JP6820565B2 - 病原性細菌の定着を阻害するペプチド及びそれを含む定着阻害剤 - Google Patents
病原性細菌の定着を阻害するペプチド及びそれを含む定着阻害剤 Download PDFInfo
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Description
本発明は、新規のペプチドに関し、特に、病原性細菌が消化器内に定着することを阻害するペプチド及びそれを含む定着阻害剤に関する。
近年、消化器の疾病の原因となる病原性細菌が数多く明らかとなっている。例えば、腸管毒性を有する病原性細菌の一種である腸管毒素原性大腸菌（Enterotoxigenic Escherichia coli :ETEC）は、水や食物を介してヒトの消化管に侵入し、コレラ様の下痢を引き起こすことが知られている。ＥＴＥＣによる感染症は、発展途上国で生活する人々やその地域を訪れる旅行者の間で深刻な問題となっており、世界中で年間約２億人が感染し、主に５歳以下の乳幼児を中心として約３８万人が死亡すると推定されている（非特許文献１）。日本の大阪空港内検疫所で実施された統計調査から、下痢を発症した日本人旅行者の約８％がＥＴＥＣに感染していることが報告されている（非特許文献２）。
ＥＴＥＣの病原性発現の第一段階として、小腸上皮細胞へ付着した上で、そこに定着する必要があり、定着因子（Colonization Factors : CFs）がその役割を担う。これまでに定着因子抗原１（CFA/I）、大腸菌表面抗原１（CS1）、推定定着抗原０７１（PCF071）など少なくとも２５種類のＣＦｓが報告されている（非特許文献３）。これらの病原因子の働きにより、ＥＴＥＣが宿主の小腸上皮細胞上に付着すると、バイオフィルムやマイクロコロニーなどを形成してそこに定着する。その後、第二段階としてＥＴＥＣは、易熱性腸管毒素（LT）又は耐熱性腸管毒素（ST）を産生し、病原性を発現する。
ＥＴＥＣが保有するＣＦｓは、それらのほぼ全てが線毛性の定着因子であり、構成成分のアミノ酸配列や免疫原性などの特徴から幾つかのグループに分類される（非特許文献３）。例えば、ＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ１、ＣＳ２、ＣＳ４、ＣＳ５、ＣＳ７、ＣＳ１４、ＣＳ１７、ＣＳ１９及びＰＣＦ０７１などは、クラス５型に属する線毛を形成するが、ＣＳ１２、ＣＳ１８、ＣＳ２０、ＣＳ２６、ＣＳ２７、及びＣＳ２８などはクラス１ｂ型の線毛を形成する。これらに加えて、ＣＳ１３、ＣＳ１５、ＣＳ２２、及びＣＳ２３、または、ＣＳ３及びＣＳ６に関しては、それぞれ同様にグループ分けされる。これらのＣＦｓの構造、性質については未だ不明な点が多いが、類似の構成成分を有しており、主に大腸菌のペリプラズム内に存在するChaperonタンパク質、線毛の主要構成サブユニット（メジャーピリン）、線毛に少数含まれるサブユニット（マイナーピリン）及び外膜Usherタンパク質から構成され、Chaperon-Usher経路により線毛が形成される（非特許文献３）。一方で、ＣＦＡ／ＩＩＩ（ＣＳ８）やLongus（ＣＳ２１）は、ＩＶ型に分類される線毛を形成し、Chaperon-Usher経路とは異なる線毛構造、及び線毛形成機構を有している。その他のＣＦｓとして、ＣＳ１０、ＣＳ１１が報告されているが、それらの線毛構造に関しては、未だ不明な部分が多い。
ＥＴＥＣが発現する非線毛性定着因子としては、ＥＴＥＣＨ１０４０７株から同定された外膜タンパク質Ｔｉａが知られており、当該タンパク質は宿主細胞表面上のプロテオグリカンに結合する（非特許文献４）。この他に、ＥＴＥＣが発現する非線毛性定着因子としては、同じくＥＴＥＣＨ１０４０７株から同定されたＥｔｐＡが知られている。ＥｔｐＡは、ｆｌａｇｅｌｌｉｎタンパク質の高度に保存された領域に結合し、菌体と宿主細胞表面を橋渡しする可能性が示唆されている（非特許文献５）。
一般的にＥＴＥＣの菌株はそれぞれ１〜３種類のＣＦｓを保有しており、また様々な分泌性の定着因子も保有している（非特許文献６）。従って、その組み合わせの複雑さに加えて、各ＣＦｓの周囲の環境に応じた空間的かつ時間的な発現制御機構の多様性、更には表面抗原への菌株依存的な変異の導入などの理由から、ワクチン等の治療法開発が難しい。現状、ワクチン開発へ向けた候補抗原としては、ほぼすべてのＥＴＥＣが産生する毒素ＬＴが考えられているが、その毒性のため経口等投与量の限界があり、近年では活性部位のアミノ酸を置換した変異体が代替抗原として検討されている。ＳＴに関しても同様の利用が考えられているが、分子サイズ（約２０残基からなるペプチド）が小さく免疫応答を引き起こすことが難しいことが問題となっている（非特許文献７）。また、各定着因子を抗原としたワクチン開発も進められている。広範な免疫を引き起こす工夫が必要なため、現在最も有効なワクチンはＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ３、ＣＳ５、ＣＳ６、そして腸管毒素ＬＴを産生する菌株を用いた生もしくは不活化ＥＴＥＣワクチンである（非特許文献７及び８）。これらのワクチンは、主にChaperon-Usher経路により形成される線毛の各グループに適用可能であり、ＥＴＥＣの臨床株の８０％に効果を示すと考えられている。
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現在までに効果的なＥＴＥＣのワクチンは開発されていない。最も有望なワクチン候補としてはＣＦＡ／Ｉ、ＣＳ３、ＣＳ５、ＣＳ６、そして腸管毒素ＬＴを産生する菌株を用いた生もしくは不活化ＥＴＥＣワクチンの研究が進んでいる。しかしながら、該ワクチンに含まれない定着因子又は毒素を含むＥＴＥＣの菌株に対しては効果を示さない。特に、ＩＶ型線毛を形成し、上記不活化ワクチンに含まれるＣＦｓとは異なる線毛構造及び特徴を有するＣＦｓを産生する菌株には適していない。特に、longus（ＣＳ２１）は幅広い地域のＥＴＥＣから特定されており、ラテンアメリカや中東、そして北アフリカを含む地域で流行している（Isidean S. D. et al. Vaccine 2011, 29, 6167-6178.）。上記不活化ワクチンでは、この様な定着因子を保有する菌株の感染を阻止することは難しい。また、菌株の不活化により分泌性の病原因子への免疫が引き起こされないことも懸念されており、長期免疫の誘導が難しいといった問題もある。これらの問題を解決するために、広範なＥＴＥＣの表面に発現する保存性が高いタンパク質を特定し、該タンパク質を抗原としてワクチンを生成することも考えられているが、未だそのようなタンパク質は発見されていない。
従って、上記タンパク質の探索及び同定をするよりも、ＥＴＥＣの各定着因子の構造および定着機構の詳細を分子レベルで明らかにし、保存されたエピトープを同定することで、複数抗原による免疫を行うことが現実的であり、より有効であると考えられる。また、定着機構が明らかになれば定着阻害剤の開発も可能である。
本発明は、前記の問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、定着因子を保有する細菌が消化器内に定着することを防止できるようにすることにある。
本発明者らは、鋭意検討を行った結果、細菌のうち、特にＩＶｂ型線毛を産生する病原性細菌が消化器内に定着するメカニズムを見出し、そのメカニズムに基づいて、該細菌の定着を阻害する新規のペプチドを作製することに成功した。
具体的に、本発明に係るペプチドは、ＩＶｂ型線毛のマイナーピリンに結合可能なアミノ酸配列を有する第１ドメインと、該第１ドメインにリンカー配列を介して接続され、多量体化が可能なアミノ酸配列を有する第２ドメインとを含むことを特徴とする。
ＩＶｂ型線毛を産生する細菌は、当該線毛のみでは消化器等の標的細胞の受容体と結合することができないものの、細菌自体が生成する分泌タンパク質が、ＩＶｂ型線毛の主要構成サブユニット（メジャーピリン）の先端に位置するマイナーピリンの分泌タンパク質結合サイトに結合することにより、標的細胞に付着及び定着できるようになる。これに対して、本発明に係るペプチドは、ＩＶｂ型線毛の上記マイナーピリンにおける分泌タンパク質結合サイトに結合可能なアミノ酸配列を有する第１ドメインを備えているため、ＩＶｂ型線毛に結合することができる。従って、本発明に係るペプチドは、ＩＶｂ型線毛に結合することにより、上記細菌の分泌タンパク質とＩＶｂ型線毛との結合を阻害し、その結果、細菌が消化器等の標的細胞に付着及び定着することを阻害することができる。また通常、ＩＶｂ型線毛はホモ三量体を形成しており、これに対して本発明に係るペプチドは多量体化が可能な第２ドメインを備えているため、ホモ三量体の全ての上記結合サイトに同時に結合することが可能である。従って、上記細菌の分泌タンパク質とＩＶｂ型線毛との結合を効率良く阻害でき、その結果、細菌が消化器等の標的細胞に付着及び定着することを効率良く阻害することができる。この抗付着メカニズムは、宿主細胞上受容体に結合するのではなく病原菌に選択的に結合し、その後宿主外への排出を誘引するため宿主への影響が極めて少ない。また、抗生物質などとは異なり、病原細菌を死滅させることがないため選択圧が少なく薬剤耐性菌の出現を抑えることも可能である。この様な抗付着メカニズムに着目した阻害剤は、尿路病原性大腸菌（Uropathogenic Escherichia coli:UPEC）が保有するＩ型線毛やＰ型線毛に対するものが研究されている（Sharon, N. Biochim. Biophys. Acta 2006, 1760, 527-537.）。いずれも先端に糖鎖を認識するレクチンドメインを有する線毛であり、それらの糖鎖結合領域に特異的に結合する糖誘導体などの開発が進んでいる。ＥＴＥＣに関しては、ナノ粒子上に糖鎖を結合させた抗付着剤が検討されている（Ravel, Y. S. et al. Nanoscale 2015, 7, 8326-8331.）。しかしながら、その線毛を介する付着メカニズムが明らかになっていないため、これまでにＩＶｂ型線毛の付着を効率よく阻害する阻害剤は開発されていない。
本発明に係るペプチドにおいて、第１ドメインは、配列番号１〜４のいずれかの配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有することが好ましい。
配列番号１〜４は、それぞれＩＶｂ型線毛を産生する細菌が発現するＣｏｆＪ、ＬｎｇＪ、ＣｆｃＪ及びＴｃｐＦといった分泌タンパク質にそれぞれ対応するマイナーピリン（ＣｏｆＢ、ＬｎｇＢ、ＣｆｃＢ及びＴｃｐＢ）の結合サイトとの結合に関与する配列である。従って、これらと高い相同性を有する第１ドメインを含むことで上記分泌タンパク質のＩＶｂ型線毛への結合を阻害することができる。さらに、第１ドメインは、配列番号１〜４のいずれかの配列からなることが特に好ましい。
