수용체 (ICAM, CD23, CD80 및 CD86)의 발현, 및 B 림프구에 의한 MHC 클래스 I, MHC 클래스 II 및 TAP 수송체의 발현 증가에 대한 CD40 활성화의 직접적인 영향을 증명하였다 (Liu, et al., 1996). 상기 과정들은 대부분의 경우에, CD40은 사이토카인 또는 다른 수용체-리간드 상호작용과 협업하여 작용한다.

단핵구 및 DC에 대한 CD40의 신호전달은 사이토카인 (IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α 및 MIP-1α)의 생존 및 분비를 향상시킨다. 또한, 이러한 APC에 대한 CD40 결찰은 보조자극 분자 (예를 들면, ICAM-1, LFA-3, CD80 및 CD86)의 상향 조절로도 이어진다. CD40 수용체의 활성화는, DC가 T 세포 활성화를 구동시키는 효과적인 APC로 완전하게 성숙하게 해 주는 중요한 신호들 중 하나이다 (Banchereau and Steinman, 1998) (Van Kooten C. and Banchereau, 2000).

마우스 모델에서의 최근 연구들은, 수지상 세포에 대한 CD40 신호전달이 관절염과 다발성 경화증과 같은 질환에서 자가면역의 매개체로서 생각되는 TH17 세포의 생성에도 중요한 역할을 한다는 것을 보여주었다 (Iezzi, et al., 2009) (Perona-Wright, et al., 2009).

CD40 및 CD40L 녹아웃 마우스 뿐만 아니라 작용활성 및 길항작용성 항-마우스 항체의 활용은, 여러가지 질환 모델에 있어서 CD40-CD40L 상호작용에 대한 역할을 연구하는 것을 가능케 하였다. 차단성 항-CD40L의 투여는, SNF1 마우스의 루푸스 신염 또는 NOD 마우스의 당뇨병과 같은 자연발생 질환을 비롯한 수개의 자가면역 모델에서, 또는 콜라겐 유도형 관절염(CIA) 또는 실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE)과 같은 질환의 실험적으로 유도된 형태에서 유익한 것으로 입증된 바 있다(Toubi and Shoenfeld, 2004). 마우스에서의 CIA는, 연골 및 뼈의 침식 이외에도 관절 염증의 발생, 콜라겐에 대한 혈청 항체 역가, 활막 조직에 대한 염증성 세포의 침윤을 차단하는 항-CD40L mAb에 의해 억제되었다 (Durie, et al., 1993). 루푸스 신염 및 EAE 모두의 경우, 항-CD40L도 진행 중인 질환을 완화시킬 수 있음이 입증되었는데, 이는 상기 질환의 효과기 단계에서의 CD40-CD40L의 역할을 확인시켜 준 것이다 (Kalled, et al., 1998); (Howard, et al., 1999).

EAE의 발병에 있어서 CD40-CD40L 상호작용의 역할은 수초 염기성 단백질에 특이적인 유전자이식 T 세포 수용체를 보유한 CD40L 결핍 마우스에서도 연구되었다. 이러한 마우스는 항원으로 프라이밍한 후 EAE를 발병하지 못했고, CD4+ T 세포는 휴지 상태로 되어 INF-γ를 생성하지 않았다 (Grewal, et al., 1996).

또한, CD40에 대해 유도된 억제성 항체는 EAE와 같은 염증성 질환 모델에서 유익한 효과를 나타냈다. 라만과 그의 동료들은 길항작용성 마우스 항-인간 CD40 mAb mu5D12와 상기 mAb의 키메라 형태가 이교계(outbred) 마모셋 원숭이에서 만성 탈수초 EAE의 임상적 발현을 효과적으로 방지하였음을 입증했다 (Laman, et al., 2002); (Boon, et al., 2001). 이의 후속 연구에서는, 키메라 항-인간 CD40 항체를 사용한 치료적 처치가 마모셋 EAE 모델에서 MRI 검출가능한 염증을 감소시키고 기존의 뇌 병변의 확대를 지연시키는 것으로 나타났다 (Hart, et al., 2005).

작용활성을 갖는 항-CD40 항체는 관절염의 마우스 모델에서 시험하였는데, 일부 상충되는 결과가 나타났다. 면역자극제에 대해서 예상되었던 바와 같이, 작용활성을 갖는 항-마우스 CD40 mAb FGK45는 CIA의 DBA/1 마우스 모델에서 질환을 악화시키는 것으로 나타났다 (Tellander, et al., 2000). 그러나, 다른 만성 CIA 모델 FGK45 및 또 다른 작용활성을 갖는 항-마우스 CD40 mAb인 3/23의 경우에서는 모두 긍정적인 치료 효과를 나타냈다 (Mauri, et al., 2000). 본 그룹은 상기 치료 요법에서의 작용활성을 갖는 항체가 IFN- 수준이 감소하고 IL-4 및 IL-10 수준이 증가하면서 Th2 반응에 대한 면역 편차를 유도함으로써 유익한 효과를 나타내는 것으로 가정하였다 (Mauri, et al., 2000).

CD40/CD154 상호작용을 차단하여 이식거부반응을 예방하는 것도 입증되었다. 붉은털원숭이의 신장 동종이식 연구에서 키메라 항-CD40 길항제인 ch5D12의 사용은, CD40의 길항작용이 질환을 변형시키고 100일 후의 평균 생존 시간을 연장시키는데 충분함을 시사한다. ch5D12를 항-CD86 항체와 조합하여 동종이식 연구 시작 시에만 투여한 후 사이클로스포린으로 장기간 치료하는 경우, 4년 초과의 평균 생존 시간이 달성되었는데, 이는 상기 조합이 잠재적으로 내성을 유발할 수 있음을 시사하는 것이다 (Haanstra, et al., 2005).

이와 같이, 효과적인 T 세포 의존성 면역 반응을 유도하는데 있어서의 CD40-CD40L 이분자체(dyad)의 결정적인 역할에 관한 증거를 제공하는 임상전 연구들이 많이 있다. 따라서, CD40 신호전달의 차단은 RA, 다발성 경화증 또는 건선과 같은 질환에서 병원성 자가면역 반응을 억제하는데 필요한 적절한 치료적 전략으로 생각된다. 그러나, 현재까지는, 이전에 개발중인 항-CD40 항체들이 심각한 부작용을 갖는 것으로 나타났기 때문에, 상기 질환들의 치료적 개입에 대해 승인된 CD40 항체는 아직 없다. 따라서, CD40-CD40L의 작용에 개입하여 CD40 신호전달을 차단하는데 사용될 수 있는 치료제들이 매우 필요한 실정이다. 이러한 필요성은 CD40에 특이적으로 결합하고, CD40 기반 질환들의 치료적 개입에서 사용할 수 있는 항원 결합 특이성, 친화도, 및 약동학 및 약력학적 특성을 나타내는, 신규한 인간화된 항-CD40 항체에 의해 해소될 수 있다.

본 발명은 인간화된 단일클론 항체로서, 상기 항체가 1 nM 미만의 길항작용 활성 IC50을 갖는 인간 CD40에 특이적으로 결합하고 B 세포 증식에서 100 ㎍/㎖ 이하의 효능작용 (agonism)을 갖지 않으며, 상기 항체가 인간이 아닌 영장류에서의 생체내 반감기가 적어도 10일인 것을 추가의 특징으로 하는 것인, 항체를 제공한다.

상기 인간화된 단일클론 항체는 해당 항체가 30 mg/kg 미만의 용량에서 사이노몰거스 원숭이에서의 반감기가 8일 초과인 것을 추가의 특징으로 할 수 있다.

예시적인 실시형태에서, 본 발명의 항체는 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 임의의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 서열 및 서열번호 5 내지 서열번호 8 중 임의의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 경쇄 서열을 포함한다.

다른 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 1 내지 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73 중 임의의 서열의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 인간화된 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편이다.

다른 실시형태에서, 상기 항체는 서열번호 5 내지 서열번호 8, 서열번호 26, 서열번호 31, 서열번호 36, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 74, 서열번호 75, 또는 서열번호 76의 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 포함하는 인간화된 항체 또는 상기 항체의 항원 결합 단편이다.

특정 실시형태에서, 본원에 기술된 단일클론 항체는, 중쇄 및 경쇄를 포함하고, 여기서, 상기 중쇄 CDR1 서열은 서열번호 9 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되고, 중쇄 CDR2 서열은 서열번호 12 내지 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택되며, 중쇄 CDR3 서열은 서열번호 16 내지 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택되고; 상기 경쇄 CDR1 서열은 서열번호 18 내지 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열을 가지며, 경쇄 CDR2 서열은 서열번호 22 내지 서열번호 23으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 경쇄 CDR3 서열은 서열번호 24 내지 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

특정 실시형태에서, 본원에 기술된 단일클론 항체는 서열번호 10의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 13의 중쇄 CDR2 서열 및 서열번호 16의 중쇄 CDR3 서열을 포함하고, 여기서, 상기 항체는 서열번호 19의 경쇄 CDR1 서열, 서열번호 22의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

다른 특정 실시형태에서, 본원에 기술된 단일클론 항체는 서열번호 9의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 14의 중쇄 CDR2 서열 및 서열번호 16의 중쇄 CDR3 서열을 포함하고, 여기서, 상기 항체는 서열번호 20의 경쇄 CDR1 서열, 서열번호 22의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 특정 실시형태에서, 본원에 기술된 단일클론 항체는 서열번호 9의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 14의 중쇄 CDR2 서열 및 서열번호 16의 중쇄 CDR3 서열을 포함하고, 여기서, 상기 항체는 서열번호 20의 경쇄 CDR1 서열, 서열번호 22의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또 다른 특정 실시형태에서, 본원에 기술된 단일클론 항체는 서열번호 11의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 15의 중쇄 CDR2 서열 및 서열번호 17의 중쇄 CDR3 서열을 포함하고, 여기서, 상기 항체는 서열번호 21의 경쇄 CDR1 서열, 서열번호 23의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 25의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 바람직한 항체의 중쇄에 대한 각 서열들도 본원에 기술되어 있다. 본 발명은, 예를 들어, 서열번호 1 내지 서열번호 4 중 임의의 한 서열의 중쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 항-CD40 항체에 관한 것이다. 상기 항-CD40 항체는 서열번호 5 내지 서열번호 8 중 임의의 한 서열의 경쇄 가변 도메인 서열을 포함하는 것을 추가의 특징으로 한다.

또한, 각각 서열번호 27 및 서열번호 26; 각각 서열번호 28 및 서열번호 26; 각각 서열번호 29 및 서열번호 26; 각각 서열번호 30 및 서열번호 26; 각각 서열번호 32 및 서열번호 31; 각각 서열번호 33 및 서열번호 31; 각각 서열번호 34 및 서열번호 31; 각각 서열번호 35 및 서열번호 31; 각각 서열번호 37 및 서열번호 36; 각각 서열번호 38 및 서열번호 36; 각각 서열번호 39 및 서열번호 36; 각각 서열번호 40 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 도메인을 갖는 인간화된 항체 또는 항체 단편도 고려된다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 27 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간화된 항체 또는 항체 단편에 대한 것이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 28 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간화된 항체 또는 항체 단편에 대한 것이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 29 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간화된 항체 또는 항체 단편에 대한 것이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 30 및 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간화된 항체 또는 항체 단편에 대한 것이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 32 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간화된 항체 또는 항체 단편에 대한 것이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 33 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간화된 항체 또는 항체 단편에 대한 것이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 34 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간화된 항체 또는 항체 단편에 대한 것이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 35 및 서열번호 31의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간화된 항체 또는 항체 단편에 대한 것이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 37 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간화된 항체 또는 항체 단편에 대한 것이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 38 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간화된 항체 또는 항체 단편에 대한 것이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 39 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간화된 항체 또는 항체 단편에 대한 것이다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명은 각각 서열번호 40 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 인간화된 항체 또는 항체 단편에 대한 것이다.

또 다른 실시형태는 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 또는 서열번호 30의 인간 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는 인간화된 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 이에 상응하는 서열번호 26의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90% 동일한 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.

또 다른 실시형태는 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 또는 서열번호 35의 인간 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는 인간화된 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 이에 상응하는 서열번호 31의 경쇄 가변 도메인과 적어도 90% 동일한 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 바로 직전의 실시형태에 기술된 분리된 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이며, 또 다른 실시형태에서, 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 32이고; 또 다른 실시형태에서, 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 33이며; 또 다른 실시형태에서, 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 34이고; 또 다른 실시형태에서, 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 35이다.

또한, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39 또는 서열번호 40의 인간 가변 도메인 중쇄 아미노산 서열의 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 갖는 프레임워크 영역을 포함하는 인간화된 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 이에 상응하는 서열번호 36의 경쇄와 적어도 90% 동일한 경쇄 아미노산 서열을 포함하는, 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 항원 결합 단편도 고려된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 바로 직전의 실시형태에 기술된 분리된 항체 또는 항원 결합 단편에 관한 것이며, 또 다른 실시형태에서, 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 37이고; 또 다른 실시형태에서, 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 38이며; 또 다른 실시형태에서, 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 39이고; 또 다른 실시형태에서, 중쇄 아미노산 서열은 서열번호 40이다.

본 발명의 항체는 해당 항체가 CD40L의 부재 하에는 B 세포로부터 사이토카인의 생성을 자극할 수 없는 것을 추가의 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 항체는 해당 항체가 50% 인간 혈청의 존재 하에 2배 미만의 친화도 (on rate) 감소로 인간 CD40에 결합하는 것을 추가의 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 항체는 해당 항체가 1 mg/kg의 농도로 포유동물에서 IgM 및 IgG 생산을 억제하는 것을 추가의 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 항체는 다양한 치료, 예방, 진단 및 기타 방법들에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 포유동물에서 CD40 매개된 면역 반응을 차단하기에 충분한 양으로 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물에서 인간 CD40의 기능을 차단하는 방법을 기술하고 있다.

또한, 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 포유동물의 이식편 대 숙주 질환의 하나 이상의 증상을 감소시키기에 충분한 양으로 상기 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 포유동물에서 이식편 대 숙주 질환을 치료하거나 개선하는 방법도 본원에서 고려된다.

예를 들어, 상기 자가면역 또는 염증성 질환은, 이에 제한되지는 않지만, 류머티스 관절염, 루푸스 신염, 다발성 경화증, 증식성 루푸스 사구체신염, 염증성 장질환 (IBD), 건선, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 크론병 및 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 하시모토 갑상선염, 원발성 점액부종, 갑상선독증/그레이브스병, 악성 빈혈, 자가면역성 위축성 위염, 자가면역성 심장염, 애디슨병, 조기 폐경, 1형 진성 당뇨병, 굿파스처 증후군, 중증 근무력증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소증, 원발성 담즙 간경변, 활동성 만성 간염 (HBs Ag 음성), 잠복성 간경변, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 경피증, 혼합 결합 조직 질환, 원반상 홍반성 루푸스 및 전신성 혈관염을 포함할 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 포유동물은 류머티스 관절염이 있다.

본 발명의 방법은 TNF-길항제, 질환 완화용 항류머티스 약물, CTLA4-길항제, 항-IL-6 수용체 mAb 및 항-CD20 mAb로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

특정 실시형태에서, 상기 염증성 질환 또는 자가면역 질환은 CD40 및 CD20을 모두 발현하는 세포와 관련된 염증성 질환 또는 자가면역 질환이다.

특정 방법에서, 치료는 비경구 투여 경로에 의해 항체 조성물을 투여하는 단계를 수반한다.

특정 방법에서, 치료는 항체 조성물을 정맥내 또는 피하 투여하는 단계를 수반한다.

본 발명의 추가의 방법은 본 발명의 항-CD40 항체의 유효량을 인간 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 인간 환자에서 B 세포에 의한 항체 생산을 억제하는 것을 포함한다.

보다 구체적으로, 상기 인간 환자는 CD40 발현 세포와 관련된 염증성 질환 또는 자가면역 질환을 앓고 있다.

예시적인 실시형태에서, 인간 환자는 류머티스 관절염, 루푸스 신염, 다발성 경화증, 증식성 루푸스 사구체신염, 염증성 장질환 (IBD), 건선, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 크론병 및 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 하시모토 갑상선염, 원발성 점액부종, 갑상선독증/그레이브스병, 악성 빈혈, 자가면역성 위축성 위염, 자가면역성 심장염, 애디슨병, 조기 폐경, 1형 진성 당뇨병, 굿파스처 증후군, 중증 근무력증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소증, 원발성 담즙 간경변, 활동성 만성 간염 (HBs Ag 음성), 잠복성 간경변, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 경피증, 혼합 결합 조직 질환, 원반상 홍반성 루푸스 및 전신성 혈관염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가면역 또는 염증성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택된 자가면역질환을 앓고 있다.

본 발명의 또 다른 방법은, 인간 세포 표면 CD40 항원에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 세포에 투여하는 단계를 포함하여, 상기 CD40 항원에 대한 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 결합이 상기 세포의 성장 또는 분화를 억제하는 것인, 인간 CD40 항원을 발현하는 세포의 성장을 억제하는 방법에 관한 것이다.

또한, 인간 CD40에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 상기 CD40에 대한 항체 또는 항원 결합 단편의 결합이 상기 CD40 관련 질환 세포의 성장 또는 분화를 억제하는 것인, CD40 관련 질환이 있는 대상체를 치료하는 방법도 고려된다. 상기 세포는, 이에 제한되지는 않지만, B 림프모세포, 췌장 세포, 폐 세포, 유방 세포, 난소 세포, 결장 세포, 전립선 세포, 피부 세포, 두경부 세포, 방광 세포, 뼈 세포 또는 신장 세포일 수 있다.

상기 세포의 성장 또는 분화를 억제하는 치료 방법은, 류머티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 만성 림프구성 백혈병, 버키트 림프종, 다발성 골수종, T 세포 림프종, 비호지킨 림프종, 호지킨병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 또는 카포시 육종의 치료에 유용할 수 있다.

또한, 인간 세포 표면 CD40 항원에 특이적으로 결합하는 본 발명의 항체 또는 항원 결합 단편을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 상기 CD40 항원에 대한 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 결합이 상기 세포의 고갈을 유도하는 것인, 말초성 B 세포의 고갈을 유도하는 방법도 고려된다.

특정 실시형태에서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 면역 질환이 있는 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 상기 면역 질환은 류머티스 관절염 또는 전신 홍반성 루푸스이다.

또한, 본 발명의 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 류머티스 관절염을 치료하는 방법도 고려되는데, 여기서 상기 항체는 상기 대상체에서 CD40의 기능을 차단하는 길항작용성 항체이다.

또한, 본 발명의 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 전신 홍반성 루푸스 또는 루푸스 신염을 치료하는 방법도 고려되는데, 여기서 상기 항체는 상기 대상체에서 CD40의 기능을 차단하는 길항작용성 항체이다.

바람직하게는, 상기 항체는 상기 대상체에서 B 세포 분화 및 항체 동형 전환을 억제하는데 효과적인 양으로 투여된다.

다른 실시형태에서, 상기 항체는 상기 대상체의 T 세포 및 대식세포에서 사이토카인과 케모카인 생성 및 부착 분자의 상향 조절을 억제하는데 효과적인 양으로 투여된다. 바람직하게는, 상기 항체는 상기 대상체에서 수지상 세포의 활성화를 억제하기에 효과적인 양으로 투여된다.

다른 실시형태에서, 상기 방법은, 항체가 상기 대상체에서 비면역 세포의 염증 유발성 사이토카인, 케모카인, 기질 금속단백질분해효소, 프로스타글란딘의 생성을 억제하고 부착 분자를 하향 조절하는데 효과적인 양으로 투여되는 것을 추가의 특징으로 한다.

특정 실시형태에서, 상기 항체는 메토트렉세이트 투여 및/또는 엔브렐(Enbrel)/휴미라(Humira)의 투여를 포함하는 요법과 병용하여 투여된다.

상기 요법을 받는 대상체는 류머티스 관절염을 앓고 있으며 메토트렉세이트 치료에만 반응하지 않는 대상체이다.

특정 실시형태에서, 상기 방법은 메토트렉세이트 투여 및/또는 엔브렐/휴미라의 투여를 포함하는 요법을 사용하여 상기 대상체를 치료하는 것을 포함한다.

본 발명의 방법은, 상기 길항작용성 항-CD40 항체를 이용한 상기 대상체의 치료가 메토트렉세이트 단독, 엔브렐 단독, 엔브렐 + 메토트렉세이트의 조합을 이용한 치료에 비해 월등한 효능을 나타냄을 추가의 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 방법은, 상기 길항작용성 항-CD40 항체를 이용한 상기 대상체의 치료가 메토트렉세이트에 대하여 불충분한 반응을 나타내었던 환자에서 엔브렐 + MTX를 이용한 치료에 비해 월등한 효능을 나타냄을 추가의 특징으로 할 수 있다.

특정 실시형태에서, 상기 항체는 항-TNF 제제를 포함하는 요법과 병용하여 투여된다.

특정 실시형태에서, 대상체는 류머티스 관절염이 있고 항-TNF 제제 단독 치료에 반응하지 않았던 대상체인 것을 특징으로 한다. 이러한 실시형태에서, 상기 방법은 상기 길항작용성 항-CD40 항체와 조합된 항-TNF 제제를 사용한 치료를 포함하는 요법으로 상기 대상체를 치료하는 것을 포함할 수 있다.

특정 실시형태에서, 상기 길항작용성 항-CD40 항체를 이용한 상기 대상체의 치료는 항-TNF 제제를 사용한 치료에 비해 월등한 효능을 나타낸다.

다른 실시형태에서, 상기 방법은 상기 길항작용성 항-CD40 항체를 이용한 상기 대상체의 치료가 항-TNF 제제 단독에 대해 불충분한 반응을 나타내었던 환자에서 오렌시아(Orencia) 또는 리툭산(Rituxan)을 사용한 치료에 비해 월등한 효능을 나타내는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 추가로, (i) 본원에 기술된 항체 또는 항원 결합 단편; 및 (ii) 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물에 대해서도 고려한다. 이러한 조성물에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 유리하게는 제2 제제, 예를 들어 세포독성제, PEG-운반체, 효소 또는 마커에 접합될 수도 있다.

또한, 본원에서는 서열번호 1 내지 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 50, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72 또는 서열번호 73 중 임의의 서열의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드도 고려된다.

또한, 본원에서는 서열번호 5 내지 서열번호 8, 서열번호 26, 서열번호 31, 서열번호 36, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 74, 서열번호 75 또는 서열번호 76 중 임의의 서열의 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드도 고려된다.

또한, 본 발명은 포유동물에서 인간 CD40의 기능을 차단하기 위한 약제를 제조하기 위한 본원에 기재된 항체의 용도에 관한 것으로, 여기서 상기 약제는 상기 포유동물에서 CD40 매개된 면역 반응을 차단한다.

한 실시형태에서, 본 발명은 포유동물에서 이식편 대 숙주 질환을 치료 또는 개선하기 위한 약제의 제조에 관한 것이다.

예시적인 실시형태에서, 상기 약제는 류머티스 관절염, 루푸스 신염, 다발성 경화증, 증식성 루푸스 사구체신염, 염증성 장질환 (IBD), 건선, 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP), 크론병 및 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 하시모토 갑상선염, 원발성 점액부종, 갑상선독증/그레이브스병, 악성 빈혈, 자가면역성 위축성 위염, 자가면역성 심장염, 애디슨병, 조기 폐경, 1형 진성 당뇨병, 굿파스처 증후군, 중증 근무력증, 자가면역성 용혈성 빈혈, 특발성 백혈구 감소증, 원발성 담즙 간경변, 활동성 만성 간염 (HBs Ag 음성), 잠복성 간경변, 쇼그렌 증후군, 피부근염, 경피증, 혼합 결합 조직 질환, 원반상 홍반성 루푸스 및 전신성 혈관염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 자가면역 또는 염증성 질환의 치료를 위하여 제조된다.

일부 실시형태에서, 상기 약제는 TNF-길항제, 질환 완화용 항류머티스 약물, CTLA4-길항제, 항-IL-6 수용체 mAb 및 항-CD20 mAb로 이루어진 군으로부터 선택되는 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

상기 약제는 비경구 투여 경로에 사용하기 위해 제조될 수 있다. 상기 약제는 정맥내 또는 피하로 사용하기 위해 제조될 수 있다.

또 다른 실시형태는 인간 환자에서 B 세포에 의한 항체 생산을 억제하기 위한 약제의 제조를 위한 본원에 기재된 항체의 용도를 고려한다.

또 다른 실시형태는 인간 CD40 항원을 발현하는 세포의 성장 및/또는 분화를 억제하기 위한 약제의 제조를 위한 본원에 기재된 항체의 사용을 고려한다.

또 다른 실시형태는 CD40 관련 질환이 있는 대상체의 치료를 위한 약제의 제조를 위한 본원에 기재된 항체의 용도를 고려하는데, 여기서 상기 약제 중의 항체 또는 항원 결합 단편의 CD40에 대한 결합은 CD40 관련 질환 세포의 성장 또는 분화를 억제한다.

상기 약제는 B 림프모세포, 췌장 세포, 폐 세포, 유방 세포, 난소 세포, 결장 세포, 전립선 세포, 피부 세포, 두경부 세포, 방광 세포, 뼈 세포 또는 신장 세포로부터 선택되는 CD40 관련 질환 세포의 치료에 사용하기 위해 제조될 수 있다.

상기 약제는 만성 림프구성 백혈병, 버키트 림프종, 다발성 골수종, T 세포 림프종, 비호지킨 림프종, 호지킨병, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 또는 카포시 육종의 치료에 사용하기 위해 제조될 수 있다.

또 다른 실시형태는 말초성 B 세포의 고갈을 유도하기 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 항체의 용도를 고려하는데, 여기서 상기 약제 중의 항체 또는 항원 결합 단편은 인간 세포 표면 CD40 항원에 특이적으로 결합하고, 상기 CD40 항원에 대한 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 결합은 상기 세포의 고갈을 유도한다.

상기 약제는 면역 질환이 있는 대상체의 치료에 사용하기 위해 제조될 수 있다.

상기 약제는 류머티스 관절염 또는 전신 홍반성 루푸스의 치료에 사용하기 위해 제조될 수 있다.

또 다른 실시형태는 대상체에서 류머티스 관절염의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 항체의 용도를 고려한다.

또 다른 실시형태는 대상체에서 전신 홍반성 루푸스 또는 루프스 신염의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서 본 발명의 항체의 용도를 고려한다.

상기 약제는 상기 대상체에서 B 세포 분화 및 항체 동형 전환의 억제에 사용하기 위해 제조될 수 있다.

상기 약제는 상기 대상체의 T 세포 및 대식세포에서 사이토카인과 케모카인 생성 및 부착 분자의 상향 조절의 억제에 사용하기 위해 제조될 수 있다.

상기 약제는 상기 대상체에서 수지상 세포의 활성화의 억제에 사용하기 위해 제조될 수 있다.

상기 약제는 상기 대상체에서 비면역 세포의 염증 유발성 사이토카인, 케모카인, 기질 금속단백질분해효소, 프로스타글란딘의 생성을 억제하고 부착 분자를 하향 조절하는데 사용하기 위해 제조될 수 있다.

특정 실시형태에서, 상기 약제는 메토트렉세이트 투여 및/또는 엔브렐/휴미라의 투여를 포함하는 요법과 조합하여 투여될 병용 약제로서 제조된다.

다른 실시형태에서, 상기 약제는 병용 약제로서 제조되며, 상기 약제는 본 발명의 항체를 포함하는 것 이외에 항-TNF 제제를 추가로 포함한다.

도 1은 간단한 용량 증량 설계를 나타낸 것이다. S-FU는 안전성 추적 관찰이다. ^*는 위약에 무작위배정된 2명의 대상체와 본 발명의 항체에 무작위배정된 8명의 대상체를 가리킨다. †는 코호트 4에서 S-FU가 더 길었다는 것을 의미한다 (42일이 아닌 56일).
도 2는 8일, 15일 및 22일에서의 본 발명의 항체의 투여전 농도 (Cpre) 및 29일에서의 저점 농도를 나타낸 것이다.
도 3a는 서로 다른 용량으로 치료한 CD40 수용체 점유율의 산술 평균 백분율을 나타낸 것이다.
도 3b는 서로 다른 용량에 의한 CD54 상향 조절의 억제율을 나타낸 것이다.

CD40 매개된 신호전달은 현재 다양한 표적 질환들에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이러한 질환들에서의 개입이 치료적으로 이로울 것임을 보여주는 다양한 임상전 데이터의 활용에도 불구하고, 자가면역 질환의 치료에 사용될 수 있는 길항작용성 항-CD40 항체가 필요한 실정이다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명은 CD40을 인식하는 인간화된 항체에 관한 것이다. 이러한 항체들은 미국 특허 8,591,900호 및 WO/2011/123489호 (각 문헌의 내용은 본원에 참조로 포함됨)에도 개시되어 있다. 특정 실시형태에서, 이러한 인간화된 항체들의 서열은 특정한 리더 마우스 항체의 서열들에 기반하여 동정되었다.

최근 몇 년간 치료가 발전하였지만, 류머티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 루푸스 신염과 같은 자가면역 질환에 대한 새로운 치료법이 여전히 필요한 실정이다. 세포 표면 수용체 CD40과 이의 리간드 CD40L (CD154)의 상호작용은, 체액성 및 세포성 면역의 조절과 이러한 자가면역 질환의 발병기전에서 중추적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서, CD40-CD40L 상호작용은 자가면역 질환의 조절을 위한 매력적인 표적이다.

CD40은 종양 괴사 인자 수용체 계열에 속하는 세포 표면 수용체로서, B 세포, 수지상 세포, 단핵구, 대식세포, 신장 세포 및 기타 비면역 세포에서 발현된다. CD40은 B 세포, 및 수지상 세포와 대식세포를 비롯한 기타 항원 제시 세포 (APC)를 활성화시켜 항원 유도형 후천성 면역성의 발달에 관여하는 주된 보조 자극 분자이지만, 이는 비면역 상주 세포의 활성화에도 관여한다. CD40L은 활성화된 T 세포 뿐만 아니라 활성화된 B 세포와 혈소판에 의해 주로 발현되는 종양 괴사 인자 상과계열의 구성원이다. CD40L에 대한 CD40의 결합은 E-셀렉틴 (CD62E), 혈관 세포 부착 분자-1 (CD106) 및 세포간 부착 분자-1 (CD54)의 상향 조절을 유도하여, 백혈구의 가장자리화(margination) 및 혈구 누출(diapedesis)을 증가시킨다.

상기 CD40-CD40L 상호작용은 최적의 APC-T 세포 활성화에 필요한 것으로 보인다. CD40-CD40L 경로는 T 세포 반응의 증강에 특히 중요한 것으로 생각되며, 여러가지 자가면역 질환에 관여한다. CD40 신호전달 경로의 차단은 T 헬퍼 1 (Th1) 세포 분화 및 면역 반응의 유지를 억제하는 것으로 나타났다. CD40과 CD40L의 발현 증가는 류머티스 관절염 환자의 활동성 질환과 관련이 있다. B 및 T 세포에서 CD40L 수준의 상승은 전신 홍반성 루푸스의 질환 활성과 관련이 있으며, 혈관 사이 세포 (mesangial cell)에서 신장 CD40 발현은 클래스 III 및 클래스 IV 루푸스 신염 환자에서 상향 조절된다.

CD40L에 대한 단일클론 항체에 대한 선행 임상 개발은, 아마도 FcγRIIa (CD32a) 혈소판 수용체를 활성화하는 항-CD40L 항체의 Fc 영역에 기인한, 혈소판의 활성화 및 응집으로 개시되었던 혈전색전증의 발병으로 인해 실패하였다. 최근의 연구들에 따르면, 기능성 Fc 영역이 결여된 항체들은 혈전색전증을 유발하지 않고, 혈소판 활성화에 실패하며, 약리학적 활성과 임상적 활성을 유지하는 것으로 나타났다.

