BRPI0610470A2 - anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antìgeno que especificamente se liga a cd40 humano, kit, composição farmacêutica, e, polinucleotìdeo isolado - Google Patents

Abstract

São providos anticorpos anti-CD40 humanizados e fragmentos de ligação a antígeno e métodos para o tratamento de doenças caracterizadas pela expressão de antígeno CD40.

Description

"ANTICORPO ISOLADO OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AANTÍGENO QUE ESPECIFICAMENTE SE LIGA A CD40 HUMANO,KIT, MÉTODOS PARA INIBIR O CRESCIMENTO DE CÉLULASEXPRESSANDO ANTÍGENO HUMANO CD40, PARA TRATAR UMINDIVÍDUO TENDO UM DISTÚRBIO ASSOCIADO COM CD40 E PARAINDUZIR DEPLEÇÃO DE CÉLULAS B PERIFÉRICAS, COMPOSIÇÃOFARMACÊUTICA, E, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO"

Continuidade

Este pedido reivindica o beneficio de pedido provisório US no.60/684.853, depositado em 26 de maio de 2006, cuja descrição é incorporadapor referência aqui em sua totalidade.

ANTECEDENTES

Esta invenção geralmente refere-se a anticorpos anti-CD40humanizados pra uso diagnóstico e terapêutico. Mais especificamente, osanticorpos anti-CD40 humanizados e métodos de uso para o tratamento devárias doenças ou distúrbios caracterizados por células expressando CD40 sãodescritos. As composições farmacêuticas e artigos de fabricação como kitscompreendendo o anticorpo anti-CD40 humanizado são também descritos.

CD40 é uma glicoproteína de membrana integral de tipo I eum membro da superfamília de receptor de fator de necrose de tumor (TNF).CD40 é expressado em vários tipos de células incluindo células B neoplásicase normais, células de interdigitação, células epiteliais basais e carcinomas.Também está presente em monócitos, macrófagos, algumas célulasendoteliais, e células dendríticas foliculares. CD40 é expressado de modo

25 prematuro em ontogenia de células B, aparecendo em precursores de célulasB subseqüente ao aparecimento de CD 10 e CD 19, mas antes da expressão deCD21, CD23, CD24, e aparecimento de imunoglobulina M de superfície(slgM) (Uckun et al., 1990, Blood 15:2449). Apesar de relatórios anterioresindicarem que CD40 estava perdido quando da diferenciação terminal decélulas B em células de plasma, CD40 foi detectado em células de plasmaderivadas de medula óssea e amídala (Pellat-Decounynck et al., 1994, Blood84:2597).

A interação de CD40 com seu ligando e contra-receptor,CD40L (também referido como CD154, gp39 e TRAP) induz respostasimunes mediadas por células e humorais. CD40L é uma proteínatransmembrana expressada predominantemente em linfócitos ativados.Células CD4+T. Como outras proteínas na família de TNF, a estrutura deCD40L é a de um trímero não covalente. A sinalização mediada por CD40parece ser requerida para a proliferação de células B, comutação de isotipo deimunoglobulina (Ig), formulação de centro germinal, e comprometimento decélulas B da memória em resposta a antígeno dependente de células T. Aligação de CD40 de CD40L resulta em multimerização de CD40, a geração desinais de ativação para células apresentando antígeno como célulasdendríticas, monócitos e células B, e a geração de sinais de diferenciação ecrescimento para fibroblastos ativados por citocinas e células epiteliais.

Apesar de vias de sinalização através da quais as moléculas de CD40funcionam em diferenciação celular não terem sido completamenteelucidadas, os sinais de CD40 são transduzidos de receptor multimerizado viarecrutamento de uma série de fatores associados com receptor de TNF("TRAFs") (Kehry, 1996, J. Immumol. 156:2345-2348). Os subconjuntos deTRAFs interagem diferencialmente com membros da família de receptor deTNF, incluindo CD40, provendo estímulos para uma ampla variedade de viasa jusante. TRAFl e TRAF2 são implicados em modulação de apoptose(Speiser et al., 1997, J. Exp. Med. 185:1777-1783; Yeh et al., 1997, Immunity7:715-725). TRAFs 2, 5, e 6 participam em eventos de proliferação eativação. Em células B normais, a ligação de CD40 a CD40L recruta TRAF2e TRAF3 para o complexo de receptor e induz a regulação negativa de outrosTRAF's. (Kuhne et al., 1997, J. Exp. Med. 186:337-342).A sinalização mediada por CD40 e apoptose são intimamenteligadas durante o desenvolvimento e diferenciação de células B. Uma funçãoprimária de apoptose em células B é a deleção clonal de células B imaturas,que se pensa resulta de reticulação extensiva de Ig de superfície em células Bimaturas. O declínio de células B maduras é também modulado por umacombinação de sinalização via Ig de superfície e sinais derivados formamcélulas T ativadas, provavelmente mediados por moléculas de CD40L. Umacombinação de sinais de Ig de superfície e CD40 pode superar a viaapoptótiça e manter a sobrevivência de células B de centro germinal. Esteresgate de apoptose em centros germinais é crítico para o desenvolvimento decélulas B de memória produzindo anticorpo de afinidade.

Em ambas as malignidades de células T e B, os efeitosantitumor (parada de crescimento com ou sem apoptose) com freqüênciaresultam quando células malignas são expostas a estímulos que levam aativação de linfócitos normais. Esta parada de crescimento induzida porativação foi observada com sinais através de ou receptores de antígeno oureceptores co-estimulatórios (Ashwell et al., 1987, Science 237:61; Bridges etal., 1987, J. Immumol. 139:4242; Page e Defranco, 1988 J Imunol. 140:3717;e Beckwith et al., 1990, J. Natl. Câncer Inst. 82:501). A estimulação de CD40por anticorpo anti-CD40 ou CD40L solúvel diretamente inibe o crescimentode linfoma de células B (Funakoshi et al., 1994, Blood 83:2787-2784).

Vários anticorpos monoclonais de murinos (mAbs) dirigidoscontra CD40 foram descritos (Katira et al. 1995, "CD40 Workshop PaneiReport"; In: Leukocyte Typing V, Schlossman et al., (eds) 1995, 1:547-550).

Por exemplo, dois mAbs, CD40.7 (M2) e CD40.8 (M3), foram mostrado parainibir a ligação de CD40 a CD40L (Fanslow et al., 1995, In: LeukocyteTyping V, Schlossman et al., (eds) 1995, 1:555-556). O estímulo de CD40 pormAbs M2 e M3 inibiu o crescimento de vários linfomas de células Bhumanos e induziram a regressão de tumores estabelecidos in vivo (Funakoshiet al., 1994, Blood 83:2787-2794; Funakoshi et al., 1996, J Imunol. 19:93-101). Patente US No. 5.182.368 descreve um mAb de murino anti-CD40,G28-5, que pode aumentar a proliferação de células B. Uma imunotoxina decadeia única baseada na região Fv de cadeia única de G28-5 seletivamentematou linhagens de células malignas hematológicas expressando CD40humano in vitro (Francisco et al., 1997, J Biol. Chem. 39:24165-24169). Noentanto, G28-5 não melhora a ativação de células B na presença de CD40L enão potência a ligação de CD40 e CD40L. Patente US no. 6.838.261 (ePatentes US relacionadas Nos. 6.946.129 e 6.843.989) descreve uma classe deformas variantes do mAb murino anti-CD40, S2C6, e seu uso no tratamentode vários distúrbios, incluindo doenças inflamatórias e imunológicas e câncer.

Além de melhorar o estímulo mediado por CD$0L, um anticorpo anti-CD40descrito na patente US 6 838 261 mostrou melhora da interação entre CD40 eCD40L, e atividade anti-neoplásica in vivo. Apesar de S2C6 sozinho irestimular a proliferação de células B em um modo similar a G28-5, S2C6 édistinto de C28-5 por sua capacidade de aumentar a ligação de CD40L e agrandeza subseqüente de sinal de ativação mediado por CD40L.

Outros mAbs anti-CD40 de murinos, por exemplo, descritosno número de publicação internacional WO 95/17202, ligam CD40 e mostrameficácia no tratamento e prevenção de doença caracterizada por célulasneoplásicas expressando CD40. Apesar de anticorpos anti-CD40 murinosterem uma aplicabilidade potencial como agentes terapêuticos no tratamentode doenças relacionadas com CD40 em humanos, sua imunogenicidadeapresenta a possibilidade de uma resposta de anticorpo neutralizante, porexemplo uma resposta de anticorpo anti-camundongo humano (HAMA) quepoderia limitar seu valor.

Assim, existe a necessidade para anticorpos anti-CD40humanizados que especificamente ligam epítopos de CD40 definidos e quemostram a especificidade de ligação a antígeno, afinidade e outrascaracterísticas funcionais desejadas do anticorpo anti-CD40 não humano análogo.

Breve Sumário

A presente invenção engloba anticorpos anti-CD40humanizados e fragmentos de ligação a antígenos dos mesmos, assim comométodos usando estes anticorpos anti-CD40 humanizados e fragmentos para otratamento de doenças e distúrbios caracterizados por células expressando oantígeno de superfície CD40. Também são incluídos kits e artigos defabricação compreendendo um anticorpo anti-CD40 humanizado.

Em algumas formas de realização, um anticorpo isolado oufragmento de ligação a antígeno que especificamente liga a CD40 humano éprovido. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno inclui um domíniovariável de cadeia pesada e/ou domínio de região variável de cadeia leve. Odomínio de região variável de cadeia pesada pode incluir uma região dearmação tendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica àseqüência de aminoácidos da seqüência de aminoácidos de consenso dosubgrupo III de cadeia pesada do domínio variável humano III de SEQ IDNO:2, e pelo menos um CDR tendo uma seqüência de aminoácidos pelomenos 90% idêntica a um CDR de cadeia pesada correspondente de SEQ IDNO:3. O domínio variável de cadeia leve pode incluir uma região de armaçãotendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à seqüência deaminoácido de consenso kappa I de subgrupo de cadeia leve de domíniovariável humano de SEQ ID NO: 13, e pelo menos um CDR tendo umaseqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a um CDR de cadeia levecorrespondente de SEQ ID NO: 14.

Em algumas formas de realização, cada CDR de cadeia pesadaé pelo menos 90% idêntico ao CDR correspondente de cadeia pesada de SEQID NO:3. Em algumas formas de realização, os CDRs de cadeia pesadaincluem as seqüências de aminoácidos do CDR1, CDR2 e CDR3 de cadeiapesada de SEQ ID N0:3. Em algumas formas de realização, cada CDR decadeia leve é pelo menos 90% idêntico ao CDR correspondente de cadeia levede SEQ ED NO: 14. Em algumas formas de realização, os CDRs de cadeialeve incluem as seqüências de aminoácidos dos CDR1, CDR2 e CDR3 deSEQ ID NO: 14.

Em algumas formas de realização, o anticorpo ou fragmentode ligação a antígeno inclui um domínio variável de cadeia pesada tendo aseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10,ou SEQ ID NO:ll. Em algumas formas de realização, o anticorpo oufragmento de ligação a antígeno inclui um domínio variável de cadeia levetendo a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, ouSEQ ID NO: 16. Em algumas formas de realização, o anticorpo ou fragmentode ligação a antígeno tem uma seqüência de domínio variável de cadeiapesada de aminoácidos de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, ouSEQ ID NO: 11, e a seqüência de domínio variável de cadeia leve deaminoácidos de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, ou SEQ ID NO: 16.

Em algumas formas de realização, o domínio variável decadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve incluem as seqüências deaminoácidos de SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ IDNO:4 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO: 14,respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ IDNO:7 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO: 14,respectivamente; SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ IDNO:6 e SEQ ID NO: 15, respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 16,respectivamente; SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQ IDNO: 10 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:l 1 e SEQ ID NO:14,respectivamente; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; ou SEQID NO: 11 e SEQ ID NO: 16, respectivamente.

Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno pode incluiruma região constante de IgG humana, como, por exemplo, uma regiãoconstante de IgG de isotipo IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4. O anticorpo oufragmento de ligação a antígeno pode incluir um domínio constante de cadeialeve, como, por exemplo, um domínio constante kappa.

Em algumas formas de realização, o anticorpo é hu sgn-0, husgn-1, hu sgn-2, hu sgn-4, hu sgn-14, hu sgn-15, hu sgn-16, hu sgn-17, husgn-18, hu sgn-19, hu sgn-22, hu sgn-23, hu sgn-26 ou hu sgn-27. Emalgumas formas de realização, o anticorpo ou fragmento de ligação a antígenocompete por ligação com anticorpo monoclonal S2C6 que é secretado por umhibridoma tendo ATCC No. de Acesso PTA-110.

O anticorpo também pode ser um fragmento de ligação aantígeno, como um fragmento Fab, um Fab', um F(ab')2, a Fv, um diacorpo,um anticorpo de cadeia única, um fragmento scFv ou um scFv- Fc. Anticorpoou fragmento de ligação a antígeno pode ser opcionalmente rotulado ouconjugado a um agente quimioterapêutico, como auristatina (por exemplo,MMAE ou MMAF).

Também é provido um kit incluindo um anticorpo anti-CD40ou fragmento de ligação a antígeno em um recipiente. O kit podeopcionalmente incluir componente (s) adicional(ais), com instruções para usaro anticorpo para detectar proteína CD40 em uma amostra biológica.

As composições farmacêuticas compreendendo um anticorpoanti-CD40 ou fragmento de ligação a antígeno dos mesmos e excipiente(s)farmaceuticamente aceitável(eis) são também providos.

Em algumas formas de realização, isolados de polinucleotídeocodificando uma região variável de cadeia pesada humanizada e/ou umaregião variável de cadeia leve humanizada são providos. Um polinucleotídeopode, por exemplo, codificar uma seqüência de domínio variável de cadeiapesada de aminoácidos de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, ouSEQ ID NO: 11. Um polinucleotídeo também pode, por exemplo, codificaruma seqüência de domínio variável de cadeia leve de aminoácidos de SEQ IDNO: 14, SEQ ID NO: 15, ou SEQ ID NO: 16.

Em algumas formas de realização, polinucleotídeo isoladocodifica uma seqüência de domínio variável de cadeia pesada de aminoácidose uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de aminoácidos de SEQID NO:3 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:14, respectivamente; SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQID NO:6 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:14, respectivamente; SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQID NO:9 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO-respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQID NO:7 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQ ID NO: 10 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 14, respectivamente;SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; ou SEQ ID NO:l 1 e SEQID NO: 16, respectivamente.

Em algumas formas de realização, métodos para inibir ocrescimento de células expressando antígeno humano CD40 são providos. Osmétodos incluem a administração de um anticorpo anti-CD40 ou umfragmento de ligação a antígeno às células, cujo anticorpo ou fragmento deligação a antígeno liga ao antígeno CD40 de superfície de célula humana. Aligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ao antígeno CD40inibe o crescimento ou diferenciação das células.

Em algumas formas de realização, métodos para tratar umindivíduo tendo um distúrbio associado com CD40 são providos. Os métodosincluem administrar ao indivíduo um anticorpo anti-CD40 ou um fragmentode ligação a antígeno, cujo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ligaa CD40 humano. A ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno aCD40 inibe o crescimento ou diferenciação de células do distúrbio associadocom CD40. O distúrbio associado com CD40 pode ser, por exemplo, leucemialinfocítica crônica, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, linfoma de célula T,Linfoma não de Hodgkin, Doença de Hodgkin, Macroglobulinemia deWaldenstrom ou Sarcoma de Kaposi.

Em algumas formas de realização, métodos para induzir adepleção de células B periféricas são providos. Os métodos incluem aadministração às células de um anticorpo anti-CD40 ou um fragmento deligação a antígeno, cujo anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno liga aum

antígeno CD40 de superfície de célula humana. A ligação doanticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ao antígeno CD40 induz adepleção das células. As células B periféricas podem, por exemplo,demonstrar reatividade autoimune em um indivíduo.

A invenção será melhor entendida com referência à seguintedescrição detalhada incluindo as formas de realização preferidas, tomadas emconjunto com os desenhos anexos e listagem de seqüência. A discussãoabaixo é descritiva, ilustrativa e exemplar e não deve ser tomada comolimitando o escopo definido por qualquer uma das reivindicações anexas.

Breve Descrição Dos Desenhos

Figuras IA e IB mostram as seqüências de polipeptídeo (SEQID NO: 18) e de codificação (SEQ ID NO: 17) e de DNA complementar decadeia pesada de um anticorpo anti-CD40 humanizado. A seqüência depolipeptídeo é anotada para indicar a posição da seqüência líder, a regiãovariável, e a região constante IgGihumana. Figura 1C mostra a seqüência depolipeptídeo (SEQ ID NO:21) e de codificação (SEQ ID NO:20) e de DNAcomplementar de cadeia leve de um anticorpo anti-CD40 humanizado. Aseqüência de seqüência é anotada para indicar a posição da seqüência líder, aregião variável, e a região constante kappa humana.

Figura 2 mostra o efeito do tratamento com um anticorpo decontrole, um anticorpo anti- CD40 murino, e um anticorpo anti-CD40humanizado sobre o volume do tumor medido em um período de duassemanas, com o tratamento começando 13 dias após o transplante do tumorpós tumor.

Figura 3 mostra o efeito do tratamento com um anticorpo decontrole, um anticorpo anti- CD40 murino, e um anticorpo anti-CD40humanizado, em sobrevivência de camundongos contendo tumor.

Descrição Detalhada

Para clareza da descrição, e não a título de limitação, adescrição detalhada da invenção é dividida nas sub-seções que seguem.

Quando são usados aqui Nomes comerciais, o Nome comercialtambém se refere à formulação do produto de nome comercial, a drogagenérico, e o(s) ingrediente (s) farmacêutico(s) ativo(s) do produto de Nomecomercial, salvo especificado em contrário.

Salvo especificado em contrário, todos os termos técnicos ecientíficos usados aqui tem o mesmo significado que comumente entendidopor um versado na arte pertinente aos métodos e composições descritos.

Definições

Os termos "CD40" e "antígeno de superfície CD40" referem-se a uma glicoproteína 50 kD expressada sobre a superfície de células normaise neoplásicas B, que atuam como um receptor para sinais envolvidos emproliferação e diferenciação celular e é às vezes referido como Bp50(Ledbetter et al., 1987, J. Imunol. 138:788-785). Uma molécula de cDNAcodificando CD40 foi isolada de uma biblioteca preparada da linhagem decélulas de linfoma de Burkitt Raji (Stamenkovic et al.. 1989, EMBO J.8:1403). A célula que expressa CD40 é qualquer célula caracterizada porexpressão na superfície de CD40, incluindo, mas não limitada a, célulasnormais e neoplásicas, células interdigitantes, células basais epiteliais, célulasde carcinoma, macrófagos, células endoteliais, células foliculares dendríticas,células de amídalas, células de plasma derivadas de medula óssea. Emalgumas formas de realização, a molécula de CD40 é uma molécula de CD40humana.

Os termos, "epítopo de antígeno CD40" e "epítopo de CD40",como usados aqui, referem-se a uma molécula (por exemplo, um peptídeo) ouum fragmento de uma molécula capaz de imunorreatividade com umanticorpo anti-CD40 e, por exemplo, inclui um determinante antigênicoCD40, reconhecido pelo anticorpo monoclonal S2C6. Os epítopos de antígenoCD40 podem ser incluídos em proteínas, fragmentos de proteína, peptídeos ououtros. Os epítopos são mais comumente proteínas, oligopeptídeos curtos,miméticos de oligopeptídeo (isto é, compostos orgânicos que imitam aspropriedades de anticorpo de ligação do antígeno CD40), ou combinações dosmesmos.

Como usado aqui, "ligação específica" e "especificamenteliga" referem-se a ligação de anticorpo a um antígeno pré-determinado.Tipicamente, o anticorpo liga com uma afinidade de pelo menos cerca delxlO7 M1, e liga ao antígeno pré-determinado com uma afinidade que é pelomenos duas vezes maior do que sua afinidade para a ligação a um antígenonão específico (por exemplo, BSA, caseína) diferente do antígeno pré-determinado ou de um antígeno intimamente relacionado.

Anticorpos nativos" e "imunoglobulinas nativas "são definidosaqui com glicoproteínas heterotetraméricas, tipicamente de cerca de 150,000daltons, compostas de duas cadeias idênticas leves (L) e duas cadeiasidênticas pesadas (H). Cada cadeia leve é covalentemente ligada a uma cadeiapesada por uma ligação dissulfeto para formar a heterodímero. O

heterotetrâmero é formado por ligação covalente de dissulfetoentre as duas idênticas cadeias pesadas destes heterodímeros. Apesar dascadeias leves e pesadas serem ligados juntas por uma ligação dissulfeto, onúmero de ligações dissulfeto entre as duas cadeias pesadas varia por isotipode imunoglobulina. Cada cadeia pesada e leve também tem ligações em pontedissulfeto regularmente espaçadas intracadeias. Cada cadeia pesada tem noamino-término um domínio variável (VH), seguido por três ou quatrodomínios constantes (CHls CH2, CH3, e CH4), assim como uma região degancho entre CH1 e CH2. Cada cadeia leve tem dois domínios, umdomínio variável amino-terminal (VL) e um domínio constantecarboxi-terminal (CL). Os VL domínio associa não covalentemente com odomínio VH, enquanto o domínio CL é comumente covalentemente ligado aodomínio CH1 via uma ligação dissulfeto. Os resíduos particulares deaminoácidos formam, como se acredita, uma interface entre os domíniosvariáveis de cadeia leve e pesada (Chotia et al., 1985, J Mol. Biol. 186:651 - 663.)

O termo "hipervariável "refere-se a ao fato de que algumasseqüências dentro dos domínios variáveis diferemextensivamente em seqüência dentre os anticorpos e contém resíduos que sãodiretamente envolvidos na ligação e especificidade de cada anticorpoparticular para seu determinante antigênico específico. Hipervariabilidade, emambos os domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesada, é concentradaem três segmentos conhecidos como regiões de determinação decomplementaridade (CDRs) ou laço hipervariável (HVLs). CDRs sãodefinidos por comparação de seqüência em Kabat et al., 1991, em: ProteinSequences of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, NationalInstitutes of Health, Bethesda, MD., enquanto HVLs são estruturalmentedefinidos de acordo com a estrutura tri-dimensional do domínio variável,como descrito por Chotia e Lesk, 1987, J. Mol Biol. 196: 901-917. Onde estesdois métodos resultam em identificações levemente diferentes de um CDR, adefinição estrutural é preferido. Os definidos por Kabat, CDR-L1 estáposicionado a cerca de resíduos 24-34, CDR-L2, a cerca de resíduos 50-56, eCDR-L3, a cerca de resíduos 89-97 no domínio variável de cadeia leve; CDR-Hl está posicionado a cerca de resíduos 31-35, CDR- H2 a cerca de resíduos50-65, e CDR-H3 a cerca de resíduos 95-102 no domínio variável de cadeiapesada.

Os três CDRs dentro de cada uma das cadeias pesada e levesão separados por regiões de armação (FR) que contém seqüências quetendem a ser menos variáveis. Do amino término para o término carbóxi dosdomínios variáveis de cadeia leve e pesada, os FRs e CDRs são dispostos naordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, e FR4. A configuraçãoprincipalmente de P-folha dos FRs leva os CDRs dentro de cada uma dascadeias a uma proximidade íntima um com o outro para os CDRs da outracadeia. A conformação resultante contribui para o sítio de ligação do antígeno(ver Kabat et al., 1991, NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, págs. 647-669), apesarde nem todos os resíduos de CDR estarem necessariamente diretamenteenvolvidos na ligação de antígeno.

Os resíduos de FR e domínios constantes de Ig não estãodiretamente envolvidos na ligação de antígeno, mas contribuem para a ligaçãode antígeno e/ou mediam a função de efetuador do anticorpo. Alguns resíduosde FR podem ter um efeito significante sobre a ligação de antígeno em pelomenos três modos: por ligação não covalentemente diretamente em umepítopo, por interação com um ou mais resíduos de CDR, e afetando ainterface entre as cadeias pesada e leve. Os domínios constantes não estãodiretamente envolvidos na ligação de antígeno mas mediam várias funções deefetuador de Ig, como na participação do anticorpo em citotoxicidade celulardependente de anticorpo (ADCC), citotoxicidade dependente de complemento(CDC) e fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP).

As cadeias leves de imunoglobulinas de vertebrados sãodesignadas em uma de duas classes claramente distintas, kappa (K) e lambda(À,), com base em uma seqüência de aminoácidos do domínio constante. Porcomparação, as cadeias pesadas de imunoglobulinas de mamíferos sãodesignadas a uma de cinco classes principais, de acordo com a seqüência dosdomínios constantes: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. IgG e IgA são aindadivididos em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGj, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi,e IgA2. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classesdiferentes de imunoglobulinas são chamados a, 5, 8, y, e \i, respectivamente.

As estruturas de subunidade e as configurações tri-dimensionais das classesde imunoglobulinas nativas são bem conhecidas.

Os termos, "anticorpo", "anticorpo anti-CD40", "anticorpoanti-CD40 humanizado", e "anticorpo anti-CD40 humanizado variante" sãousados aqui no sentido mais amplo e especificamente englobam anticorposmonoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento completo),anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorposbi-específicos), e fragmentos de anticorpos destes como domínios variáveis eoutras porções de anticorpos que mostram uma atividade biológica desejada,por exemplo, ligação de CD40.

O termo "anticorpo monoclonal" (mAb) refere-se a umanticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmentehomogêneos; isto é, os anticorpos individuais compreendendo a populaçãosão idênticos exceto pelas mutações de ocorrência natural, que podem estarpresentes em quantidades menores. Anticorpos monoclonais são altamenteespecíficos, sendo dirigidos contra um determinante antigênico único,também referido como epítopo. O modificador "monoclonal" é indicativo deuma população substancialmente homogênea de anticorposdirigidos para o epítopo idêntico e não deve ser construídocomo requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular.Anticorpos monoclonais podem ser feitos por qualquer técnica oumetodologia conhecidas na arte; por exemplo, o método de hibridomaprimeiro descrito por Kohler et al., 1975, Nature 256:495, ou métodos deDNA recombinante conhecidos na arte (ver, por exemplo, patente US no.4.816.567). Em outro exemplo, anticorpos monoclonais também podem serisolados de bibliotecas de anticorpos de fagos, usando técnicas descritas emClackson et al., 1991, Nature 352: 624-628, e Marks et al, 1991, J. Mol. Biol.222: 581-597.

Em contraste, os anticorpos em uma preparação de anticorpospoliclonais são tipicamente uma população heterogênea de isotipos e/ouclasses de imunoglobulina e também demonstram uma variedade deespecificidade de epítopos.

O termo anticorpo "quimérico "como usado aqui é um tipo deanticorpo monoclonal em que uma porção de ou a completa seqüência deaminoácidos em uma ou mais regiões ou domínios de cadeia pesada e/ou leveé idêntica com, homóloga a ou uma variante da seqüência correspondente emum anticorpo monoclonal de outra espécies ou pertencendo a outra classe ouisotipo de imunoglobulina, ou de uma seqüência de consenso. Os anticorposquiméricos incluem fragmentos destes anticorpos, desde que o fragmento deanticorpo demonstre a atividade biológica desejada de seu anticorpo parental,por exemplo ligação ao mesmo epítopo (ver, por exemplo, patente US no.4.816.567; e Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA Sh 6851-6855).