また、本発明に係るペプチドにおいて、第１ドメインは、配列番号５の配列を有することが好ましい。
配列番号５は、上記ＣｏｆＪのアミノ酸配列のうち、上記マイナーピリン（ＣｏｆＢ）の結合サイトとの結合に強く関与する配列である。従って、第１ドメインが配列番号５の配列を有することで本発明に係るペプチドは、ＣｏｆＪとマイナーピリン（ＣｏｆＢ）との結合を効率良く阻害することができる。また、第１ドメインを配列番号５の配列のみで構成することにより、第１ドメインをより短くできて、構造の単純化が可能となる。
また、本発明に係るペプチドにおいて、第１ドメインは、配列番号２３の配列を有することが好ましい。
配列番号２３は、上記配列番号５のＮ末端側にセリンが付加され、Ｃ末端側にリジンが付加された配列であり、第１ドメインが配列番号２３の配列を有することで、本発明に係るペプチドは、上記配列番号５の場合と同様に、ＣｏｆＪとマイナーピリン（ＣｏｆＢ）との結合を効率良く阻害することができる。また、第１ドメインを配列番号２３の配列のみで構成することにより、第１ドメインをより短くできて、構造の単純化が可能となる。
本発明に係るペプチドにおいて、第２ドメインは、三量体化が可能なアミノ酸配列を含むことが好ましい。
ＩＶｂ型線毛は、上述の通りホモ三量体を形成しているため、第２ドメインが、三量体化が可能なアミノ酸配列を含むことにより、ホモ三量体における全てのマイナーピリンにおける結合サイトに本発明のペプチドが結合できるようになる。これにより、細菌の分泌タンパク質とＩＶｂ型線毛との結合を効率良く阻害できる。
本発明に係るペプチドにおいて、第２ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列、又は配列番号７若しくは配列番号８のアミノ酸配列を４回〜１０回繰り返すアミノ酸配列を有することが好ましい。
配列番号６は、ＧＣＮ４三量体コイルドコイルを形成する配列であり、配列番号７若しくは配列番号８の配列を４回〜１０回繰り返すアミノ酸配列は、コラーゲン様三重らせん構造を形成する配列であり、すなわち、ペプチドの三量体化を促す配列である。従って、このようなアミノ酸配列を有する第２ドメインを備えることにより、本発明のペプチドは三量体を形成することが可能となる。従って、これらの配列を採用することにより、上述のとおり、細菌の分泌タンパク質とＩＶｂ型線毛との結合を効率良く阻害できるペプチドを得ることができる。
また、本発明に係るペプチドにおいて、リンカー配列は、配列番号９であってもよい。
本発明に係る定着阻害剤は、上記本発明に係るペプチドを含むことを特徴とする病原性細菌が消化器に定着することを阻害するものである。
本発明に係る定着阻害剤によると、上記本発明に係るペプチドを含むため、ＩＶｂ型線毛と消化器の標的細胞との結合を阻害できる。その結果、ＩＶｂ型線毛を産生する細菌が消化器に付着及び定着することを阻害することができる。
本発明に係るペプチド及びそれを含む定着阻害剤によると、ＩＶｂ型線毛を産生する細菌が消化器に付着及び定着することを阻害することができる。
以下、本発明を実施するための形態を説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
本発明の実施形態に係るペプチドは、病原性細菌の線毛、特にＩＶｂ型線毛に結合することによって、病原性細菌が該線毛を介して標的細胞の受容体に結合することを防止できるペプチドである。本実施形態に係るペプチドは、ＩＶｂ型線毛と結合する第１ドメインと、多量体化が可能な第２ドメインと、それらを接続するリンカー配列とを含む。
本実施形態において、病原性細菌とは、特にＩＶｂ型線毛を有する病原性細菌であり、例えば腸管毒素原性大腸菌（Enterotoxigenic Escherichia coli :ETEC）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、シトロバクター・ローデンチウム（Citrobacterrodentium）等である。
まず、上記ＥＴＥＣ等のＩＶｂ型線毛を有する病原性細菌が消化器等を構成する細胞に付着及び定着するメカニズム、及び本実施形態に係るペプチドがその付着及び定着を阻害するメカニズムの概略を説明する。
上記ＥＴＥＣ等は、図１（ａ）に示すように、その表面に主要構成サブユニットであるメジャーピリンと、僅かに含まれ、メジャーピリンの先端に位置するマイナーピリンとから構成される線毛を形成している。特に、それらは多量体、例えばホモ三量体を形成している。ＥＴＥＣ等は、このような構成の線毛のみでは、消化器等の標的細胞に付着することができず、付着のためには、ＥＴＥＣ等が発現する分泌タンパク質が必要である。前記マイナーピリンには、分泌タンパク質の結合サイトが存在し、該分泌タンパク質がマイナーピリンに結合することで、図１（ｂ）に示すように、該分泌タンパク質を介して線毛が標的細胞の受容体に結合することができる。これにより、ＥＴＥＣが標的細胞に付着し、その後マイクロコロニーなどを形成して定着できるようになる。
本実施形態に係るペプチドは、上述の通り、ＩＶｂ型線毛と結合する第１ドメインを有しており、図２に示すようにペプチドの第１ドメインが線毛のマイナーピリンにおける分泌タンパク質結合サイトに結合するため、分泌タンパク質が該結合サイトに結合することを阻害することができる。特に、本実施形態に係るペプチドは、多量体化、特に三量体化を促す第２ドメインを有するため、三量体を形成することにより、図２（ｂ）に示すように三量体の線毛の全ての結合サイトと結合することができる。これにより、効率良く分泌タンパク質と線毛との結合を阻害でき、その結果、ＥＴＥＣ等の病原性細菌が標的細胞に付着及び定着することを効率良く阻害することができる。
以下に、これらのメカニズムについてより詳細に説明する。
（ＩＶｂ型線毛の形成メカニズム）
ＥＴＥＣ等のＩＶｂ型線毛を産生する細菌は、定着因子を発現し、該定着因子が線毛の形成を担う。菌体上にＩＶｂ型線毛を形成する定着因子としては、ＣＦＡ／ＩＩＩ（CS8）が知られ、これと遺伝子構造や構成タンパク質が極めてよく似ている他の定着因子としてＬｏｎｇｕｓ（CS21）が知られている。なお、ＩＶ型線毛は、その主要構成サブユニットであるメジャーピリンのＮ末端配列と全体の大きさからＩＶａ型もしくはＩＶｂ型に大別されるが、ＣＦＡ／ＩＩＩ（CS8）やＬｏｎｇｕｓ（CS21）は、ＩＶｂ型に属する。
ＥＴＥＣ等のＩＶｂ型線毛を産生する細菌は、定着因子を発現し、該定着因子が線毛の形成を担う。菌体上にＩＶｂ型線毛を形成する定着因子としては、ＣＦＡ／ＩＩＩ（CS8）が知られ、これと遺伝子構造や構成タンパク質が極めてよく似ている他の定着因子としてＬｏｎｇｕｓ（CS21）が知られている。なお、ＩＶ型線毛は、その主要構成サブユニットであるメジャーピリンのＮ末端配列と全体の大きさからＩＶａ型もしくはＩＶｂ型に大別されるが、ＣＦＡ／ＩＩＩ（CS8）やＬｏｎｇｕｓ（CS21）は、ＩＶｂ型に属する。
これまでに機能解析研究から、ＣＦＡ／ＩＩＩを構成する遺伝子群であるｃｏｆオペロンは、メジャーピリンをコードする遺伝子ｃｏｆＡ、マイナーピリンをコードする遺伝子ｃｏｆＢなどの遺伝子を含む１４種類の遺伝子群から構成されることを明らかにしている（Taniguchi, T. et al. Infect. Immun. 2001, 69, 5864-5873.）。さらに、本発明者らにより、ＣｏｆＡの立体構造を決定し、ＣＦＡ／ＩＩＩにより形成された線毛の構造が明らかとなっている（Fukakusa, S. et al. Acta Cryst. 2012, D68, 1418-1429.）（図３）。また、図３に示すように、Ｘ線結晶構造解析法を用いた立体構造決定と超遠心分析による溶液中での会合状態の解析からＣＦＡ／ＩＩＩにより形成される線毛を構成するマイナーピリンＣｏｆＢはＮ末端側のピリン様ドメインと中央部分及びＣ末端側のβシートに富んだ２つのドメインが螺旋状に絡み合った強固なホモ三量体構造を形成することが明らかとなっている。加えて、図４（ａ）及び（ｂ）に示すように、当該三量体構造は、主にメジャーピリンＣｏｆＡから構成されるＩＶｂ型線毛の先端に位置し、線毛形成開始を促す役割を有することについても明らかとなっている（Kawahara, K. et al. J. Mol. Biol. 2016, 428, 1209-1226.）。
このＩＶｂ型線毛の先端は、マイナーピリンＣｏｆＢのＣ末端側に存在するβシートに富んだドメインにより束ねられているが類似ドメイン検索の結果、このドメインは、図５（ａ）に示すように、Ｈ型レクチン様折り畳み構造をもつことが明らかとなった。Ｈ型レクチンドメインは、ＥＴＥＣが保有するＣＦＡ／ＩＩＩ線毛のほか、Dictyostelium discoideumのDiscoidin I（図５（ｂ））やDiscoidin II、リンゴマイマイと呼ばれるカタツムリから発見されたHelixpomatia agglutinin（HPA）、また近年ではSymbiodiniumsp.のSinularia lochmodes （SLL2）が知られており（Lescar, J. et al. Glycobiology 2007, 17, 1077-1083.; Kita, A. et al.Glycobiology 2015, 25, 1016-1023.）、いずれもホモ三量体を形成する。三量体の分子境界には、３か所の等価で保存された糖鎖結合部位がある。当該結合箇所において、Discoidin IやDiscoidin II、HPA、SLL2の場合、N-acetyl-D-galactosamine（GalNac）が結合することが確認されている。いずれも糖鎖と結合することで、細胞接着や自己凝集に関わる。また、レクチンドメインによる糖鎖の認識は、Ｉ型線毛においても確認されている。
（ＥＴＥＣの付着及び定着メカニズム）
ＥＴＥＣが標的細胞に付着及び定着するメカニズムの概略は、図１を参照した上記説明の通りであるが、以下に、ＥＴＥＣが標的細胞に付着及び定着するメカニズムについてより詳細に説明する。
ＥＴＥＣが標的細胞に付着及び定着するメカニズムの概略は、図１を参照した上記説明の通りであるが、以下に、ＥＴＥＣが標的細胞に付着及び定着するメカニズムについてより詳細に説明する。
上記ＣｏｆＢが上記レクチンドメインを有するため、標的細胞に対する付着能の発現は、当該ドメインにより起こると想定されるが、後の実施例で詳述する細胞アッセイの結果から、大腸菌のＣＦＡ／ＩＩＩ株は表面に産生するＩＶｂ型線毛のみでは、Ｃａｃｏ２細胞への付着能が発揮されず、同じくｃｏｆオペロンにコードされている分泌タンパク質ＣｏｆＪの発現が必須であることが明らかになった。これは、本発明者らが作製したＥＴＥＣのＣｏｆＪ欠損株が、線毛形成能を有するにも関わらず付着能を示さないことから明らかになった結果である。この結果から、ＣｏｆＪが線毛と腸管上皮細胞に介在することで腸管付着およびその後の定着に関与すると考えられる。