한 실시형태에서, 본 발명의 항체는 CD40에 선택적으로 결합하여 CD40-CD40L 상호작용을 차단하는 인간화된 길항작용성 항-CD40 단일클론 항체로서; 이는 효능 활성이 없고 사이토카인 생성을 자극하지 못하도록 설계되었다. Fc 영역의 두 치환 돌연변이 (Leu234Ala 및 Leu235Ala)를 도입하여 Fc 매개형 항체 의존성 또는 보체 매개형 세포성 세포독성 및 혈소판 활성화를 방지하였다. 본 발명의 항체는, 인간 (EC90 = 6.85 ± 0.74 nM)과 사이노몰거스 원숭이 B 세포에서 강력하고 서로에 필적하는 결합 특성과, CD40L로 유도된 말초 혈액 단핵 세포 증식에 대한 효능 작용이 없는 강력한 억제를 나타내었다. 본 발명의 항체는, 혈소판에 결합되는 경우에 혈소판 활성화, 응집 또는 기능을 변화시키는 것으로는 보이지 않는다. 사이노몰거스 원숭이에 대한 전임상 평가에서, 26주간 본 발명의 항체를 최대 50 mg/kg의 다회분 용량으로, B 세포 수준의 가역적 감소, 림프 기관 배중심의 가역적 감소 및 혈전색전증 발병이나 관련 사이토카인 방출이 없는 우수한 전반적 건강상태가 입증되었다 (미공개 데이터). 이러한 평가에서 유해작용이 관찰되지 않는 수준은 최고 투여량인 50 mg/kg이었다 (미공개 데이터).

실시예 9에서 볼 수 있는 것처럼, 건강한 지원자들을 대상으로 한 단일 용량 상승 연구에서, 최대 120 mg 까지의 본 발명 항체의 정맥내 (IV) 및 피하 (SC) 단일 용량의 증가는 내약성이 좋았으며, CD40-CD40L 경로를 차단할 가능성이 높은 것으로 나타났다. 본 발명의 항체의 IV 및 SC 투여 후에는 모두, CD40 수용체 점유율 (RO)에서의 용량 연관 증가와 B 세포 활성화의 억제 (CD54 상향 조절의 억제에 의해 측정됨)가 관찰되었다.

정의

"CD40" 및 "CD40 표면 항원"이라는 용어들은, 정상 및 종양 B 세포의 표면 상에 발현되는 대략 48 kD의 당단백질을 지칭하는데, 이는 세포 증식 및 분화에 관여하는 신호에 대한 수용체로서 작용한다 (Ledbetter et al., 1987, J. Immunol. 138:788-785). CD40을 코딩하는 cDNA 분자는 버키트 림프종 세포주 라지(Raji)로부터 제조된 라이브러리로부터 분리된 바 있다 (Stamenkovic et al., 1989, EMBO J. 8:1403).

본원에서, CD40을 내재적으로 발현하는 세포는 CD40의 표면 발현을 특징으로 하는 임의의 세포인데, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 정상 및 종양 B 세포, 감입 세포, 기저 상피 세포, 암종 세포, 대식세포, 내피 세포, 여포성 수지상 세포, 편도선 세포 및 골수 유래의 형질 세포를 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 CD40 분자는 인간 CD40 분자이다.

본 발명의 항체는 인간 재조합 및 천연 CD40에 특이적으로 결합한다. 인간화된 단일클론 항체는, 1 nM 미만의 길항작용 활성 IC50을 갖는 인간 CD40에 특이적으로 결합하고 B 세포 증식에서 100 ㎍/㎖ 이하의 효능작용을 갖지 않으며, 상기 항체는 인간이 아닌 영장류에서의 생체내 반감기가 적어도 10일인 것을 추가의 특징으로 한다.

바람직하게는, 항체는 1 nM 미만의 EC50으로 CD40-Fc 접합체 중의 CD40에 특이적으로 결합하고, 2.5 nM 미만의 EC50으로 CD40 발현 세포 중의 CD40에 특이적으로 결합한다. 상기 항체의 길항작용 특성은, B 세포 또는 수지상 세포 길항작용 활성 IC50이 1 nM 미만인 것으로 정의된다. 추가로, 상기 항체는 다른 항-CD40 항체 (예컨대, 항-CD40 항체 4D11)에 비해 증가된 생체내 반감기를 갖는 우수한 약동학적 특성을 보유한다.

본원에서, CD40을 발현하는 세포는 CD40의 표면 발현을 특징으로 하는 임의의 세포인데, 예컨대 이에 제한되지는 않지만, 정상 및 종양 B 세포, 감입 세포, 기저 상피 세포, 암종 세포, 대식세포, 내피 세포, 여포성 수지상 세포, 편도선 세포 및 골수 유래의 형질 세포를 들 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 CD40 분자는 인간 CD40 분자이다.

본 발명의 항체는 특정 "CD40 항원 에피토프" 및 "CD40 에피토프"를 인식한다. 본원에서 이러한 용어들은 항-CD40 항체와 면역반응성을 가질 수 있는 분자 (예컨대, 펩타이드) 또는 분자의 단편을 가리키는데, 예를 들어, 경쇄 서열번호 26과 중쇄 서열번호 27, 28, 29 또는 30 중 어느 한 임의의 서열; 또는 경쇄 서열번호 31과 중쇄 서열번호 32, 33, 34 또는 35 중 어느 한 임의의 서열; 또는 경쇄 서열번호 36과 중쇄 서열번호 37, 38, 39 또는 40 중 어느 한 임의의 서열의 중쇄/경쇄 서열 조합을 갖는 임의의 항체에 의해 인식되는 CD40 항원 결정기를 포함한다. CD40 항원 에피토프는 단백질, 단백질 단편, 펩타이드 등에 포함될 수 있다. 에피토프는 대부분 통상적으로 단백질, 짧은 올리고펩타이드, 올리고펩타이드 모방체 (즉, CD40 항원의 항체 결합 특성을 모방하는 유기 화합물), 또는 이들의 조합체이다.

항체 또는 면역글로불린의 전반적인 구조에 대해서는 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 이러한 분자들은 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 이루어진, 통상 약 150,000 돌턴의 이종사량체성 당단백질이다. 각 경쇄는 하나의 이황화 결합에 의해 중쇄에 공유 결합하여 이종이량체를 형성하고, 상기 이종사량체 분자는 이종이량체의 2개의 동일한 중쇄 간에 이황화 공유 결합을 통해 형성된다. 경쇄 및 중쇄는 하나의 이황화 결합에 의해 연결되지만, 두 중쇄들 간의 이황화 결합의 수는 면역글로불린 동형에 따라 다르다. 또한, 중쇄와 경쇄는 각각 사슬내 일정한 간격을 둔 이황화 가교도 갖는다. 각 중쇄는 아미노 말단에 가변 도메인 (V_H)에 이어 3개 또는 4개의 불변 도메인 (C_H1, C_H2, C_H3 및 C_H4) 뿐만 아니라 C_H1과 C_H2 사이에 경첩 영역도 갖는다. 각 경쇄는 아미노 말단 가변 도메인 (V_L) 및 카복시 말단 불변 도메인 (C_L)의 2개의 도메인을 갖는다. V_L 도메인은 V_H 도메인과 비공유 결합하는 반면, C_L 도메인은 이황화 결합을 통해 C_H1 도메인에 통상 공유 결합한다. 특정한 아미노산 잔기들이 경쇄와 중쇄 가변 도메인 간에 계면을 형성하는 것으로 생각된다 (문헌 [Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186:651-663]).

가변 도메인 내 어떤 도메인들은 서로 다른 항체들 간에서 광범위하게 다른 특성, 즉, "초가변성"을 나타낸다. 이러한 초가변 도메인은, 각각 특정 항체의 특이적인 항원 결정기에 대한 결합 특이성에 직접적으로 관여하는 잔기들을 함유하고 있다. 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두에 있어서 초가변성은 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 초가변성 루프 (HVL)로 알려진 3개의 분절에 집중되어 있다. CDR은 문헌 [Kabat et al., 1991, In: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.]에서의 염기서열 비교에 의해 정의되는 한편, HVL은 문헌 [Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917]에 기재된 바와 같이 가변 도메인의 3차원 구조에 따라서 구조적으로 정의된다. 상기 두 방법들이 CDR의 동정에 있어서 약간 서로 다른 결과를 가져오는 경우에는, 구조적 정의가 우선한다. 카바트에 의해 정의된 바와 같이, 경쇄 가변 도메인에서 CDR-L1은 대략 24-34번의 잔기에 위치하고, CDR-L2는 대략 50-56번의 잔기에 위치하며, CDR-L3은 대략 89-97번의 잔기에 위치하는 한편; 중쇄 가변 도메인에서 CDR-H1은 대략 31-35번의 잔기에 위치하고, CDR-H2는 대략 50-65번의 잔기에 위치하며, CDR-H3은 대략 95-102번의 잔기에 위치한다. 따라서, 중쇄 및 경쇄의 CDR1, CDR2, CDR3은 주어진 항체에 대하여 고유한 기능적 특성들을 한정한다.

각각의 중쇄 및 경쇄 내에 존재하는 3개의 CDR은 가변적인 경향이 덜한 서열들을 함유하는 프레임워크 영역 (FR)에 의해 분리되어 있다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 아미노 말단에서 카복시 말단에 이르기까지, 상기 FR 및 CDR은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4의 순서로 배열된다. 대부분의 FR β-시트 입체구조는 각 사슬들 내에 해당 CDR들을 서로 인접하여 위치하도록 할 뿐만 아니라 다른 사슬의 CDR들에도 인접하여 위치하게 한다. 모든 CDR 잔기들이 반드시 항원 결합에 직접적으로 관여하는 것은 아니지만, 상기 생성된 입체구조는 항원 결합 부위에 일조한다 (문헌 [Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669] 참조).

FR 잔기 및 Ig 불변 도메인은 항원 결합에 직접적으로 관여하지는 않지만, 항원 결합에 기여하고/하거나 항체 효과기 기능을 매개한다. 일부 FR 잔기들은 적어도 하기의 3가지 방식: 에피토프에 직접 비공유 결합함으로써, 하나 이상의 CDR 잔기들과의 상호작용에 의해, 그리고 중쇄 및 경쇄 간의 계면에 영향을 줌으로써, 항원 결합에 큰 영향을 주는 것으로 생각된다. 불변 도메인은 항원 결합에 직접적으로 관여하지는 않지만, 다양한 Ig 효과기 기능, 예컨대 항체 의존성 세포독성 (ADCC), 보체 의존성 세포독성 (CDC) 및 항체 의존성 세포성 식균작용(ADCP)을 매개한다.

척추동물의 면역글로불린 경쇄는, 불변 도메인의 아미노산 서열을 기준으로 뚜렷이 구분되는 두 부류인 카파(κ) 및 람다 (λ)중 어느 하나로 지정된다. 이와는 대조적으로, 포유동물의 면역글로불린 중쇄는 불변 도메인의 서열에 따라 하기 5개의 주요 부류 중 하나로 지정된다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. IgG 및 IgA는 하위부류 (동형), 예컨대, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로 더 세분화된다. 서로 다른 부류의 면역글로불린에 해당하는 중쇄 불변 도메인들은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 부른다. 천연 면역글로불린 부류의 서브유닛 구조와 3차원 입체구조에 대해서는 익히 공지되어 있다.

"항체", "항-CD40 항체", "인간화된 항-CD40 항체" 및 "인간화된 항-CD40 항체 변이체"라는 용어들은 본원에서 광의의 의미로 사용하며, 특히 단일클론 항체 (전장 단일클론 항체 포함), 다중클론 항체, 다중특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체) 및 항체 단편, 예컨대 가변 도메인 및 목적하는 생체 활성, 예를 들어 CD40 결합을 나타내는 항체의 다른 부분들과 같은 항체 단편을 망라한다.

"단일클론 항체" (mAb)라는 용어는 실질적으로 균일한 항체들의 군집 중의 항체를 지칭하는데; 즉, 상기 군집 내의 각 항체들은 최소량으로 존재할 수 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단일클론 항체는 단일 항원 결정기인 "에피토프"에 대해 유도되는 고특이성 항체이다. 따라서, "단일클론"이라는 수식어는 동일한 에피토프에 대하여 유도되는 실질적으로 균일한 항체들의 군집을 의미하는 것으로, 어떤 특정한 방법에 의해 해당 항체를 제조하는 것이 필요한 것으로 이해되어서는 안된다. 단일클론 항체는, 당업계에 공지된 임의의 기법 또는 방법; 예컨대, 하이브리도마 방법 (문헌 [Kohler et al., 1975, Nature 256: 495]), 또는 당업계에 공지된 재조합 DNA 방법 (예컨대, 미국 특허 4,816,567호 참조), 또는 문헌 [Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-628] 및 [Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581-597]에 기술된 기법들을 사용하여, 파지 항체 라이브러리를 이용한 재조합적으로 제조된 단일클론의 분리 방법 등으로 제조될 수 있다.

키메라 항체는 한 종 (예컨대, 마우스와 같은 인간이 아닌 포유동물)의 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 다른 종 (예컨대, 인간) 항체의 중쇄 및 경쇄 불변 영역으로 이루어지며, 상기 제1 종 (예컨대, 마우스) 항체의 가변 영역을 코딩하는 DNA 서열을 상기 제2 종 (예컨대, 인간) 항체의 불변 영역에 대한 DNA 서열에 연결하여, 상기 연결된 서열들을 함유하는 발현 벡터를 사용하여 숙주를 형질전환시켜 키메라 항체를 생성할 수 있도록 하여 해당 키메라 항체를 수득할 수 있다. 다르게는, 상기 키메라 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 하나 이상의 영역 또는 도메인이, 또 다른 면역글로불린 부류 또는 동형 유래이거나 또는 공통 서열 또는 생식세포 계열의 서열 유래의 단일클론 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 그에 상동하거나 또는 그의 변이체인, 항체일 수도 있다. 키메라 항체는, 이의 항체 단편이 모항체의 목적하는 생체 활성, 예를 들어, 동일한 에피토프에 대한 결합을 나타내는 경우라면, 해당 항체의 단편도 포함할 수 있다 (예컨대, 미국 특허 4,816,567호 및 문헌 [Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855] 참조).

"항체 단편", "항-CD40 항체 단편", "인간화된 항-CD40 항체 단편 ", "인간화된 항-CD40 항체 단편 변이체"라는 용어들은, 가변 영역 또는 기능적 역량, 예를 들어, 특이적 CD40 에피토프 결합이 유지되는 전장 항-CD40 항체의 일부를 지칭한다. 항체 단편의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fv, scFv 및 scFv-Fc 단편, 이원항체(diabody), 선형 항체, 단쇄 항체, 미니항체, 항체 단편들로부터 형성된 이원항체, 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

전장 항체를 파파인 또는 펩신과 같은 효소들로 처리하여 유용한 항체 단편을 생성할 수도 있다. 파파인 소화를 이용하여, 각각 단일 항원 결합 부위를 보유하는 "Fab 단편"으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편 및 나머지 "Fc 단편"을 생성한다. 또한, 상기 Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 C_H1 도메인도 함유한다. 펩신 처리는, 2개의 항원 결합 부위를 보유하면서도 항원과 가교결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편을 생성한다.

Fab' 단편은 C_H1 도메인의 C-말단에 항체 경첩 영역 유래의 하나 이상의 시스테인을 비롯한 추가의 잔기들이 존재한다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. F(ab')₂ 항체 단편은 경첩 영역의 시스테인 잔기들에 의해 연결된 Fab' 단편들의 쌍이다. 항체 단편들의 다른 화학적 커플링에 대해서도 공지되어 있다.

"Fv" 단편은 기밀한 비공유 결합으로 된 1개의 중쇄와 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어진 완전한 항원 인지 및 결합 부위를 함유한다. 이러한 구성으로, 각 가변 도메인의 3개의 CDR들이 상호작용하여 V_H-V_L 이량체 표면의 항원 결합 부위를 한정하게 된다. 전체적으로, 상기 6개 CDR이 해당 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다.

"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 도메인들이 단일 폴리펩타이드 사슬 중에 존재하는 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함하는 단쇄 Fv 변이체이다. 상기 단쇄 Fv는 항원을 인지하여 결합할 수 있다. 상기 scFv 폴리펩타이드는 선택적으로 V_H와 V_L 도메인 사이에 위치한 폴리펩타이드 링커를 함유하여 scFv에 의한 항원 결합을 위해 목적하는 3차원 구조의 형성을 용이하게 할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Pluckthun, 1994, In The Pharmacology of monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315] 참조).

알려진 기타 항체 단편들로는 탠덤 Fd 분절(V_H-C_H1-V_H-C_H1)의 쌍을 포함하여 항원 결합 영역들의 쌍을 형성하는 것들을 포함한다. 이러한 “선형 항체”들은, 예를 들어, 문헌 [Zapata et al. 1995, Protein Eng. 8(10):1057-1062]에 기재된 바와 같은 이중특이적 또는 단일특이적일 수 있다.

인간화된 항체 또는 인간화된 항체 단편은, 사전에 결정한 항원에 결합할 수 있으며 대체로 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 FR 및 대체로 비인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 CDR을 포함하는, 면역글로불린 아미노산 서열 변이체 또는 이의 단편을 포함하는 특정한 유형의 키메라 항체이다. "유입(import)" 서열로 지칭되는 경우가 많은 상기 비인간 아미노산 서열은 일반적으로 "유입" 항체 도메인, 특히 가변 도메인으로부터 취한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 적어도, 인간 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인의 FR 사이에 삽입된 비인간 항체의 CDR 또는 HVL을 포함한다. 본 발명은 인간 생식세포 계열 서열의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인들의 FR 사이에 삽입된, 표 3과 4에 나타낸 쥐과의 단일클론 항체 유래의 CDR을 함유하는 인간화된 특정 항-CD40 항체에 대하여 기술하고 있다. 특정 쥐과의 FR 잔기들이 인간화된 항체의 기능에 중요할 수 있으므로, 특정한 인간 생식세포 계열 서열의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 잔기들을 그에 상응하는 쥐과 서열의 잔기들과 동일하게 되도록 변형시키는 것이다.

또 다른 양태에서, 인간화된 항-CD40 항체는 적어도 하나, 일반적으로 2개의 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')₂, Fabc 및 Fv 단편들에 함유된 바와 같은) 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함하는데, 여기서, CDR들은 모두 또는 실질적으로 모두 비인간 면역글로불린의 CDR에 해당하며, 구체적으로 본원에서는, CDR들은 모두 하기 본원의 표 1 내지 4에서 상세히 설명하는 바와 같은 쥐과의 서열이고, FR들은 모두 또는 실질적으로 모두 인간 면역글로불린 공통 서열 또는 생식세포 계열의 서열의 FR들이다. 또 다른 양태에서, 인간화된 항-CD40 항체는 면역글로불린 Fc 영역의 적어도 일부, 일반적으로 인간 면역글로불린의 것들도 포함한다. 통상적으로, 항체는 적어도 중쇄의 가변 도메인 뿐만 아니라 경쇄도 모두 함유할 것이다. 또한, 항체는 적절히 중쇄의 C_H1, 경첩, C_H2, C_H3, 및/또는 C_H4 영역 중 하나 이상을 포함할 수도 있다.

인간화된 항-CD40 항체는 임의 부류의 면역글로불린, 예컨대 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE, 및 이의 임의의 동형, 예컨대 IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ 및 IgA₂로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 불변 도메인은 보체 결합성 불변 도메인일 수 있는데, 이 경우 인간화된 항체는 세포독성 활성을 나타내어야 하고, 동형은 통상 IgG₁인 것이 바람직하다. 이러한 세포독성 활성이 바람직하지 않는 경우에는, 불변 도메인은 다른 동형, 예컨대 IgG₂의 것일 수 있다. 대안적인 인간화 항-CD40 항체는 하나 이상의 면역글로불린 부류 또는 동형 유래의 서열을 포함할 수 있으며, 목적하는 효과기 기능을 최적하기 위해 특정한 불변 도메인들을 선택하는 일은 당업자라면 누구나 쉽게 할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 IgG₁ 항체, 보다 구체적으로는 효과기 기능이 녹아웃된 IgG₁ 항체를 제공한다.

인간화된 항-CD40 항체의 FR 및 CDR, 또는 HVL은 모체 서열과 정확하게 상응될 필요는 없다. 예를 들어, 상기 유입 CDR, 또는 HVL, 또는 공통 또는 생식세포 계열의 FR 서열 내의 하나 이상의 잔기들을 치환, 삽입 또는 결실에 의해 변형 (예컨대, 돌연변이 유발)시켜, 생성된 아미노산 잔기가 모체 서열의 상응하는 위치에서도 본래 잔기와 더 이상 동일하지 않도록 하되, 해당 항체가 CD40에 결합하는 기능은 유지하게끔 할 수 있다. 이러한 변형은 일반적으로 광범위하게 하지는 않을 것이며, 보존적 변형이 될 것이다. 통상, 상기 인간화된 항체 잔기의 적어도 75%, 보다 통상적으로는 적어도 90%, 대부분의 경우 95% 초과, 또는 98% 초과, 또는 99% 초과가 모체 공통 또는 생식세포 계열의 FR 및 유입 CDR 서열의 것들에 상응하게 될 것이다.

중쇄와 경쇄 가변 영역 간의 계면 ("V_L-V_H 계면")에 영향을 미치는 면역글로불린 잔기들은 서로에 대하여 두 사슬의 근접성 또는 배향성에 영향을 미치는 것들이다. 사슬간 상호작용에 관여할 수 있는 특정 잔기들로는, V_L 잔기 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96 및 98번 및 V_H 잔기 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100 및 103번 {문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987)]}에 기술된 넘버링 체계를 사용함)을 포함한다. 또한, 미국 특허 6,407,213호는 VL 잔기 43 및 85번과 VH 잔기 43 및 60번과 같은 잔기들도 이러한 상호작용에 관여할 수 있는지에 대해 논의한다. 이러한 잔기들은 인간 IgG에 대해서만 제공되는 것이나, 다양한 종들에게도 사용될 수 있다. 사슬간 상호작용에 관여할 것으로 충분히 예상되는 중요한 항체 잔기들을 공통 서열로의 치환을 위해 선택한다.

"공통 서열" 및 "공통 항체"라는 용어들은, 임의의 특정 부류, 동형 또는 서브유닛 구조의 모든 면역글로불린, 예컨대 인간 면역글로불린 가변 도메인 내 각각의 위치에서 가장 빈번하게 나타나는 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열을 가리킨다. 상기 공통 서열은 특정한 종 또는 다양한 종들의 면역글로불린을 기반으로 할 수 있다. "공통" 서열, 구조 또는 항체는, 특정 실시양태에 기술된 바와 같은 인간 공통 서열을 포함하며, 임의의 특정 부류, 동형 또는 서브유닛 구조의 모든 인간 면역글로불린 내 각각의 위치에서 가장 빈번하게 나타나는 아미노산 잔기들을 포함하는 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 이해한다. 따라서, 상기 공통 서열은, 각 위치에 하나 이상의 공지된 면역글로불린에는 존재하지만 임의의 한 면역글로불린의 전체 아미노산 서열과 정확히 동일하지는 않을 수 있는 아미노산을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 가변 영역 공통 서열은 자연적으로 생성되는 임의의 항체 또는 면역글로불린 또는 이의 변이체로부터 수득하지 않는다. 이에 대해서는, 문헌 [Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., and variants thereof]을 참조한다. 중쇄 및 경쇄 공통 서열의 FR, 및 이들의 변이체는 인간화된 항-CD40 항체의 제조에 유용한 서열을 제공한다. 이에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 6,037,454호 및 6,054,297호를 참조한다.

인간 생식세포 계열의 서열은 인간 대상군에서 자연적으로 발견된다. 이러한 생식세포 계열의 유전자들의 조합은 항체의 다양성을 만들어 낸다. 항체의 경쇄에 대한 생식세포 계열의 항체 서열은 보존된 인간 생식세포 계열의 카파 또는 람다 v-유전자 및 j-유전자들에서 유래한다. 이와 유사하게, 중쇄 서열은 생식세포 계열의 v-, d- 및 j-유전자들에서 유래한다 (문헌 [LeFranc, M-P, and LeFranc, G, “The Immunoglobulin Facts Book” Academic Press, 2001]).

본원에 사용된 "변이체", "항-CD40 변이체", "인간화된 항-CD40 변이체" 또는 "인간화된 변이 항-CD40"은 각각, 적어도 서열번호 1 내지 4 중 임의의 한 서열로부터 유래된 쥐과의 중쇄 가변 CDR 또는 서열번호 5 내지 서열번호 8 중 임의의 한 서열에 나타낸 쥐과의 단일클론 항체로부터 유래된 쥐과의 경쇄 CDR 서열, 및 인간 공통서열로부터 유래된 FR 서열을 함유하는 인간화된 항-CD40 항체를 가리킨다. 변이체는, 해당 아미노산 변화가 CD40에 대한 항체의 결합을 실질적으로 손상시키지 않는 한, 경쇄 또는 중쇄 가변 도메인 중 하나 또는 모두에서 하나 이상의 아미노산 변화를 갖는 것들을 포함한다. 본원에서 제조된 예시적인 인간화 항체로는 항체 A, 항체 B 및 항체 C로 지정된 항체들이 포함되며, 이들의 다양한 중쇄 및 경쇄 서열은 서열번호 26 내지 서열번호 40에 나타나 있다.

"분리된" 항체란 그의 천연 환경의 성분으로부터 동정되어 분리 및/또는 회수된 것을 가리킨다. 항체의 천연 환경의 오염원들로는, 항체의 진단적 또는 치료적 사용을 방해할 수 있는 물질들로서, 그 예로는 효소, 호르몬 또는 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 들 수 있다. 한 양태에서, 항체는 적어도 해당 항체의 95 분리 중량% 초과로 정제될 것이다.

분리된 항체에는, 해당 항체의 천연 환경 중의 적어도 하나의 성분이 존재하지 않기 때문에, 해당 항체가 생성되는 재조합 세포 내의 동일반응계 항체도 포함된다. 그러나, 통상적으로, 분리된 항체는 재조합 세포 물질을 제거하는 적어도 하나의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

"항체 성능"이라는 용어는, 항원에 대한 항체 인식이나 생체 내에서 항체의 효능에 기여하는 요인을 지칭한다. 항체의 아미노산 서열 변화, 예컨대 폴딩은 항체 특성에 영향을 줄 수 있으며, 물리적 요인들, 예컨대 항원에 대한 항체의 초기 결합율 (k_a), 항원에 대한 항체의 해리 상수(k_d), 항원에 대한 항체의 친화도 상수 (Kd), 항체의 입체구조, 단백질 안정성 및 항체의 반감기에도 영향을 줄 수 있다.

본원에서 사용되는 "에피토프 태깅된"이라는 용어는 "에피토프 태그"에 융합된 항-CD40 항체를 지칭한다. "에피토프 태그"는 항체 생산용 에피토프를 제공하기에 충분한 수의 아미노산을 갖는 폴리펩타이드이지만, 인간화된 항-CD40 항체의 목적한 활성을 방해하지 않도록 설계된다. 상기 에피토프 태그는 일반적으로 충분히 고유의 특이성을 가져, 해당 에피토프 태그에 대해 유도된 항체가 다른 에피토프들과는 사실상 교차 반응하지 않게 된다. 적절한 태그 폴리펩타이드는 일반적으로 적어도 6개의 아미노산 잔기를 포함하고, 통상 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기 또는 약 9 내지 30개의 잔기를 포함한다. 에피토프 태그 및 해당 에피토프에 결합하는 항체의 예로는 인플루엔자 HA 태그 폴리펩타이드 및 이의 항체 12CA5 (Field et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165); c-myc 태그 및 이의 항체 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 (Evan et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616); 및 단순 헤르페스 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 이의 항체 (Paborsky et al. 1990, Protein Engineering 3(6): 547-553)를 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 에피토프 태그는 "구제 (salvage) 수용체 결합 에피토프"이다. 본원에 사용된 "구제 수용체 결합 에피토프"라는 용어는, IgG 분자 (예컨대, IgG₁, IgG₂, IgG₃ 또는 IgG₄)의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 역할을 하는 IgG 분자의 Fc 영역에 대한 에피토프를 지칭한다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 항체는 세포 독성제에 접합시킬 수 있다. 세포 독성제란 세포의 기능을 억제 또는 방해하고/하거나 세포를 파괴하는 물질이다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예컨대, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ 및 Re¹⁸⁶), 화학요법제, 및 세균, 진균류, 식물 또는 동물 유래의 효소 활성 독소 및 이의 단편들을 포함하고자 한 것이다. 이러한 세포 독성제는 표준 절차를 사용하여 본 발명의 인간화된 항체에 커플링시킬 수 있으며, 예를 들어 항체 요법으로 치료하도록 지시된 환자를 치료하는데 사용될 수도 있다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화합물이다. 본 발명의 치료용 항체와 접합시킬 수 있는 화학요법제들은 무수히 많다. 이러한 화학요법제의 예로는 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이클로스포스파미드; 알킬 설포네이트, 예컨대 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 예컨대 알트레트아민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민; 아세토게닌 (특히, 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체인 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히, 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴, 오리스타틴 (유사체인 모노메틸-오리스타틴 E 및 모노메틸-오리스타틴 F 포함); 듀오카르마이신 (합성 유사체인 KW-2189 및 CBI-TMI 포함); 엘레우테로빈(eleutherobin); 판크라티스타틴; 사코딕티인(sarcodictyin); 스폰기스타틴(spongistatin); 질소 머스타드, 예컨대, 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로르에타민 옥사이드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴; 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예컨대, 에네다이인(enediyne) 항생제 [예를 들면, 칼리케아미신, 특히 칼리케아미신 감마II 및 칼리케아미신 파이II {예컨대, 문헌 (Angew. Chem. Intl. Ed. Engl., 33:183-186) 참조}]; 다이네마이신 A를 비롯한 다이네마이신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스퍼아미신; 및 네오카지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질인 에네다이인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우쓰라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 독소루비신 (Adriamycin™) (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마셀로마이신, 미토마이신, 예컨대, 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜버시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자유리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시유리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록스유리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예컨대, 아미노글루테티미드, 미토탄, 트리로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코사이드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜친; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 하이드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산, 2-에틸하이드라지드; 프로카바진; PSK®; 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노사이드("Ara-C"); 사이클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예컨대 파클리탁셀 [TAXOL®, 브리스톨-메이어스 스퀴브 온콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 미국 뉴저지주 프린스톤 소재] 및 도세탁셀 [TAXOTERE®, 론-포울렌크 로레르(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니 소재]; 클로람부실; 겜시타빈 (GEMZAR®); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포사이드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈 (NAVELBINE®); 노반트론; 테니포사이드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레티노산; 카페시타빈; 및 전술한 임의의 물질의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다. 또한, 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하도록 작용하는 항호르몬제, 예컨대 항에스트로겐제 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (Nolvadex™ 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-하이드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜 (Fareston™); 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소인 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메게스트롤 아세테이트 (Megace™), 엑세메스탄, 포르메스탄, 파드로졸, 보로졸 (Rivisor™), 레트로졸 (Femara™) 및 아나스트로졸 (Arimidex™); 및 항안드로겐제, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤라이드 및 고세렐린; 및 전술한 임의의 물질의 약제학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체들도 상기 정의에 포함된다. 상기 제제들 중 임의의 하나 이상의 제제를 본 발명의 인간화된 항체에 접합시켜 다양한 질환의 치료에 유용한 치료제를 제공할 수 있다.

또한, 항체를 전구약물에도 접합시킬 수 있다. "전구약물"은 모체 약물에 비해 종양 세포에 대한 세포독성이 덜하여 효소적으로 활성화 또는 전환시켜 보다 활성을 갖는 형태로 될 수 있는 약제학적 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태이다. 이에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Wilman, 1986, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", In Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast] 및 문헌 [Stella et al., 1985, "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, In: "Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press]을 참조한다. 보다 활성을 갖는 무세포독성 약물로 전환될 수 있는 유용한 전구약물로는, 이에 제한되지는 않지만, 포스페이트 함유 전구약물, 티오포스페이트 함유 전구약물, 설페이트 함유 전구약물, 펩타이드 함유 전구약물, D-아미노산-변형된 전구약물, 글리코실화된 전구약물, β-락탐 함유 전구약물, 임의 치환되는 페녹시아세트아미드 함유 전구약물, 임의 치환되는 페닐아세트아미드 함유 전구약물, 5-플루오로사이토신 및 기타 5-플루오로유리딘 전구약물을 포함한다. 전구약물 형태로 유도될 수 있는 세포독성 약물의 예로는, 이에 제한되지는 않지만, 상술한 화학요법제들을 포함한다.