Os termos, "fragmento de anticorpo", "fragmento de anticorpoanti-CD40 ", "fragmento de anticorpo anti-CD40 humanizado ", "fragmentode anticorpo anti-CD40 humanizado variante "referem-se a uma porção de umde anticorpo anti-CD40 de comprimento completo, em que a região variávelou uma capacidade funcional é retida, por exemplo, ligação de epítopo deCD40 específico. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas nãosão limitados a, um fragmento Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, scFv e scFv-Fc, umdiacorpo, um anticorpo linear, um anticorpo de cadeia única, um minicorpo,um diacorpo formado a partir de fragmentos de anticorpos, e anticorpos multi-específicos formados a partir de fragmento de anticorpos.

Alguns tipos de fragmentos de anticorpos podem ser geradospor tratamento enzimático de um anticorpo de comprimento completo. Adigestão de papaína de anticorpos produz dois fragmentos de ligação aantígeno idênticos, chamados fragmentos "Fab", cada com um sítio de ligaçãoa antígeno único, e um fragmento "Fc" residual, assim chamados devido à suacapacidade de cristalizar prontamente. O fragmento Fab também contém odomínio constante de cadeia leve e o CH1 domínio de cadeia pesada. Otratamento com pepsina dá um fragmento F(ab')2 que tem dois sítios deligação a antígeno e é ainda capaz de reticular o antígeno.

Os fragmentos Fab' diferente dos fragmentos Fab pelapresença de alguns resíduos adicionais no C-término do domínio ChI,incluindo uma ou more cisteínas da região de gancho do anticorpo. Fab-SH éuma designação aqui para um Fab' em que os resíduo(s) de cisteína dosdomínios constantes contém um grupo tiol livre. O fragmento de F(ab')2 deanticorpos são pares dos fragmentos de Fab' ligados por resíduos de cisteínana região de gancho. Outras copulações químicas de fragmentos de anticorpossão também conhecidas.

"Fv" é a fragmento mínimo de anticorpo que contém um sítiocompleto de reconhecimento e ligação de antígeno consistindo de um dímerode um domínio variável de uma cadeia pesada e uma leve em associação nãocovalente firme. Nesta configuração, os três CDRs de cada domínio variávelinterage para definir o sítio de ligação de antígeno na superfície do dímeroVh- Vl. Coletivamente, os seis CDRs conferem especificidade de ligação aoantígeno ao anticorpo.

Um fragmento de anticorpo Fv" ou "scFv" de cadeia única [euma variante Fv de cadeia única compreendendo os domínios Vh e VL de umanticorpo, em que os domínios estão presentes em uma cadeia única depolipeptídeo e que é capaz de reconhecer e ligar o antígeno. O polipeptídeoscFv opcionalmente contém um ligador de polipeptídeo posicionado entre osdomínios VH e VL que permite que scFv forme uma estrutura tri-dimensionaldesejada para ligação de antígeno (ver, por exemplo, Pluckthun, 1994, In ThePharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg e Moore eds.,Springer- Verlag, New York, pp. 269- 315).

O termo "diacorpos" refere-se a um fragmento pequeno deanticorpos tendo dois sítios de ligação a antígeno. Cada fragmento contém umdomínio variável de cadeia pesada (Vh) concatenado a um domínio variávelde cadeia leve (VL). Ao usar um ligador que é curto para permitir a formaçãode pares entre os dois domínios na mesma cadeia, os domínios VH-VL ligadossão forçados a formar pares com os domínios complementares de outracadeia, criando dois sítios de ligação de antígeno.

Diacorpos são descritos mais completamente,, por exemplo,em EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 90: 6444-6448.

O termo "anticorpos lineares" refere-se a anticorpos quecompreendem um par de segmentos Fd in tandem (VH -ChI- Vh -Ch1) queformam um par de ligação de regiões de antígeno. Os anticorpos linearespodem ser bi-especííicos ou monoespecíficos como descrito em, por exemplo,Zapata et al. 1995, Proteína Eng. 8(10):1057-1062.

Um anticorpo humanizado ou um fragmento de anticorpohumanizado inclui uma variante de seqüência de aminoácidos deimunoglobulina, ou fragmento dos mesmos, que é capaz de ligação a umantígeno predeterminado e que compreende um ou mais de FRs tendosubstancialmente a seqüência de aminoácidos de uma imunoglobulinahumana e um ou mais CDRs tendo substancialmente a seqüência deaminoácidos de uma imunoglobulina não humana. Esta seqüência deaminoácidos não humana é referida aqui como uma seqüência de"importação", que é tipicamente tomada de um domínio de anticorpo deimportação, particularmente um domínio variável. Geralmente, um anticorpohumanizado inclui pelo menos os CDRs ou HVLs de um anticorpo nãohumano, inserido entre os FRs de um domínio variável de cadeia leve oupesada humano. Em alguns aspectos, um anticorpo anti-CD40 humanizadocontém resíduos de CDR e/ou HVL ou seqüências derivadas de anticorpomonoclonal S2C6 murino inserido entre os FRs de domínios variáveis decadeia leve e pesada de seqüência de consenso humana.

Em outro aspecto, um anticorpo anti-CD40 humanizadocompreende substancialmente todos dentre pelo menos um, e tipicamentedois, domínios variáveis (como contido, por exemplo, em fragmentos Fab,Fab1, F(ab')2, Fabc, e Fv) em que todos, ou substancialmente todos, dos CDRscorrespondem aos de uma imunoglobulina não humana e todos, ousubstancialmente todos, dos FRs são os de uma seqüência de consenso deimunoglobulina humana. Em outro aspecto, um anticorpo anti-CD40humanizado também inclui pelo menos uma porção de uma região Fc deimunoglobulina, tipicamente de uma imunoglobulina humana. Comumente, oanticorpo irá conter tanto o domínio variável de cadeia leve assim como pelomenos o de um cadeia pesada. O anticorpo também pode incluir um maisdentre CH1, gancho, regiões CH2, CH3 e/ou CH4 da cadeia pesada, comoapropriado.

Um anticorpo anti-CD40 humanizado pode ser selecionado dequalquer classe de imunoglobulinas, incluindo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE, equalquer isotipo, incluindo IgGi, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi e IgA2. Por exemplo,o domínio constante pode ser um constante de fixação de complemento ondese deseja que o anticorpo humanizado demonstre atividade citotóxica, e oisotipo é tipicamente IgGi. Onde esta atividade citotóxica não é desejável, odomínio constante pode ser de outro isotipo, por exemplo, IgG2. Umanticorpo anti-CD40 humanizado alternativo pode compreender seqüências demais de uma classe ou isotipo de imunoglobulina, e a seleção de domíniosconstantes particulares para otimizar as funções efetuadoras desejadas está deacordo com os conhecimentos dos versados.

Os FRs e CDRs, ou HVLs, de um anticorpo anti-CD40humanizado não precisam corresponder precisamente às seqüências parentais.

Por exemplo, um ou mais resíduos no CDR de importação, ou HVL, ou aseqüência de consenso FR pode ser alterado (por exemplo, mutagenizado) porsubstituição, inserção ou deleção de modo que o resíduo de aminoácidoresultante não é mais idêntico ao resíduo original na posição correspondenteem uma seqüência parental. Estas alterações, no entanto, tipicamente nãoserão extensivas. Geralmente, pelo menos 75% dos resíduos de anticorpohumanizado irão corresponder aos das seqüências de FR e CDR deimportação, com maior freqüência pelo menos 90%, e com maior freqüênciaainda do que 95%, ou mais do que 98% ou mais do que 99%.

Os resíduos de imunoglobulina que afetam a interface entreregiões variáveis de cadeia pesada e leve ("a interface VL -VH ") são os queafetam a proximidade ou orientação das duas cadeias com relação uma àoutra. Alguns resíduos que podem estar envolvidos em interações inter-cadeias incluem os resíduos VL 34, 36, 38, 44, 46, 87, 89, 91, 96, e 98 eresíduos VH 35, 37, 39, 45, 47, 91, 93, 95, 100, e 103 (utilizando o sistema denumeração especificado em Kabat et al., Protein Sequences of ImunologicalInterest (National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1987)). Os resíduosadicionais incluem resíduos VL 43 e 85, e resíduos VH 43 e 60, comomostrado na patente US no. 6.407.213, incorporada aqui por referência emsua totalidade. Apesar destes resíduos serem indicados para IgG humanaapenas, eles são aplicáveis através de espécies. Os resíduos de anticorpo deimportação que são razoavelmente esperados como estando envolvidos eminterações intercadeias são selecionados para substituição na seqüência deconsenso.

Os termos "seqüência de consenso" e "anticorpo de consenso"como usados aqui referem-se a uma seqüência de aminoácidos quecompreendem o resíduo de aminoácido de ocorrência mais freqüente em cadalocal em todas as imunoglobulinas de qualquer classe, isotipo, ou estrutura desubunidade particular, por exemplo, um domínio variável de imunoglobulinahumana. A seqüência de consenso podem ser baseada em imunoglobulinas deuma espécies particular ou de muitas espécies. Uma seqüência de "consenso",estrutura ou anticorpo é entendida como englobando uma seqüência humanade consenso, como descrito em algumas formas de realização, e para fazerreferência a uma seqüência de aminoácidos que compreende os resíduos deaminoácidos de ocorrência de maior freqüência em cada local em todas asimunoglobulinas humanas de qualquer classe, isotipo, ou estrutura desubunidade particular. São providas estruturas humanas de consenso eestruturas de consenso que consideram outras espécies além de humana.

Assim, a seqüência de consenso contém uma seqüência de aminoácidos tendoem cada posição um aminoácido que está presente em uma ou maisimunoglobulinas conhecidas, mas que pode não exatamente duplicar aseqüência de aminoácidos completa de qualquer imunoglobulina única. Aseqüência de consenso de região variável não é obtido de qualquer anticorpoou imunoglobulina produzido naturalmente. As seqüências de consensoutilizáveis incluem uma seqüência de consenso kappa I de cadeia levevariável humana (SEQ ID NO: 13) e uma seqüência de consenso do subgrupoIII de cadeia pesada variável humana (SEQ ID NO:2), derivadas dos dadosapresentados em Kabat et al., 1991, Protein Sequences of ImunologicalInterest, 5a. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health,Bethesda, MD., e variantes das mesmas. Os FRs de seqüências de consensode cadeia pesada e leve, e variantes dos mesmos, fornecem seqüênciasutilizáveis para a preparação de anticorpos anti-CD40 humanizados. Ver, porexemplo, Patentes U.S. Nos. 6.037.454 e 6.054.297. Em algumas formas derealização, o FR usado para preparar os anticorpos humanizados foi derivadode seqüências de consenso para uma seqüência de consenso kappa I de cadeialeve variável humana e para uma seqüência de consenso do subgrupo III decadeia pesada variável humana.

Como usado aqui, "variante", "variante anti-CD40", "varianteanti-CD40 humanizada", ou "anti-CD40humanizado variante" refere-se cadaa um anticorpo anti-CD40 humanizado tendo pelo menos uma seqüência CDRou HVL variável de cadeia pesada derivada de anticorpo monoclonal S2C6murino e seqüências FR derivadas de seqüências de consenso humanas.

Variantes incluem as tendo uma ou mais mudanças de aminoácidos em umaou ambas os domínios variáveis de cadeia leve ou cadeia pesada, desde que amudança de aminoácido não prejudique substancialmente a ligação doanticorpo a CD40. Variantes anti-CD40 humanizadas tipicamente incluemsubstituições de aminoácidos que melhoram o desempenho do anticorpo aopermitir uma duplicação melhorada da molécula do anticorpo.

Um anticorpo "isolado" é um que foi identificado e separadoe/ou recuperado de um componente de seu meio natural. Os componentescontaminantes do meio natural do anticorpo são os materiais que podeminterferir com os usos diagnósticos e terapêuticos do anticorpo, e podemincluir enzimas, hormônios ou outros solutos proteináceos ou nãoproteináceos. Em um aspecto, o anticorpo será purificado:

(a) a mais do que 95% isolação em peso do anticorpo comodeterminado pelo método de Lowry, e em outro aspecto, mais do que 99%isolamento em peso, ou

(b) a um grau de isolamento suficiente para obter pelo menos15 resíduos de seqüência de aminoácidos N- terminal ou interna por uso deum sequenciador de copo giratório, ou

(c) até homogeneidade por SDS-PAGE sob condições deredução ou não redução como visualizado usando azul Coomassie oupreferivelmente coloração de prata.Um anticorpo isolado inclui um anticorpo in situ dentro decélulas recombinantes, porque pelo menos um componente do meio naturaldo anticorpo não estará presente. Comumente, no entanto, um anticorpoisolado será preparado por pelo menos uma etapa de purificação.

O termo "desempenho de anticorpo" refere-se a fatores quecontribuem para o reconhecimento do anticorpo do antígeno ou a eficácia deum anticorpo in vivo. Mudanças em uma seqüência de aminoácidos de umanticorpo podem afetar as propriedades do anticorpo tais como a duplicação, epodem influenciar os fatores físicos, como a taxa inicial de ligação doanticorpo ao antígeno (v0), constante de dissociação do anticorpo do antígeno(Kd), constante de afinidade do anticorpo para o antígeno, conformação doanticorpo, e estabilidade da proteína, e meia-vida do anticorpo.

O termo "epítopo etiquetado" quando usado aqui, refere-se aum anticorpo anti-CD40 fundido em uma "etiqueta de epítopo". Uma"etiqueta de epítopo "é um polipeptídeo tendo um número suficiente deaminoácidos para prover um epítopo para a produção de anticorpo, ainda éprojetado de modo a não interferir com a atividade biológica desejada doanticorpo anti-CD40 humanizado. A etiqueta de epítopo é geralmentesuficientemente singular de modo que um anticorpo criado contra a etiquetado epítopo não reage cruzado com os outros epítopos. Os polipeptídeos deetiqueta apropriados geralmente contém pelo menos 6 resíduos deaminoácidos e geralmente contém cerca de 8 a 50 resíduos de aminoácidos,ou cerca de 9 a 30 resíduos. Exemplos de etiquetas de epítopo e o anticorpoque liga o epítopo incluem o polipeptídeo de etiqueta flu HA e seu anticorpo12CA5 (Field et al., 1988 Mol. Cell. Biol. 8: 2159-2165; c-myc tag eanticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 e 9E10 dos mesmos (Evan et al.,1985,Mol. Cell. Biol. 5(12):3610-3616; e etiqueta de glicoproteína de vírusHerpes simplex D (gD) e seu anticorpo (Paborsky et al. 1990, ProteinEngenharia 3(6): 547-553). Em algumas formas de realização, a etiqueta doepítopo é um "epítopo de ligação de receptor de salvamento". Como usadoaqui, os termos "epítopo de ligação de receptor de salvamento" refere-se a umepítopo da região Fc de uma molécula de IgG (como IgGi, IgG2, IgG3, ouIgG4) que é responsável pelo aumento na meia-vida no soro da molécula de IgG.

O termo "agente citotóxico" refere-se a uma substancia queinibe ou evita a função de células e/ou causa destruição de células. O termo sedestina a incluir isótopos radioativos (como I131, I125, Y90' e Re186), agentesquimioterapêuticos, e toxinas como as toxinas enzimaticamente ativas deorigem bacteriana, fungica, planta, ou animal, e seus fragmentos. Estesagentes citotóxicos podem ser copulados a um anticorpo, por exemplo, umanticorpo anti-CD40 humanizado, usando procedimentos padrões conhecidose usados, por exemplo, para tratar um paciente indicado para terapia com oanticorpo.

Um "agente quimioterapêutico" é um composto químicoutilizável no tratamento de câncer. Exemplos de agentes quimioterapêuticosincluem agentes alquilantes como tiotepa e ciclosfosfamida (CYTOXAN™);sulfonatos de alquila como busulfan, improsulfan, e piposulfan; aziridinascomo benzodopa, carboquona, meturedopa, e uredopa; etileniminas emetilamelaminas incluindo altretamina, trietilenemelamina,trietilenefosforamida, trietilenetiofosforamida, e trimetilolomelamina;acetogeninas (especialmente bulatacina e bulatacinona); camptotecina(incluindo o análogo sintético topotecano); briostatina; calistatina; CC- 1065(incluindo seus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina, e bizelesina);criptoficinas (particularmente criptoficina 1 e criptoficina 8); dolastatina,auristatinas, (incluindo análogos monometil-auristatina E e monometil-auristatina F); duocarmicina (incluindo os análogos sintéticos, KW-2189 eCBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; sarcodictiina; spongistatina;mostardas nitrogênio como clorambucil, clornafazina, cholofosfamida,estramustina, ifosfamida, mecloretamina, cloridrato de oxido demecloretarnina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina;trofosfamida, mostarda uracila; nitrosuréias como carmustina, clorozotocina,fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; antibióticos como osantibióticos de enediina (por exemplo, caliceamicina, especialmentecalicemicina gama II e caliceamicina phill, ver por exemplo, Agnew, Chem.Intl. Ed. Engl, 33:183-186; dinemicina, incluindo dinemicina A;bisfosfonatos, como clodronato; esperamicina; assim como cromóforo deneocarzinostatina e cromóforos antibióticos de enediina de cromo proteínarelacionados) aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina,bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina,chromomicinas, dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (Adriamycin™) (incluindo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino- doxorubicina, edeoxidoxorubicina), epirubucina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina,mitomicinas como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina,olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina,rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex,zinostatina, zorubicina; anti-metabólitos, como metotrexato e 5-fluorouracil(5-FU); análogos de ácido fólico como denopterina, metotrexato, pteropterina,trimetrexato; análogos de purina como fludarabina, 6- mercaptopurina,tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina como ancitabina, azacitidina,6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina,floxuridina; androgênios como calusterona, propionato de dromostanolona,epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adranais como aminoglutetimida,mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico como ácido frolínico;aceglatona; aldofosfamida glicosídeo; ácido aminolevulínico; eniluracil;amsacrina; bestrabucil; bisantreno; edatraxato; defofamina; democolcina;diaziquona; elfornitina; acetato de eliptínio; uma epotilona; etoglucídeo;nitrato de gálio; hidroxiuréia; lentinana; lonidamina; maitansinóides comomaitansina e ansamitocinas; mitoguazona, mitoxantrona; mopidamol;nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácidopodofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK®; razoxano; rizoxina;sizofiran;

Espiro germânio; ácido tenuazônico; triaziquona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A,roridina A e anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina;mitabronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinosídeo ("Ara-C");ciclofosfamida; tiotepa; taxóides, por exemplo, paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Miers Squibb Oncology, Princeton, NJ) e doxetaxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); clorambucil; gemcitabina (Gemzar™); 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platina como cisplatinae carboplatina; vinblastina; platina; etoposídeo (VP- 16); ifosfamida;mitoxantrona; vincristina; vinorelbina (Navelbine™); novantrona;teniposídeo; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato;CPT-11; inibidor de topoisomerase RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO);retinóides como ácido retinóico; capecitabina; e sais farmaceuticamenteaceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima. Também estãoincluídos nesta definição os agentes anti-hormonais que atuam para regular ouinibir a ação hormonal sobre os tumores como anti-estrogênios e moduladoresseletivos de receptor de estrogênio (SERMs), incluindo, por exemplo,tamoxifeno (incluindo Nolvadex™), raloxifeno, droloxifeno, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, ceoxifeno, LY117018, onapristona, etoremifeno (Fareston™); inibidores de aromatase que inibem a enzimaaromatase, que regula a produção de estrogênio nas glândulas adrenais, como,por exemplo, 4(5)- imidazóis, aminoglutetimida, acetato de megestrol(Megace™), exemestano, formestano, fadrozol, vorozol (Rivisor™), letrozol(Femara™), e anastrozol (Arimidex™); e anti-androgênios como flutamida,nilutamida, bicalutamida, leuprolídeo, e goserelina; e sais farmaceuticamenteaceitáveis, ácidos ou derivados de qualquer um dos acima.

O termo "pró-droga" como usado aqui refere-se a umprecursor ou forma de derivado de uma substância farmaceuticamente ativaque é menos citotóxica para as células de tumor comparado com a drogaparental e é capaz de ser enzimaticamente ativado ou convertido em umaforma mais ativa. Ver, por exemplo, Wilman, 1986, "Prodrugs in CâncerChemotherapy", em Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382,615th Meeting Belfast and Stella et al., 1985, "Prodrugs: A ChemicalApproach to Targeted Drug Delivery, em: "Directed Drug Delivery,Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press. Os pró-drogas utilizáveisincluem, mas não são limitados a, pró-drogas contendo fosfato, pró-drogascontendo tiofosfato, pró-drogas contendo sulfato - pró-drogas contendopeptídeo, pró-drogas modificadas com D-aminoácidos, pró-drogasglicosiladas, pró-drogas contendo p-lactama, - pró-drogas contendofeenoxiacetamida opcionalmente substituída, e pró-drogas contendofeenilacetamida opcionalmente substituída, 5-fluorocitosina e outros pró-drogas de 5-fluorouridina que podem ser convertidos em drogas isentas decitotoxicidade mais ativos. Exemplos de drogas citotóxicos que podem serderivatizados em uma forma de pró-droga incluem, mas não são limitados aosagentes quimioterapêuticos descritos acima.

O termo "rótulo" refere-se a um composto ou composiçãodetectável que é conjugada diretamente ou indiretamente no anticorpo. Orótulo pode ser sozinho detectável (por exemplo, rótulos de radioisótopos ourótulos fluorescentes) ou, no caso de um rótulo enzimático pode catalisar aalteração química de um composto ou composição substrato que é detectável.Anticorpo anti-CD40 humanizado rotulado pode ser preparado e usado invárias aplicações incluindo diagnóstico in vitro e in vivo.

Um "lipossoma" é uma vesícula pequena composta de váriostipos de lipídeos fosfolipídeos, e/ou tensoativo. Lipossomas são utilizáveispara distribuição a um mamífero de um composto ou formulação, como umanticorpo anti-CD40 humanizado mostrado aqui, opcionalmente, copulado aou em combinação com um ou mais agentes farmaceuticamente ativos. Oscomponentes do lipossoma são comumente dispostos em uma formação de bi-camadas, similar à disposição de lipídeos de membranas biológicas

Uma molécula de ácido nucleico "isolada" é uma molécula deácido nucleico que é identificada e separada de pelo menos uma moléculacontaminante de ácido nucleico com que ela é comumente associada na fontenatural do ácido nucleico de anticorpo. Uma molécula de ácido nucleicoisolada é diferente do que na forma ou configuração em que ela é encontradana natureza. As moléculas de ácido nucleico isoladas são, assim, distintas damolécula de ácido nucleico como ela existe em células naturais. No entanto,uma molécula de ácido nucleico isolada inclui uma molécula de ácidonucleico contida nas células que comumente expressam o anticorpo onde, porexemplo, a molécula de ácido nucleico está em um local cromossômicodiferente do das células naturais.

O termo "seqüências de controle" refere-se a seqüências depoiinucleotídeo necessárias para expressão de uma seqüência de codificaçãooperativamente ligada em um organismo hospedeiro particular. As seqüênciasde controle apropriadas para uso em células procarióticas incluem, porexemplo, seqüências de promotor, operador, e sítio de ligação de ribossomas.

As seqüências de controle eucarióticas incluem, mas não são limitados a,promotores, sinais de poliadenilação e melhoradores. Estas seqüências decontrole podem ser utilizadas para expressão e produção de anticorpo anti-CD40 humanizado em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas.

Uma seqüência de ácido nucleico é "operativamente ligada"quando ela é colocada em uma relação funcional com outra seqüência deácido nucleico. Por exemplo, uma preseqüência de ácido nucleico ou lídersecretório é operativamente ligado a um ácido nucleico codificando umpolipeptídeo se ele for expressado como uma preproteína que participa nasecreção do polipeptídeo; um promotor ou melhorador é operativamenteligado a uma seqüência de codificação se ele afetar a transcrição daseqüência; ou um sítio de ligação ribossoma é operativamente ligado a umaseqüência.de codificação se ele estiver posicionado de modo a facilitar atradução. Geralmente "operativamente ligado" significa que as seqüências deDNA sendo ligadas são contíguas, e, no caso de um líder secretório, contíguase em matriz de leitura. No entanto, melhoradores são opcionalmentecontíguos. A ligação pode ser obtida por ligação em sítios de restriçãoconvenientes. Se estes sítios não existirem, os adaptadores deoligonucleotídeos sintéticos ou ligadores podem ser usados.

Como usado aqui, as expressões "célula", "linhagem decélulas", e "cultura de células" são usadas interpermutavelmente e todas estasdesignações incluem a progênie dos mesmos. Assim, "transformantes" e"células transformadas" incluem as células primárias e as culturas derivadasdas mesmas sem levar em conta o número de transferências. Tambémentende-se que toda a progênie não é precisamente idêntica no teor de DNA,devido a mutações deliberadas ou de ocorrência natural. A progênie mutanteque tem a mesma função ou atividade biológica, como triado para as célulasoriginalmente transformadas está incluída. Onde se pretende designaçõesdistintas, isto será evidente do contexto.

O termo "mamífero" para fins de tratamento refere-se aqualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animaisdomesticados e de criação, e de zoológicos, para a prática de esportes, ouanimais de estimação, como cachorros, cavalos, gatos vacas, e outros.Preferivelmente, o mamífero é humano.

Um "distúrbio", como usado aqui, é qualquer condição que iriase beneficiar do tratamento com um anticorpo anti-CD40 humanizadodescrito aqui. Isto inclui distúrbios crônicos ou agudos ou doenças incluindoas condições patológicas que predispõem o mamífero ao distúrbio emquestão. Exemplos ou distúrbios não limitativos a serem tratados aquiincluem câncer, malignidades hematológicas, tumores benignos e malignos,leucemias e malignidades linfóides e distúrbios inflamatórios, angiogênicos eimunológicos.

Os termos "câncer" e "canceroso" referem-se a ou descrevem acondição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada porcrescimento de células desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas nãosão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia.

Como usado aqui, o termo "distúrbio associado com CD40" ou"doença associada com CD40" refere-se a uma condição em que modificaçãoou eliminação de células expressando CD40 é indicada. Estas incluem célulasexpressando CD40 demonstrando uma proliferação anormal ou célulasexpressando CD40 que são associadas com crescimento canceroso oumaligno. Mais particular, exemplos de cânceres que demonstram expressãoanormal de antígeno CD40 incluem linfoblastóides de células B, linfoma deBurkitt, mieloma múltiplo, linfomas de células T, Sarcoma de Kaposi,osteosarcoma, tumores epidérmicos e endoteliais, cânceres pancreáticos, depulmão, mama, ovariano, colon, próstata, cabeça e pescoço, pele (melanoma),bexiga e rim.

Estes distúrbios incluem, mas não são limitados a, leucemias,linfomas, incluindo linfoma de célula B e linfoma não de Hodgkin, mielomamúltiplo, Macroglobulinemia de Waldenstrom; tumores sólidos, incluindosarcomas, como osteosarcoma, sarcoma de Ewing, melanoma maligno,adenocarcinoma, incluindo adenocarcinoma ovariano, Sarcoma de Kaposi/tumor de Kaposi e carcinoma de célula escamosa.

Um distúrbio associado com CD40 também inclui doenças edistúrbios do sistema imune, como distúrbios auto-imunes e distúrbiosinflamatórios. Estas condições incluem, mas não são limitadas a, artritereumatóide (RA), lúpus eritematoso sistêmico, (SLE), escleroderma,síndrome de Sjogren, esclerose múltipla, doença de intestino inflamatória (porexemplo, colite ulcerativa e doença de Crohn), inflamação pulmonar, asma, epúrpura trombocitopênica idiopática (ITP).

A expressão "para o crescimento de"ou "inibidor docrescimento "quando usada aqui refere-se a inibição do crescimento ouproliferação de um célula, especialmente um tipo de célula neoplásicaexpressando o antígeno CD40. Assim, inibição do crescimento, por exemplo,reduz de modo significante a porcentagem de células neoplásicas na fase S.

