JP2002538767A - 樹状細胞およびｂ細胞の遺伝子組換えによる免疫調節 - Google Patents

樹状細胞およびｂ細胞の遺伝子組換えによる免疫調節

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Abstract

(57)【要約】 免疫系の中心となる樹状細胞およびＢ細胞の遺伝子組換え細胞を作成するために、遺伝子送達ベクターを用いる。結果として、免疫を調節するために、その表面上にCD40標的抗原を有する細胞の遺伝子組換えを用いることができる。これまでは、樹状細胞およびＢ細胞は遺伝子導入に対して抵抗を示した。本発明は、それら細胞型に対する遺伝子導入の劇的な増強を仲介するために働く。遺伝子導入と同時に、この中に記載のベクター系は、樹状細胞およびＢ細胞をより強力な免疫調節状態に成熟化する。本発明は、樹状細胞およびＢ細胞の遺伝子操作のための技術を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景関連出願の説明 本出願は、米国特許法第119条（ｅ）の元で、1998年９月29日に出願され、現
在放棄されている、米国仮特許出願第60/102,257号の優先権を主張する。
【０００２】連邦政府資金援助 本発明は、部分的に、国立衛生研究所からの助成CA74242による資金を用いて
得られた。結果的に、連邦政府が本発明において特定の権利を有する。
【０００３】発明の分野 本発明は、概して、免疫学およびアデノウィルス遺伝子治療に関する。より詳
細には、本発明は、樹状細胞およびＢ細胞の遺伝子組換えによる免疫調節に関す
る。
【０００４】関連技術 樹状細胞(DC)が免疫系において重要な役割を果たすことは、多くの証拠によっ
て示唆されている(Bancheareau, J. and R.M. Steinman, 1998, Dendric cells
and the control of immunity. Nature, 392: 245)。まず、樹状細胞は、T細胞
に基づく免疫の重要なメディエーターとして働くことが認識されている。その重
要な機能から、多くの臨床的戦略、特にワクチン接種において、樹状細胞の利用
が提案されてきた。樹状細胞の遺伝子組換えが感染性病原体および発ガン性病原
体の両方に対する免疫を高め得ることが明らかになってきた(Reeves, M. E., et
al. 1996, Retroviral transduction of human dendritic cells with a tumor
-associated antigen gene, Cancer Res. 56: 5672-7)。重要なこととして、全
てのそれら戦略は、樹状細胞への遺伝子の送達のための効率的なベクターに基づ
いて述べられている。本目的のため、通常、遺伝子導入の効率が低いにもかかわ
らず、多くのやり方が利用されてきた(Arthur, J. F., et al. 1997, A compari
son of gene transfer methods in human dendritic cells, Cancer Gene Ther.
4: 17-25; Van Tendeloo, V.F.I., et al. 1998, Nonviral transfection of d
istinct types of human dendritic cells: high-efficiency gene transfer by
electroporation into hematopoetic progenitor- but not monocyte-derived
dendritic cells, Gene Ther. ５: 700-７)。１つの候補は、複製欠損アデノウ
ィルスベクターであった。本ベクターは、その高い力価、効率的な遺伝子送達、
および豊富な遺伝子発現のおかげで、臨床応用によく適していると推奨されてき
た。
【０００５】 それら理論上の利点にもかかわらず、樹状細胞のアデノウィルスベクター感染
に対する抵抗によって、遺伝子に基づく免疫療法の戦略の完全な恩恵を得ること
が妨げられた (Arthur, J. F., et al. 1997, A comparison of gene transfer
methods in human dendritic cells, Cancer Gene Ther. 4: 17-25; Dietz, A.
B. and S. Vuk-Pavlovic, 1998, High efficiency adenovirus-mediated gene t
ransfer to human dendritic cells, Blood, 91: 392-8)。アデノウィルス介在
遺伝子導入に対する樹状細胞の抵抗現象は、アデノウィルス侵入受容体の不足に
基づくであろう。許容性細胞において、アデノウィルスの突き出たファイバー−
ノブ(fiber-knob)タンパク質が、細胞表面のコクサッキー−アデノウィルス受容
体(CAR)への結合を仲介しており、αvβ３またはαvβ５インテグリンの何れか
によるビリオンとの相互作用およびビリオンの内部化がそれに続く(Wickham, T.
J., et al. 1993, Integrins αvβ３ and αvβ５ promote adenovirus inter
nalization but not virus attachment. 73: 309-19; Bergelson, J. M., et al
. 1997, Isolation of a common receptor for Coxsackie B viruses and adeno
viruses 2 and 5, Science, 275: 1320-3)。本分析は、CARは存在しないが、αv
β５インテグリンが適切に発現していることを表した。細胞受容体の代用となる
二重特性な構成要素によって標的化されたアデノウィルスによる、CAR発現に依
存しない高い効率の遺伝子導入が以前報告されている。樹状細胞上に発現された
マーカーCD40を標的とする類似の戦略が樹状細胞への遺伝子導入を増強し得るこ
とを前提とした。
【０００６】 樹状細胞の受容体CD40に対して親和性を有するモノクロナール抗体に抗ファイ
バー−ノブモノクロナール中和抗体を化学的に結合させることによって、二重特
性抗体を作成した。本発明は、その二重特性抗体と複合体を形成したアデノウィ
ルスが、単球由来樹状細胞に対する遺伝子導入の劇的な増強を仲介することを示
す。さらに重要なこととして、CD40標的化 (CD40-targetted) ベクターを感染さ
せた後、いくつかの樹状細胞成熟マーカーの上向き調節および同種MLR(allo-MLR
)能力の増強が観察されており、ベクター自体が成熟化特性を有することを示唆
する。
【０００７】 従って、従来技術は、免疫調節の目的で樹状細胞およびＢ細胞に形質導入する
方法を欠いている。本発明は、本分野における長年の必要性および要求を実現す
る。
【０００８】 発明の概要 アデノウィルスのファイバー−ノブに対して親和性を有する抗体と樹状細胞の
受容体CD40に対して親和性を有する抗体とを化学的に結合させることによって、
二重特性抗体を作成した。本発明は、CD40標的化アデノウィルスが、単球由来樹
状細胞に対する遺伝子導入の劇的な増強を仲介すること、ならびにその増強が、
形質導入された細胞数の量的増加をもたらすことを示す。さらに、本発明は、そ
の増強が元のモノクロナール抗体G28.5によってうまく阻害され、およびその結
合体がCD40陰性細胞株における遺伝子導入を仲介できないことから、その増強が
G28.5抗体によって認識されるエピトープに対して特異的であることを示す。さ
らには、標的化ベクターを感染させた後、いくつかの十分証明された樹状細胞成
熟マーカーの上向き調節およびそのような細胞による増強された同種MLRが観察
された。代用のアデノウィルス受容体としておよび樹状細胞の成熟化の強力な誘
因としての、本筋書きにおけるCD40の二重の役割は、免疫系におけるこの重要な
細胞型に対する標的化戦略として好都合であることが分かるであろう。
【０００９】 本発明の１つの目的は、樹状細胞およびＢ細胞のような免疫細胞を標的とし、
それら細胞に形質導入させ得るアデノウィルスベクターを提供することにあり、
Ｂ細胞の形質導入は結果的にＢ細胞の成熟化をもたらす。
【００１０】 本発明の１つの実施形態において：アデノウィルスベクター；ならびにCD40抗
原を認識する抗体またはその断片に結合したアデノウィルスのファイバー−ノブ
タンパク質を認識する抗体またはその断片を含む二重特性抗体：を含む免疫調節
アデノウィルスを提供しており、そのアデノウィルスは、免疫細胞を標的として
、その細胞に形質導入し、結果的にその細胞を調節する。さらには、二重特性抗
