JPH09507074A - Ｃｄ４０を発現する腫瘍細胞を特徴とする疾患の予防又は治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＣＤ４０を発現する腫瘍細胞を特徴とする疾患に罹患した哺乳動物の治療方法であって、薬剤学的に受容される緩衝剤中のＣＤ４０結合タンパク質の治療有効量を投与することを含む方法を開示する。ＣＤ４０結合タンパク質は、ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体及びＣＤ４０リガンドを含む。ＣＤ４０結合タンパク質はＣＤ４０を発現する腫瘍細胞を特徴とする疾患に罹患する恐れのある個体において、このような疾患を予防するためにも使用可能である。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＤ４０を発現する腫瘍細胞を特徴とする疾患の予防又は治療方法 発明の技術分野 本発明は、ＣＤ４０を発現する腫瘍細胞(neoplastic cell)を特徴とする疾患 の予防又は治療方法に関する。さらに詳しくは、本発明はＢ細胞リンパ腫を治療 又は予防する方法に関する。 発明の背景 免疫芽細胞Ｂ細胞リンパ腫はしばしば、例えば、同種移植レシピエント及び その他の長期間免疫抑制療法を受けたレシピエント等の免疫寛容処理された(imm unocompromised)個体、ＡＩＤＳ患者，並びに例えばＸ染色体性リンパ球増殖症 候群若しくはＷｉｓｃｏｎ−Ａｌｄｒｉｃｈ症候群等の第一期免疫疾患を伴う患 者に生ずる（Ｔｈｏｍａｓ等，Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：３２９， １９９１；Ｓｔｒａｕｓ等，Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１８：４５，１ ９９３）。これらの腫瘍は潜伏性Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ） 感染症のＴ細胞制御の欠陥の結果として生ずると思われる。重度な併発免疫不全 症候群（ＳＣＩＤ）を有するマウスに健康なＥＢＶ陽性個体からの末梢血リンパ 球（ＰＢＬ）を接種することによって、ヒト起源の同様なリンパ腫を誘導するこ とができる（Ｍｏｓｉｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ ３３５：２５６，１９８８；Ｒｏ ｗ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４７，１９９１）。 正常ヒトＢ細胞と腫瘍ヒトＢ細胞の両方の表面に存在する細胞表面抗原、ＣＤ ４０は、３０，６００の予測分子量を有する２７７アミノ酸のペプチドであり、 １９アミノ酸分泌シグナルペプチドは主として疎水性のアミノ酸から成る。この 細胞表面抗原はＢ細胞増殖と分化とに重要な役割を果たすことが判明している。 ＣＤ４０をコードするｃＤＮＡは、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞ラインＲａｊｉ から作製されたｃＤＮＡライブラリーから単離されている（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖ ｉｃ等，ＥＭＢＯ Ｊ．８：１４０３，１９８９）。ＣＤ４０は単球及び上皮細 胞の表面上と、ある種の上皮癌腫上とにも発現される（Ｅ．Ａ．Ｃｌａｒｋ，Ｔ ｉｓｓｕｅ Ａｎｔｉｇｅｎｓ ３６：３３；１９９０）。 活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞は高レベルのＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）を発現す る。Ｓｐｒｉｇｇｓ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１５４３（１９９２）及 び米国特許出願第０７／９６９，７０３号（１９９２年１０月２３日出願）（こ れの開示は本明細書に援用される）に記載されるように、ヒトＣＤ４０Ｌ（膜結 合糖タンパク質）が最近、末梢血Ｔ細胞からクローン化されている。ネズミＣＤ ４０Ｌのクローン化はＡｒｍｉｔａｇｅ等，Ｎａｔｕｒｅ３５７：８０，１９９ ２に記載されている。ＣＤ４０Ｌは共刺激物(costimulus)の不存在下でＢ細胞増 殖を誘導し、サイトカインの存在下で免疫グロブリンの産生を誘導することもで きる。 ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体は技術上周知である（例えば、ＬＥＵＫ ＯＣＹＴＥ ＴＹＰＩＮＧ ＩＩＩ：Ａ．Ｊ．ＭｃＭｉｃｈａｅｌ編集．Ｏｘｆ ｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ オックスフォード及びＬＥＵＫＯ ＣＹＴＥ ＴＹＰＩＮＧ ＩＶ：Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅ ｓｓ オックスフォードにおけるＢ細胞抗原に関する項を参照のこと）。ＣＤ４ ０に対する抗体は正常Ｂ細胞に共刺激シグナルを及ぼし、増殖及び分化反応を惹 起することが実証されている。同様に、ＣＤ４０−Ｌはタンパク質刺激又は共刺 激シグナルを正常Ｂ細胞に及ぼす。 一部のＢ細胞リンパ腫ラインへの表面ＩｇＭの架橋がリンパ腫細胞に抑制シグ ナルを及ぼすことが観察されている（Ｂｅｃｋｗｉｔｈ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ．１４７：２４１１，１９９１）。同様に、正常リンパ球を活性化させる刺激へ の悪性Ｂ又はＴ細胞の暴露は細胞の成長を停止させることができる（Ａｓｈｗｅ ｌｌ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３７：６１，１９８７；Ｂｒｉｄｇｅｓ等，Ｊ．Ｉ ｍｍｕｎｏｌ．１３９；４２４２，１９８７；Ｍｅｒｃｅｐ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．１４０；３２４，１９８８；Ｓｕｓｓｍａｎ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１ ４０；２５２０，１９８８；ＷａｒｎｅｒとＳｃｏｔｔ，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎ ｏｌ．１４０：３７１７，１９８８）。 Ｇａｒｎｉｅｒ等は、ＣＤ４０又は他のＢ細胞マーカー、ＣＤ２３に対する抗 体が、ヒトＰＢＬを注入され、次にＥＢＶに感染されたＳＣＩＤマウスにおける リンパ腫形成の阻害にある程度の効果を示すことを観察している（Ａｂｓｔｒａ ｃｔ １６７，ＸＩＶｔｈ，Ｉｎｔｌ．Ｃｏｎｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｒ ａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ，１９９２）。しかし、関係する 作用機序が抗ＣＤ４０抗体によるＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合の阻害であるの か、又は他の何らかの手段によるＣＤ４０へのＣＤ４０Ｌの結合の阻害であるの かは当該技術分野において知られていない。それ故、ＣＤ４０を発現する、Ｂ細 胞リンパ種及び他の悪性細胞に対する他の抗ＣＤ４０抗体及びＣＤ４０−Ｌ自体 の効果を評価することが技術上必要とされている。 発明の概要 本発明は、ＣＤ４０を発現する腫瘍細胞を特徴とする疾患に罹患した哺乳動物 の治療方法であって、薬剤学的に受容される緩衝剤中のＣＤ４０結合タンパク質 の治療有効量を投与することを含む方法に関する。