O termo "infusão intravenosa' refere-se à introdução de umagente na veia de paciente animal ou humano durante um período de tempomaior do que aproximadamente 15 minutos, geralmente entreaproximadamente 30 a 90 minutos.

O termo "bolo intravenoso" ou "compressão intravenosa"refere-se à administração da droga na veia de um animal ou humano, de modoque o corpo recebe a droga em aproximadamente 15 minutos ou menos,geralmente 5 minutos ou menos.

O termo "administração subcutânea" refere-se a introdução deum agente sob a pele de um paciente animal ou humano, preferível em umabolsa entre a pele e o tecido subjacente, por uma liberação prolongada,relativamente lenta, de um receptáculo de droga. Beliscar ou puxar a pele paracima e para fora do tecido subjacente pode criar a bolsa.

O termo "infusão subcutânea" refere-se à introdução de umadroga sob a pele de um de um paciente animal ou humano, preferível em umabolsa entre a pele e o tecido subjacente, por uma liberação prolongada,relativamente lenta, de um receptáculo de droga durante um período de tempoincluindo, mas não limitado a, 30 minutos ou menos, ou 90 minutos oumenos. Opcionalmente, a infusão pode ser feita por implante subcutâneo deuma bomba de distribuição de droga implantada sob a pele do paciente animalou humano, em que a bomba libera uma quantidade pré-determinada de drogadurante um período de tempo pré-determinado, como 30 mina, 90 mina, ouum período de tempo se estendendo durante o regime de tratamento.

O termo "bolo subcutâneo" refere-se à administração da drogaabaixo da pele de um paciente animal ou humano, onde a distribuição dadroga do bolo ocorre em menos que aproximadamente 15 min; em outroaspecto, menos que 5 minutos, e ainda outro aspecto, menos que 60 segundos.Em ainda outro aspecto, a administração está dentro de uma bolsa entre a pelee o tecido subjacente, onde a bolsa pode ser criada por beliscão ou puxão dapele para cima e para fora do tecido subjacente.

O termo "quantidade terapeuticamente eficaz" é usado para sereferir a uma quantidade de um agente ativo tendo um resultado benéfico parao paciente, por exemplo um efeito de parada de crescimento ou causa adeleção da célula. Em um aspecto, a quantidade terapeuticamente eficaz temuma atividade apoptótica, ou é capaz de induzir a morte celular. Em outroaspecto, a quantidade terapeuticamente eficaz refere-se a uma concentraçãosérica de alvo que foi mostrada como sendo eficaz em, por exemplo, retardara progressão da doença. A eficácia pode ser medida em modos convencionais,dependendo das condições a serem tratadas. Por exemplo, em doenças oudistúrbios neoplásicos, caracterizados por células expressando CD40, aeficácia pode ser medida por avaliação do tempo até a progressão da doença(TTP), ou determinando as taxas de resposta (RR).

Os termos "tratamento" e "terapia" e outros, como usado aqui,significam incluir medidas terapêuticas, assim como profiláticas ousupressivas para uma doença ou distúrbio levando a qualquer efeitoclinicamente desejável ou benéfico, incluindo mas não limitado a alívio ouremédio de um ou mais sintomas, regressão, retardo ou térmico de progressãoda doença ou distúrbio. Assim, por exemplo, o termo tratamento inclui aadministração de um agente antes ou após o início de um sintoma de umadoença ou distúrbio assim evitando ou removendo um ou mais sinais dadoença ou distúrbio. Como outro exemplo, o termo inclui a administração deum agente após a manifestação clínica da doença para combater os sintomasda doença. Além disso, a administração de um agente após o início e após ossintomas clínicos terem se desenvolvidos onde a administração afeta osparâmetros clínicos da doença ou distúrbio, como o grau de dano ao tecido oua quantidade ou extensão de metástase, se ou não o tratamento levando amelhora da doença, compreende "tratamento" ou "terapia", como usado aqui.

O termo "inserto de embalagem" é usado para fazer referênciaa instruções comumente incluídas em embalagens comerciais de produtosterapêuticos, que contém informação sobre as indicações, uso, administração,contra-indicações e/ou conselhos com relação ao uso de tais produtosterapêuticos.

A abreviatura "AFP" refere-se a dimetilvalina -valina -dolaisoleunina- dolaproinea-fenilalanina-p-fenilenodiamina.

A abreviatura "MMAE" refere-se a monometil auristatina E.

A abreviatura "AEB" refere-se a um éster produzido porreação de auristatina E com ácido paraacetil benzóico.

A abreviatura "AEVB" refere-se a um éster produzido porreação de auristatina E com ácido benzoilvalérico.

A abreviatura "MMAF" refere-se a dovalina -valina -dolaisoleunina- dolaproina-fenilalanina.

Anticorpos

São descritos e mostrados aqui os anticorpos anti-CD40humanizados, e composições e artigos de fabricação compreendendo umanticorpo anti-CD40 humanizado. Também descritos são agentes de ligaçãoque incluem um fragmento de ligação a antígeno de um anticorpo anti-CD40humanizado. Os anticorpos anti-CD40 humanizados e agentes de ligaçãopodem parar o crescimento de células, causar a deleção de célulasexpressando CD40 ou de outra forma induzir ou causar um efeito citotóxicoou citostático em células alvo. Os anticorpos anti-CD40 humanizados eagentes ligação podem ser usados no tratamento de uma variedade de doençasou distúrbios caracterizados pela proliferação de células expressando oantígeno de superfície CD40.

Um anticorpo anti-CD40 humanizado e um agente de ligaçãode CD40 incluem, cada, pelo menos uma porção que especificamentereconhece um epítopo CD40 (isto é, um fragmento de ligação a antígeno). Emalgumas formas de realização um anticorpo anti-CD40 humanizado ou umagente de ligação de CD40 inclui um fragmento de ligação a antígeno quecompete para ligação com anticorpo S2C6.

Em algumas formas de realização, o fragmento de ligação aantígeno pode, por exemplo, bloquear a proliferação ou de outra forma parar ocrescimento de uma célula ou causa sua depleção, morte ou de outra formasua deleção, por exemplo, através da ligação do antígeno de superfície CD40.Por exemplo, em malignidades de células T e B, efeitos anti-tumor (porexemplo, parada do crescimento com ou sem deleção ou apoptose de células)podem resultar quando as células malignas são expostas a estímulos que levaà ativação de linfócitos normais. Esta parada do crescimento induzida porativação foi observada com sinais através de ou os receptores de antígeno oureceptores co- estimulatórios (ver, por exemplo, Ashwell et al., 1987, Science237:61; Bridges et al., 1987, J. Imunol. 139:4242; Page e Defranco, 1988, J.Imunol. 140:3717; e Beckwith et al., 1990, J. Natl. Câncer Inst. 82:501). Oestímulo de CD40 como um resultado da ligação específica por ou anticorpoou ligando solúvel, inibe o crescimento de linfoma de células B (ver, porexemplo, Funakoshi et al., 1994, Blood 83:2787-2794). Agentes que inibem ocrescimento de células malignas deste modo e que são dirigidos contra oantígeno de superfície CD40 são exemplos de agentes apropriados.Os agentes específicos de CD40 incluem um fragmento deligação a antígeno de um anticorpo anti-CD40 humanizado que liga a CD40(por exemplo, CD40 humano ou uma variante do mesmo). Os agentesespecíficos CD40 e anticorpos podem ser opcionalmente conjugados com oufundidos a um agente citotóxico ou quimioterapêutico. Em aspectos onde oanticorpo humanizado liga ao antígeno de superfície CD40 e causa a depleçãodos tipos de células expressando CD40, a ligação é geralmente caracterizadapor abrigo da célula CD40 de antígeno de superfície in vivo. Os agentes deligação apropriados ligam o antígeno CD40 com suficiente afinidade e/ouavidez de modo que o agente específico de CD40 é utilizável como um agenteterapêutico por especificamente marcando uma célula expressando oantígeno.

Em um aspecto, o agente é um anticorpo humanizadocontendo os CDRs do anticorpo monoclonal S2C6 de murino. (O anticorpoS2C6 é descrito, por exemplo, por Paulie et al., 1984, Câncer Imunol.Imunother. 17:165-179.) O anticorpo S2C6 foi mostrado como exercendouma atividade agonista em células B periféricas humanas, como demonstradopela capacidade do anticorpo de estimular a proliferação primária de células Bem um modo dependente de dose (ver, por exemplo, Paulie et al., 1989, J.Imunol. 142:590-595), assim como atividade anti-neoplásica in vivo (ver, porexemplo, patente US no. 6.838.261).

Em algumas aspectos, o anticorpo humanizado aumenta aligação de ligando CD40 a CD40 por pelo menos 45%, por pelo menos 50%,por pelo menos 60% ou por pelo menos 75%. Um método de aumentos deligação de ligando CD40 a CD40 é mostrado na patente US no. 6.838.261(cuja descrição é incorporada por referência aqui).

Em algumas formas de realização, os anticorpos anti-CD40humanizados, incluindo fragmento de ligação a antígenos dos mesmos, comodomínios variáveis de cadeia pesada e leve, compreendem uma seqüência deaminoácidos dos resíduos derivada dos CDRs ou HVLs do anticorpo S2C6murino (ver, por exemplo, patente US no. 6.838.261) e resíduos deaminoácidos derivados de regiões de armação de uma imunoglobulinahumana. Em um aspecto, os aminoácidos de região de armação humana sãoderivados de seqüências de consenso humanas para o for the domínio variávelde sub-grupo III de cadeia pesada e a variável de cadeia leve kappa, comodescrito na patente US no. 6.037.454. Os anticorpos anti-CD40 humanizadosopcionalmente incluem substituições de aminoácidos específicas nas regiõesde armação de consenso.

A substituição específica de resíduo de aminoácidos nestasposições de resíduos de aminoácidos nestas posições dearmação pode melhorar os vários aspectos de desempenho de anticorposincluindo afinidade de ligação e/ou estabilidade, sobre o demonstrado emanticorpos humanizados formados por "permuta direta" de CDRs ou HVLsnas regiões de armação de consenso humanas, como mostrado nos exemplosabaixo.

Em algumas formas de realização, os anticorpos anti-CD40humanizados mostrados aqui compreendem pelo menos um domínio variávelde cadeia pesada ou cadeia leve compreendendo os CDRs ou HVLs doanticorpo monoclonal S2C6 murino e os FRs dos domínios variáveis deconsenso de cadeia pesada e leve humanos tendo as substituições específicasdescritas na Tabela 5. Um alinhamento das seqüências de aminoácidosvariáveis de cadeia pesada tendo substituições e seqüências de aminoácidosvariáveis de cadeia leve tendo substituições é mostrado nas Tabelas 3 e 4,respectivamente. Estas seqüências incluem um domínio variável de cadeiapesada tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e um domíniovariável de cadeia leve tendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.

Em algumas formas de realização, o anticorpo anti-CD40humanizado é um fragmento de anticorpo. Várias técnicas foramdesenvolvidas para a produção de fragmento de anticorpos. Fragmentospodem ser derivados via digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, porexemplo, Morimoto et al., 1992, Journal of Biochemical and BiophysicalMethods 24:107- 117; e Brennan et al., 1985, Science 229:81).

Alternativamente, os fragmentos podem ser produzidos diretamente emcélulas hospedeiras recombinantes. Por exemplo, fragmentos Fab'-SH podemser diretamente recuperados de E. coli e quimicamente copulados para formarfragmentos F(ab')2 (ver, por exemplo, Carter et al., 1992, Bio/Technology10:163-167). Por outra abordagem, fragmentos F(ab')2 podem ser isoladosdiretamente de cultura de célula hospedeira recombinante. Outras técnicaspara a produção de fragmento de anticorpos serão evidentes para os versadosna arte.

Algumas formas de realização incluem um fragmento F(ab')2de um anticorpo anti-CD40 humanizado compreendendo uma seqüência dedomínio variável de cadeia pesada de aminoácidos e uma seqüência dedomínio variável de cadeia leve de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; (SED ID NO.:4 e SEQ ID NO: 14, respectivamente;SEQ ID N0:5 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID N0:6 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID N0:7 e SEQ ID NO: 14, respectivamente;SEQ ID N0:8 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID N0:9 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID N0:6 e SEQ ID NO: 15, respectivamente;SEQ ID N0:6 e SEQ ID N0:16, respectivamente; SEQ ID N0:7 e SEQ IDNO: 16, respectivamente; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 14, respectivamente;SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO: 10 e SEQ IDNO: 16, respectivamente; ou SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 16,respectivamente. Estas formas de realização podem incluir um anticorpointacto compreendendo estes F(ab')2.

Outras formas de realização incluem um fragmento F(ab')2 deum anticorpo anti-CD40 humanizado compreendendo uma seqüência dedomínio variável de cadeia pesada de aminoácidos e uma seqüência dedomínio variável de cadeia leve de aminoácidos de SEQ ID NO:7 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 16, respectivamente;SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQ ID NO: 10 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:l 1 e SEQ ID NO: 14, respectivamente;SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; e SEQ ID NO: 11 e SEQID NO: 16, respectivamente.

Ainda outras formas de realização incluem um fragmentoF(ab')2 de um anticorpo anti-CD40 humanizado compreendendo umaseqüência de domínio variável de cadeia pesada de aminoácidos e umaseqüência de domínio variável de cadeia leve de aminoácidos de SEQ IDNO:7 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 16,respectivamente; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; e SEQID NO: 11 e SEQ ID NO: 16, respectivamente.

Algumas formas de realização incluem um fragmento F(ab')2de um anticorpo anti-CD40 humanizado que contém um domínio variável decadeia pesada compreendendo uma seqüência de aminoácidos de SEQ IDNO: 10 e um domínio variável de cadeia leve compreendendo uma seqüênciade aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

Em algumas formas de realização, o anticorpo ou fragmentode anticorpo inclui um região constante que media função de efetuador. Aregião constante pode prover citotoxicidade celular dependente de anticorpo(ADCC), fagocitose celular dependente de anticorpo (ADCP) e/oucitotoxicidade dependente de complemento (CDC) respostas contra umacélula de marcação expressando CD40. O (s) domínio(s) podem ser, porexemplo, uma região Fc de uma molécula de Ig. Tipicamente, o agente deligação de CD40 recruta e/ou ativa as células de sangue brancas citotóxicas(por exemplo, células exterminadoras naturais (NK), células fagocíticas (porexemplo, macrófago), e/ou componentes de complemento do soro).

O domínio efetuador de um anticorpo pode ser de quaisquerespécies e isotipos de animal vertebrado apropriados. Os isotipos dediferentes espécies de animais diferem nas capacidades de mediar as funçõesdo efetuador. Por exemplo, a capacidade de imunoglobulina humana paramediar CDC e ADCC/ADCP é geralmente da ordem deIgM«IgGi«IgG3>IgG2>IgG4 e IgGi«IgG3>IgG2/IgM/IgG4, respectivamente.As imunoglobulinas de murinos mediam CDC e ADCC/ADCP geralmente naordem de IgM«IgG3»IgG2b>IgG2a»IgGi e IgG2b>IgG2a>IgGi»IgG3,respectivamente. Em outro exemplo, IgG2a murino media ADCC enquantotanto IgG2a murino e IgM mediam CDC.

Modificações de Anticorpos

Os anticorpos anti-CD40 humanizados e agentes podem incluirmodificações do anticorpo anti-CD40 humanizado ou fragmento de ligação aantígeno dos mesmos. Por exemplo, pode ser desejável modificar o anticorpocom relação à função de efetuador, de modo a melhorar a eficácia doanticorpo no tratamento de câncer, por exemplo. Uma destas modificações é aintrodução de resíduo(s) cisteína na região Fc, assim permitindo a formaçãoda ligação de dissulfeto intercadeias nesta região. O anticorpo homodiméricoassim gerado por ter uma capacidade de internalização melhorada /ou mortede células mediada por complemento e/ou citotoxicidade celular dependentede anticorpo (ADCC). Ver, por exemplo, Caron et al., 1992, J. Exp Med.176:1191-1195; e Shopes, 1992, J. Imunol. 148:2918-2922. Os anticorposhomodiméricos tendo atividade melhorada anti-tumor também podem serpreparados usando reticuladores heterobifuncionais, como descrito em Wolffet al., 1993, Câncer Research 53: 2560-2565. Alternativamente, um anticorpopode ser engenheirado para conter regiões Fc duais, melhorando a lisecomplemento e as capacidades de ADCC do anticorpo. Ver Stevenson et al.,1989, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230.Anticorpos com capacidade melhorada para suportar ADCCforam gerados por modificação do padrão de glicosilação de sua região Fc.Isto é possível porque a glicosilação do anticorpo no resíduo de asparagina,N297, no domínio CH2 está envolvida na interação entre IgG e receptores Fcyum pré-requisito para ADCC. As linhagens de célula hospedeira foramengenheiradas para expressar anticorpos com glicosilação alterada, como bi-seção aumentada de N-acetiglucosamina ou fucose reduzida. A redução defiicose prove uma melhora maior para a atividade de ADCC do que oaumento da presença de bi-seção de N- acetilglucosamina. Além disso, amelhora de ADCC por anticorpos de baixo teor de fucose é independente dopolimorfismo de FcyRIIIa V/F.

A modificação da seqüência de aminoácidos da região Fc deanticorpos é uma alternativa à engenharia de glicosilação para melhorarADCC. O sítio de ligação em IgGi humano para receptores de Fcy foideterminado por análise mutacional extensiva. Isto levou à geração deanticorpos IgGi humanizados com mutações Fc que aumentam a afinidade deligação para FcyRIIIa e melhoram ADCC in vitro. Adicionalmente, asvariantes de Fc foram obtidas com muitas permutações diferentes depropriedades de ligação, por exemplo, melhorada ligação a receptores deFcyR específicos com ligação inalterada ou diminuída para outros receptoresde FcyR.

Em algumas formas de realização, a região Fc pode sermodificada como descrito em Pedidos de patente U.S Publicação Nos. 2006-0003412 e 2006-0008883, cujas descrições são incorporadas por referênciaaqui.

Outro aspecto inclui imunoconjugados compreendendo osanticorpo humanizado ou fragmentos do mesmo conjugado a um agentecitotóxico como um agente quimioterapêutico, uma toxina (por exemplo, umatoxina enzimaticamente ativa de origem bacteriana, fímgica, planta, ouanimal, ou fragmentos da mesma), ou um isótopo radioativo (isto é, um radioconjugado).

Agentes quimioterapêuticos utilizáveis na geração destesimunoconjugados foram descritos acima. As toxinas enzimaticamente ativas efragmentos das mesmas que podem ser usados para formar imunoconjugadosutilizáveis incluem cadeia A de difteria, fragmentos ativos de não ligação detoxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa),cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modeccina, alfa-sarcina,proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacaamericana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia,curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogellina,restrictocina, fenomicina, enomicina, os tricotecenos, e outros. Uma variedadede radionuclídeos são disponíveis para a produção de anticorpos anti-CD40humanizados radio conjugados. Exemplos incluem 212Bi, 1311, 13IIna, 90Y, e 186Re.

Conjugados do anticorpo anti-CD40 humanizado e agentescitotóxicos ou quimioterapêuticos podem ser feitos por métodos conhecidométodos, usando vários agentes de copulação de proteína bifuncional, comoN -succinimidil-3-(2-piridilditiol) propionato (SPDP), iminotiolano (IT),derivados bifuncionais de imidoésteres (como dimetil adipimidato HCL),ésteres ativos (como suberato de disuccinimidila), aldeídos (comoglutareldeído), compostos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil)hexanediamina), derivados de bis- diazônio (como bis-(p-diazônio benzoil)-etilenodiamina), diisocianatos (como 2,6-diisocianato de tolueno), ecompostos de flúor bis-ativos (como l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Porexemplo, uma imunotoxina de ricina pode ser preparada como descrito emVitetta et al., 1987, Science 238:1098. Ácido triaminapentaacético de 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno rotulado com carbono 14 (MX-DTPA) éum agente quelante exemplar para a conjugação de radionucleotídeo aoanticorpo. Ver, por exemplo, Publicação Internacional WO 94/11026.Conjugados também podem ser formados com um ligador clivável, como quemostrado em Pedido de patente EP publicado 0 624 377; cuja descrição éincorporada por referência aqui.

Em outra forma de realização, o anticorpo pode ser conjugadoa um receptor (como estreptavidina) para utilização em pré-marcação detumor. Neste procedimento, o conjugado anticorpo- receptor é administrado aum paciente, seguido por remoção de conjugado não ligado da circulaçãousando um agente de depuração e então administração de um "ligando" queseletivamente liga o receptor (por exemplo, avidina), o ligando sendoconjugado a um agente citotóxico (por exemplo, um radionuclídeo).

Os anticorpos anti-CD40 humanizados mostrados aquitambém podem ser formulados como imunolipossomas. Lipossomas contendoo anticorpo são preparados por métodos conhecidos na arte, como descrito emEpstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:3688; Hwang et al., 1980,Proc. Natl Acad. Sei. USA 77:4030; e Pat. U.S. Nos. 4,485,045 e 4,544,545.Lipossomas tendo melhorado tempo de circulação são descritos, por exemplo,em patente US no. 5.013.556.

Os lipossomas particularmente utilizáveis podem ser geradospor método de evaporação em fase reversa com uma composição de lipídeoscompreendendo fosfatidileolina, colesterol e fosfatidiletanolaminaderivatizada com PEG- (PEG-PE). Lipossomas são extrudados através defiltro de tamanho de poro definido para dar lipossomas com o diâmetrodesejado. Os fragmentos Fab' de um anticorpo mostrado aqui podem serconjugados aos lipossomas como descrito em Martin et al., 1982, J. Biol.Chem. 257:286-288 via uma região de intertroca de dissulfeto. Um agentequimioterapêutico (como doxorubicina) está opcionalmente contido dentro dolipossoma. Ver, por exemplo, Gabizon et al., 1989, J. National Câncer Inst.81(19):1484.Os anticorpos descritos e mostrados aqui também podem serusados em procedimentos ADEPT (terapia de pró-droga de enzima dirigida aanticorpo) para conjugar o anticorpo a uma enzima de ativação de pró-drogaque converte uma pró-droga (por exemplo, um agente quimioterapêutico depeptidila), a uma droga anti-câncer ativo. Ver, por exemplo, WO 81/01145,WO 88/07378, e patente US no. 4.975.278. O componente de enzima doimunoconjugado utilizável para ADEPT é uma enzima capaz de atuar sobreuma pró-droga em tal modo para converter o mesmo em sua forma citotóxicamais ativa. As específicas enzimas que são utilizáveis em ADEPT incluem,mas não são limitada fosfatase alcalina para converter pró-drogas contendofosfato em drogas livres; arilsulfatase para converter pró-drogas contendosulfato em drogas livres; citosina deaminase para converter 5-fluorocitosinanão tóxica na droga anti-câncer, 5-fluorouracila; proteases, como serratiaprotease, termolisina, subtilisina, carboxipeptidases, e catepsinas (comocatepsinas B e L), para converter pró-drogas contendo peptídeo em drogaslivres; D-alanilcarboxipeptidases, para converter pró-drogas contendosubstituintes de D-aminoácido; enzimas de clivagem de carboidratos como 0-galactosidase e neuraminidase para converter pró-drogas glicosilados emdrogas livres; (3 - lactarnase para converter drogas derivatizados com (3-lactamas em drogas livres; e penicilina amidases, como penicilina V amidaseou penicilina G amidase, para converter drogas derivatizados em seusnitrogênios amina com grupos fenoxiacetila ou fenilacetila, respectivamente,em drogas livres. Alternativamente, anticorpos tendo atividade enzimática("abzimas") podem ser usados para converter os pró-drogas em drogas livresativos (ver, por exemplo, Massey, 1987, Nature 328: 457-458). Conjugadosanticorpo-abzima podem ser preparados por métodos conhecidos para aliberação de abzima em uma população de células de tumor, por exemplo, porligação covalentemente da enzima ao anticorpo anti-CD40 humanizado/reagentes de reticulação heterobifuncionais, discutidos acima.Alternativamente, proteínas de fusão compreendendo pelo menos a região deligação de antígeno de um anticorpo mostrado aqui ligado a pelo menos umaporção funcionalmente ativa de uma enzima como descrito acima podem serconstruídas usando técnicas de DNA recombinante (ver, por exemplo,Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608).

Em algumas formas de realização, pode ser desejável usar umfragmento anti-CD40 de anticorpo humanizado, em vez de um anticorpointacto, para aumentar a penetração no tumor, por exemplo. Pode serdesejável modificar o fragmento de anticorpo a fim de aumentar sua meia-vida sérica. Isto pode ser obtido, por exemplo, por incorporação de umepítopo de receptor de ligação de salvamento no fragmento de anticorpo. Emum método, a região apropriada do fragmento de anticorpo pode ser alterada(por exemplo, mudada), ou o epítopo pode ser incorporado em uma etiquetade peptídeo que é então fundida no fragmento de anticorpo em uma dasextremidades ou no meio, por exemplo, por síntese de DNA ou peptídeo. Ver,por exemplo, WO 96/32478.

Em outras formas de realização, modificações covalentes doanticorpo anti-CD40 humanizado são também incluídas. Elas podem ser feitaspor síntese química ou por clivagem enzimática ou química do anticorpo, seaplicável. Outros tipos de modificações covalentes do anticorpo podem serintroduzidas na molécula por reação do resíduo de aminoácidos marcado doanticorpo com um agente derivatizante orgânico que é capaz de reator comcadeias laterais selecionadas ou os resíduos amino- ou carbóxi-terminais..

As modificações covalente incluem modificação de resíduoscisteinila, resíduos histidila, resíduos lisinila e amino-terminal, resíduosarginila, resíduos tirosila, grupos laterais carboxila (aspartila ou glutamila),resíduos glutaminila e asparaginila, ou serila, ou resíduos treonila. Outro tipode modificação covalente envolve glicosídeos de copulação química ouenzimática para o anticorpo.A remoção de quaisquer porções de carboidratos presentes noanticorpo pode ser obtida de modo químico ou enzimático. A desglicosilaçãoquímica é descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys.259:52 e por Edge et al., 1981, Anal. Biochem., 118:131. A clivagemenzimática das porções de carboidratos em anticorpos pode ser obtida pelouso de várias endo- e exo-glicosidases como descrito por Thotakura et al.,1987, Meth. Enzymol. 138:350.

Outro tipo de modificação covalente utilizável compreende aligação do anticorpo a um de vários polímeros não proteináceos, por exemplo,polietileno glicol, polipropileno glicol, ou polioxialquilenos, no modoespecificado em uma ou mais das patentes US no. 4.640.835, patente US no.4.496.689, patente US no. 4.301.144, patente US no. 4.670.417, patente USno. 4.791.192 e patente US no. 4.179.337.

Humanização e Variantes de Seqüência de Aminoácidos

Exemplo 1 abaixo descreve procedimentos para ahumanização de um anticorpo anti-CD40 enquanto Exemplo 2 descrevevariantes. Em algumas formas de realização, pode ser desejável gerarvariantes de seqüência de aminoácidos destes anticorpos humanizados,particularmente onde eles melhora a afinidade de ligação ou outraspropriedades biológicas do anticorpo humanizado.

As variantes de seqüência de aminoácidos do anticorpo anti-CD40 podem ser preparadas por introdução de mudanças de nucleotídeoapropriadas no DNA do anticorpo anti-CD40, ou por síntese de peptídeo.Estas variantes incluem, por exemplo, deleções de, e/ou inserções dentro dee/ou substituições de, resíduos dentro das seqüências de aminoácidos doanticorpo anti-CD40s dos exemplos aqui. Qualquer combinação de deleções,inserções, e substituições é feita para chegar a uma construção final, desdeque a construção final possua as características desejadas. As mudanças deaminoácidos também podem alterar os processos pós-translacionais doanticorpo humanizado ou variante anti-CD40, como mudança do número ouposição de sítios de glicosilação.