ＣｏｆＪは、超遠心分析等の結果から、図６（ａ）及び（ｂ）に示すように線毛構成サブユニットのうち線毛先端にのみ位置するサブユニットであるＣｏｆＢと相互作用することが明らかになり、さらに、ＣｏｆＪは、Ｎ末端の二次構造をもたない領域（１〜２４）で、ＣｏｆＢ三量体に存在する等価な３か所の結合サイトのいずれか１か所に結合することが、Ｘ線結晶構造解析等の結果から示された。
現在、ＣｏｆＪには様々なサブタイプが報告されており、特にＣｏｆＪの球状ドメインの表面において変異が生じやすいため、ＣｏｆＪを用いたワクチン開発は難しい。また、線毛の主要構成サブユニットであるＣｏｆＡも同様に線毛の表面部分に変異が多く生じることも報告されている（Njoroge, S. M. et al. FEMS Pathogens and Diseases 2015, 73, 1-4.）。一方で、ＣｏｆＪとＣｏｆＢの相互作用部位のアミノ酸は高度に保存されていることも明らかになった。このことから、ＣｏｆＪとＣｏｆＢの相互作用を阻害することにより、ＥＴＥＣの定着を阻害できるということが示唆され、この考えに基づいて本願発明に係るペプチドが見出された。
（ペプチドの構成）
上述の通り、本実施形態に係るペプチドは、ＩＶｂ型線毛の特にマイナーピリンと結合する第１ドメインと、多量体化が可能な第２ドメインと、それらを接続するリンカー配列とを含む。
上述の通り、本実施形態に係るペプチドは、ＩＶｂ型線毛の特にマイナーピリンと結合する第１ドメインと、多量体化が可能な第２ドメインと、それらを接続するリンカー配列とを含む。
具体的に、第１ドメインは、線毛のマイナーピリンにおける分泌タンパク質の結合サイトに結合可能なアミノ酸配列を含む。例えばＣｏｆＢに結合可能なＣｏｆＪにおけるＮ末端の二次構造をもたない領域（１〜２４番目）のアミノ酸配列(SPSSSEGGAFTVNMPKTSTVDDIR：配列番号１)を含み、好ましくは配列番号１の配列と少なくとも７０％の相同性を有し、より好ましくは８０％以上の相同性を有し、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有し、特に９５％以上の相同性を有することが好ましい。
また、ＣｏｆＢと上記ＣｏｆＪにおけるＮ末端の二次構造をもたない領域（ＣｏｆＪ１−２４）とが結合した複合体の結晶構造において、ＣｏｆＢは、図７に示すように、ＣｏｆＪ１−２４ペプチドの５番目のセリンから１５番目のプロリンまでを特に認識しており、中でも１０番目のフェニルアラニンがＣｏｆＢの疎水性ポケットに深く突き刺さっている。従って、ＣｏｆＢとの結合について、第１ドメインは少なくともアミノ酸配列（SEGGAFTVNMP：配列番号５）を含むことにより達成できる。
また、第２ドメインは、三量体構造を示すＩＶ型線毛の先端における結合サイトの全てと結合できるように、多量体化、特に三量体化を促す配列を含む。例えば、三量体化を可能とするペプチドとしては、ＧＣＮ４ロイシンジッパーを三量体化が可能となるよう改変したもの（RMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLI：配列番号６）（Harburyet al. Nature 1994, 371, 80-83.）、(Pro-Pro-Gly)n（配列番号７）又は（Pro-Hyp-Gly)n（配列番号８）でｎ＝４〜１０の繰り返し配列からなるコラーゲン様モデルペプチド等を用いることができる。ここでHypは、４（R）-ヒドロキシプロリンである。
リンカー配列は、リンカーとして機能する配列であれば特に限定されないが、例えばTSGGG（配列番号９）等を用いることができる。
以上では、主に定着因子ＣＦＡ／IIIにより形成されるＩＶｂ型線毛について説明したが、他の定着因子としてＥＴＥＣが発現するＬｏｎｇｕｓ、コレラ菌が発現するＴｃｐ又はC.rodentiumが発現するＣｆｃ等により形成されるＩＶｂ型線毛は、上記ＣＦＡ／IIIによる線毛と類似性が高いことが知られている（Mundy, R. et al. Mol. Microbiol. 2003, 48, 795-809）。上記メジャーピリンであるＣｏｆＡに対応するものとして、それぞれＬｎｇＡ（Ｌｏｎｇｕｓ）、ＴｃｐＡ（Ｔｃｐ）、ＣｆｃＡ（Ｃｆｃ）が同定されており、それらのＮ末端側のピリン特有の疎水性領域の配列相同性は７０〜７５％と高い配列相同性を有する。図８に、ＣｏｆＡ等を発現するｃｏｆオペロンと共にＬｎｇＡ等を発現するｌｎｇオペロン、ＴｃｐＡ等を発現するｔｃｐオペロン、及びＣｆｃＡ等を発現するｃｆｃオペロンを示す。図８に示すように、ＣｏｆＡ、ＬｎｇＡ、ＴｃｐＡ及びＣｆｃＡのみならず、多くの相同遺伝子が存在している。
また、マイナーピリンであるＣｏｆＢに対応するＬｎｇＢ（Ｌｏｎｇｕｓ）、ＴｃｐＢ（Ｔｃｐ）、ＣｆｃＢ（Ｃｆｃ）も同様に互いに類似性がある。これらに加えて、分泌タンパク質ＣｏｆＪに対応するＬｎｇＪ（Ｌｏｎｇｕｓ）、ＴｃｐＦ（Ｔｃｐ）、ＣｆｃＪ（Ｃｆｃ）の各Ｎ末端配列にも類似性がある。図９にそれらのＮ末端領域のアミノ酸配列を示す。図９において、矢印は上述したＣｏｆＢとの結合に強く関与するＣｏｆＪの１０番目のフェニルアラニンを示し、下線は、二次構造を形成しないと考えられる配列部分を示す。下線部分は本実施形態のペプチドに係る配列番号１〜４の配列に相当し、この配列は上述の通り二次構造を形成しない部分の配列であり、すなわちマイナーピリンとの結合に有利な配列である。
なお、本実施形態のペプチドは、ペプチドの分解等を防止するために修飾されていても構わない。
本実施形態に係るペプチドの作製方法は、特に限定されず、ペプチド合成のために通常用いられ得る方法を利用でき、例えば遺伝子工学的方法や有機合成を用いた化学的方法を用いることができ、より具体的には以下の実施例において示す方法を用いることができる。
本発明の他の実施形態は、ＩＶｂ型線毛を産生する細菌が消化器等の標的細胞に付着及び定着を阻害するための上記本発明に係るペプチドを含む定着阻害剤である。本実施形態に係る定着阻害剤は、上記ペプチドの他に、安定剤、緩衝剤、希釈剤、又は賦形剤等の添加剤を含んでいても構わない。また、本実施形態に係る定着阻害剤は、経口投与可能な剤形であることが好ましく、例えば錠剤、カプセル剤及び丸剤等であることが好ましいが、これらに限定されない。さらに、本実施形態に係る定着阻害剤は、以下のものに限定されないが、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、ヒプロメースフタル酸エステル（ＨＰＭＣＰ）及びアクリル酸系高分子等を用いた腸溶性コーティングや、エチルセルロース等を用いた徐放性コーティング等のコーティング処理がなされていてもよい。
以下に本発明の代表的な実施例として、ＥＴＥＣのＣＦＡ／III線毛による定着能に対する本発明に係るペプチドの効果について説明する。
（実施例１）大腸菌ＣＦＡ／III産生株のＣａｃｏ２細胞への付着実験
これまでの報告からＣＦＡ ａｇａｒで培養したＣＦＡ／III産生野生型ＥＴＥＣ３１−１０株（ＥＴＥＣ １３７３株）だけでなく、大腸菌ＨＢ１０１株（Nippon Gene）にｃｏｆオペロンを含むプラスミドｐＴＴ２４０を導入した菌株（HB101cof）は、同様の培養条件で野生株同様のＩＶｂ型線毛形成能をもち、またＣａｃｏ２細胞に付着することが報告されている（Honda, T. et al. Infect. Immun. 1989, 57, 3452-3457.;Taniguchi, T.et al. Infect. Immun. 2001, 69, 5864-5873.）。ここで、cofオペロンを含むプラスミドpTT240の作製は以下の手順で行った。まず、cof遺伝子クラスターの塩基配列解析をおこなった結果、cof遺伝子のプロモーター配列の上流に制限酵素KpnIの切断サイト、cof遺伝子クラスターの最後の遺伝子であるcofJ遺伝子の下流に制限酵素StuIの切断サイトが存在することが明らかとなったため、cof遺伝子クラスターを含むプラスミドpSH1134を制限酵素StuIで切断後、phosphorylated KpnI linker (Takara Shuzo)をライゲーションし、制限酵素KpnIで切断処理をした。得られた13.8kbのフラグメントを0.8%のアガロースゲルで電気泳動をおこない精製後、制限酵素KpnI処理をしたプラスミドpMW119(Nippon Gene)にライゲーションをおこなった。得られたプラスミドをpTT240とした。また、Ｃａｃｏ２細胞は、ＥＴＥＣの小腸上皮細胞への定着のモデル細胞と考えられている（Darfeuille-Michaud, A. et al. Infect. Immun. 1990, 58, 893-902.）。そこで、ＨＢ１０１ｃｏｆとＣａｃｏ２細胞とを用いて、以下の通り、付着実験を行った。
これまでの報告からＣＦＡ ａｇａｒで培養したＣＦＡ／III産生野生型ＥＴＥＣ３１−１０株（ＥＴＥＣ １３７３株）だけでなく、大腸菌ＨＢ１０１株（Nippon Gene）にｃｏｆオペロンを含むプラスミドｐＴＴ２４０を導入した菌株（HB101cof）は、同様の培養条件で野生株同様のＩＶｂ型線毛形成能をもち、またＣａｃｏ２細胞に付着することが報告されている（Honda, T. et al. Infect. Immun. 1989, 57, 3452-3457.;Taniguchi, T.et al. Infect. Immun. 2001, 69, 5864-5873.）。ここで、cofオペロンを含むプラスミドpTT240の作製は以下の手順で行った。まず、cof遺伝子クラスターの塩基配列解析をおこなった結果、cof遺伝子のプロモーター配列の上流に制限酵素KpnIの切断サイト、cof遺伝子クラスターの最後の遺伝子であるcofJ遺伝子の下流に制限酵素StuIの切断サイトが存在することが明らかとなったため、cof遺伝子クラスターを含むプラスミドpSH1134を制限酵素StuIで切断後、phosphorylated KpnI linker (Takara Shuzo)をライゲーションし、制限酵素KpnIで切断処理をした。得られた13.8kbのフラグメントを0.8%のアガロースゲルで電気泳動をおこない精製後、制限酵素KpnI処理をしたプラスミドpMW119(Nippon Gene)にライゲーションをおこなった。得られたプラスミドをpTT240とした。また、Ｃａｃｏ２細胞は、ＥＴＥＣの小腸上皮細胞への定着のモデル細胞と考えられている（Darfeuille-Michaud, A. et al. Infect. Immun. 1990, 58, 893-902.）。そこで、ＨＢ１０１ｃｏｆとＣａｃｏ２細胞とを用いて、以下の通り、付着実験を行った。