体は、遺伝子融合の産物であって差し支えない。
【００１１】 さらに別の実施形態において、CD40を認識する抗体またはその断片をコードす
る遺伝子あるいはCD40の天然リガンドである三量体のCD40リガンドをコードする
遺伝子によって、ファイバー−ノブタンパク質をコードするアデノウィルス遺伝
子が置換されている組換えアデノウィルスベクターを含む免疫調節アデノウィル
スを提供する。そのアデノウィルスは、免疫細胞を標的として、その細胞に形質
導入し、その形質導入が結果的にその細胞の調節をもたらす。
【００１２】 本発明のさらに別の実施形態において、アデノウィルスベクターは、腫瘍抗原
をコードする遺伝子、病原菌の抗原をコードする遺伝子、細胞傷害性物質をコー
ドする遺伝子、ならびに免疫調節物質をコードする遺伝子より成る群から選択さ
れる治療遺伝子を発現していて差し支えなく；CD40抗原を認識する抗体はG28.5
であり；免疫細胞は樹状細胞およびＢ細胞より成る群から選択され、ならびに非
免疫細胞は血管内皮細胞、上皮細胞、慢性炎症を示す細胞、およびカポジ肉腫の
細胞と血管より成る群から選択され；さらに免疫細胞の成熟化は免疫細胞の調節
を示唆する。
【００１３】 さらに別の実施形態において、個体に免疫調節アデノウィルスを投与する処置
を含む、免疫調節を必要とする個体における免疫調節の方法を提供しており、そ
の際、アデノウィルスがその個体において免疫反応を調節する。その調節は、ア
デノウィルスによる治療遺伝子の発現および／または免疫細胞の変異によって生
じる。免疫細胞は、樹状細胞およびＢ細胞より成る群から選択され、ならびに非
免疫細胞は血管内皮細胞、上皮細胞、慢性炎症を示す細胞、およびカポジ肉腫の
細胞と血管より成る群から選択される。通常、その方法は、癌、感染症、同種移
植拒絶、異種移植拒絶、自己免疫疾患のような疾患を有する個体を治療するのに
有用であろう。さらには、免疫調節アデノウィルスの投与は、全身投与、皮内投
与、ex vivoより成る群から選択される。本発明の他のおよび別の態様、特徴、
および利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の記載から明らかになるであろ
う。
【００１４】 図面の簡単な説明 本発明の上記の特徴、利点、および目的、ならびに明白となるであろう他のも
のが達成されおよび詳細に理解され得るように添付図面において示されている特
定の実施形態を参照することによって、上記において簡単に概説された本発明の
より詳細な説明が得られる。
【００１５】 図１は、Fab−抗CD40によって標的化されたアデノウィルスが増強された量のC
D40特異的遺伝子導入を仲介することを示す。結合していない抗CD40モノクロナ
ール抗体の存在下または非存在下においてプレインキュベートした単球由来樹状
細胞（図１Ａ）または神経膠腫細胞株D65（図１Ｂ）にAdCMVLucを単独で、ある
いはFab−抗CD40と複合体を形成したAdCMVLucを感染させた。24時間インキュベ
ートした後、ルシフェラーゼの発現について細胞を評価した。
【００１６】 図２は、CD40に対するアデノウィルスの標的化が、所定のレベルの遺伝子発現
を達成するのに必要であるウィルスのMOIを減らすことを示す。Fab−抗CD40結合
体の存在下または非存在下においてウィルスを短時間インキュベートし、続いて
、感染多重度(MOI)1000、100、10、および１に相当するように慎重にウィルスを
希釈した。単球由来樹状細胞に感染させて、24時間後に、ルシフェラーゼの発現
について細胞を測定した。
【００１７】 図３は、CD40標的化アデノウィルス、β１インテグリン標的化アデノウィルス
、およびリポソーム標的化アデノウィルスが、単球由来樹状細胞への類似の遺伝
子導入を仲介することを示す。PBS、Fab−抗CD40結合体、Fab−抗β１インテグ
リン結合体、Fab−抗EGFR結合体、またはリポソームの中の１つと共にプレイン
キュベートしたグリーン蛍光タンパク質(GFP)をコードするアデノウィルスを単
球由来樹状細胞に感染させた。37℃で24時間インキュベートした後、フローサイ
トメトリーを用いて、GFPの発現について評価し、10,000細胞の分析に基づいてG
FP陽性細胞の割合（％）として示している。
【００１８】 図４は、CD40標的化が、樹状細胞成熟マーカーの発現を仲介することを示す。
指示した条件、すなわちウィルス／結合体、または結合体単独と共に、細胞を処
理し、さらに24時間インキュベートした。示された試料は、フローサイトメトリ
ーによって、CD83、HLA−DR、HLA−DQ、CD86およびCD54の発現を示唆する。
【００１９】 図５は、抗CD40抗体またはFab−抗CD40結合体で処理した後、IL−12の産生が
増強されることを示す。指示した標的化アデノウィルスと共に、あるいはアデノ
ウィルスの非存在下において結合していない抗CD40抗体またはFab−抗CD40結合
体と共に、単球由来樹状細胞を処理した。48時間後、樹状細胞成熟マーカーIL−
12の産生について、ELISAによって上清を評価した。注目すべきこととして、8ng
未満の値は、本測定法による検出の線形範囲を超える。
【００２０】 図６は、CD40に対する標的化が、同種混合リンパ球反応(allo-Mixed Lymphocy
te Reaction)を形成する能力の増強を仲介することを示す。指示する条件で単球
由来樹状細胞を処理し、さらに指示した応答細胞／刺激細胞の比(R:S)で、非接
着性リンパ球応答細胞と共に混合した。続いて、細胞を3H標識し、３日後細胞に
結合している放射能(cpm)を評価した。
【００２１】 図７は、初期Ｂ細胞(primary B cell)がCAR（図７Ａ）およびαvβ５インテグ
リン（図７Ｂ）を欠いていることを示す。アデノウィルスは受容体を介して細胞
に侵入する。抗CARモノクロナール抗体RmcBおよび抗αvβ５特異的モノクロナー
ル抗体P1F6を用いて、細胞をFACS分析した（αvβ３はαvβ５に類似する）。
【００２２】 図８はFab−抗CD40またはFab−抗β１インテグリンによって標的化されたアデ
ノウィルスが初期の正常なＢ細胞への増強された量の遺伝子導入を仲介すること
を示す。精製した初期Ｂ細胞に、AdCMVLuc単独、あるいは以下に指示したFab、F
ab−抗CD40、またはFab−抗β１インテグリンと複合体を形成したAdCMVLucを感
染させた。24時間インキュベートした後、ルシフェラーゼの発現について細胞を
評価した。
【００２３】 図９は、自然状態において、樹状細胞の活性化が、樹状細胞を成熟化し得るヘ
ルパーT細胞上に発現しているCD40リガンドによって仲介され、そのような樹状
細胞が適切に細胞傷害性T細胞(CTL)を刺激し得ることを示す。
【００２４】 図１０は、CD40標的化アデノウィルスが、樹状細胞の成熟化につながるCD40の
活性化を介してCD4+ヘルパーT細胞の機能の代用となり得ることを示す。従って
、CD40標的化アデノウィルスは、ヘルパーT細胞の働き無しに、CTL反応を刺激し
得る。
【００２５】 発明の詳細な説明 多くの研究が、遺伝子組換え樹状細胞の重要な結果を強調している。それらの
中で、樹状細胞への効率的な遺伝子導入を達成するためのベクターが多くの免疫
調節戦略に勝っており、別の最近のベクター系は低い遺伝子導入効率に苦しんで
いる。アデノウィルス(Ad)は、樹状細胞への形質導入と関連して用いられてきた
が、その遺伝子送達の効率は部分最適であることが分かっている。二重特性抗体
を用いることにより、樹状細胞上に広く発現しているマーカCD40に対するアデノ
ウィルスの標的化による単球由来樹状細胞への増強された遺伝子導入について、
本発明はうまく実証している。CD40標的化ウィルスは、非標的化ウィルス(untar
geted virus)に比べて、遺伝子導入において劇的な量的改善を示した。元のモノ
クロナール抗体によってうまく阻害され、ならびにCD40陰性細胞への遺伝子導入
は改善しないことから明らかであるように、その遺伝子導入はCD40に特異的であ
ることが証明されている。そのような特徴によって、所定のレベルの形質導入の
ために必要なウィルスの量を減らし得ることが予測され、従って、ベクターに関
連する毒性を軽減し、かつ異所性遺伝子送達を減らすことが期待されるであろう
。
【００２６】 本系の新規性の基本は、単球由来樹状細胞の免疫学的状態を調節するベクター
自体の能力にある。表現型としてはCD83、MHC、および補助的刺激分子の上昇し
た発現によって、ならびに機能的には混合リンパ球反応（MLR）における増強さ
れたアロ刺激能力(allostimulatory capacity)によって示されるように、そのベ
クターは樹状細胞の成熟を誘導する。そのベクターを他のアデノウィルスに基づ