Um método utilizável para a identificação de alguns resíduosou regiões do anticorpo anti- CD40 que são os locais preferidos para amutagenese é chamado "mutagenese de varredura de alanina "como descritopor Cunningham e Wells (Science, 244:1081-1085 (1989)). Aqui, um resíduoou grupo de resíduos de marcação são identificados (por exemplo, resíduoscarregados como arg, asp, his, lys, e glu) e substituídos por um aminoácidoneutro ou negativamente carregado (tipicamente alanina) para efetuar ainteração do aminoácidos com antígeno CD40. Estes locais de aminoácidosdemonstrando sensibilidade funcional para as substituições então sãorefinados por introdução ainda ou de outras variantes em, ou para os sítios desubstituição. Assim, apesar do sítio para a introdução de uma variação deseqüência de aminoácidos ser predeterminado, a natureza da mutação por sinão precisa ser predeterminada. Por exemplo, para analisar o desempenho deuma mutação em um dado sítio, a mutagenese aleatória ou de varredura dealanina é conduzida no códon ou região de marcação e as variantes deanticorpo anti-CD40 expressadas são tríadas para a atividade desejada.

As inserções de seqüência de aminoácidos incluem fusõesamino- e/ou carboxila-terminais na faixa de comprimento de um resíduo apolipeptídeos contendo uma centena ou mais de resíduos, assim comoinserções intraseqüências de resíduo de aminoácidos únicos ou múltiplos.

Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo anti-CD40 fundido auma etiqueta de epítopo. Outras variantes insercionais da molécula deanticorpo anti-CD40 incluem uma fusão para o N- ou C-término do anticorpoanti-CD40 de uma enzima ou um polipeptídeo que aumenta a meia vida séricado anticorpo.

Outro tipo de variante é uma variante de substituição deaminoácido. Estas variantes tem, pelo menos, um resíduo de aminoácido namolécula de anticorpo anti-CD40 removido e um resíduo diferente inseridopor sua vez. Os sítios de maior interesse para a mutagenese substitucionalincluem as regiões hipervariáveis, mas alterações de FR são tambémcontempladas. As substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sobo cabeçalho de "substituições preferidas". Se estas substituições resultam emuma mudança na atividade biológica, então mudanças mais substancias,denominadas "substituições exemplares ", ou como ainda descrito abaixo comreferência às classes de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtostriados.

TABELA 1

<table>table see original document page 47</column></row><table>

As modificações substanciais nas propriedades biológicas doanticorpo são obtidas por seleção de substituições que diferem de modosignificante em seu efeito na manutenção da (a) estrutura do esqueleto dopolipeptídeo na área de substituição, por exemplo, como uma conformação defolha ou helical, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no sítio demarcação, ou (c) o grosso da cadeia lateral. Os resíduos ocorrendonaturalmente são divididos em grupos com base em propriedades de cadeialateral comuns:

• (1) hidrofóbicas: norleucina, met, ala, vai, leu, ile;

• (2) hidrofílicas neutras: cys, ser, thr;

• (3) ácidas: asp, glu;

• (4) básicas: asn, gln, his, lys, arg;

• (5) resíduos que influenciam a orientação de cadeia: gly, pro; e

• (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

As substituições não conservativas irão acarretar a troca de ummembro de uma destas classes por outra classe.

Qualquer resíduo de cisteína não envolvido na manutenção daconformação apropriada do anticorpo anti-CD40 humanizado ou variantetambém podem ser substituído, geralmente com serina, para melhorar aestabilidade oxidativa da molécula, evitar a reticulação aberrante ou proverpontos estabelecidos de conjugação a um composto citotóxico ou citostático.

Inversamente, a(s) ligação (ões) de cisteína podem seradicionadas ao anticorpo para melhorar sua estabilidade (particularmenteonde o anticorpo é um fragmento de anticorpo como fragmento Fv).

Um tipo de variante substitucional envolve substituir um oumais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo,um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante (s)resultante (s) selecionada(s) para outro desenvolvimento terão melhoradaspropriedades biológicas relativas ao anticorpo parental dos quais elas sãogeradas. Um modo conveniente para gerar estas variantes substitucionais ématuração por afinidade usando exibição de fagos. Brevemente, vários sítiosde região hipervariável (por exemplo, 6-7 sítios) são mudados de modo agerar todas as substituições de amino possíveis em cada sítio. As variantes deanticorpo assim geradas são mostradas em um modo monovalente a partir departículas de fagos filamentosos como fusões do produto de gene III de Ml3embalados dentro de cada partícula. As variantes mostradas em fagos sãoentão tríadas para sua atividade biológica (por exemplo, afinidade porligação). A fim de identificar sítios de região hipervariável candidatos paramodificação, mutagenese de varredura de alanina pode ser realizada paraidentificar os resíduos de região hipervariável contribuindo de modosignificante para a ligação de antígeno. Alternativamente, ou além disso, podeser benéfico analisar uma estrutura de cristal do complexo antígeno-anticorpopara identificar pontos de contato entre o anticorpo e CD40 humano. Estesresíduos de contato e resíduos vizinhos são candidatos para substituição deacordo com técnicas elaboradas aqui. Uma vez que estas variantes sãogeradas, o painel de variantes é submetido à triagem como descrito aqui eanticorpos com propriedades superiores em um ou mais testes relevantespodem ser selecionados para posterior desenvolvimento.

Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera opadrão de glicosilação original do anticorpo. Por "alteração" significa-se adeieção de uma ou mais porções de carboidratos encontradas no anticorpo,e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes noanticorpo.

Glicosilação of anticorpos é tipicamente ou N-ligada ou 0-ligada. N-ligada refere-se à fixação da porção de carboidrato à cadeia lateralde um resíduo asparagina. As seqüências de tripeptídeo sasparagina-X-serinae asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido exceto prolina, são asseqüências de reconhecimento para a fixação enzimática da porção decarboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de uma destasseqüências de tripeptídeos em um polipeptídeo cria um sítio de glicosilaçãopotencial. A glicosilação O-ligada refere-se à fixação de um dos açúcares N-aceilgalactosamina, galactose, ou xilose a um hidroxiaminoácido, maiscomumente serina ou treonina, apesar de 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisinatambém poderem ser usados.

Adição de sítios de glicosilação para o anticorpo éconvenientemente obtida por alteração da seqüência de aminoácidos de modoque eles contém um ou mais das acima descritas seqüências de tripeptídeos(para sítios de glicosilação N-ligados). A alteração pode ser também feita poradição de, ou substituição por um ou mais resíduos de serina ou treonina paraa seqüência do anticorpo original (para sítios de glicosilação O-ligados).

As moléculas de ácido nucleico codificando variantes deseqüência de aminoácidos do anticorpo anti- CD40 são preparadas por umavariedade de métodos conhecidos na arte. Estes métodos incluem, mas nãosão limitados a, isolamento de uma fonte natural (no caso de seqüêncianaturalmente ocorrendo de variantes de aminoácidos) ou preparação pormutagenese mediada por oligonucleotídeo (ou dirigida por sítio), mutagenesePCR, e mutagenese de cassete de uma variante preparada anteriormente ouuma versão não variante do anticorpo anti-CD40.

Anticorpo humanos

Como uma alternativa à humanização, anticorpo humanospodem ser gerados. Por exemplo, animais transgênicos (por exemplo,camundongos) podem ser usados que são capazes, quando de imunização, deproduzir um repertório completo de anticorpo humanos na ausência deprodução de imunoglobulina endógena. Por exemplo, foi descrito que adeleção homozigótica do gene da região de união de cadeia pesada deanticorpo (JH) em camundongos quiméricos e mutantes de linhagem germinalresulta em completa inibição de produção de anticorpo endógeno. Atransferência do arranjo de gene de imunoglobulina de linhagem germinalhumana nestes camundongos mutantes de linhagem germinal irá resultar naprodução de anticorpo humanos quando do desafio com antígeno. Como umaalternativa a humanização, anticorpo humanos podem ser gerados. Porexemplo, animais transgênicos (por exemplo, camundongos) podem serusados que são capazes, quando da imunização, de produzir um repertóriocompleto de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulinaendógena. Por exemplo, foi descrito que a deleção homozigótica do gene daregião de união de cadeia pesada do anticorpo (JH) em camundongosquiméricos e mutantes de linhagem germinal resulta em completa inibição deprodução de anticorpo endógeno. A transferência de arranjo do gene deimunoglobulina de linhagem germinal humana nestes camundongos mutantesde linhagem germinal irá resultar na produção de anticorpo humanos quandodo desafio com antígeno. Ver, por exemplo, Jakobovits et al., 1993, Proc.Natl. Acad. Sei. USA 90:2551; Jakobovits et al., 1993, Nature 362:255-258;Bruggermann et al., 1993, Year in Immuno. 7:33; e Patentes U.S. Nos.5.591.669; 5.589.369; 5.545.807; 6.075.181; 6.150.584; 6.657.103; e6.713.610.

Alternativamente, a tecnologia de exibição de fagos (ver, porexemplo, McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-553) pode ser usada paraproduzir anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos in vitro, dosrepertórios de genes de domínio variável de imunoglobulina (V) a partir dedoadores não imunizados. De acordo com esta técnica, genes de domínio deanticorpo V são clonados em quadro com um gene de proteína de capa maiorou menos de bacteriófago filamentoso, como Ml3 ou fd, e exibidos comofragmento funcional de anticorpos sobre a superfície da partícula do fago.Porque a partícula filamentosa contém uma cópia de DNA de filamento únicodo genoma do fago, seleções baseadas nas propriedades funcionais doanticorpo também resultam em seleção do gene codificando o anticorpodemonstrando estas propriedades. Assim, o fago imita algumas daspropriedades da célula B. A exibição de fagos pode ser realizada em umavariedade de formatos: para um estudo, ver, por exemplo, Johnson e Chiswell,1993, Current Opinion in Structural Biology 3:564-571. Várias fontes desegmentos de gene V podem ser usadas para exibição de fagos. Clackson etal., 1991, Nature 352:624-628 isolaram um arranjo diverso de anticorpos anti-oxazolona de uma biblioteca combinatorial aleatória pequena de genes Vderivados de baços de camundongos imunizados. Um repertório de genes Vde doadores humanos não imunizado pode ser construído e os anticorpos paraum arranjo diverso de antígenos (incluindo auto- antígenos) podem serisolados, essencialmente seguindo as técnicas descritas por Marks et al., 1991,J. Mol. Biol. 222:581-597, ou Griffith et al,1993, EMBO J. 12:725-734. Vertambém Patente U.S. Nos. 5.565.332 e 5.573.905. Como discutido acima,anticorpos humanos também podem ser gerados por células B ativadas invitro (ver Patentes U.S. Nos. 5.567.610 e 5.229.275).

Polinucleotídeos, Vetores, Células hospedeiras, e MétodosRecombinantes

Outras formas de realização englobam isolados depolinucleotídeos que compreendem uma seqüência codificando um anticorpoanti-CD40 humanizado, vetores, e células hospedeiras compreendendopolinucleotídeos, e técnicas recombinantes para produção do anticorpohumanizado. Os isolados de polinucleotídeo podem codificar qualquerformada desejada do anticorpo anti-CD40 incluindo, por exemplo, anticorposmonoclonais de comprimento completo, Fab, Fab1, F(ab')2, e Fv fragmentos,diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpos de cadeia única, eanticorpos multi-específicos formados a partir de fragmento de anticorpos.

Algumas formas de realização incluem polinucleotídeosisolados compreendendo seqüências que codificam um anticorpo oufragmento de anticorpo tendo a seqüência de região variável de cadeia pesadade aminoácidos de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ IDNO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, ou SEQID NO: 11. Algumas formas de realização incluem polinucleotídeos isoladoscompreendendo seqüências que codificam um anticorpo ou fragmento deanticorpo tendo uma seqüência de domínio variável de cadeia leve deaminoácidos de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, ou SEQ ID NO: 16.

Em um aspecto, as seqüência(s) de polinucleotídeo isoladocodifíca(m) um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo um domíniovariável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia levecompreendendo as seqüências de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO: 14, respectivamente;SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO: 14, respectivamente;SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:9 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 15, respectivamente;SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQ ID NO:7 e SEQ IDNO:16, respectivamente; SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:14, respectivamente;SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO: 10 e SEQ IDNO: 16, respectivamente; ou SEQ ID NÓ: 11 e SEQ ID NO: 16,respectivamente.

Em outro aspecto, a(s) seqüência(s) de polinucleotídeo isoladocodifica (m) um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo um domíniovariável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia levecompreendendo as seqüências de aminoácidos de SEQ ID NO:7 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 16, respectivamente;SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQ ID NO: 10 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 14, respectivamente;SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; e SEQ ID NO: 11 e SEQIDNO: 16, respectivamente.

Em ainda outro aspecto, a(s) seqüência(s) de polinucleotídeoisolado codifica(m) um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo umdomínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia levecompreendendo as seqüências de aminoácidos de SEQ ID NO:7 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 16, respectivamente;SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; e SEQ ID NO: 11 e SEQID NO: 16, respectivamente.

Em ainda outro aspecto, a(s) seqüência(s) de polinucleotídeoisolado codifica(m) um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo umdomínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia levecompreendendo as seqüências de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e umdomínio variável de cadeia leve compreendendo uma seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO: 16.

O(s) polinucleotídeo(s) que compreendem a seqüênciacodificando um anticorpo anti- CD40 humanizado ou um fragmento ou cadeiados mesmos pode(m) ser fundido(s) em uma ou mais seqüências regulatóriasou de controle, como conhecido na arte, e podem estar contidas em vetores deexpressão apropriados ou célula hospedeira como conhecido na arte. Cadauma dentre as moléculas de polinucleotídeos codificando os domíniosvariáveis de cadeia pesada ou leve pode ser independentemente fundido emuma seqüência de polinucleotídeo codificando um domínio constante, comoum domínio constante humano, permitindo a produção de anticorpos intactos.

Alternativamente, polinucleotídeos, ou porções dos mesmos, podem serfundido juntos, provendo um gabarito para a produção de um anticorpo decadeia única.

Para a produção recombinante, um polinucleotídeocodificando o anticorpo é inserido em um vetor replicável para clonagem(amplificação do DNA) ou para expressão. Muitos vetores apropriados para aexpressão do anticorpo recombinante são disponíveis. Os componentes devetor geralmente incluem, mas não são limitados a, um ou mais dos seguintes:uma seqüência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genesmarcadores, um elemento melhorador, um promotor, e uma seqüência determinação de transcrição.

Os anticorpos anti-CD40 humanizados também podem serproduzidos como polipeptídeos de fusão, em que o anticorpo é fundido comum polipeptídeo heterólogo, como uma seqüência de sinal ou outropolipeptídeo tendo um sítio de clivagem específico no término amino daproteína madura ou polipeptídeo. A seqüência de sinal heteróloga selecionadaé tipicamente uma que é reconhecida e processada (isto é, clivada por umapeptidase de sinal) pela célula hospedeira. Para células hospedeirasprocarióticas que não reconhecem e processam a seqüência de sinal deanticorpo anti-CD40 humanizado, a seqüência de sinal pode ser substituídapor uma seqüência de sinal procariótica. A seqüência de sinal pode ser porexemplo, fosfatase alcalina, penicilinase, lipoproteína, líderes de enterotoxinaII estáveis em calor, e outros. Para levedura secreção, a seqüência de sinalnativa pode ser substituída, por exemplo, com uma seqüência líder obtida delevedura invertase alfa-fator (incluindo líderes de a-fator de Saccharomyces eKluyveromyces), fosfatase de ácido, glucoamilase de C. albicans, ou o sinaldescrito em WO90/ 13646. Em células de mamíferos, seqüências de sinal demamíferos, assim como líderes secretórios virais, por exemplo, o sinal deherpes simplex gB, podem ser usadas. O DNA para esta região de precursor éligado na matriz de leitura para DNA codificando o anticorpo anti-CD40humanizado.

Os vetores de expressão e clonagem contém uma seqüência deácido nucleico que permite ao vetor replicar em uma ou mais célulashospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clonagem, estaseqüência é uma que permite ao vetor replicar independentemente do DNAcromossômico hospedeiro, e inclui origens de replicação ou seqüênciasreplicando autonomamente. Estas seqüências são bem conhecidas para umavariedade de bactérias, leveduras, e vírus. A origem de replicação doplasmídeo pBR322 é apropriada para a maior parte das bactérias Gram-negativas, a origem do plasmídeo 2jli é apropriada para a levedura, e váriasorigens virais (SV40, polioma, adenovírus, VSV, e BPV) são utilizáveis paraa clonagem de vetores em células de mamíferos. Geralmente, o componentede origem de replicação não é necessário para os vetores de expressão demamíferos (a origem SV40 pode ser tipicamente usada somente porque elacontém o promotor prematuro).

Os vetores de expressão e clonagem vetores podem conter umgene de seleção, também chamado um marcador selecionável. Os genes deseleção típicos codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticosou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, outetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecemnutrientes críticos não disponíveis de meios complexos, por exemplo, o genecodificando D-alanina racemase para Bacilli.

Um exemplo de um esquema de seleção utiliza uma droga paraparar o crescimento de uma célula hospedeira. Estas células que sãotransformadas com sucesso com um gene heterólogo produzem uma proteínaconferindo resistência aa droga e assim sobrevivem ao regime de seleção.Exemplos desta seleção dominante usam os drogas neomicina, ácidomicofenóüco e higromicina.

Outro exemplo de marcadores selecionáveis apropriados paraas células de mamífero são os que permitem a identificação de célulascompetentes para absorver um ácido nucleico codificando um anticorpo anti-CD40 humanizado, como DHFR (dihidrofolato reductase), timidina quinase,metalotioneína-I e -II (como genes metalotioneína de primatas), adenosinadeaminase, ornitina decarboxilase, e outros.

Por exemplo, células transformadas com o gene de seleção deDHFR são primeiro identificadas por cultivo de todos os transformantes emum meio de cultura que contém metotrexato (Mtx), um antagonistacompetitivo de DHFR. Uma célula hospedeira apropriada quando DHFR detipo selvagem é empregado é a linhagem de células de ovário de hamsterchinês (CHO) deficiente em atividade de DHFR (por exemplo, DG44).

Alternativamente, células hospedeiras (particularmentehospedeiros de tipo selvagem que contém DHFR endógeno) transformadas ouco-transformadas com seqüências de DNA codificando anticorpo anti-CD40,proteína DHFR de tipo selvagem, e outro marcador selecionável comoaminoglicosídeo 3 '-fosfotransferase (APH), podem ser selecionadas porcrescimento de células em meio contendo um agente de seleção para omarcador selecionável como antibiótico aminoglicosídico, por exemplo,canamicina, neomicina, ou G418. Ver, por exemplo, patente US no.4.965.199.

Um gene de seleção apropriado para uso em levedura é o geneTRP1 presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stinchcomb et al., 1979,Nature 282: 39). O gene TRPl prove um marcador de seleção para uma cepamutante de levedura faltando a capacidade para crescer em triptofano, porexemplo, ATCC No. 44076 ou PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85:12). Apresença da lesão trpl no genoma da célula hospedeira de levedura entãoprove um meio efetivo para detectar a transformação por crescimento naausência de triptofano. Similarmente, cepas de levedura deficientes emLeu2p, como ATCC 20,622 e 38,626 são complementadas por plasmídeosconhecidos contendo o gene LEU2.

Além disso, os vetores derivados de pKDl plasmídeo circular1,6 um podem ser usados para transformação de leveduras de Kluyveromyces.Alternativamente, um sistema de expressão para a produção em larga escalade quimisina de bezerro recombinante foi relatado para K. lactis (Van denBerg, 1990, Bio/Technology 8:135). Os vetores de expressão de múltiplascópias estável para secreção de albumina de soro humano recombinantemadura por cepas industriais de Kluyveromyces também foram mostrados(Fleer et al., 1991, Bio/Technology 9:968-975).Os vetores de expressão e clonagem geralmente contém umpromotor que é reconhecido para o organismo hospedeiro e é operativamenteligado à molécula de ácido nucleico codificando um anticorpo anti-CD40 oucadeia de polipeptídeo dos mesmos. Promotores apropriados para uso comhospedeiros procarióticos incluem promotor phoA, sistemas de promotor 0-lactamase e lactose, fosfatase alcalina, sistema promotor de triptofano (trp), epromotores híbridos como o promotor tac. Outros promotores bacterianosconhecidos são também apropriados. Promotores para uso em sistemasbacterianos também irão conter uma seqüência Shine-Dalgamo (S.D.)operativamente ligada ao DNA codificando o anticorpo anti-CD40humanizado.

Muitas seqüências de promotor eucarióticas são conhecidas.Virtualmente todos os genes eucarióticos tem uma região rica em ATlocalizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do sítio onde atranscrição é iniciada. Outra seqüência encontrada 70 a 80 bases a montantedo início da transcrição de muitos genes é uma região CNCAAT onde N podeser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3' da maior parte dos geneseucarióticos, está uma seqüência AATAAA que pode ser o sinal para adiçãoda cauda poli A para a extremidade 3' da seqüência de codificação. Todasestas seqüências são apropriadamente inseridas em vetores de expressãoeucarióticos.

Exemplos de seqüências de promotor apropriadas para usocom hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3-fosfogliceratoquinase ou outras enzimas glicolíticas, como enolase, gliceraldeído-3 -fosfatodesidrogenase, hexoquinase, piruvato decarboxilase, fosfofructoquinase,glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerate mutase, piruvato quinase,triosefosfato isomerase, fosfoglucose isomerase, e glucoquinase.

Os promotores indutíveis tem a vantagem adicional detranscrição controlada por condições de crescimento. Estes incluem regiões depromotor de levedura para álcool desidrogenase 2, isocitocromo C, ácidofosfatase, enzimas derivadas associadas com metabolismo de nitrogênio,metalotioneína, gliceraldeído-3 -fosfato desidrogenase, e enzimasresponsáveis por utilização de maltose e galactose. Apropriados vetores epromotores para uso em expressão de levedura são ainda descritos em EP73,657. Melhoradores de levedura também são usados com vantagem compromotores de levedura.

A transcrição de anticorpo anti-CD40 humanizado de vetoresem células hospedeiras de mamíferos é controlada, por exemplo, porpromotores obtidos dos genomas de vírus como vírus polioma, vírus doepitelioma contagioso das aves, adenovírus (como Adenovírus 2), víruspapiloma bovino, vírus sarcoma das aves, citomegalovírus, um retrovírus,vírus de hepatite-B e Vírus 40 símios (SV40), de promotores de mamíferosheterólogos, por exemplo, o promotor actina ou um promotor deimunoglobulina, ou de promotores de choque térmico, desde que estespromotores seja compatíveis com os sistemas de células hospedeiras.

Os promotores tardio e prematuro do vírus SV40 sãoconvenientemente obtidos como um fragmento de restrição de SV40 quetambém contém a origem viral de replicação de SV40. O promotor prematuroimediato do citomegalovírus humano é convenientemente obtido como umfragmento de restrição HindIII E. Um sistema para a expressão de DNA emhospedeiros mamíferos usando o vírus papiloma bovino como um vetor émostrado na patente US no. 4.419.446. Uma modificação deste sistema édescrita em patente US no. 4.601.978. Ver também Reyes et al., 1982, Nature297:598-601, descrevendo a expressão de cDNA p -interferon humano emcélulas de camundongo sob o controle de um promotor de timidina quinase devírus de herpes simplex. Alternativamente, a repetição terminal longa do vírusde sarcoma rous pode ser usada como um promotor.

Transcrição de um DNA codificando um anticorpo anti-CD40humanizado mostrado aqui por eucariotos superiores é com freqüência naumentada por inserção de uma seqüência de melhorador no vetor. Muitasseqüências de melhorador são agora conhecidas de genes de mamífero (porexemplo, globina, elastase, albumina, a-fetoproteína, e insulina).

Tipicamente, no entanto, um melhorador de um vírus de célula eucariótica éusado. Exemplos incluem o melhorador SV40 no lado tardio da origem dereplicação (bp 100-270), o melhorador do promotor prematuro decitomegalovírus, o melhorador de polioma no lado tardio da origem dereplicação, e melhoradores de adenovírus. Ver também Yaniv, 1982, Nature297:17-18 para uma descrição de elementos melhoradores para a ativação depromotores eucarióticos. O melhorador podem ser emendadOo no vetor emuma posição 5 1 ou 3' para a seqüência codificando o anticorpo anti-CD40humanizado, mas está preferivelmente localizado no sítio 5' do promotor.

Os vetores de expressão usados em células hospedeiraseucarióticas (levedura, fungos, insetos, plantas, animais, humanos, ou célulasnucleadas de outros organismos multicelulares) também podem conterseqüências necessárias para a terminação de transcrição e para estabilizar omRNA. Estas seqüências são comumente disponíveis de regiões nãotraduzidas 5' e, ocasionalmente 3', de DNAs ou cDNAs eucarióticos ou virais.

Estas regiões contém os segmentos de nucleotídeos transcritos comofragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA codificandoanticorpo anti-CD40. Um componente de terminação de transcrição utilizávelé a região de poliadenilação de hormônio de crescimento. Ver W094/11026 eo vetor de expressão mostrado aqui. Em algumas formas de realização,anticorpos anti-CD40 humanizados podem ser expressados usando o sistemaCHEF. (ver, por exemplo, patente US no. 5.888.809; cuja descrição éincorporada por referência aqui.)

As células hospedeiras apropriadas para clonagem ouexpressando o DNA nos vetores aqui são procariótico, levedura, ou eucariotossuperior, como descrito acima. Os procariotos apropriados para este fimincluem eubactérias, como organismos Gram-negativos ou Gram-positivos,por exemplo, Enterobacteriaceae como EScherichia, por exemplo, E. coli,Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por exemplo,Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia marcescans, eShigella, assim como Bacilli como B. subtilis e B. licheniformis (porexemplo, B. licheniformis 41 P mostrados em DD 266,710 publicado em 12de abril de 1989), Pseudomonas como P. aeruginosa, e Streptomyces.Umhospedeiro de clonagem preferido de E. coli é E. coli 294 (ATCC 31,446),apesar de outras cepas como E. coli B, E. coli XI 776 (ATCC 31,537), e E.coli W3110 (ATCC 27,325) serem apropriadas. Estes exemplos sãoilustrativos em vez de limitativos.

Além de procariotos, micróbios eucarióticos como fungosfilamentosos ou leveduras são hospedeiros apropriados de clonagem ouexpressão para vetores codificando anticorpos anti-CD40 humanizados.Saccharomyces cerevisiae, ou fermento de padaria comum é mais comumenteusado dentre os microorganismos eucarióticos inferiores hospedeiros. Noentanto, vários outros gêneros, espécies, e cepas são comumente disponíveis eutilizáveis aqui, como Schizosaccharomyces pombe; hospedeirosKluyveromyces como, por exemplo, K. lactis, K.fragilis (ATCC 12,424), K.bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, e K.marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastors (EP 183,070); Cândida;Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomycescomo Schwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos como, porexemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, e hospedeiros Aspergilluscomo A. nidulans e A. niger.

As células hospedeiras apropriadas para a expressão ofanticorpo anti-CD40 humanizado glicosilado são derivadas de organismosmulticelulares. Exemplos de células de invertebrados incluem células deplantas e insetos, incluindo, por exemplo, numerosas cepas baculovirais evariantes e células hospedeiras de insetos permissivas correspondentes dehospedeiros como Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito),Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca das frutas), eBombyx mori (bicho-de-seda). Uma variedade de cepas virais para transfeçãosão publicamente disponíveis, por exemplo, a variante L-I de Autographacalifornica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV, e estes vírus podemser usados, particularmente para transfeção de células de Spodopterafrugiperda.