まず、５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン、１０％ウシ胎児血清（FBS：Fetal Bovine Serum）を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM；Dulbecco’sModified Eagle’s Medium) を用いてＣａｃｏ２細胞を分散させ、血球計算版を用いて細胞濃度を測定し、３．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように希釈した。６ウェルプレートに希釈液を５００μＬずつ加え、ＣＯ２インキュベータ内で５％ＣＯ２、３７℃において４８時間静置、培養を行った。培養したＣａｃｏ２細胞をＰＢＳで２回洗浄した。洗浄後、１００μｇ／ｍＬアンピシリン、１％Ｄ−マンノースを含むＤＭＥＭを０．２２μｍフィルターに通し、ろ過をした後、各ウェルに５００μＬずつ加えた。
次に、ＨＢ１０１ ｃｏｆのグリセロールストックを少量かきとり、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地に添加し、２５℃で一晩振盪培養をおこなった。培養液を適宜希釈し、濁度計を用いて、培養液のＯＤ６６０を算出した。培養液を段階希釈し、ＣＦＵ（colony forming unit）を測定した。測定したＣＦＵから、ＯＤ６６０＝１．０におけるＨＢ１０１ｃｏｆの濃度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を算出した。この算出値を後のＨＢ１０１ ｃｏｆの濃度決定のために用いた。
上記培養とは別に、ＨＢ１０１ ｃｏｆのグリセロールストックを少量かきとり、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地に添加し、２５℃で一晩振盪培養をおこなった。菌体培養液を１００μｇ／ｍＬアンピシリンを含むＬＢ培地で１０倍希釈し、ＣＦＡ ａｇａｒプレート（1% Casamino Acid, 0.15% yeast extract, 0.005% MgSO4,0.0005% MnCl2, 2% アガロース）に５００μＬ添加し、３７℃で２４時間静置し培養を行った。培養後の寒天培地上にＰＢＳを３ｍＬ添加し、コンラージ棒で懸濁後、回収した。回収した培養液を１００倍希釈し、ＯＤ６６０を測定した。測定したＯＤ６６０から希釈前の培養液のＯＤ６６０を算出し、前述したＯＤ６６０＝１．０におけるＨＢ１０１ｃｏｆの濃度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を基に、大腸菌濃度（ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を算出した。ＨＢ１０１ ｃｏｆを１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにＰＢＳで希釈し、定着アッセイ用サンプルとした。
６ウェルプレートのＣａｃｏ２細胞に、調製したサンプルを５０μＬ添加し、ＣＯ２インキュベータ内で、５％ＣＯ２、３７℃において３時間静置した。３時間後、ＰＢＳで３回洗浄した後、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含むＰＢＳを５００μＬ加え、５分静置した後回収した。回収した溶液を段階希釈し、ＣＦＵを測定した。測定したＣＦＵから、Ｃａｃｏ２細胞に定着していた細菌数を算出した。定着していた細菌数をＣａｃｏ２細胞に添加した細菌数（５．０×１０７ｃｅｌｌｓ）で除し、１００を乗じることでＲｅｃｏｖｅｒｙｒａｔｅ（％）を計算した結果、１６．９％であり、本実験系での付着能を確認した。
（実施例２）ＣｏｆＢ欠損株及びＣｏｆＪ欠損株のＣａｃｏ２細胞への付着実験
上記実施例１において、ＨＢ１０１ ｃｏｆがＣａｃｏ２細胞に付着可能であることが確認できたため、次に、ＣｏｆＢ欠損株及びＣｏｆＪ欠損株を作製し、ＣｏｆＢ及びＣｏｆＪの機能について検討した。以下にその方法を説明する。
上記実施例１において、ＨＢ１０１ ｃｏｆがＣａｃｏ２細胞に付着可能であることが確認できたため、次に、ＣｏｆＢ欠損株及びＣｏｆＪ欠損株を作製し、ＣｏｆＢ及びＣｏｆＪの機能について検討した。以下にその方法を説明する。
まず、プラスミドｐＴＴ２４０を基にしてｃｏｆＪ遺伝子の欠損株（HB101-cof-ΔcofJ）を作製した。ｃｏｆＪ遺伝子のＯＲＦ領域に２箇所、制限酵素ＮｃｏＩの切断サイトが存在することに着目し、ＮｃｏＩを用いて３７℃で１時間インキュベートすることで切断後、精製を行った。精製した切断物をライゲーションすることで得られたプラスミドをＣｏｆＪ欠損プラスミドｐｃｏｆ−ΔｃｏｆＪとした。ｐｃｏｆ−ΔｃｏｆＪにより大腸菌株ＨＢ１０１を形質転換することにより得られた株をＣｏｆＪ欠損株HB101-cof-ΔcofJとした。
ｃｏｆＪ欠損株にトランスでｃｏｆＪ遺伝子を補完するために、プラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４にｃｏｆＪ遺伝子を組み込むこととした。プラスミドｐＴＴ２４０においてｃｏｆＪ遺伝子の上流にＳａｌＩ、下流にＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素サイトが存在することに着目し、制限酵素処理後、切断物末端の平滑化をおこない、精製をした。精製した切断物をＥｃｏＲＶ処理したプラスミドベクターｐＡＣＹＣ１８４(NIPPON GENE)とライゲーションをすることで得られたプラスミドをｃｏｆＪ補完プラスミドｐｃｏｆＪとした。ｐｃｏｆ−ΔｃｏｆＪとｐｃｏｆＪにより大腸菌株ＨＢ１０１を形質転換することにより得られた株をＣｏｆＪ補完株HB101-cof-ΔcofJ+pcofJとした。
ＣｏｆＢ欠損株HB101-cof-ΔcofB、およびＣｏｆＢ補完株HB101-cof-ΔcofB+pcofBの作製に関しては引用文献(Kawahara,K, et al. J. Mol. Biol, 2016, 428, 1209-1226.) に準じた。ＣｏｆＪ欠損株HB101-cof-ΔcofJ、ＣｏｆＪ補完株HB101-cof-ΔcofJ+pcofJ、ＣｏｆＢ欠損株HB101-cof-ΔcofBおよびＣｏｆＢ補完株HB101-cof-ΔcofB+pcofBの付着実験は実施例１と同様の手法によりおこなった。
実験の結果、Recoveryrateは、ＣｏｆＪ欠損株HB101-cof-ΔcofJは０．３０％、ＣｏｆＪ補完株HB101-cof-ΔcofJ+pcofJは２．９％、ＣｏｆＢ欠損株HB101-cof-ΔcofBは０．７９％およびＣｏｆＢ補完株HB101-cof-ΔcofB+pcofBは２．９％であった。
すなわち、ＨＢ１０１ ｃｏｆと比較して、ＣｏｆＪ欠損株HB101-cof-ΔcofJは、０．０１８倍、ＣｏｆＢ欠損株HB101-cof-ΔcofBは０．０４７倍しかＣａｃｏ２細胞に付着しなかった。また、ＣｏｆＪ補完株HB101-cof-ΔcofJ+pcofJおよびＣｏｆＢ補完株HB101-cof-ΔcofB+pcofBはＨＢ１０１ ｃｏｆほどの定着能を有さなかったものの、各欠損株と比較して定着能の回復が見られた。従って、ＨＢ１０１ｃｏｆによるＣａｃｏ２細胞に対する付着には、ＣｏｆＢおよびＣｏｆＪが関与すると認められる。
すなわち、ＨＢ１０１ ｃｏｆと比較して、ＣｏｆＪ欠損株HB101-cof-ΔcofJは、０．０１８倍、ＣｏｆＢ欠損株HB101-cof-ΔcofBは０．０４７倍しかＣａｃｏ２細胞に付着しなかった。また、ＣｏｆＪ補完株HB101-cof-ΔcofJ+pcofJおよびＣｏｆＢ補完株HB101-cof-ΔcofB+pcofBはＨＢ１０１ ｃｏｆほどの定着能を有さなかったものの、各欠損株と比較して定着能の回復が見られた。従って、ＨＢ１０１ｃｏｆによるＣａｃｏ２細胞に対する付着には、ＣｏｆＢおよびＣｏｆＪが関与すると認められる。
（実施例３）ＣｏｆＪと線毛サブユニットの相互作用解析
次に、分泌タンパク質であるＣｏｆＪと、線毛構成サブユニットであるＣｏｆＡおよびＣｏｆＢとの相互作用について解析した。
次に、分泌タンパク質であるＣｏｆＪと、線毛構成サブユニットであるＣｏｆＡおよびＣｏｆＢとの相互作用について解析した。
ＣｏｆＪと線毛構成サブユニットＣｏｆＡおよびＣｏｆＢの相互作用解析には、溶解度の向上のため、ＣｏｆＡ、ＣｏｆＢのＮ末端の疎水性領域（１〜２８残基）を除いたコンストラクト（ΔＮ２８−ＣｏｆＡ、ΔＮ２８−ＣｏｆＢ）を設計して発現および精製を行った。これらの発現、精製法については過去の論文 (Fukakusa, S, et al. Acta Cryst. 2012, D68, 1418-1429.; Kawahara, K, et al. J. Mol. Biol, 2016, 428, 1209-1226.)に従って行った。
ＣｏｆＪの発現精製は以下の手順でおこなった。プラスミドｐＴＴ２４０から、Forward primer: 5’-GCGCCCGGGTCGCCATCCTCTTCAGAAGG-3’（配列番号１０）とReverse primer: 5’- CAAGAATTCTTATTAATCAAGGCCACAAGCCTTC-3’（配列番号１１）を使用してＰＣＲで増幅した。制限酵素ＳｍａＩとＥｃｏＲＩとにより処理した後、同様の処理を行ったｐＥＴ４８ｂベクター（Merck Biosciences）にライゲーションしたプラスミドをＣｏｆＪ発現プラスミドとした。ＣｏｆＪ発現プラスミドを用いて大腸菌株SHuffle T7 Express lysY Competent E.coli（NewEngland Biolabs）を形質転換した菌株を、３５μｇ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地で、３７℃で振盪培養し前培養とした。前培養液を全量本培養液に加え３７℃でＯＤ６６０が０．６０になるまで培養した。発現誘導は０．２ｍＭのＩＰＴＧを加えることで行い、２０℃で１８時間振盪培養した。菌体は４０００ｇ、４℃、７分遠心分離で回収し、氷上でＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒ（50mM Tris-HCl、1M NaCl, pH8.0）に懸濁し、終濃度０．２ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、終濃度０．２％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加え１５分静置した。菌体は超音波（１０秒，５０秒休憩，１５サイクル）により破砕し可溶性タンパク質を含む上清は２４０００ｇ、４℃、１時間遠心分離をすることにより回収した。得られた上清はＮｉ２＋を結合し、上記Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒで平衡化したHiTrap Chelatingカラム（GEHealthcare Biosciences）に加えた。１５ｍＭ Imidazoleを加えた上記Ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒで洗浄後、Ｈｉｓｔａｇ付きのＣｏｆＪは１５〜５００ｍＭのImidazoleグラジエントにより溶出した。溶出画分にTurbo3C protease（Accelagen）を３０units加え、１０℃で50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl, pH8.0, 15mM Imidazoleに透析しつつ融合タグを切断した。融合タグを切断したＣｏｆＪは平衡化したＮｉカラムを通過させることでタグと分離した。分離したＣｏｆＪは20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl, pH8.0で平衡化したゲル濾過カラムSuperdex75（GE Healthcare Biosciences）を用いて最終精製を行った。