治療有効量は約０．０１〜約 １ｍｇ／ｋｇ体重である。ＣＤ４０結合タンパク質はＣＤ４０に対するモノクロ ーナル抗体、ＣＤ４０リガンド、及びこれらの組合せから選択することができる 。特に好ましいモノクローナル抗体はｈＣＤ４０ｍ２（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，米国，メリーランド州，ロック ビルにブダペスト条約の下で寄託、ＡＴＣＣ受け入れ番号ＨＢ１１４５９を与え られる）とｈＣＤ４０ｍ３であり、これらはＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／１３０，５ ４１（１９９３年１０月１日に出願）に記載される。ＣＤ４０リガンドのオリゴ マー形が特に好ましく、これは溶解性ＣＤ４０リガンド−Ｆｃ融合タンパク質と オリゴマーＣＤ４０ロイシンジッパー融合タンパク質とを含み、これらの両方が Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／９６９，７０３（１９９２年１０月２３日に出願）に記 載されている。本発明はまた、ＣＤ４０を発現する腫瘍細胞を特徴とする疾患に 罹患しやすい哺乳動物においてこの疾患を予防する方法であって、薬剤学的に受 容される緩衝剤中のＣＤ４０結合タンパク質の治療有効量を投与することを含み 、治療有効量が約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇ体重である方法にも関する。ＣＤ４ ０を発現する腫瘍細胞はＢリンパ腫細胞、一部の骨髄腫細胞及び一部の癌腫細胞 を含む。 図面の簡単な説明 図１は、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体Ｍ２とＭ３とを用いた、数種類のリン パ腫細胞ラインによるＣＤ４０発現を説明する。 図２は、ＣＤ４０に対する抗体（黒い方形）による数種類のリンパ腫細胞ライ ン増殖の抑制を実証する；これと対照的に、ｍｓＩｇＧは増殖を抑制しなかった （白い方形）。 図３は、溶解性抗ＣＤ４０（パネルＡ）又は固定ＣＤ４０（パネルＢ）のリン パ腫成長に対する効果の比較を示す。 図４は、溶解性ＣＤ４０リガンドがインビトロでＢ細胞リンパ腫の成長を抑制 できることを実証する。 図５は、ＣＤ４０に対する抗体がインビトロでヒト骨髄腫細胞の成長を抑制で きることを実証する。 図６は、溶解性ＣＤ４０リガンドがインビボでＢ細胞リンパ腫の成長を抑制で きることを実証する。 発明の詳細な説明 本発明は、ＣＤ４０として知られる細胞表面分子を発現する腫瘍細胞を特徴と する疾患を治療又は予防する方法に関する。本発明の方法はＣＤ４０結合タンパ ク質及びＣＤ４０自体の適当なコンホメーションに基づいて非共有結合相互作用 で特異的にＣＤ４０を結合するタンパク質（又は複数のタンパク質）（ＣＤ４０ 結合タンパク質と呼ぶ）を用いる。例えば、ＣＤ４０結合タンパク質はＣＤ４０ リガンドの細胞外領域を含むことができる。他の場合には、ＣＤ４０結合タンパ ク質は抗原結合領域を通してＣＤ４０を結合する抗体を含むことができる。さら に別のＣＤ４０結合タンパク質は、組換え体方法によって、ＣＤ４０リガンドか らのＣＤ４０結合領域（ドメイン）又はＣＤ４０に対する抗体を第２タンパク質 （例えば、ヒト免疫グロブリンＦｃドメイン）と共に含む融合タンパク質を作製 することによって製造することができる。ＣＤ４０ ヒトＣＤ４０抗原（ＣＤ４０）は、３０，６００の分子量を有する２７７アミ ノ酸のペプチドであり、１９アミノ酸分泌シグナルペプチドは主として疎水性の アミノ酸から成る（Ｓｔａｍｅｎｋｏｖｉｃ等，上記文献）。ヒトＣＤ４０をコ ードするｃＤＮＡは、Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞ラインＲａｊｉから作製され たｃＤＮＡライブラリーから単離されている。ＣＤ４０ｃＤＮＡによってコード される推定(putative)タンパク質は、推定リーダー配列、膜貫通(transmembrane )ドメイン及び膜結合受容体に共通した他の幾つかの特徴(feature)を有する。Ｃ Ｄ４０はＢリンパ球、上皮細胞及び一部の癌腫細胞ラインに発現されることが判 明している。 ＣＤ４０は、細胞外領域におけるシステインリッチモチーフの存在によって定 義される、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）／神経成長因子（ＮＧＦ）受容体ファミリー のメンバーである（Ｓｍｉｔｈ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４８：１０１９，１９９ ０；ＭａｌｌｅｔｔとＢａｒｃｌａｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １ ２：２２０，１９９１）。このファミリーはリンパ球抗原ＣＤ２７、ＣＤ３０（ Ｈｏｄｇｋｉｎリンパ腫及びＲｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ細胞に検出される抗 原）、ＴＮＦの２つの受容体、４−１ＢＢと呼ばれるネズミタンパク質、ラット ＯＸ４０抗原、ＮＧＦ受容体及びＦａｓ抗原を含む。 ＣＤ４０は技術上周知の幾つかの手段のいずれかによって細胞表面に検出する ことができる。例えば、本明細書の実施例１に述べるように、細胞がＣＤ４０を 発現するか否かを決定するための蛍光活性化細胞選別方法に、ＣＤ４０に特異的 な抗体を用いることができる。細胞表面分子を検出する他の方法もＣＤ４０の検 出に有用である。ＣＤ４０モノクローナル抗体 ＣＤ４０表面抗原に対するモノクローナル抗体（ＣＤ４０ｍＡｂ）はヒトＢ細 胞に対する種々な生物学的活性を仲介することが判明している。例えば、ＣＤ４ ０ｍＡｂはホモ型(homotypic)又はヘテロ型(heterotypic)接着を誘導し（Ｂａｒ ｒｅｔｔ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：１７２２，１９９１；Ｇｏｒｄｏｎ 等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５，１９８８）、細胞サイズを増大さ せる（Ｇｏｒｄｏｎ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５，１９８８；Ｖ ａｌｌｅ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１４６３，１９８９）。ＣＤ ４０ｍＡｂはまた、抗ＩｇＭ、ＣＤ２０ｍＡｂ若しくはホルボールエステルの単 独によって（ＣｌａｒｋとＬｅｄｂｅｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８３：４４９４，１９８６；Ｇｏｒｄｏｎ等，ＬＥＵＫＯＣ ＹＴＥ ＴＹＰＩＮＧ ＩＩＩ：Ａ．Ｊ．ＭｃＭｉｃｈａｅｌ編集，Ｏｘｆｏｒ ｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，オックスフォード，４２６頁；Ｐａｕ ｌｉｅ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：５９０，１９８９）又はＩＬ−４との 協力によって（Ｖａｌｌｅ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９：１４６３， １９８９；Ｇｏｒｄｏｎ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１５３５，１ ９８７）活性化されたＢ細胞の増殖をも誘導して、ＩＬ−４刺激Ｔ細胞欠損培養 物からＩｇＥ（Ｊａｂａｒａ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１８６１，１９ ９０；Ｇａｓｃａｎ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８，１９９１）、ＩｇＧ 及びＩｇＭ（Ｇａｓｃａｎ等，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８，１９９１）を 産生させる。 