As culturas de células de plantas de algodão, milho, batata,soja, petúnia, tomate e tabaco também podem ser utilizadas comohospedeiros.

Em outro aspecto, a expressão de anti-CD40 humanizado érealizada células de vertebrados. A propagação de células de vertebrados emcultura (cultura de tecido) se tornou um procedimento de rotina e técnicas sãoamplamente disponíveis. Exemplos de linhagens de célula hospedeira demamífero utilizáveis são a linhagem CVI de rim de macaco CV1 transformadapor SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), linhagem de rim embriônico humano(293 ou células 293 subclonadas para crescimento em cultura em suspensão(Graham et al., 1977, J Gen Virol. 36: 59), células de rim de hamster bebê(BHK, ATCC CCL 10), células de ovário de hamster chinês /-DHFR" (CHO,Urlaub et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77: 4216; por exemplo,DG44), células Sertoli de camundongo (TM4, Mather, 1980, Biol. Reprod.23:243-251), células de rim de macaco (CVI ATCC CCL 70), células de rimde macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL- 1587), células decarcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2), células de rim canino(MDCK, ATCC CCL 34), células de rim de rato búfalo (BRL 3A, ATCCCRL 1442), células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75), células defígado humano (Hep G2, HB 8065), tumor mamário de camundongo (MMT060562, ATCC CCL51), células TRI (Mather et al., 1982, Annals NY. Acad.Sei. 383: 44-68), células MRC 5, células FS4, e linhagem de hepatomahumano (Hep G2).

Células hospedeiras são transformadas com os vetores declonagem ou expressão acima -descritos para a produção de anticorpo anti-CD40 humanizado e cultivadas em meio nutriente convencional modificadocomo apropriado para induzir promotores, selecionar transformantes, ouamplificar os genes codificando as seqüências desejadas.

As células hospedeiras usadas para produzir um anticorpo anti-CD40 humanizado descritas aqui podem ser cultivadas em vários meios. Osmeios comercialmente disponíveis como FIO de Ham (Sigma- Aldrich Co.,St. Louis, MO), meio essencial mínimo ((MEM), (Sigma-Aldrich Co.),RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Co.), e meio de Eagle modificado por Dulbecco((DMEM), Sigma-Aldrich Co.) são apropriados para cultivar as célulashospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios descritos em um ou maisdentre Ham et al., 1979, Meth. Enz. 58: 44, Barnes et al., 1980, Anal Biochem.102: 255, patente US no. 4.767.704, patente US no. 4.657.866, patente US no.4.927.762, patente US no. 4.560.655, patente US no. 5.122.469, WO90/103430, e WO 87/00195 podem ser usados como meios de cultura para ascélulas hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado comonecessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (como insulina,transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (como cloreto de sódio,cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (como HEPES), nucleotídeos (comoadenosina e timidina), antibióticos (como gentamicina), elementos de traço(definidos como compostos inorgânicos geralmente presentes emconcentrações finais na faixa micromolar), e glucose ou uma fonte de energiaequivalente. Outros suplementos também podem ser incluídos em apropriadasconcentrações que devem ser conhecidas dos versados. As condições decultura, como temperatura, pH, e outros, são as previamente usadas com acélula hospedeira selecionada para expressão, e serão evidentes para osversados na arte.

Quando usando técnicas recombinantes, o anticorpo pode serproduzido intracelularmente, no espaço periplásmico, ou diretamentesecretado no meio. Se o anticorpo for produzido intracelularmente, as célulaspodem ser rompidas para liberar proteína como uma primeira etapa. Osresíduos particulados, ou células hospedeiras ou fragmentos lisados, podemser removidos, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltração. Carter et al.,1992, Bio/Technology 10:163- 167 descrevem um procedimento para isolaranticorpos que são secretados para o espaço periplásmico de E. coli.Brevemente, a pasta de células é descongelada na presença de acetato desódio (pH 3,5), EDTA, e fluoreto de fenil metilsulfonila (PMSF) durantecerca de 30 minutos. Os resíduos de células podem ser removidos porcentrifugação. Onde o anticorpo é secretado no meio, os sobrenadantes destessistemas de expressão são geralmente primeiro concentrados usando um filtrode concentração de proteína comercialmente disponível, por exemplo, umaunidade ultrafiltração de Amicon ou unidade Millipore Pellicon. Um inibidorde protease como PMSF pode ser incluído em qualquer uma das etapas acimapara inibir a proteólise e antibióticos podem ser incluídos para evitar ocrescimento de contaminantes adventícios. A variedade de métodos pode serusada para isolar o anticorpo da célula hospedeira.

A composição de anticorpos preparada a partir das célulaspode ser purificada usando, por exemplo, cromatografia hidroxilapatita,eletroforese de gel, diálise e cromatografia por afinidade, com cromatografiapor afinidade sendo uma técnica de purificação típica. A apropriabilidade deproteína A como um ligando de afinidade depende das espécies e isotipo dequalquer domínio Fc de imunoglobulina que está presente no anticorpo.Proteína A pode ser usada para purificar anticorpos que são baseados emcadeias pesadas humanas gama 1, gama 2, ou gama 4 (ver, por exemplo,Lindmark et al., 1983 J. Imunol. Meth. 62:1-13). Proteína G é recomendadapara todo os isotipos de camundongos e para gama 3 humano (ver, porexemplo, Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575). Uma matriz em que oligando de afinidade é fixado é com maior freqüência agarose, mas outrasmatrizes são disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis com vidro de porocontrolado ou poli(estirenodivinil) benzeno permitem que taxas de fluxo maisrápidas e tempos de processamento mais curtos possam ser obtidos comagarose. Onde o anticorpo compreende um domínio CH3, a resina BakerbondABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) é utilizável para purificação. Outrastécnicas para purificação de proteína como fracionamento em uma coluna detroca iônica, precipitação de etanol, HPLC em fase reversa, cromatografia emsílica, cromatografia em heparina SEPHAROSE™m cromatografia em umaresina de troca iônica ou catiônica (como uma coluna de ácido poliaspártico),chromatofocalização, SDS-PAGE, e precipitação de sulfato de amônio sãotambém disponíveis dependendo do anticorpo a ser recuperado.

Após as etapas de purificação preliminares, a misturacompreendendo o anticorpo de interesse e contaminantes pode ser submetidaa cromatografia de interação hidrofóbica de baixo pH usando um tampão deeluição em um pH de entre cerca de 2,5-4,5, tipicamente realizadas emconcentrações baixas de sal (por exemplo, de sal de cerca de 0-0,25M).

Condições de hibridização

Também são incluídos ácidos nucleicos que hibridizam sobcondições de estringência baixa, alta e moderada, como definido aqui, emtoda ou uma porção (por exemplo, uma porção codificando uma regiãovariável) da seqüência de nucleotídeo representada por SEQ ED NO: 17, ouseu complemento, ou SEQ ID NO:20 ou seu complemento. A porção dehibridização do ácido nucleico de hibridização é tipicamente de pelo menos15 (por exemplo, 20, 25, 30 ou 50) nucleotídeos de comprimento. A porçãode hibridização do ácido nucleico de hibridização é pelo menos 80%, porexemplo, pelo menos 90%, pelo menos 95%, ou pelo menos 98%, idêntica àseqüência de um porção ou de todo ácido nucleico codificando umpolipeptídeo anti- CD40 (por exemplo, uma região variável de cadeia pesadaou de cadeia leve), ou seu complemento. Os ácidos nucleicos de hibridizaçãodo tipo descritos aqui podem ser usados, por exemplo, como uma sonda declonagem, um iniciador, por exemplo, um iniciador de PCR, ou uma sondadiagnostica.

A título de exemplo e não limitação, procedimentos usandocondições de estringência baixa são os seguintes (ver também Shilo eWeinberg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:6789-6792). Em uma formade realização, filtros contendo DNA são pretratados durante 6 h a 40 °C emuma solução contendo 35%) formamida, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5mM EDTA5 0,1% PVP, 0,1% Ficoll, 1% BSA, e 500 ug/ml DNA de espermade salmão desnaturado. Hibridizações são realizadas na mesma solução comas seguintes modificações: 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 ug/mlDNA de esperma de salmão, 10%) (peso/vol) dextrano sulfato, e 5-20 X IO6cpm de sonda P-rotulada é usado. Filtros são incubados em mistura dehibridização durante 18-20 h a 40 °C, e então lavados durante 1,5 h a 55°C emuma solução contendo 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA, e0,1% SDS. A solução de lavagem é substituído com solução nova e incubadapor mais 11,5 h a 60 °C. Filtros são secados com mata-borrão e expostos paraauto-radiografia. SE necessário, filtros são lavados uma terceira vez a 65-68°C e re-expostos a filme. Em outra forma de realização, um exemplo decondições de baixa estringência incluem hibridização em um tampãocompreendendo 35% formamida, 5X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mMEDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,2% BSA, 100 ug/ml DNA de esperma desalmão desnaturado, e 10% (peso/vol) dextrano sulfato, durante 18-20 horas a40°C, lavando em um tampão consistindo de 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH7,4), 5 mM EDTA, e 0,1% SDS, durante 1,5 horas a 55 °C, e lavando em umtampão consistindo de 2X SSC, 25 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA, e0,1% SDS, durante 1,5 horas a 60 °C. Outras condições de estringência baixaque podem ser usadas são bem conhecidas na arte (por exemplo, comoempregado para hibridizações de espécies cruzadas).

A título de exemplo e não limitação, procedimentos usandocondições de estringência elevada são como a seguir. A pré-hibridização defiltros contendo DNA é realizada durante 8 h a durante a noite a 65°C emtampão composto de 6X SSC, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA,0,02% PVP, 0,02% Ficoll, 0,02% BSA, e 500 ug/ml DNA de esperma desalmão desnaturado. Filtros são hidridizados durante 48 h a 65°C em misturade prehibridização contendo 100 ug/ml DNA de esperma de salmãodesnaturado e 5-20 X IO6 cpm de sonda 32P-rotulada. Lavagem de filtros éfeita a 37°C durante 1 h em uma solução contendo 2X SSC, 0,01% PVP,0,01%o Ficoll, e 0,01% BSA. Isto é seguido por uma lavagem em 0,1X SSC a50 °C durante 45 min antes da auto-radiografia. Outras condições de altaestringência que podem ser usadas são bem conhecidos na arte.

A título de exemplo e não limitação, procedimentos usandocondições de estringência moderada são como a seguir: Filtros contendo DNAsão pretratados durante 6 horas a 55°C em uma solução contendo 6X SSC, 5Xsolução de Denhardt, 0,5% SDS e 100 ug/ml DNA de esperma de salmãodesnaturado. Hibridizações são realizadas na mesma solução com 5-20 x IO6cpm de sonda 32P-rotulada. Filtros são incubados em mistura de hibridizaçãodurante 18- 20 horas a 55°C, e então lavados duas vezes durante 30 minutos a60 °C em uma solução contendo IX SSC e 0,1 % SDS. Filtros são secados commata-borrão e expostos para auto-radiografia. Lavagem of filtros é feita a37°C durante 1 hora em uma solução contendo 2X SSC, 0,1% SDS. Outrascondições de estringência moderada que podem ser usados são bemconhecidos na arte (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, MolecularCloning, A Laboratory Manual, 2a. Ed., Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, New York; Sambrook et al., 2001; MolecularCloning, A Laboratory Manual, 3a. ed., Cold Spring Harbor Publish., ColdSpring Harbor, N. Y.; Ver também Ausubel et al., eds., na série de manuais detécnica de laboratório Current Protocols in Molecular Biology, 1987-1999,Current Protocols,© 1994- 199 John Wiley e Sons, Inc.).

Algumas formas de realização incluem isolados depolinucleotídeos incluindo seqüências que codificam um anticorpo oufragmento de anticorpo tendo uma seqüência de região variável de cadeiapesada de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, ou SEQ IDNO:ll. Algumas formas de realização incluem polinucleotídeos isoladosincluindo seqüências que codificam um anticorpo ou fragmento de anticorpotendo uma seqüência de domínio variável de cadeia leve de aminoácidos queé pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, oupelo menos 99% idêntica à seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO: 15, ou SEQ ID NO: 16.

Em um aspecto, a(s) seqüência(s) de polinucleotídeo isoladocodificam um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo um domíniovariável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, cada incluindouma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelomenos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ IDNO:4 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO: 14,respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ IDNO:7 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO: 14,respectivamente; SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ IDNO:6 e SEQ ID NO: 15, respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 16,respectivamente; SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQ IDNO: 10 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:l 1 e SEQ ID NO: 14,respectivamente; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; ou SEQID NO: 11 e SEQ ID NO: 16, respectivamente.

Em outro aspecto, a(s) seqüência(s) de polinucleotídeo isoladocodifica (m) um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo um domíniovariável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve, cadaincluindo uma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica àseqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO: 14,respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQ IDNO:7 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 14,respectivamente; SEQ ID NO:l 1 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ IDNO: 10 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; e SEQ ID NO: 11 e SEQ IDNO: 16, respectivamente.

Em ainda outro aspecto, a(s) seqüência (s) de polinucleotídeocodifica (m) um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo uma regiãovariável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, cada incluindouma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelomenos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ IDNO:6 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 16,respectivamente; e SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 16, respectivamente.

Em ainda outro aspecto, a(s) seqüência(s) de polinucleotídeoisolado codifica(m) um anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo uma regiãovariável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, cada incluindouma seqüência de aminoácidos que é pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelomenos 95%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% idêntica à seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO. 16, respectivamente.

Como usado aqui, os termos "idêntica" ou "identidadepercentual," no contexto de duas ou mais seqüências de ácidos nucleicos oupolipeptídeos, referem-se a duas ou mais seqüências ou subseqüências quesão iguais ou tem uma porcentagem especificada de resíduos de nucleotídeosou de aminoácidos que são iguais, quando comparados e alinhados para umacorrespondência máxima. Para determinar a identidade percentual, asseqüências são alinhadas para fins de comparação ótima (por exemplo,espaços podem ser introduzidos na seqüência de uma primeira seqüência deaminoácidos ou seqüência de ácido nucleico para um alinhamento ótimo coma segunda seqüência amino ou de ácido nucleico). Os resíduos deaminoácidos ou nucleotídeos nas posições correspondentes de aminoácidos ouposições nucleotídeo são então comparados. Quando a posição na primeiraseqüência é ocupada para o mesmo resíduo de aminoácido ou nucleotídeocomo a posição correspondente na segunda seqüência, então as moléculas sãoidênticas nesta posição. A identidade percentual entre as duas seqüências éuma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas seqüências(isto é, % identidade = # de posições idênticas / # total de posições (porexemplo, posições de sobreposição) x 100). Em algumas formas derealização, as duas seqüências que são comparadas tem o mesmocomprimento após os espaços serem introduzidos dentro das seqüências,como apropriado (por exemplo, excluindo a seqüência adicional seestendendo além das seqüências sendo comparadas). Por exemplo, quandoseqüências de região variável são comparadas, as seqüências de líder e/oudomínio constante não são consideradas. Para comparações de seqüênciaentre duas seqüências, um CDR "correspondente" refere-se a um CDR nomesmo local em ambas as seqüências (por exemplo, CDR-H1 de cadaseqüência).

A determinação de identidade percentual ou similaridadepercentual entre duas seqüências pode ser obtida usando um algoritmomatemático. Um exemplo preferido, não limitativo, de um algoritmomatemático utilizado para a comparação de duas seqüências é o algoritmo deKarlin e Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2264-2268,modificado como em Karlin e Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA90:5873-5877. Um tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST eXBLAST de Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410. As buscasBLAST de nucleotídeo podem ser realizadas com o programa NBLAST,escore = 100, comprimento de palavra = 12, para obter seqüências denucleotídeo homologas a um ácido nucleico codificando uma proteína deinteresse. As buscas de proteína BLAST podem ser realizadas com oprograma XBLAST, escore = 50, comprimento de palavra = 3, para obterseqüências de aminoácidos homóloga à proteína de interesse. Para obteralinhamentos com espaços para fins de comparação, Gapped BLAST pode serutilizado como descrito em Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, PSI- Blast pode ser usado para realizar uma buscaiterada que detecta relações distantes entre as moléculas (Id.). Quando usandoprogramas BLAST, Gapped BLAST, e PSI-Blast, os parâmetros de defaultdos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem serusados. Outro exemplo preferido, não limitativo, de um algoritmo matemáticoutilizado para a comparação de seqüências é o algoritmo de Myers e Miller,CABIOS (1989). Este algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão2.0) que faz parte do pacote de software de alinhamento de seqüência GCG.Quando utilizando o programa ALIGN para comparação de seqüências deaminoácidos, uma tabela de resíduo ponderai PAM1 20, uma penalidade decomprimento de espaço de 12, e uma penalidade de espaço de 4 podem serusadas. Os algoritmos adicionais para análise de seqüência são conhecidos naarte e incluem ADVANCE e ADAM como descrito em Torellis e Robotti,1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5; e FASTA descritos em Pearson eLipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444-8. Em FASTA, ktup éuma opção de controle que fixa a sensitividade e velocidade da busca. Sektup=2, regiões similares nas duas seqüências sendo comparadas forencontrado ao se procurar em pares de resíduos alinhadas; se ktup=l,aminoácidos alinhados únicos são examinados, ktup pode ser configurado em2 ou 1 para seqüências de proteína, ou de 1 a 6 para seqüências de DNA. Odefault se ktup não for especificado é 2 para proteínas e 6 para DNA.Alternativamente, alinhamento de seqüência de proteína pode ser realizadousando o algoritmo CLUSTAL W, como descrito por Higgins et al., 1996,Methods Enzymol. 266:383-402.

Usos não terapêuticos

Os anticorpos descritos aqui são utilizáveis como agentes depurificação de afinidade. Neste processo, os anticorpos são imobilizados emuma fase sólida como resina Sephadex ou papel de filtro, usando métodosbem conhecidos na arte. O anticorpo imobilizado é contatado com a amostracontendo Proteína CD40 (ou fragmento da mesma) a ser purificada, e a seguiro suporte é lavado com um solvente apropriado que irá removersubstancialmente todo o material na amostra exceto a Proteína CD40, que éligada ao anticorpo imobilizado. Finalmente, o suporte é lavado com outrosolvente apropriado, como tampão glicina, pH 5,0 que irá liberar a ProteínaCD40 do anticorpo.

Anticorpos anti-CD40 humanizados são também utilizáveisem testes diagnósticos para detectar e/ou quantificar Proteína CD40, porexemplo, detectando a expressão de CD40 em células, tecidos ou soroespecíficos.

Para aplicações diagnosticas, o anticorpo tipicamente serárotulado com uma porção detectável. Numerosos rótulos são disponíveis quepodem ser geralmente agrupados nas seguintes categorias:

(a) Radioisótopos, por exemplo, como 35S, 14C, 1251,3H, e 13!I.The anticorpo pode ser rotulado com o radioisótopo, usando the técnicasdescritas em, por exemplo, Current Protocols in Imunology, Volumes 1 e 2,1991, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, N. Y., Pubs.Radioatividade pode ser medida por exemplo, por contagem de cintilação.

(b) rótulos fluorescentes como quelatos de terra rara (quelatosde európio) ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados,dansila, Lissamina, ficoeritrina, e Texas Red são disponíveis. Os rótulosfluorescentes podem ser conjugados ao anticorpo via técnicas conhecidas,como as mostradas em Current Protocols in Imunology, supra, por exemplo.Fluorescência pode ser quantificada usando um fluorímetro.

(c) Vários rótulos de enzima-substrato são disponíveis, ver,por exemplo, patente US no. 4.275.149 que prove uma revisão de alguns dosmesmos). A enzima geralmente catalisa uma alteração química do substratocromogênico que pode ser medida usando várias técnicas. Por exemplo, aenzima pode catalisar uma mudança de cor em um substrato que pode sermedida espectrofotometricamente. Alternativamente, a enzima pode alterar afluorescência ou quimiluminescência do substrato. Técnicas para quantificaruma mudança na fluorescência são descritas acima. O substratoquimiluminescente se torna eletronicamente excitado por uma reação químicae pode então emitir luz que pode ser medida, usando um quimiluminômetro,por exemplo, ou doa energia para um receptor fluorescente. Os exemplos derótulos enzimáticos incluem luciferases como luciferase de vaga-lume eluciferase bacteriana (patente US no. 4.737.456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinedionas, malato desidrogenase, urease, peroxidase comoperoxidase de raiz forte(HRPO), fosfatase alcalina, |3 -galactosidase,glucoamilase, lisozima, sacarídeo oxidases (como glucose oxidase, galactoseoxidase, e glucose-6-fosfato desidrogenase), oxidases heterocíclicas (comouricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase, e outras.Técnicas para conjugar enzimas em anticorpos são descritas, por exemplo, em0'Sullivan et ai., 1981, Methods for the Preparation of Enzyme- antibodyConjugates for use in Enzyme Imunoassays, em Methods in Enzym. (J.Langone & H. Van Vunakis, eds.), Academic press, N. Y., 73: 147-166.

Exemplos de combinações enzima-substrato incluem, porexemplo:

(a) peroxidase de raiz forte (HRPO) com hidrogênioperoxidase como um substrato, em que a hidrogênio peroxidase oxida umprecursor de corante como ortofenileno diamina (OPD) ou cloridrato de3,3',5,5'-tetrametil benzidina (TMB);

(b) fosfatase alcalina (AP) com para-Nitrofenil fosfato comosubstrato cromogênico, e

(c) (3-D-galactosidase ((3 -D-Gal) com um substratocromogênico como p- nitrofenil- (3-D-galactosidase ou substrato fluorgênico4-metilumbeliferil- P - D-galactosidase.

Numerosas outras combinações de enzima-substrato sãodisponíveis para os versados na arte. Para uma revisão geral das mesmas, Verpatente US no. 4.275.149 e patente US no. 4.318.980.

O rótulo pode ser indiretamente conjugado com o anticorpousando várias técnicas conhecidas. Por exemplo, os anticorpo podem serconjugados com biotina e qualquer uma das três categorias amplas de rótulosmencionados acima pode ser conjugada com avidina, ou vice versa. Biotinaliga seletivamente a avidina e assim, o rótulo pode ser conjugado com oanticorpo neste modo indireto. Alternativamente, para obter uma conjugaçãoindireta do rótulo com o anticorpo, o anticorpo pode ser conjugado com umhapteno pequeno (como digoxina) e um dos tipos diferentes de rótulos acimamencionado é conjugado com um anticorpo anti-hapteno (por exemplo,anticorpo anti-digoxina). Assim, a conjugação indireta do rótulo com oanticorpo pode ser obtida.

Em outra forma de realização, o anticorpo anti-CD40humanizado é usado não rotulado e detectado com um anticorpo rotulado queliga o anticorpo anti-CD40 humanizado.

Os anticorpos descritos aqui podem ser empregados emqualquer método de teste conhecido, como testes de ligação competitivos,testes sandwich diretos e indiretos, e testes de imunoprecipitação. Ver, porexemplo, Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pags..l47-158 (CRC Press, Inc. 1987).

Kits diagnósticos

Um anticorpo anti-CD40 humanizado pode ser usado em umkit diagnóstico, isto é, uma combinação embalada de reagentes emquantidades predeterminadas com instruções para realizar o teste diagnóstico.Onde o anticorpo é rotulado com uma enzima, o kit pode incluir substratos ecofatores requeridos para a enzima como um precursor de substrato que proveo cromóforo ou fluoróforo detectável. Além disso, outros aditivos podem serincluídos como estabilizadores, tampões (por exemplo tampão de bloco, outampão de lise), e outros. As quantidades relativas dos vários reagentespodem ser variadas amplamente para prover concentrações em solução doreagentes que substancialmente otimizam a sensibilidade do teste. Osreagentes podem ser providos como pós secos, geralmente liofilizadosincluindo excipientes que em dissolução irão prover uma solução reagentetendo a concentração apropriada.

Usos terapêuticos

Em outra forma de realização, um anticorpo anti-CD40humanizado mostrado aqui é utilizável no tratamento de vários distúrbiosassociados com a expressão de CD40 como descrito aqui.

O anticorpo anti-CD40 humanizado ou agente é administradopor qualquer meio apropriado, incluindo parenteral, subcutâneo,intraperitoneal, intrapulmonar, e intranasal, e, se desejado para tratamentolocal imunossupressivo, administração intralesional (incluindo perfundido oude outra forma contatando o enxerto com o anticorpo antes do transplante). Oanticorpo anti-CD40 humanizado ou agente pode ser administrado, porexemplo, como uma infusão ou como um bolo. As infusões parenteraisincluem administração intramuscular, intravenosa, intraarterial,intraperitoneal, ou subcutânea. Além disso, o anticorpo anti-CD40humanizado é apropriadamente administrado por infusão de pulsos,particularmente com doses declinantes do anticorpo. Em um aspecto, adosagem é dada por injeções, mais preferivelmente injeções intravenosa ousubcutânea, dependendo em parte ou se a administração é breve ou crônica.

Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagemapropriado de anticorpo irá depender de uma variedade de fatores como o tipode doença a ser tratado, como definidos acima, a severidade e curso dadoença, se o anticorpo é administrado para fins preventivos ou terapêuticos,terapia anterior, o histórico clínico do paciente, e resposta ao anticorpo, e aopinião do médico clínico. O anticorpo é apropriadamente administrado aopaciente de uma vez ou em uma série de tratamentos.

Dependendo do tipo e severidade da doença, cerca de 1 ug/kga 20 mg/kg (por exemplo, 0,1-15 mg/kg) de anticorpo é uma dosagemcandidata iniciai para a administração ao paciente, se, por exemplo, para umaou mais administrações separadas ou uma infusão contínua. Uma dosagemdiária típica pode estar na faixa de cerca de 1 ug/kg a 100 mg/kg ou mais,dependendo dos fatores acima mencionados. Para administrações repetidasdurante vários dias ou mais tempo, dependendo da condição, o tratamento émantido até uma supressão desejada dos sintomas da doença ocorrer. Noentanto, outros regimes de dosagem podem ser utilizáveis. O progresso daterapia é facilmente monitorado por técnicas e testes convencionais. Umregime de dosagem exemplar é o mostrado em WO 94/04188.

A composição de anticorpo será formulada, dosada, eadministrada em um modo consistentes com a boa prática médica. Fatorespara consideração neste contexto incluem os distúrbios particulares sendotratados, o mamífero particular sendo tratado, a condição clínica do pacienteindividual, a causa do distúrbio, o sítio de liberação do agente, o método deadministração, o esquema de administração, e outros fatores conhecidos dosmédicos clínicos. A "quantidade terapeuticamente eficaz" do anticorpo a seradministrado será governada por estes considerações, e é a quantidademínima necessária para evitar, melhorar ou tratar o distúrbio associado com aexpressão de CD40.

O anticorpo não precisa ser mas é opcionalmente, formuladocom um ou mais agentes correntemente usados para evitar ou tratar odistúrbio em questão. A quantidade eficaz destes outros agentes depende daquantidade de anticorpo anti-CD40 humanizado presente na formulação, otipo de distúrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos acima. Estes sãogeralmente usados nas mesmas dosagens e com vias de administração comousadas aqui antes ou de cerca de 1 a 99% das dosagens empregadas até agora.