진단 및 치료적 모니터링 목적을 위해, 본 발명의 항체를 표지, 즉 표지 단독 또는 표지와 추가의 제2 제제 (전구약물, 화학요법제 등)에 접합시킬 수도 있다. 상기 제2 제제와는 구별되는 표지는, 검출가능한 화합물 또는 조성물인 제제를 가리키며, 본 발명의 인간화된 항체에 직접 또는 간접적으로 접합시킬 수 있다. 상기 표지는 그 자체로 검출될 수 있거나 (예컨대, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소적 표지인 경우에는, 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변형을 촉진할 수 있다. 표지된 인간화 항 CD40 항체는 시험관내 및 생체내 진단을 비롯한 다양한 응용 분야에 제조 및 사용할 수 있다.

본 발명의 항체는 그의 생체내 전달에 영향을 주기 위해 리포솜 제제의 일부로서 제형화될 수도 있다. "리포좀"은 다양한 유형의 지질, 인지질 및/또는 계면활성제로 구성된 작은 소포이다. 리포좀은, 임의로 하나 이상의 약제학적 활성제 및/또는 표지에 커플링시키거나 이들과 함께 조합하여, 본원에 개시된 인간화된 항-CD40 항체와 같은 화합물 또는 제제를 포유동물에게 전달하는데 유용하다. 리포좀의 성분들은 일반적으로 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 이중층 형식으로 배열된다.

본 발명의 특정 양태는 본 발명의 인간화된 항체의 하나 이상의 도메인을 코딩하는 분리된 핵산들에 관한 것이다. "분리된" 핵산 분자란, 항체 핵산의 천연 공급원에 통상적으로 관여한 적어도 하나 오염원 핵산 분자로부터 동정하여 분리시킨 핵산 분자를 말한다. 분리된 핵산 분자는 자연 세포에 존재하는 핵산 분자와는 구별된다.

본 발명의 다양한 양태에서, 인간화된 항체의 하나 이상의 도메인들은 재조합적으로 발현될 것이다. 이러한 재조합 발현은 하나 이상의 조절 서열, 즉 특정한 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 사용할 수 있다. 원핵생물 세포에 사용하기에 적절한 조절 서열로는, 예를 들어 프로모터, 오퍼레이터 및 리보좀 결합 부위 서열을 포함한다. 진핵생물 조절 서열로는, 이에 제한되지는 않지만, 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 포함한다. 이러한 조절 서열은 원핵 및 진핵생물 숙주 세포에서 인간화된 항-CD40 항체의 발현 및 생산에 이용될 수 있다.

하나의 핵산 서열이 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 놓이는 경우, 이를 "작동가능하게 연결"되었다고 한다. 예를 들어, 핵산 전구서열 또는 분비성 리더 서열이 폴리펩타이드의 분비에 관여하는 전구단백질로서 발현되는 경우 해당 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되어 있다고 하고; 프로모터 또는 인핸서가 서열의 전사에 영향을 주는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다고 하며; 또는 리보좀 결합 부위를 해독 촉진을 위해 위치시키는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 있다고 한다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"이라는 말은, 연결되어 있는 DNA 서열이 연속적이라는 것을 의미하며, 분비성 리더 서열의 경우에는, 연속적이고 판독 프레임에 존재함을 의미한다. 그러나, 인핸서들은 선택적으로 연속적일 수 있다. 연결은 적당한 제한 부위에서 결찰에 의해 달성될 수 있다. 이러한 부위들이 존재하지 않는 경우에는, 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터 또는 링커를 사용할 수 있다.

본원에 사용된 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"이라는 표현들은 서로 교환하여 사용할 수 있으며, 이러한 모든 명칭들은 이의 후대 개체를 포함한다. 따라서, "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"는 1차 대상체 세포 및 형질전환의 횟수와는 상관없이 그로부터 유래된 배양물도 포함한다.

치료 목적용의 "포유동물"이라는 용어는, 인간, 가축 및 농장 동물과 동물원, 스포츠, 또는 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소 등을 비롯한 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 가리킨다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이다.

본원에 사용된 "질환"은 본원에 기재된 인간화된 항-CD40 항체를 이용하는 치료로부터 유익할 수 있는 임의의 병태이다. 여기에는 포유동물이 문제의 장애에 대해 잘 걸리도록 하는 상기 병리학적 상태를 비롯한 만성 및 급성 장애 또는 질환이 포함된다. 본원에서 치료될 장애들에 대한 비제한적인 예로는 암, 혈액암, 양성 및 악성 종양, 백혈병과 림프암 및 염증성, 혈관형성, 자가면역 및 면역학적 장애를 포함한다.

"암" 및 "암성"이라는 용어들은 일반적으로 조절되지 않는 세포 증식을 특징으로 하는 포유동물에서의 병리학적 상태를 지칭하거나 기술하는 말이다. 암의 예로는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만 이들에 제한되지는 않는다.

본원에서 "CD40 관련 장애" 또는 CD40 관련 질환"이라는 용어는, CD40을 발현하는 세포의 변형 또는 제거가 나타나는 병태를 가리킨다. 이들은 비정상적 증식을 나타내는 CD40 발현 세포, 또는 암성 또는 악성 증식과 관련된 CD40 발현 세포를 포함한다. CD40 항원의 비정상적 발현을 나타내는 암의 보다 구체적인 예로는 B 세포 림프아구종 세포, 버키트 림프종, 다발성 골수종, T 세포 림프종, 카포시 육종, 골육종, 상피 및 내피 종양, 췌장암, 폐암, 유방암, 난소암, 결장암, 전립선암, 두경부암, 피부암(흑색종), 방광암 및 신장암을 포함한다. 상기 장애로는, 이에 제한되지는 않지만, 백혈병, B 세포 림프종 및 비호지킨 림프종을 포함하는 림프종, 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증; 골육종, 유잉 육종, 악성 흑색종과 같은 육종, 난소 선암종을 포함하는 선암종, 카포시 육종/카포시 종양 및 편평 세포 암종을 포함한다.

CD40 관련 질환에는 자가면역성 질환 및 염증성 질환과 같은 면역계 질환 및 장애도 포함된다. 이러한 질환으로는, 이에 제한되지는 않지만, 류머티스 관절염 (RA), 전신 홍반성 루푸스 (SLE), 경피증, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 건선, 염증성 장질환 (예컨대, 궤양성 대장염 및 크론병), 폐렴, 천식 및 특발성 혈소판감소성 자반증 (ITP)을 포함한다.

본원에 사용되는 "~의 성장을 정지시킨다" 또는 "성장 억제성"이라는 말은, 세포, 특히 CD40 항원을 발현하는 신생물성 세포 유형의 성장 또는 증식을 억제한다는 말이다. 따라서, 성장 억제는, 예를 들어 S기에서 신생물성 세포의 비율(%)을 크게 감소시킨다.

"정맥내 주입"이라는 용어는 약 15분 초과, 일반적으로는 약 30 내지 90분의 시간 동안 동물 또는 인간 환자의 정맥에 해당 제제를 주입하는 것을 가리킨다.

"정맥내 볼루스(일시주사)" 또는 "정맥내 급속주입(push)"이라는 용어는, 신체가 약 15분 이하, 일반적으로는 5분 이하 이내에 약물을 수용하도록 동물 또는 인간의 정맥에 약물을 투여하는 것을 지칭한다.

"피하 투여"라는 용어는, 약물 저장소로부터의 비교적 느리고 지속적인 전달에 의해, 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에, 바람직하게는 피부와 하부 조직 사이의 공동 내에 제제를 주입하는 것을 가리킨다. 피부를 꼬집거나 하부 조직으로부터 들어서 위로 잡아 당기면 공동이 생길 수 있다.

"피하 주입"이라는 용어는, 이에 제한되지는 않지만, 30분 이하 또는 90분 이하의 시간 동안 약물 저장소로부터의 비교적 느리고 지속적인 전달에 의해, 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에, 바람직하게는 피부와 하부 조직 사이의 공동 내에 약물을 주입하는 것을 지칭한다. 임의로, 상기 주입은 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에 이식된 약물 전달 펌프의 피하 이식에 의해 이루어질 수 있으며, 이 경우 상기 펌프는 30분, 90분과 같은 예정된 시간 또는 치료 처방계획의 기간에 걸쳐있는 시간 동안 사전에 결정한 양의 약물을 전달한다.

"피하 볼루스(일시주사)"라는 용어는 동물 또는 인간 환자의 피부 아래에 약물을 투여하는 것을 지칭하며, 이 경우 볼루스 약물 전달은 약 15분 미만; 또 다른 양태에서는 5분 미만, 또 다른 양태에서는 60초 미만에 이루어진다. 또 다른 양태에서, 투여는 피부와 하부 조직 사이의 공동 내이며, 이 경우 상기 공동은 피부를 꼬집거나 하부 조직으로부터 들어서 위로 잡아 당기면 생성될 수 있다.

"치료적 유효량"이라는 용어는, 치료 중인 질환의 증상들 중 하나 이상의 증상을 경감시키거나 완화시키는 활성제의 양을 가리키는데 사용된다. 따라서, 상기 양은 환자에 있어서 유익한 결과를 나타내는 양, 예를 들어, 성장 정지 효과를 나타내거나 세포의 고갈을 유발하는 양이다. 한 양태에서, 상기 치료적 유효량은 아폽토시스 활성을 갖거나 세포 사멸을 유도할 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 치료적 유효량은, 예를 들어 질환의 진행을 늦추는데 효과적인 것으로 나타난 목표 혈청 농도를 가리킨다. 효능은 치료될 질환에 따라 통상적인 방식으로 측정할 수 있다. 예를 들어, CD40을 발현하는 세포를 특징으로 하는 신생물성 질환 또는 장애에서, 효능은 질환 진행 시간을 평가하거나 반응 속도를 측정함으로써 측정될 수 있다.

본원에 사용되는 "치료" 및 "요법" 등의 용어들은, 하나 이상의 증상의 완화 또는 경감, 질환 또는 질병 진행의 퇴행, 지연 또는 중단을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 임의의 임상적으로 바람직하거나 유익한 효과를 유도하는 해당 질환 또는 질병에 대한 치료적인 조치 뿐만 아니라 예방적 또는 대증적 조치를 포함하고자 한다. 따라서, 예를 들어, 치료라는 용어는 질병 또는 장애의 증상의 개시 전 또는 개시 후에 제제를 투여함으로써 상기 질병 또는 장애의 하나 이상의 징후를 예방하거나 제거하는 것을 포함한다. 또 다른 예로서, 상기 용어는 질병에 대한 임상 소견 후 제제를 투여하여 해당 질병의 증상을 방지하는 것을 포함한다. 또한, 발병 후 및 임상적 증상이 나타난 후 제제의 투여는, 치료가 해당 질병의 개선을 가져오는지의 여부와는 관계없이, 상기 제제의 투여가 조직 손상의 정도 또는 전이의 양 또는 정도와 같은 질병 또는 장애의 임상적 매개변수에 영향을 미치는 경우 본원에 사용되는 "치료" 또는 "요법"을 포함한다. 또한, 본 발명의 조성물을 단독으로 또는 다른 치료제와 병용하여 사용하였을 때, 인간화된 CD40 항체 조성물을 사용하지 않는 경우의 증상에 비해 치료되는 질환의 적어도 하나의 증상을 완화 또는 개선하기만 하면, 그 결과는 해당 질환의 모든 증상들이 완화되었는지 여부와 상관없이 기저 질환에 대한 효과적인 치료로서 간주되어야 할 것이다.

"포장 삽지"라는 용어는, 치료 의약품의 사용에 관한 적응증, 사용법, 투여, 금기 사항 및/또는 경고사항에 대한 정보를 포함하는, 치료 의약품의 상용 패키지에 관례적으로 포함되는 설명서를 가리키는데 사용된다.

항체

인간화된 항-CD40 항체, 및 하나 이상의 본 발명의 인간화된 항-CD40 항체를 포함하는 조성물 및 제품을 기술 및 개시한다. 본 발명의 항체는 미국 특허 8,591,900호 또는 WO/2011/123489호에도 개시되어 있으며, 상기 각 문헌의 전문은 본원에 참조로 포함된다. 또한, 인간화된 항-CD40 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 결합제도 기술된다. 인간화된 항-CD40 항체 및 결합제는 세포 성장을 정지시키거나, CD40을 발현하는 세포의 고갈을 유발하거나, 다른 한편으로는 표적 세포에 대한 세포독성 효과 또는 세포증식억제 효과를 유도하거나 유발할 수도 있다. 인간화된 항-CD40 항체 및 결합제는 CD40 표면 항원을 발현하는 세포의 증식을 특징으로 하는 다양한 질환 또는 장애의 치료에 사용될 수 있다. 인간화된 항-CD40 항체 및 CD40 결합제는 각각 적어도, CD40 에피토프를 특이적으로 인식하는 부분 (즉, 항원 결합 단편)을 포함한다.

초기 특성 분석에서, CD40 결합 특성화 분석을 기준으로 쥐과 항체를 선별하였다.

상기 초기 연구로부터, 하기 표 1에 나타낸 중쇄 가변 영역 및 표 2에 나타낸 경쇄 가변 영역을 갖는 쥐과 항체들을 선별하였다:

인간화된 가변 영역을 생성하기 위해서 프레임워크 상동성, CDR 구조, 보존된 표준(canonical) 잔기, 보존된 계면 패킹 잔기 및 기타 매개변수들을 기반으로 하여 각 마우스 리더에 대한 인간 프레임워크 서열들을 선별하였다.

선택된 다양한 쥐과 항체들의 쥐과 중쇄 및 경쇄 CDR을 각각 표 3과 표 4에 나타내었다:

상기 열거한 H-CDR1은 초티아(Chothia) 넘버링 체계 (Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948)를 이용하는 서열을 사용한다. 상기 서열에 대한 카바트 넘버링은 굵은 이탤릭체 글자로 나타내고, IMGT 넘버링은 CDR1 및 CDR2에 있어서 상기 표에서 밑줄친 잔기로 나타낸다. 2H11, 10F2 및 19B10 각각에 대한 H-CDR3의 서열은 TTSYYVGTYGY(서열번호 77)이고, 20E2에 대한 H-CDR3의 서열은 ARQDGYRYAMDY(서열번호 78)이다.

다시, 표 4에서도 굵은 이탤릭체 글자로 나타낸 서열에 대한 카바트 넘버링과 함께 초티아 넘버링 체계를 사용하고, IMGT 넘버링은 밑줄친 글자로 나타낸다.

IgG로의 전환을 위해, 키메라 모체 Fab에 비해 우수하거나 이와 동등한 결합을 나타내는 Fab를 선택하였다. 20E2 계열 유래의 클론들은 2개의 서로 다른 IgG 포맷으로 전환되었다: a) Fc/경첩 영역에 2개의 돌연변이, 즉 반분자 형성을 감소시키는 Ser228Pro와 FcγR 결합을 더 감소시키는 Leu235Glu를 갖는, IgG4DM (Double Mutant, 이중 돌연변이체); b) Fc 영역에 2개의 돌연변이, 즉 FcγR과 같은 효과기 기능과 보체 결합을 감소시키는 Leu234Ala 및 Leu235Ala을 갖는, IgG1 KO (효과기 기능의 녹-아웃, Knock-Out). 두 IgG 포맷은 모두 문헌에 기재되어 있다. 실시예 1은 세 후보물질의 인간화를 보다 상세하게 기재하고 있다. 상기 인간화의 결과, 하기에 나타낸 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 인간화된 항체 서열이 수득된다:

일부 실시형태에서, 항원 결합 단편은, 예를 들어 CD40 표면 항원에 결합하여 세포의 증식을 차단하거나 다르게는 세포의 성장을 정지시키거나, 또는 세포의 고갈, 사멸 또는 다르게는 세포의 결실을 유발할 수도 있다. 예를 들어, T 및 B 세포의 악성종양에서 항종양 효과 (예를 들어, 세포 결실 또는 아폽토시스의 존재 또는 부재 하의 성장 정지)는 흔히 악성종양 세포가 정상적인 림프구의 활성화를 유도하는 자극에 노출되는 경우에 발생한다. 상기 활성화 유도된 성장 정지는 항원 수용체 또는 보조자극 수용체를 통한 신호로 관찰되었다 (문헌참조: 예를 들면, [Ashwell et al., 1987, Science 237:61]; [Bridges et al., 1987, J. Immunol. 139:4242]; [Page and Defranco, 1988, J. Immunol. 140:3717]; 및 [Beckwith et al., 1990, J. Natl. Cancer Inst. 82:501]). 항체 또는 가용성 리간드에 의한 특이적 결합의 결과로서의 CD40 자극은, B 세포 림프종 성장을 억제한다 (문헌참조: 예를 들면, [Funakoshi et al., 1994, Blood 83:2787-2794]). 이러한 방식으로 악성종양 세포 성장을 억제하고 CD40 표면 항원에 대해 유도되는 제제들이 적절한 제제의 예가 된다.

CD40 특이적 제제로는 CD40 (예를 들어, 인간 CD40 또는 이의 변이체)에 결합하는 인간화된 항-CD40 항체의 항원 결합 단편을 포함한다. 상기 CD40 특이적 제제 및 항체는 임의로 세포독성 제제 또는 화학치료제와 접합되거나 이에 융합될 수도 있다. 상기 인간화된 항체가 CD40 표면 항원에 결합하여 CD40 발현 세포 유형의 고갈을 유발하는 양태에서, 결합은 일반적으로 생체내에서 CD40 표면 항원 세포에 대한 귀소성(homing)을 특징으로 한다. 적절한 결합제는 충분한 친화도 및/또는 결합활성으로 CD40 항원에 결합하여 CD40 특이적 제제가 해당 항원을 발현하는 세포를 특이적으로 표적화하는 치료제로서 유용하다.

일부 양태에서, 인간화된 항체는 CD40에 대한 CD40 리간드의 결합을 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80%, 또는 적어도 90%, 또는 적어도 95% 감소시킨다.

일부 실시형태에서, 중쇄 및 경쇄 가변 도메인과 같은 항원 결합 단편을 포함하는 인간화된 항-CD40 항체는, 상기 본원에 기재된 바와 같은 CDR 항체 A (중쇄 서열 = 서열번호 27; 서열번호 28; 서열번호 29; 또는 서열번호 30; 경쇄 서열 = 서열번호 26), 항체 B (중쇄 서열 = 서열번호 32; 서열번호 33; 서열번호 34; 또는 서열번호 35; 경쇄 서열 = 서열번호 31) 및 항체 C (중쇄 서열 = 서열번호 37; 서열번호 38; 서열번호 39; 또는 서열번호 40; 경쇄 서열 = 서열번호 36)로부터 유도된 잔기의 아미노산 서열 및 인간 면역글로불린의 프레임워크 영역으로부터 유도된 아미노산 잔기를 포함한다. 상기 인간화된 항-CD40 항체는 선택적으로 공통 또는 생식계열 프레임워크 영역에서 특정 아미노산 치환을 포함한다.

이러한 프레임워크 위치에서의 특정 아미노산 잔기의 치환은, 하기 실시예에 나타낸 것과 같이, 인간 생식세포 프레임워크 영역에 CDR 또는 HVL을 "직접 교환(direct swap)"하여 형성된 인간화된 항체에서 입증된 것에 비해 결합 친화도 및/또는 안정성을 비롯한 다양한 측면에서 항체 성능을 개선할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 4의 중쇄(V_H) 서열 및 서열번호 5 내지 서열번호 8의 경쇄(V_L) 서열을 갖는 다른 단일클론 항체도 기술한다 (상기 표 1과 2 참조). 이러한 쥐과 항체의 CDR 서열은 표 3과 4에 나타나 있는데, 상기 CDR들을 인간 공통 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 FR에 도입하면 본 발명의 유용한 인간화된 항체를 생성시킬 것이다.

일부 특정 실시형태에서, 본원에 개시된 인간화된 항-CD40 항체는 적어도, 상기 표 1 내지 4에 나타낸 쥐과의 단일클론 항체의 CDR 또는 HVL 및 인간 생식계열 중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 FR을 포함하는 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 예시적인 실시형태에서, 본원에서 제조된 인간화된 항체는 항체 A, 항체 B 및 항체 C이고, 이들의 다양한 중쇄 및 경쇄 서열은 서열번호 26 내지 서열번호 40에 나타나 있다.

특정 실시형태에서, 서열번호 26의 경쇄 서열과 조합된 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 또는 서열번호 30 중 어느 하나의 중쇄 서열을 갖는 항체가 고려된다. 대안적인 항체로는 서열번호 31의 경쇄 서열과 조합된 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 또는 서열번호 35의 중쇄 서열을 갖는 것들을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 36의 경쇄 서열과 조합된 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39 또는 서열번호 40의 중쇄 서열을 갖는 인간화된 항체가 제공된다.

이러한 서열들의 CDR을 표 3과 4에 나타낸다. 특정 실시형태에서, 이러한 예시적인 면역글로불린들 간에 변경된 CDR 영역 (즉, 예를 들어 항체 A의 1개 또는 2개의 CDR를 항체 C의 유사한 CDR로 변경)을 갖는 키메라 항체가 유용한 항체를 생성할 수 있는 것으로 생각된다.

특정 실시형태에서, 상기 인간화된 항-CD40 항체는 항체 단편이다. 상기에서는 다양한 항체 단편들에 대하여 전반적으로 논의하였고, 이제 항체 단편의 생산을 위해서 개발된 기술들에 대하여 살펴보고자 한다. 단편은 온전한 항체들의 단백질 가수분해 소화를 통해 유도할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117]; 및 [Brennan et al., 1985, Science 229:81] 참조). 다르게는, 상기 단편은 재조합 숙주 세포에서 직접 생산될 수도 있다. 예를 들어, Fab'-SH 단편을 이. 콜라이로부터 직접 회수하여 화학적으로 커플링하여 F(ab')₂ 단편을 형성시킬 수 있다. (예컨대, 문헌 [Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167] 참조). 또 다른 접근법으로, F(ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리할 수도 있다. 항체 단편의 제조를 위한 다른 기법들에 대해서는 당업계의 숙련자들이라면 명백하게 알 수 있을 것이다.

특정 실시형태로는 서열번호 26의 경쇄 서열과 조합된 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29 또는 서열번호 30 중 어느 하나의 중쇄 서열을 포함하는 인간화된 항-CD40 항체의 F(ab')₂ 단편을 포함한다. 대안적인 항체로는 서열번호 31의 경쇄 서열과 조합된 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34 또는 서열번호 35의 중쇄 서열을 갖는 것들을 포함한다. 추가의 실시형태에서, 서열번호 36의 경쇄 서열과 조합된 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39 또는 서열번호 40의 중쇄 서열을 갖는 항체가 제공된다. 상기 실시형태들은 상기 F(ab')₂를 포함하는 온전한 항체를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 상기 항체 또는 항체 단편은 효과기 기능을 매개하는 불변 영역을 포함한다. 상기 불변 영역은 CD40을 발현하는 표적 세포에 대하여 항체 의존성 세포성 세포독성 (ADCC), 항제 의존성 세포성 식균작용 (ADCP) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC) 반응을 제공할 수 있다. 상기 효과기 도메인(들)은, 예를 들어, Ig 분자의 Fc 영역이다. 일반적으로, CD40 결합제는 세포독성 백혈구 [예컨대, 자연 살해 (NK) 세포, 식세포작용 세포 (예컨대, 대식세포) 및/또는 혈청 보체 성분]를 동원 및/또는 활성화시킨다.

항체의 효과기 도메인은 임의의 적절한 척추동물 종 및 동형에서 유도될 수 있다. 서로 다른 동물 종들의 동형들은 효과기 기능을 매개하는 능력에서도 서로 다르다. 예를 들어, CDC 및 ADCC/ADCP를 매개하는 인간 면역글로불린의 능력은 일반적으로 각각 대략 IgM

IgG₁

IgG₃ > lgG₂ > lgG₄ 및 IgG₁

IgG₃ > IgG₂/IgM/IgG₄의 순이다. 쥐과의 면역글로불린은 일반적으로 각각 쥐과의 IgM

IgG₃>>IgG_2b>>IgG_2a>>IgG₁ 및 IgG_2b>IgG_2a>IgG₁>>lgG₃의 순으로 CDC 및 ADCC/ADCP를 매개한다. 또 다른 예에서, 쥐과의 IgG_2a는 ADCC를 매개하는 반면, 쥐과의 IgG_2a와 IgM은 모두 CDC를 매개한다.

항체 변형

상기 인간화된 항-CD40 항체 및 제제는 인간화된 항-CD40 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 암을 치료하는데 있어서 항체의 효과를 증진시키기 위해, 효과기 기능과 관련하여 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 그러한 변형의 한 예로서, Fc 영역으로 시스테인 잔기(들)를 도입하여 이 영역에서 사슬간 이황화 결합을 형성하는 것을 들 수 있다. 이렇게 제조된 동종이량체 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체 매개형 세포 사멸 및/또는 항체 의존성 세포성 세포독성(ADCC)을 나타낼 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Caron et al., 1992, J. Exp Med. 176:1191-1195]; 및 [Shopes, 1992, J. Immunol. 148:2918-2922]를 참조한다. 증진된 항종양 활성을 갖는 동종이량체 항체는 문헌 [Wolff et al., 1993, Cancer Research 53: 2560-2565]에 기재된 바와 같이 이종이기능성 가교 링커를 사용하여 제조될 수도 있다. 다르게는, 이중 Fc 영역을 함유하도록 항체를 조작하여 해당 항체의 보체 용해성 및 ADCC 능력을 증강시킬 수도 있다. 이에 대해서는, 문헌 [Stevenson et al., 1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230]을 참조한다.

ADCC를 지원하는 능력이 개선된 항체는 이들의 Fc 영역의 당화 패턴을 변형시켜서 제조되어 왔었다. 이것은 C_H2 도메인내 아스파라긴 잔기인 N297에서 항체 당화가 ADCC의 전제 조건인 IgG와 Fcγ간의 상호작용에 관여하기에 가능한 것이다. 숙주 세포주는 2등분 N-아세틸글루코사민의 증가 또는 푸코스의 감소와 같이 당화가 변형된 항체를 발현하도록 조작되었다. 푸코스 감소는 2등분 N-아세틸글루코사민의 존재를 증가시킨다기 보다는 ADCC 활성을 크게 증진시킨다. 더욱이, 푸코스 함량이 적은 항체에 의한 ADCC의 증진은 FcγRIIIa V/F 다형성과는 무관하다.

항체 Fc 영역의 아미노산 서열의 변형은 ADCC를 증강시키기 위한 당화 조작에 대한 대안이다. Fcγ 수용체에 대한 인간 IgG₁ 상의 결합 부위가 광범위한 돌연변이 분석에 의해 결정된 바 있다. 이로써 FcγRIIIa에 대한 결합 친화도를 증가시키고 시험관내 ADCC를 증강시키는 Fc 돌연변이를 갖는 인간화된 IgG₁ 항체를 제조할 수 있다. 추가로, 결합 특성들의 여러가지 서로 다른 순열을 이용하여, 예를 들어, 다른 FcγR 수용체에 대한 결합이 변함이 없거나 감소된 특정 FcγR 수용체에 대한 결합이 개선된 Fc 변이체들을 수득하였다.

또 다른 양태로는 화학치료제, 독소 (예를 들어, 세균, 진균류, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편) 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)와 같은 세포독성제에 접합된 인간화된 항체 또는 이의 단편을 포함하는 면역접합체를 포함한다.

이러한 면역접합체의 제조에 유용한 화학치료제들에 대해서는 상술하였다. 유용한 면역접합체를 제조하는데 사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소 및 이의 단편으로는, 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 차란티아(Momordica charantia) 억제제, 쿠르신(curcin), 크로틴(crotin), 사파오나리아 오피시날리스(Sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 트리코테세네스 등을 포함한다. 다양한 방사성 핵종들이 방사성접합된 인간화된 항-CD40 항체의 제조에 유용하다. 이의 예로는 ²¹²Bi, ¹³¹I, ¹³¹In, ⁹⁰Y 및 ¹⁸⁶Re를 포함한다.

상기 인간화된 항-CD40 항체와 세포독성 또는 화학치료제의 접합체는, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이기능성 유도체(예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데하이드(예를 들어, 글루타르알데하이드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)과 같은 다양한 이기능성 단백질 커플링제를 사용하여 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., 1987, Science 238:1098]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성 뉴클레오타이드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트제이다. 접합체는 절단가능한 링커를 사용하여 제조될 수도 있다.

또 다른 실시형태에서, 상기 항체는 종양 사전표적화에 사용하기 위한 "수용체" (예를 들어, 스트렙타비딘)에 접합될 수 있다. 이 과정에서는, 상기 항체-수용체 접합체를 환자에게 투여하고, 이어서 정화제를 사용하여 순환계로부터 미결합된 접합체를 제거한 후, 수용체(예를 들어, 아비딘)에 선택적으로 결합하는 "리간드"를 투여하게 되는데, 상기 리간드가 세포독성제(예를 들어, 방사성 핵종)에 접합된다.

본원에 개시된 상기 인간화된 항-CD40 항체는 면역리포좀으로서 제형화할 수도 있다. 항체 함유 리포좀은 문헌 [Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688]; [Hwang et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030]; 및 미국 특허 4,485,045호와 4,544,545호에 기재된 바와 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 제조한다. 증가된 순환 시간을 갖는 리포좀은, 예를 들어 미국 특허 5,013,556호에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 리포좀을 한정된 공극 크기의 필터를 통해 압출시켜 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 생성한다. 본원에 개시된 항체의 Fab' 단편은, 이황화 상호교환 반응을 통해 문헌 [Martin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:286-288]에 기재된 바와 같이 리포좀에 접합시킬 수 있다. 화학치료제 (예를 들어, 독소루비신)은 임의로 상기 리포좀 내에 포함된다. 예를 들면, 문헌 [Gabizon et al., 1989, J. National Cancer Inst. 81 (19):1484]을 참조한다.

또한, 본원에 기술되어 개시된 항체들은 ADEPT (항체로 유도된 효소 프로드럭 요법)에 사용될 수도 있는데, 이 경우에는 상기 항체를 프로드럭 (예를 들어, 펩티딜 화학치료제)을 활성 항암 약물로 전환시키는 프로드럭 활성화 효소에 접합시켜서이용한다. 이에 관해서는, 예를 들면 WO 81/01145호, WO 88/07378호 및 미국 특허 4,975,278호를 참조한다. ADEPT에 유용한 면역접합체의 효소 성분은 이를 보다 활성인 세포독성 형태로 전환시키는 방식으로 프로드럭에 작용할 수 있는 효소이다. ADEPT에 유용한 특정 효소들로는, 이에 제한되지는 않지만, 포스페이트-함유 프로드럭을 유리된 약물로 전환시키기 위한 알칼리성 포스파타제; 설페이트-함유 프로드럭을 유리된 약물로 전환시키기 위한 아릴설파타제; 비독성 5-플루오로시토신을 항암 약물인 5-플루오로우라실로 전환시키기 위한 시토신 데아미나제; 펩타이드-함유 프로드럭을 유리된 약물로 전환시키기 위한 프로테아제, 예를 들어, 세라티아 프로테아제, 써모라이신, 서브틸리신, 카복시펩티다제 및 카뎁신 (예를 들어, 카뎁신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 프로드럭을 전환시키기 위한 D-알라닐카복시펩티다제; 당화 프로드럭을 유리된 약물로 전환시키기 위한 β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제와 같은 탄수화물-절단 효소; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키기 위한 β-락타마제; 및 이들의 아민 질소에서 각각 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 유도체화된 약물을 유리된 약물로 전환시키기 위한, 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제와 같은 페니실린 아미다제를 포함한다. 다르게는, 효소 활성을 갖는 항체 ("항체효소(Abzyme)")는 프로드럭을 유리된 활성 약물로 전환시키는데 사용될 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Massey, 1987, Nature 328: 457-458] 참조). 항체-항체효소 접합체는, 종양 세포군으로 항체효소를 전달하기 위해 공지된 방법, 예를 들어 상기 효소를 상기 논의한 인간화된 항-CD40 항체/이종이기능성 가교결합 시약에 공유결합시킴에 의해 제조될 수 있다. 다르게는, 적어도 상술한 바와 같은 효소의 기능성 활성 부분에 결합된 본원에 개시된 항체의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은 재조합 DNA 기술을 이용하여 작제할 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608] 참조).

특정 실시형태에서, 예를 들어 종양 침투를 증가시키기 위해, 온전한 항체보다는 인간화된 항-CD40 항체 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 항체 단편의 혈청 반감기를 증가시키기 위해 상기 항체 단편을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 예를 들어, 구제 수용체 결합 에피토프를 항체 단편으로 도입하여 달성할 수 있다. 하나의 방법에서, 항체 단편의 적당한 영역을 변형 (예를 들어, 돌연변이)시킬 수 있거나, 또는 상기 에피토프를 펩타이드 태그에 혼입시킬 수 있고, 이어서 이를 예를 들어, DNA 또는 펩타이드 합성에 의해 양쪽 말단 중 하나 또는 중간에서 항체 단편과 융합시킨다 (예를 들어, WO 96/32478호 참조).