ＣｏｆＪのＮ末端側の２４残基を有さないΔＮ２４−ＣｏｆＪの発現は以下のように実施した。ＣｏｆＪ発現用ベクターを基に、forward primer:5’- GGTTGCCCAACTTTGGAAAC -3’（配列番号１２）とReverse primer: 5’- ACCCAGACCCGGGTCCCTGAAAGAG-3’（配列番号１３）を使用してインバースＰＣＲによって増幅した後、制限酵素ＳｍａＩで平滑化後、ライゲーションしたプラスミドをＣｏｆＪΔ２４発現プラスミドとした。ＣｏｆＪΔ２４の発現および精製はＣｏｆＪと同様の手法で行った。
以上の方法により調製したＣｏｆＢ、ＣｏｆＪ、及びΔＮ２４−ＣｏｆＪを用いて相互作用解析を行った。分泌タンパク質ＣｏｆＪとΔＮ２８−ＣｏｆＢの相互作用解析には等温滴定型熱量計Microcal iTC200(GE Healthcare社製)を用いた。滴定シリンジに０．５９ｍＭのＣｏｆＪ溶液、測定セルに２８．５μＭ（三量体換算）のΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液をそれぞれ充填し、ＣｏｆＪ溶液をΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液に滴下した際に生じる熱量変化を直接観測することで両者の相互作用を評価した。滴定条件は初回滴下量を１μＬ、２回目以降の滴下量を２μＬとし、１２０秒毎に合計２０回滴下した。測定温度は２５℃とし、溶媒は20mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaClとした。ＣｏｆＪ溶液の滴下により発熱変化が観測され、これは滴定の進行に伴い希釈熱と同等にまで収束した。得られたデータについて解析ソフトＯｒｉｇｉｎ（Microcal）を用いた解析を行った結果、ＣｏｆＪとΔＮ２８−ＣｏｆＢの結合が観測された。両者の解離定数Ｋｄ値は０．２μＭであった。
同様に、ＣｏｆＪとΔＮ２８−ＣｏｆＡの相互作用解析に等温滴定型熱量計Microcal iTC200(GE Healthcare社製)を用いた。滴定シリンジに０．５９ｍＭのＣｏｆＪ溶液、測定セルに２８．５μＭ（三量体換算）のΔＮ２８−ＣｏｆＡ溶液をそれぞれ充填し、ＣｏｆＪ溶液をΔＮ２８−ＣｏｆＡ溶液に滴下した際に生じる熱量変化を直接観測することで両者の相互作用を評価した。滴定条件及び溶媒条件は分泌タンパク質ＣｏｆＪとΔＮ２８−ＣｏｆＢの相互作用解析と同様とした。ＣｏｆＪ溶液の滴下による熱量変化は観測されなかった。このことからＣｏｆＪとΔＮ２８−ＣｏｆＡは結合しないことが示された。
次に、分泌タンパク質ＣｏｆＪのＮ末端領域（１〜２４）の線毛への結合への寄与を調べるため、ΔＮ２４−ＣｏｆＪとΔＮ２８−ＣｏｆＢの相互作用解析を等温滴定型熱量計Microcal iTC200(GE Healthcare社製)を用いて実施した。滴定シリンジに０．５９ｍＭのΔＮ２４−ＣｏｆＪ溶液、測定セルに２８．５μＭ（三量体換算）のΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液をそれぞれ充填し、ΔＮ２４−ＣｏｆＪ溶液をΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液に滴下した際に生じる熱量変化を直接観測することで両者の相互作用を評価した。ΔＮ２４−ＣｏｆＪ溶液の滴下による熱量変化は観測されなかった。このことからΔＮ２４−ＣｏｆＪとΔＮ２８−ＣｏｆＢは結合しないことが示された。
さらに、分泌タンパク質ＣｏｆＪのＮ末端領域（１〜２４）の線毛への結合への寄与を調べるため、株式会社スクラムから購入したＣｏｆＪのＮ末端の２４アミノ酸残基からなる合成ペプチド（ＣｏｆＪ１−２４ペプチド）とΔＮ２８−ＣｏｆＢの相互作用解析を、上記と同様に等温滴定型熱量計Microcal iTC200(GE Healthcare社製)を用いて実施した。滴定シリンジに２ｍＭのＣｏｆＪ１−２４ペプチド溶液、測定セルに３３．９μＭ（三量体換算）のΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液をそれぞれ充填し、ＣｏｆＪ１−２４ペプチド溶液をΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液に滴下した際に生じる熱量変化を直接観測することで両者の相互作用を評価した。ＣｏｆＪ１−２４ペプチド溶液の滴下により発熱変化が観測され、これは滴定の進行に伴い希釈熱と同等にまで収束した。得られたデータについて解析ソフトＯｒｉｇｉｎを用いた解析を行った結果、ＣｏｆＪ１−２４ペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢの結合が観測された。両者の解離定数Ｋｄ値は４μＭであった。
次に、ＣｏｆＪ１−２４ペプチドの結合特異性を調べるため、株式会社スクラムから購入した合成ランダムペプチド（CofJpepR）とΔＮ２８−ＣｏｆＢの相互作用解析を等温滴定型熱量計Microcal iTC200(GE Healthcare社製)を用いて実施した。滴定シリンジに２ｍＭのランダムペプチド溶液、測定セルに２８．５μＭ（三量体換算）のΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液をそれぞれ充填し、ΔＮ２４−ＣｏｆＪ溶液をΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液に滴下した際に生じる熱量変化を直接観測することで両者の相互作用を評価した。ランダムペプチド溶液の滴下による熱量変化は観測されなかった。このことからランダムペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢは結合しないことが示された。
以上から、ＣｏｆＡとＣｏｆＪは結合しないが、ＣｏｆＢとＣｏｆＪとが結合し、特にＣｏｆＪのＮ末端の１〜２４のアミノ酸残基が関与することが示唆された。
（実施例４）ＣｏｆＪとΔＮ２８−ＣｏｆＢの超遠心分析による会合比の決定
次に、ＣｏｆＪとΔＮ２８−ＣｏｆＢとの会合比について検討した。それらの会合比の決定には分析用超遠心機Optima XL-I(Beckman Coulter社製)を用いた。測定セルのウィンドウにはクォーツを選択し、センターピースにはセル長１．２ｃｍのチャコールエポン製６穴センターピースを用いた。測定温度は２０℃とし、溶媒は20mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaClとした。ローター回転数は５０００，８０００，１００００ｒｐｍに設定し、各回転数において設定回転数到達後２時間毎にセル中の濃度勾配をＵＶ検出器にてモニターした。スキャン毎に観測される吸光度のｒｍｓｄ値が０．０１以下になった時点を沈降平衡とし、平衡到達を確認した後、２９７ｎｍにて沈降平衡における濃度勾配を評価した。積算回数は４回とした。このようにして得られた濃度勾配と、それに基づき算出された見かけの分子量から、１分子のＣｏｆＪと１分子の三量体ΔＮ２８−ＣｏｆＢが会合していることが確認された。
次に、ＣｏｆＪとΔＮ２８−ＣｏｆＢとの会合比について検討した。それらの会合比の決定には分析用超遠心機Optima XL-I(Beckman Coulter社製)を用いた。測定セルのウィンドウにはクォーツを選択し、センターピースにはセル長１．２ｃｍのチャコールエポン製６穴センターピースを用いた。測定温度は２０℃とし、溶媒は20mM Tris-HCl (pH 8.0), 150mM NaClとした。ローター回転数は５０００，８０００，１００００ｒｐｍに設定し、各回転数において設定回転数到達後２時間毎にセル中の濃度勾配をＵＶ検出器にてモニターした。スキャン毎に観測される吸光度のｒｍｓｄ値が０．０１以下になった時点を沈降平衡とし、平衡到達を確認した後、２９７ｎｍにて沈降平衡における濃度勾配を評価した。積算回数は４回とした。このようにして得られた濃度勾配と、それに基づき算出された見かけの分子量から、１分子のＣｏｆＪと１分子の三量体ΔＮ２８−ＣｏｆＢが会合していることが確認された。
（実施例５）ＣｏｆＪ１−２４ペプチドとＣｏｆＢとの複合体構造の決定
次に、上記ＣｏｆＪ１−２４ペプチドとＣｏｆＢとからなる複合体の構造を決定するために、その複合体の結晶の作製を試みた。
次に、上記ＣｏｆＪ１−２４ペプチドとＣｏｆＢとからなる複合体の構造を決定するために、その複合体の結晶の作製を試みた。
そのために、まず、ペプチド合成により得られたＣｏｆＪ１−２４ペプチドを物質量比で２倍となるようにΔＮ２８−ＣｏｆＢと混合し、結晶化サンプルとした。初期スクリーニングは２０℃でシッティングドロップ蒸気拡散法により、スクリーニングキットWizard ScreenI,II（Emerald Biosystems）を用いておこなった。各ドロップには、ＣｏｆＢとして濃度が１０、５、２．５ｍｇ／ｍＬとなるように調製した上記混合ペプチド（ΔN28-CofB/CofJ1-24ペプチド）１μＬと結晶化溶液１μＬを混合し静置した。スクリーニングの結果、WizardII-39(100 mM CAPS pH10.5, 20% PEG 8000, 200 mM NaCl)の条件において初期結晶が得られた。条件の最適化後、結晶化溶液４０μＬをリザーバーとして濃度５ｍｇ／ｍＬのΔN28-CofB/CofJ1-24ペプチドと結晶化溶液を等量混合した３〜４μＬのドロップを形成し、２０℃で３日間静置することで、針状の結晶を得ることに成功した。