さらに、ＣＤ４０ｍＡｂはＢ細胞からのＩＬ−４仲介溶解性ＣＤ２３／Ｆｃｅ ＲＩＩ放出を強化し（ＧｏｒｄｏｎとＧｕｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ８ ：３３９，１９８７；Ｃａｉｒｎｓ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：３ ４９，１９８８）、ＩＬ−６のＢ細胞産生を促進する（ＣｌａｒｋとＳｈｕ，Ｊ ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４５，１４００，１９９０）と報告されている。最近、Ｃ Ｄ_W３２＋接着性細胞の存在下で、ヒトＢ細胞ラインが一次Ｂ細胞集団(primary B cell population)からＩＬ−４及びＣＤ４０ｍＡＢによって得られている（Ｂ ａｎｃｈｅｒｅａｕ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：７０，１９９１）。さらに、 胚中心のセントロサイト(centrocyte)は、ＣＤ４０及び／又は抗原受容体によっ て活性化されるならば、アポプトシスから防御されることができる（Ｌｉｅ等， Ｎａｔｕｒｅ，３４２：９２９，１９８９）。上記集団の各々は、Ｂ細胞の生物 学的活性を刺激するＣＤ４０ｍＡｂを述べている。 Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／１３０，５４１（１９９３年１０月１日出願）はｈＣ Ｄ４０ｍ２及びｈＣＤ４０ｍ３と呼ばれる、ＣＤ４０に対する２つのモノクロー ナル抗体を開示しており、この出願の関連する開示は本明細書に援用される。ｈ ＣＤ４０ｍ２（ＡＴＣＣ ＨＢ１１４５９）及びｈＣＤ４０ｍ３は、他のＣＤ４ ０ｍＡｂとは異なり、ＣＤ４０を結合し、ＣＤ４０Ｌを本質的に発現する細胞へ のＣＤ４０の結合を阻害する。ｈＣＤ４０ｍ２及びｈＣＤ４０ｍ３によっては、 不適切なＩｇＧ又は対照ＣＤ４０ｍＡｂ，Ｇ２８．５に比べて、１２．５μｇ／ ｍｌ程度の低濃度において、結合の９５％より大きい阻害が観察された。ｈＣＤ ４０ｍ２はまた、ＣＤ４０誘導ＴＮＦα産生をも抑制することができた。 慣習的な方法を用いて、他のＣＤ４０モノクローナル抗体を得ることもできる （本明細書に援用される、米国特許第ＲＥ３２，０１１号、第４，９０２，６１ ４号、第４，５４３，４３９号及び第４，４１１，９９３号を参照のこと；やは り、本明細書に援用される、「モノクローナル抗体、ハイブリドーマ：生物学的 分析における新しい次元」，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｋｅｎｎｅｔｔ，Ｍｃ Ｋｅａｒｎ及びＢｅｃｈｔｏｌ（編集），１９８０，及び「抗体：実験室マニュ アル」，ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（編集），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８を参照のこと）。 簡単に説明すると、ＣＤ４０に対する免疫反応を惹起させるのに適した、ＣＤ ４０の１種類を動物に注入する。ＣＤ４０に対する血清抗体レベルがプラトーに 達するまで、必要に応じて動物を再免疫化し、次に、溶解性ＣＤ４０の最終的ブ ースト(final boost)を投与し、３〜４日後に殺した。例えば脾臓及びリンパ節 のような、多量のＢ細胞を含む器官を回収し、この器官をメッシュスクリーン(m esh screen)に通すことによって、又は細胞を封入する脾臓若しくはリンパ節膜 を破壊することによって、粉砕して、単細胞サスペンジョンにする。 或いは、インビトロ免疫化方法の使用によって、モノクローナル抗体の作製に 適した細胞を得る。簡単に説明すると、動物を殺して、脾臓とリンパ節とを摘出 する。単細胞サスペンジョンを調製し、上述のように免疫反応の惹起に適した種 類のＣＤ４０を含む培養物中に細胞を加える。続いて、リンパ球を回収し、以下 に述べるように融合させる。 インビトロ免疫化の使用によって又は上記のような免疫化動物から得られる細 胞を、例えばＥｐｓｔｅｉｎバーウイルス(bar virus)（ＥＢＶ）のようなウイ ルスによるトランスフェクションによって、不死化する(immortalized)（Ｇｌａ ｓｋｙとＲｅａｄｉｎｇ，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ ８（４）：３７７〜３８９，１ ９８９）。或いは、モノクローナル抗体を分泌する“ハイブリドーマ”を作製す るために、回収した脾臓及び／又はリンパ節の細胞サスペンジョンを適当な骨髄 腫細胞と融合させる。適当な骨髄腫ラインは抗体の構成又は発現において不完全 であり、さらに、免疫化動物からの細胞と同系(syngeneic)であることが好まし い。このような多くの骨髄腫細胞ラインが当該技術分野において周知であり、例 えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ａ ＴＣＣ）（メリーランド州，ロックビル）のようなソース(source)から入手可能 である（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ＆ Ｈｙｂｒｉｄ ｏｍａｓ，第６版，ＡＴＣＣ，１９８８）。ＣＤ４０リガンド 活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ４０に対する高レベルのリガンド（ＣＤ４０Ｌ） の高レベルを発現する。Ｓｐｒｉｇｇｓ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１５ ４３（１９９２）及び米国特許出願第０７／９６９，７０３号（１９９２年１０ 月２３日出願）（これの開示は本明細書に援用される）に記載されるように、ヒ トＣＤ４０Ｌ（膜結合糖タンパク質）が最近、末梢血Ｔ細胞からクローン化され ている。ネズミＣＤ４０Ｌのクローン化はＡｒｍｉｔａｇｅ等，Ｎａｔｕｒｅ， ３５７：８０，１９９２に記載されている。ＣＤ４０Ｌは共刺激物の不存在下で Ｂ細胞増殖を誘導し、サイトカインの存在下で免疫グロブリンの産生を誘導する こともできる。 ＣＤ４０−ＬはそのＣ末端の細胞外領域と、膜貫通領域と、そのＮ末端の細胞 内領域とを有するＩＩ型膜ポリペプチドである。溶解性ＣＤ４０−ＬはＣＤ４０ −Ｌの細胞外領域（配列番号ＮＯ：１のアミノ酸４７〜アミノ酸２６１）又はそ のフラグメントを含む。ＣＤ４０−Ｌの生物学的活性はＣＤ４０−Ｌの細胞外領 域とＣＤ４０との結合によって仲介され、この活性はＢ細胞増殖と抗体分泌（Ｉ ｇＥ分泌を含む）の誘導とを含む。 Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／９６９，７０３は、ＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２と呼ばれる 、溶解性ＣＤ４０−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質の作製を開示する。