다른 실시형태에서, 인간화된 항-CD40 항체의 공유적 변형도 포함된다. 공유적 변형에는 시스테이닐 잔기, 히스티딜 잔기, 라이시닐 및 아미노-말단 잔기, 아르기닐 잔기, 티로실 잔기, 카복실 측쇄기 (아스파틸 또는 글루타밀), 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기, 또는 세릴 또는 트레오닐 잔기의 변형이 포함된다. 다른 유형의 공유적 변형은 글리코시드를 항체에 화학적 또는 효소적으로 커플링시키는 단계를 수반한다. 상기 변형은 경우에 따라 항체의 화학적 합성 또는 효소적 또는 화학적 절단에 의해 제조될 수 있다. 다른 유형의 항체의 공유적 변형은, 항체의 표적화된 아미노산 잔기를, 선택된 측쇄나 아미노- 또는 카복시-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시켜서 해당 분자로 도입될 수 있다.

항체 상에 존재하는 임의의 탄수화물 모이어티의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다. 화학적 탈당화는 문헌 [Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52] 및 [Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131]에 기재되어 있다. 항체 상의 탄수화물 모이어티의 효소적 절단은 문헌 [Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol 138:350]에 기재된 바와 같이 다양한 내인성 및 외인성 글리코시다제를 사용하여 수행할 수 있다.

다른 유형의 유용한 공유적 변형은, 미국 특허 4,640,835호, 미국 특허 4,496,689호, 미국 특허 4,301,144호, 미국 특허 4,670,417호, 미국 특허 4,791,192호 및 미국 특허 4,179,337호 중 하나 이상에 제시된 방식으로, 항체를 다양한 비단백질성 중합체, 예를 들어, 폴리에텔린 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌 중 하나에 연결시키는 단계를 포함한다.

인간화 및 아미노산 서열 변이체

항-CD40 항체의 아미노산 서열 변이체는 항-CD40 항체 DNA에 적당한 뉴클레오타이드 변화를 도입하거나, 또는 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 상기 변이체는, 예를 들어 본원 실시예의 항-CD40 항체의 아미노산 서열내 잔기로부터의 결실 및/또는 상기 잔기내로의 삽입 및/또는 상기 잔기들의 치환을 포함한다. 상기 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합으로 최종 작제물을 제조하되, 단, 상기 최종 작제물이 목적하는 특성을 갖도록 한다. 상기 아미노산 변화는 당화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같이, 인간화되거나 변이된 항-CD40 항체의 해독후 과정을 변경시킬 수도 있다.

돌연변이 유발에 바람직한 위치인 항-CD40 항체의 특정 잔기 또는 영역들의 동정에 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 바와 같이 소위 "알라닌 스캐닝 돌연변이 유발"로 불리운다. 여기에서는, 잔기 또는 표적 잔기들의 군을 동정하여 (예를 들어, arg, asp, his, lys 및 glu와 같은 하전된 잔기), 중성 또는 음전하 아미노산 (일반적으로 알라닌)으로 치환시켜 CD40 항원과 상기 아미노산의 상호작용에 영향을 준다. 이후, 상기 치환에 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치들을, 치환 부위에 또는 치환 부위에 대해 추가의 변이체 또는 다른 변이체를 도입하여 개량한다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위는 사전에 결정하는 반면에, 돌연변이 자체의 성질에 대해서 사전에 결정할 필요는 없다. 예를 들어, 소정의 부위에서 돌연변이의 수행능을 분석하기 위해, 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이 유발법을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하여 발현된 항-CD40 항체 변이체들을 목적 활성에 대해 스크리닝한다.

아미노산 서열 삽입은, 길이 범위가 하나의 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩타이드에 이르는 아미노- 및/또는 카복실-말단 융합 뿐만 아니라, 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입도 포함한다. 말단 삽입의 예로는 에피토프 태그에 융합된 항-CD40 항체를 포함한다. 항-CD40 항체 분자의 다른 삽입형 변이체로는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 또는 폴리펩타이드의 항-CD40 항체의 N- 또는 C-말단에 대한 융합을 포함한다.

또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이러한 변이체는 제거된 항-CD40 항체 분자에서 하나 이상의 아미노산 잔기 및 그 위치에 삽입된 상이한 잔기를 갖는다. 치환형 돌연변이 유발을 위해 가장 관심대상인 부위는 초가변 영역을 포함하지만, FR 변형도 고려된다. 보존적 치환은 "바람직한 치환"이라는 표제 하에 표 5에 나타내었다. 상기 치환이 생물학적 활성을 변화시키는 경우라면, "예시적 치환"으로 나타내거나, 또는 아미노산 부류를 참조하여 하기에 추가로 기술하는 바와 같이 보다 실질적인 변화를 도입하여 생성물들을 스크리닝할 수 있다.

단백질 화학에서, 항체의 생물학적 특성은 (a) 치환 영역에서 예를 들어, 시트 또는 나선 입체구조로서 폴리펩타이드 골격의 구조, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 부피크기를 유지시키는 것에 대한 항체의 효과가 상당히 달라지는 치환을 선택함에 의해서 수행될 수 있는 것으로 일반적으로 용인되고 있다. 천연 발생하는 잔기들은 통상적인 측쇄 특성에 따라 하기의 군으로 세분한다:

(1) 소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gin, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비보존적 치환은 상기 부류들 중 하나의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 교환하는 단계를 수반할 것이다.

인간화되거나 변이된 항-CD40 항체의 적당한 입체구조를 유지시키는데 관여하지 않는 임의의 시스테인 잔기도, 일반적으로 세린으로 치환되어 해당 분자의 산화적 안정성을 개선하거나, 비정상적인 가교결합을 차단하거나, 또는 세포독성 또는 세포억제성 화합물에 대한 확립된 접합점을 제공할 수 있다. 그와는 반대로, 시스테인 결합(들)은 항체에 첨가되어 이의 안정성을 개선할 수 있다 (특히, 상기 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).

치환적 변이체의 한 유형은 모체 항체 (예를 들어, 인간화된 항체 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환시키는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가의 개발을 위해 선택된, 생성된 변이체(들)는 이들이 제조된 모체 항체에 비해 생물학적 특성이 개선될 것이다. 상기 치환적 변이체를 제조하는 간편한 방법은 파지 디스플레이를 사용하는 친화도 성숙화 기법이다. 간략히 설명하면, 수개의 초가변 영역 부위 (예를 들어, 6개 또는 7개 부위)를 돌연변이시켜 각 부위에서 가능한 모든 아미노산 치환을 수행한다. 그렇게 생성된 항체 변이체들은, 각각의 사상 파지 입자 내에 패키징된 M13의 유전자 III 생성물에 대한 융합물로서 상기 각 입자로부터 1가 형태로 디스플레이 된다. 이어서, 상기 파지 디스플레이된 변이체들을 이들의 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형을 위한 후보 초가변 영역 부위를 동정하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발을 수행하여 항원 결합에 크게 기여하는 초가변 영역 잔기들을 동정할 수도 있다. 대안적으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 상기 항체와 인간 CD40간의 접촉점을 동정하는 것이 유익할 수도 있다. 상기 접촉 잔기들과 그에 이웃하는 잔기들은 본원에서 숙고된 기술에 따른 치환에 대한 후보물질이다. 상기 변이체가 제조되면, 변이체들의 패널을 본원에 기재된 바와 같은 스크리닝을 거쳐, 하나 이상의 관련 검사분석에서 우수한 특성을 갖는 항체를 추가의 개발을 위해 선택할 수 있다.

항체의 아미노산 변이체의 또 다른 유형은 항체의 본래 당화 패턴을 변형시킨다. "변형"이란 항체에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 제거하고/하거나, 항체내 존재하지 않는 하나 이상의 당화 부위를 첨가하는 것을 의미한다.

일부 실시형태에서, 당화 부위를 첨가하기 위해 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 필요할 수도 있다. 항체의 당화는 일반적으로 N-연결되거나 O-연결된다. N-연결이라는 것은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 잔기의 측쇄로 부착시키는 것을 가리킨다. 트리펩타이드 서열인 아스파라긴-X-세린과 아스파라긴-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 모이어티를 아스파라긴 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩타이드내 상기 트리펩타이드 서열 중 어느 하나의 존재는 잠재적인 당화 부위를 생성한다. O-연결된 당화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중 하나를 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 가리키지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신도 사용될 수 있다. 따라서, 소정의 단백질, 예를 들어 항체를 당화시키기 위해서는, 단백질의 아미노산 서열을 조작하여 (N-연결된 당화 부위를 위한) 하나 이상의 상술한 트리펩타이드 서열을 함유하도록 만든다. 상기 변형은 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 (O-연결된 당화 부위를 위해) 본래의 항체의 서열에 부가하거나, 또는 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수 있다.

항-CD40 항체의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조한다. 이러한 방법으로는, 이에 제한되지는 않지만, (천연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우) 천연 공급원으로부터의 분리, 또는 초기 제조된 변이체 또는 비변이체 형태의 항-CD40 항체에 경우에는, 올리고뉴클레오타이드 매개형 (또는 부위 특이적) 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 및 카세트 돌연변이 유발에 의한 제조를 포함한다.

폴리뉴클레오타이드, 벡터, 숙주 세포, 및 재조합 방법

다른 실시형태로는 인간화된 항-CD40 항체를 코딩하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 및 상기 인간화된 항체의 제조를 위한 재조합 기술을 포함한다. 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드는 예를 들어, 전장 단일클론 항체, Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편, 이원항체, 선형 항체, 단일쇄 항체 분자, 및 항체 단편으로부터 제도된 다중특이적 항체를 포함하는 임의의 목적하는 형태의 항-CD40 항체를 코딩할 수 있다.

일부 실시형태는 서열번호 1 내지 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 또는 서열번호 40 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태는 서열번호 26, 서열번호 31 또는 서열번호 36의 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

한 양태에서, 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)은 각각 서열번호 27 및 서열번호 26; 각각 서열번호 28 및 서열번호 26; 각각 서열번호 29 및 서열번호 26; 각각 서열번호 30 및 서열번호 26; 각각 서열번호 32 및 서열번호 31; 각각 서열번호 33 및 서열번호 31; 각각 서열번호 34 및 서열번호 31; 각각 서열번호 35 및 서열번호 31; 각각 서열번호 37 및 서열번호 36; 각각 서열번호 38 및 서열번호36; 각각 서열번호 39 및 서열번호 36; 각각 서열번호 40 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편을 코딩한다.

인간화된 항-CD40 항체 또는 이의 단편 또는 쇄를 코딩하는 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드(들)는, 당업계에 공지된 바와 같은 하나 이상의 조절 또는 제어 서열과 융합될 수 있고, 당업계에 공지된 바와 같은 적합한 발현 벡터 또는 숙주 세포에 함유될 수도 있다. 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 각각의 폴리뉴클레오타이드 분자는, 인간 불변 도메인과 같은 불변 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 독립적으로 융합될 수 있어, 온전한 항체가 제조될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 부분은 함께 융합되어 단쇄 항체의 제조를 위한 주형을 제공할 수 있다.

재조합 제조의 경우, 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위해 복제가능한 벡터 내로 삽입한다. 재조합 항체를 발현하기 위해 다수의 적절한 벡터를 이용할 수 있다. 상기 벡터 성분은 일반적으로 하기들 중 하나 이상을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 원점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 성분, 프로모터 및 전사 종결 서열.

상기 인간화된 항-CD40 항체는 융합 폴리펩타이드로서도 제조될 수 있는데, 이 경우 상기 항체는 신호 서열과 같은 이종성 폴리펩타이드, 또는 성숙한 단백질 또는 폴리펩타이드의 아미노 말단에 특이적 절단 부위를 갖는 다른 폴리펩타이드와 융합된다. 상기 선택된 이종성 신호 서열은 통상적으로 숙주 세포에 의해 인식되어 처리되는 (즉, 신호 펩티다제에 의해 절단됨) 것이다. 인간화된 항-CD40 항체 신호 서열을 인식하여 처리하지 않는 원핵성 숙주 세포의 경우에는, 상기 신호 서열을 원핵세포 신호 서열로 치환할 수 있다. 상기 신호 서열은 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, 지질단백질, 열-안정성 장독소 II 리더 등일 수 있다. 효모 분비의 경우, 천연 신호 서열은 예를 들어, 효모 인버타제 알파-인자 (사카로마이세스(Saccharomyces) 및 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) α-인자 리더를 포함함), 산 포스파타제, 씨. 알비칸스(C. albicans) 글루코아밀라제, 또는 WO90/13646에 기재된 신호로부터 수득된 리더 서열로 치환될 수 있다. 포유동물 세포에서, 포유동물 신호 서열 뿐만 아니라 바이러스 분비 리더, 예를 들어, 단순 포진 gD 신호가 사용될 수 있다. 이러한 전구체 영역에 대한 DNA는 판독 프레임 내에서 인간화된 항-CD40 항체를 코딩하는 DNA에 연결된다.

발현 및 클로닝 벡터는, 해당 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제될 수 있도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 일반적으로, 클로닝 벡터에서, 이러한 서열은 해당 벡터가 숙주 염색체 DNA와는 독립적으로 복제될 수 있도록 하는 서열로서, 복제 원점 또는 자발적 복제 서열을 포함한다. 상기 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322 유래의 복제 원점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2-υ 플라스미드 원점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 원점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 및 BPV)은 포유동물 세포에서 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 원점 성분은 포유동물 발현 벡터에는 필요치 않다 (상기 SV40 원점은 일반적으로 초기 프로모터를 함유하기 때문에 사용될 수 있다).

발현 및 클로닝 벡터는 발현의 확인을 용이하게 하는 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자를 함유할 수 있다. 통상적인 선별가능한 마커 유전자는, 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하거나, 또는 다르게는 보충적 영양요구성이 결핍되거나, 또는 다른 대안에서 복합 배지에는 존재하지 않는 특정 영양분을 공급하는 단백질을 코딩하는데, 예를 들어, 바실리의 경우 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자를 들 수 있다.

선별 계획의 한 예는 숙주 세포의 성장을 정지시키는 약물을 사용하는 것이다. 이종성 유전자로 성공적으로 형질전환된 세포들은 내약성을 부여하는 단백질을 생성하므로 선별 과정에서 생존한다. 상기 주요 선별의 예로는 약물인 네오마이신, 마이코페놀산 및 하이그로마이신을 사용한다. 포유동물 세포에 통상적인 선별 마커로는, 인간화된 항-CD40 항체를 코딩하는 핵산을 흡수하기 위해 경쟁하는 세포들의 동정을 가능하게 하는 것들로서, 예를 들어, DHFR (디하이드로폴레이트 리덕타제), 티미딘 키나제, 메탈로티오네인-I 및 -II (예를 들어, 영장류 메탈로티오네인 유전자), 아데노신 데아미나제, 오르니틴 데카복실라제 등이 있다. DHFR의 경쟁 길항제인 메토트렉세이트(Mtx)를 함유하는 배양 배지에서 상기 형질전환체 모두를 배양하여, DHFR 선별 유전자로 형질전환된 세포를 먼저 동정한다. 야생형 DHFR이 사용되는 경우, 적당한 숙주 세포는 DHFR 활성 (예를 들어, DG44)이 결핍된 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주이다.

다르게는, 항-CD40 항체, 야생형 DHFR 단백질, 및 다른 선별 마커, 예를 들어, 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제(APH)를 코딩하는 DNA 서열로 형질전환되거나 동시 형질전환된 숙주 세포 (특히, 내인성 DHFR을 함유하는 야생형 숙주)를, 아미노글리코시딕 항생제, 예컨대 카나마이신, 네오마이신 또는 G418과 같은 선별 마커에 대한 선별 제제를 함유하는 배지내 세포 성장에 의해 선별할 수 있다. 이에 대해서는, 예를 들어 미국 특허 4,965,199호를 참조한다.

재조합 생산이 숙주 세포로서 효모 세포에서 수행되는 경우, 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 TRP1 유전자 (Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39)를 선별 마커로서 사용할 수 있다. 상기 TRP1 유전자는 트립토판 중에서 성장하는 능력이 결핍된 효모의 돌연변이 균주, 예를 들어, ATCC 44076호 또는 PEP4-1에 대한 선별 마커를 제공한다 (Jones, 1977, Genetics 85:12). 이어서, 효모 숙주 세포 유전체에서 trp1 병소의 존재는 트립토판 부재 하의 성장에 의한 형질전환을 검출하기에 효과적인 환경을 제공한다. 이와 유사하게, Leu2p 결핍된 효모 균주, 예를 들어, ATCC 20,622호 및 38,626호는 LEU2 유전자를 함유하는 공지된 플라스미드에 의해 보충된다.

추가로, 1.6 ㎛의 환형 플라스미드 pKD1로부터 유도된 벡터는 클루이베로마이세스 효모의 형질전환을 위해 사용될 수 있다. 다르게는, 재조합 소 키모신의 대규모 생산을 위한 발현 시스템은 케이 락티스(K. lactis)에 대해 보고되었다 (Van den Berg, 1990, Bio/Technology 8:135). 클루이베로마이세스의 산업형 균주에 의한 성숙한 재조합 인간 혈청 알부민의 분비를 위해 안정한 다수 복제수 발현 벡터도 개시된 바 있다 (Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975).

발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 숙주 유기체에 의해 인식되는 프로모터를 함유하고, 항-CD40 항체 또는 이의 폴리펩타이드 쇄를 코딩하는 핵산 분자에 작동가능하게 연결되어 있다. 원핵세포 숙주에 사용하기 위해 적절한 프로모터로는 phoA 프로모터, β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어, tac 프로모터를 포함한다. 공지된 다른 세균 프로모터도 적합하다. 세균 시스템에 사용하기 위한 프로모터도 상기 인간화된 항-CD40 항체를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된 샤인-달가모(S.D.) 서열을 함유할 것이다.

여러가지 진핵세포 프로모터 서열들이 공지되어 있다. 사실상 모든 진핵세포 유전자들은 전사가 개시되는 부위로부터 상류부로 대략 25 내지 30개 염기에 위치한 AT-풍부한 영역을 갖는다. 많은 유전자들의 전사 개시점으로부터 상류부로 70개 내지 80개 염기에서 발견되는 또 다른 서열은 N이 임의의 뉴클레오타이드일 수 있는 CNCAAT 영역이다. 대부분의 진핵세포 유전자의 3' 말단에는, 상기 코딩 서열의 3' 말단에 폴리 A 꼬리를 부가하기 위한 신호일 수 있는 AATAAA 서열이 있다. 이들 서열 모두는 진핵세포 발현 벡터에 적절히 삽입된다.

효모 숙주에 사용하기 위해 적합한 프로모터 서열의 예로는 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 당분해 효소, 예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 아이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 아이소머라제, 포스포글루코스 아이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터들을 포함한다.

유도성 프로모터는 성장 조건에 의해 제어되는 전사에 있어 추가적인 이점을 갖는다. 이들은 알콜 데하이드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 유도체 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데하이드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 및 말토스 및 갈락토스 이용에 관여하는 효소에 대한 효모 프로모터 영역을 포함한다. 효모 발현에 사용하기 위해 적합한 벡터 및 프로모터는 유럽 특허 73,657호에 추가로 기재되어 있다. 효모 인핸서도 효모 프로모터와 함께 사용하는 것이 유리하다.

포유동물 숙주 세포에서 벡터에서의 인간화된 항-CD40 항체 전사는 예를 들어, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스, 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 시미안 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 유전체로부터 수득된 프로모터, 이종성 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 면역글로불린 프로모터, 또는 열 충격 프로모터에 의해 제어되는데, 단, 이러한 프로모터들은 숙주 세포 시스템과 상용성이어야 한다.

상기 SV40 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 SV40 바이러스 복제 원점 역시 함유하는 SV40 제한 단편으로서 적절히 수득된다. 인간 사이토메갈로바이러스의 조기발현(immediate early) 프로모터는 HindIII E 제한 단편으로서 적절히 수득된다. 소 유두종 바이러스를 벡터로서 사용하여 포유동물 숙주에서 DNA를 발현하는 시스템은 미국 특허 4,419,446호에 기재되어 있다. 상기 시스템의 변형은 미국 특허 4,601,978호에 기재되어 있다. 또한, 단순 포진 바이러스 유래의 티미딘 키나제 프로모터의 제어 하에, 마우스 세포에서 인간 p-인터페론 cDNA의 발현을 개시하고 있는 문헌 [Reyes et al., 1982, Nature 297:598-601]도 참조한다. 다르게는, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복체가 프로모터로서 사용될 수도 있다.

재조합 발현 벡터에 사용될 수 있는 다른 유용한 요소는, 고등 진핵세포에 의해 인간화된 항-CD40 항체를 코딩하는 DNA의 전사를 증가시키는데 사용되는 인핸서 서열이다. 현재 포유동물 유전자(예를 들어, 글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질, 및 인슐린) 유래의 많은 인핸서 서열들이 공지되어 있다. 그러나, 통상적으로 진핵세포 바이러스 기원의 인핸서가 사용된다. 이의 예로는 복제 원점의 후부측 상의 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 원점의 후부측 상의 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다. 진핵세포 프로모터의 활성화를 위한 요소를 증진시키는 기재에 대해서는 문헌 [Yaniv, 1982, Nature 297:17-18]더 참조한다. 상기 인핸서는 인간화된 항-CD40 항체 코딩 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터 내로 스프라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.

진핵세포 숙주 세포 (효모, 진균류, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 유기체 기원의 유핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA를 안정화시키는데 필요한 서열을 함유할 수도 있다. 상기 서열은 통상적으로 진핵세포 또는 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및 때로는 3' 비해독 영역에서부터 이용가능하다. 이들 영역은 항-CD40 항체를 코딩하는 mRNA의 비해독 부분에서 폴리아데닐화된 단편으로서 전사된 뉴클레오타이드 절편을 함유한다. 한가지 유용한 전사 종결 성분은 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역이다. WO94/11026호 및 여기에 기재된 발현 벡터들을 참조한다. 일부 실시형태에서, 인간화된 항-CD40 항체는 CHEF 시스템을 사용하여 발현될 수 있다 (이에 대해서는, 예를 들면, 미국 특허 5,888,809호를 참조하며; 이의 내용은 본원에 참조로서 포함된다).

본원의 벡터에서 DNA를 클로닝하거나 발현시키는데 적합한 숙주 세포는 상술한 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포이다. 상기 목적에 적절한 원핵 세포로는 진정세균, 예를 들어, 그람-음성 또는 그람-양성 유기체, 예컨대 에스케리키아, 예를 들어, 이. 콜라이, 엔테로박터(Enterobacter), 어위니아(Erwinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 프로테우스(Proteus), 살모넬라(Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 타이피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아(Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스(Serratia marcescans), 및 시겔라(Shigella), 뿐만 아니라 바실리(Bacilli), 예를 들어, 비. 서브틸리스(B. subtilis) 및 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공개된 DD 266,710에 기재된 비. 리케니포르미스(B. licheniformis) 41 P), 슈도모나스(Pseudomonas), 예를 들어, 피. 아에루기노사(P. aeruginosa), 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)와 같은 장내 세균(Enterobacteriaceae)을 포함한다. 하나의 바람직한 이. 콜라이 클로닝 숙주는 이. 콜라이 294 (ATCC 31,446)이지만, 다른 균주, 예를 들어, 이. 콜라이 B, 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537) 및 이. 콜라이 W3110 (ATCC 27,325)이 적합하다. 이들 예는 제한이라기 보다는 예시하기 위한 것이다.

원핵세포 이외에도, 사상 진균류 또는 효모와 같은 진핵세포 미생물도 인간화된 항-CD40 항체-코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 통상적인 제빵 효모는 하등 진핵세포 숙주 유기체 중에서 가장 통상적으로 사용된다. 그러나, 다수의 다른 속, 종 및 균주들이 통상적으로 본원에서 이용가능하고 유용하며, 예를 들어, 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe); 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 숙주, 예를 들어, 케이. 락티스(K. lactis), 케이. 프라길리스(K. fragilis)(ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(K. bulgaricus)(ATCC 16,045), 케이. 윅커라미(K. wickeramii)(ATCC 24,178), 케이. 월티(K. waltii)(ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸(K. drosophilarum)(ATCC 36,906), 케이. 써모톨러란스(K. thermotolerans), 및 케이. 마륵시아누스(K. marxianus); 야로위아(yarrowia)(EP 402,226); 피키아 파스토르스(Pichia pastors)(EP 183,070); 캔디다(Candida); 트리코더마 레시아(Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa); 슈와니오마이세스(Schwanniomyces), 예를 들어, 슈와니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis); 및 사상 진균류, 예를 들어, 뉴로스포라(Neurospora), 페니실리움(Penicillium), 톨리포클라디움(Tolypocladium), 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 숙주, 예를 들어, 에이. 니둘란스(A. nidulans) 및 에이. 나이거(A. niger)가 있다.

당화된 인간화 항-CD40 항체의 발현을 위해 적합한 숙주 세포는 다세포 유기체로부터 유도된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함하고, 예를 들어, 다양한 배큘로바이러스 균주 및 변이체, 및 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(캐터필러), 아에데스 아에집티(Aedes aegypti)(모기), 아에데스 알보픽투스(Aedes albopictus)(모기), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(초파리), 및 봄빅스 모리(Bombyx mori)(누에)와 같은 숙주 기원의 상응하는 임의의 곤충 숙주 세포를 포함한다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 종들은 공개적으로 이용가능한데, 예를 들어, 아우토그라파 캘리포니카(Autographa californica) NPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 균주가 있으며, 상기 바이러스는 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있다.

면, 옥수수, 감자, 대두, 페투니아, 토마토 및 담배의 식물 세포 배양물도 숙주로서 사용될 수 있다.

다른 양태에서, 인간화된 항-CD40의 발현은 척추동물 세포에서 수행된다. 배양 (조직 배양) 중 척추동물 세포의 증식은 통상적인 절차가 되었고 해당 기술은 광범위하게 이용가능하다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651)에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 주, 인간 배아 신장 주 (현탁 배양액 중의 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포 (Graham et al., 1977, J. Gen Virol. 36: 59), 아기 햄스터 신장 세포(BHK, ATCC CCL 10), 중국 햄스터 난소 세포/-DHFR1 (CHO, Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4216; 예를 들면, DG44), 마우스 세르톨리 세포(mouse Sertoli cells) (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod. 23:243-251), 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70), 아프리칸 그린 원숭이 신장 세포(VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 경부 암종 세포 (HELA, ATCC CCL 2), 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 랫트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442), 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065), 마우스 유방 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51), TR1 세포 (Mather et al., 1982, Annals N.Y. Acad. Sci. 383: 44-68), MRC 5 세포, FS4 세포, 및 인간 간세포암 주 (Hep G2)이다.

숙주 세포는 인간화된 항-CD40 항체 제조를 위해 상기된 발현 또는 클로닝 벡터를 사용하여 형질전환시키고 프로모터를 유도하거나, 형질전환체를 선별하거나 목적하는 서열을 코딩하는 유전자를 증폭시키기 위해 적당히 변형된 통상적인 영양 배지에서 배양한다.

본원에 기재된 인간화된 항-CD40 항체를 제조하는데 사용되는 숙주 세포는 다양한 배지에서 배양할 수 있다. 시판되는 배지, 예를 들어 햄(Ham's)의 F10 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재, 시그마-알드리치 컴퍼니), 최소 필수 배지 ((MEM), (시그마-알드리치 컴퍼니), RPMI-1640 (시그마-알드리치 컴퍼니), 및 듈베코 변형 이글 배지((DMEM), 시그마-알드리치 컴퍼니)가 숙주 세포를 배양하기 위해 적합하다. 추가로, 문헌 [Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44], [Barnes et al., 1980, Anal. Biochem. 102: 255], 미국 특허 4,767,704호, 미국 특허 4,657,866호, 미국 특허 4,927,762호, 미국 특허 4,560,655호, 미국 특허 5,122,469호, WO 90/103430호, 및 WO 87/00195호 중 하나 이상에 기재된 배지 중 어느 하나가 상기 숙주 세포용 배양 배지로서 사용될 수 있다. 이들 배지 중 어느 하나는 필요한 만큼 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 상피 성장 인자), 염(예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충제(예를 들어, HEPES), 뉴클레오타이드(예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제(예를 들어, 젠타마이신), 미량 원소(통상적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로서 정의됨) 및 글루코스 또는 이의 균등 에너지원을 보충할 수 있다. 당업자에게 공지된 다른 보충물도 적당한 농도로 함유될 수 있다. 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 앞서 사용된 것들이며, 이는 당업자에게 자명할 것이다.

재조합 기술을 사용하는 경우, 상기 항체는 세포질 공간에서 세포내 제조될 수 있거나 배지로 직접 분비될 수도 있다. 항체가 세포내에서 제조되는 경우, 상기 세포는 제1 단계로서 단백질을 방출하기 위해 파쇄될 수 있다. 과립 파쇄물인 숙주 세포 또는 용해된 단편들은 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거될 수 있다. 문헌 [Carter et al., 1992, Bio/Technology 10:163-167]은 이. 콜라이의 세포질 공간으로 분비되는 항체를 분리하기 위한 과정을 기재하고 있다. 간략히 설명하면, 세포 페이스트를 나트륨 아세테이트(pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 약 30분 이상 해동시킨다. 세포 파쇄물은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 상기 항체가 배지로 분비되는 경우, 상기 발현 시스템의 상청액은 먼저 일반적으로 시판되는 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘 또는 밀리포어 펠리콘 한외여과 유니트를 사용하여 농축시킨다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제는 단백질용해를 억제하기 위한 이전의 임의의 단계 중에 포함될 수 있고, 항생제는 우발적인 오염물의 성장을 차단하기 위해 포함될 수 있다. 다양한 방법을 사용하여 숙주 세포로부터 항체를 분리할 수 있다.

상기 세포로부터 제조된 상기 항체 조성물은 예를 들어, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고 친화성 크로마토그래피가 전형적인 정제 기술이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 항체내 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 동형에 따라 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 감마 1, 감마 2, 또는 감마 4 중쇄를 기반으로 하는 항체를 정제할 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13]을 참조한다). 단백질 G가 모든 마우스 동형 및 인간 감마 3을 위해 권고된다 (예를 들면, 문헌 [Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575] 참조). 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로스이지만 다른 매트릭스가 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어, 제어된 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스로 성취될 수 있는 것보다 신속한 유동 속도 및 보다 짧은 프로세싱 시간을 가능하게 한다. 항체가 C_H3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABX™ 수지 (미국 뉴저지주 필립스버그 소재의 J. T. Baker)가 정제를 위해 유용하다. 이온-교환 칼럼 상의 분획, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카상 크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE^TM 상의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지(예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼) 상의 크로마토그래피, 크로마토포커싱, SDS-PAGE 및 황산암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술들도 회수될 항체에 따라 이용가능하다.

임의의 예비 정제 단계(들) 후, 목적하는 항체 및 오염물을 포함하는 혼합물은 약 2.5 내지 4.5의 pH에서 용출 완충액을 사용하는 낮은 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용할 수 있고, 전형적으로 낮은 염 농도(예를 들어, 약 0 내지 0.25 M의 염)에서 수행한다.

또한, 본원에 정의된 바와 같은 낮은, 중간정도 및 높은 엄중 조건 하에서 각각 서열번호 27 및 서열번호 26; 각각 서열번호 28 및 서열번호 26; 각각 서열번호 29 및 서열번호 26; 각각 서열번호 30 및 서열번호 26; 각각 서열번호 32 및 서열번호 31; 각각 서열번호 33 및 서열번호 31; 각각 서열번호 34 및 서열번호 31; 각각 서열번호 35 및 서열번호 31; 각각 서열번호 37 및 서열번호 36; 각각 서열번호 38 및 서열번호 36; 각각 서열번호 39 및 서열번호 36; 각각 서열번호 40 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)에 의해 대표되는 뉴클레오타이드 서열의 전체 또는 일부(예를 들어, 가변 영역을 코딩하는 부분)에 하이브리드화하는 핵산이 포함된다. 하이브리드화 핵산의 하이브리드화 부분은 전형적으로 길이가 15개 이상(예를 들어, 20, 25, 30 또는 50개)인 뉴클레오타이드이다. 하이브리드화 핵산의 하이브리드화 부분은 항-CD40 폴리펩타이드(예를 들어, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역)를 코딩하는 핵산의 전체 또는 일부의 서열 또는 이의 상보체와 80% 이상, 예를 들어, 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상 동일하다. 본원에 기재된 유형의 하이브리드화 핵산은 예를 들어, 클로닝 프로브, 프라이머, 예를 들어, PCR 프라이머 또는 진단 프로브로서 사용될 수 있다.