得られたΔN28-CofB/CofJ1-24ペプチド複合体結晶については大型放射光施設SPring-8 BL26B1で回折測定を実施した。ナイロンループを用いてドロップから複合体結晶を回収後、−１７３℃の窒素気流下で急速凍結をおこない、回折データを収集した。複合体結晶からの回折像は最高分解能３．８５Åの回折能を示した。プログラムHKL2000を用いて、強度積分、スケーリング処理をおこなった。複合体結晶は空間群Ｐ６５に属し、格子定数はａ＝１５７．７６Å、ｂ＝１５７．７６Å、ｃ＝１１８．５３Å、α＝β＝９０．０°、γ＝１２０．０°であった。初期位相の決定は、プログラムPhaserを使用した分子置換法により行った。分子置換適用の際の初期探索モデルの座標データは、ΔN28-CofB（PDBID:5AX6）の座標データを使用し、可動性の高いドメイン１とドメイン２間のリンカーの存在を考慮し、ドメイン１フラグメントとそれ以外（ドメイン２及び３からなる三量体フラグメント）の２つのフラグメントに分解したものを初期探索モデルとして採用し、分子置換による初期位相の解を求めた。その結果、初期検索モデルとして採用したドメイン１単量体フラグメントが３つ、ドメイン２及び３からなる三量体フラグメントを１つ含む解が１つ見つかった。分子置換法の結果得られたフラグメントを分子モデリング支援プログラムＣｏｏｔによってそれぞれを繋ぎ合わせた後、構造精密化用プログラムPHENIX.refineによる初期構造の精密化を行ったところ、図１０に示すように、ΔＮ２８−ＣｏｆＢ三量体のＨ型レクチンドメインの分子境界部にＣｏｆＪ１−２４ペプチドの電子密度が３箇所観測された。
この結果から、ＣｏｆＢ三量体のＨ型レクチンドメインにおいて、３つのＣｏｆＪペプチドが結合可能であることが示唆された。
（実施例６）ＧＣＮ４融合型阻害ペプチドの設計
次に、上記ＣｏｆＢ三量体のそれぞれのＨ型レクチンドメインに結合可能な三量体ペプチドを作製するために、三量体化ドメインを有するＧＣＮ４を用い、これとＣｏｆＪペプチドとがリンカーを介して結合したペプチドの作製を試みた。
次に、上記ＣｏｆＢ三量体のそれぞれのＨ型レクチンドメインに結合可能な三量体ペプチドを作製するために、三量体化ドメインを有するＧＣＮ４を用い、これとＣｏｆＪペプチドとがリンカーを介して結合したペプチドの作製を試みた。
そのために、まず、ＣｏｆＪ１−２４ペプチドとリンカー（TSGGG）を用いてＧＣＮ４を融合させた阻害ペプチド（CofJ1-24-GCN4と呼ぶ）の発現プラスミドを以下の通り構築した。ＰＣＲ反応によってオリゴ核酸を連結しCofJ1-24-GCN4遺伝子を合成した。CJN-T-1,6(表１)が終濃度０．６μＭ、CJN-T-2,3,4,5(表１)が終濃度０．０３μＭとなるように調製し、ＰＣＲを２０サイクルおこなった。得られた増幅産物を制限酵素ＮｄｅＩ／ＸｈｏＩで切断、精製し、同様の処理をしたｐＥＴ３０ａベクター（Merck Biosciences）にライゲーションし、プラスミドを得た。しかし、このプラスミドではCofJ1-24-GCN4が発現しなかったため、Ｎ末端にＧＳＴタグを付加したベクターにより発現させることとした。プライマーとしてCJN-T-7、8、テンプレートに前述したプラスミドを用い、ＰＣＲを３５サイクルおこなった。得られた増幅産物を制限酵素ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩで切断、精製し、同様の処理をしたpGEX6P-1ベクター（GE Healthcare Biosciences）にライゲーションし、CofJ1-24-GCN4発現プラスミドを得た。
次に、CofJ1-24-GCN4発現用プラスミドを用いて大腸菌株BL21(DE3)（NIPPON GENE）を形質転換した。コロニーを拾い、アンピシリンを１００μｇ／ｍＬ含むＬＢ培地に加え、３７℃で一晩振盪培養した。翌朝、当該培養液を本培養培地に全量加えてスケールアップし、３７℃で振盪培養した。ＯＤ６６０＝０．６に達したときに、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように加え、２５℃で１８時間振盪し、発現誘導を行った。発現誘導した菌体を４０００ｇ、７分、４℃で遠心回収した。得られた菌体を氷上においてlysis buffer (20 mM Tris-HCl, 1M NaCl, pH8.0)で溶解した後、リゾチームを20 μg/mL、TritonX-100を0.2%となるように加え15分放置した後、15秒間超音波破砕、1分休憩のサイクルを15回繰り返した。超音波破砕液を20000g、4℃で1時間遠心し、遠心上清を0.8 μmフィルターでろ過した。ろ過したサンプルをlysis bufferで平衡化したＧＳＴカラム(GlutathioneSepharose 4 Fast Flow：GE Healthcare Biosciences)にアプライした。ＧＳＴカラムをlysis bufferで洗浄した後、elution buffer (20 mMTris-HCl, 20 mM GSH, pH8.0 )で溶出した。溶出サンプルを３０unitsのTurbo 3C protease（Accelagen）で酵素処理をしながら、透析buffer(20 mM Tris-HCl, pH8.0)で透析をおこない、ＧＳＴタグとCofJ1-24-GCN4を切断した。切断後のサンプルをＧＳＴカラムにアプライし、ＧＳＴタグとCofJ1-24-GCN4を分離した。回収したサンプルを透析bufferで平衡化したHitrapDEAEカラム（GE Healthcare Biosciences）にアプライし、ＮａＣｌの濃度を０から２Ｍまでグラジエントをかけることで、溶出をおこなった。得られたサンプルをゲル濾過buffer(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH8.0)で平衡化したSuperdex75(26/60)カラム（GE HealthcareBiosciences）にアプライし、最終精製物とした。
得られた最終精製物は、Ｎ末端側から、ベクター由来配列４残基(GPLG)、ＣｏｆＪN末領域由来２４残基（CofJ1-24配列）(SPSSSEGGAFTVNMPKTSTVDDIR：配列番号１)、リンカー配列５残基(TSGGG：配列番号９)、ＧＣＮ４配列３０残基(RMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLI)から構成される（配列番号６）。これをCofJ1-24-GCN4阻害ペプチドとする。
（実施例７）ＧＣＮ４融合型阻害ペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢとのＩＴＣによる相互作用解析
実施例６で得られたCofJ1-24-GCN4阻害ペプチドの線毛への結合の寄与を調べるため、CofJ1-24-GCN4阻害ペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢの相互作用解析を等温滴定型熱量計Microcal iTC200(GE Healthcare社製)を用いて実施した。滴定シリンジに０．５９ｍＭのCofJ1-24-GCN4阻害ペプチド溶液、測定セルに２８．５μＭ（三量体換算）のΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液をそれぞれ充填し、CofJ1-24-GCN4阻害ペプチド溶液をΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液に滴下した際に生じる熱量変化を直接観測することで両者の相互作用を評価した。CofJ1-24-GCN4阻害ペプチド溶液の滴下により発熱変化が観測され、これは滴定の進行に伴い希釈熱と同等にまで収束した。得られたデータについて解析ソフトOriginを用いた解析を行った結果、CofJ1-24-GCN4阻害ペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢとの結合が観測された。両者の解離定数Ｋｄ値は０．０４μＭであった。
実施例６で得られたCofJ1-24-GCN4阻害ペプチドの線毛への結合の寄与を調べるため、CofJ1-24-GCN4阻害ペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢの相互作用解析を等温滴定型熱量計Microcal iTC200(GE Healthcare社製)を用いて実施した。滴定シリンジに０．５９ｍＭのCofJ1-24-GCN4阻害ペプチド溶液、測定セルに２８．５μＭ（三量体換算）のΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液をそれぞれ充填し、CofJ1-24-GCN4阻害ペプチド溶液をΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液に滴下した際に生じる熱量変化を直接観測することで両者の相互作用を評価した。CofJ1-24-GCN4阻害ペプチド溶液の滴下により発熱変化が観測され、これは滴定の進行に伴い希釈熱と同等にまで収束した。得られたデータについて解析ソフトOriginを用いた解析を行った結果、CofJ1-24-GCN4阻害ペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢとの結合が観測された。両者の解離定数Ｋｄ値は０．０４μＭであった。
解析の結果得られたCofJ1-24-GCN4阻害ペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢとの結合親和性は、ＣｏｆＪとΔＮ２８−ＣｏｆＢの結合親和性に比べて５倍程度強いことが示され、ＧＣＮ４融合型阻害ペプチドがＣｏｆＪとΔＮ２８−ＣｏｆＢとの相互作用を効率良く阻害することが明らかとなった。
（実施例８）プルダウンアッセイによる阻害ペプチドのＣｏｆＢ／ＣｏｆＪ相互作用の阻害
CofJ1-24-GCN4阻害ペプチドがＣｏｆＢとＣｏｆＪの結合を阻害可能かどうか調べるために、Ｎｉカラムを用いたプルダウンアッセイによりｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系で確かめた。実験には、チオレドキシンタグ(Trx)、Hisタグ(His)が付加したΔN28-CofB(Trx-His−ΔN28-CofB)、CofJ、CofJ1-24-GCN4、CofJ1-24ペプチド、CofJ1-24ペプチドのアミノ酸配列をランダム化したペプチド(CofJpepR)を使用した。なお、CofJpepRの配列は、NPSGFDKSGSSTTRTPAMSVIVDE（配列番号２２）である。