く遺伝子導入ベクターと比較すると、観察される樹状細胞に対する顕著な効果は
CD40に対して特異的であることが明らかになった。本ベクターは、高い効率の遺
伝子導入ベクターとして働くのみならず、遺伝子送達に続く樹状細胞の成熟化を
促進させるための補足のステップの必要性を回避できる。
【００２７】 本発明は、樹状細胞およびＢ細胞のCD40細胞表面抗原を標的とするアデノウィ
ルスベクターに関する。本発明は、さらに、標的化アデノウィルスベクターを用
いて樹状細胞およびＢ細胞に形質導入する方法に関する。本発明はまた、本発明
の標的化アデノウィルスベクターによる形質導入に続いて樹状細胞およびＢ細胞
を成熟化させる方法に関する。
【００２８】 本発明に基づき、従来の分子生物学、微生物学、および慣用技術である組換え
DNA技術を用いて差し支えない。そのような技術は、文献において完全に説明さ
れている。例えば、Sambrook, Fritsch ＆Maniatis, “Molecular Cloning: A L
aboratory Manual (1982); “DNA Cloning: A Practical Approach”, Volumes
I and II(D.N. Glover ed. 1985); “Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait
ed. 1984); “Nucleic Acid Hybridization” (B.D.Hames ＆ S.J. Higgins ed
s. (1985)); “Transcription and Translation” (B.D. Hames ＆ S.J. Higgin
s eds. (1984)); “Animal Cell Culture” (R.I. Freshney, ed. (1986)); “I
mmobilized Cell And Enzymes” (IRL Press, (1986)); B. Perbal, “A Practi
cal Guide To Molecular Cloning” (1984)を参照。従って、この中で出てきた
場合は、以下の用語は以下に記載の定義を有する。
【００２９】 「DNA分子」とは、１本鎖構造、または２本鎖らせん構造のデオキシリボヌク
レオチド（アデニン、グアニン、チミン、シトシン）の重合体を称する。その用
語は、その分子の１次および２次構造のみを示し、特定の３次構造に限定しない
。従って、その用語は、特に、直線DNA分子（例えば制限断片）、ウィルス、プ
ラスミド、および染色体において見出される２本鎖DNAを含む。その構造を検討
する際に、DNAの転写されないストランド（すなわち、mRNAに相同の配列を有す
るストランド）に沿った５’から３’方向の配列のみを与える通常の慣例に従う
。
【００３０】 「ベクター」とは、別のDNA断片を結合して、その結合した断片の複製を生じ
得るプラスミド、ファージ、またはコスミドのようなレプリコンである。「レプ
リコン」とは、in vivoでDNA複製の自立的単位として機能する：すなわちそれぞ
れの制御下で複製が可能である：任意の遺伝子要素(例えば、プラスミド、染色
体、ウィルス)である。「複製起点」とは、DNA合成を開始するDNA配列を称する
。「発現制御配列」とは、別のDNA配列の転写および翻訳を制御および調節するD
NA配列を称する。コード配列は、RNAポリメラーゼがコード配列をｍRNA（さらに
コード配列によってコードされるタンパク質に翻訳される）に転写する際に、細
胞において転写および翻訳の制御配列に「動作可能に連結」しており、かつそれ
らの「制御下」にある。
【００３１】 通常、挿入されたDNA断片の効率的な転写および翻訳を促進させるプロモータ
ーを包含する発現ベクターを宿主と組み合わせて用いる。発現ベクターは、通常
、複製起点、プロモーター、ターミネーター、並びに形質転換された細胞におい
て表現型の選択をもたらし得る特定の遺伝子を包含する。最適な細胞増殖を達成
するための当業界で公知の手段に基づき、形質転換宿主を発酵させ、および培養
して差し支えない。
【００３２】 DNA「コード配列」とは、適切な制御配列の支配下に置いた場合に、in vivoで
転写され、およびポリペプチドに翻訳される２本鎖DNA配列である。コード配列
の境界は、５’（アミノ）末端にある開始コドンおよび３’（カルボキシル）末
端にある翻訳終止コドンによって特定される。コード配列として、それらに限定
はされないが、原核細胞の配列、真核細胞mRNA由来のcDNA、真核細胞（例えば哺
乳類）DNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列が挙げられる。ポリアデニ
ル酸化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード配列の３’側に位置するで
あろう。「cDNA」は、コピーDNAまたは相補的DNAとして定義され、mRNA転写物か
らの逆転写反応産物である。「エキソン」とは、遺伝子座から転写され、かつ発
現される配列であり、一方、「イントロン」とは、遺伝子座から転写されるが発
現されない配列である。
【００３３】 転写および翻訳制御配列とは、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル酸
化シグナル、ターミネーター等のようなDNA制御配列であり、それらは宿主細胞
においてコード配列の発現をもたらす。ヌクレオチド配列における「シス要素」
は、「共通配列」または「モチーフ」とも称するが、特定遺伝子座の発現を上向
き制御または下向き制御し得る他のタンパク質と相互作用する。「シグナル配列
」も、コード配列と共に含まれていて差し支えない。その配列は、宿主細胞に伝
達して適切な細胞の場所にポリペプチドを指向させる、ポリペプチドのB末端に
あるシグナルペプチドをコードする。シグナル配列は、原核細胞および真核細胞
に本来存在する種々のタンパク質と関連して発見され得る。
【００３４】 「プロモーター配列」とは、細胞においてRNAポリメラーゼに結合し、下流域
（３’方向）のコード配列を転写し得るDNA調節領域である。本発明を明示する
目的において、プロモーター配列は、その３’末端において転写開始位置と結合
し、バックグラウンドを超える検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な
最少数の塩基または要素を含むように上流（５’方向）に延長している。プロモ
ーター配列内に、転写開始位置、ならびにRNAポリメラーゼの結合を担うタンパ
ク結合領域（共通配列）が見出されるであろう。真核細胞のプロモーターは、必
ずではないが、「TATA」ボックスおよび「CAT」ボックスを包含することが多い
。真核細胞のプロモーターは、−10位および−35位の共通配列に加えて、シャイ
ン・ダルガーノ配列を包含する。
【００３５】 「オリゴヌクレオチド」の用語は、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド、好
ましくは３つより多くのデオキシリボヌクレオチドを含む分子として定義される
。その正確なサイズは、最終的な機能および使用するオリゴヌクレオチドによっ
て定まる多くの因子に依存するであろう。この中で用いられている「プライマー
」の用語は、精製された制限酵素による消化等によって生じた天然物であるか、
あるいは合成によって作成されたかに関わらず、核酸ストランドに相補的である
プライマー延長産物の合成が誘導されるような条件下、すなわち、適切な温度お
よびpHで、ヌクレオチド、およびDNAポリメラーゼのような誘導物質の存在下に
置かれた場合に、合成開始点として作用し得るオリゴヌクレオチドを称する。プ
ライマーは、１本鎖または２本鎖のどちらであっても差し支えなく、誘導物質の
存在下において、所望の延長産物の合成を準備するために十分長くなければなら
ない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの起源、および使用する方
法等の多くの因子に依存する。例えば、診断的用途のためのプライマーの長さは
、標的配列の複雑さに依存し、オリゴヌクレオチドプライマーは、通常、15−25
以上のヌクレオチドを包含するが、それより少ないヌクレオチドを含んでいても
差し支えない。
【００３６】 特定の標的DNA配列の異なるストランドに対して「実質的に」相補的であるよ
うにプライマーを選択する。このことは、それぞれのストランドとハイブリダイ
ズするように、プライマーが十分相補的でなければならないことを意味する。従
って、プライマー配列は、鋳型の正確な配列を反映する必要は無い。例えば、プ
ライマー配列の残りの部分がストランドに相補的であるように、非相補的ヌクレ