일부 실시형태는 서열번호 1 내지 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 또는 서열번호 40 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태는 서열번호 5 내지 서열번호 8, 서열번호 26, 서열번호 31, 또는 서열번호 36 중 어느 하나의 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

한 양태에서, 상기 분리된 폴리뉴클레오타이드 서열(들)은, 각각 서열번호 27 및 서열번호 26; 각각 서열번호 28 및 서열번호 26; 각각 서열번호 29 및 서열번호 26; 각각 서열번호 30 및 서열번호 26; 각각 서열번호 32 및 서열번호 31; 각각 서열번호 33 및 서열번호 31; 각각 서열번호 34 및 서열번호 31; 각각 서열번호 35 및 서열번호 31; 각각 서열번호 37 및 서열번호 36; 각각 서열번호 38 및 서열번호 36; 각각 서열번호 39 및 서열번호 36; 각각 서열번호 40 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편의 아미노산 서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 각각 포함하는, 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역 갖는 항체 또는 항체 단편을 코딩한다.

다른 양태에서, 본 발명은 바로 직전에 상술한 실시형태에서의 폴리뉴클레오타이드에 관한 것으로, 여기서 코딩된 항체 또는 항체 단편의 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역은, 하나의 실시형태에서, 각각 서열번호 27 및 서열번호 26; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 28 및 서열번호 26; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 29 및 서열번호 26; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 30 및 서열번호 26; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 32 및 서열번호 31; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 33 및 서열번호 31; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 34 및 서열번호 31; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 35 및 서열번호 31; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 37 및 서열번호 36; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 38 및 서열번호 36; 다른 실시형태에서 각각 서열번호 39 및 서열번호 36; 다른 실시형태에서, 각각 서열번호 40 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편의 아미노산 서열과 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 관련된 용어 "동일한" 또는 "% 동일성"은 최대 상응하게 비교되고 정렬되는 경우, 동일하거나 동일한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 특정 %를 갖는 2개 이상의 서열 또는 서브서열을 지칭한다. % 동일성을 결정하기 위해, 상기 서열은 최적의 비교 목적(예를 들어, 제2 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적의 정렬을 위해 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열에 갭이 도입될 수 있음)을 위해 정렬된다. 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 제1 서열내 위치가 제2 서열내 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유되는 경우, 그 분자는 상기 위치에서 동일하다. 2개의 서열간의 % 동일성은 서열에 의해 나누어지는 동일한 위치의 수의 함수이다(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 #/총 위치의 #(예를 들어, 중첩 위치)×100). 일부 실시형태에서, 비교되는 2개의 서열은 적절히 갭이 서열 내에 도입된 후 동일한 길이이다(예를 들어, 비교되는 서열보다 확장되는 추가의 서열은 제외시킴). 예를 들어, 가변 영역 서열이 비교되는 경우, 상기 리더 및/또는 불변 도메인 서열은 고려되지 않는다. 2개의 서열간의 서열 비교를 위해, "상응하는" CDR은 양쪽 서열내 동일한 위치에서의 CDR을 지칭한다(예를 들어, 각각의 서열의 CDR-H1).

2개의 서열간의 % 동일성 또는 % 유사성의 측정은 수학적 알고리즘을 사용하여 성취할 수 있다. 2개의 서열의 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 바람직한 비제한적인 예는 문헌 [Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877]에서와 같이 변형된 문헌 [Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268]의 알고리즘이다. 상기 알고리즘은 문헌 [Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램으로 도입된다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 NBLAST 프로그램, 스코어=100, 단어길이=12로 수행하여 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산과 상동성인 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 단어길이=3으로 수행하여 목적하는 단백질과 상동성인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적용 갭 정렬을 수득하기 위해, 갭 BLAST를 문헌 [Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 바와 같이 사용할 수 있다. 대안으로, PSI-Blast를 사용하여 분자(Id.)간의 원거리 관계를 검출하는 반복적인 검색을 수행할 수 있다. BLAST, 갭 BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 사용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 계수를 사용할 수 있다. 서열 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리즘의 다른 바람직한 비제한적인 예는 문헌 [Myers and Miller, CABIOS (1989)]의 알고리즘이다. 상기 알고리즘은 GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)으로 도입된다. 아미노산 서열을 비교하기 위해 ALIGN 프로그램을 사용하는 경우, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티, 및 4의 갭 페널티를 사용할 수 있다. 서열 분석을 위한 추가의 알고리즘은 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5]에 기재된 ADVANCE 및 ADAM; 및 문헌 [Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8]에 기재된 FASTA를 포함한다. FASTA 내에서, ktup는 검색의 감도 및 속도를 설정하는 제어 옵션이다. ktup=2인 경우, 비교되는 2개의 서열내 유사 영역은 정렬된 잔기의 쌍을 관찰함에 의해 발견되고; ktup=1인 경우, 단일 정렬된 아미노산이 조사된다. ktup는 단백질 서열에 대해 2 또는 1로 설정되거나 DNA 서열에 대해 1 내지 6으로 설정될 수 있다. ktup가 특정되지 않는 경우 디폴트는 단백질에 대해서는 2이고 DNA에 대해서는 6이다. 대안으로, 단백질 서열 정렬은 문헌 [Higgins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402]에 기재된 바와 같이 CLUSTAL W 알고리즘을 사용하여 수행할 수 있다.

비-치료학적 용도

본원에 기재된 항체는 친화성 정제 제제로서 유용하다. 상기 공정에서, 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 단백질 A 수지와 같은 고형 상에 고정화시킨다. 고정화된 항체는 정제될 CD40 단백질(또는 이의 단편)을 함유하는 샘플과 접촉시키고, 이후 지지체는 고정화된 항체에 결합된 CD40 단백질을 제외하고는 샘플내 실질적으로 모든 물질을 제거할 적합한 용매로 세척한다. 최종적으로, 상기 지지체는 항체로부터 CD40 단백질을 방출시킬 다른 적합한 용매로 세척한다.

인간화된 항-CD40 항체는 또한 CD40 단백질을 검출하고/하거나 정량하는, 예를 들어, 특정 세포, 조직 또는 혈청에서 CD40 발현을 검출하는 진단학적 검사에서 유용하다.

일부 실시형태에서, 예를 들어, 진단학적 목적을 위해 항체에 검출가능한 모이어티로 표지시키는 것이 유리할 것이다. 많은 검출가능한 표지가 이용가능하고 방사성 동위원소, 형광성 표지, 효소 기질 표지 등을 포함한다. 상기 표지는 다양한 공지된 기술을 사용하여 간접적으로 항체에 접합시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 항체는 비오틴과 접합될 수 있고 상기 언급된 3개의 광범위한 카테고리의 표지가 아비딘과 접합될 수 있거나 그 반대일 수 있다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하고, 따라서 상기 표지는 이의 간접적인 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대안으로, 항체와 표지의 간접적인 접합을 성취하기 위해, 상기 항체는 소형 합텐(예를 들어, 디곡신)과 접합시킬 수 있고, 상기 언급된 상이한 유형의 표지 중 하나는 항-합텐 항체(예를 들어, 항-디곡신 항체)와 접합시킨다. 따라서, 항체와 표지의 간접적인 접합을 성취할 수 있다.

예시적인 방사성 동위원소 표지는 ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H, 및 ¹³¹I를 포함한다. 상기 항체는 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, 1991], [Coligen et al., Ed. Wiley-lnterscience, New York, N.Y., Pubs]에 기재된 기술을 사용하여 상기 방사성 동위원소로 표지시킬 수 있다. 방사성 활성은 예를 들어, 섬광 계수기로 측정할 수 있다.

예시적인 형광 표지는 희토류 킬레이트(유로퓸 킬레이트) 또는 플루오레신 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체로부터 유도된 표지를 포함하고, 댄실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드가 이용가능하다. 상기 형광성 표지는 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology] (상기 문헌)에 기재된 것들과 같은 공지된 기술을 통해 항체에 접합시킬 수 있다. 형광성은 형광 측정기를 사용하여 정량할 수 있다.

당업계에 공지된 널리-특성 분석된 다양한 효소-기질 표지가 있다(검토를 위해 미국 특허 4,275,149호 참조). 상기 효소는 일반적으로 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색 기질의 화학적 변형을 촉매한다. 예를 들어, 변형은 분광학적으로 측정될 수 있는 기질내 색상 변화일 수 있다. 대안으로, 상기 효소는 기질의 형광성 또는 화학발광성을 변화시킬 수 있다. 형광성 변화를 정량하기 위한 기술은 상기되어 있다. 화학발광성 기질은 화학적 반응에 의해 전기적으로 여기되고, 이어서 화학적 발광 측정기를 사용하여 측정될 수 있는 광을 방출할 수 있거나 에너지를 형광 수용체에 공여할 수 있다.

효소적 표지의 예는 초파리 루시페라제 및 세균 루시페라제(미국 특허 4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어, 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제(예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제(예를 들어, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등과 같은 루시페라제를 포함한다. 효소를 항체에 접합시키기 위한 기술은 예를 들어, 문헌 [O'Sullivan et al., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (J. Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N.Y., 73: 147-166]에 기재되어 있다.

효소-기질 조합의 예는 예를 들어 다음을 포함한다: 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRPO)와 기질로서의 하이드로겐 퍼옥시다제(여기서, 상기 하이드로겐 퍼옥시다제는 오르토페닐렌 디아민(OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드(TMB)와 같은 염료 전구체를 산화시킨다); 알칼리성 포스파타제(AP)와 발색 기질로서 파라-니트로페닐 포스페이트; 및 β-D-갈락토시다제(β-D-Gal)와 발색 기질, 예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제 또는 형광성 기질 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제.

많은 다른 효소-기질 조합이 당업자에게 이용가능하다. 이들의 일반적인 검토를 위해 미국 특허 4,275,149호 및 미국 특허 4,318,980호를 참조한다.

다른 실시형태에서, 상기 인간화된 항-CD40 항체는 비표지된 상태로 사용되고 인간화된 항-CD40 항체와 결합하는 표지된 항체로 검출된다.

본원에 기재된 항체는 경쟁 결합 검사, 직접적이고 간접적인 샌드위치 검사 및 면역침전 검사법과 같은 공지된 임의의 검사 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc. 1987)]을 참조한다.

진단학적 키트

인간화된 항-CD40 항체가 진단학적 키트, 즉, 진단학적 검사를 수행하기 위한 지침서와 함께 소정량의 팩키징된 시약의 조합으로 사용될 수 있다. 항체가 효소로 표지되는 경우, 상기 키트는 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체와 같은, 효소에 의해 요구되는 기질 및 보조 인자를 포함할 수 있다. 추가로, 안정화제, 완충제(예를 들어, 블록 완충제 또는 용해 완충제) 등과 같은 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적 양은 실질적으로 검사의 감도를 최적화하는 시약의 용액 중에 농도를 제공하기 위해 광범위하게 다양할 수 있다. 상기 시약은 일반적으로 동결건조된 무수 분말로서 제공될 수 있고, 용해시 적당한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함한다.

치료학적 용도

다른 실시형태에서, 본원에 기재된 인간화된 항-CD40 항체는 본원에 기재된 바와 같은 CD40의 발현과 관련된 다양한 장애의 치료에 유용하다.

상기 인간화된 항-CD40 항체 또는 시약은 비경구, 피하, 복강내, 폐내 및 비강내를 포함하는 임의의 적합한 수단에 의해 투여되고, 경우에 따라 국소 면역억제 치료를 위해 병변내 투여한다 (이식 전에 이식편을 항체로 관류시키거나 이와 접촉시킴을 포함함). 상기 인간화된 항-CD40 항체 또는 제제는 예를 들어, 주입 또는 볼루스(bolus)로서 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 추가로, 상기 인간화된 항-CD40 항체는 펄스 주입에 의해 적합하게 투여되고, 특히 감소하는 용량의 항체로 투여된다. 한 양태에서, 상기 용량은 주사, 가장 바람직하게는 부분적으로 투여가 일시적이거나 만성적인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투여된다.

질환의 예방 또는 치료를 위해, 적당한 항체의 용량은 상기 정의된 바와 같이 치료될 질환 유형, 질환의 중증도 및 경로, 항체가 예방적 또는 치료학적 목적을 위해 투여되는지의 여부, 이전의 치료요법, 환자의 임상적 병력 및 항체에 대한 반응 및 담당 의사의 소견과 같은 다양한 인자에 따라 다양할 것이다. 상기 항체는 적합하게 한번에 또는 일련의 치료로 환자에게 투여된다.

질환의 유형 및 중증도에 따라, 약 1 ㎍/kg 내지 20 mg/kg(예를 들어, 0.1 내지 15 mg/kg)의 항체가 예를 들어, 1회 이상의 별도의 투여 또는 연속 주입에 의한 것인지의 여부에 상관없이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 용량이다. 전형적인 하루 용량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 몇일 또는 오랜 기간 동안 반복적인 투여를 위해, 병태에 따라 상기 치료는 목적하는 질환 증상의 억제가 발생할 때까지 지속한다. 그러나, 다른 용량 치료계획이 유용할 수 있다. 상기 치료요법의 과정은 통상적인 기술 및 검사에 의해 용이하게 모니터링된다. 예시적인 용량 치료계획은 WO94/04188호에 기재되어 있다.

"경감" 및 "완화"와 같은 의미로 본원에 사용되는 용어 "억제"는 질환의 하나 이상의 특징을 감소시킴을 의미한다.

항체 조성물은 우수한 의학적 관행과 일치하는 양식으로 제형화된 용량으로 투여된다. 여기서 고려해야 할 인자는 치료될 특정 장애, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 병태, 장애의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획 및 의학적 수행자에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 투여될 "치료학적 유효량"의 항체는 상기의 고려에 의해 지배되고, CD40 발현과 관련된 장애를 예방하거나 경감시키거나 치료하는데 필요한 최소량이다.

상기 항체는 그럴 필요는 없지만 미지의 장애를 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 제형화한다. 상기 제제의 유효량은 제형 중에 존재하는 인간화된 항-CD40 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형 및 상기 논의된 다른 인자들에 의존한다. 이들은 일반적으로 본원에서 사용된 바와 같은 동일한 용량 및 투여 경로 또는 이전에 사용된 용량의 약 1 내지 99%로 사용된다.

CD40-관련 장애

상기 항-CD40 항체 또는 제제는 CD40의 발현을 특징으로 하는, 예를 들어, 면역 세포(예를 들어, 림프구 또는 수지상 세포)의 부적절한 활성화를 특징으로 하는 CD40-발현 암 또는 면역학적 장애를 치료하거나 예방하기 위해 유용하다. 상기 CD40의 발현은 예를 들어, 세표 표면 상에 증가된 CD40 단백질 및/또는 상기 발현된 CD40의 변형된 항원성으로 인한 것일 수 있다. 본원에 기재된 방법에 따른 면역학적 장애의 치료 또는 예방은, 유효량의 항-CD40 항체 또는 제제를, 상기 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상자에게 투여하여 항체가 (i) CD40을 발현하고 질환 상태와 관련된 활성화된 면역 세포에 결합하고 (ii) 활성화된 면역 세포상에서 세포독성, 세포억제성 또는 면역억제성 효과를 나타냄으로써 성취된다.

면역 세포의 부적절한 활성화를 특징으로 하고 본원에 기재된 방법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 면역학적 질환은 예를 들어, 장애를 뒷받침하는 과민성 반응(들) 유형(들)에 의해 분류될 수 있다. 이들 반응은 전형적으로 4가지 유형으로 분류된다: 과민감성 반응, 세포독성(세포용해성) 반응, 면역 복합체 반응 또는 세포-매개된 면역(CMI) 반응(또한, 지연형 과민감성(DTH) 반응으로 언급됨). 문헌 [Fundamental Immunology (William E. Paul ed., Raven Press, N.Y., 3rd ed. 1993)]을 참조한다.

상기 면역학적 질환의 특정 예는 하기를 포함한다: 류머티스 관절염, 자가면역 탈수초성 질환(예를 들어, 다발성 경화증, 알레르기성 뇌척수염), 내분비 안질환, 포도막염, 전신 홍반성 루푸스, 중증 근무력증, 그레이브스병, 사구체신염, 자가면역 혈액학적 장애, 염증성 장질환(예를 들어, 크론병 또는 궤양성 장염), 과민증, 알레르기 반응, 쇼그렌 증후군, I형 진성 당뇨병, 원발성 담즙성 간경변, 베게너 육아종증, 섬유근육통, 다발성근염, 피부근육염, 염증성 근염, 다발성 내분비 부전증, 슈미트 증후군, 자가면역 포도막염, 애디슨 질환, 부신염, 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 자가면역 갑상선 질환, 악성 빈혈, 위축성 위염, 만성 간염, 루포이드 간염, 죽상 동맥경화증, 아급성 피부 홍반성 낭창, 부갑상선 기능 저하증, 드레슬러 증후군, 자가면역 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 용혈성 빈혈, 심상성 천포창, 천포창, 포진성 피부염, 원형 탈모증, 유천포장, 경피증, 진행성 전신 경화증, CREST 증후군(석회증, 레이노드 현상, 식도 운동 장애, 수지 경화증), 및 모세혈관 확장증), 남성 및 여성 자가면역 불임, 강직성 척추염, 궤양성 장염, 복합 연결 조직 질환, 결절성 다발성 동맥염, 전신 괴사성 혈관염, 아토피성 피부염, 위축성 비염, 굿 파스튜어 증후군, 샤가스 질환, 유육종증, 류머티스 열, 천식, 재발성 낙태, 항-인지질 증후군, 농부폐(farmer's lung), 다형 홍반(erythema multiforme), 심장절개술후 증후군, 쿠싱 증후군(Cushing's syndrome), 자가면역 만성 활성 간염, 새 사육자 폐(bird-fancier's lung), 독성 표피 괴사융해, 알포트 증후군(Alport's syndrome), 폐포염, 알레르기 폐포염, 섬유성 폐포염, 간질 폐 질환, 결절성 홍반, 괴저성 농피증, 수혈 반응, 다카야수 동맥염, 류머티스성 다발성 근육통, 측두동맥염, 주혈흡충증, 거대 세포 동맥염, 회충증, 아스퍼질러스증, 샘프터 증후군, 습진, 림프종모양 육아종증, 베체트 질환(Behcet's disease), 카플란 증후군(Caplan's syndrome), 카와사키 질환, 뎅기, 뇌척수염, 심내막염, 심내막 섬유증, 내안구염, 장기 융기성 홍반(erythema elevatum et diutinum), 건선, 태아성 적아구증, 호산구성 근막염, 슐만 증후군(Shulman's syndrome), 펠티 증후군(Felty's syndrome), 필라리아증, 모양체염, 만성 모양체염, 이종만성 모양체염, 푸흐 모양체염, IgA 신장병, 헤노흐-쇤라인 자반증(Henoch-Schonlein purpura), 이식편 대 숙주 질환, 이식 거부증, 심근병증, 이튼-램버트 증후군(Eaton-Lambert syndrome), 재발성 다발연골염, 한냉글로불린혈증(cryoglobulinemia), 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 에반 증후군(Evan's syndrome), 급성 호흡 곤란 증후군, 폐 염증, 골다공증, 지연형 과민감성 및 자가면역 성선 부전증.

따라서, 본원에 기재된 방법은 B 림프구 장애(예를 들어, 전신 홍반성 루푸스, 굿 파스튜어 증후군, 류머티스 관절염 및 I형 당뇨병), Th₁-림프구의 장애(예를 들어, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 원발성 담즙성 간경변증, 베게너 육아종증, 결핵 또는 이식편 대 숙주 질환) 또는 Th₂-림프구의 장애(예를 들어, 아토피성 피부염, 전신 홍반성 루푸스, 아토피성 천식, 비염, 알레르기성 비염, 오멘 증훈, 전신 경화증 또는 만성 이식편 대 숙주 질환)의 치료를 포함한다. 일반적으로 수지상 세포를 포함하는 장애는 Th₁-림프구 또는 Th₂-림프구의 장애를 포함한다.

류머티스성 관절염(RA)은 인구 약 1%에 영향을 미치는 가장 통상적인 염증성 자가면역 질환 중 하나이다. 효과적인 치료법(예를 들어, MTX 및 항-TNF 제제)이 이용가능하지만, 특히 항-TNF 치료요법에 적절히 응답하지 않는 (환자의 약 30%) 환자들에 대한 의학적 요구를 충족시키지 못한다. 추가로, 환자의 50% 이하는 주로 부작용 뿐만 아니라 증가되는 인지된 수의 환자가 치료학적 이득을 얻지 못하기 때문에 5년 이내에 TNF-길항제 치료를 중단한다. 따라서, RA에서 염증 및 관절 파괴를 표적화하지만 유일하게 TNF의 직접적인 억제에 의존하지 않는 효과적인 치료요법을 확립하는 것이 중요하다. 매우 매력적인 접근법은 공동-자극 세포 경로를 표적화하는 것이다. 공동자극에서 주요 수용체-리간드 쌍 중 하나는 CD40/CD40L이다. 상기 시스템은 면역 세포간의 상호작용 및 면역과 비-면역 세포간의 상호작용을 가능하게 하고, 이 모두는 RA의 병리학에서 중요하다. 본 발명의 길항성 항체를 사용한 CD40의 차단은 RA에서 하기의 효과 중 하나 이상을 가질 수 있다:

1) B 세포 분화 및 항체 동형 전환을 억제하고;

2) T-세포 및 마크로파지에서 사이토킨 및 케모킨 생산 및 접착 분자의 상향조절을 억제하고;

3) 수지상 세포의 활성화를 억제하고;

4) 염증촉진 사이토킨, 케모킨, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 프로스타글란딘의 생성을 억제하고, 비면역 세포(예를 들어, 상피, 내피 및 간엽 세포)내의 접착 분자의 하향 조절을 억제한다.

상기 효과 중 하나를 성취하는 방법은 본원에서 명백하게 고려된다. RA에 추가로, 본 발명의 조성물은 특히 다발성 경화증, 건선(건선성 관절염을 포함함), 소아성 류머티스 관절염, 염증성 장질환, 전신 홍반성 루푸스 및 고형 기관 이식의 치료 방법에 유용하다.

류머티스 관절염(RA)은 성인에서 대략 1%의 만연성을 갖는 만성 전신성 자가면역 질환이다. 상기 질환은 계속 진행하여 상당한 이환율 및 미성숙한 치사율(치사율은 주로 악화된 심혈관 질환 때문이다)을 유발한다. 현재, 관절 손상이 질환 과정 중에 조기에 발생하고 환자의 30% 이하는 진단시 골 침식의 방사선적 증거를 나타내고 1년 후에는 60%까지 증가하는 것으로 밝혀졌다. 현재 지침서는 명확한 진단이 확정된 후 3개월 내에 통상적인 질환-개질 항류머티스 약물(DMARD)을 사용한 치료요법을 개시할 것을 추천한다. DMARD는 관절 손상을 감소시키거나 예방하고 관절 기능을 유지할 잠재력을 갖는다. 현재, 류머티스 관절염 학자는 대부분의 환자에 대해 초기 DMARD 치료제로서 메토트렉세이트(MTX)를 선택한다.

TNF-길항제 에타너셉트(Enbrel®), 인플릭시마브(Remicade®), 아달리무마브(Humira®), CTLA4-길항제 아바타셉트(Orencia®), 항-IL-6 수용체 mAb 토실리주마브 및 항-CD20 mAb 리툭시마브(Rituxan®)가 RA의 치료에 효과적이다. 현재 지침서는 일반적으로 통상적인 DMARD에 대한 부적당한 반응 후 활성 RA의 치료를 위해 생물학적 DMARD를 사용할 것을 추천한다.

이전의 MTX 치료 없이 조기 공격적 RA를 나타내는 환자에서의 최근 연구는 TNF-길항제와 MTX의 병용이 단일 치료요법으로서 사용되는 각각의 경우보다 우수함을 보여주었다. 가장 두드러진 결과는 병용 치료요법의 상당한 방사선학적 이득이었다. 따라서, MTX와 TNF-억제제의 병용이 공격적 질환 및 공격적 표현형(예를 들어, 높은 활성 스코어, 기능적 손상, 류머티스 인자(RF)에 대한 혈청양성 또는 항-사이클릭 시트룰린화된 펩타이드 항체(CCP), 상승된 CRP, 방사선학적 침식)에 대한 위험성이 매우 높은 환자에서 사용되어야만 한다. 그러나, 본 발명자는 임상적 수행에서 TNF-길항제가 제1 라인 치료요법으로서 사용되는 것은 드물 것으로 예상한다. 미국 류머티스 관절염 학자의 연구 조사는 2005년 4월에 수행되었고, TNF-길항제를 사용해야 한다는 결정에 가장 영향을 미치는 인자가 MTX 또는 다수의 DMARD의 실패, 의사의 평가, 기능성 손상 및 방사선학적 악화 또는 침식임을 보여주었다. 현재, RA를 갖는 환자의 대략 20%는 미국에서 TNF-억제제 치료요법을 받고 있다.

상당수의 RA 환자들은 약물 내성 및 독성 또는 반응의 결여 때문에 생물학적 치료요법을 포함하는 현재 치료로 적절히 도움을 받지 못하고 있다. 환자의 50% 이하는 주로 부작용뿐만 아니라 증가하는 인지되는 수의 환자들이 이들의 반응을 상실하기 때문에 5년 내에 TNF 길항제 치료를 중단한다.

일부 실시형태에서, 면역학적 장애는 T 세포-매개된 면역학적 장애, 예를 들어, 장애와 관련된 활성화된 T 세포가 CD40을 발현하는 T 세포 장애이다. 항-CD40 항체 또는 제제는 상기 CD40-발현 활성화된 T 세포를 고갈시키기 위해 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 항-CD40 항체 또는 제제의 투여는 CD40-발현 활성화된 T 세포를 고갈시킬 수 있지만, 휴식기 T 세포는 상기 항-CD40 또는 제제에 의해 실질적으로 고갈되지 않는다. 본원에서, "실질적으로 고갈되지 않는"이란 휴식기 T 세포 중 약 60% 미만, 또는 약 70% 미만 또는 약 80% 미만이 고갈되지 않음을 의미한다.

본원에 기재된 바와 같은 항-CD40 항체 및 제제는 또한 CD40-발현 암을 치료하거나 예방하기 위해 유용하다. 본원에 기재된 방법에 따른 CD40-발현 암의 치료 또는 예방은 유효량의 항-CD40 항체 또는 제제를, 치료 또는 예방이 요구되는 대상자에게 투여하여 항체 또는 제제가 (i) CD40-발현 암 세포에 결합하고 (ii) 세포독성 또는 세포억제 효과를 나타내어 CD40-발현 암 세포를 고갈시키거나 이의 증식을 억제함에 의해 성취된다.

본원에 기재된 방법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 CD40-발현 암은 예를 들어, 백혈병, 예를 들어, 급성 백혈병, 급성 림프구 백혈병, 급성 골수성 백혈병(예를 들어, 골수아구성, 전골수성, 골수단구성, 단구성 또는 적백혈병), 만성 백혈병, 만성 골수성(과립구성) 백혈병, 또는 만성 림프구성 백혈병; 진성 다혈구증; 림프종(예를 들어, 호지킨 질환 또는 비호지킨 질환); 다발성 골수종, 발덴스트룀 거대글로불린혈증; 중쇄 질환; 고형 종양, 예를 들어, 육종 및 암종(예를 들어, 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골성 육종, 골육종, 척색종, 혈관육종, 내피육종, 림프관육종, 림프혈관내피육종, 활막종, 중피종, 유잉 종양, 평활근육종, 횡문근육종, 결장 암종, 결장직장 암종, 췌장암, 유방암, 난소암, 전립선암, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두상 선암종, 낭선암종, 수질성 암종, 기관지 암종, 신장 세포 암종, 간암, 담관 암종, 융모막암종, 정상피종, 배아 암종, 윌름 종양, 경부암, 자궁암, 고환 종양, 폐 암종, 소형 세포 폐 암종, 비 소형 세포 폐 암종, 방광 암종, 상피 암종, 신경아교종, 성상세포종, 수아세포종, 두개인두종, 상의세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종, 희소돌기아교세포종, 뇌수막종, 흑색종, 신경아세포종, 망막아세포종, 비인두암종, 또는 식도 암종)을 포함한다.

약제학적 조성물 및 이의 투여

CD40 결합제(예를 들어, 항-CD40 항체)를 포함하는 조성물은 면역학적 장애 또는 CD40-발현 암을 갖거나 이의 위험에 처한 대상자에게 투여될 수 있다. 본 발명은 추가로 CD40 발현 암 또는 면역학적 장애의 예방 또는 치료를 위한 약물의 제조에서 CD40 결합제(예를 들어, 항-CD40 항체)의 용도를 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "대상자"는 CD40-결합제가 투여될 수 있는 임의의 포유동물 환자를 의미하고, 예를 들어, 인간 및 비인간 포유동물, 예를 들어, 영장류, 설치류 및 개를 포함한다. 본원에 기재된 방법을 사용한 치료를 위해 구체적으로 의도된 대상자는 인간을 포함한다. 상기 항체 또는 제제는 면역학적 장애 또는 CD40-발현 암의 예방 또는 치료에서 단독으로 또는 다른 조성물과 조합하여 투여될 수 있다.

상기 약제학적 조성물에 사용하기 위해 바람직한 항체는 서열번호 1 내지 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 또는 서열번호 40 중 어느 하나의 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 갖는 인간화된 항체 또는 항체 단편을 포함하는 것들이다.

일부 실시형태는 서열번호 26, 서열번호 31, 또는 서열번호 36의 경쇄 가변 도메인 아미노산 서열을 갖는 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 특히 바람직한 인간화된 항체 조성물은 각각 서열번호 27 및 서열번호 26; 각각 서열번호 28 및 서열번호 26; 각각 서열번호 29 및 서열번호 26; 각각 서열번호 30 및 서열번호 26; 각각 서열번호 32 및 서열번호 31; 각각 서열번호 33 및 서열번호 31; 각각 서열번호 34 및 서열번호 31; 각각 서열번호 35 및 서열번호 31; 각각 서열번호 37 및 서열번호 36; 각각 서열번호 38 및 서열번호 36; 각각 서열번호 39 및 서열번호 36; 각각 서열번호 40 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 본 발명에서 서열번호 1 내지 서열번호 4, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30, 서열번호 32, 서열번호 33, 서열번호 34, 서열번호 35, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 42, 서열번호 44, 서열번호 46, 서열번호 48, 서열번호 53, 서열번호 57, 서열번호 58, 서열번호 59, 서열번호 60, 서열번호 61, 서열번호 62, 서열번호 63, 서열번호 64, 서열번호 65, 서열번호 66, 서열번호 67, 서열번호 68, 서열번호 69, 서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 또는 서열번호 73의 중쇄 서열 중 어느 하나를 코딩하는 분리된 폴리뉴클레오타이드가 고려된다. 다른 실시형태는 서열번호 5 내지 서열번호 8, 서열번호 26, 서열번호 31, 서열번호 36, 서열번호 41, 서열번호 43, 서열번호 45, 서열번호 47, 서열번호 49, 서열번호 50, 서열번호 51, 서열번호 52, 서열번호 54, 서열번호 55, 서열번호 56, 서열번호 74, 서열번호 75, 또는 서열번호 76의 서열 중 어느 하나의 임의의 서열의 경쇄 서열을 코딩하는 분리된 핵산에 관한 것이다.