CofJ1-24-GCN4阻害ペプチドがＣｏｆＢとＣｏｆＪの結合を阻害可能かどうか調べるために、Ｎｉカラムを用いたプルダウンアッセイによりｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系で確かめた。実験には、チオレドキシンタグ(Trx)、Hisタグ(His)が付加したΔN28-CofB(Trx-His−ΔN28-CofB)、CofJ、CofJ1-24-GCN4、CofJ1-24ペプチド、CofJ1-24ペプチドのアミノ酸配列をランダム化したペプチド(CofJpepR)を使用した。なお、CofJpepRの配列は、NPSGFDKSGSSTTRTPAMSVIVDE（配列番号２２）である。
Trx-His−ΔN28-CofBが１μＭ、CofJ1-24-GCN4が各濃度(０、０．５、１．０、２．０、５．０、１０．０μＭ)となるように混合した溶液を一晩氷上で静置した。さらに、終濃度が１μＭとなるようにＣｏｆＪを混合し氷上で１時間静置したものを実験サンプルとした。20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH8.0で平衡化したＮｉカラムに各サンプルをアプライし、20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 15 mM Imidazole, pH8.0でカラムの洗浄をおこなった。その後、20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 300 mM Imidazole, pH8.0で溶出をおこない、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって溶出画分の確認をおこなった。その結果を図１１に示す。図１１に示すように、予めＣｏｆＪと同濃度以上のCofJ1-24-GCN4をTrx-His-ΔN28-CofBと混合しておくことで、ＣｏｆＪとTrx-His-ΔN28-CofBの結合を強力に阻害できることが明らかとなった。
CofJ1-24ペプチド、およびCofJpepRに関しても同様の方法でその阻害能を検討した。具体的に、Trx-His-ΔN28-CofBが１μＭ、CofJ1-24ペプチドおよびCofJpepRが１０００μＭとなるように混合した溶液を一晩氷上で静置した。さらに、終濃度１μＭとなるようにＣｏｆＪを混合し氷上で１時間静置したものを実験サンプルとした。プルダウンアッセイは前述の方法と同様に行った。その結果を図１２に示す。図１２に示すように、CofJ1-24ペプチドではＣｏｆＪの１０００倍の濃度を予め加えていたとしても、ＣｏｆＪとTrx-His-ΔN28-CofBとの結合をほとんど阻害できないことが明らかとなった。また、CofJpepRでは、全く阻害できないことが明らかとなった。このことから、CofJ1-24-GCN4は三量体化することにより、ＣｏｆＢと強く結合することで、ＣｏｆＢとＣｏｆＪの結合を阻害できるものと考えられる。
（実施例９）Ｃａｃｏ２細胞を用いた阻害ペプチドのＥＴＥＣ付着阻害活性評価
実施例１および実施例２と同様の手法で定着実験をおこなった。その際、CofJ1-24-GCN4を０、１０、１００、１０００μｇ／ｍＬ、ＨＢ１０１ ｃｏｆを１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように混合調製後、２５℃で１時間静置したものを５０μＬずつ５００μＬの培地に加え、CofJ1-24-GCN4が０、１、１０、１００μｇ／ｍＬ、ＨＢ１０１ ｃｏｆが１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにした。この結果を図１３に示す。図１３に示すように、Recovery rateは、０μｇ／ｍＬ CofJ1-24-GCN4が１４．７％、１μｇ／ｍＬ CofJ1-24-GCN4が１４．０％、１０μｇ／ｍＬ CofJ1-24-GCN4が１１．５％、１００μｇ／ｍＬ CofJ1-24-GCN4が２．６％であった。
実施例１および実施例２と同様の手法で定着実験をおこなった。その際、CofJ1-24-GCN4を０、１０、１００、１０００μｇ／ｍＬ、ＨＢ１０１ ｃｏｆを１．０×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように混合調製後、２５℃で１時間静置したものを５０μＬずつ５００μＬの培地に加え、CofJ1-24-GCN4が０、１、１０、１００μｇ／ｍＬ、ＨＢ１０１ ｃｏｆが１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにした。この結果を図１３に示す。図１３に示すように、Recovery rateは、０μｇ／ｍＬ CofJ1-24-GCN4が１４．７％、１μｇ／ｍＬ CofJ1-24-GCN4が１４．０％、１０μｇ／ｍＬ CofJ1-24-GCN4が１１．５％、１００μｇ／ｍＬ CofJ1-24-GCN4が２．６％であった。
この結果から、CofJ1-24-GCN4が濃度依存的にＨＢ１０１ｃｏｆのＣａｃｏ２細胞に対する定着を阻害することが明らかとなった。
（実施例１０）ＣｏｆＪ４−１６ペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢとのＩＴＣによる相互作用解析
ここまで、ＣｏｆＪ１−２４ペプチドがＣｏｆＢ／ＣｏｆＪ相互作用を阻害して、ＥＴＥＣの腸組織への付着を阻害することを示した。上述したようにＣｏｆＪ１−２４ペプチド／ΔＮ２８−ＣｏｆＢ複合体の結晶構造から、ＣｏｆＪ１−２４ペプチドの一部、具体的には図７に示した通り、５番目のセリンから１５番目のプロリンがそれら両者の相互作用に特に関与していると考えられる。そこで、次に、ＣｏｆＪ１−２４ペプチドのうち、特に重要と考えられる部分を含む、ＣｏｆＪ１−２４ペプチドの４番目から１６番目までのアミノ酸配列からなるＣｏｆＪ４−１６ペプチド（配列番号２３）であっても、ＣｏｆＪ１−２４ペプチドと同等の効果を示すことができるか否かを検討した。
ここまで、ＣｏｆＪ１−２４ペプチドがＣｏｆＢ／ＣｏｆＪ相互作用を阻害して、ＥＴＥＣの腸組織への付着を阻害することを示した。上述したようにＣｏｆＪ１−２４ペプチド／ΔＮ２８−ＣｏｆＢ複合体の結晶構造から、ＣｏｆＪ１−２４ペプチドの一部、具体的には図７に示した通り、５番目のセリンから１５番目のプロリンがそれら両者の相互作用に特に関与していると考えられる。そこで、次に、ＣｏｆＪ１−２４ペプチドのうち、特に重要と考えられる部分を含む、ＣｏｆＪ１−２４ペプチドの４番目から１６番目までのアミノ酸配列からなるＣｏｆＪ４−１６ペプチド（配列番号２３）であっても、ＣｏｆＪ１−２４ペプチドと同等の効果を示すことができるか否かを検討した。
まず、実施例３で行った試験と同様に、ＣｏｆＪ４−１６ペプチドの線毛への結合への寄与を調べるため、ＣｏｆＪ４−１６の合成ペプチド（株式会社スクラムから購入）とΔＮ２８−ＣｏｆＢとの相互作用解析を、上記と同様に等温滴定型熱量計Microcal iTC200(GE Healthcare社製)を用いて実施した。具体的に、滴定シリンジに２ｍＭのＣｏｆＪ４−１６ペプチド溶液、測定セルに３３．９μＭ（三量体換算）のΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液をそれぞれ充填し、ＣｏｆＪ４−１６ペプチド溶液をΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液に滴下した際に生じる熱量変化を直接観測することで両者の相互作用を評価した。ＣｏｆＪ４−１６ペプチド溶液の滴下により発熱変化が観測され、これは滴定の進行に伴い希釈熱と同等にまで収束した。得られたデータについて解析ソフトＯｒｉｇｉｎを用いた解析を行った結果、ＣｏｆＪ４−１６ペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢの結合が観測された。両者の解離定数Ｋｄ値は４μＭであった。
以上から、ＣｏｆＪ４−１６ペプチドが、ＣｏｆＪ１−２４ペプチドと同様にＣｏｆＢと結合できることが示唆された。
（実施例１１）ＣｏｆＪ４−１６−ＧＣＮ４ペプチドの設計
次に、実施例６で行ったのと同様に、ＣｏｆＪ４−１６においても三量体ペプチドを作製するために、三量体化ドメインを有するＧＣＮ４、及びリンカーを用いて、ＣｏｆＪ４−１６−ＧＣＮ４ペプチドの作製を試みた。
次に、実施例６で行ったのと同様に、ＣｏｆＪ４−１６においても三量体ペプチドを作製するために、三量体化ドメインを有するＧＣＮ４、及びリンカーを用いて、ＣｏｆＪ４−１６−ＧＣＮ４ペプチドの作製を試みた。
ＣｏｆＪ４−１６ペプチドとリンカー(TSGGG)を用いてＧＣＮ４を融合させた阻害ペプチド(CofJ4-16-GCN4と呼ぶ)の発現プラスミドを以下の通り構築した。CofJ1-24-GCN4発現プラスミドにおけるCofJ1-24ペプチド配列の両末端に予め組み込んでおいた制限酵素BamHI及びSpeIのサイトを両制限酵素を用いて切断後、精製した。CofJ4-16の配列を含むオリゴヌクレオチド1：5’-GATCCAGCGAAGGTGGTGCTTTCACCGTTAACATGCCGAAGA-3’（配列番号２４）とオリゴヌクレオチド2：5’-CTAGTCTTCGGCATGTTAACGGTGAAAGCACCACCTTCGCTG-3’（配列番号２５）を混合、アニーリングさせることで二本鎖DNAとし、精製したベクターとライゲーションをすることでCofJ4-16-GCN4発現プラスミドを得た。