オチド断片をプライマーの５’末端に結合させて差し支えない。あるいは、非相
補的塩基またはより長い配列をプライマーに散在させて、そのストランドに十分
相補的を有しまたはそのストランドにハイブリダイズするプライマー配列を提供
し、従って延長産物の合成のための鋳型を形成して差し支えない。
【００３７】 この中で用いられているように、「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵
素」の用語は、特定ヌクレオチド配列で、またはその近くで、２本鎖DNAを切断
する酵素を称する。
【００３８】 「組換えDNA技術」とは、通常、異なる生物由来のDNAのin vitroでの連結の結
果として２つの異種DNA分子を結合させる技術を称する。組換えDNA分子は、通常
、遺伝子工学における実験によって産生される。同義語として、「遺伝子スプラ
イシング」、「分子クローニング」、および「遺伝子工学」が挙げられる。その
ような操作の産物が、「組換え体」または「組換え分子」となる。
【００３９】 そのようなDNAが細胞内に導入された場合に、細胞は、外因性または異種のDNA
で「形質転換」され、「トランスフェクト」され、あるいは「形質導入」される
。形質転換DNAが細胞のゲノム中に一体化しても（共有結合する）しなくても差
し支えない。例えば、原核細胞、酵母細胞、および哺乳類細胞において、形質転
換DNAはベクターまたはプラスミドのようなエピソーム的要素上に維持されてい
て差し支えない。真核細胞に関して、安定に形質転換された細胞は、形質転換DN
Aが染色体中に一体化して染色体の複製によって娘細胞に遺伝するような細胞で
ある。その安定性は、真核細胞が形質転換DNAを包含する娘細胞の集団を含む細
胞株またはクローンを確立する能力によって示される。「クローン」とは、有糸
分裂によって単一の細胞または祖先から派生した細胞の集団である。「細胞株」
とは、多くの世代に亘り、in vitroで安定に成長し得る初代細胞のクローンを称
する。外来DNAで形質転換された植物または動物のような生物は、「トランスジ
ェニック」と称する。この中で用いられているように、「宿主」の用語は、原核
細胞のみならず、酵母、植物、および動物細胞のような真核細胞も含むことを意
味する。当業者に周知の任意の技術を用いて、宿主を形質転換させるために組換
えDNA分子または遺伝子を用いることができる。１つの好ましい実施形態は、原
核細胞の形質転換の目的におけるベクターの使用である。原核細胞宿主として、
大腸菌、ネズミチフス菌、セレイシア・マルセッセンス、および枯草菌が挙げら
れる。真核細胞宿主として、ピッキア・パストリス(Pichia pastoris)のような
酵母、哺乳類細胞、および昆虫細胞、さらに好ましくはアラビドプシス・タリア
ナ(Arabidopsis thaliana)およびトバキュム・ニコチアナ(Tobaccum nicotiana)
のような植物細胞が挙げられる。
【００４０】 約75％以上（好ましくは約80％以上、さらに最も好ましくは約90％または95％
以上）のヌクレオチドが、定義された長さのDNA配列に亘って一致する場合には
、２つのDNA配列は「実質的に相同」である。配列データバンクにおいて利用で
きる標準のソフトウェアを用いて配列を比較することによって、あるいは、例え
ばその特定の系のために定められたようなストリンジェントな条件下におけるサ
ザンハイブリダイゼーション実験において、実質的に相同である配列を同定でき
る。適切なハイブリダイゼーション条件を特定することは、慣用技術の範囲内で
ある。例えば、Maniatis et al., supra; DNA Cloning, Vols. I＆II, supra; N
ucleic Acid Hybridization, supraを参照。
【００４１】 「DNA構造のヘテロ領域」とは、大きなDNA分子内の同定可能なDNAの断片であ
って、天然においては、その大きなDNA分子と関連して見出されていないもので
ある。従って、そのヘテロ領域が哺乳類遺伝子をコードする場合、通常、由来す
る生物のゲノムにおいてその哺乳類ゲノムDNAに隣接していないDNAが、その哺乳
類遺伝子に隣接するであろう。別の例示において、コード配列は、そのコード配
列自体が天然では見出されない構造である（例えば、ゲノムコード配列がイント
ロン、または天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列を包含するcDNA）。
対立遺伝子の変異または自然に生じる突然変異は、この中で定義したようなDNA
のヘテロ領域を生じさせない。
【００４２】 この中で用いられているように、抗体に適用する「断片」とは、通常、10残基
以上、より一般的には20残基以上、さらに好ましくは30残基以上（例えば50残基
）の長さであるが、全体の完全な配列よりは短い。例えば、天然の抗体または組
換え抗体の酵素的消化、抗体の特定の断片をコードする発現ベクターを用いる組
換えDNA技術、あるいは化学的合成等、当業者に公知の方法によって、抗体断片
を作成することができる。候補断片が抗原への結合を示す能力は、この中に記載
の方法によって評価できる。
【００４３】 当業者に公知の従来のノーザンハイブリダイゼーション技術に基づいて、植物
または他のトランスジェニック組織から得られた細胞または組織におけるmRNAの
相対量を確かめるために、標準的ノーザンブロット法を用いて差し支えない。あ
るいは、当業者に公知のサザンハイブリダイゼーション技術に基づいて、トラン
スジェニック系における遺伝子の存在およびそのコピー数を確認するために、標
準的サザンブロット法を用いて差し支えない。ノーザンブロットおよびサザンブ
ロットは共に、例えば放射能標識したcDNA、あるいは20以上（好ましくは30以上
、より好ましくは50以上、および最も好ましくは100以上）の長さの連続的ヌク
レオチドであるそのDNA配列の断片のようなハイブリダイゼーションプローブを
用いる。当業者に公知である任意の多くの異なる方法によって、DNAハイブリダ
イゼーションプローブを標識して差し支えない。
【００４４】 そのような研究のために最も一般的に用いられる標識は、放射性元素、酵素、
紫外線に曝した場合に蛍光を発する化学物質である。多くの蛍光物質が公知であ
り、標識として利用できる。そのような蛍光物質として、例えば、フルオレセイ
ン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、AMCAブルー、およびルシファー
(Lucifer)イエローが挙げられる。特定の検出用試薬は、ヤギにおいて調製され
、イソチオシアネートを介してフルオレセインに結合させた抗ウサギ抗体である
。放射性元素または酵素でタンパク質を標識して差し支えない。任意の一般的に
利用できる計数手段によって、放射能標識を検出することができる。3H、14C、3 2 P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、および186Reから
好ましい同位体を選択して差し支えない。
【００４５】 酵素標識も同様に有用であり、現在利用されている任意の比色分析技術、分光
光度技術、蛍光分光光度技術、電流滴定技術、またはガス計量技術によって検出
できる。カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒド等のような結
合分子との反応によって、酵素を選択された粒子に結合させる。そのような方法
において用い得る多くの酵素が公知であり、かつ利用できる。好ましい酵素は、
ペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−D−グルコシダーゼ、β−D−ガ
ラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ+ペルオキシダーゼ、お
よびアルカリホスファターゼである。別の標識物質および方法の開示の例示とし
て、米国特許第3,654,090号、第3,850,752号、および第4,016,043号を参照する
。
【００４６】 この中で用いられているように、「免疫調節」の用語は、癌、病原菌、自己免
疫抗原、あるいは同種／異種移植に対する免疫を促進または抑制する能力を称す
る。
【００４７】 この中で用いられているように、「成熟化」の用語は、免疫細胞に関する場合
は、特定の表面マーカーの発現、特定の可溶性因子の産生、または混合リンパ球
反応における増強された能力を示し、それらの全てはT細胞のようなエフェクタ
ー細胞からの反応を誘導する能力においてより効果的となった細胞の特徴として
知られている。
【００４８】 この中で用いられているように、「CD40抗原」は、TNF受容体(TNFR)ファミリ
ーの一員を称するものとする。CD40は、CD40リガンド(gp39)の受容体として働く