RA의 치료가 고려되는 특정 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 단독의 MTX에 적당히 반응하지 않는 중간정도 내지 중증 활성 RA를 갖는 환자에서 주요 임상적 반응을 유도하고 구조적 손상의 진행을 감소시키면서, 징후 및 증상을 감소시키는 방법에 사용될 수 있다. 현재 예시적인 당해 치료요법은 엔브렐/휴미라 (휴미라 및 엔브렐을 사용한 데이터는 2개의 상이한 환자 집단에서 수득되었다)이다. 본 발명의 조성물은 단독의 MTX에 응답하지 않는 대상자에 대해 엔브렐/휴미라 치료요법 대신에 또는 엔브렐/휴미라 치료법과의 조합으로 사용될 수 있다. 바람직하게, 상기 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 예를 들어, 6개월째에 ACR20이 화합물 + MTX에 대해 > 85%(GS: 엔브렐 + MTX 71% 대 위약 + MTX 27%, 휴미라 + MTX 12개월째 59% 대 위약 + MTX 24%)^*에 의해 결정되는 바와 같이 메토트렉세이트에 대해 부적당한 반응을 갖는 환자에서 엔브렐 + MTX에 대한 우수한 효능을 가질 것이다. 본 발명의 조성물의 보다 우수한 효능에 대한 추가의 기준은 다음을 포함할 수 있다: 엔브렐과 유사한 1년 기간 이상의 구조적 손상의 진행 억제(52주 후 평균 변형된 샤프 스코어 휴미라 + MTX 0.1 대 위약 + MTX 2.7)^*. 여전히 다른 실시형태에서, 상기 조성물은 ACR70(휴미라 + MTX에 대해 20%, 위약 + MTX에 대해 4%)^*에 의해 결정되는 바와 같이 메토트렉세이트에 대한 부적당한 반응을 나타내는 환자에서 엔브렐 보다 우수한 "주요 임상적 반응"을 나타낸다.

다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 항-TNF 제제에 대해 부적당한 반응을 갖는 중간정도 내지 중증 활성 RA를 갖는 환자에서 주요 임상적 반응을 유도하고 구조적 손상의 진행을 감소시키는, 징후 및 증상을 감소시키는 것으로 나타날 수 있다. 현재 골드 표준: 비-항-TNF 생물학적 치료요법. 바람직하게, 상기 대상자에서, 본 발명의 조성물은 항-TNF 제제에 대해 부적당한 반응을 갖는 환자에서 병력적 비교에 의해 비-항-TNF 생물학적(예를 들어, 오렌시아, 리툭산)과 비교하여 열등하지 않은 효능을 갖는다: 6개월째 ACR20은 화합물 + DMARD에 대해 >50%(GS: 오렌시아 + DMARD 50% 대 위약 + DMARD 20%). 또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 리툭산과 유사하게 관절 침식 및 관절 공간의 좁아짐에 대해 받아들여진 X-선 스코어링 방법에 의한 평가시 1년 기간 이상의 구조적 손상의 진행을 억제한다(52주 후 평균 변형된 샤프 스코어 리툭산 + MTX 1.0 대 위약 + MTX 2.31).

다양한 전달 시스템이 공지되어 있고 CD40 결합제를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 도입 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. CD40 결합제는 예를 들어, 주입, 볼루스 또는 주사에 의해 투여될 수 있고, 화학치료제와 같은 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신성이거나 국소적일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 상기 투여는 피하 주사에 의한 것이다. 상기 주사용 제형은 예를 들어, 격주 1회로 투여될 수 있는 사전 충전된 주사기로 제조될 수 있다.

본 발명의 항체의 안전성 특성을 결정하고, 이는 바람직하게는 다음과 같은 하나 이상의 특징을 포함할 것이다: 류머티스 관절염을 치료하기 위해 통상적으로 사용되는 다른 약물(예를 들어, DMARD, 스테로이드, NSAID)과 임상적으로 상당한 부작용을 나타내지 않음; 엔브렐과 비교하여, 안전성 또는 내성 문제로 인한 보다 큰 중단율을 나타내지 않음; 항-TNF 제제 또는 다른 통상적으로 사용되는 생물학적 제제 보다 큰 심각한 감염율을 나타내지 않음; 엔브렐과 유사한 주사 부위 반응 또는 주입 반응의 빈도수 및/또는 중증도; 치료요법의 반복 주기에 따른 치료시 약물 내성이 발현되지 않거나 최소의 발현(5% 미만); 중화 항체 부재이거나 최소; 생체내 혈전색전증을 유발할 수 있는 증진된 혈소판 응고/활성화 또는 출혈을 유발할 수 있는 혈소판/내피 기능부전의 증거 부재.

특정 실시양태에서, CD40 결합제 조성물은 주사, 카테터, 좌약 또는 이식물에 의해 투여되며, 이때 상기 이식물은 다공성, 비다공성 또는 젤라틴성 물질, 예컨대 실라스틱 막과 같은 막, 또는 섬유를 포함한다. 일반적으로, 조성물 투여시, 상기 항-CD40 항체 또는 제제가 흡수하지 않는 물질을 사용한다.

다른 실시양태에서, 상기 항-CD40 항체 또는 제제는 제어 방출형 시스템으로 전달된다. 한 실시양태에서, 펌프를 사용할 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [Langer, 1990, Science 249:1527-1533]; [Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201]; [Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507]; [Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574] 참조). 또 다른 실시양태에서, 중합체 물질을 사용할 수 있다 (예컨대, 문헌 [Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974)]; [Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984)]; [Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61]을 참조한다. 또한, 문헌 [Levy et al., 1985, Science 228:190]; [During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351]; [Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105]도 참조한다). 다른 제어 방출형 시스템은, 예를 들어 상기 문헌 [Langer]에서 논의되어 있다.

CD40 결합제 (예컨대, 항-CD40 항체)는 치료적 유효량의 결합제 및 하나 이상의 약제학적으로 상용가능한 성분들을 포함하는 약제학적 조성물로 투여될 수 있다.

전형적인 실시형태에서, 상기 약제학적 조성물은 인간에게 정맥내 또는 피하 투여하기 위해 적합한 약제학적 조성물로서, 통상적인 과정에 따라 제형화된다. 전형적으로, 주사 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 경우에 따라, 상기 약제는 또한 주사 부위에서 통증을 완화시키기 위한 가용화제 및 국부 마취제(예를 들어, 리그노카인)를 포함할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분들은 예를 들어, 활성제의 양을 지적하는 앰플 또는 사쉐와 같은 밀봉 용기내 무수 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서의 단위 용량 형태로 별도로 또는 함께 혼합하여 공급된다. 약제가 주입에 의해 투여되어야만 하는 경우, 이것은 멸균 약제 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 약제가 주사에 의해 투여되는 경우, 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플은 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있도록 제공될 수 있다.

추가로, 상기 약제학적 조성물은 (a) 동결건조된 형태의 CD40 결합제 (예컨대, 항-CD40 항체)를 함유하는 용기 및 (b) 약제학적으로 허용가능한 주사용 희석제 (예컨대, 멸균수)를 함유하는 제2 용기를 포함하는 약제학적 키트로 제공될 수 있다. 상기 약제학적으로 허용가능한 희석제는 동결건조된 항-CD40 항체 또는 제제의 환원 또는 희석에 사용될 수 있다. 선택적으로, 이러한 용기(들)과 관련하여, 약제 또는 생물학적 제제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관이 규정한 형태의 통지가 있을 수 있으며, 이러한 통지는 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매에 대한 해당 정부 기관의 승인을 담고 있다.

면역학적 장애 또는 CD40-발현 암의 치료 또는 예방에 효과적인 CD40 결합제(예를 들어, 항-CD40 항체)의 양은 표준 임상적 기술에 의해 결정될 수 있다. 추가로, 시험관내 검사는 임의로 최적의 용량 범위의 동정을 돕기 위해 사용될 수 있다. 상기 제형 중에 사용될 정확한 용량은 또한 투여 경로 및 면역학적 장애 또는 CD40-발현 암의 단계에 의존하고, 수행자의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야만 한다. 시험관내 또는 동물 모델 시험 시스템으로부터 유도한 용량 반응 곡선으로부터 외삽하여 유효 용량을 추정할 수 있다.

예를 들어, 항-CD40 항체 또는 제제의 독성 및 치료학적 효능은 ED₅₀(집단의 50%에 치료학적으로 효과적인 용량)을 결정하기 위한 표준 약제학적 과정에 의해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 결정될 수 있다. 대형 치료학적 지수를 나타내는 CD40-결합제(예를 들어, 항-CD40 항체)가 바람직하다. CD40-결합제가 독성 부작용을 나타내는 경우, 환부 조직 부위로 CD40-결합제를 표적화하는 전달 시스템은 비-CD40-발현 세포의 잠재적 손상을 최소화하여 부작용을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.

세포 배양 검사 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 인간에 사용하기 위한 용량 범위를 제형화하는데 사용될 수 있다. CD40 결합제의 용량은 전형적으로 거의 독성이 없는 ED₅₀을 포함하는 혈액 순환 농도 범위 내에 있다. 상기 용량은 사용되는 용량 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 상기 범위 내에서 다양할 수 있다. 상기 방법에 사용되는 임의의 CD40 결합제에 대해, 상기 치료학적 유효 용량은 처음에 세포 배양 검사로부터 평가할 수 있다. 용량은 세포 배양물에서 결정되는 바와 같이 IC₅₀(즉 증상의 최대 절반 억제를 성취하는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 성취하기 위한 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 상기 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다. 혈장내 수준은 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피, ELISA 등에 의해 측정될 수 있다.

일반적으로, 면역학적 장애 또는 CD40-발현 암을 갖는 환자에게 투여되는 항-CD40 항체 또는 CD40 결합제의 용량은 전형적으로 대상자의 체중 kg당 약 0.1 mg 내지 약 100 mg이다. 대상자에 투여되는 용량은 대상자의 체중 kg당 약 0.1 mg 내지 약 50 mg, 약 1 mg 내지 약 30 mg, 약 1 mg 내지 약 20 mg, 약 1 mg 내지 약 15 mg, 또는 약 1 mg 내지 약 10 mg이다.

예시적인 용량은 1 ng/kg 내지 100 mg/kg을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 용량은 약 0.5 mg/kg, 약 1 mg/kg, 약 2 mg/kg, 약 3 mg/kg, 약 4 mg/kg, 약 5 mg/kg, 약 6 mg/kg, 약 7 mg/kg, 약 8 mg/kg, 약 9 mg/kg, 약 10 mg/kg, 약 11 mg/kg, 약 12 mg/kg, 약 13 mg/kg, 약 14 mg/kg, 약 15 mg/kg 또는 약 16 mg/kg이다. 상기 용량은 예를 들어, 매일, 매주 1회(주간), 매주 2회, 매주 3회, 매주 4회, 매주 5회, 매주 6회, 2주 간격으로 또는 1개월 간격으로, 2개월 간격으로 또는 3개월 간격으로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 용량은 약 0.5 mg/kg/주, 약 1 mg/kg/주, 약 2 mg/kg/주, 약 3 mg/kg/주, 약 4 mg/kg/주, 약 5 mg/kg/주, 약 6 mg/kg/주, 약 7 mg/kg/주, 약 8 mg/kg/주, 약 9 mg/kg/주, 약 10 mg/kg/주, 약 11 mg/kg/주, 약 12 mg/kg/주, 약 13 mg/kg/주, 약 14 mg/kg/주, 약 15 mg/kg/주 또는 약 16 mg/kg/주이다. 일부 실시형태에서, 상기 용량의 범위는 약 1 mg/kg/주 내지 약 15 mg/kg/주이다.

일부 실시형태에서, CD40 결합제를 포함하는 약제학적 조성물은 결합제에 접합되거나 접합되지 않은 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 항-CD40 항체 또는 CD40 결합제는 면역학적 장애 또는 CD40-발현 암의 치료 또는 예방을 위한 하나 이상의 치료제와 병용하여 동시-투여될 수 있다. 예를 들어, 병용 치료요법은 세포억제, 세포독성 또는 면역억제제를 포함할 수 있다. 병용 치료요법은 또한 예를 들어, 활성화된 림프구, 수지상 세포 또는 CD40-발현 암 세포의 표면 상에 CD40 이외의 수용체 또는 수용체 복합체를 표적화하는 제제의 투여를 포함할 수 있다. 상기 제제의 예는 활성화된 림프구, 수지상 세포 또는 CD40-발현 암 세포의 표면에서 분자에 결합하는 제2 비-CD40 항체를 포함한다. 다른 예는 상기 수용체 또는 수용체 복합체를 표적화하는 리간드를 포함한다. 전형적으로, 상기 항체 또는 리간드는 활성화된 림프구, 수지상 세포 또는 CD40-발현 암 세포 상에 세포 표면 수용체에 결합하고, 세포억제 또는 세포독성 신호를 활성화된 림프구, 수지상 세포 또는 CD40-발현 암 세포에 전달함에 의해 항-CD40 항체의 세포독성 또는 세포억제 효과를 증진시킨다.

상기 병용 치료요법 실시는 질환 계수(예를 들어, 증상의 중증도, 증상 수 또는 재발 빈도)에 대한 부가적 또는 공동상승 효과를 가질 수 있다.

병용 투여를 위한 치료학적 치료계획과 관련하여, 특정 실시형태에서, 항-CD40 항체 또는 CD40 결합제는 치료제와 동시에 투여된다. 다른 특정 실시형태에서, 상기 치료제는 항-CD40 항체 또는 CD40 결합제의 투여 전 또는 후에 적어도 1시간 및 수개월 간격으로, 예를 들어, 항-CD40 항체 또는 CD40 결합제의 투여 전 또는 후에 적어도 1시간, 5시간, 12시간, 하루, 1주, 1개월 또는 3개월 간격으로 투여된다.

유용한 부류의 세포독성 또는 면역억제제는 예를 들어, 항튜불린제, 아우리스타틴스(예를 들어, MMAE 또는 MMAF), DNA 마이너 그루브 결합제, DNA 복제 억제제, 알킬화제(예를 들어, 시스-플라틴, 모노(백금), 비스(백금) 및 트리-핵 백금 착물 및 카보플라틴과 같은 백금 착물), 안트라사이클린, 항생제, 안티폴레이트, 항대사물, 화학치료 감작화제, 두오카마이신, 에토포사이드, 불소화된 피리미딘, 이온투과 담체, 렉시트로프신, 니트로소우레아, 플라티놀, 예비-형성 화합물, 퓨린 항대사물, 푸로마이신, 방사선 감작화제, 스테로이드, 탁산, 토포아이소머라제 억제제, 빈카 알칼로이드 등을 포함한다.

개별 세포독성 또는 면역억제제는 예를 들어, 안드로겐, 안트라마이신(AMC), 아스파라긴아제, 5-아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 부설판, 부티오닌 설폭스이민, 캄프토테신, 카보플라틴, 카무스틴(BSNU), CC-1065, 클로람부실, 시스플라틴, 콜히친, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 시티딘 아라비노사이드, 사이토칼라신 B, 다카바진, 닥티노마이신(이전에는 액티노마이신), 다우노루비신, 데카바진, 도세탁셀, 독소루비신, 에스트로겐, 5-플루오로데옥시우리딘, 5-플루오로우라실, 그라미시딘 D, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 로무스틴(CCNU), 메클로르에타민, 멜팔란, 6-머캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미트라마이신, 미토마이신 C, 미톡산트론, 니트로이미다졸, 파클리탁셀, 플리카마이신, 프로카비진, 스트렙토조토신, 테노포사이드, 6-티오구아닌, 티오TEPA, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, VP-16 및 VM-26을 포함한다.

일부 전형적인 실시형태에서, 상기 치료제는 세포독성제이다. 적합한 세포독성 제제는 예를 들어, 돌라스타틴(예를 들어, 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE, AEB 또는 AEVB), DNA 마이너 그루브 결합제(예를 들어, 에네디인 및 렉시트로프신), 두오카마이신, 탁산(예를 들어, 파클리탁셀 및 도세탁셀), 푸로마이신, 빈카 알칼로이드, CC-1065, SN-38, 토포테칸, 모르폴리노-독소루비신, 리족신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 에키노마이신, 콤브레타스타틴, 네트로프신, 에포틸론 A 및 B, 에스트라무스틴, 크립토피신, 세마도틴, 마이탄시노이드, 디스코데르몰리드, 엘레우테로빈, 또는 미톡산트론을 포함한다.

일부 실시형태에서, 상기 세포독성제는 통상적인 화학치료제, 예를 들어, 독소루비신, 파클리탁셀, 멜팔란, 빈카 알칼로이드, 메토트렉세이트, 미토마이신 C 또는 에토포사이드이다. 추가로, 강력한 제제, 예를 들어, CC-1065 유사체, 칼리케아미신, 마이탄신, 돌라스타틴 10의 유사체, 리족신 및 팔리톡신이 항-CD40 항체 또는 이의 제제에 연결될 수 있다.

특정 실시형태에서, 세포독성 또는 세포억제제는 아우리스타틴 E(또한 당업계에서 돌라스타틴-10으로서 공지됨) 또는 이의 유도체이다. 전형적으로, 아우리스타틴 E 유도체는 예를 들어, 아우리스타틴 E와 케토산간에 형성된 에스테르이다. 예를 들어, 아우리스타틴 E는 파라아세틸 벤조산 또는 벤조일발레르산과 반응시켜 각각 AEB 및 AEVB를 생성할 수 있다. 다른 전형적인 아우리스타틴 유도체는 AFP, MMAF, 및 MMAE를 포함한다. 아우리스타틴 E 및 이의 유도체의 합성 및 구조는 예를 들어, 미국 특허원 공보 제2004-0157782 A1호 및 제2005-0238649호; 국제 특허원 번호 제PCT/US03/24209호, 국제 특허원 제PCT/US02/13435호, 및 미국 특허 6,884,869호; 제6,323,315호; 제6,239,104호; 제6,034,065호; 제5,780,588호; 제5,665,860호; 제5,663,149호; 제5,635,483호; 제5,599,902호; 제5,554,725호; 제5,530,097호; 제5,521,284호; 제5,504,191호; 제5,410,024호; 제5,138,036호; 제5,076,973호; 제4,986,988호; 제4,978,744호; 제4,879,278호; 제4,816,444호; 및 제4,486,414호에 기재되어 있고; 상기 문헌의 기재는 본원에 참조로서 인용된다.

특정 실시형태에서, 세포억제제는 DNA 마이너 그루브 결합제이다(문헌참조: 미국 특허 6,130,237호). 예를 들어, 일부 실시형태에서, 마이너 그루브 결합제는 CBI 화합물이다. 다른 실시형태에서, 상기 마이너 그루브 결합제는 에네디인(예를 들어, 칼리케아미신)이다.

항-튜불린 제제의 예는 탁산(예를 들어, Taxol®(파클리탁셀), Taxotere®(도세탁셀)), T67(툴라리크), 빈카 알킬로이드(예를 들어, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신, 및 비노렐빈), 및 돌라스타틴(예를 들어, 아우리스타틴 E, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB)을 포함하지만 이들에 제한되지 않는다. 다른 항튜불린 제제는 예를 들어, 박카틴 유도체, 탁산 유사체(예를 들어, 에포틸론 A 및 B), 노코다졸, 콜히친 및 콜시미드, 에스트라무스틴, 크립토피신, 세마도틴, 마이탄시노이드, 콤브레타스타틴, 디스코데르몰리드, 및 엘레우테로빈을 포함한다.

일부 실시형태에서, 상기 세포독성제는 마이탄시노이드, 다른 그룹의 항-튜불린 제제이다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 마이탄시노이드는 마이탄신 또는 DM-1 (이뮤노겐 인코포레이티드(ImmunoGen, Inc.); 문헌 [Chari et al., 1992, Cancer Res. 52:127-131]도 참조)이다.

일부 실시형태에서, 상기 치료제는 방사성 동위원소가 아니다.

일부 실시형태에서, 세포독성 또는 면역억제제는 항대사물이다. 항대사물은 예를 들어, 퓨린 길항제(예를 들어, 아조티오프린 또는 미코페놀레이트 모페틸), 디하이드로폴레이트 리덕타제 억제제(예를 들어, 메토트렉세이트), 아사이클로비르, 간시클로비르, 지도부딘, 비다라빈, 리바바린, 아지도티미딘, 시티딘 아라비노사이드, 아만타딘, 디데옥시우리딘, 요오도데옥시우리딘, 포스카메트, 또는 트리플루리딘일 수 있다.

다른 실시형태에서, 세포독성 또는 면역억제제는 타크롤리무스, 사이클로스포린 또는 라파마이신이다. 추가의 실시형태에서, 세포독성제는 알데스류킨, 알렘투주마브, 알리트레티노인, 알로푸리놀, 알트레타민, 아미포스틴, 아나스트로졸, 아르센 트리옥사이드, 벡사로텐, 벡사로텐, 칼루스테론, 카페시타빈, 셀레콕시브, 클라드리빈, 다베포에틴 알파, 데니류킨 디프티톡스, 덱스라족산, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피루비신, 에포에틴 알파, 에스트라무스틴, 엑세메스탄, 필그라스팀, 플록스우리딘, 플루다라빈, 풀베스트란트, 겜시타빈, 겜투주마브 오조가미신, 고세렐린, 이다루비신, 이포스파미드, 이마티니브 메실레이트, 인터페론 알파-2a, 이리노테칸, 레트로졸, 류코보린, 레바미솔, 메클로르에타민 또는 질소 머스타드, 메게스트롤, 메스나, 메토트렉세이트, 메톡스살렌, 미토마이신 C, 미토탄, 난드롤론 펜프로피오네이트, 오프렐베킨, 옥살리플라틴, 파미드로네이트, 페가데마제, 페가스파르가제, 페그필그라스팀, 펜토스타틴, 피포브로만, 플리카마이신, 포르피머 나트륨, 프로카바진, 퀴나크린, 라스부리카제, 레블리미드, 사르그라모스팀, 스트렙토조신, 타목시펜, 테모졸로미드, 테니포시드, 테스톨락톤, 티오구아닌, 토레미펜, 토시투모마브, 트라스투주마브, 트레티노인, 우라실 머스타드, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈 및 졸레드로네이트이다.

추가의 실시형태에서, 상기 약물은 인간화된 항-HER2 단일클론 항체; RITUXAN [리툭시마브; 제넨테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.), 미국 캘리포니아주 사우스 샌프란시스코 소재; 키메라 항-CD20 단일클론 항체]; OVAREX [알타렉스 코포레이션(AltaRex Corporation, 메사추세츠주)]; PANOREX [글락소 웰컴(Glaxo Wellcome, 노스캐롤라이나주; 쥐과 IgG2a 항체]; 세툭시마브 에리비툭스(Cetuximab Erbitux) [임클론 시스템스 인코포레이티드(Imclone Systems Inc.), 뉴욕주; 항-EGFR IgG 키메라 항체); 비탁신(Vitaxin) [메드이뮨 인코포레이티드(MedImmune, Inc., 메릴렌드주)]; Campath I/H [류코사이트(Leukosite, 메사추세츠주; 인간화된 IgG1 항체)]; 스마트 MI95 [프로틴 디자인 랩스 인코포레이티드(Protein Design Labs, Inc., 캘리포니아주; 인간화된 항-CD33 IgG 항체)]; LymphoCide [이뮤노메딕스 인코포레이티드(Immunomedics, Inc., 뉴저지주; 인간화된 항-CD22 IgG 항체)]; 스마트 ID10 [프로틴 디자인 랩스 인코포레이티드, 캘리포니아주; 인간화된 항-HLA-DR 항체)]; 온콜림(Oncolym) [테크니클론 인코포레이티드(Techniclone, Inc., 캘리포니아주; 방사성 표지된 쥐과 항-HLA-Dr10 항체)]; 알로뮨(Allomune) [바이오트랜스플랜트(BioTransplant, 캘리포니아주; 인간화된 항-CD2 mAb)]; 아바스틴(Avastin)(제넨테크 인코포레이티드, 캘리포니아주; 항-VEGF 인간화된 항체); 에프라투주마브(Epratuzamab)(이뮤노메딕스 인코포레이티드, 뉴저지주, 및 암젠(Amgen), 캘리포니아주; 항-CD22 항체); 및 CEAcide (이뮤노메딕스, 뉴저지주; 인간화된 항-CEA 항체)이다.

다른 적합한 항체는 하기의 항원에 대한 항체를 포함하지만 이들에 제한되지 않는다: CA125, CA15-3, CA19-9, L6, 루이스 Y, 루이스 X, 알파 페토단백질, CA 242, 태반 알칼리성 포스파타제, 전립선 특이적 항원, 프로스타트산 포스파타제, 상피 성장 인자, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, 항-트랜스페린 수용체, p97, MUC1-KLH, CEA, gp100, MART1, 전립선 특이적 항원, IL-2 수용체, CD20, CD52, CD33, CD22, 인간 융모막의 고나도트로핀, CD38, 뮤신, P21, MPG, 및 Neu 종양 유전자 생성물.

일부 실시형태에서, 치료제는 면역억제제이다. 상기 면역억제제는 예를 들어 간사이클로비르(gancyclovir), 에타너셉트, 타크롤리무스, 사이클로스포린, 라파마이신, 사이크로포스파미드, 아자티오프린, 마이코페놀레이트 모페틸 또는 메토트렉세이트일 수 있다. 대안적으로, 면역억제제는 예를 들어, 글루코코르티코이드(예를 들어, 코티졸 또는 알도스테론) 또는 글루코코르티코이드 유사체(예를 들어, 프레드니손 또는 덱사메타손)일 수 있다.

적합한 사이클로옥시게나제 억제제는 메클로페남산, 메페남산, 카프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 펜부펜, 페노프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 나부메톤, 나프록센, 설린닥, 테녹시캠, 톨메틴, 및 아세틸살리실산을 포함한다.

적합한 리폭시게나제 억제제는 산화환원(Redox) 억제제(예를 들어, 카테콜 부탄 유도체, 노르디하이드로구아이아레트산(NDGA), 마소프로콜, 페니돈, 라노팔렌, 인다졸리논, 나파자트롬, 벤조푸라놀, 알킬하이드록실아민), 및 비-산화환원 억제제(예를 들어, 하이드록시티아졸, 메톡시알킬티아졸, 벤조피란 및 이의 유도체, 메톡시테트라하이드로피란, 보스웰산 및 보스웰산의 아세틸화된 유도체, 및 사이클로알킬 라디칼로 치환된 퀴놀린메톡시페닐아세트산), 및 산화환원 억제제의 전구체를 포함한다.

다른 적합한 리폭시게나제 억제제는 항산화제(예를 들어, 페놀, 프로파일 갈레이트, 플라보노이드 및/또는 플라보노이드를 함유하는 천연 발생 기질, 플라본의 하이드록실화된 유도체, 플라보놀, 디하이드로쿼세틴, 루테올, 갈란긴, 오로볼, 칼콘의 유도체, 4,2',4'-트리하이드록시칼콘, 오르토-아미노페놀, N-하이드록시우레아, 벤조푸라놀, 에브셀렌 및 환원 셀레노엔자임의 활성을 증가시키는 종), 철 킬레이트 제제(예를 들어, 하이드록삼산 및 이의 유도체, N-하이드록시우레아, 2-벤질-1-나프톨, 카테콜, 하이드록실아민, 카노졸 트롤록스 C, 카테콜, 나프톨, 설파살라진, 질류톤, 5-하이드록시안트라닐산 및 4-(오메가-아르알킬)페닐알칸산), 이미다졸-함유 화합물(예를 들어, 케토코나졸 및 이트라코나졸), 페노티아진 및 벤조피란 유도체를 포함한다.

또 다른 적합한 리폭시게나제 억제제는 에이코사노이드의 억제제(예를 들어, 옥타데카테트라에노산, 에이코사테트라엔산, 도코사펜타엔산, 에이코사헥사엔산 및 도코사헥사엔산 및 이의 에스테르, PGE1(프로스타글란딘 E1), PGA2(프로스타글란딘 A2), 비프로스톨, 15-모노하이드록시에이코사테트라엔산, 15-모노하이드록시-에이코사트리엔산 및 15-모노하이드록시에이코사펜타엔산, 및 류코트리엔 B5, C5 및 D5), 칼슘 흐름을 방해하는 화합물, 페노티아진, 디페닐부틸아민, 베라파밀, 푸코사이드, 쿠르쿠민, 클로로겐산, 카페산, 5,8,11,14-에이코사테트라이엔산(ETYA), 하이드록시페닐레틴아미드, 로나팔렌, 에스쿨린, 디에틸카바마진, 페난트롤린, 바이칼레인, 프록시크로밀, 티오에테르, 디알릴 설파이드 및 디-(1-프로페닐)설파이드를 포함한다.

류코트리엔 수용체 길항제는 칼시트리올, 온타졸라스트, 바이어 Bay-x-1005, 시바-가이기 CGS-25019C, 에브셀렌, 레오 덴마크 ETH-615, 릴리 LY-293111, 오노 ONO-4057, 테루모 TMK-688, 베링거 잉겔하임 BI-RM-270, 릴리 LY 213024, 릴리 LY 264086, 릴리 LY 292728, 오노 ONO LB457, 파이저 105696, 페르두 프레데릭 PF 10042, 론-포울렌 로러(Rhone-Poulenc Rorer) RP 66153, 스미스클린 비캠(SmithKline Beecham) SB-201 146, 스미스클린 비캠(SmithKline Beecham) SB-201993, 스미스클린 비캠 SB-209247, 세아를레(Searle) SC-53228, 스미토모(Sumitamo) SM 15178, 아메리칸 홈 프로덕츠(American Home Products) WAY 121006, 베이어 베이(Bayer Bay)-o-8276, 워너-램버트(Warner-Lambert) CI-987, 와너-람베르트 CI-987BPC-15LY 223982, 릴리 LY 233569, 릴리 LY-255283, 마크로넥스(MacroNex) MNX-160, 머크 앤드 코포레이션(Merck and Co.) MK-591, 머크 앤드 코포레이션 MK-886, 오노 ONO-LB-448, 퍼듀 프레데릭(Purdue Frederick) PF-5901, 론-포울렌 로러 RG 14893, 론-포울렌 로러 RP 66364, 론-포울렌 로러 RP 69698, 쉬오노오기(Shionoogi) S-2474, 세아를레(Searle) SC-41930, 세아를레 SC-50505, 세아를레 SC-51146, 세아를레 SC-52798, 스미스클린 비캠 SK 및 F-104493, 레오 덴마크 SR-2566, 타나베 T-757 및 테이진(Teijin) TEI-1338을 포함한다.

제품

다른 양태에서, 상기된 장애의 치료를 위해 유용한 물질을 함유하는 제품이 포함된다. 제품은 용기 및 표지를 포함한다. 적합한 용기는 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 및 시험 튜브를 포함한다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 병태를 치료하기에 효과적인 조성물을 유지하고, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 천공될 수 있는 스토퍼를 갖는 바이알일 수 있다. 상기 조성물내 활성제는 인간화된 항-CD40 항체이다. 용기 상에 또는 이와 함께 포함된 상기 표지는 조성물이 선택된 병태의 치료를 위해 사용됨을 지적한다. 제품은 약제학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어, 인산-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이것은 상업적 및 사용자 관점에서 요망될 수 있는 다른 물질을 추가로 포함할 수 있고, 다른 완충제, 희석제, 여과제, 바늘, 주사기 및 사용 지침서와 함께 패키지 삽입물을 포함한다.

본 발명은 하기의 실시예로 추가로 기재되지만 이는 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 : 인간화된 항-CD40 항체의 제조

쥐과 항체 20E2, 및 2H11을 상기 표 1과 2에 나타냈다. 20E2 및 2H11 클론의 인간화를 완료하였다. 인간 및 쥐과 잔기들이 임의의 소정의 위치에서 인간 또는 쥐과 잔기일 수 있도록 다양하게 하여 라이브러리를 제조하였다. 인간 생식세포 계열 및 쥐과 항체간에 서로 다른 아미노산들에 대해서 이러한 라이브러리를 제조하였다. 모체 쥐과 항체 기능을 보유하는 클론만을 선별하였다.

이렇게, 항체 A, 항체 B 및 항체 C는, 마우스 항체 20E2 (항체 A 및 항체 B) 또는 2H11 (항체 C)가 인간 IgG1-KO (KO = 녹아웃)/카파 골격으로 클로닝되어 유래된 인간화된 항체이다. IgG1-KO는 Fc 영역에 2개의 돌연변이, 즉 Leu234Ala와 Leu235Ala를 함유하여 FcγR 및 보체 결합을 감소시켰다.