ＣＤ４０−Ｌ／ ＦＣ２はＨｏｐｐ等によって記載される８アミノ酸配列（Ｈｏｐｐ等，Ｂｉｏ／ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４，１９８８；Ｆｌａｇ（登録商標）と呼ば れる）と、ＩｇＧ₁Ｆｃドメインと、［Ｇｌｙ₄Ｓｅｒ］₃リンカー配列（米国特 許第５，０７３，６２７号に記載）と、ヒトＣＤ４０−Ｌの細胞外領域とを含む 。“ロイシン ジッパー”と呼ばれる３３アミノ酸配列と、Ｈｏｐｐ等（上記文 献）が記載する８アミノ酸親水性配列と、これに続くヒトＣＤ４０−Ｌの細胞外 領域とを含む、トリマーＣＤ４０−Ｌと呼ばれる、溶解性ＣＤ４０−Ｌ融合タン パク質もＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／９６９，７０３に記載される。ＣＤ４０−Ｌの 両オリゴマー形は共刺激物の不存在下でのヒトＢ細胞増殖を誘導し、（適当なサ イトカインとの組合せで）ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＭの産生を生じる。 Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０７／９６９，７０３に記載されるＣＤ４０−Ｌ／ＦＣ２及 びトリマーＣＤ４０−Ｌは、組換えタンパク質の既知製造方法を用いて製造する ことができる他の種類のＣＤ４０−Ｌと同様に、本発明の方法に有用である。付加的なＣＤ４０結合タンパク質 組換えＤＮＡ方法を用いて、ＣＤ４０に対する抗体をコードする遺伝子の可変 領域を組み入れることによっても、結合タンパク質を製造することができる（Ｊ ａｍｅｓ Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ等，「混合プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖 反応：単ハイブリドーマ細胞からのヒトモノクローナル抗体可変領域遺伝子のク ローン化」，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ７：９３４〜９３８，１９８９年９ 月；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ等，「治療のためのヒト抗体の再成形」，Ｎａｔｕｒｅ ，３３２：３２３〜３２７，１９８８；Ｒｏｂｅｒｔｓ等，「タンパク質操作に よってその抗原に対するアフィニティと特異性とを強化した抗体の作製」，Ｎａ ｔｕｒｅ，３２８：７３１〜７３４，１９８７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等，「ヒト 抗体の再成形：抗リゾチム活性の移植」，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４〜 １５３６，１９８８；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ等，「Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ外毒素 に融合した２抗体可変領域から成る組換えイムノトキシン」，Ｎａｔｕｒｅ，３ ３９，３９４〜３９７，１９８９を参照のこと）。 簡単に説明すると、ＣＤ４０ｍＡｂの抗原結合部位（又はＣＤ４０結合ドメイ ン：可変領域）をコードするＤＮＡを単離し、増幅し、他のタンパク質（例えば 、ヒトＩｇＧ）をコードするＤＮＡに結合させる（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ等，上記 文献を参照；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ等，上記文献も参照のこと）。或いは、抗原結 合部位（可変領域）を他の完全に異なるタンパク質に結合させるか、又は挿入し て（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ等，上記文献参照）、抗体の抗原結合部位と、完全に異 なるタンパク質の機能活性とを有する、新しいタンパク質を生成する。 さらに、哺乳動物のＣＤ４０に特異的に結合する、抗体の小部分又は可変領域 をコードするＤＮＡ配列を本発明に関連して用いることもできる。同様に、ＣＤ ４０リガンドのＣＤ４０結合領域（細胞外ドメイン）を用いて、他のＣＤ４０結 合タンパク質を製造することもできる。オリゴマーを形成するタンパク質又はペ プチドをコードするＤＮＡ配列は、ＣＤ４０抗体の抗原結合ドメイン、又はＣＤ ４０リガンドの細胞外ドメインを含むＣＤ４０結合タンパク質の製造に特に有用 であると思われる。ある一定の、このようなオリゴマー形成タンパク質はＵ．Ｓ ．Ｓ．Ｎ．０７／９６９，７０３に開示されており、他の有用なオリゴマー形成 タンパク質はＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／１０７，３５３（１９９３年８月１３日出 願）及びＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．０８／１４５，８３０（１９９３年９月２９日出願） に開示される。 適当な抗体又は結合タンパク質が得られたならば、それらを当業者に周知の多 くの方法によって単離又は精製することができる（「抗体：実験室マニュアル」 ，ＨａｒｌｏｗとＬａｎｅ（編集），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬ ａｂｏｒａｔｏｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８８参照）。適当な方法には、ペプチド 若しくはタンパク質アフィニティカラム、ＨＰＬＣ若しくはＲＰ−ＨＰＬＣ、プ ロティンＡ若しくはプロティンＧカラム上での精製、又はこれらの方法の組合せ がある。組換え体ＣＤ４０結合タンパク質を標準方法によって調製して、例えば 、ＣＤ４０ｍＡｂに関して述べる生体活性(bioactivity)アッセイによるような 、ＥＬＩＳＡ、ＡＢＣ又はドット ブロット分析法を含めた分析法を用いてＣＤ ４０に対する結合特異性に関して試験することができる。ＳＣＩＤマウス方法 ＳＣＩＤ（重度複合免疫不全）マウスなる用語は、適切なＴ細胞受容体と免疫 グロブリンの遺伝子再構成を妨げ、そのために機能的Ｂ細胞及びＴ細胞を実際に 含まない、染色体１６欠損を有するマウスの突然変異Ｃ．Ｂ−１７系統を意味す る（Ｂｏｓｍａ等，Ｎａｔｕｒｅ，３０１：２５７，１９８３）。ＳＣＩＤマウ スはヒト胎児リンパ組織(lymphoid tissue)によって及び成人リンパ球によって 再構成することができ、そのため、インビボにおけるヒト免疫機能を研究するた めのモデルとして用いられている（Ｍｏｓｉｅｒ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３５：２ ５６，１９８８；ＭｃＫｕｎｅ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４１：１６３２，１９８ ８；Ｋａｍｅｌ−ＲｅｉｄとＤｉｃｋ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１７０７，１ ９８８）。Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）感染症の血清学的徴候 を有する個体からのヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）によって再構成されたＳＣＩ Ｄマウスは、しばしば、Ｂ細胞起源のリンパ腫を発生させる（Ｍｏｓｉｅｒ等， 上記文献；Ｃａｎｎｏｎ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８５：１３３３，１ ９９０；Ｒｏｗｅ等，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４７，１９９１；Ｐｕｒ ｔｉｌｏ等，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，４７：５１０，１９９１）。