。CD40は、Bリンパ球、単球、樹状細胞、内皮細胞、上皮細胞、および線維芽細
胞上に発現していることが知られている。注目すべきこととして、その分子は、
活性化された内皮細胞（慢性炎症のような）の領域、およびカポジ肉腫の血管に
おいて、特に広く発現していることが知られている。
【００４９】 本発明の新規なアデノウィルスベクターを用いて、薬剤組成物を調製すること
を特に考えている。その場合、その薬剤組成物は本発明の新規なアデノウィルス
ベクターおよび薬剤的に許容される担体を含む。当業者は、過度の実験無しに、
本発明のアデノウィルスベクターの適切な用量および投与経路を容易に特定でき
るであろう。治療のためにin vivoで用いる場合、例えば免疫調節効果によって
全身腫瘍組織量を除去または軽減するような治療的効果量で、患者または動物に
本発明のアデノウィルスベクターを投与する。それは、通常、非経口的に、好ま
しくは静脈内に投与されるが、適切であれば別の投与経路を用いる。用量および
投薬計画は、病気の性質およびその患者数、例えば治療指数のような特定ベクタ
ーの特性、患者、病歴、および他の因子に依存する。通常、患者の体重当たり約
0.001から約500mg/kgの範囲で、本発明のアデノウィルスベクターを投与する。
治療の悪影響とバランスをとりながら、計画を延長して、効果を最適化する。Re
mington’s Pharmaceutical Science, 17th Ed. (1990) Mark Publishing Co. E
aston, Penn,; and Goodman and Gilman’s: The Pharmacological Basis of Th
erapeutics 8th Ed (1990) Pergamon Press を参照。
【００５０】 非経口投与のためには、薬剤的に許容される非経口媒体と組み合わせて、単位
用量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）にアデノウィルスベクタ
ーを製剤化するのが最も一般的である。そのような媒体は、好ましくは毒性が無
く、かつ非治療的である。そのような媒体の例は、水、生理食塩水、リンガー溶
液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。非揮発性油お
よびオレイン酸エチルのような非水媒体を用いても差し支えない。担体としてリ
ポソームを用いても差し支えない。そのような媒体は、例えば緩衝剤および保存
剤等の等張性および化学的安定性を強化する物質のような微量の添加剤を含んで
いて差し支えない。通常、約0.001mg/mlから500mg/mlの濃度で、そのような媒体
中にアデノウィルスベクターを製剤化する。
【００５１】 従って、本発明は、免疫細胞の遺伝子操作のための遺伝子送達系に関するもの
であり：(a)アデノウィルス；および(b)CD40抗原を認識する成分を含む。好まし
くは、CD40抗原を認識する成分は、アデノウィルスのファイバー−ノブタンパク
質に結合した三量体のCD40リガンド、およびCD40抗原に対する第２抗体またはそ
の断片と結合しているアデノウィルスのファイバー−ノブタンパク質に対する第
１抗体またはその断片より成る群から選択される。CD40抗原に対する代表的抗体
はG28.5である。
【００５２】 １つの態様において、通常、第１抗体と第２抗体を遺伝子的に融合して差し支
えない。免疫細胞に形質導入し、およびそれら細胞を免疫調節するために、本遺
伝子送達系を用いることができる。さらには、治療遺伝子も含んでいて差し支え
ない。代表的治療遺伝子として、腫瘍抗原をコードする遺伝子、病原菌の抗原を
コードする遺伝子、自己免疫抗原をコードする遺伝子、免疫調節物質をコードす
る遺伝子、ならびに細胞傷害性物質をコードする遺伝子が挙げられる。本系を用
いて形質導入および免疫調節され得る代表的免疫細胞として、樹状細胞およびＢ
細胞が挙げられる。１つの態様において、Ｂ細胞を本系と接触させた後、Ｂ細胞
は成熟化される。
【００５３】 また、本発明は免疫調節を必要とする個体において免疫細胞を遺伝子操作する
方法に関するものであり、上記の遺伝子送達系を個体に投与する処置を含む。本
方法は、その個体が癌、感染症、同種移植拒絶、異種移植拒絶、自己免疫疾患の
ような疾患を有する場合に有用であろう。本系を用いて形質導入および免疫調節
され得る代表的免疫細胞として、樹状細胞およびＢ細胞が挙げられる。１つの態
様において、Ｂ細胞を本系と接触させた後、Ｂ細胞は成熟化される。
【００５４】 また、本発明は、ファイバー−ノブタンパク質をコードするアデノウィルス遺
伝子がCD40抗原を認識するタンパク質をコードする遺伝子で置換されているよう
な、免疫細胞の遺伝子操作のための組換えアデノウィルスベクターに関する。好
ましくは、そのCD40抗原を認識する遺伝子は、三量体CD40リガンドをコードする
遺伝子およびCD40抗原に対する抗体またはその断片をコードする遺伝子より成る
群から選択される。CD40に対する好ましい抗体はG28.5である。免疫細胞に形質
導入し、およびそれら細胞を免疫調節するために、組換えアデノウィルスベクタ
ーを用いて差し支えない。組換えアデノウィルスベクターは、腫瘍抗原をコード
する遺伝子、病原菌の抗原をコードする遺伝子、自己免疫抗原をコードする遺伝
子、免疫調節物質をコードする遺伝子、ならびに細胞傷害性物質をコードする遺
伝子のような治療遺伝子をさらに含んでいて差し支えない。免疫調節を必要とす
る個体において免疫細胞を遺伝子操作する方法において、組換えアデノウィルス
を用いて差し支えない。そのような個体は、癌、感染症、同種移植拒絶、異種移
植拒絶、自己免疫疾患のような疾患を有していて差し支えない。
【００５５】 以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示する目的で与えられており、
いかなる方法においても本発明を限定することを意味しない。
【００５６】実施例１ 単球由来樹上細胞(MoDC)の培養 リンホプレップ(Nycomed AS, Oslo, Norway)による密度勾配遠心沈殿法によっ
て、ヘパリン処理した抹消血から抹消血単核細胞(PBMC)を単離し、さらに単球由
来樹状細胞およびその前駆体のための最適低温保存用培地としてすでに記載され
ている12.5％DMSOおよび25％FCSを補充したRPMI1640中で低温保存した(Makino a
nd Baba)。50U/mLペニシリン−ストレプトマイシン、1.6mM L−グルタミン、0.0
1mMβ−メルカプトエタノール(完全培地)、ならびに10％FCSを含有するイスコー
ブ(Iscove)の修飾ダルベッコ培地中、３−５x106細胞/mlの濃度で、新鮮なまた
は低温保存したPBMCを懸濁させ、さらにプラスチック培養フラスコ(NUNK, Inter
med, Denmark)の底に細胞を接着させた。37℃で２時間インキュベート後、PBSで
洗浄して非接着細胞を除去した。1000U/ml rIL-4(CLB, Amsterdam, The Netherl
ands)および100 ng/mL GM-CSFを補充した10％FCS含有完全培地中、接着細胞をさ
らに６日間培養した。典型的な樹状細胞の形態を有するゆるく接着した細胞を採
取し（PBS中の0.5mM EDTAと共にインキュベートすることによって接着細胞を剥
がした）、さらにFACS分析またはアデノウィルス介在遺伝子導入に用いた。
【００５７】実施例２ 混合リンパ球反応 同種または自家の混合リンパ球反応のために、単球由来樹状細胞を刺激細胞と
して丸底96穴培養プレート(Nunclon Delta, Intermed, Denmark)に段階的に添加
した。応答細胞の供給源として非接着リンパ球画分を用いた。指示された応答細
胞／刺激細胞比(R:S)で、同種または自家の単球由来樹状細胞に、１x105リンパ
球／wellを添加した。10％ヒトプール血清(CLB, Amsterdam, The Netherlands)
を含有する完全培地中、３日間細胞を培養した。最後の18時間は、 [3H]−チミ
ジン(0.4mCi/well)(Amersham, Aylesbury, UK)を加えて培養し、その後細胞をガ
ラス繊維上に採取し、さらに平台液体シンチレーションカウンター(Wallac, Tur
ku, Finland)を用いて、[3H]−チミジンの取込みを特定した。
【００５８】実施例３ 表現型の分析 フルオレセインイソチオシアネート(FITC)またはフィコエリトリン(PE)に直接
結合させたモノクロナール抗体(MoAb)を用いて、細胞染色を実施した。用いた抗
体は、HB15(CD83)、BL6(CD1a)、BU15(CD11c)、MAB89(CD40)(Immunotech, Marsei