Distúrbios associados com CD40

Os anticorpos anti-CD40 ou agentes são utilizáveis para otratamento ou prevenção de um câncer expressando CD40 ou um distúrbioimunológico caracterizado por expressão de CD40, por exemplo, por ativaçãoinapropriado de células imunes (por exemplo, linfócitos ou célulasdendríticas). Esta expressão de CD40 pode ser devido a, por exemplo, níveisaumentados de Proteína CD40 na superfície das células e/ou antigenicidadealterada do CD40 expressado. Tratamento ou prevenção do distúrbioimunológico, de acordo com métodos descritos aqui, é obtido poradministração a um indivíduo in necessidade deste tratamento ou prevençãode uma quantidade eficaz do anticorpo anti-CD40 ou agente, pelo que oanticorpo (i) liga células imunes ativadas que expressam CD40 e que sãoassociadas com o estado da doença e (ii) exercem um efeito citotóxico,citostático, ou imunossupressivo sobre as células imunes ativadas.As doenças imunológicas que são caracterizados por ativaçãoinapropriada de células imunes e que podem ser tratadas ou evitadas pelosmétodos descritos aqui podem ser classificadas, por exemplo, pelo (s) tipo (s)de reação (s) de hipersensibilidade que estão subjacentes ao distúrbio. Estasreações são tipicamente classificadas em quatro tipos: reações anafiláticas,reações citotóxicas (citolíticas), reações do complexo imune, ou reações deimunidade mediadas por células (CMI) (também referidas como reações dehipersensibilidade de tipo retardado (DTH).

(ver, por exemplo, Fundamental Imunology (William E. Pauled., Raven Press, N.Y., 3rd ed. 1993).)

Os exemplos específicos destas doenças imunológicas incluemos seguintes: artrite reumatóide, doenças demielinativas autoimunes (porexemplo, esclerose múltipla, encefalomielite alérgica), oftalmopatiaendocrina, uveoretinite, lúpus eritematoso sistêmico, miastenia grave, doençade Grave, glomerulonefrite, distúrbio hepatologico autoimune, doença deintestino inflamatória (por exemplo, doença de Crohn ou colite ulcerativa),anafilaxia, reação alérgica, síndrome de Sjogren, diabetes melito tipo I,cirrose biliar primária, granulomatose de Wegener, fibromialgia, polimiosite,dermatomiosite, miosite inflamatória, falha endocrina múltipla, síndrome deSchmidt, uveite autoimune, doença de Addison, adrenalite, tiroidite, tiroiditede Hashimoto, doença da tiróide autoimune, anemia perniciosa, atrofiagástrica, hepatite crônica, hepatite lupíde, aterosclerose, lúpus eritematosocutâneo sub-agudo, hipoparatiroidismo, síndrome de Dressier,trombocitopenia autoimune, púrpura trombocitopênica idiopática, anemiahemolítica, penfigo vulgaris, penfigo, dermatite herpetiformis, alopeciaareata, penfigóide, escleroderma, esclerose sistêmica progressiva, síndromede CREST (calcinose, fenômeno de Rainaud, dismotilidade esofageana,esclerodactilidade, e telangiectasia), infertilidade autoimune masculina efeminina, espondolite anquilosante, colite ulcerativa, doença do tecidoconectivo mista, poliarterite nodosa, vasculite necrotizante sistêmica,dermatite atópica, rinite atópica, síndrome de Goodpasture, doença deChagas, sarcoidose, febre reumática, asma, aborto recorrente, síndrome anti-fosfolipídeo, pulmão de fazendeiro, eritema multiforme, síndrome póscardiotomia, síndrome de Gushing, hepatite ativa crônica autoimune, pulmãode bird-fancier, necrolise epidérmica tóxica, síndrome de Alport, alveolite,alveolite alérgica, alveolite fibrosante, doença de pulmão intersticial, eritemanodoso, pioderma gangrenoso, reação de transfusão, arterite de Takaiasu,polimialgia reumática, arterite temporal, esquistosòmiase, arterite de célulagigante, ascariase, aspergilose, síndrome de Sampter, eczema, granulomatoselinfomatóide, doença de Behcet, síndrome de Caplan, doença de Kawasaki,dengue, encefalomielite, endocardite, fibrose endomiocardial, endoftalmite,eritema elevatum et diutinum, psoriase, eritroblastose fetalis, faciiteeosinofílica, síndrome de Shulman, síndrome de Felti, filariase, ciclite, ciclitecrônica, ciclite heterocrônica, ciclite de Fuch, nefropatia de IgA, Henoch-Sconlein púrpura, doença de enxerto versus hospedeiro, rejeição a transplante,cardiomiopatia, síndrome de Eaton- Lambert, policondrite com relapso,crioglobulinemia, macroglobulemia de Waldenstrom, síndrome de Evan,síndrome de falta de ar aguda, inflamação pulmonar, osteoporose,hipersensibilidade de tipo retardada e falha gonadal autoimune.

Conseqüentemente, os métodos descritos aqui englobamtratamento de distúrbios de linfócitos B (por exemplo, lúpus eritematososistêmico, síndrome de Goodpasture, artrite reumatóide, e diabetes tipo I),linfócitos Thi (por exemplo, artrite reumatóide, esclerose múltipla, psoriase,síndrome de Sjorgren, tiroidite de Hashimoto, doença de Grave, cirrose biliarprimária, granulomatose de Wegener, tuberculose, ou doença de hospedeiroversus enxerto), ou linfócitos Th2 (por exemplo, dermatite atópica, lúpuseritematoso sistêmico, asma atópica, rinoconjuntivite, rinite alérgica,síndrome de Omenn, esclerose sistêmica, ou doença de enxerto versushospedeiro crônica). Geralmente, distúrbios envolvendo células dendríticasenvolvem distúrbios de linfócitos Thi ou linfócitos Th2.

Em algumas formas de realização, o distúrbio imunológico éum distúrbio imunológico mediado por células T, como um distúrbio decélulas T em que as células T ativadas associadas com o distúrbio expressamCD40. Anticorpos anti-CD40 ou agentes podem ser administrados paradepletar estas células T ativadas expressando CD40. Em uma forma derealização específica, a administração de anticorpo anti-CD40s ou agentespode depletar células T ativadas expressando CD40, enquanto as células Tlatentes não são substancialmente depletadas pelo anti-CD40 ou agente. Nestecontexto, "não substancialmente depletado" significa que menos do que cercade 60%, ou menos do que cerca de 70% ou menos do que cerca de 80% decélulas latentes não são depletadas.

O anticorpo anti-CD40s e agentes como descritos aqui sãotambém utilizáveis para o tratamento ou prevenção de um câncer expressandoCD40. Tratamento ou prevenção de um câncer expressando CD40, de acordocom métodos descritos aqui, é obtido por administração a um indivíduo emnecessidade deste tratamento ou prevenção de uma quantidade eficaz doanticorpo anti-CD40 ou agente, pelo que o anticorpo ou agente (i) liga acélulas de câncer expressando CD40 e (ii) exerce um efeito citotóxico oucitostático para depletar ou inibir a proliferação das células de câncerexpressando CD40.

Os cânceres expressando CD40 que podem ser tratados ouevitados pelos métodos descritos aqui incluem, por exemplo, leucemia, comoleucemia aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda (porexemplo, mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica, oueritroleucemia), leucemia crônica, leucemia mielocítica crônica(granulocítica), ou leucemia linfocítica crônica; Policitemia vera; Linfoma(por exemplo, Doença de Hodgkin ou doença não de Hodgkin); mielomamúltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom; doença de cadeia pesada;tumores sólidos como sarcomas e carcinomas (por exemplo, fibrosarcoma,mixosarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogênico,osteosarcoma, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma,linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing,leiomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de colon, carcinomacolorectal, câncer pancreático, câncer de mama, câncer ovariano, câncer depróstata, carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula basal,adenocarcinoma, carcinoma das glândulas sudoríparas, carcinoma dasglândulas sebáceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares,cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinomade célula renal, hepatoma, carcinoma do duto biliar, coriocarcinoma,seminoma, carcinoma embrional, tumor de Wilms, câncer cervical, cânceruterino, tumor testicular, carcinoma de pulmão, carcinoma de pulmão decélula pequena, carcinoma de pulmão não de célula pequena, carcinoma dabexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma,craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuromaacústico, oligodendroglioma, menangioma, melanoma, neuroblastoma,retinoblastoma, carcinoma nasofaringeal, ou carcinoma esofageano).

Composições farmacêuticas e administração das mesmas

A composição compreendendo um agente de ligação de CD40(por exemplo, um anticorpo anti-CD40) pode ser administrada a um indivíduotendo ou em risco de ter um distúrbio imunológico ou um câncer expressandoCD40. A invenção ainda prove o uso de um agente de ligação de CD40 (porexemplo, um anticorpo anti-CD40) na fabricação de um medicamento para aprevenção ou tratamento de um câncer expressando CD40 ou distúrbioimunológico. Os termos "indivíduo" como usado aqui significam qualquerpaciente mamífero ao qual um agente de ligação de a CD40 pode seradministrado, incluindo, por exemplo, mamíferos humanos e não humanos,como primatas, roedores, e cachorros. Os indivíduos especificamentedestinados para tratamento usando os métodos descritos aqui incluemhumanos. Os anticorpos ou agentes podem ser administrados ou sozinhos ouem combinação com outras composições na prevenção ou tratamento dodistúrbio imunológico ou câncer expressando CD40.

Vários sistemas de liberação são conhecidos e podem serusados para administrar o agente de ligação de CD40. Métodos de introduçãoincluem mas não são limitados a vias intradérmica, intramuscular,intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural, e oral. O agentede ligação de CD40 pode ser administrado, por exemplo por infusão, bolo ouinjeção, e pode ser administrado junto com outros agentes biologicamenteativos, como agentes quimioterapêuticos. Administração pode ser sistêmicaou local.

Em formas de realização específicas, a composição de agentede ligação de CD40 é administrada por injeção, por meio de um cateter, pormeio de um supositório, ou por meio de implante, o implante sendo de ummaterial poroso, não poroso, ou gelatinoso, incluindo uma membrana, comouma membrana sialástica, ou uma fibra. Tipicamente, quando administrando acomposição, materiais em que o anticorpo anti-CD40 ou agente não absorvesão usados.

Em outras formas de realização, o anticorpo anti-CD40 ouagente é distribuído em um sistema de liberação controlada. Em um forma derealização, uma bomba pode ser usada (ver, por exemplo, Langer, 1990,Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201;Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, JV. Engl. J. Med.321:574). Em outra forma de realização, materiais poliméricos podem serusados, (ver, por exemplo, Medicai Applications of Controlled Release(Langer e Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1974); ControlledDrug Bioavalilability, Drug Product Design and Performance (Smolen e Balieds., Wiley, New York, 1984); Ranger e Peppas, 1983, Macromol. ScL Rev.Macromol. Chem. 23:61. Ver também Levy et al., 1985, Science 228:190;During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg.71:105.) Outros sistemas de liberação são discutidos, por exemplo, emLanger, supra.

Um agente de ligação de CD40 (por exemplo, um anticorpoanti-CD40) pode ser administrado nas composições farmacêuticascompreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz do agente de ligaçãoe um ou mais ingredientes farmaceuticamente compatíveis. Por exemplo, acomposição farmacêutica tipicamente inclui um ou mais veículosfarmacêuticos (por exemplo líquidos estéreis, como água e óleos, incluindo osde origem em petróleo, animal, vegetal ou sintética, como óleo de amendoim,óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo, e outros). Agua é um veículo maistípico quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente.

As soluções salinas e soluções de dextrose e glicerol aquosas também podemser empregadas como veículos líquidos, particularmente para soluçõesinjetáveis. Os excipientes farmacêuticos apropriados incluem, por exemplo,amido, glucose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílicagel, esíearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leitedesnatado, glicerol, propileno, glicol, água, etanol, e outros. Outrosexcipientes farmacêuticos apropriados incluem aminoácidos (por exemploarginina, histidina, glicina), tensoativos (por exemplo polissorbatos), eaçúcares e álcoois de açúcar (por exemplo sacarose ou sorbitol e outrospolióis (por exemplo trehalose). A composição, se desejado, também podeconter quantidades menores de agentes umectantes ou emulsificantes, ouagentes de tampão de pH. Estas composições podem tomar a forma desoluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas pós,formulações de liberação sustentada, e outros. A composição pode serformulada como um supositório, com aglutinantes tradicionais, e veículoscomo triglicerídeos. As formulações orais podem incluir veículos padrõescomo tipos farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio,sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Os exemplos deveículos farmacêuticos apropriados são descritos em "Remington'sPharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Estas composições irão conteruma quantidade terapeuticamente eficaz de ácido nucleico ou proteína,tipicamente em forma purificada, junto com uma quantidade apropriada deveículo de modo a prover a forma para administração apropriada ao paciente.

As formulações correspondem ao modo de administração.

Em formas de realização típicas, a composição farmacêutica éformulada de acordo com os procedimentos de rotina como uma composiçãofarmacêutica adaptada para administração intravenosa aos seres humanos.

Tipicamente, composições para administração intravenosa são soluções emtampão aquoso isotônico estéril. Quando necessário, a droga também podeincluir um agente solubilizante e um anestésico local como lignocaína paramelhorar a dor no sítio da injeção. Geralmente, os ingredientes são supridosou em separado ou misturados juntos em forma de dosagem unitária, porexemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado sem água em umrecipiente hermeticamente vedado como uma ampola ou saquinho indicando aquantidade de agente ativo. Onde a droga deve ser administrado por infusão,ele pode ser distribuído com um frasco de infusão contendo solução salina ouágua de tipo farmacêutico estéril. Onde a droga é administrado por injeção, aampola de água estéril para injeção ou solução salina podem ser providos demodo que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

Além disso, a composição farmacêutica pode ser provida comoum kit farmacêutico compreendendo (a) um recipiente contendo um agente deligação de CD40 (por exemplo, um anticorpo anti-CD40) em forma liofilizadae (b) um segundo recipiente contendo um diluente farmaceuticamenteaceitável (por exemplo, água estéril) para injeção. O diluentefarmaceuticamente aceitável pode ser usado para reconstituição ou diluiçãodo anticorpo anti-CD40 liofilizado ou agente. Opcionalmente associado comestes recipiente(s) pode estar um aviso da forma prescrita por uma agência decontrole governamental regulando a fabricação, uso ou venda de produtosfarmacêuticos ou biológicos, cujo aviso reflete a aprovação pela agência dafabricação, uso ou venda para administração humana.

A quantidade do agente de ligação de CD40 (por exemplo,anticorpo anti-CD40) que é eficaz no tratamento ou prevenção de umdistúrbio imunológico ou câncer expressando CD40 pode ser determinada portécnicas clínicas padrões. Além disso, testes in vitro podem ser opcionalmenteempregados para ajudar a identificar faixas de dosagem ótimas. A doseprecisa a ser empregada na formulação irá também depender da via deadministração, e o estágio de distúrbio imunológico ou câncer expressandoCD40, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do clínico e cadacircunstância do paciente. As doses eficazs podem ser extrapoladas das curvasde resposta a dose derivadas de sistemas de teste de modelo animal ou invitro.

Por exemplo, a toxicidade e eficácia terapêutica do anticorpoanti-CD40 ou agente podem ser determinadas em culturas de células ouanimais experimentais por procedimentos farmacêuticos padrões para adeterminação de LD50 (a dose letal a 50% da população) e o ED5o (a doseterapeuticamente eficaz em 50% da população). A relação de dose entreefeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressadocomo a relação LD50/ ED5o. O agente de ligação deCD40 (por exemplo umanticorpo anti-CD40) que demonstra um grande índice terapêutico épreferido. Onde um agente de ligação de CD40 demonstra efeitos lateraistóxicos, um sistema de liberação que marca o agente de ligação CD40 para osítio de tecido afetado pode ser usado para minimizar o dano em potencial àscélulas não expressando CD40 e, assim, reduzir os efeitos laterais.Os dados obtidos de testes de cultura de células e estudos comanimais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosagem para usoem humanos. A dosagem do agente de ligação de CD40 tipicamente está emuma faixa de concentrações de circulação que incluem o CD50 com pouca ounenhuma toxicidade. A dosagem pode variar na faixa dependendo da formade dosagem empregada e a via de administração usada. Para qualquer agentede ligação de CD40 usado no método, a dose terapeuticamente eficaz pode serestimada inicialmente de testes de cultura de células. Uma dose pode serformulada em modelos animais para obter uma faixa de concentração noplasma circulante que inclui o IC50 (isto é, a concentração do composto deteste que obtém uma inibição meia-máxima de sintomas) como determinadoem cultura de células. Esta informação pode ser usada para determinar maisprecisamente as doses utilizáveis em humanos. Níveis em plasma podem sermedidos, por exemplo, por cromatografia de líquido de elevado desempenho.

Geralmente, a dosagem de um anticorpo anti-CD40 ou agentede ligação de CD40 administrado a um paciente com um distúrbioimunológico ou câncer expressando CD40 é tipicamente de cerca de 0,1mg/kg a cerca de 100 mg/kg do peso corporal do indivíduo. A dosagemadministrada a um indivíduo é de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 50 mg/kg,cerca de 1 mg/kg a cerca de 30 mg/kg, cerca de 1 mg/kg a cerca de 20 mg/kg,cerca de 1 mg/kg a cerca de 15 mg/kg, ou cerca de 1 mg/kg a cerca de 10mg/kg do peso corporal do indivíduo.

As doses exemplares incluem, mas não são limitados a, de 1ng/kg a 100 mg/kg. Em algumas formas de realização, a dose é cerca de 0,5mg/kg, cerca de 1 mg/kg, cerca de 2 mg/kg, cerca de 3 mg/kg, cerca de 4mg/kg, cerca de 5 mg/kg, cerca de 6 mg/kg, cerca de 7 mg/kg, cerca de 8mg/kg, cerca de 9 mg/kg, cerca de 10 mg/kg, cerca de 11 mg/kg, cerca de 12mg/kg, cerca de 13 mg/kg, cerca de 14 mg/kg, cerca de 15 mg/kg ou cerca de16 mg/kg. A dose pode ser administrada, por exemplo, diariamente, uma vezpor semana (semanalmente), duas vezes por semana, três vezes por semana,quatro vezes por semana, cinco vezes por semana, seis vezes por semana, bi-semanalmente ou mensalmente. Em formas de realização específicas, a dose écerca de 0,5 mg/kg/semana, cerca de 1 mg/kg/semana, cerca de 2mg/kg/semana, cerca de 3 mg/kg/semana, cerca de 4 mg/kg/semana, cerca de5 mg/kg/semana, cerca de 6 mg/kg/semana, cerca de 7 mg/kg/semana, cercade 8 mg/kg/semana, cerca de 9 mg/kg/semana, cerca de 10 mg/kg/semana,cerca de 11 mg/kg/semana, cerca de 12 mg/kg/semana, cerca de 13mg/kg/semana, cerca de 14 mg/kg/semana, cerca de 15 mg/kg/semana oucerca de 16 mg/kg/semana. Em algumas formas de realização, a dose está nafaixa de cerca de 1 mg/kg/semana a cerca de 15 mg/kg/semana.

Em algumas formas de realização, as composiçõesfarmacêuticas compreendendo o agente de ligação de CD40 podem aindacompreender um agente terapêutico, ou conjugado ou não conjugado aoagente de ligação. O anticorpo anti-CD40 ou agente de ligação de CD40 podeser coadministrado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos parao tratamento ou prevenção de distúrbios imunológicos ou cânceresexpressando CD40. Por exemplo, terapia de combinação pode incluir umagente citostático, citoíóxico, ou imunossupressivo. Terapia de combinaçãotambém pode incluir, por exemplo, administração de um agente que marcaum receptor ou complexo receptor diferente de CD40 na superfície delinfócitos ativados, células dendríticas ou células de câncer expressandoCD40. Um exemplo destes agentes inclui um segundo anticorpo não CD40que liga a uma molécula na superfície de um linfócito ativado, céluladendrítica ou célula de câncer expressando CD40. Outro exemplo inclui umligando que marca este receptor ou complexo de receptor. Tipicamente, esteanticorpo ou ligando liga a um receptor de superfície de célula em linfócitosativados, células dendríticas ou célula de câncer expressando CD40 e melhorao efeito citotóxico ou citostático do anticorpo anti-CD40 por distribuição deum sinal citostático ou sinal citotóxico para o linfócito ativado, céluladendrítica ou célula de câncer expressando CD40.

Esta administração combinatorial pode ter um efeito aditivo ousinergístico sobre os parâmetros da doença (por exemplo, severidade de umsintoma, o número de sintomas ou freqüência de relapso).

Com relação a regimes terapêuticos para a administraçãocombinatorial, em uma forma de realização específica, um anticorpo anti-CD40 ou agente de ligação de CD40 é administrado concorrentemente comum agente terapêutico. Em outra forma de realização específica, o agenteterapêutico é administrado antes ou subseqüente à administração do anticorpoanti-CD40 ou agente de ligação a CD40, por pelo menos uma hora e atévários meses, por exemplo pelo menos uma hora, cinco horas, 12 horas, umdia, uma semana, um mês ou três meses, antes ou subseqüente àadministração do anticorpo anti-CD40 ou agente de ligação de CD40.

As classes utilizáveis dos agentes citotóxicos ouimunossupressivos incluem, por exemplo, agentes antitubulina, auristatinas(por exemplo, MMAE, ou MMAF), ligadores de ranhura menor de DNA,inibidores de replicação de DNA, agentes alquilantes (por exemplo,complexos de platina como complexos de ds-platina, mono(platina),bis(platina) e platina tri-nuclear e carboplatina), antraciclinas, antibióticos,antifolatos, antimetabólitos, sensibilizadores de quimioterapias,duocarmicinas, etoposídeos, pirimidinas fluoradas, ionoforos, lexitropsinas,nitrosouréias, platinóis, compostos de pré-formação, antimetabólitos depurina, puromicinas, sensibilizadores de radiação, esteróides, taxanos,inibidores de topoisomerase, alcalóides vinca, ou outros.

Os agentes individuais citotóxicos ou imunossupressivosincluem, por exemplo, um androgênio, antramicina (AMC), asparaginase, 5-azacitidina, azatioprina, bleomicina, busulfan, butionina sulfoximina,camptotecina, carboplatina, carmustina (BSNU), CC- 1065, clorambucil,cisplatina, colquicina, ciclofosfamida, citarabina, citidina arabinosídeo,citocalasina B, dacarbazina, dactinomicina (anteriormente actinomicina),daunorubicina, decarbazina, docetaxel, doxorubicina, um estrogênio, 5-fluordeoxiuridina, 5- fluorouracil, gramicidina D, hidroxiuréia, idarubicina,ifosfamida, irinotecan, lomustina (CCNU), mecloretamina, melfalan, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona,nitroimidazol, paclitaxel, plicamicina, procarbizina, estreptozotocina,tenoposídeo, 6-thioguanina, tioTEPA, topotecan, vinblastina, vincristina,vinorelbina, VP-16 e VM-26.

Em algumas formas de realização típicas, o agente terapêuticoé um agente citotóxico. Os agentes citotóxicos apropriados incluem, porexemplo, dolastatinas (por exemplo, auristatina E, AFP, MMAF, MMAE,AEB ou AEVB), ligadores de ranhura menor de DNA (por exemplo,enediinas e lexitropsinas), duocarmicinas, taxanos (por exemplo, paclitaxel edocetaxel), puromicinas, alcalóides vinca, CC- 1065, SN-38, topotecano,morfolino-doxorubicina, rizoxina, cianomorfolino-doxorubicina,equinomicina, combretastatina, netropsina, epotilona A e B, estramustina,criptofisinas, cemadotina, maitansinóides, discodermolídeo, eleuterobina, oumitoxantrona.

Em algumas formas de realização, o agente citotóxico é umquimioterapêutico convencional como, por exemplo, doxorubicina, paclitaxel,melfalan, alcalóides vinca, metotrexato, mitomicina C ou etoposídeo. Alémdisso, agentes potentes como análogos de CC- 1065, caliqueamicina,maitansina, análogos de dolastatina 10, rizoxina, e palitoxina podem serligados aos anticorpos anti-CD40 ou agentes dos mesmos.

Em formas de realização específicas, o agente citotóxico oucitostático é auristatina E (também conhecida na arte como dolastatina- 10) ouum derivado dos mesmos. Tipicamente, o derivado de auristatina E é, porexemplo, um éster formado entre auristatina E e um ceto-éster. Por exemplo,auristatina E pode ser reagida com ácido paraacetil benzóico ou ácido benzoilvalérico para produzir AEB e AEVB, respectivamente. Outros derivados deauristatina típicos incluem AFP, MMAF, e MMAE. A síntese e estrutura deauristatina E e seus derivados são descritos em, por exemplo, Publicação depedido de patente U.S. Nos. 2004-0157782 Al e 2005- 0238649; Pedido depatente internacional No. PCT/US03/24209, Pedido de patente internacionalNo. PCTVUS02/13435, e Patentes.S. Nos. 6.884.869; 6.323.315; 6.239.104;6.034.065; 5.780.588; 5.665.860; 5.663.149; 5.635.483; 5.599.902;5.554.725; 5.530.097; 5.521.284; 5.504.191; 5.410.024; 5.138.036;5.076.973; 4.986.988; 4.978.744; 4.879.278; 4.816.444; e 4.486.414; cujasdescrições são incorporadas por referência aqui.

Em formas de realização específicas, o agente citotóxico é umagente de ligação de ranhura menor de DNA (ver, por exemplo, patente USno. 6.130.237.) Por exemplo, em algumas formas de realização, o agente deligação de ranhura menor é um composto CBI. Em outras formas derealização, o agente de ligação de ranhura menor é uma enediina (porexemplo, caliqueamicina).

Exemplos de agentes anti-tubulina incluem, mas não sãolimitados a, taxanos (por exemplo, Taxol® (paclitaxel), Taxotere®(docetaxel)), T67 (Tularik), alcalóides vinca (por exemplo, vincristina,vinblastina, vindesina, e vinorelbina), e dolastatinas (por exemplo, auristatinaE, AFP, MMAF, MMAE, AEB, AEVB). Outros agentes antitubulinaincluem, por exemplo, derivados de baccatina, análogos de taxano (porexemplo, epotilona A e B), nocodazol, colquicina e colcimida, estramustina,criptofisinas, cemadotina, maiansinóides, combretastatinas, discodermolídeo,e eleuterobina.

Em algumas formas de realização, o agente citotóxico é ummaitansinóide, outro grupo de agentes anti-tubulina. Por exemplo, em formasde realização específicas, o maitansinóide é maitansina ou DM-I (ImunoGen,Inc.; Ver também Chari et al., 1992, Câncer Res. 52:127- 131).

Em algumas formas de realização, o agente terapêutico não éum radioisótopo.

Em algumas formas de realização, o agente citotóxico ouimunossupressivo é um antimetabólito. O antimetabólito pode ser, porexemplo, um antagonista de purina (por exemplo, azotioprina oumicofenolato mofetil), um inibidor de reductase dihidrofolato (por exemplo,metotrexato), aciclovir, gangciclovir, zidovudina, vidarabina, ribavarina,azidotimidina, citidine arabinosídeo, amantadina, dideoxiuridina,iododeoxiuridina, poscarnet, ou trifluridina.