Ｖｅｒｏ ｎｅｓｅ等は、注入ＰＢＬ中の機能的Ｔ細胞の存在が潜伏性ＥＢＶ感染Ｂ細胞が 腫瘍塊(tumour mass)に進行するために絶対的に必要であることを報告した（Ｊ ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７６：１７６３，１９９２）。このＳＣＩＤマウスモデル に発生するリンパ腫は非常に侵襲的であり、免疫寛容化された(immunocompromis ed)個体に生ずるＥＢＶリンパ腫に類似する。ＣＤ４０結合タンパク質組成物の投与 本発明は、適当な希釈剤又はキャリヤー中に有効量のＣＤ４０結合タンパク質 を含む治療組成物と、この組成物を用いる哺乳動物の治療方法をも提供する。治 療用には、精製済みＣＤ４０結合タンパク質又はその生物学的活性類似体をその 適応症に適当な方法での治療のために患者（好ましくは、ヒト）に投与する。し たがって、例えば、所望の治療効果を得るために投与されるＣＤ４０結合タンパ ク質薬剤組成物（例えば、ＣＤ４０リガンドの溶解性細胞外ドメイン若しくはそ のフラグメント、又はＣＤ４０に対するモノクローナル抗体）をボラス注射、連 続注入、インプラントからの持続放出、又は他の適当な方法によって投与するこ とができる。 典型的には、ＣＤ４０結合タンパク質治療剤は、生理学的に受容されるキャリ ヤー、賦形剤又は希釈剤と組合せて精製済みＣＤ４０結合タンパク質を含む薬剤 組成物として投与される。このようなキャリヤーは用いる用量及び濃度において 患者に無害である。通常は、このような組成物の製造はＣＤ４０結合タンパク質 を緩衝剤、例えばアスコルビン酸のような酸化防止剤、低分子量（約１０残基未 満）ポリペプチド、タンパク質、アミノ酸、炭水化物（グルコース、スクロース 若しくはデキストランを含む）、例えばＥＤＴＡのようなキレート化剤、グルタ チオン、その他の安定剤及び賦形剤と混合することを含む。中性緩衝化生理食塩 水又は、同種の(conspecific)血清アルブミンと混合した生理食塩水が例示的な 好ましい希釈剤である。 適当な投与量は、技術上周知である方法によって決定することができる。典型 的には、ＣＤ４０結合タンパク質の治療有効投与量は、約０．０１〜約１ｍｇ／ ｋｇ体重の範囲内である。さらに、ＣＤ４０結合タンパク質は薬物、毒素又は放 射性化合物のコンジュゲート又は組合せとして用いることもできる。種々な疾患 を治療するためのこのようなコンジュゲートの製造は技術上周知である（例えば 、Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２：１６５７，１９９１参照）。予防又は治療 本明細書に記載するこれらの結果は、ＣＤ４０結合タンパク質がＢ細胞リンパ 腫の治療のみでなく、移植後若しくは例えばＡＩＤＳのような免疫抑制の他の症 例(instance)において生ずることがあり、このような患者集団における重大な危 険性を示すＥＢＶ誘導Ｂ細胞リンパ腫の予防においても、有意に臨床的に使用可 能であることを実証する。ＣＤ４０結合タンパク質は種々なＢ細胞リンパ腫を直 接抑制することができるので、ＣＤ４０結合タンパク質を毒素又は放射性化合物 のコンジュゲートとして用いる必要はなく、そのために、正常なＢ細胞への毒性 及び可能な負の効果を避けることができる。 本発明の方法は、免疫寛容化された個体にしばしば生ずる免疫芽細胞のＢ細胞 リンパ腫の予防に有用である。このような予防方法では、免疫芽細胞のＢ細胞リ ンパ腫を発症する危険性のある哺乳動物にＣＤ４０結合タンパク質を投与する。 個体を危険にさらす免疫寛容状態が存在する限り、ＣＤ４０結合タンパク質を投 与することができる。 同様に、本発明の方法が、ＣＤ４０を発現する他の種類の悪性細胞を特徴とす る腫瘍疾患の危険性にある個体における、このような疾患の発生（再発）を予防 するために利用可能であることを結果が実証する。このような症例の危険状態に あると見なされる個体は、腫瘍細胞がＣＤ４０を発現する癌の素因を示す家族歴 又は他の遺伝的特徴を有する個体、及び化学療法の結果として薬物耐性腫瘍疾患 を発症し、薬物耐性腫瘍細胞がＣＤ４０を発現する個体を含む。 ＣＤ４０を発現する腫瘍細胞を特徴とする疾患に罹患した個体も本発明の方法 によって治療することができる。治療なる用語は、当該技術分野で一般的に理解 されるように、疾患の臨床的症状又は徴候が観察された後の療法の開始を一般的 に意味する。本発明の方法は、罹患した個体に適当な他の療法（化学療法、放射 線療法及び免疫方法を含む）と併用することができる。 本明細書に挙げた全ての参考文献の関連する開示は特に本明細書に援用される 。下記実施例は特定の実施態様を例示することを意図するものであり、発明の範 囲を限定するものではない。 実施例１ この実施例はヒトＢ細胞リンパ腫細胞と細胞ラインとの特徴付けを説明する。 用いた細胞はＲＬ及びＤＢ、Ｂ細胞起源の散在性大細胞リンパ腫を有する患者か ら得た細胞ライン（Ｂｅｃｋｗｉｔｈ等，上記文献）と、ＴＵ２Ｃ及びＣＨ１Ｍ ６２、ＥＢＶ血清陽性個体からのＰＢＬを注入したＳＣＩＤマウスから得たＥＢ Ｖ誘導リンパ腫とを含有した。研究を開始する前に、これらの細胞を標準培養条 件下で６か月未満の間、培養維持した。他の細胞はＲａｊｉ、Ｂｕｒｋｉｔｔリ ンパ腫を有する患者から培養した細胞ラインと、ＬＣＬ−２３１１、インビボで ＥＢＶをヒトＰＢＬに感染させることによって得られるリンパ芽球(lymphoblast oid)細胞ラインとを含有した。 細胞ラインの全ては抗ＣＤ４０モノクローナル抗体Ｍ２とＭ３を用いる、フロ ーサイトメトリー(flow cytometry)によって、ＣＤ４０発現に関して陽性であっ た；結果は図１に示す。ＲＬ、ＤＢ及びＲａｊｉ細胞は、それらのＣＤ４０発現 において同質(homogeneous)であったが、ＳＣＩＤマウスからのＥＢＶ誘導リン パ腫は抗ＣＤ４０による染色強度において異質(heterogeneous)であった。これ らのマウスからのリンパ腫が異質であり、オリゴクローナルであることは実証さ れており（Ｎａｋａｍｉｎｅ等，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４２：１３９，１ ９９３）、これがＣＤ４０の他とは異なる(differential)発現の原因と考えられ る。ＣＤ２０（他のＢ細胞マーカー）も腫瘍細胞上に存在した。 実施例２ この実施例は、インビトロにおけるリンパ腫細胞と細胞ラインとの増殖力に対 する抗ＣＤ４０抗体（Ｍ２とＭ３）の効果を説明する。実質的にＲｏｗｅ等が記 載する通りに分析法を用いて、増殖を判定した（Ｊ．Ｅｘｐ，Ｍｅｄ．１７３： １４７，１９９１）。簡単に説明すると、分析を実施する２４時間前に、細胞ラ インを分割した。細胞を培地中に１ｘ１０⁵／ｍｌの濃度に再懸濁させ、細胞懸 濁液の１００μｌを、適当に希釈した試薬［Ｉｍｍｕｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔ ｉｏｎ（米国，ワシントン州，シアトル）から得たモノクローナル抗ＣＤ４０抗 体Ｍ２とＭ３、又はＣａｐｐｅ（米国，ペンシルバニア州，ウェストチェスター ）から購入したマウスＩｇＧ骨髄腫タンパク質（ｍｓＩｇＧ）］１００μｌを既 に含む９６孔丸底マイクロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗ ｏｒｋｓ，米国、ニューヨーク州，コーニング）に入れた。