lle, France)、SK7(CD3)、4G7(CD19)、B73.1(CD16)、MoP9(CD14)、NCAM 16.2(CD
56)、L243(HLA-DR)、2A3(CD25)(Becton Dickinson, San Jose, CA)、2331(CD86)
、G46-2.6(HLA A,B,C)、HA58(CD54)、およびTU169(HLA-DQ) (Pharmingen, San D
iego, CA)である。Cellquest FACS 解析ソフトウェア(Becton Dickinson)を用い
て、FACStarで試料を分析した。
【００５９】 分析前にアデノウィルスベクターを細胞に感染させた場合、微量ルシフェラー
ゼ分析において用いられる結合体またはウィルスの全ての値が、より多数の感染
細胞に比例して増加した。AdCMVLucを用いて、１x106細胞のバッチで、細胞に感
染させた。洗浄および完全培地の添加後、24時間インキュベートするために細胞
をマイクロ遠心チューブ中に放置すること以外においては、ルシフェラーゼ遺伝
子導入分析に用いられる方法に類似の方法で細胞に感染させた。24時間後、フロ
ーサイトメトリーによって、成熟関連表面マーカーの発現について細胞を評価し
た。
【００６０】実施例４ ウィルスおよび細胞株 Robert Gerard(University of Leuven, Leuven, Beligium)から、CMV極初期プ
ロモーターによってホタルルシフェラーゼを発現している初代E1、E3欠失ベクタ
ー、AdCMVLucを得た。ウィルスを許容細胞株293上で増殖させてプラーク滴定し
、さらにCsCl密度勾配上における二重遠心によって精製した。全てのウィルス水
溶液を使用するまで−80℃で保存した。ヒトコクサッキー／アデノウィルス受容
体に対するマウスモノクロナール抗体RmcB(from Dr. Robert Finberg, Dana Far
ber Cancer Institute)は以前記載されている。αvβ３に対するマウスモノクロ
ナール抗体LM609およびαvβ５インテグリンに対するP1F6は、それぞれ、Chemic
on(Temcula, CA)およびGibco BRL(Gaithersburg, MD)から購入した。アデノウィ
ルス血清型５の受容体結合ドメインのカルボキシ末端に特異的なマウスモノクロ
ナール中和抗体1D6.14は以前記載されている。抗CD40モノクロナール抗体を産生
するハイブリドーマG28.5(ATCC#9110-HB)および、β１インテグリンに対するモ
ノクロナール抗体を産生するTS2/16.2.1(ATCC#243-HB; “TS2”)は、ATCCから購
入した。その両方のハイブリドーマは、SCIDマウスにおいて腹水を作成するため
に用いられた。
【００６１】 HiTrap プロテインAカラム(Pharmacia)およびMAPS結合バッファーシステム(Bio-
Rad)を用いて、FPLCクロマトグラフィーシステムで抗体を精製した。固定化パパ
イン(Pierce)を用いて1D6.14モノクロナール抗体をFabフラグメントに消化し、
さらにHiTripプロテインAカラムを用いて、Fcフラグメントのネガティブセレク
ションによってそのFabフラグメントを精製した。
【００６２】実施例５ 抗体および結合体 1D6.14 Fabフラグメントならびにモノクロナール抗体G28.5およびTS2をホウ酸
緩衝液中、10mg/mLに濃縮した。モノクロナール抗体(mAb)に対するFabの分子比
１：１での化学的結合は、記載されているように実施した(Segal, D. M. and B.
J. E. G. Bast, 1994 Production of bispecific antibodies, Editors: Colog
an, J. E., A. M. Kruisbeek, D. A. Marguiles, E. M. Shevach, W. Strober,
Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, New York, Volume 1
, Sections 2.13.1−2.13.16)。ホウ酸緩衝液pH8.5中、FPLC(Pharmacia, Piscat
away, NJ)を用いて、HR10/30 Superose 12カラムで結合体を精製し、適切な分子
量200kDaである１：１比のFab−抗受容体抗体に相当する画分をプールした。
【００６３】実施例６ アデノウィルス(Ad)感染およびルシフェラーゼ分析のプロトコル 非接着単球由来樹状細胞を採取し、0.5mM EDTA遊離接着細胞画分と混合し、続
いて2.5％FCS含有完全RPMIで洗浄した。50μl中の2.4ｘ104細胞を各試験条件の
ために三重で、個々のマイクロ遠心チューブに分配した。マイクロ遠心チューブ
の使用は、接着および非接着画分の両方に相当する細胞の簡易化された感染およ
び洗浄を可能とした。各試験条件のウィルス当たり10μl以下の最少容量で、室
温で30分間、結合体およびウィルスをインキュベートした。インキュベートに続
いて、各マイクロ遠心チューブの細胞に感染させるために100μLが用いられるよ
うに混合液を希釈した。その容量中のウィルスの量は、感染多重度100に相当す
る。感染混合物を含有するマイクロ遠心チューブを37℃で１時間放置した。続い
て、非結合ウィルスを除去するため、チューブにおいて、PBSで細胞を洗浄し、
遠心し、さらに上清を吸引した。ペレット細胞を10％FCS含有RPMI 1mL中に再懸
濁液させ、ポリリジンをコートした24穴プレートの各ウェルに移し、一晩インキ
ュベートした。ポリリジンコートウェルは、接着画分および懸濁画分の両方をウ
ェル表面に固着させることによって、後のルシフェラーゼ分析におけるより簡単
な処理を可能とした。感染後の24時間のインキュベートに続いて、上清を全ての
ウェルから吸引し、さらにPromega Luciferase測定キットを用いて細胞を処理し
た。詳細には、直接、プレート上で細胞を溶解させ、凍結解凍を１回行った。溶
解物をルシフェラーゼ基質と混合し、すぐにLumat照度計で測定することによっ
て溶解物を分析した。
【００６４】 ブロッキング実験のために、感染前に、元の（非結合の）G28.5モノクロナー
ル抗体で細胞をブロッキングした。以前このモノクロナール抗体のために報告さ
れた迅速な内部化速度に基づき、細胞表面からの受容体の変調を最小にするため
に、全てのブロッキングが４℃で実施された。ブロッキング試薬と共に細胞を30
分間インキュベートした後、最適量のFab−G28.5と複合体を形成したウィルスを
直接細胞に添加し、さらに37℃で30分間インキュベートし、その後洗浄して、24
穴プレートに移した。Fabによるブロッキングをみるために、予め特定された1D6
.14 Fabの中和濃度を超える過剰量と共にウィルスをプレインキュベートした。
これに関しては、指示された条件の結合体をFabに置き換えたに過ぎない。
【００６５】実施例７ 標的化のための結合体の最適量の確認 最適にアデノウィルスを被覆するのに必要である標的化のための結合体の量を
特定するため、MOIが100の予め定めた数のウィルス粒子上で、結合体を滴定し、
その際、単球由来樹状細胞における相対的光度単位(RLU)としてのルシフェラー
ゼ発現の観点から遺伝子導入を測定した。順次増加する濃度のFab−G28.5と共に
プレインキュベートしたAdCMVLucを単球由来樹状細胞に感染させた。結合体：ウ
ィルス比を高めると標的化遺伝子導入の量が減少し、おそらく過剰なFab−G28.5
結合体によるCD40に対する結合への競合から生じるであろうことが明らかとなっ
た。自然対数の1/2ごとの間隔で、0.01ng/wellから2000ng/wellの範囲の所定の
量の結合体を2.4ｘ106ビリオンと共にインキュベートして、その滴定試験を行っ
た。ルシフェラーゼ遺伝子発現の最も高いレベルに相当する結合体の量が「最適
量」と称され、全ての後の実験で用いられた。
【００６６】実施例８ 定量的な遺伝子導入を実証するためのGFP受容体遺伝子 ルシフェラーゼを用いて観察される遺伝子導入が、実際に増加した形質導入細
胞の数に相関することを確認するため、GFP遺伝子を運搬するアデノウィルスを
細胞に感染させた。フローサイトメトリーに基づくマーカー分析を受ける細胞と
同様に、最適比のFab−G28.5結合体と複合体を形成したAdGFPを用いて、単球由
来樹状細胞にバッチ感染させた。感染の24時間後、フローサイトメトリーを用い
て陽性細胞を可視化した。
【００６７】実施例９ CD40標的化アデノウィルスと非標的化アデノウィルス間の差別的MOI分析 異なるMOIのCD40標的化ウィルスと非標的化ウィルスを細胞にバッチ感染させ
た。Fab−G28.5を1000MOIに相当する濃度のAdCMYLucと混合した。MOIが500、100