Em outras formas de realização, o agente citotóxico ouimunossupressivo é tacrolimus, ciclosporina ou rapamicina. Em outras formasde realização, o agente citotóxico é aldesleucina, alemtuzumab, alitretinoina,alopurinol, altretamina, amifostina, anastrozol, trioxido arsênico, bexaroteno,bexaroteno, calusterona, capecitabina, celecoxib, cladribina, Darbepoetinaalfa, Denileucina diftitox, dexrazoxana, propionato de dromostanolona,epirubicina, Epoetina alfa, estramustina, exemestano, Filgrastim, floxuridina,fludarabina, fiilvestrant, gemcitabina, gemtuzumab ozogamicina, goserelina,idarubicina, ifosfamida, imatinib mesilato, Interferon alfa-2a, irinotecan,letrozol, leucovorina, levamisol, mecloretamina ou mostarda nitrogênio,megestrol, mesna, metotrexato, metoxsalen, mitomicinaC, mitotano,fenpropionato de nandrolono, oprelvecina, oxaliplatina, pamidronato,pegademase, pegaspargase, pegfilgrastim, pentostatina, pipobroman,plicamicina, porfímero sódico, procarbazina, quinacrina, rasburicase,revlimid, Sargramostim, estreptozocina, tamoxifeno, temozolomida,teniposídeo, testolactona, tioguanina, toremifeno, Tositumomab,Trastuzumab, tretinoina, uracil mostarda, valrubicina, vinblastina, vincristina,vinorelbina e zoledronato.

Em formas de realização adicionais, a droga é um anticorpomonoclonal anti-HER2humanizado; RITUXAN (rituximab; Genentech, Inc.,South San Francisco, CA); um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico);OVAREX (AltaRex Corporation, MA); PANOREX (Glaxo Wellcome, NC;um anticorpo IgG2 de murino); Cetuximab Erbitux (Imclone Systems Inc.,NY; um anticorpo quimérico de IgG anti-EGFR); Vitaxin (Medlmmune, Inc.,MD); Campath I/H (Leukosite, MA; um anticorpo de IgGl humanizado);Smart MI95 (Protein Design Labs, Inc., CA; um anticorpo de IgG anti-CD33humanizado); LymphoCide (Imunomedics, Inc., NJ; um anticorpo de IgGanti-CD22 humanizado); Smart IDIO (Protein Design Labs, Inc., CA; umanticorpo anti-HLA-DR humanizado); Oncolym (Techniclona, Inc., CA; umanticorpo anti-HLA-DrlO radio-rotulado de murino); Allomune(BioTransplant, CA; um mAb anti-CD2 humanizado); Avastin (Genentech,Inc., CA; um anticorpo anti-VEGF humanizado); Epratuzamab(Imunomedics, Inc., NJ e Amgen, CA; um anticorpo anti-CD22); e CEAcide(Imunomedics, NJ; um anticorpo anti-CEA humanizado).

Outros anticorpos apropriados incluem, mas não são limitadosa, anticorpos contra os seguintes antígenos: CA125, CA15-3, CA19-9, L6,Lewis Y, Lewis X, alfa fetoproteína, CA 242, fosfatase alcalina placental,antígeno específico da próstata, ácido prostático fosfatase, fator decrescimento epidérmico, MAGE-I, MAGE-2, MAGE-3, MAGE -4, receptoranti transferrina, p97, MUC1-KLH, CEA, gplOO, MARTI, antígenosespecíficos da próstata, receptor de IL-2, CD20, CD52, CD33, CD22,gonadotropina coriônica humano, CD38, mucina, P21, MPG, e produto Neuoncogene.

Em algumas formas de realização, o agente terapêutico é umagente imunossupressivo. O agente imunossupressivo pode ser, por exemplo,ganciclovir, etanercept, tacrolimus, ciclosporina, rapamicina, ciclofosfamida,azatioprina, micofenolato mofetil ou metotrexato. Alternativamente, o agenteimunossupressivo pode ser, por exemplo, um glucocorticóide (por exemplo,Cortisol ou aldosterona) ou um análogo de glucocorticóide (por exemplo,prednisona ou dexametasona).

Os inibidores de ciclooxigenase apropriados incluem ácidomeclofenâmico, ácido mefenâmico, carprofen, diclofenac, diflunisal,fenbufeno, fenoprofeno, ibuprofeno, indometacina, cetoprofeno, nabumetona,naproxeno, sulindac, tenoxicam, tolmetina, e ácido acetil salicíclico..

Os inibidores de lipoxigenase incluem inibidores redox (porexemplo, derivados catecol butano, ácido nordihidroguaiarético (NDGA),masoprocol, fenidona, Ianopalen, indazolinonas, nafazatrom, benzofiiranol,alquilhidroxilamina), e inibidores não redox (por exemplo, hidroxitiazóis,metoxialquiltiazóis, benzopiranos e derivados dos mesmos,metoxitetrahidropirano, ácidos boswélicos e derivados acetilados de ácidos

Boswélicos, e ácidos quinolino metoxifenilacéticossubstituídos com radicais cicloalquila) e precursores de inibidores redox.

Outros inibidores de lipoxigenase apropriados incluemantioxidantes (por exemplo, fenóis, gaiato de propila, flavonóides e/ousubstratos naturalmente ocorrendo contendo flavonóides, derivadoshidroxilados das flavonas, flavonol, dihidroquercetina, luteolina, galangina,orobol, derivados de calcona, 4,2',4'-trihidroxicalcona, orto-aminofenóis, N-hidroxiuréias, benzofuranóis, ebselen e espécies que aumentam a atividadedas selenoenzimas redutores, agentes quelantes de ferro (por exemplo, ácidoshidroxâmicos e derivados dos mesmos, N-hidroxiuréias, 2-benzil-l-naftol,catecóis, hidroxilaminas, carnosol trolox C, catecol, naítol, sulfasalazina,zileuton, ácido 5-hidroxiantranílico e ácidos 4- (omega-arilalquil)fenilalcanóicos), compostos contendo imidazol (por exemplo,cetoconazol e itraconazol), fenotiazinas, e derivados de benzopirano.

Ainda outros inibidores de lipoxigenase apropriados inclueminibidores de eicosanóides (por exemplo, ácidos octadecatetraenóico,eicosatetraenóico, docosapentaenóico, eicosahexaenóico e docosahexaenóicoe ésteres dos mesmos, PGE1 (prostaglandina El), PGA2 (prostaglandina Al),viprostol, ácidos 15-monohidroxieicosatetraenóico, 15-monohidroxi-eicosatrienóico e 15-monohidroxieicosapentaenóico, e leucotrienos B5, C5 eD5), compostos interferindo com os fluxo de cálcio, fenotiazinas,difenilbutilaminas, verapamil, fuscosídeo, curcumina, ácido clorogênico ácidocaféico, ácido 5,8,11,14- eicosatetraienóico (ETYA), hidroxifenilretinamida,Ionapalen, esculina, dietilcarbamazina, fenantrolina, baicaleina, proxicromil,tioéteres, dialil sulfeto e di-(l-propenil) sulfeto.

Os antagonistas de receptor de leucotrieno incluem calcitriol,ontazolast, Bayer Bay-x- 1005, Ciba-Geigy CGS-25019C, ebselen, LeoDenmark ETH-615, Lilly LY-293111, Ono ONO-4057, Terumo TMK-688,Boehringer Ingelheim BI-RM-270, Lilly LY 213024, Lilly LY 264086, LillyLY 292728, Ono ONO LB457, Pfizer 105696, Perdue Frederick PF 10042,Rhone-Poulenc Rorer RP 66153, SmithKline Beecham SB-201146,SmithKline Beecham SB-201993, SmithKline Beecham SB-209247, SearleSC-53228, Sumitamo SM 15178, American Home Products WAY 121006,Bayer Bay-o-8276, Warner-Lambert CI-987, Warner-Lambert CI-987BPC-15LY 223982, Lilly LY 233569, Lilly LY-255283, MacroNex MNX-160,Merck e Co. MK-591, Merck e Co. MK- 886, Ono ONO-LB-448, PurdueFrederick PF-5901, Rhone-Poulenc Rorer RG 14893, Rhone-Poulenc RorerRP 66364, Rhone-Poulenc Rorer RP 69698, Shionoogi S-2474, Searle SC-41930, Searle SC-50505, Searle SC-51146, Searle SC-52798, SmithKlineBeecham SKandF- 104493, Leo Denmark SR-2566, Tanabe T-757 e TeijinTEM 33 8.

Artigos de fabricação

Em outro aspecto, um artigo de fabricação contendo osmateriais utilizáveis para o tratamento dos distúrbios descritos acima éincluído. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo. Osrecipientes apropriados incluem, por exemplo, frascos, frasquinhos, seringas etubos de testes. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedadede materiais como vidro ou plástico. O recipiente mantém uma composiçãoque é eficaz para o tratamento da condição e pode ter uma abertura de acessoestéril. Por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ouum frasquinho tendo uma tampa perfurável por uma agulha de injeçãohipodérmica. O agente ativo na composição é o anticorpo anti-CD40humanizado. O rótulo sobre ou associado com o recipiente indica que acomposição é usada para o tratamento da condição de escolha. O artigo defabricação pode ainda compreender um segundo recipiente compreendendoum tampão farmaceuticamente aceitável, como solução salina tamponada comfosfato, solução de Ringer e solução de dextrose. Ele pode ainda incluir outrosmateriais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindooutros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, inserções na embalagempara instruções de uso.

Depósitos ATCC

Um Depósito do ATCC de anticorpo monoclonal S2C6 foifeito em 25 de maio de 1995 de acordo com os termos do Tratado deBudapeste sobre o reconhecimento internacional de depósito demicroorganismos para os fins de procedimentos de patentes. O ATCC estálocalizado em 10801 University Boulevard, Manassas, Virgina 20110-2209,USA. Este Depósito do ATCC recebeu o número de acesso de PTA-110. OATCC está localizado em 10801 University Boulevard, Manassas, Virgina20110-2209, USA. Qualquer depósito é dado como um auxílio para osversados na arte e não é uma aceitação de que o depósito é requerido sob 35U.S.C. Seção 112. O descrito aqui não deve ser limitado em escopo peloanticorpo depositado, porque a forma de realização depositada se destina a seruma ilustração única de alguns aspectos da invenção e qualquer anticorpo queé funcionalmente equivalente está dentro do escopo desta invenção. Odepósito de material aqui não constitui uma aceitação de que a descriçãodescrita aqui contida é inadequada para permitir a prática de qualquer aspectoda invenção, incluindo o seu melhor modo, nem que deve ser construídocomo limitando o escopo das reivindicações nas ilustrações específicas queela representa. De fato, várias modificações da invenção além das mostradas edescritas aqui se tornarão evidentes para os versados na arte da descriçãoacima e estão dentro do escopo das reivindicações anexas.

A invenção é ainda descrita nos seguintes exemplos, que nãose destinam a limitar o escopo da invenção. As linhagens de células descritasnos seguintes exemplos foram mantidas em cultura de acordo com ascondições especificadas pelo American Type Culture Collection (ATCC) ouDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Braunschweig, Alemanha (DMSZ). Os reagentes de cultura de células foramobtidos de Invitrogen Corp. (Carlsbad, CA).

EXEMPLOS

Exemplo 1: Produção de Anticorpo anti-CD40 humanizado

Um anticorpo anti-CD40 humanizado foi construídogeralmente por importação dos CDRs do anticorpo doador anti-CD40 demurino em um anticorpo humano recipiente. O anticorpo doador foi oanticorpo monoclonal murino S2C6, descrito em patente US no. 6.838.261, edemonstrado prover sinais de promoção de crescimento fortes para linfócitosB-. Ver, por exemplo, Paulie et. al., 2000, J. Imunol 142:590. Seqüências deconsenso para o domínio variável de cadeia pesada de subgrupo III humano(SEQ ID NO:2) e domínio variável de cadeia leve kappa de subgrupo Ihumano (SEQ ID NO: 13) foram obtidos, como geralmente descrito emCarter et.al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:4285; patente US no.6.037.454, e patente US no. 6.054.297 para uso como os domínios de cadeiapesada e leve recipiente humano.

O fagomídeo pEMXl, descrito em Cunningham et. al. (1989,Science 243:1330-1336), contém um fragmento de DNA codificando odomínio variável de cadeia leve kapa subgrupo I de consenso humano e umvariável domínio de cadeia pesada de subgrupo III humano, de consenso,, e éum vetor utilizável para a mutagenese assim como para a expressão de F(ab)sem E. coli. DNA codificando os domínios variáveis de consenso éoperativamente ligado a um promotor de fosfatase alcalina e seqüência Shine-dalgarno, derivada de um plasmídeo à base de pUCl 19, pAK2, como descritoem Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei USA 89:4285. Um sítio derestrição único Spel foi engenheirado entre os polinucleotídeos codificando osdomínios variáveis de cadeia pesada e leve F(ab). pEMXl foi construído eusado na preparação dos anticorpos humanizados mostrados aqui.

Um primeiro mAb S2C6 F(ab), humanizado, referido comosgn-0, foi construído por importação dos CDRs do anticorpo murino nasregiões de armação de seqüência de consenso humana para mutagenesedirigida ao sítio. A mutagenese foi conduzida geralmente de acordo commétodos descritos em Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488. Asseqüências de aminoácidos resultantes dos domínios variáveis de cadeia levee pesada de molécula F(ab) humanizada (sgn-0) são mostradas em Tabela 2(SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO: 14, respectivamente), e são comparados comos do anticorpo doador, anticorpo monoclonal murino S2C6 (mMAb S2C6,também referido aqui como SGN-14; SEQ ID NO.l e SEQ ID NO: 12,respectivamente), e com os dos anticorpos recipientes de seqüência deconsenso humana, HuVH III e HuVlk I (SEQ ID NO:2 e SEQ ID NO: 13,respectivamente).

Os plasmídeos foram transformados em E. coli cepa XL-I Blue(Stratagene, San Diego, CA) para preparação de DNA de filamento único eduplo. Cada um dos domínios variáveis de cadeia leve e de cadeia pesadaforam completamente seqüenciados usando o método dideoxinucleotídeo(Sequenase, U.S. Biochemical Corp.). Plasmídeos foram transformados em E.coli cepa 16C9, um derivado de MM294, colocados em placas LG contendo 5ug/ml carbenicilina, e uma colona única foi selecionada para expressão daproteína. A cultura de 5 ml foi adicionada a 500 ml AP5-100 ug/mlcarbenicilina e deixada crescer durante 16 horas em um frasco de agitaçãocom anteparos de 4 L a 37 °C. O meio APS consistia de 1,5 g glucose, 11,0 gHycase SF, 0,6 g extrato de levedura (certificado), 0,19 g MgS04 (anidro),1,07 g NH4CI, 3,73 g KC1, 1,2 g NaCl, 120 ml 1M trietanolamina, pH 7,4, a 2L de água e então filtrado de modo estéril através de um filtro de 0,1 umSealkeen.

Células foram coletadas por centrifugação em um frasco decentrífuga de 1 L (Nalgene) a 3000X g, e o sobrenadante removido. Apóscongelar durante 1 hora, a pelota foi recolocada em suspensão em 25 ml MES10 mM frio, 10 mM EDTA, pH 5,0 (tampão A). 250 ul de 0,1 M PMSF(Sigma) foi adicionado para inibir a proteólise e 3,5 ml de carga de 10 mg/mlde lisozima de clara de ovo de galinha (Sigma) foram adicionados paraauxiliar a lise da parede de célula bacteriana. Após a agitação suave em gelodurante 1 hora, a amostra foi centrifugada a 40,000 X g durante 15 minutos. Osobrenadante foi levado a 50 ml com tampão A e carregado em uma coluna de2 ml DEAE equilibrada com tampão A. O fluxo transpassante foi entãoaplicado a uma coluna de proteína G-Sepharose CL-4B (Pharmacia) (0,5 mlvolume de leito) equilibrada com tampão A. A coluna foi lavada com 10 mltampão A e eluída com 3 ml 0,3 M glicina, pH 3,0, em 1,25 ml de 1M TRIS,pH 8,0. O F(ab) foi então trocado em tampão em PBS usando um filtroCentricon- 30 (Amicon) e concentrado a um volume final de 0,5 ml. Os géisSDS PAGE do F(ab) foram ciclados para verificar a pureza e o pesomolecular foi verificado por espectrometria de massa com eletro-pulverização.

O anticorpo humanizado, sgn-0, demonstrou uma afinidade deligação significantemente diminuída para CD40 imobilizado em placas demicrotitulação, como comparado com o anticorpo de murino parental.Tabela 2

<table>table see original document page 99</column></row><table>

Exemplo 2: Preparação de anticorpos de variante anti-CD40 humanizados

Uma série de mutações foram feitas no anticorpo humanizadogabarito, sgn-0, preparado como descrito para exemplo 1. As mutaçõesespecíficas foram feitas no DNA codificando os domínios variáveis de cadeialeve e de cadeia pesada de sgn-0 por mutagenese dirigida ao sítio, e asseqüências de variantes produzidas da molécula de gabarito são listadasabaixo nas tabelas 3 e 4.

Anticorpos construídos usando estes domínios variáveis decadeia leve e pesada variantes foram analisados para atividade de ligação.

Cada anticorpo foi diluído em concentrações equivalentes e então serialmentediluído. Os anticorpos diluídos foram testados para ligação a CD40imobilizados em placas de microteste. Os dados de ligação por afinidade paraos anticorpos variantes são mostrados abaixo na Tabela 5. Anticorposmostrando atividade de ligação se aproximando do anticorpo de murinoparental foram sgn-14, sgn-18, sgn-19, sgn-22, sgn-23, sgn-26, e sgn-27, comvariantes sgn-14, sgn-18, sgn-26, e sgn-27 mais intimamente se aproximandoda do anticorpo murino parenta, SGN-14, e variante sgn-26 mostrando omelhor desempenho nestes testes.

Tabela 3

Domínio variável de cadeia pesada

<table>table see original document page 100</column></row><table><table>table see original document page 101</column></row><table>Tabela 4

Domínio variável de cadeia leve

<table>table see original document page 102</column></row><table>Tabela 5

<table>table see original document page 103</column></row><table>

Exemplo 3

Atividade citotóxica in vitro de anticorpo anti-CD40humanizado

As linhagens de células de mieloma múltiplo humano CD40+ eCD 13 8"^, MM.1S, que é sensível a dexametasona, e MM.IR, que é resistentea dexametasona, assim como células de tumor recentemente isoladas (CD40+,CD 13 8^) de dois pacientes com mieloma múltiplo, foram tratadas comconcentrações crescentes (0-100 ug/ml) de anticorpo S2C6 humanizadodurante 48 h. A síntese de DNA foi medida por absorção de [H]- timidina.Os resultados indicaram que anticorpo S2C6 humanizado não estimulou aproliferação de MM.1S, MM.IR ou as células de tumor de dois pacientes (p >0,1).

Para ainda definir o efeito citotóxico de anticorpo S2C6humanizado contra estas células, culturas de MM.1S e MM. IR foram tratadasdurante 6 h com anticorpo S2C6 humanizado (10 ug/ml) e então co-cultivados com o inibidor de síntese de proteína de novo cicloheximida (0,2ug/ml) por mais 48 h. A viabilidade celular foi testada usando brometo de 3-(4,5- dimetiltiozol-2-il) -2,5- difenil tetrazólio de redução (MTT) como oindicador. O tratamento com anticorpo S2C6 humanizado e cicloheximidadisparou 50-60% de morte celular em ambas as linhagens de células,enquanto o tratamento com Ig de controle isotipo apenas, com ou semcicloheximida, não induziu citotoxicidade. O anticorpo S2C6 humanizadodisparou 20-30% de citotoxicidade de células em culturas de células de tumorde 2 pacientes, que foi significativamente melhorado na presença decicloheximida em uma dose não tóxica (0,2 ug/ ml).

Exemplo 4 - Atividade anti-tumor de anticorpo anti-CD40humanizado

A atividade anti-tumor de anticorpo anti-CD40 humanizado foitestada em modelo de xenoenxerto de linfoma de camundongo SCID. Cincomilhões de células de tumor Ramos foram injetadas subcutaneamente emcamundongos SCID (10/grupo) 13 dias antes de iniciar o tratamento comdroga. O anticorpo anti-CD40 de murinos ou S2C6 humanizado foi dadointra-peritoneamente 3 vezes por semana (4 mg/kg/dose) com 8 ou 5 dosesadministradas. Os camundongos foram examinados para crescimento detumor, e volume de tumor foi medido semanalmente durante o período deestudo de 14 dias. Os resultados na figura 2 mostram um aumento de quase 9vezes no crescimento de tumores em camundongos de controle, enquanto nomesmo período de tempo, o crescimento de tumor em camundongos tratadoscom ou anticorpo anti-CD40 de murinos ou S2C6 humanizado foinegligenciável. Os dados demonstram que o anticorpo humanizado foi tãoefetivo como o anticorpo anti-CD40 de murinos na supressão do crescimentode tumor neste modelo de xenoenxerto de linfoma B.

Exemplo 5 - Sobrevivência prolongada de anticorpo anti-CD40 humanizado

A eficácia do anticorpo anti-CD40 humanizado emsobrevivência de camundongos contendo tumor foi testada em um modelo dexenoenxerto de linfoma de camundongo SCID. Os camundongos SCID(1 O/grupo) foram inoculados intravenosamente com um milhão de células detumor Ramos três dias antes do tratamento com anticorpo. Os camundongosforam tratados com anticorpo anti-CD40 humanizado ou murino, ou umcontrole de Ig, administrados intraperitonealmente duas vezes por semana (4mg/kg/dose) durante um total de cinco doses. As gaiolas dos camundongosforam examinadas diariamente para mortalidade. Os resultados mostrados nafigura 3 mostram que nenhum dos camundongos tratados com um anticorpode controle sobreviveram além do dia 34 após a inoculação do tumor,enquanto oito dos dez camundongos tratados com anticorpo anti-CD40murino e todos os dez camundongos tratados com o anticorpo anti-CD40humanizado permaneceram vivos mesmo 90 dias após o implante do tumor.Os dados demonstram que o anticorpo humanizado foi tão efetivo como oanticorpo anti-CD40 murino para prolongar a sobrevivência de camundongosSCID neste modelo de xenoenxerto de linfoma B.

Várias referências, incluindo pedidos de patente, patentes, epublicações científicas são citadas aqui, cujas descrições devem serincorporadas aqui por referência em suas totalidades. A citação ouidentificação de qualquer referência aqui não deve ser construída como umaadmissão de que esta referência está disponível como arte anterior para apresente invenção.

A aplicação dos ensinamentos descritos aqui não deve serlimitada em escopo pelas formas de realização específicas descritas aqui. Defato, várias modificações estarão nas capacidades do versado na arte à luz dosensinamentos contidos aqui e exemplos anexos. Estas modificações sedestinam a estar no escopo das reivindicações anexas.INDICAÇÕES RELACIONADAS A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO

<table>table see original document page 107</column></row><table>LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

<110> Genentech, Inc.

Seatfcla Genetics, Inc.Leomarct G. PrestaLori Y. 0'ConaellDoromina, Svefclana

<120> anticorpos anti-CD40 humanizado e métodos de uso<130> Hu CD4Ô

<150> US 60/684,853<151> 2005-05-26

<X60> 22

<170> P&fcmtln versíóit 3.3

<210> 1

<21I> 113

<212> PRT

<213> MusMusculus

<40Q>- 1

Glu Vai Gln %ea Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Vai Lys Pro Gly Ala15 10 15

Ser Vai ifys Ile Ser Cys iys Alas Ser Gly tyr Ser Pbe Thx Gly 1Tyr20 25 30

Tyr lie His Trp Vai Lys Gln Ser His Gly X.ys Ser Leu Glu f xp Ile35 40 45

Gly Arg Vai Ile Pro Asn As» Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln fcys Plie50 55 60Lys Gly Lys Ala lie Leu. Thr Vai Aâp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Glu Gly lie Tyr Trp Trp Gly His Gly Thr Thr Leu Thr Vai100 105 110

Ser

<2io> a

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> construto sintético

<40Õ> 2

Glu Vai Gla Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Glu Pro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pfae Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30

Ala Met Ser Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu ?rp Vai35 40 45

Ala Vai lie. Ser Gly Asp Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai50 55 60t/ys Gly Arg Ph© Thr lie Ser Arg Asp Asa Ser fcys Asa Thr Leu Tyr$5 70 75 80

Leu Gln Met &gn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 9S

Ala Arg Gly Arg Gly Gly Giy Ser Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 10S 110

Vai Thr Vai Ser115

<210> 3

<2Í1> 113

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> construto sintético<40Q> 3

0lu Vai Gln Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly Leut Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

ser Leu Arg Leu Ser Cys Alá Ala Ser Gly Tyr Ser Phe ^Ehx Gly Tyr20 25 30

Tyr He His Txp Vai Arg Gl« Ala Pro Gly Lyss Gly Leu Glu Trp Vai35 40 áS

Ala Arg vai lie Pro Asn Aan Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gla Lys Phe50 55 60Lys Gly Arg Phe Tfcr He ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Tiur Leu Tyr65 70 "75 80

Leu Gln, Met Asa Séx Leu ArS Ala Glu Asp Thr Ala. Vai Tyr Tyr Cys85 90 9S

Ala Arg Glu Gly lie Tyr Trp Trp Gly Gla Gly Thr Leu vai Thr Vai100 10 5 11D

Ser

<210> 4

<211> 113

<212> PRf

<213> Artificial

<:220>

<223> construto sintético<400> 4

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Sla Pro Gly Gly15 10 1S

Ser Leu Ar-g Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Mãe ?hr Gly Tyr20 25 30

tpyr lie His Trp Vai hXQ Gln Ala 5ro Gly Lys Gly Leu Glu <Trp Vai35 40 45

Ala Arg Vai lie tro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arçj Ph.e Thr lie Ser Vai Asp As» Ser hys Asa Tísr Leu Tyr65 70 7S 80

Leu Gla M<at Aan Ser Leu Arg ala Glu Asp Thr Ala Vai [Cyr Tyr CysSS 90 95

Ala Arg Glu Gly 11& Tyr Trp Trp Gly Gla Gly Thr hmx Vai Thr Vai100 105 110

Ser

<210> 5<211> 1X3

<2i2> m%-

<2Í3> Artificial<22Ó>

<222> construto sintético<400> 5

Glu Vai Gln Leu Vai Glu gav Gly Gly Gly Leu Vai Gla Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ehe Thr Gly Tyr20 25 30

Tyr lie His Trp Vai Arg Gl© Ala J?ro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ala Arg Vai lie Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asa Gln Lys Phe50 55 60

kys Gly Arg" Fhe Thr lie Ser Arg Asp Lys Ser I«ys Aan Thr Leu TyrS5 70 75 80Leu Gln Mét Asn Ser &eu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Glu Gly He Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai100 105 110

Ser

<210> 6

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial

<22Q>

<221> construto sintético<400> 6

Qlu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vál Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser She Thr Gly Tyr20 25 30

Tyr lie His Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lya Gly Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ala Arg Vai Xle Pro Asn Asa Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Leu Ser Vai Asp Asn Ser Lys Asa Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Mefc Asn Ser Leu Arg Ala Glv. Asp Tia: Ala Vai Tyr fyr CyS85 90 95

Ala Arg Glu Gly Ha Tyr Trp Tzp Gly <Slft Gly Thr Leu Vai Tfair Vai100 105 110

Ser

<210> 7

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

•«223> construto sintético<400> 7

Glu Vai Gln. Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Qln Fro Gly Gly15 10 15

ser Leu Arg Leu Ser Cya Ala Ala Ser Gly *3fyr Ser Phe Tbx Gly Tyx20 25 30

Tyr IX© hís Txp Vai Ara Ala Fro Oly Lys Gly Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ala Arg vai lie Pro As» Aen Gly Gly fhr Sex Tyr Asn Gln Lys Phe50 SS 60

Lys Gly Arg Sbe fhr Leu Ser Vai Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr65 70 75 S0Lsu Gln Ket Asn. Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cye85 90 95

Ala Arg Glu Gly lie Tyr Trp Trp Gly Glo Gly Thr Leu vai Thr Vai100 103 110

Ser

<210> S

<211> 113

<212> KSf

<213> Artificial

-<22;3> construto sintético<400> S

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Prt? Gly Gly15 10 15

Ser Seu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr20 25 30

Tyr He His Trp Vai Arg Gln Ala Rro Gly Lya Gly Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ala Arg Vai lie Pro Asa Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys &m50 55 60