７２時間後に、［³ Ｈ］チミジン １μＣｉ／孔（比活性 ６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ；Ｎｅｗ Ｅｎｇ ｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，米国，マサ チューセッツ州，ボストン）を培養の最後の８〜１８時間に加えた。ＰｈＤＣｅ ｌｌ回収系（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社，米国，マサチュー セッツ州，ケンブリッジ）を用いて、培養物をガラス繊維フィルター上に回収し 、［³Ｈ］チミジン取込みをＬＫＢ βカウンター（ＬＫＢ Ｉｎｓｔｒｕｍｅ ｎｔｓ社，フィンランド，ツルク(Turku)］を用いる液体シンチレーションによ って分析した。各実験は４〜６回実施し、代表的な実験の結果を図２に示す。 抗ＣＤ４０モノクローナル抗体Ｍ２及びＭ３と共にのインキュベーションは、 試験したＲＬ、ＤＢ、ＬＣＬ−２３１１及びＥＢＶリンパ腫細胞ラインの増殖の 有意な阻害を生じ、４０〜６０％の最適な阻害は、リンパ腫細胞に依存して、溶 解性抗体１〜１０μｇ／ｍｌにおいて生じた。Ｒａｊｉ細胞ラインは溶解性抗Ｃ Ｄ４０によって有意に影響されるとは思われなかった。 次に、リンパ腫成長に対する溶解性抗ＣＤ４０の効果を固定化抗ＣＤ４０の効 果に比較した。簡単には、孔を３７℃において一晩、ヤギ抗マウス抗体と共にイ ンキュベートした。次に、Ｋｅｖｉｎ Ｃｏｎｌｏｎ博士（Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＢＲＭＰ，ＮＣ Ｉ−ＦＣＲＤＣ，米国，メリーランド州，フレデリック）によって提供された、 モノクローナル抗体Ｍ２、Ｍ３、抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、又はｍｓＩｇ Ｇを１０μｇ／ｍｌの濃度で、孔に加え、孔をさらに４時間、３７℃においてイ ンキュベートした。次に、増殖分析を上述のように実施した；結果を図３に示す 。溶解性抗ＣＤ４０、又は溶解性若しくは固定化抗ＣＤ２０に比べて、固定化は 固定化抗ＣＤ４０抗体による有意に大きい増殖阻害（ｐ＜０．０５）を生じた。 ＣＤ４０の刺激は、正常Ｂ細胞に対するその効果とは対照的に、ＥＢＶ誘導Ｂリ ンパ腫に阻害効果を及ぼす。 実施例３ この実施例は、インビトロにおけるＢ細胞リンパ腫の成長に対するＣＤ４０リ ガンドの効果を説明する。溶解性ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ；Ｕ．Ｓ．Ｓ． Ｎ．０７／９６９，７０３に記載）はトランスフェクトした(transfected)ＣＯ Ｓ−７細胞から上澄み液(supernatant fluid)として得て、実施例２に上述した ように用いた増殖分析において、ＲＬ又はＴＵ２Ｃ細胞を用いて試験した。ネズ ミＣＤ４０−Ｌは、ＣＤ４０を発現するヒト細胞に結合し、ヒトＣＤ４０−Ｌと 同様に共刺激物として作用するので、ネズミＣＤ４０−Ｌ含有上澄み液とヒトＣ Ｄ４０−Ｌ含有上澄み液との両方を試験した。上澄み液の各ロットを滴定して、 増殖の最適阻害を生じる濃度を測定した；１：５希釈が最大阻害を生じた。 例示的な結果を図４に示す；数値は対照上澄み液に比べた阻害％として表す。 試験した種々なリンパ腫に対して溶解性ヒトリガンドは阻害性であり、ＲＬ及び ＴＵ２Ｃ細胞に対して上澄み液の１：５希釈度において最大阻害（５０〜８０％ ）が見られた。溶解性ネズミＣＤ４０−Ｌは同様な（より良くはないとしても） 阻害効果を生じた。ベクターのみによってトランスフェクトしたＣＯＳ−７細胞 からの対照上澄み液はリンパ腫成長を促進した。したがって、Ｂリンパ腫に対す るＣＤ４０−Ｌの阻害効果はＣＤ４０に対する抗体の阻害効果に近似する(paral lel)。 実施例４ この実施例は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＢ細胞リンパ腫の成長に対する抗 ＣＤ４０の効果を説明する。Ｃ．Ｂ−１７ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ（ＳＣＩＤ）マウ スはＡｎｉｍａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＮＣＩ−ＦＣＲ ＤＣ，米国，メリーランド州，フレデリック）から入手し、生後６〜８週間にな るまで用いなかった。マウスは特定の病原菌の無い条件下に常に維持し；マイク ロアイソレータケージ(microisolator cage)に収容し、食餌、水及び敷きわらの 全てを使用前にオートクレーブ処理した。トリメトプリム／スルファメトキサゾ ール（３２０ｍｌにつきトリメトプリム４０ｍｇとスルファメトキサゾール２０ ０ｍｇ）をマウスに与える飲料水中に懸濁液として含めた。全てのマウスに細胞 転移(cell transfer)の１日前に、アシアロＧＭＩ（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａ ｌ，米国，テキサス州，ダラス）（ネズミＮＫ細胞上に存在するマーカー）（Ｍ ｕｒｐｈｙ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：１４２１，１９９２）に対 する抗血清を静脈内投与して、腫瘍に対する宿主抵抗性を除去した。 ０日目に、ＳＣＩＤマウスに５ｘ１０⁶ＲＬ若しくはＴＵ２Ｃ細胞を静脈内又 は腹腔内注入した。次に、腫瘍細胞レシピエントにＨＢＳＳ（ハンクス平衡塩類 溶液）０．２ｍｌ中の抗ＣＤ４０又はｍｓＩｇＧの２μｇを０、３又は１４日目 から出発して１０日間にわたって、１日置きに静脈内投与した（全体で５回注入 ）。マウスを腫瘍発生と進行とに関して監視し、死にかけたマウスを安楽死させ た。全てのマウスを腫瘍徴候に関して剖検した。肝臓、腎臓及びリンパ系器官を 腫瘍細胞の存在に関して組織学的に分析した。パラメトリック分析（スチューデ ントｔ検定）と非パラメトリック分析（Ｗｉｌｃｏｘａｎランク サム検定(ran k sum test)）の両方を実施して、群が有意に異なる（ｐ＜０．０５）か否かを 判定した。全ての実験は３〜１０マウス／群を含み、２〜３回実施した。結果は 以下の表に示す。 抗ＣＤ４０は、治療を０、３又は１４日目に開始した場合に、ＲＬ又はＴＵ２ Ｃ腫瘍を受容したマウスの生残を有意に（ｐ＜０．０５）改善した。ＳＣＩＤマ ウスを０日目に抗ＣＤ４０で治療した場合に、ＲＬ Ｂ細胞リンパ腫ラインを受 容したマウスに、数か月後に腫瘍の徴候は存在しなかった。しかし、ＥＢＶリン パ腫ＴＵ２Ｃと抗ＣＤ４０とを受容したマウスの一部は、抗ＣＤ４０治療の停止 の数週間後に腫瘍を発現した。 異なる経路の腫瘍細胞投与に関して、異なるパターンの転移性成長が観察され た。ＥＢＶ誘導リンパ腫をｉｐ投与されたマウスはリンパ節と肝臓とに広範囲に 転移した腹膜腫瘍を発現したが、このリンパ腫をｉｖ投与されたマウスは主とし て腎臓転移を発現した。抗ＣＤ４０は、腫瘍投与経路に関係なく、腫瘍成長を有 意に阻害し、レシピエントマウスの生残を促進することができた。 抗ＣＤ４０による腫瘍含有マウスの治療は、腫瘍細胞の転移の３日又は４日後 に、また、１４日後程度に遅く、治療を開始した場合にも、生残の有意な改良を 生じた。これらの結果は、抗ＣＤ４０治療が、レシピエントマウスにおけるかな り大きな、広範囲な腫瘍負荷(tumor burden)（＞１ｃｍ³）から治療を開始した 場合にも、効果的であることを実証する。 実施例５ この実施例はＥＢＶ血清陽性個体からのＰＢＬを注入したＳＣＩＤマウスにお ける腫瘍成長に対する抗ＣＤ４０の効果を説明する。