次に、CofJ4-16-GCN4発現用プラスミドを用いて大腸菌株BL21(DE3)（NIPPON GENE）を形質転換した。コロニーを拾い、アンピシリンを１００μｇ／ｍＬ含むＬＢ培地に加え、３７℃で一晩振盪培養した。翌朝、当該培養液を本培養培地に全量加えてスケールアップし、３７℃で振盪培養した。ＯＤ６６０＝０．６に達したときに、ＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように加え、２５℃で１８時間振盪し、発現誘導を行った。発現誘導した菌体を４０００ｇ、７分、４℃で遠心回収した。得られた菌体を氷上においてlysis buffer (20mM Tris-HCl, 1M NaCl, pH8.0)で溶解した後、リゾチームを20 μg/mL、TritonX-100を0.2%となるように加え15分放置した後、15秒間超音波破砕、1分休憩のサイクルを15回繰り返した。超音波破砕液を20000g、4℃で1時間遠心し、遠心上清を0.8 μmフィルターでろ過した。ろ過したサンプルをlysis bufferで平衡化したＧＳＴカラム(GlutathioneSepharose4 Fast Flow：GE Healthcare Biosciences)にアプライした。ＧＳＴカラムをlysis bufferで洗浄した後、elution buffer (20mMTris-HCl, 20 mM GSH, pH8.0 )で溶出した。溶出サンプルを３０unitsのTurbo 3C protease（Accelagen）で酵素処理をしながら、透析buffer(20 mM Tris-HCl, pH8.0)で透析をおこない、ＧＳＴタグとCofJ4-16-GCN4を切断した。切断後のサンプルをＧＳＴカラムにアプライし、ＧＳＴタグとCofJ4-16-GCN4を分離した。回収したサンプルを透析bufferで平衡化したHitrapDEAEカラム（GE HealthcareBiosciences）にアプライし、カラムに結合しなかった画分を回収した。得られたサンプルをゲル濾過buffer(20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH8.0)で平衡化したSuperdex75(26/60)カラム（GEHealthcareBiosciences）にアプライし、最終精製物とした。
得られた最終精製物は、Ｎ末端側から、ベクター由来配列４残基(GPLG)、CofJＮ末領域由来１３残基(SSEGGAFTVNMPK：配列番号２３)、リンカー配列５残基(TSGGG：配列番号９)、ＧＣＮ４配列３０残基(RMKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLI：配列番号６)から構成される。これをCofJ4-16-GCN4阻害ペプチドとする。
（実施例１２）CofJ4-16-GCN4阻害ペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢとのＩＴＣによる相互作用解析
実施例１１で得られたCofJ4-16-GCN4阻害ペプチドの線毛への結合の寄与を調べるため、CofJ4-16-GCN4阻害ペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢの相互作用解析を等温滴定型熱量計Microcal iTC200(GE Healthcare社製)を用いて実施した。滴定シリンジに０．５９ｍＭのCofJ4-16-GCN4阻害ペプチド溶液、測定セルに２８．５μＭ（三量体換算）のΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液をそれぞれ充填し、CofJ4-16-GCN4阻害ペプチド溶液をΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液に滴下した際に生じる熱量変化を直接観測することで両者の相互作用を評価した。CofJ4-16-GCN4阻害ペプチド溶液の滴下により発熱変化が観測され、これは滴定の進行に伴い希釈熱と同等にまで収束した。得られたデータについて解析ソフトOriginを用いた解析を行った結果、CofJ4-16-GCN4阻害ペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢとの結合が観測された。両者の解離定数Ｋｄ値は０．０８μＭであった。
実施例１１で得られたCofJ4-16-GCN4阻害ペプチドの線毛への結合の寄与を調べるため、CofJ4-16-GCN4阻害ペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢの相互作用解析を等温滴定型熱量計Microcal iTC200(GE Healthcare社製)を用いて実施した。滴定シリンジに０．５９ｍＭのCofJ4-16-GCN4阻害ペプチド溶液、測定セルに２８．５μＭ（三量体換算）のΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液をそれぞれ充填し、CofJ4-16-GCN4阻害ペプチド溶液をΔＮ２８−ＣｏｆＢ溶液に滴下した際に生じる熱量変化を直接観測することで両者の相互作用を評価した。CofJ4-16-GCN4阻害ペプチド溶液の滴下により発熱変化が観測され、これは滴定の進行に伴い希釈熱と同等にまで収束した。得られたデータについて解析ソフトOriginを用いた解析を行った結果、CofJ4-16-GCN4阻害ペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢとの結合が観測された。両者の解離定数Ｋｄ値は０．０８μＭであった。
解析の結果得られたCofJ4-16-GCN4阻害ペプチドとΔＮ２８−ＣｏｆＢとの結合親和性は、ＣｏｆＪとΔＮ２８−ＣｏｆＢの結合親和性に比べて２．５倍程度強いことが示され、ＧＣＮ４融合型阻害ペプチドがＣｏｆＪとΔＮ２８−ＣｏｆＢとの相互作用を効率良く阻害することが明らかとなった。
（実施例１３）プルダウンアッセイによるCofJ4-16-GCN4阻害ペプチドのCofB/CofJ相互作用の阻害
CofJ4-16-GCN4阻害ペプチドがＣｏｆＢとＣｏｆＪの結合を阻害可能かどうか調べるために、Ｎｉカラムを用いたプルダウンアッセイによりｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系で確かめた。実験には、チオレドキシンタグ(Trx)、Hisタグ(His)が付加したΔN28-CofB(Trx-His-ΔN28-CofB)、CofJ、CofJ4-16-GCN4を使用した。
CofJ4-16-GCN4阻害ペプチドがＣｏｆＢとＣｏｆＪの結合を阻害可能かどうか調べるために、Ｎｉカラムを用いたプルダウンアッセイによりｉｎ ｖｉｔｒｏの実験系で確かめた。実験には、チオレドキシンタグ(Trx)、Hisタグ(His)が付加したΔN28-CofB(Trx-His-ΔN28-CofB)、CofJ、CofJ4-16-GCN4を使用した。
Trx-His-ΔN28-CofBが１μＭ、CofJ4-16-GCN4が各濃度(０、０．５、１．０、２．０、５．０、１０μＭ)となるように混合した溶液を一晩氷上で静置した。さらに、終濃度が１μＭとなるようにCofJを混合し氷上で1時間静置したものを実験サンプルとした。20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH8.0で平衡化したNiカラムに各サンプルをアプライし、20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 15 mM Imidazole, pH8.0でカラムの洗浄をおこなった。その後、20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 300 mM Imidazole, pH8.0で溶出をおこない、SDS-PAGEによって溶出画分の確認をおこなった。その結果、図１４に示すように、予めCofJと同濃度以上のCofJ4-16-GCN4をTrx-His-ΔN28-CofBと混合しておくことで、CofJとTrx-His-ΔN28-CofBの結合を強力に阻害できることが明らかとなった。
（実施例１４）Ｃａｃｏ２細胞を用いたCofJ4-16-GCN4のＥＴＥＣ付着阻害活性評価
CofJ4-16-GCN4を用いて実施例９と同様にＥＴＥＣ付着阻害活性評価を行った。CofJ4-16-GCN4を０、１０、１００、１０００μｇ／ｍＬ、ＨＢ１０１ｃｏｆを１．０×１０９ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように混合調製後、２５℃で１時間静置したものを５０μＬずつ５００μＬの培地に加え、CofJ4-16-GCN4が０、１、１０、１００μｇ／ｍＬ、ＨＢ１０１ｃｏｆが１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにした。その結果、図１５に示すように、Recovery rateは、０μｇ／ｍＬ CofJ4-16-GCN4が１．０１％、１μｇ／ｍＬ CofJ4-16-GCN4が０．３２％、１０μｇ／ｍＬ CofJ4-16-GCN4が０．３６％、１００μｇ／ｍＬ CofJ4-16-GCN4が０．０６８％であった。
CofJ4-16-GCN4を用いて実施例９と同様にＥＴＥＣ付着阻害活性評価を行った。CofJ4-16-GCN4を０、１０、１００、１０００μｇ／ｍＬ、ＨＢ１０１ｃｏｆを１．０×１０９ ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように混合調製後、２５℃で１時間静置したものを５０μＬずつ５００μＬの培地に加え、CofJ4-16-GCN4が０、１、１０、１００μｇ／ｍＬ、ＨＢ１０１ｃｏｆが１．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるようにした。その結果、図１５に示すように、Recovery rateは、０μｇ／ｍＬ CofJ4-16-GCN4が１．０１％、１μｇ／ｍＬ CofJ4-16-GCN4が０．３２％、１０μｇ／ｍＬ CofJ4-16-GCN4が０．３６％、１００μｇ／ｍＬ CofJ4-16-GCN4が０．０６８％であった。
この結果から、CofJ4-16-GCN4が濃度依存的にＨＢ１０１ｃｏｆのＣａｃｏ２細胞に対する定着を阻害することが明らかとなった。
Claims (4)
- ＩＶｂ型線毛のマイナーピリンに結合可能なアミノ酸配列を有する第１ドメインと、
前記第１ドメインにリンカー配列を介して接続され、多量体化が可能なアミノ酸配列を有する第２ドメインとを含み、
前記第１ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を有し、
前記第２ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列、又は配列番号７若しくは配列番号８のアミノ酸配列の４〜１０回の繰り返し配列を有することを特徴とするペプチド。 - 前記第１ドメインは、配列番号２３の配列を有することを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
- 前記リンカー配列は、配列番号９であることを特徴とする請求項１又は２に記載のペプチド。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチドを含む病原性細菌の消化器への定着阻害剤。
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