상기 인간화의 결과로 하기에 나타낸 다양한 인간화된 중쇄 및 경쇄 가변 서열을 수득하였다:

서열번호 41 (가변 경쇄 서열):

서열번호 42 (가변 중쇄 서열):

서열번호 43 (가변 경쇄 서열):

서열번호 44 (가변 중쇄 서열):

서열번호 45 (가변 경쇄 서열):

서열번호 46 (가변 중쇄 서열):

서열번호 47 (가변 경쇄 서열):

서열번호 48 (가변 중쇄 서열):

서열번호 49 (가변 경쇄 서열):

서열번호 50 (가변 경쇄 서열):

서열번호 51 (가변 경쇄 서열):

서열번호 52 (가변 경쇄 서열):

서열번호 53 (가변 중쇄 서열):

서열번호 54 (가변 경쇄 서열)

서열번호 55 (가변 경쇄 서열):

서열번호 56 (가변 경쇄 서열):

서열번호 57 (가변 중쇄 서열):

서열번호 58 (가변 중쇄 서열):

서열번호 59 (가변 중쇄 서열):

서열번호 60 (가변 중쇄로 밝혀진 서열):

서열번호 61 (가변 중쇄 서열):

서열번호 62 (가변 중쇄 서열):

서열번호 63 (가변 중쇄 서열):

서열번호 64 (가변 중쇄 서열):

서열번호 65 (가변 중쇄 서열):

서열번호 66 (가변 중쇄 서열):

서열번호 67 (가변 중쇄 서열):

서열번호 68 (가변 중쇄 서열):

서열번호 69 (가변 중쇄 서열):

서열번호 70 (가변 중쇄 서열):

서열번호 71 (가변 중쇄 서열):

서열번호 72 (가변 중쇄 서열)

서열번호 73 (가변 중쇄 서열)

서열번호 74 (가변 경쇄 서열) 항체 10F2Hum 유래의 1

서열번호 75 (가변 경쇄 서열) 항체 10F2Hum 유래의 2

서열번호 76 (가변 경쇄 서열)

본 발명의 예시적인 인간화된 항체는 하기의 표에 제시된 중쇄 및 경쇄 서열을 갖는 것들이다. 하기의 표에서 굵게 밑줄친 서열은 가변 도메인들인 한편, 통상적인 밑줄치지 않은 서열은 불변 도메인들이다:

상기 가변 영역들을 1개 또는 2개의 서로 다른 적절한 IgG 발현 벡터에 서브클로닝하였다:

A) FcγR 및 보체 결합과 같은 효과기 기능을 감소시키기 위해 Fc 영역내 Leu234Ala, Leu235Ala 이중 돌연변이를 갖는 인간 IgG1-KO (녹아웃)/카파 포맷

B) IgG4 반분자의 발생을 감소시키기 위해 경첩 영역 내에 Ser228Pro 돌연변이를 가지며, FcγR 결합을 추가로 감소시키기 위해 Leu235Glu 돌연변이를 갖는, 인간 IgG4-DM (이중 돌연변이)/카파 포맷

2개의 후보 항체 A 및 항체 B를 정제하여 하기의 기준으로 평가하였다:

- CCF의 외관(탁도)

- CCF의 여과 특성

- r단백질 A에 대한 수율

- 용출 및 중화시 탁도

- 가용성 응집물(SEC)

- 순도/오염 양상(SDS)

- 하전 양상(IEF)

실시예 2: 시험관내 데이터

공개된 서열을 기준으로 제조된 항체 4D11 (Kirin/Astellas) 및 PG-102 (PanGenetics)과 함께 항체 A, 항체 B 및 항체 C에 대하여 특성을 분석하였다. 항체 A, 항체 B, 항체 C 및 4D11에 대한 데이터는 하기에 나타내었다. PG-102는 효능 활성과 B 세포 증식의 다소 불완전 억제성을 나타내었다 (나타내지는 않음). 표 2.2에 수득된 데이터를 개괄하였다. 상기 데이터에 대한 자세한 설명은 표 2.2에 이어질 것이다.

[표 2.2]

A. 세포 CD40 및 재조합 CD40 단백질에 대한 인간화된 항체의 결합

세포 CD40에 대한 인간화된 항체의 특이적 결합은 인간 CD40-형질감염된 HEK293 세포를 사용하는 유세포분석법에 의해 분석하였다. 항체 A, 항체 B 및 항체 C의 농도 의존성 결합을 관찰하였다. 상기 항체들은 유사한 결합 프로파일을 나타내었다. 본 발명의 항체 및 Kirin 항체 4D11의 EC50 값은 모두 약 1nM의 동일한 범위에 있는데, 이는 형질감염된 세포내 고수준의 CD40으로 인해 검사의 감도 한계치에 있을 가능성이 높다. 인간 라모스(Ramos) 세포 상의 세포성 CD40에 대한 인간화된 항체의 특이적 결합 역시 농도 의존성 결합을 입증하였다. 상기 항체들은 약간 상이한 결합 프로파일 및 0.21 내지 1.22 nM의 EC50 값을 나타내었다. 형질감염되지 않은 HEK293 세포 또는 T 세포주 HSB-2와 같은 CD40 음성 세포에 대해서는 어떠한 결합도 검출되지 않았으므로, 이는 CD40에 대한 선택적 결합을 확인시켜 주는 것이다 (데이터는 나타내지 않음).

인간 CD40-Fc 단백질에 결합하는 항체 A, 항체 B 및 항체 C의 친화도는 ForteBio Octet를 통해 측정하여 해리 상수(K_D)가 <100 pM임을 알 수 있었다. 항체 및 CD40-Fc 2가 결합활성의 영향으로 인해, 100 pM 미만의 Kd는 정확하게 측정되지 않는다. 또한, CD40-Fc에 대한 결합은 50% 인간 혈청의 부재 및 존재 하에 분석하였는데, 결합에 대한 혈청의 어떠한 유의한 효과도 관찰되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).

B. B 세포 활성화/증식 분석에서 인간화된 항체의 활성

인간화된 항체의 활성은, 말초 혈액에서 유도된 인간 B 세포를 IL-2 및 IL-4의 존재 하에 재조합 CD40L로 자극시키는 B 세포 증식 분석에서 시험하였다. 항체 A, 항체 B 및 항체 C는 강력한 B 세포의 증식 억제를 나타내었다. BI 항체와 Kirin 항체 4D11의 억제 곡선 및 IC50 값의 비교를 통해, 상기 4D11 항체가 다수의 공여자에 대하여 시험되는 경우 보다 높은 효능을 나타냄을 알 수 있다. CD40L 항체의 부재 하에 효능 활성에 대해 시험되는 경우, 항체 B, 항체 A 및 항체 C는 4D11 항체와 유사하게 10 ㎍/㎖ (67 nM) 이하 농도에서 기준치 수준 이상의 어떠한 B 세포 증식도 유도하지 않았다.

상기 경쟁 항체 4D11이 평균 IC50이 약 0.02 nM로 약간 더 강력한 것으로 나타났고 효능 효과가 없었다. 3개의 BI 항체 및 4D11에 대한 데이터를 상기 표 2.2에 나타내었다. 다른 경쟁 항체인 PG-102 (클론 5D12로부터 유도됨)도 상기 분석에서 시험하였는데, CD40L의 부재 하에 B 세포 증식을 자극하는 상당한 효능제 효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명자들의 리더 후보물질의 효능 활성의 결여는 이들을 PG-102와 명백히 구분짓게 한다.

제2 분석에서는, 인간 B 세포에서 CD86 상향 조절의 억제에 대해 상기 항체를 평가하였다. 이 경우, 상기 분석은 모두 외인성 CD40L의 존재 하에, 인간 전혈 또는 정제된 B 세포를 사용하여 수행할 수 있다. B 세포 증식 데이터와 일관되게, 인간 전혈에서 시험된 항체 B, 항체 A 및 항체 C는 유세포분석법으로 측정시 CD40 매개된 CD86 상향조절에 대한 강력한 억제를 나타내었다. 항체 C가 상기 분석에서 4D11과 유사한 효능을 나타내었던 반면, 항체 B와 항체 A의 효능은 다소 약했다. 정제된 B 세포 또는 전혈에서의 항체 B 및 4D11에 대한 비교를 통해, 항체 B의 효능 (IC50 및 IC90 값)이 CD40을 함유하는 다른 세포 또는 혈청의 존재 하에 B 세포에 비해 정제된 B 세포의 경우에는 비교적 변화가 없었고, 4D11은 전혈 조건 하에 효능에 급격한 변화를 나타냈음을 알 수 있었다.

사이노몰거스 원숭이 B 세포에 대한 CD86 상향 조절의 억제에 대해 전혈 샘플로 항체 B, 항체 A 및 항체 C를 평가하는 경우 유사한 데이터들이 나타났다. 사이노몰거스 원숭이 전혈에서 시험된 항체 B, 항체 A 및 항체 C는 유세포측정법으로 측정시 CD40 매개된 CD86 상향조절에 대한 강력한 억제를 나타내었다. 따라서, 이러한 항체들은 모두 인간 CD40에 대한 유사한 효능과 함께 사이노몰거스 원숭이 CD40에 대한 기능적인 교차 반응성을 나타낸다.

항체 의존적 세포성 세포독성을 매개하는 능력에 대한 항체 B IgG1 KOb 및 항체 B IgG1 WT의 활성을 평가하였다. 상기 분석에서, 라모스 세포는 효과기 대 표적 세포가 50:1인 비율에서 인간 PBMC로 항온배양하였다. 항체 B IgG1 KOb 및 항체 B IgG1 WT는 20 ug/㎖에서부터 적정하여, LDH의 방출에 의해 세포 사멸의 정도를 모니터링하였다. 나타낸 데이터들은 하나의 대표적인 실험에서 나온 것이다. 상기 데이터는 항체 A IgG1 Wt 20E2-12-RIgG1 WT가 ADCC의 효과적인 매개자이고, 효과기 기능을 제거하는 돌연변이를 함유하는 항체 B IgG1 KOb는 ADCC 활성을 보유하지 않고 있음을 보여준다.

실시예 3: 약동학적/약력학적 연구

A. 사이노몰거스 원숭이에서 1 또는 10 mg/kg의 항체 A 및 항체 B의 단회 용량 IV 투여

항체 A와 항체 B를 각각 수컷 사이노몰거스 원숭이 (N=3)에 용량당 1 및 10 mg/kg으로 IV 투여하였다. 혈액 샘플을 0 내지 504 시간 (3주간) 동안 수집하고, 혈청을 회수한 후, 샘플은 분석때까지 -20℃에서 보관하였다. 상기 샘플은 상기된 바와 같은 샌드위치 ELISA로 분석하였다. 양 항체의 IV 투여 후 원숭이의 양 항체 모두에 대한 혈청 농도-시간 프로파일과 약동학적 매개변수들을 하기 표 2.7.1 (항체 A)과 2.7.2 (항체 B)에 요약하였다. 두 항체 모두 용량 의존성 약동학을 보여주었는데, 이는 저용량에서의 소거율은 주로 표적 매개된 경향과 일관되게 나타나는 것이고, 고용량에서는 항체가 주로 이화작용에 의해 제거됨을 시사하는 것이다. 막 결합 표적들 (예를 들어, CD19, CD20, EGFR, CD146 및 HER2)을 표적화하는 다른 MAb에 대해서도 유사한 용량 의존성 약동학적 프로파일이 관찰되었다. 항체 A에 대한 소거율은 각각 1 및 10 mg/kg 용량의 경우 0.8 및 0.1 mL/h/kg이었다. 항체 B에 대한 소겨율은 각각 1 및 10 mg/kg 용량의 경우 0.7 및 0.1 mL/hr/kg이었다. 이와 유사하게, 항체 A 반감기는 각각 1 및 10 mg/kg 용량의 경우 1일 및 13일이었고, 항체 B 반감기는 동일한 각 용량의 경우 2 및 13일이었다. 항체 B가, 항체 A에 대한 동일한 각 용량에 비해 저용량에서 아주 조금 긴 반감기를 갖지만, 이러한 차이가 만성 투여시보다 지연된 노출로 해석되리라 예측할 수는 없다. 양 화합물에 대한 AUC는 초과비례하고, 양 화합물에 대한 분포 용적(Vss)은 일반적으로 거대 극성 단백질 치료제에서 나타나는 한정된 조직 분포를 나타내는 혈장 용적(약 40 mL/kg)에 근접하였다. 이를 종합해 보면, 두 항체 간에 약동학적 매개변수에 있어서 주목할 만한 차이는 없었다.

[표 2.7.1]

[표 2.7.2]

B. 생체외 약력학적 연구

상술한 PK 연구의 일부로서, 본 발명자들은 항-CD40 항체의 약력학적 효과를 분석하였다. 이러한 목적을 위해, 전혈 샘플을 밤새 재조합 CD40L과 함께 항온배양하여, B 세포상의 CD86 발현의 증가를 유세포분석법으로 측정하였다. 샘플은 투약 후 0일(치료전), 2일, 7일 및 14일째에 분석하였다. CD86 발현의 증가치가 비교적 적었지만 (약 5 내지 20%), 용량 의존성 효과는 관찰되었다. 10 mg/kg의 항체 A와 항체 B를 투여한 동물군에서, CD86 유도는 같은 용량에서 지연된 노출과 일관되게 2, 7 및 14일째에 완전히 억제되었다. 1 mg/kg을 투약한 동물은 2일째에 완전한 억제를 나타내었고, 7일째에는 부분적 억제를 나타냈고, 14일째에는 어떠한 억제도 나타내지 않았다. 시간 경과에 따른 약력학적 효과의 손실은 저용량군에서 항체의 보다 신속한 소거율과 상관관계가 있다.

실시예 4: 독성학 관련 연구: 혈소판 상의 CD40

CD40은 인간 혈소판 상에서 항시적으로 발현하며 (문헌 [Henn, et al., 2001] 및 [Inwald, et al., 2003]), CD40L은 활성화된 혈소판의 세포 표면 상에서 신속하고 일시적으로 발현된다 (Henn, et al., 2001). FcγR 결합이 없는 항-CD40 항체가 혈소판에 대해 효과를 나타낼 것으로 예상되지는 않지만, 이것이 그러한 경우임을 직접적으로 입증하는 것은 중요하다. 유세포분석 연구를 수행하여 인간 및 사이노몰거스 혈소판에 대한 항-CD40 리더 후보물질의 결합을 입증하였다.

앞서, 유세포분석법에 의해서 G28.5 및 mAb 89 항-CD40 mAb가 휴지기 인간 혈소판에 결합한다는 사실은 입증되었던 바 있다(Henn, et al., 2001). 이것은 FITC-표지된 G28.5 항체를 사용하여 확인되었다. 5배 연속 희석된 G28.5를 제조하여 0.5 ㎍/㎖ 내지 0.32 ng/㎖ 범위를, 인간 (2명의 공여자) 또는 사이노몰거스 원숭이 (3마리의 공여체)로부터 수득된 100 ㎕의 혈소판 중에서 30분간 실온에서 항온배양하였다. 추가로, APC-표지된 항-CD45 mAb를 사용하여 다른 CD40⁺ 세포 유형에 결합된 혈소판을 동정하고 이들 세포를 분석에서 제외하였다. 항체 염색 후, 혈소판을 세척하여 옵틸라이즈(Optilyse) C로 고정화시키고 유세포측정법을 수행하였다. 평균 형광 강도(MFI)는 CD45^- 혈소판에 결합하는 항체에 대한 측정치로서 측정하였다.

시판중인 5c3 및 선택된 본 발명의 항-CD40 마우스 mAb의 항체를 FITC로 표지하였다. 라모스 세포에 결합함을 확인하였다. 항체 분자당 FITC 분자의 수는 항체 분자당 2 내지 4개 범위의 FITC였다. 시판품 및 후보물질 항-CD40 mAb의 5배 연속 희석액을 0.5 ㎍/㎖ 내지 0.32 ng/㎖ 범위로 제조하여, 실온에서 30분간 인간 (3명의 공여자) 및 사이노몰거스(2마리의 공여체) 혈소판과 함께 항온배양하였다.

인간 혈소판에 대한 마우스 후보물질 항-CD40 mAb의 결합을 입증하는 대표적인 그래프는 앞서 미국 특허 8,591,900호에 나타났던 바 있다. 4개의 후보물질 단일클론 항체는 FITC-표지된 동형 대조군 항체와 비교하였을 때 인간 혈소판에 대해 특이적 결합을 나타냈다. 10F2, 2H11, 19B10 및 20E2도 이에 필적할 정도로 혈소판에 결합하였다. 유사한 경향이 사이노몰거스 혈소판에 대해서도 관찰되었다 (데이터는 나타내지 않음).

상기 연구들 이외에도, 인간 및 사이노몰거스 원숭이 전혈 샘플에서 혈소판 및 B 세포에 결합하는 능력에 대해, 직접 표지된 항체 B와 4D11을 비교하였다. 4D11은 인간 및 사이노몰거스 원숭이 혈액 샘플에서 B 세포와 혈소판에 모두 (EC50에 의해 적시된 바와 같이) 유사한 결합을 나타내었다. 항체 B는 유사한 양상을 나타냈지만 결합 효능이 훨씬 더 약했다.

실시예 5: NSG 마우스 모델에서의 생체내 약리학적 연구

이식편 대 숙주 반응을 생성시키기 위해 면역결핍 NSG 마우스에 인간 PBMC를 주사한 항체 생산 모델에서 인간화된 항체인 항체 A의 효능을 평가하였다. 인간 IgM (hIgM) 및 IgG (hIgG)의 상당량의 생성이 이식 후 2주째부터 검출될 수 있었다. 5 및 1 mg/kg 용량의 항체 A를 사용한 치료가 이식 후 2주 및 3주째에 hIgG 및 hIgM 반응을 크게 억제하였다. 비교기 항체 (4D11)도 5 mg/kg의 단일 용량에서 평가하였는데, 이 역시 반응의 저지를 입증하였다. 제2 연구에서는, 항체 A, 항체 B 및 항체 C의 모든 항체들을 1mg/kg의 단일 용량에서 시험하였는데, 2주째에 IgM 및 IgG 반응을 완전히 억제하였다.

실시예 6: 바이오마커 분석

수용체 상향 조절: 수용체의 CD40L로 유도된 상향 조절은 유세포분석법으로 측정할 수 있다. 인간 전혈은 최적화된 농도의 가용성 CD40L로 자극시킬 수 있고, CD20+수용체+세포의 전체 비율을 유세포분석법으로 측정할 수 있다. CD20 양성 세포에 대한 CD86 발현의 % 변화는 항체 A와 B를 평가하는 사이노몰거스 PK 연구와 함께 병행하여 측정하였다. 상기 데이터는 항체의 노출과 일치하는 시점에서 CD86 상향 조절의 억제를 보여준다.

표적화된 프로테오믹스: 전혈에서 CD40 자극시 단백질의 분비 증가는 잠재적인 바이오마커(들)로서 이용될 수 있다. 가용성 CD40L의 최적화된 농도 및 자극 시간은 MDC/CCL22 및 분비된 여러가지 다른 단백질들을 검출하는 루미넥스 멀티플렉스 비드 플랫폼을 사용하여 확립하였다. 임상 샘플들은 항-CD40 mAb의 완전 용량 범위에서 인간 전혈로부터 평가할 것이다.

수용체 점유율: CD40 수용체 점유율은 인간 전혈에서 B 세포의 유세포측정 분석을 기반으로 시험관내 또는 생체외 분석으로 측정할 수 있다. 본 발명의 현재 후보물질 항체 및 비경쟁 항-CD40 항체 5C3을 사용하여 수용체 점유율 분석을 정량화할 것이다.

실시예 7: 인간화된 항-CD40 항체의 항종양 활성

경우에 따라서는, 본 발명의 항체의 항종양 특성을 측정하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 측정은 SCID 마우스 림프종 이종이식 모델에서 인간화된 항-CD40 항체의 항종양 활성을 분석함으로써 수행할 수 있다. 상기 SCID 모델에 종양을 제공하기 위해 암 세포를 주사할 수 있는데, 예를 들어 5×10⁶ (백만)개의 종양 세포를 약물 처리 개시 13일 전에 SCID 마우스(10마리/군)에 피하 주사할 수 있다. 본 발명의 쥐과 항-CD40 항체 또는 비교군 (예를 들어, 대조군 또는 다른 인간화된 항체)을 1주에 복강내로 3회 주사 (4 mg/kg/용량)하고 8 또는 5 용량을 투여한다. 해당 마우스에서 종양의 발생과 증식을 모니터링하고, 종양 용적은 선택된 연구 기간, 예컨대 14일의 연구 기간 동안 매주 측정할 수 있다. 바람직하게는, 상기 결과는 본 발명의 항체로 처리된 마우스와 비교하여 대조군 마우스에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배 이상의 종양 성장 증가를 나타낼 것이다. 바람직하게는, 처리 기간 동안, 본 발명의 항체로 처리된 마우스에서의 종양 성장은 무시할 정도일 수 있다. 이러한 데이터는 시험된 인간화된 항체가 상기 B 림프종 이종이식 모델에서 종양 성장을 억제하는데 효과적임을 확증할 수 있는 것이다.

실시예 8: 인간화된 항-CD40 항체에 의한 생존 연장

상술한 것들과 같은 종양 함유 마우스의 생존에 대한 인간화된 항-CD40 항체의 효능은 SCID 마우스 림프종 이종 이식 모델에서 분석할 수 있다. 항체 치료 3일 전에 1×10⁶ (백만)개의 종양 세포로 SCID 마우스(10마리/군)를 정맥내 접종한다. 이어서, 마우스를 본 발명의 쥐과 또는 인간화된 항-CD40 항체 또는 Ig 대조군으로 처리하고, 총 5 용량으로 주당 2회 (4 mg/kg/용량) 복강내 투여한다. 이후, 상기 마우스 우리를 매일 확인하면서 치사율에 대해 조사함으로써 암에 걸린 대상자의 생존을 연장하는데 있어서 본 항체의 효능 수준을 측정할 수 있다.

특허 출원, 특허 및 과학 기술 관련 간행물을 비롯한 다양한 문헌들을 본원에 인용하여, 그 전문을 본원에 참조로 포함시킨다. 본원에 대한 임의의 참조문헌의 인용 또는 일체화는 상기 문헌들이 본 발명에 대한 선행 기술로서 이용가능함을 인정하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

실시예 9: 건강한 대상자들에서, 본 발명의 항체, 길항작용성 항-CD40 항체의 다회분 용량 상승에 대한 안전성, 약동학 및 약력학: 자가면역 질환에 대한 잠재적인 새로운 치료법

본 무작위배정, 위약 대조, 이중 맹검 연구의 목적은, 건강한 대상체에게 4주간 80, 120, 180 또는 240 mg의 본 발명의 항체를 반복적으로 주 1회 SC 투여에 대한 안전성, 내약성, 약동학 (PK) 및 약력학 (PD)에 대해 알아보는 것이다.

방법

연구 설계

본 1상 연구는 참가하는 센터의 독립된 생명윤리 위원회와 뉴질랜드 보건 당국의 승인을 받았으며, 모든 참가 대상자들에게 사전 동의서를 제공하였다. 본 연구는 베링거 인겔하임이 후원하고, 오클랜드 클리니컬 스터디스 리미티드(Auckland Clinical Studies Ltd)가 뉴질랜드의 오클랜드 소재의 한 임상시험 센터에서 수행하였다.

본 연구는 무작위배정, 위약 대조 및 이중 맹검, 용량군 내 연구였다. 본 발명의 항체의 80-240 mg의 다회분 SC 용량 상승을 건강한 대상자들에게 4주간의 치료 기간에 걸쳐 주 1회 시험하였다.

용량은 단일 용량 상승 연구의 안전성, PK 및 PD 데이터를 기초로 선택하였다. 해당 연구에서, 시험된 최대 IV 용량 (120 mg)은 내약성이 좋았고, 시험된 120 mg의 SC 용량보다 최대 관찰 농도 (C_max)가 7배 더 높고, 농도-시간 곡선 (AUC) 아래 면적이 3배 더 컸다. 이러한 PK 데이터를 기초로, 단일 용량 상승 연구에서의 120 mg IV 용량에 대한 노출이 240 mg SC 용량으로 예상되는 노출을 커버할 것으로 계산되었다.

적격인 대상자들을, 4개의 순차적 SC 용량군 (80, 120, 180 및 240 mg)에서 대화식 응답 기법을 통해 4:1의 비율로 본 발명의 항체 또는 위약을 투여받도록 무작위배정하였고, 해당 용량군들을 적어도 7일간 격리하였다. 각 용량군은 10명의 대상자들로 구성하였다 (8명은 활성 약물, 2명은 위약) (도 1). 다음 용량 수준으로 증가시킬 것인지의 여부는 안전성, 내약성, PK 및 PD 데이터에 대한 평가를 기초로 독립된 데이터 모니터링 위원회에 의해 결정되었다.

모든 대상자들은 22일째에 마지막 치료 용량을 투여받았다. 80, 120 및 180 mg의 SC 용량군의 대상자들은 마지막 투약 후 42일 동안 추적관찰하였고, 총 연구 기간은 64일이었다. 240 mg의 SC 용량군의 대상자들은 56일간 추적관찰하였고, 총 연구 기간은 78일이었다.

대상자, 연구원 및 후원사 직원들은 치료를 연구하기 위해 해당 치료에 대해 알지 못하게 하였다. 80-180 mg의 SC 용량군의 환자들이 연구를 마친 후에 초기 데이터베이스 잠금을 수행하였고, 240 mg의 SC 용량군의 완료 후에 모든 데이터를 맹검해제하였다.

PK 분석을 위한 혈액 샘플 (2.7 mL)은 유치 카테터를 사용하여 팔뚝의 정맥에서 채취하여 에틸렌디아민 테트라아세트산 삼칼륨 항응고제 튜브로 넣었다. 샘플은 투약 전; 투약 후 1, 8 및 12시간째, 1차 투약 후 1, 2, 3일째 (오전과 오후, 12시간 간격), 4일째 (오전과 오후, 12시간 간격), 5, 6, 7일째 (2차 투약 전), 14일째 (3차 투약 전), 21일째 (4차 투약 전과, 4차 투약 후 1시간 및 12시간째), 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 31, 34, 38, 42, 49, 56, 63일째 (80-180 mg 용량군만 해당) 및 77일째 (240 mg 용량군만 해당)에 수집하였다.

본 발명의 항체에 대한 항체 (ADA)의 평가를 위한 혈액 샘플은, 투약 전과 1차 투약 후 21일째 (4차 투약 전), 38, 63일째 (80-180 mg 용량군만 해당) 및 1차 투약 후 77일째 (240 mg 용량군만 해당)에 채취하였다.

혈액 샘플들을 수집한 후 즉시 얼음 위에 놓고, 샘플 수집 후 30분 이내에 4℃에서 10분간 원심분리하였다. 혈장을 2개의 폴리프로필렌 샘플 바이알 (각 0.5 mL)로 옮겨서 분석 실험실로 이송하기 전에 -20℃로 보관하였다.

PD 분석을 위한 혈액 샘플 (4.9 mL)들은, 투약 전과 1차 투약 후 3, 7일째 (2차 투약 전), 21일째 (4차 투약 전), 24, 28, 38, 63일째 (80-180 mg 용량군만 해당) 및 77일째 (240 mg 용량군만 해당)에, 유치 카테터를 사용하여 팔뚝의 정맥에서 채취하여 헤파린-항응고제 혈액 튜브에 넣고, 이들을 분석을 위해 즉시 실험실로 전달하였다. CD40 RO에 대한 분석 유효성 검증 및 CD54 상향조절 분석을 통해서, 분석 전에, 전혈을 각각 최대 24시간 및 6시간 동안 실온에 방치할 수 있었음을 알 수 있었다.

연구 참가자

체질량 지수가 18.5 내지 29.9 kg/m²인 18세에서 60세의 적격인 대상자들을 등록하였다. 여성 참가자들은, 연구 약물을 투여하기 전 30일 이상 동안, 연구 완료 후 최대 30일 동안은 폐경 후이거나, 외과적으로 불임이거나, 성관계를 절제한 상태이거나, 정관수술을 받은 섹스 파트너가 있거나, 또는 허용된 피임 방법을 실시해야 하며, 연구 전과 연구를 수행하는 동안에는 임신에 대해 음성 판정 결과가 나와야 한다.

대상자들이 건강 검진이나 실험실 검사를 통해 확인된 임상적으로 유의한 여하의 이상 징후; 수반되는 질병; 임의의 위장, 간, 신장, 호흡기, 심혈관, 대사, 면역 또는 호르몬 질환; 중추 신경계의 질병; 기립성 저혈압, 실신 또는 일시적 기억 상실; 또는 알레르기 또는 약물 과민 반응이 있는 경우에는 제외되었다. 또한, 대상체들이 무작위배정 전 30일 또는 10 반감기 미만 이내의 반감기가 긴 (t_1/2; 24시간 초과) 임의의 다른 약물을 복용한 경우; 본 연구의 첫 투약일 전 10일 이내에 연구 결과에 영향을 미칠 수 있는 약물을 복용한 경우; 연구의 첫 투약일 전 60일 이내에 임의의 임상시험용 약물을 투여받았던 경우; 연구의 첫 투약일 전 30일 이내에 헌혈한 적이 있는 경우; 약물 남용 또는 과도한 알코올 또는 담배 사용의 증거가 있는 경우; 인간 면역결핍 바이러스, B형 간염, C형 간염, 결핵, 또는 만성 또는 관련 급성 감염에 대해 양성으로 판정된 경우; 연구의 첫 투약일 전 1주 이내에 새로운 운동 요법을 시작하려고 했던 경우에도 제외되었다. 연구 완료 후 30일 이내에 수유 중이거나 임신을 계획 중인 여성들도 제외되었다.

분석 방법

본 발명의 항체의 혈장 농도는, 최저 정량 한계를 30 ng/㎖으로 한, 검증된 샌드위치 효소 결합 면역흡착 검정법 (ELISA)을 사용하여 분석하였다. 먼저, 96-웰 미량역가 측정판을 본 발명의 항체에 대한 항체로 코팅하고, 차단 및 세척하였다. 이후, 상기 측정판을 연구 샘플, 보정물질 또는 품질 관리 샘플과 함께 항온배양하고, 다시 세척하였다. 본 발명의 항체의 결합은, 본 발명의 항체에 대한 비오틴이 표지된 항체로 검출한 후, 이어서 호스래디쉬 퍼옥시다아제와 접합된 스트렙타비딘으로 검출하고, 마지막으로 퍼옥시다제 기질인 테트라메틸벤지딘으로 검출하였다. 상기 측정판을 비색 분석법으로 판독하고, 데이터를 5개의 매개변수 로지스틱 피팅으로 분석하였다. 상기 정량 범위는 30-800 ng/㎖이었다. 저농도 (50 또는 100 ng/㎖), 중간 농도 (126 또는 200 ng/㎖), 고농도 (500 또는 590 ng/㎖)의 3가지 농도의 품질 관리 샘플을 사용하여 통상적인 분석을 수행하는 동안에 정확도와 정밀도가 적절한지를 평가하였다. ELISA의 재현성은 샘플 검증 분석 (incurred sample reanalysis)에 의해 시험하였는데, 샘플의 93%가 허용 기준을 통과하였다 (평균과의 차이가 30% 이하).

본 발명의 항체는 검증된 가교 전기화학발광법법을 사용하여 혈장 샘플 중에서 분석하였다. 기록된 모든 샘플 데이터는 분석별 허용 기준을 충족하였다. ADA 분석의 유효성 검증을 통해, 250 ng/㎖의 양성 대조군 항체 ADA가 50 ㎍/㎖의 본 발명의 항체의 혈장 농도의 존재 하에 검출될 수 있었음이 입증되었다. 대상자에 있어서 진정한 양성 반응에 대해서는 추가의 역가 분석에 의해 추가로 특성을 분석하였다. 역가는 샘플의 연속 2배 희석 분석에 의해 측정하였다. 기록된 역가들은 해당 측정판별 컷 포인트보다 크거나 같은 평균 전기화학발광 값을 생성한 최고 배율 희석치였다.

본 발명의 항체 농도의 측정과 ADA 평가는 모두 코반스 래버러토리스 인코포레이티드 (Covance Laboratories, Inc.) (미국 버지니아주 챈틸리 소재)에 의해 수행되었다.

CD40 RO 측정을 위해서, 전혈 샘플을 과량의 플루오레세인-이소티오시아네이트 (FITC) 표지된 본 발명의 항체 및 항-CD19-알로피코시아닌 (APC; B 세포의 개폐용)과 함께 암실에서 실온으로 20분간 항온배양하였다. 형광 활성화 세포 분류법 (FACS) 용해 용액을 첨가하여 튜브들을 암실에서 실온으로 15분간 항온배양한 후, 4℃에서 6분 동안 원심분리 (1300 rpm)하고 상청액을 제거하였다. CellFix를 첨가하고, 튜브들을 볼텍싱하여 암실에서 4℃로 FACS 분석시까지 보관하였고, 상기 분석은 CellFix 첨가 후 24시간 이내에 수행하였다. 모든 샘플들은 측정하는 중에도 얼음 위에 놔두었다.