ＳＣＩＤマウス（上記実施 例４に記載）に組換え体ヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，米 国，カリフォルニア州，サウスサンフランシスコ）を注入した、この成長ホルモ ンはｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスにおけるＥＢＶリンパ球新生を促進することが 実証されており（Ｍｕｒｐｈｙ等，Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ．Ｉｍｍｕｎ．６： ３５５，１９９２）、これは恐らく、処置済みマウスにおけるヒトＴ細胞移植(e ngraftment)の促進によると思われる（Ｍｕｒｐｈｙ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４４８１，１９９２）。Ｔ細胞移植はｈｕＰ ＢＬ−ＳＣＩＤモデル（１８）におけるヒトＢ細胞リンパ腫形成にとって必須で あると思われる。ｒｈＧＨ（ＨＢＳＳ ０．２ｍｌ中１０μｇ）を０日目と１日 置きに、４〜８週間後の分析時までｉｐ投与した。ヒトＰＢＬは健康なドナーか らロイコパック中に(in leucopacks)採取した。抗アシアロＧＭ−１を実施例４ に記載するように投与した。 ヒトＰＢＬは健康な、ＥＢＶ血清陽性ドナーからロイコパック中に採取した。 全てのドナーはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）に対する抗体と、Ｂ型 肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）とに関して選別し、採取(donation)前にインフォー ムドコンセントを得た。ＰＢＬを向流洗浄(counter-current elutriation)によ って精製し、フローサイトメトリーによって評価して、＞９０％リンパ球を含む リンパ球画分を得た。ＰＢＬ（１ｘ１０⁸）をレシピエントＳＣＩＤマウスに０ 日目にｉｐ投与した。 マウスを抗ＣＤ４０、抗ＣＤ２０又はｍｓＩｇＧ（２μｇ／０．２ｍｌ ＰＢ Ｓ）によって１日置きに２０日間、全体で１０回ｉ.ｐ.注入で処置した。表２は ５〜８マウス／群による３回の実験を代表する結果を示す。 これらの結果は、ｈｕＰＢＬ転移の時点での抗ＣＤ４０によるｈｕＰＢＬ−Ｓ ＣＩＤキメラマウスの治療がこれらのマウスにおけるヒトＢ細胞リンパ腫の発現 を完全に予防することを実証した。抗ＣＤ２０はインビトロにおいてリンパ腫に 影響を与えなかったが、抗ＣＤ２０によるｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤキメラの治療も リンパ腫の発生を予防した。 実施例６ この実施例は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＴ（ＨＬＡ⁺，ＣＤ３⁺）細胞とＢ （ＨＬＡ⁺，ＣＤ３^-）細胞の移植に対する抗ＣＤ４０の効果を説明する。ｈｕＰ ＢＬ−ＳＣＩＤマウスキメラは上記実施例５におけるように作製した。腹腔内に 検出されるヒトＴ細胞とＢ細胞との％を算出し、血清中のヒト免疫グロブリンを 酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって定量した。動物をリ ンパ腫の存在に関しても検査した；リンパ腫を明示した動物はひん死であり、腹 腔内に広範囲な腫瘍小塊の徴候を示した。ｈｕＰＢＬ転移後の４〜８週間にマウ スを分析した；対照（ｍｓＩｇ）治療マウスは全て３３．２±１．２日目にＥＢ Ｖ誘導Ｂ細胞リンパ腫のために死亡した。 腹腔内細胞の単細胞懸濁液を得て、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によっ て評価した。２％ヒトＡＢ血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ，米国，ニューヨーク州， グランドアイランド）の存在下で染色を実施し、ヒト及びマウスＦｃ受容体を飽 和させた。ＦＡＣＳ分析に用いた試薬はフルオレセインイソチオシアネート（Ｆ ＩＴＣ：Ｏｌｙｍｐｕｓ，米国，ニューヨーク州，レークサクセス）にコンジュ ゲートしたモノクローナル抗ヒト−ＨＬＡ−ＡＢＣと、ロイ４−ビオチニル化抗 ＣＤ３（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，米国，カリフォルニア州，マウン テンビュー）であった。一次(primary)抗体インキュベーション後に、ＥＰＩＣ Ｓフローサイトメータ(flow cytometer)を用いて、細胞を分析した。 ヒト免疫グロブリンレベルをＥＬＩＳＡによって分析した。平底９６孔マイク ロタイタープレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗｏｒｋｓ，米国，ニュー ヨーク州，コーニング）をＰＢＳ中１μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇ（Ｋｉｒｋｅ ｇａａｒｅｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，米国，メリーラン ド州，ガイザースブルグ）で被覆し、５％ヤギ血清で、２回洗浄し、ブロックし た(blocked)。次に、孔をｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスキメラから、又はヒトＩ ｇＭ＋ＩｇＧ標準（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．，米国，カリフォルニア州，サンタバ ーバラ）の滴定から得られた血清と共にインキュベートした。４回洗浄した後に 、アルカリホスファターゼーコンジュゲーテッド(conjugated)ヤギ抗ヒトＩｇ（ Ｋｉｒｋｅｇａａｒｅｄ ａｎｄ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，米国， メリーランド州，ガイザースブルグ）を加えた。プレートをインキュベートし、 再び洗浄した。最終洗浄後に、基質を加え、酵素反応を発生させた。ＯＤを４０ ２ｎｍにおいて測定した。結果を表３に示す。 抗ＣＤ４０による治療は、腹膜細胞のＦＡＣＳ分析とヒト免疫グロブリンの血 清レベルの測定とによって判定されるように、ヒトＴ細胞及びＢ細胞の移植を妨 げなかった。実験Ａでは、血清中のヒトＩｇレベルに基づくと、ヒト細胞の移植 度はｍｓＩｇＧ受容動物におけるよりも抗ＣＤ４０治療動物において定量的に少 ないように思われた。しかし、抗ＣＤ４０を受容しなかったｈｕＰＢＬ−ＳＣＩ ＤキメラマウスはＢ細胞リンパ腫を発現したので、検出された高レベルのヒト免 疫グロブリンはＢ細胞リンパ腫によるものと思われる。抗ＣＤ４０とは対照的に 、抗ＣＤ２０による治療は、血清中のＢ細胞の低い％とヒトＩｇレベルの低下と の両方で実証されるように、Ｂ細胞の移植を阻害するように思われた。 実施例７ この実施例はＳＣＩＤマウスにおけるＢ細胞の移植に対する抗ＣＤ４０とｍｓ ＩｇＧとの効果を説明する。ｈｕＰＢＬ−ＳＣＩＤマウスキメラは、ＰＢＬをＥ ＢＶ陰性ドナーから得たこと以外は、上記実施例５に記載したように作製した。 したがって、これらのキメラがリンパ腫を発現することは予想されず、それ故、 正常Ｂ細胞の移植をより正確に表示した。これらのキメラを抗ＣＤ４０又は抗Ｃ Ｄ２０によって治療し、腹腔内に検出されるヒトＴ細胞及びＢ細胞の％を測定し 、血清中のヒト免疫グロブリン量を実施例６に記載するように定量した。結果は 表５に示す。 抗ＣＤ４０による治療はヒトＢ細胞の移植を促進し、抗ＣＤ４０が正常Ｂ細胞 をスペアしながら(sparing)、リンパ腫細胞を除去するその能力によって、リン パ腫の治療又は予防に付加的な価値を有することを実証した。 