、50、10、および１になるように、その混合物を慎重に希釈した。標的化試料と
比較するため、標的化のための結合体を含まない、アデノウィルスの同じMOIの
試料を同時に調製した。ルシフェラーゼ遺伝子導入実験において成されたように
、単球由来樹状細胞に感染させ、ルシフェラーゼを分析した。
【００６８】実施例１０ 単球由来樹状細胞の妥当性の確認 末梢血から単離した単球をIL−４およびGM−CFSで処理することによって、単
球由来樹状細胞を調製した。それら細胞の同一性は、２つの方法で確認した。CD
14、CD3、およびCD19の発現を欠くことから、フローサイトメトリーによって純
度を実証した。さらに、その細胞は、多少不明瞭な細胞があるが、樹状細胞表現
型を示し、接着画分および非接着画分の混合物は多細胞の集団に結合した。それ
ら単球由来樹状細胞は、CD83のような樹状細胞成熟マーカーの発現が陰性であり
、従って未成熟であった。
【００６９】実施例１１ 観察された遺伝子導入の増強はCD40に特異的である 最適にアデノウィルスを被覆するのに必要である標的化のための結合体の量を
特定するため、MOIが100の予め定めた数のウィルス粒子上で、結合体を滴定し、
その際、単球由来樹状細胞におけるルシフェラーゼ発現の観点から遺伝子導入を
測定した。順次増加する濃度のFab−G28.5と共にプレインキュベートしたAdCMVL
ucを単球由来樹状細胞に感染させた。CD40標的化遺伝子導入は、Fab−G28.5結合
体−ウィルス比が、2.4ｘ106pfu(OD260で特定して、1.75x108粒子／mL)当たり30
ngのFab−G28.5の場合に最大となった。さらに、結合体：ウィルス比を高めると
、標的化遺伝子導入の量が減少し、その減少はおそらく過剰なFab−G28.5結合体
によるCD40に対する結合への競合から生じるであろうことが明らかとなった。最
適の結合体：ウィルス比において、ルシフェラーゼ受容体遺伝子の発現によって
特定したところ、CD40標的化アデノウィルスは、単球由来樹状細胞への遺伝子導
入を自然対数で２倍に増強した。CD40に対する特異性を検討するためのいくつか
の方法において、その最適量を用いて分析した。
【００７０】 観察された遺伝子導入の増強の根拠として結合体の抗CD40抗体を関連付けるた
め、元の抗CD40抗体G28.5と共に細胞をプレインキュベートした。その方法で細
胞をブロッキングした場合、予想通り標的化遺伝子導入において95％の減少が観
察された。G28.5モノクロナール抗体自体がビリオンとの結合に依存しない増強
されたアデノウィルス遺伝子導入を仲介する可能性を排除するため、非標識化ア
デノウィルスを感染させる前に、非結合G28.5モノクロナール抗体と共に細胞を
プレインキュベートした。G28.5モノクロナール抗体と共に細胞をプレインキュ
ベートすると、遺伝子導入に極わずかな増強をもたらした。
【００７１】 二重特性な結合体が非特異的細胞結合を仲介する（さらに詳細には、樹状細胞
上のFc受容体と二重特性抗体の相互作用によって）可能性を排除するため、樹状
細胞の表面には存在しないマーカー(EGFR)に親和性を有する無関係な結合体を試
験した。無関係な結合体は遺伝子導入の増強を仲介せず、観察されたCD40標的化
の特異性を実証する。ベクターの特異性に関する厳格な試験として、CD40陰性グ
リオーマ細胞株D65においても、上記の条件で試験した。Fab−G28.5による標的
化アデノウィルスがD65において増強された遺伝子発現をもたらさなかったこと
は、CD40に対する本ベクターの特異性をさらに示唆する。
【００７２】実施例１２ 遺伝子導入の増強は、形質導入細胞の数の増加による ルシフェラーゼ遺伝子導入は、CD40標的化アデノウィルスによる遺伝子発現の
全体的な増加を示したが、本測定法の特徴は、増加した数の細胞が実際に形質導
入されたか否かを示唆し得る。標的化の結果として、わずかな形質導入細胞がよ
り豊富な遺伝子発現を示しただけである可能性を排除するため、定量的マーカー
であるグリーン蛍光タンパク質GFPを用いた。フローサイトメトリーを用いて、
形質導入細胞の数をモニターした。非標的化アデノウィルスを感染させた細胞と
比較して、CD40標的化アデノウィルスが量的により多くの細胞に形質導入したこ
とが特定された。β１インテグリン標的化アデノウィルスおよびリポソーム結合
アデノウィルスの２つの他の方法を用いて、同程度のレベルの遺伝子導入を観察
した。今回も、EGFRに対する無関係な結合体を用いた場合、その増強された遺伝
子導入は認められなかった。
【００７３】実施例１３ Fab−G28.5は異なる供与体におけるアデノウィルス介在遺伝子導入を増強し、そ のような標的化は所定のレベルの導入遺伝子発現を達成するのに必要なウィルス の量を減らし得る 異なる量の供与体における本標的化戦略の効果を同時に比較するために、単球
由来樹状細胞上において、いくつかのMOIで、CD40標的化アデノウィルスを非標
的化アデノウィルスと比較した。それらの結果も、所定のMOIの標的化アデノウ
ィルスが、非標的化アデノウィルスの場合100倍高いMOIにおいてのみ認められる
遺伝子導入の量をもたらすことを示唆する。それら結果は、所定のレベルの遺伝
子導入のために、CD40標的化アデノウィルスを用いた場合、細胞当たり有意に少
ない感染性ビリオンが必要であることを強調する。より多くのウィルス量は、よ
り大きい直接的ウィルス介在細胞傷害ならびに強い抗アデノウィルス免疫反応に
関連するため、投与されるウィルス量を減らし得ることはアデノウィルスベクタ
ーの使用に関連する毒性を減らす重要な意味を持つ。
【００７４】実施例１４ CD40標的化アデノウィルスによって形質導入されたMDCCは成熟樹状細胞の表現型 特性および機能特性を示す 強化された遺伝子導入効率を実証した後、表現型および機能的能力に関連する
樹状細胞に対するウィルスの影響を調べた。樹状細胞の成熟化に対する標的化ア
デノウィルスベクターまたは標的化のための結合体単独の影響を特定するため、
フローサイトメトリーを用いていくつかのマーカーを分析した。CD86、CD83、CD
80、ICAM−1、MHC II（HLA-DR,HLA-DQ）、およびMHC Iの発現について、予め24
時間処理した細胞を分析した。アデノウィルスを単独で用いた場合には樹状細胞
の表現型に全く変化は認められなかったが、３つの全ての高い効率のアデノウィ
ルス遺伝子送達系を用いた場合にはCD86、HLA−DR、およびHLA−DQの増強された
発現を含む明白な変化が認められた。Fab−抗CD40結合体またはCD40標的化アデ
ノウィルスの何れかで処理することによってもたらされた独特の特性として、樹
状細胞に最も密接に関連した変化、すなわちCD83およびICAM−1の増強された発
現が挙げられる。
【００７５】 樹状細胞の成熟化のより厳密な指標は、混合リンパ球反応である。いくつかの
ベクターまたは結合体を用いて処理したMDDCを同種供与体由来の応答細胞と混合
し、誘導細胞の増殖を誘導する能力を評価した。アデノウィルス単独ではMLRの
増強を仲介しなかったが、アデノウィルスの存在下または非存在下における任意
の処理は同種MLRにおけるMDDC反応性を劇的に促進させることができた（図６）
。さらには、非結合モノクロナール抗体の効果はアデノウィルスの存在下でFab
−CD40結合体を用いた場合に認められる効果と比較して、有意に低かったが、結
合体単独の効果はウィルスと共に結合体を用いた場合に認められる効果に匹敵し
た。CD40標的化を用いて観察される成熟化効果の１つの可能性のある説明は、ア
デノウィルス粒子の樹状細胞への高い効率の侵入から生じるウィルス介在効果で
あろう。その理由のため、高い効率の代用のアデノウィルスベクターであるβ１
インテグリン標的化アデノウィルスまたはリポソーム結合アデノウィルスを感染
させた樹状細胞もMLRで評価した。それらの代用のベクターが顕著な増強を仲介
できなかったことは、成熟表現型がCD40に関連することを示唆する。
【００７６】 機能的成熟化の別の証拠として、その発現が樹状細胞の成熟化に特徴的である
サイトカインIL−12の産生について、48時間後に、MDDC上清を評価した(Cella,
M, et al. 1996, Ligation of CD40 on dendritic cells triggers production
of high levels of IL-12 and enhances T-cell stimulatory capacity: T-T he
lp via APC activation, J. of Exp. Med. 184: 747-52)（図５）。その結果は
、非結合G28.5モノクロナール抗体で処理した細胞の上清において、IL−12レベ