Lys Gly Arg Ala Thr Ilé Ser Vai Asp Asn Ser Lys àsm Thr Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gln Ntet Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr CysÔ5 90 95

Ala Axg Glu Gly He fyr Trp ?r£> Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai100 105 HO

Ser

<21Q> 9

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> construto sintético<400> 9

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln peo Gly Gly15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser ©ly TÇyx Ser Flie tfhr Gly 'íyr20 2S 30

Tyr He Kia Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai35 40 45

Ala Arg Vai Ha Pra Asn Aen Gly Gly flfhr Ser Tyr Asn Gln Lys PheS0 55 60

Lys Gly Arg Ala Tbx Leu Sear vai Asp Asn Ser Lys Asa'íhr Leu Tyr65 70 75 80

Leu Glu Kat Asn ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 ÔSAla Arg Glu Gly lie tyr Trp 2rp Gly Gln Gly Thr Le» Vai *&a: Vai100 105 110

Ser

<210> 10

<2ll> 113

<2\2> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> construto sintético

<400> ao

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Se? Leu''Arg Leu Ser cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly a?yr20 25 30

Tyr lie His Trp Vai Arg Gl» Ala fcro Gly Lys Gly Lêu Glu Trp Vai35 40 45

Ala Arg Vai lie Pro Asn Ala Gly Gly *tbx Ser Ttyr Asa Gln Lys Phe50 55 60

Lys Gly Arg Phe IPhr Leu Ser Vai Asp Asti Ser Lys Asn Tlir Ala Tyr65 70 75 80

Leu Gla Mefc Asn Ser Leu Arg Ala Glu Assp Thr Ala Vál Tyr Tyr Cys35 90 95Ala Arg Glu Gly lie Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Vai Thr Vai100 105 210

Sér

<210> 11

<211> 113

<212> PRT

<2l3> Artificial

<220>

<223> construto sintético

Glu Vai Gln Leu Vai 01u Ser Gly Gly Gly Iiôu Vai Gln tro Gly Gly1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr20 25 30

Tyr Ile His Trp Vai Arg Gln Ala Fro Gly Lys Gly I*eu Glu Trp Vai35 40 45

Ala Ara Vai Ile Pro hatt Gln Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln l*ys PheS0 55 €0

ÍA/ã Gly Arg Phe Thr Ijôü Ser Vai Asp Asn. Ser Lys Asn Thr Ala Tyr65 70 75 60

Leu Gln Met Asn Ser 5*eu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Glu Gly Ile Tyr Trp Txp Gly Gln Gly Tfrr Leu Vai Thr Vai100 105 ilO

Ser

<210> 12

<211> 113

<212> PRT

<2l3> MUSKUSCulttS

<400> 12

Asp Vai Vai Vai Thr Gln Thr Pro t*eu Ser Leu pro Vai Ser It&i Gly15 10 15

Ala Gln Ala Ser xlô Ser cys Àrg Ser Ser Gln Ser Imx Vai His Ser20 25 30

Asa Gly Asn Thr phe Leu Hls Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser35 40 45

Pro Lys Leu Leu lie Tyr Thr Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro50 55 60

Asj> Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Tbr Leu I»ys Ile65 70 75 80

Sêr Arg Vai Glu Ala Glu Asp teu Gly Vai Tyr Phe Cys S«r Gln Thr85 90 95

Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lyg Leu Glu Ile Gln100 105 110<210> 13

<2ll> 108

<212> FRT

<213> Artificial

<220>

<223> construto sintético

<400> 13

Aep Ile Gln Ufet Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly15 10 15

Asp Arg vai Thr lle Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lle Ser Asa Tyr20 25 30

Leu, Ala Trp Tyr Gla Gln I*ys Pro Gly Lys Alá Pro Lys Leu Leu ile35 40 45

Tyr Ala Ala. ser Ser Leu Glu Sér Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 S5 60

Ser Gly Ser Gly Thr Así> Phe Thr Leu Thr lle Ser Ser Leu Gln Pro65 " 70 75 60

Glu Aso Phe Ala Tltr Tyr Tyr Cys Gln Gla Tyr Ãan Ser Leu Pro ÍPrp8S 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Ly# Leu GItí lle Gla Arg100 105

<210> 14<211> 113

<212> PR5?

<213> Arcificial

<220>

«223> construto sintético

<400> 14

Asp Ile Gln üíêt Thr Gltt Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly1 5 10 15

Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Vai His Ser20 25 30

Asn Gly Asa Tbr Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala35 40 45

Pro x»ys Leu Leu He Tyr Thr Vai ser A&a Arg Mie Ser Gly Vai Pro50 55 60

Ser Arg P&e Ser Gly Ser Gly Ser Gly Tttr Asp Phm Thr Leu Thr Ile65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ph& Ala Thr Tyr Tyr Cys Ser Gln Thr85 90 95

Thr His Vai pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Gltt Ile Lys100 105 110

Arg

<210> 15<211> 113<212> PR»

<213> Artificiai

<220>

<223> construto sintético<400> 15

Asp Vai Gln Vai Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly15 10 15

Asp Arg Vai Thr He ^hr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Vai His Ser20 25 30

Asa Gly Asn Tlir Phe Leu His Trp £yr Gla Gla Lys Pro Gly Lys Ala35 40 45

Pro Lya Leu, Leu lie l?yr I5ir Vai Ser Aan Arg Phe Ser Gly Vai Pro50 55 60

Ser Arçr Phe Ser Gly ser Gly ser Gly Tbr Asp phe i&r Leu Thr Xle65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu as» Phe Ala 2?hr <£yr Tyr Cys Ser Gln Thr85 50 95

Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Gla Gly Tar Lys Vai Glu lie Lys100 105 110

Arg

<210> 16<21I> 113<212> PRT<213> Artificial<220>

<223> construto sintético<400> 16

Asp rle Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly15 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Ârg Ser Ser Gln Ser Leu Vai His Ser20 25 30

hsn Gly Asrt Thr JPhe Leu His Trp fyr Gln Gln hys Pro Gly Lys Ala35 40 45

Pro Lys Leu Leu He Tyr 'Chr Vai Ser Asa Arg Phe Ser Gly Vai Pro50 55 60

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ele65 70 75 80

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Tíhr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr85 90 95

Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys; vai Glu lie Lys100 105 110

Arg

<210> 17

<211> 1392

<212> DNA

<213> Artificial<22Ô>

<223> construto sintético<40Q> 17

atgggatggfc catgtatcat cctttttcta gtagcaactg caactggagt acattcagaa 60

gttcagotgg tggagfccfcgg cggfcggcetg gtgcageeag ggggetcaçt ccgtctgtcc 120

tgtgcagctt ctggctacag ctteaccggt tafctacatcc actgggtccg fccaggçcccg' 180

ggtaagggcc tggaatgggt tgcaagggtt attcctaacg ccggcggtac cagttataac 240

cagaagttca agggccgttt cacattgagc gtcgacaatfc ccaaaaacac agcatacctg 300

cagatgaaça gectgcgtge tgaggacact gccgtctact attgtgctcg agagggtatc 360

tactggfcggg gtcaaggaaç cctggteaoc gtetoctcgg cctccaccaa gggcccatcg 420

gtçtfceccec tggçâccctc etccâagagc acetctgggg gcacagcggc cctgggctgc 480

otggtcaagg act&cttccc cgaaccggfcg acggtgtcgt ggaactcagg egccctgaec 540

agcggcgtgo acaccttccc ggctgtccta cagtcctcag gactctactc cctcagoagc 600

gtggtgactsf tgccctetag cagcttgggc acccagacet aeatetgcaa cgtgaatcac 660

aagcccagca acacca&ggt ggacaagaãa gttgagccca aatcfctgfcga caaaactcác 720

acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctggggggae cgtcagtctt cctcttcccc 780

ccaaaaccca aggacaccct eatgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 940

gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 900

cataátgcca agacaaagcc gcgggaggag cagtacaaca gcacgtaceg tgtggtcagc 960

gtçQtcaccg tcetgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc: 1020

aacaaagccc tcacagoccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg gcagccccga 1080

gaacçacagg tgtacâccct gcccccatcc cgggaagaga tgaccaagaa ccaggtcagc 1140ctgacctgcc tggfceaaagg cttctatccc agcgac-atcg ccgtggagtg ggagageaat 1200

gggcagccgg agaacaacta caagaccacg ccfccccghgc tggactccga cggctccttc 1260

ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc ãgcaggggaa cgtcttctca 1320

tgctccgtga tgcatgagge tctgcacaae cactaeacgc agaagagcct ctecctgtcb 1380

ccgggtaaat ga 1392

<210> 18

<211> 463

<212> PRT

<213> Artificial

<;22B>

<223> construto sintético

<400> 18

Mete. Gly tfrp Ser Cys Xle He Leu pbe Leu vai Ala Vive Ala Thr Gly1 5 10 15

Vai His Ser Glu Vai 61a Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Glii20 25 30

£ro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Çys Ala Ma Ser Gly *fyr Ser Phe35 40 45

fhr Gly «Tyr Tyr lie His Txp Vai Arg Gla Ala Pro Gly Lys Gly Leu50 55 60

Glu Trp Vai Ala Arg Vai He Pro Asa Ala Gly Gly <fhr Ser líyr Asn65 70 ?S 80

Gln Lys Phe l,ys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Vai Âsp Asn Ser l»ys Asn85 90 05Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn, Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Giy lie Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu11S 120 125

Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Vai Fhe Fro Leu130 13S 140

Ala fro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys145 150 155 160

Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Fro Gli± Fro Vai Thr Vai Ser Trp Asa Ser165 170 175

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Fhe Pro Ala Vai Leu Gln Ser180 18S 190

Ser Gly Leu Tyr ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser195 200 tm

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr lie Cys Asn Vai Asn Ris Lys Fro Ser Asn210 215 220

Thr Lys Vai Asp Lys Lya Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His225 230 235 240

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai245 250 255

Phe Leu Fhe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr260 265 270

j?ro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu275 2B0 285

Vai Lys Phe Asn Txp Tyx Vàl Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys290 295 300

Thr Lys Pro Ara Glu Glu Glü Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser305 310 315 320

Vai Leu Thr Vai Leu His Gln Asp Trp Leu Asa Gly Lys Glu Tyr Lys325 330 335

Cys Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr Ile340 345 350

ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Ãrg Glu Pro Glu. vai Tyr Thr Leu pro355 360 363

Pro Ser Arg Glu Glu Ktet Thr Lys Asn Gln Vai Ser Leu «br Cys Leu370 375 380

Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Xle Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn385 390 395 400

Gly Gltk pro Glu Asn, Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vãl Lãu Asp Ser405 410 415

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg420 425 430Trp Gln Glxt Gly Asn Vai Phõ Ser cys Ser Vai isefc His Glu Ala Leu435 440 445

His Asn Bis Tyr Thr Gln i*ya Ser Léti Ser I*eu Ser ?ro Gly Lys450 455 460

<210> 19

<211> 444

<212> 1?RT

<213> Artificial

<220>

<223> construto sintético<4O0> 19

Glu Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly15 10 15

Ser teu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Ph© Thr Gly Tyr20 25 30

Tyr 11$ His Trp Vai Arg Glu Ala Pro Gly kys Gly t«U Glu Trp Vai35 40 45

Ala Are Vai Xle Pro Asn Ala Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe50 55 60

E.ye Gly Arg ehe Thr l*eu Ser Vai Asp Asn Ser Lya Asn Thr Ala Tyr65 70 75 90

Leu Gln Mel; Asn Ser Beu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys85 90 95

Ala Arg Glu Gly lie Tyr Trp Trp Gly Gln Gly Thr Lsu Vai Thr VaiSer Ser Ala Ser Thr Lys Gly pro Ser Vai I»he Pro Jjeu Ala Pro Ser115 120 125

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ma Leu Gly Cys Leu Vai Lys130 135 140

Asp Tyr Phe Pro GIu Pro Vai *?hr vai Ser Trp ftsn Ser Gly Ala Leu145 150 155 160

#hr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gln Ser Ser Gly Leti165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai fhx Vai Pro Ser Ser ser Leu Gly Thr180 185 190

Gln Thr Tyr lle Çyâ Asa vai Asa His Lys Pro Ser Am Thr Lys Vai195 200 205

Asp Lys Lye Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Çyg Pro210 215 220

Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe Leu Fhe225 230 235 248

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Mefc lle Ser Aro; Thr Pro Gln Vai245 250 255

Thr cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Gln Vai Lys Phe260 265 270Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu vai His Asti Ala Lys T&r Lys Pro275 280 285

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser fhr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai Leu "Ehr290 295 300

Vai Leu HÍS Gln Asp Trp teu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai305 310 315 320

Ser As» Lys Ala Leu Pro Ala Pro 11© Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala325 330 33S

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Vai Tyr T&r Leu Pro Pro Ser Arg340 34S 350

Glu Glu Mefc fhr Lys Asn Gla Vai Ser lièu Thr Cys Leu Vai Lys Gly355 360 365

Ptie Tyr Pro Ser Asp Il« Ala Vai Glu frp Glu Ser Asn Gly Gln Pro370 375 380

Glu Asn Asn Tyr Lys tfcur Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser385 390 395 400

Phe Pbê Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln.

405 410 415

Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Ket His Glu Ala Leu His Asn His420 425 430

Tyr Hir Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys435 440<21Q> 20<211>- 73.7<212> DNA<213> Artificial

<220>

<223> construto sintético<400> 20

afcgggatggt catgtaecafc cctttttcta gfcagcaactg caaccggtgt acattcagat 60

atacagatga cceagtccco gagctccctg tccgcctctg tgggcgatag ggtcaccatc 120

acctgcagafc ccagtcaaag cttagtacat agcaatggta acaotttccfc ccactggtat 180

caacagaaac caggaaaagc tccgaaacta ctgatttaca ctgttagcaa ccggttctct 240

ggagtccctfc ctcgcttctc tggafcceggfc tctgggacgg atttcactct gaccatcagc 300agtctgcagc cagaagactt cgct&cgfcat ttctgtagtc agactaçtca tgttccatgg • 360

acatttggac agggtaccaa ggtggagatc aaaogaactg tggctgcacc atctgtcttc 420

atcttccegc catctgatga gcagttgaaa tctggaacfcg cttctgttgt gtgcctgctg 480

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataaogc çctccaatcg 540

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600

agcaccetga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagfcc 660

acccatcagg gcctgagcfcc geecgtcaca aagagcfcfcca acaggggaga gtgttaa 717

*210> 21

<211> 238

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> construto sintético<400> 21

Met Gly Trp Ser Cys lle Xle Leu Phe heu. Vai ala Thr Ala Thr Gly15 10 15

Vai Sis Ser Ãsp Xle Gln Me-t Thr Gla Ser Pro Ser Ser Leu ser Ala20 25 30

Ser Vai Gly Asp Arg Vai Thr Xle Thr Cys Arg Ser S«r Glü Ser Leu35 40 45

vai His Ser Asn Gly Asn Thr Phe Leu ííis Trp Tyr Gln Gln Lys Pro50 55 60

Gly l»ys Ala Pro Lys Leu Leu xle Tyr Thr Vai Ser Asm Arg the Ser65 *70 75 ÔO

Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr85 90 9S

Leu Thr lle Ser Ser l^eu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys100 105 110

Ser Gln. Thr Thr His Vai Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Vai115 120 125

Glu Xle Lys Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Xle Phe Pro Pro130 13S 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cya Leu Leu145 1B0 155 160

As ri Asíi Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gla Trp Lys Vai Asp Asn165 170 175

Ala Leu Gln. Ser Gly km Ser Gltt Glu Ser Vai Thr Glu Gln, Asp Ser180 185 120

Lys Asp ser Thr Tyr Ser h&i Ser Ser Thr Iteu Thr laeu Ser iys Ala195 200 205

Aep Tyr Glu Lys Eis Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His 01» Gly210 215 220

Zj&h, Ser Ser Pro vai Thr Ifys Ser She hsn Arg Gly Glu Cys225 230 225

<2l0> 22

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> construto sintético

<400> 22

Asp He Gln Mefc Thr Gln Ser J?ro Ser Ser iieu Ser Ala Ser Vai Gly1 5 10 15

Aep Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Vai Hia Ser20 25 30

Asa Gly Asá Thr Phe I»eu His Trp Tyr Gln Gln Lys Prt» Gly hyB Ala35 m 45

Pro Xrys Leu Iieu lie Tyr Thr Vai ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro50 55 60Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lle65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Ser Gln Thr85 90 95

Thr His Vàl Pro Trp Thr Fhe Gly Gln Gly Thr Lys Vai Glu Xlã Lya100 105 110

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe XXe Phe Pro Pro Ser Asp Glu115 120 125

Gln Leu Lys ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asm Asn Phe130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gln $rp Lys Vai Asp Aen Ala Lgu Gln145 ISO 155 1S0

Ser Gly Assa Ser Gln Glu Ser Vai tffa.r Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu180 185 190

Lys HIes Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gln Gly Leu ser Ser19S 200 205

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asa Arg Gly Glu Cys310 215

Claims (49)

1. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno queespecificamente se liga a CD40 humano, caracterizado pelo fato decompreender um domínio variável de cadeia pesada humanizadocompreendendo uma região de armação tendo uma seqüência de aminoácidospelo menos 90% idêntica à seqüência de aminoácidos da região de armaçãoda seqüência de aminoácidos de consenso de subgrupo de cadeia pesada dodomínio variável humano III da SEQ ID NO:2, e compreendendo pelo menosum CDR tendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a umCDR de cadeia pesada correspondente de SEQ ID NO:3.

2. Anticorpo isolado ou fragmento de ligação a antígeno queespecificamente se liga a CD40 humano, caracterizado pelo fato decompreender um domínio variável de cadeia leve humanizadocompreendendo uma região de armação tendo uma seqüência de aminoácidospelo menos 90% idêntica à região de armação da seqüência de aminoácidosde consenso de subgrupo de cadeia leve do domínio variável humano kappa Ide SEQ ID NO: 13, e compreendendo pelo menos um CDR tendo umaseqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a um CDR de cadeia levecorrespondente de SEQ ID NO: 14.

3. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ainda compreender domíniovariável de cadeia leve humanizado compreendendo uma região de armaçãocompreendendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica àregião de armação da seqüência de aminoácidos de consenso do subgrupo decadeia leve do domínio variável humano kappa I de SEQ ID NO: 13compreendendo pelo menos um CDR tendo uma seqüência de aminoácidospelo menos 90% idêntica a um CDR de cadeia leve correspondente de SEQ ID NO: 14.

4. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que cada CDR de cadeiapesada é pelo menos 90% idêntico ao correspondente CDR de cadeia pesadade SEQIDNO:3.

5. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que os CDRs de cadeiapesada compreendem a seqüência de aminoácidos dos CDRs correspondentesCDR de cadeia pesada de SEQ ID NO:3.

6. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que cada CDR decadeia leve é pelo menos 90% idêntico ao CDR de cadeia leve correspondentede SEQ ID NO: 14.

7. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que os CDRs de cadeia levecompreendem as seqüências de aminoácidos dos CDRs de cadeia leve deSEQ ID NO. 14.

8. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência deaminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO:3, SEQ IDNO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ IDNO:9, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO:l 1.

9. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência deaminoácidos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 14, SEQ IDNO: 15, ou SEQ ID NO: 16.

10. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de compreender a seqüência deaminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ ID NO.3, SEQ IDNO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ IDNO:9, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO. 11, e a seqüência de aminoácidos dedomínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, ou SEQ IDNO: 16.

11. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 1 ou 3, caracterizado pelo fato de ainda compreender aregião constante de IgG humana.

12. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o isotipo da regiãoconstante de IgG é IgGl, IgG2, IgG3, ou IgG4.

13. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o isotipo da regiãoconstante de IgG é IgGl.

14. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de ainda compreender umdomínio constante de cadeia leve.

15. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o domínio constante decadeia leve é um domínio constante kappa.

16. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o domínio variável decadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve compreendem asseqüências de aminoácidos de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO: 14,respectivamente; SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ IDNO:5 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 14,respectivamente; SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 14,respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 15, respectivamente; SEQ IDNO:6 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO: 16,respectivamente; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ IDNO: 11 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 16,respectivamente; ou SEQ ID NO:l 1 e SEQ ID NO: 16, respectivamente.

17. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o domínio variável decadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve compreendem asseqüências de aminoácidos de SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO: 14,respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQ IDNO:7 e SEQ ID NO:16, respectivamente; SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO: 14,respectivamente; SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ IDNO: 10 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; ou SEQ ID NO: 11 e SEQ IDNO: 16, respectivamente.

18. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o domínio variável decadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve compreendem asseqüências de aminoácidos de SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO: 14,respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQ IDNO: 10 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; ou SEQ ID NO: 11 e SEQ IDNO: 16, respectivamente.

19. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o domínio variável decadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve compreendem asseqüências de aminoácidos de SEQ ID NO:3 e SEQ ID NO: 14,respectivamente.

20. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o domínio variável decadeia pesada e o domínio variável de cadeia leve compreendem asseqüências de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 16,respectivamente.

21. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 16-20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo ainda compreende umaregião constante de immunoglobulina humana.

22. Anticorpo de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de compreender as seqüências de aminoácidos de cadeia pesada ecadeia leve especificadas em SEQ ID NO: 19 e SEQ ID NO:22,respectivamente.

23. Anticorpo de acordo com a reivindicação 21, caracterizadopelo fato de ser hu sgn-0, hu sgn- 1, hu sgn-2, hu sgn-4, hu sgn-14, hu sgn-15,hu sgn-16, hu sgn-17, hu sgn-18, hu sgn-19, hu sgn-22, hu sgn-23, hu sgn- 26ou hu sgn-27.

24. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que é umfragmento de anticorpo de ligação a antígeno.

25. Fragmento de ligação a antígeno de acordo com areivindicação 24, caracterizado pelo fato de que o fragmento de anticorpo éum fragmento Fab, um Fab', um F(ab')2, um Fv, um diacorpo, um anticorpode cadeia única, um fragmento scFv ou um scFv-Fc.

26. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de aindacompreender um rótulo detectável.

27. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de queanticorpo é conjugado a um agente quimioterapêutico.

28. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o agentequimioterapêutico é uma auristatina.

29. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que a auristatina é MMAEouMMAF.

30. Kit, caracterizado pelo fato de compreender em umrecipiente o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno como definido emqualquer uma das reivindicações 1-3, e opcionalmente instruções para usar oanticorpo para detectar proteína CD40 em uma amostra biológica.

31. Método para inibir o crescimento de células expressandoantígeno humano CD40, caracterizado pelo fato de compreender administrar oanticorpo ou fragmento de ligação a antígeno como definido em qualquer umadas reivindicações 1-3, às células, cujo anticorpo ou fragmento de ligação aantígeno especificamente liga ao antígeno CD40 de superfície de célulahumana, em que a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno aoantígeno CD40 inibe o crescimento ou diferenciação das células.

32. Método para tratar um indivíduo tendo um distúrbioassociado com CD40, caracterizado pelo fato compreender administrar aoindivíduo o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno como definido emqualquer uma das reivindicações 1-3, cujo anticorpo ou fragmento de ligaçãoa antígeno especificamente liga a CD40 humano, em que a ligação doanticorpo ou fragmento de ligação a antígeno a CD40 inibe o crescimento oudiferenciação de células do distúrbio associado com CD40.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que as células do distúrbio associado com CD40 são célulaslinfoblastóides B, pancreáticas, células de pulmão, células de mama, célulasdo ovário, células do cólon, células da próstata, células da pele, células dacabeça e pescoço, células da bexiga, células dos ossos ou células do rim.

34. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizadopelo fato de que o distúrbio associado com CD40 é leucemia linfocíticacrônica, linfoma de Burkitt, mieloma múltiplo, um linfoma de célula T célula,linfoma não de Hodgkin, doença de Hodgkin, macroglobulinemia deWaldenstrom ou sarcoma de Kaposi.

35. Método para induzir depleção de células B periféricas,caracterizado pelo fato de compreender a administração às células doanticorpo ou fragmento de ligação a antígeno como definido em qualquer umadas reivindicações 1-3, cujo anticorpo ou fragmento de ligação a antígenoespecificamente liga a uma célula de antígeno CD40 de superfície humano,em que a ligação do anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno ao antígenoCD40 induz a depleção das células.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno éadministrado a um indivíduo tendo um distúrbio imune.

37. Método de acordo com a reivindicação 37, caracterizadopelo fato de que o distúrbio imune é artrite reumatóide ou lúpus eritematososistêmico.

38. Anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno de acordocom qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que oanticorpo ou fragmento de ligação a antígeno compete para ligação comanticorpo monoclonal S2C6 que é secretado por um hibridoma tendo Númerode Acesso ATCC PTA- 110.

39. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato decompreender:(i) o anticorpo ou fragmento de ligação a antígeno comodefinido em qualquer uma das reivindicações 1-3; e(ii) um excipiente farmaceuticamente aceitável.

40. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato decodificar a região variável de cadeia pesada humanizada do anticorpo oufragmento de ligação a antígeno como definido na reivindicação 1.

41. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato decodificar a região variável de cadeia leve humanizada do anticorpo oufragmento de ligação a antígeno como definido na reivindicação 2.

42. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 40,caracterizado pelo fato de ainda codificar a região variável de cadeia levehumanizada compreendendo uma região de armação compreendendo umaseqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à região de armação daseqüência de aminoácidos de consenso do subgrupo de cadeia leve de regiãovariável humana kappa I de SEQ ID NO: 13 e compreendendo pelo menosum CDR tendo uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica a umCDR de cadeia pesada correspondente de SEQ ID NO:3.

43. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 40ou 42, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica umaseqüência de aminoácidos de domínio variável de cadeia pesada de SEQ IDNO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ IDNO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO:l 1.

44. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 41ou 42, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica a seqüênciade aminoácidos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 14, SEQ IDNO:15,ouSEQIDNO:16.

45. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica a seqüência deaminoácidos de domínio variável de cadeia pesada e a seqüência deaminoácidos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:3 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO: 14, respectivamente;SEQ ID NO:5 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO: 14, respectivamente;SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:9 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 15, respectivamente;SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQ ID NO:7 e SEQ IDNO: 16, respectivamente; SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 14,respectivamente; SEQ ID NO:l 1 e SEQ ID NO: 14, respectivamente; SEQ IDNO: 10 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; ou SEQ ID NO:l 1 e SEQ ID NO:-16, respectivamente.

46. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica a seqüência deaminoácidos de domínio variável de cadeia pesada e a seqüência deaminoácidos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:7 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 16, respectivamente;SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQ ID NO: 10 e SEQ IDNO: 14, respectivamente; SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 14, respectivamente;SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; ou SEQ ID NO: 11 e SEQID NO: 16, respectivamente.

47. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica a seqüência deaminoácidos de domínio variável de cadeia pesada e a seqüência deaminoácidos de domínio variável de cadeia leve SEQ ID NO:7 e SEQ ID NO:-14, respectivamente; SEQ ID NO:6 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; SEQID NO: 10 e SEQ ID NO: 16, respectivamente; ou SEQ ID NO: 11 e SEQ IDNO: 16, respectivamente.

48. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica a seqüência deaminoácidos de domínio variável de cadeia pesada e a seqüência deaminoácidos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO:3 e SEQ IDNO: 14, respectivamente.

49. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 43,caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica a seqüência deaminoácidos de domínio variável de cadeia pesada e a seqüência deaminoácidos de domínio variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 10 e SEQ IDNO: 16, respectivamente.