CD54 상향조절에 대한 억제 측정을 위해서, 전혈을 인터루킨-4 (IL-4) 단독 ("자극시키지 않은 FACS 튜브"), 또는 MegaCD40L + IL-4 ("자극시킨 FACS 튜브")와 함께 항온배양하였다. 상기 튜브들을 볼텍싱하여 가습된 항온배양기 중에서 어둡게 하여 37℃로 23-26시간 동안 항온배양하였다. 항-CD19-APC 및 항-CD54-피코에리트린 (PE)을 각 튜브에 첨가하고, 튜브들을 볼텍싱하여 암실에서 실온으로 20분간 항온배양하였다. FACS 용해 용액을 첨가하여 튜브들을 암실에서 실온으로 15분간 항온배양한 후, 4℃에서 6분 동안 원심분리 (1300 rpm)하고 상청액을 제거하였다. CellFix를 첨가하고, 튜브들을 볼텍싱하여 암실에서 4℃로 FACS 분석시까지 보관하였고, 상기 분석은 CellFix 첨가 후 2시간 이내에 수행하였다. 모든 샘플들은 측정하는 중에도 얼음 위에 놔두었다.

상기 CD40 RO 및 CD54 상향조절 분석은 모두 준정량적이었다. 분석 결과들은 비율 변화를 기반으로 하였다 (즉, 적극치료 샘플들은 투약 전 샘플과 관련되어 있음).

혈전색전증 발생의 가능성을 조사하기 위해, 아래의 평가들을 수행하였다: 프로트롬빈 시간-국제 표준화 비율 (PT-INR), 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT), 항트롬빈 III, 피브리노겐, 단백질 S 및 C, 혈소판 계수, 출혈 시간 (Duke 법으로 측정함) 및 D-이량체.

약동학적 평가

본 발명의 항체에 대한 혈장 농도-시간 데이터는 WinNonlin™ (버전 5.02, 미국 노스캐롤라이나주 게리 소재)을 이용하는 비구획 접근법으로 분석하였다. 측정된 매개변수들은 하기를 포함하였다: C_max, C_max를 달성하는 데 걸리는 시간 (t_max), 최종 소실 상수 (λz) 및 최종 t_1/2 (표준 WinNonlin™ 절차를 사용). 마지막 (4차) 투약 후 균일한 투약 구간 τ 동안의 농도-시간 곡선 아래 면적 (AUC_0-τ)은 WinNonlin™의 선형 업 로그-다운 (linear-up log-down) 알고리즘을 사용하여 계산하였다. 누적 비율 (C_max에 기반한 R_A,Cmax; AUC_0-τ에 기반한 R_A,AUC)은 첫 투약 후 값에 대한 4차 투약 후 값의 비율로 계산되었다.

약력학적 평가

상술한 유효성 검증 FACS 분석을 이용하여 전혈에서 megaCD40L 유도된 CD54의 상향조절에 의해 측정된 바와 같이, 약력학적 평가에는 본 발명의 항체에 의한 CD40 RO 및 B 세포 활성화의 억제에 대한 평가가 포함되었다. 본 발명의 항체 용량과 CD40 RO 및 CD54 상향조절의 억제 사이의 관계는, 이전에 문헌 [Albach et al. Eur J Clin Pharmacol. 2018;74(2):161-169]에서 표준 S자형 E_max 모델을 사용하여 연구되어 보고된 바 있다.

안전성 및 내약성

본 발명의 항체의 안전성과 일반적인 내약성에 대해서는, 치료 중 발생한 이상 반응 (AE), 신체 검사, 활력 징후 (혈압 및 맥박), 12-전극(lead) 심전도 (ECG) 및 임상 실험실 시험 (혈액학, 임상 화학 및 소변 검사)을 모니터링하여 평가하였다.

통계 분석

정식 샘플 크기 측정은 수행하지 않았다. 용량군당 8명의 대상자들이면 PK 및 안전성 분석에 충분한 것으로 간주하였다. 연구 결과는 안전성, PK 및 PD에 대한 기술 통계학을 사용하여 분석하였다. 안전성 모집단은 연구 약물 (본 발명의 항체 또는 위약)을 투여받은 모든 대상자들을 포함하였다. 상기 PK 및 PD 모집단에는 각각 연구 약물을 투여받아 PK 및 PD 분석에 평가가 가능한 데이터를 제공한 모든 대상자들이 포함되었다. 4차 투약 후 AUC_0-τ 및 C_max의 용량 비례성은 거듭제곱 모형을 사용하여 평가하였다. 기울기에 대한 95% 신뢰 구간 (CI)을 계산하였다. 완벽한 용량 비례성은 1의 기울기 매개변수 (β)로 정의하였다. 농도 데이터에 대한 그래프 제시를 포함하는 묘사 분석을 수행하여 정상 상태가 달성되었는지의 여부를 평가하였다.

결과

대상자

총 40명의 건강한 대상자들을 무작위로 선정하여 본 연구에서 치료하였다. 대상자들은 4주간의 기간 동안 반복하여 위약 (n = 8), 80 mg의 본 발명의 항체 (n = 8), 120 mg의 본 발명의 항체 (n = 8), 180 mg의 본 발명의 항체 (n = 8), 또는 240 mg의 본 발명의 항체 (n = 8)를 사용하여 주 1회 SC 치료를 받았다. 40명의 대상자들 모두 예정된 관찰 기간을 완료하였으며 조기 중단은 없었다. 대부분의 대상자들은 남성 (83%)과 백인 (73%)이었고, 평균 (표준 편차 [SD]) 연령은 30세 (10.8세), 평균 (SD) 체질량 지수는 25 (3.1) kg/m²이었다. 치료군들 간에는 관련된 인구통계학적 차이가 없었다.

약동학

1차 SC 용량 (1일째) 및 마지막 SC 용량 (4차) 투여 후 본 발명의 항체에 대해 선택된 PK 매개변수들의 기하 평균 (gMean)을 표 9.2에 나타내었다. 1차 투약 후에 중앙값 t_max는 매주 투약할 때마다 증가하였으나, t_max는 4차 투약 후에는 어떠한 용량 관계도 뚜렷하게 나타내지 않았다 (t_max, 4). 투여된 용량에 대해 정규화된 최대 혈장 농도 및 AUC (각각 C_{max, norm}, 4 및 AUC_{τ, norm}, 4)는, 본 발명의 용량군 중 80 mg의 항체의 경우에 더 낮았고, 3개의 고용량군에서는 유사하였는데, 이는 80 mg 내지 120 mg의 노출의 경우에는 비례적으로 증가하는 것을 초과하지만, >120 mg의 용량의 경우에는 용량 비례 역학에 가까운 것임을 시사하는 것이다. C_max 또는 AUC에 기반한 기하 평균 축적 비율 (각각 R_{A, Cmax}, 4 및 R_{A, AUC}, 4)을 측정하여 4회의 다회분 투여 후 본 발명의 항체의 축적에 대해 평가하였다. 4번의 주 1회 80 mg SC 투약 후, R_{A, Cmax}, 4 및 R_{A, AUC}, 4의 값은 각각 단회 용량 후보다 8.3배와 11.6배가 더 컸는데, 이는 본 발명의 항체가 축적되었음을 의미한다. gMean 축적은 3개의 고용량의 경우에 더 적었다 (범위: R_{A, Cmax}, 4의 경우 3.7-4, R_{A, AUC}, 4의 경우 4.9-5.8). 본 발명의 항체의 최종 t_1/2 범위는 156 내지 199시간 (6-8일)이었다. 최저 농도의 육안 검사를 통해 어떤 용량에서도 정상 상태가 달성되지 않았음을 알 수 있었다: 모든 용량군에서의 최저 혈장 농도는 각 후속 투약에 따라 계속 증가하였다 (도 2).

[표 9.2]

SC 용량 범위 80-240 mg에 대한 용량 비례성 분석에서, C_max 및 AUC0-τ의 기울기가 1에서 크게 벗어난 것으로 나타났는데, 이는 본 발명의 항체 노출이 용량에 비례하지 않음을 시사한다 (C_max: 거듭제곱 모형 기울기 β = 1차 투여 후 2.1 [95% CI 1.2-2.9]; 기울기 β = 마지막 투여 후 1.4 [95% CI 1.1-1.8]; n = 32; AUC_0-τ: 기울기 β = 마지막 투여 후 1.4 [95% CI 1.1-1.8]; n = 32). 그러나, 고용량 (120-240mg)의 경우에는 용량 비례성 경향이 관찰되었다.

약력학

본 발명의 항체의 투여는 용량 의존성 CD40 RO 및 CD54 상향조절의 억제를 유도하였다 (도 3).

본 발명의 항체의 단회 SC 투여 후, 산술 평균 CD40 RO는 1차 투약 후 측정시 (72시간) 각 용량 수준에 대하여 거의 최대값을 이미 달성하였다 (도 3a). 이 시점에서, 80 mg 용량은 약 89%의 CD40 RO를 유도하였다. 120-240 mg 용량군의 경우, CD40 RO는 94-95%에서 안정 상태를 유지하였는데; 이것이 분석 검출 한계였기 때문에, 더 높은 점유 수준이 달성될 수 있었는지의 여부는 확인할 수 없었다. 이러한 CD40 RO 수준은 나머지 연구 기간 동안에도 유지되었다.

본 발명의 항체의 마지막 (4차) 주 1회 SC 투여 후, CD40 RO는 모든 투여량 (80-240 mg)에서 39일째 (마지막 투여 후 17일째)까지 모든 측정 시점에서 >90%였다. 180 mg 용량군의 경우, 79% (기하 변동 계수 [gCV] 23%) CD40 RO가 64일째에도 여전히 측정가능하였고, 240 mg 용량군의 경우에는 68% (gCV 29%) CD40 RO가 78일째에 측정가능했는데, 이는 수용체에 대한 장기간의 지속적인 결합을 시사하는 것이지만, 이보다 이후의 시점에서는 변동성이 더 커졌다. 위약군에서는 주목할 만한 CD40 RO가 관찰되지 않았다.

본 발명의 항체의 단회 용량 투여 후 CD54 상향조절의 억제는, CD40 RO에서 관찰된 것과 유사한 양상을 보였으며, 상기 80 mg 용량은 1차 투여 후 측정시 (72시간째) 87% 억제를 나타냈고, 이 시점에서 고용량의 경우에는 >90% 억제가 관찰되었다 (모든 용량군; 도 3b). 80 mg 용량군의 경우, 억제는 투여 후 7일째에 95%로 더 증가했던 반면, 다른 모든 용량의 경우에는 72시간째 이후부터 계속 95% 억제가 관찰되었으며; 위약군에서는 CD54 상향조절의 억제가 -20% 내지 30% 사이에서 변화를 보였다. 본 발명의 항체의 마지막 (4차) 주 1회 SC 투여 후, CD54 상향조절의 억제는 모든 투여량에서 39일째 (마지막 투여 후 17일째)까지 >90%였다. 억제 효과는 180 mg 군 (64일째에 89%)과 240 mg 군 (78일째에 51%)의 경우에 여전히 측정가능했다.

안전성

AE의 전반적인 빈도와 강도는 본 발명의 항체 치료군에서 유사하였다 (본 발명의 모든 항체 용량 [78%] 및 위약군 [88%]). 심각한 AE, 중증 AE, 또는 중단이나 사망을 초래하는 AE는 보고된 바 없었다. 대상자들의 수는 적었으나, 본 발명의 항체 용량, 치료 관련 AE 또는 AE의 빈도와 강도 간에는 어떠한 관계도 없는 것으로 보였다. 본 발명의 항체를 투여받은 8명의 대상자들 (25%)과 위약을 투여받은 5명의 대상자들 (63%)에서 감염이 보고되었다. 혈전색전증 발생은 없었다. 본 발명의 항체를 투여받은 4명의 대상자들 (13%)과 위약을 투여받은 2명의 대상자들 (25%)에서 가장 빈번하게 보고된 치료 관련 AE는 두통이었다. 모든 AE는 강도가 경증이나 중등증으로, 모두 해결되었다.

80 mg 및 120 mg의 치료군의 각 대상자들에서, 치료전과 본 발명의 항체 또는 위약으로 치료한 후에 크레아틴 키나아제 (CK)의 실질적인 상승이 관찰되었다 (정상 상한치 [ULN]의 1.1-88배 범위). 전반적으로, 이러한 CK 상승은 일반적으로 광범위한 운동에 연유한 것으로 판단되었다. 고용량군 (180-240 mg)의 경우 보다 엄격한 운동 제한을 시행하였더니 CK 수준이 감소하였다 (최대 ULN의 3배).

본 발명의 항체로 치료를 받은 모든 대상자들 중에서 경증 및 일과성 백혈구 감소증과 호중구 감소증이 각각 12명 (37.5%)과 14명 (43.8%)의 대상자들에서 관찰되었다. 위약을 투여받은 단 1명의 대상자만이 경증 및 일과성 호중구 감소증을 나타냈다. 치료를 받기 전에 경증 일과성 백혈구 감소증이 있는 12명의 대상자들 가운데 4명 (33.3%)과 경증 일과성 호중구 감소증이 있는 14명의 대상자들 가운데 5명 (35.7%)에서 정상 하한치 (LLN) 미만의 값이 관찰되었다. 모든 대상자들에서, 백혈구 (WBC) 및 절대 호중구 수가 정상치 (WBC 정상 범위: 4-11×10⁹/L, 절대 호중구 정상 범위: 1.9-7.5×10⁹/L)로 복귀하였거나, 또는 연구 종료시까지 치료전 수준에 도달하였지만, 연구 종료 방문시 3.77×10⁹/L의 WBC 수를 나타낸 1명의 대상자와 연구 종료 방문시 각각 3.58×10⁹/L 및 1.69×10⁹/L의 적은 WBC 수와 절대 호중구 수를 나타낸 또 1명의 대상자는 예외적으로 그렇지 못했다. 또한, 본 발명의 항체 용량을 증가시켜도 백혈구 감소증 또는 호중구 감소증이 있는 대상자들의 수는 증가하지 않았다.

출혈 시간, 혈소판 수, 또는 D-이량체, 항트롬빈 III, 피브리노겐 및 단백질 S와 C를 비롯한 응고 매개변수에서도 임상적으로 유의한 변화는 없었다.

활력 징후, ECG 또는 신체 검사와 관련하여 그룹 간에 임상적으로 관련된 소견이나 치료의 차이가 없었다. 국소 내약성의 평가를 통해, 본 발명의 항체의 모든 용량이 내약성이 좋았고, 위약군과 비교하여 차이가 없음을 알 수 있었다.

기존의 ADA 반응은 4명의 대상자 (10%)에서 관찰되었는데, 이들 중 3명은 이후에 본 발명의 항체를 투여받았고 1명은 위약을 투여받았다. ADA 역가는 본 발명의 항체 240 mg을 투여한 이들 중 단 1명에서만 증가하였다 (치료로 증강된 ADA [생물제제 투여 후 더 높은 수준으로 증가된 기존의 ADA]).

혈청전환은 본 발명의 항체 치료 후 16명의 대상자들 (50%)에서 관찰되었는데; 주로 연구 종료 샘플에서 개시하였다 (15명의 대상자들 [47%]). 그 당시에, 본 발명의 항체 수준은 이미 매우 낮았다 (본 발명의 항체의 gMean 혈장 농도는 80-240 mg 용량군의 경우 0.182-10.5 ㎍/㎖ 범위였음).

치료로 유도된 ADA (생물제제 투여 후 새로 발생된 ADA) 또는 치료로 증강된 ADA 반응은, 80 mg 용량군에서 5명의 대상자들 (62.5%)과 120 mg 용량군에서 6명의 대상자들 (75%)에서 관찰되었다. 80 mg 및 120 mg 용량군의 전체 중앙값 역가는 각각 20과 8이었다. 치료로 유도되거나 치료로 증강된 ADA 반응은, 고용량군에서는 더 적은 대상자들: 180 mg 및 240 mg 용량군에서 2명 (25%) 및 4명 (50%)의 대상자들에게서 관찰되었고, 전체 중앙값 역가는 각각 4와 8이었다. 각 대상자들에서 최대 역가는 120 mg 용량군에서 관찰된 640이었다.

논의

본 연구의 목적은 건강한 대상자들에서 본 발명의 항체의 SC 용량 상승 (주당 80-240 mg)에 대한 4주간의 효과를 살펴보려는 것이었다. PK 매개변수에 대한 평가는 본 발명의 항체 120-240 mg의 SC 용량에 있어서 거의 비례하는 동역학을 시사하였으나, 본 발명의 항체의 단일 IV 투여 후, 선행 연구에서 관찰된 바와 같이, 표적 매개된 약물 소거로 인해 80-120 mg의 SC 용량에 있어서 초과비례성 동역학을 나타났다. 상기 효과는 CD40 수용체 (특히 짧은 t_1/2를 갖는 혈소판)의 광범위한 분포에 의해 증강되며, 길항작용성 항-CD40 항체에 대한 다른 연구에서도 이미 보고된 바 있다. (1차 및 마지막 투여 후) C_max 및 (마지막 투여 후) AUC_0-τ에 대한 본 발명의 항체의 SC 투여량 범위 120-240 mg에서 거의 비례하는 용량-노출 관계가 관찰되었고, 양 매개변수의 경우 기울기 β = 1.2인데, 이는 아마도 CD40 RO가 이러한 용량에서 거의 포화상태로 되었음을 시사하는 것이다. 80 mg 및 120 mg의 본 발명 항체의 1차 SC 투여 후에 본 연구에서 달성된 혈장 노출은, 건강한 지원자를 대상으로 한 이전의 단일 용량 상승 연구에서 관찰된 것과 유사했으며, 여기서 120 ㎍ · h/㎖ 및 888 ㎍ · h/㎖의 gMean AUC 값은 각각 본 발명의 항체의 80 mg과 120 mg의 단회 SC 투여 후에 수득되었다. 본 발명의 항체의 축적은 단일 용량 (1차 투여) 투여에서보다 다회분 투여 후 모든 용량 수준에서 관찰되었다. 그러나, 120-240 mg 용량의 경우에 더 낮은 축적이 관찰되었는데, gMean R_{A, Cmax} 값은 3.7 내지 4였고, gMean R_{A, AUC} 값은 4.9 내지 6으로 비교적 일정하였다. 투여된 어떤 용량에서도 4주 이내의 기간에 정상 상태에 도달하지 못했다. 모델링을 통해서, 본 발명의 항체 120 mg을 주 1회 투여하는 경우, 정상 상태에 도달하는 데 최대 12주가 걸릴 수 있음을 알 수 있었다 (원고 준비중). 약 12주 이내에 정상 상태에 도달할 것이라는 예측은, 류머티스 관절염 환자를 12주간 120 mg의 본 발명의 항체를 주 1회 SC 투여하는 치료에서, PK 정상 상태가 약 10-12주 이내에 달성된 점으로부터 확인하였던 것이다. 따라서, 이 사실은 향후 임상 연구에서 보다 신속하게 정상 상태에 도달하기 위한 부하 용량의 사용을 뒷받침하는 것이다. 노출 매개변수 AUC 및 C_max의 경우, 개인간 변동성은 80 mg 용량에서 더 높았고 (gCV: 56.4-59.1%), 120 mg 및 180 mg 용량에서 중간 정도였으며 (gCV: 35.4-37.4%), 240 mg 용량에서 더 낮았다 (gCV: 21.9-22.4%). 본 발명의 항체는 SC 주사 부위에서부터 서서히 흡수되었으며, 중앙값 t_max는 1차 투여 후 용량에 따라 증가하였고; 4차 투여 후에는 t_max, 4와 용량 관계를 나타내지 않았다. 본 발명의 항체의 다회 투여 후, 추정된 최종 t_1/2는 6일 내지 8일 범위였고, 용량 간에 명확한 차이는 없었다.

CD40 RO 및 CD54 상향조절의 억제에 대한 평가는, 120 내지 240 mg의 본 발명의 항체의 단회 SC 용량이, 투여 후 72시간부터 >90%의 CD40 RO 및 >90%의 CD54 상향조절 억제를 유도하였음을 시사하였다. 본 발명의 항체의 마지막 (4차) 투여 후, >90%의 CD40 RO 및 CD54 상향 조절의 억제는 SC 용량 범위 80-240 mg의 투여 후 적어도 408시간 (17일) 동안 유지되었다. 이러한 결과는 본 발명의 항체를 격주로 SC 투여하여 작용성 CD40 결찰에 대한 계속적인 완전한 억제의 가능성을 시사하는 것이다. 모델링을 통해서, 본 발명의 항체 120 mg을 3주간 주 1회로 SC 투여한 후, 매 2주마다 1회 투여하였더니, 계속적인 >90%의 CD40 RO를 유도하였음을 알 수 있었다. 류머티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스 또는 루푸스 신염과 같은 염증성 질환이 있는 환자에서, CD40 수용체는 다양한 면역 세포들과 상주 세포들 (예컨대, 루푸스 신염의 혈관 사이 세포)에서 매우 잘 발현되고 상향 조절될 것이므로; 자가면역 질환이 있는 환자에서 CD40 수용체를 완전히 차단하기 위해서는 건강한 대상자들의 B 세포에서 90% 수용체 점유율을 유도했던 것들보다 더 높은 본 발명의 항체 용량이 필요할 수도 있을 것으로 예상된다. 이러한 환자들에서의 본 발명의 항체에 대한 임상 연구는, 더 긴 투약 구간도 임상 효능을 달성할 수 있을지의 여부 또는 매주 투약이 필요한지의 여부에 대해서도 평가할 필요가 있을 것이다.

본 발명의 항체의 다회분의 SC 상승 용량은 안전한 것으로 생각되었으며, 건강한 대상자들에서도 전반적으로 우수한 내약성을 나타냈다. 모든 AE는 강도가 경증 또는 중등증이었고, 연구 중단으로 이어지는 AE도 보고되지 않았다. ULN 초과로 상승된 혈청 CK 값은 본 발명의 항체군과 위약군 모두에서 치료 전과 치료 후 일부 대상자들에게서 보고되었긴 하지만, 이는 과도한 운동에서 연유한 것으로; 이전에 문헌에 보고되었던 것과 유사하다. 180 mg 및 240 mg 용량군에 대하여 보다 엄격한 운동 제한을 시행한 결과, CK 농도가 감소하였다. 몇 명의 대상자들은 본 발명의 항체로 치료한 후 경증 및 일과성 백혈구 감소증 및 호중구 감소증을 나타냈다. 그러나, 백혈구 감소증이 있는 대상자들의 33.3%, 호중구 감소증이 있는 대상자들의 35.7%에서 치료 전에 LLN 미만의 값이 이미 각각 관찰되었던 바 있다. 일과성 호중구 감소증은 건강한 대상자들에게서는 매우 흔하고, 경우에 따라서는 동시적 바이러스 감염과 관련이 있다. 호중구 감소증은 고강도 스포츠를 행하는 대상자들에게서 이전에 보고되었던 바 있으며, 본 연구에 등록된 대부분의 대상자들은 혈청 CK 값의 상당한 상승치로 뒷받침되는 바와 같이 강도 높은 신체 활동을 수행했었다. 또한, 최근에는 운동으로 유발된 근육 손상이 빠른 국소 염증 반응을 일으키며 백혈구의 국소적 축적이 근육 약화와 관련이 있음이 밝혀졌다. 본 연구에서 관찰된 CK 수준의 상승은 이러한 대상자들이 약간의 근육 손상이 있었음을 의미하므로; 순환계로부터 근육으로의 백혈구 재분배가 상기 관찰된 일과성 백혈구 감소증과 호중구 감소증에 기여했을 수 있다. 이를 종합하면, 상기 관찰된 호중구 감소증과 본 발명의 항체를 사용한 치료 간에는 명확한 관계가 없다. 그러나, WBC와 호중구에서의 변화는 본 발명의 항체를 이용한 후속 임상 연구에서 주의 깊게 모니터링될 것이다.

임상적으로 유의미한 활력 징후, ECG 평가 또는 신체 검사 결과들은 보고된 바 없었다. 본 발명의 항체의 단일 IV 및 SC 용량의 투여 후 관찰된 것들과 일관되게, 다회분 투여 동안에는 혈전색전증 발생이 보고된 바 없었으며, 혈소판 또는 응고 매개변수에서 임상적으로 유의한 변화도 없었다. 앞서, 인간 혈소판을 이용한 혈소판 응집검출 및 결합 연구에 대한 조사는 CD40 차단이 혈소판 기능에 명백한 영향을 미치지는 않았던 것으로 나타났고 (미공개 데이터); 독성학 연구에서는, 사이노몰거스 원숭이의 혈소판에 결합된 본 발명의 항체가 혈소판 수나 기능에 영향을 미치지 않는다는 점도 입증되었던 바 있다. 이를 종합해 보면, 이러한 결과들은 본 발명의 항체가 혈소판에 결합되는 경우에 혈소판 활성화, 응집 또는 기능을 변화시키지 않을 것임을 시사하는 것이다. 이러한 데이터들과 기능적 Fc 영역이 결여된 다른 항-CD40 또는 항-CD40L 항체의 데이터들은, 앞서 항 CD40L 항체들에서 관찰되었던 바와 같이, 혈전색전증 발병의 위험은 항체의 Fc 기능을 제거함으로써 피할 수 있다는 해석을 뒷받침한다.

본 발명의 항체를 투여받은 대상자들 중 50%에서 치료로 유도되거나 치료로 증강된 ADA 반응은, 어떠한 임상 증상도 일으키지 않았거나 (AE와의 관계가 없거나 노출 변화가 없음), 또는 다회분 투여 후 PK의 관측가능한 변화를 나타내지 않았다. 백혈구와 호중구의 수는 영향을 받지 않아서, 정상 범위 내에 있거나 2명의 대상자를 제외하고는 치료 전 수준에 도달하였다 (이 2명의 대상자들은 ADA에 대해 음성이었다). 고용량군 (180 mg 및 240 mg)의 경우보다 80 mg 및 120 mg 용량군에서 ADA가 더 많이 발생하였다. 본 발명의 항체 혈장 농도는 ADA 반응의 개시 시점 (연구 종료 방문)에 분석의 최저 정량 한계에 근접하였고; 본 발명의 항체는 대부분이 제거되었으며, 본 발명의 항체의 순환 수준은 ADA 분석의 내약성 미만이었다. 또한, 본 연구에서 소수의 대상자들은 본 발명의 항체 용량 또는 ADA 발생 또는 역가에 대한 최종적인 평가가 이루어지지 않았다. 본 발명의 항체가 CD40 수용체를 억제하여 항체 생성을 차단하는 기전에 의한다면, 본 발명의 항체 투여 및 항체 동위원소 전환 후 ADA의 발생은 예상될 수 없을 것이다. 1512시간 (63일) 시점 (80-180 mg 용량군) 또는 1848시간 (77일) 시점 (240 mg 용량군)에서 CD40 RO는 이미 90% 미만으로 감소하였다. 더욱이, 본 발명의 항체 수준은 배중심에서 훨씬 더 낮을 것으로 예상되므로; 본 발명의 항체의 농도는 너무 낮아서 ADA의 형성을 차단할 수 없었을 것이다. 또한, 본 가설은 사이노몰거스 원숭이에서 본 발명의 항체를 사용한 임상전 평가에 의해서도 뒷받침되는데, 여기서 모든 용량은 말초성 B 세포에 대해 >90%의 CD40 RO를 나타냈으나, 최저 용량군 (1 mg/kg)은 배중심에 대한 완전한 약리 효과를 나타내지 못하고 ADA를 발생시키기 되었다 (21 및 미공개 데이터)

결론

건강한 대상자들에게 4주간에 걸쳐 다회분의 주 1회 SC 본 발명의 항체 용량을 상승시킨 후, PK는 80 mg 내지 120 mg의 용량의 경우에는 표적 매개된 소거로 인해 초과비례적으로 증가했으나, >120 mg의 용량의 경우에는 거의 비례하였다. 본 발명의 항체의 용량 의존적 축적은 향후 임상 연구에서 곧바로 정상 상태를 달성하기 위한부하 용량의 사용을 뒷받침한다. 본 발명의 항체는 CD40L로 유도된 CD54 상향조절을 지속적으로 억제하면서 CD40-CD40L 경로를 차단할 가능성이 높은 것으로 나타났다. 따라서, 향후 연구에서는 투약 구간을 더 길게 하여도 류머티스 관절염, 전신 홍반성 루푸스 또는 루푸스 신염과 같은 자가면역 질환을 앓고 있는 환자들에서 임상적으로 효율적일 수 있을지의 여부에 대해서도 평가할 필요가 있을 것이다. 80-240 mg 범위에 걸쳐서 본 발명의 항체의 다회분 SC 용량을 상승시키는 것은 일반적으로 내약성이 좋았고, 급성 면역 반응에 관련된 징후들도 관찰되지 않았다.

본원에 개시된 교시내용의 활용은 본 명세서에 기재된 특정 실시양태들에 의해 범위가 한정되지 않는다. 실제로, 본원에 포함된 교시내용과 이에 수반되는 실시예들을 감안하여 당업자의 역량 내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있을 것이다. 이러한 변형들도 첨부된 청구항의 범위 내에 포함시키고자 한다.

<110> Steffgen, Juergen Theodor Hilbert, James Michael Joseph, David P. Ravva, Patanjali <120> Anti-CD40 Antibodies <130> 09-0684 <150> 62/691,766 <151> June 29, 2018 <160> 78 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40 Murine Lead VH Sequence of 2H11 <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Val His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Ser Lys Tyr Ala Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40 Murine Lead VH Sequence of 10F2 <400> 2 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala 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Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 72 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Sequence Version 6 from Antibody 10F2Hum <400> 72 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Lys Ala Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 73 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Heavy Sequence Version 7 from Antibody 10F2Hum <400> 73 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Gly Asp Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 74 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Light Sequence Version 1 from Antibody 10F2Hum <400> 74 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Leu Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Phe Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 75 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Light Sequence Version 2 from Antibody 10F2Hum <400> 75 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Leu Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Phe Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 76 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Variable Light Sequence Version 3 from Antibody 10F2Hum <400> 76 Gln Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 Leu Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Trp Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Thr Phe Tyr Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 77 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 for 2H11, 10F2 and 19B10 <400> 77 Thr Thr Ser Tyr Tyr Val Gly Thr Tyr Gly Tyr 1 5 10 <210> 78 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy Chain CDR3 for 20E2 <400> 78 Ala Arg Gln Asp Gly Tyr Arg Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10

Claims (7)

1. 부하 용량을 포함하는 치료적 유효량의 항-CD40 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 자가면역질환을 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 항-CD40 항체가
   a) 서열번호 9 내지 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 12 내지 서열번호 15로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR2 서열, 및 서열번호 16 내지 서열번호 17로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 CDR3 서열; 및
   b) 서열번호 18 내지 서열번호 21로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR1 서열, 서열번호 22 내지 서열번호 23으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR2 서열, 및 서열번호 24 내지 서열번호 25로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 CDR3 서열
   을 포함하는 것인, 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 항체가 서열번호 10의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 13의 중쇄 CDR2 서열 및 서열번호 16의 중쇄 CDR3 서열을 포함하고; 상기 항체가 서열번호 19의 경쇄 CDR1 서열, 서열번호 22의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 것인, 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 항-CD40 항체가 서열번호 9의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 14의 중쇄 CDR2 서열 및 서열번호 16의 중쇄 CDR3 서열을 포함하고; 상기 항체가 서열번호 20의 경쇄 CDR1 서열, 서열번호 22의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 24의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 것인, 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 항-CD40 항체가 서열번호 11의 중쇄 CDR1 서열, 서열번호 15의 중쇄 CDR2 서열 및 서열번호 17의 중쇄 CDR3 서열을 포함하고; 상기 항체가 서열번호 21의 경쇄 CDR1 서열, 서열번호 23의 경쇄 CDR2 서열 및 서열번호 25의 경쇄 CDR3 서열을 포함하는 것인, 방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 항-CD40 항체가
   서열번호 44의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 43의 경쇄 가변 영역;
   서열번호 53의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 52의 경쇄 가변 영역; 또는
   서열번호 58의 중쇄 가변 영역 및 서열번호 56의 경쇄 가변 영역
   을 포함하는 것인, 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 항-CD40 항체가
   서열번호 30의 중쇄 및 서열번호 26의 경쇄;
   서열번호 35의 중쇄 및 서열번호 31의 경쇄; 또는
   서열번호 40의 중쇄 및 서열번호 36의 경쇄
   를 포함하는 것인, 방법.

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