実施例８ この実施例は、インビトロにおけるＣＤ４０に対する抗体の、ヒト骨髄腫細胞 の成長に及ぼす効果を説明する。ＣＤ４０リガンドに対する抗体（Ｍ２）を実質 的に実施例２に上述したように、ＣＤ４０を発現するＭ１６ヒト骨髄腫細胞を用 いて、増殖分析において試験した。 得られた結果は図５に示す；数値は対照上澄み液に比べた阻害率として表す。 抗ＣＤ４０モノクローナル抗体Ｍ２と共にのインキュベーションは、試験したＭ １６ヒト骨髄腫細胞ラインの増殖を有意に阻害し、０．１ｎｇ／ｍｌ程度の少量 がほぼ５０％の阻害を生じた。抗ＣＤ４０の濃度の上昇によって、阻害の増大が 観察された。 実施例９ この実施例は、ＳＣＩＤマウスにおけるヒトＢ細胞リンパ腫の成長に対する組 換え体ヒトＣＤ４０リガンドの効果を説明する。ＳＣＩＤマウスは実質的に上記 実施例４に記載するように得て、処置した。０日目に、ＳＣＩＤマウスに５ｘ１ ０⁶ＲＬ細胞又はＴＵ２Ｃ細胞を腹腔内投与した。次に、腫瘍細胞レシピエント にヒトＣＤ４０リガンドをコードするベクターによってトランスフェクトした細 胞からの濃縮上澄み液１００μｌ又はベクター単独（対照）を投与した。２種類 の濃度のＣＤ４０リガンド含有上澄み液を試験した：すなわち、１０倍濃縮物と ２倍濃縮物（それぞれ、１０ｘと２ｘ）。濃縮上澄み液を３日目から出発して、 １５日間、３日毎に腹腔内投与した（全体で５回注入）。マウスを腫瘍発現と進 行に関して監視し；ひん死のマウスを安楽死させた。全てのマウスを腫瘍の徴候 に関して剖検した。肝臓、腎臓及びリンパ系器官を腫瘍細胞の存在に関して分析 した。パラメトリック分析（スチューデントｔ検定）又は非パラメトリック分析 （Ｗｉｌｃｏｘａｎランク サム検定）の両方を実施して、群が有意に異なる（ ｐ＜０．０５）か否かを判定した。全ての実験は７〜１０マウス／群を含み、３ 回実施された。 ＲＬ細胞を用いる例示的実験の結果を図６に示す。実施例３においてインビト ロで得られた結果と同様に、組換え体ＣＤ４０リガンドはＳＣＩＤマウスにおい てインビトロで腫瘍細胞の成長を阻害した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 19/00 9356−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 19/00 // Ｃ１２Ｎ 15/02 9637−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ (72)発明者 ファンズロウ，ウィリアム・シー，ザ・サ ード アメリカ合衆国ワシントン州98023，フェ デラル・ウェイ，サウス・ウエスト・スリ ーハンドレッドアンドトゥエンティーセブ ンス・プレース 218 (72)発明者 ロンゴ，ダン・エル アメリカ合衆国メリーランド州20895，ケ ンジントン，バロル・レーン 9610 (72)発明者 マーフィー，ウィリアム・ジェイ アメリカ合衆国メリーランド州21701，フ レデリック，スクーナー・コート 7996

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＣＤ４０を発現する腫瘍細胞を特徴とする疾患に罹患した哺乳動物の治 療方法であって、薬剤学的に受容される緩衝剤中のＣＤ４０結合タンパク質の治 療有効量を投与することを含み、該治療有効量が約０．０１〜約１ｍｇ／ｋｇ体 重である前記方法。 ２．ＣＤ４０結合タンパク質が、ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体、Ｃ Ｄ４０リガンド、及びこれらの組合せから成る群から選択される請求項１記載の 方法。 ３．ＣＤ４０結合タンパク質がモノクローナル抗体、ｈＣＤ４０ｍ２（ＡＴ ＣＣ ＨＢ１１４５９）である請求項２記載の方法。 ４．ＣＤ４０結合タンパク質がモノクローナル抗体、ｈＣＤ４０ｍ３である 請求項２記載の方法。 ５．ＣＤ４０結合タンパク質が溶解性オリゴマーＣＤ４０リガンドである請 求項２記載の方法。 ６．溶解性オリゴマーＣＤ４０リガンドがＦｃ融合タンパク質である請求項 ５記載の方法。 ７．溶解性オリゴマーＣＤ４０リガンドがロイシンジッパー融合タンパク質 である請求項５記載の方法。 ８．ＣＤ４０発現細胞が、Ｂリンパ腫細胞、骨髄腫細胞及び癌腫細胞から成 る群から選択される請求項１記載の方法。 ９．ＣＤ４０発現細胞が、Ｂリンパ腫細胞、骨髄腫細胞及び癌腫細胞から成 る群から選択される請求項２記載の方法。 １０．ＣＤ４０発現細胞が、Ｂリンパ腫細胞、骨髄腫細胞及び癌腫細胞から 成る群から選択される請求項３記載の方法。 １１．ＣＤ４０発現細胞が、Ｂリンパ腫細胞、骨髄腫細胞及び癌腫細胞から 成る群から選択される請求項４記載の方法。 １２．ＣＤ４０発現細胞が、Ｂリンパ腫細胞、骨髄腫細胞及び癌腫細胞から 成る群から選択される請求項５記載の方法。 １３．ＣＤ４０発現細胞が、Ｂリンパ腫細胞、骨髄腫細胞及び癌腫細胞から 成る群から選択される請求項６記載の方法。 １４．ＣＤ４０発現細胞が、Ｂリンパ腫細胞、骨髄腫細胞及び癌腫細胞から 成る群から選択される請求項７記載の方法。 １５．ＣＤ４０を発現する腫瘍細胞を特徴とする疾患に罹患しやすい哺乳動 物におけるこの疾患を予防する方法であって、薬剤学的に受容される緩衝剤中の ＣＤ４０結合タンパク質の治療有効量を投与することを含み、治療有効量が約０ ．０１〜約１ｍｇ／ｋｇ体重である前記方法。 １６．ＣＤ４０結合タンパク質が、ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体、 ＣＤ４０リガンド、及びこれらの組合せから成る群から選択される請求項１５記 載の方法。 １７．ＣＤ４０結合タンパク質がモノクローナル抗体、ｈＣＤ４０ｍ２（Ａ ＴＣＣ ＨＢ１１４５９）である請求項１６記載の方法。 １８．ＣＤ４０結合タンパク質がモノクローナル抗体、ｈＣＤ４０ｍ３であ る請求項１６記載の方法。 １９．ＣＤ４０結合タンパク質が溶解性オリゴマーＣＤ４０リガンドである 請求項１６記載の方法。 ２０．溶解性オリゴマーＣＤ４０リガンドがＦｃ融合タンパク質である請求 項１９記載の方法。 ２１．溶解性オリゴマーＣＤ４０リガンドがロイシンジッパー融合タンパク 質である請求項１９記載の方法。 ２２．ＣＤ４０を発現する腫瘍細胞を特徴とする疾患に罹患した哺乳動物に 投与するための薬剤の製造へのＣＤ４０結合タンパク質の使用。 ２３．ＣＤ４０結合タンパク質が、ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体、 ＣＤ４０リガンド、及びこれらの組合せから成る群から選択される請求項２２記 載の使用。 ２４．ＣＤ４０結合タンパク質がモノクローナル抗体、ｈＣＤ４０ｍ２（Ａ ＴＣＣ ＨＢ１１４５９）である請求項２３記載の使用。 ２５．ＣＤ４０結合タンパク質がモノクローナル抗体、ｈＣＤ４０ｍ３であ る請求項２３記載の使用。 ２６．ＣＤ４０結合タンパク質が溶解性オリゴマーＣＤ４０リガンドである 請求項２３記載の使用。 ２７．ＣＤ４０を発現する腫瘍細胞を特徴とする疾患に罹患した哺乳動物に 投与するための薬剤の製造方法であって、適当な賦形剤又はキャリヤー中にＣＤ ４０結合タンパク質を配合することを含む前記方法。 ２８．ＣＤ４０結合タンパク質が、ＣＤ４０に対するモノクローナル抗体、 ＣＤ４０リガンド、及びこれらの組合せから成る群から選択される請求項２７記 載の方法。 ２９．ＣＤ４０結合タンパク質がモノクローナル抗体、ｈＣＤ４０ｍ２（Ａ ＴＣＣ ＨＢ１１４５９）である請求項２８記載の方法。 ３０．ＣＤ４０結合タンパク質がモノクローナル抗体、ｈＣＤ４０ｍ３であ る請求項２８記載の方法。 ３１．ＣＤ４０結合タンパク質が溶解性オリゴマーＣＤ４０リガンドである 請求項２８記載の方法。