ルが数倍に劇的に上昇し、さらにFab−抗CD40結合体単独またはCD40標的化アデ
ノウィルスで処理しても上昇した。
【００７７】 非常に多くの臨床的可能性にもかかわらず、遺伝子組換え樹状細胞の広範囲に
わたる応用はいくつかの障害によって妨害されてきた。それらの障害として、ex
vivo形質導入に要求される大規模な操作、現在のベクターによる低い遺伝子導
入効率、および遺伝子導入に続いて樹状細胞を免疫学的に強力な状態に成熟化さ
せる必要性が挙げられる(Bancheareau, J. and R. M Steinman, 1998, Dendriti
c cells and the control of immunity, Nature, 392: 245)。抗原捕獲の過程に
おいて活動的である末梢樹状細胞を「未成熟樹状細胞」と称する。能動的抗原回
収を行うにもかかわらず、それら細胞は細胞傷害性Tリンパ球(CTL)のようなエフ
ェクター細胞を活性化するのに必要である補助的刺激分子およびサイトカインの
適切なパネルを発現しない。従って、未成熟樹状細胞は、CD40活性化によって免
疫学的に強力な「成熟」状態に分化されなければならない(Bennett, S. R. M.,
et al. 1998, Help for cytotoxic-T-cell responses is mediated by CD40 sig
naling, Nature, 393: 478-480; Ridge, J. P.,et al. 1998, A conditioned de
ndritic cell can be a temporal bridge between a CD4+ T-helper and a T-ki
ller cell, Nature, 393: 474-7; Schoenberger, S. P., et al. 1998, Nature,
393: 478-80; Ridge, J. P., et al. 1998, T-cell help for cytotoxic T-lym
phocytes is mediated by cd40-cd40L interactions, 393: 480-3)。この理由の
ため、CD40標的化アデノウィルスベクターが有する樹状細胞の成熟化に対する効
果を評価した。
【００７８】 抗CD40結合体および程度は低いが単量体抗体がウィルスの非存在下において樹
状細胞の成熟化を仲介する能力は、成熟化現象がアデノウィルス非依存的である
ことを明白に示唆する。さらには：CD83およびICAM−1の発現；IL−12の産生；
ならびに抗CD40モノクロナール抗体、Fab−抗CD40結合体、およびCD40標的化ア
デノウィルスによるMDDCの処理によってほとんど単独で観察されるが他の試験さ
れたアデノウィルスベクターでは観察されない改善されたMLR：に基づき、その
成熟化現象がCD40に対する標的化の直接的および特異的結果であることはかなり
確かであるように思われる。
【００７９】 本発明は、CD40標的化アデノウィルス遺伝子送達が遺伝子導入の量の劇的な増
加およびCD40に特異的である成熟化効果を仲介することを示す。結果的に、ex v
ivoにおいて、結合体によって標的化されたアデノウィルスおよびリポソーム結
合アデノウィルスは類似の増強をもたらしたが、CD40標的化アデノウィルスのよ
り細胞特異的な標的化および成熟化能力が、理論的に、in vivoでの試みをより
確かなものとする。
【００８０】 抗CD40モノクロナール抗体またはCD40に基づく結合体を用いた全ての場合にお
いて樹状細胞の成熟化に基づいて増加したCD40発現を報告した以前の研究と際立
って対照的に、FACS分析は24時間後に、表面CD40発現の低下を示した。処理の48
時間後に結合体が細胞表面で検出されたため、残っていた結合体が後のCD40の検
出を分かりにくくした可能性がある。
【００８１】 本発明は、Fab−抗CD結合体が非結合抗CD40モノクロナール抗体を用いた場合
に認められるよりも、MDDCにおいてより劇的なMLR反応性を仲介することを示す
。以前の報告はCD40経路を活性化するための手段としてのCD40架橋に関係してお
り、本系がその抗体の架橋速度論を変化させる２つの手段がこの中で提案されて
いる。第一に、ファイバー−ノブの固有の三量体構造は、12のキャプシド頭部の
それぞれに対して３つまでの結合体分子の結合をもたらす。第二は、Fab：抗CD4
0モノクロナール抗体の比が単純な１：１以外の比であるヘテロダイマーをもた
らし得る化学的架橋法の半無作為(semi-random)的特性である。
【００８２】 要約すれば、アデノウィルスは樹状細胞表現型に対するわずかな効果を仲介す
るが、それら効果は、高い効率の抗体標的化アデノウィルスまたはリポソーム結
合アデノウィルスに基づく遺伝子導入ベクターによる場合のように十分な数の粒
子が各細胞に侵入する場合にのみ認められることは明らかである。β１インテグ
リン標的化アデノウィルスまたはリポソーム結合アデノウィルスを用いた場合に
認められる補助的刺激分子の増強された発現が細胞に侵入したキャプシド自体の
結果であるか、導入遺伝子の発現の結果であるか、あるいはバックグラウンドの
アデノウィルス遺伝子発現による結果であるかに関して推測することは興味深い
。代用のアデノウィルス受容体としておよび樹状細胞の成熟化の強力な誘因とし
ての、本筋書きにおけるCD40の二重の役割は、免疫系の主要な細胞型に対する標
的化戦略として有用であろう。
【００８３】 CD40標的化アデノウィルスベクターの１つの利点は、抗原コード遺伝子の送達
によって、関心抗原に対するエフェクター細胞を準備する可能性を有する大量の
樹状細胞を調製し得ることであり、そうでなければ免疫系に利用されにくいであ
ろう隠れた抗原の場合に特に重要である。樹状細胞によるヘルパーT細胞の活性
化におけるCD40の重要な役割から生じることとして、そのような系はCTLの活性
化におけるCD4+T細胞の助けの必要性を無視して用途を持つことができる。臨床
目的のための二重特性抗体に基づくアデノウィルスの標的化の利用は以前提案さ
れているが、強化臨床応用のためのその抗体に基づく戦略の限界が認められてい
る。その理由のため、三量体アデノウィルスファイバーとCD40の天然リガンドで
ある三量体のCD40Lの間の遺伝子融合戦略が有用である。
【００８４】実施例１５ Ｂ細胞の形質導入 リンパ球はその中に遺伝子を送達させるのが困難な細胞型であることはかなり
前から認識されている。いくつかの型の造血細胞がアデノウィルス粒子の結合お
よび／または内部化を仲介できないことが記録されている(Silver, L. and C.W.
Anderson, 1988, Nonpermissivity of human peripheral blood lymphocytes t
o adenovirus type 2 infection, J. of Virology, 62: 341-5; Mentel, R., et
al. 1997, Adenovirus-receptor interaction with human lymphocytes, J. of
Med. Virology, 51: 252-7; Wattel, E., et al., 1996, Differential effica
cy of adenoviral mediated gene transfer into cells from hematological ce
ll lines and fresh hematological malignancies, Leukemia, 10: 171-4)。初
期Ｂ細胞が第１アデノウィルス受容体CARおよび第２受容体であるαvインテグリ
ンの両方を発現できないことが認められている（図７Ａおよび７Ｂ）。このこと
は、アデノウィルスがそれら細胞に効率的に感染できないことを説明するであろ
う。
【００８５】 その欠陥を克服するため、それぞれ、Ｂ細胞マーカーであるCD40およびβ１イ
ンテグリンを指向するFab−抗CD40結合体およびFab−抗β１インテグリン結合体
を用いた。それら両方の結合体は、CARの不存在に置き換わり、および細胞にビ
リオンを内部化させる代用の方法を提供するための結合を再構築することが予測
された。以前に記載されたそれら受容体の内部化機能によって、それら結合体が
αvインテグリンの内部化機能を再構築することが期待された。それら標的化戦
略の何れかを用いることによって、非標的化アデノウィルスの10倍以上まで初期
Ｂ細胞に対する遺伝子導入が増強された（図８）。CD40またはβ１インテグリン
に対するアデノウィルスの標的化が第１結合受容体ならびに第２内部化受容体の
両方の欠損を同時に克服したように思われることから、それらの結果は特に興味
深い。
【００８６】 本明細書において言及されている特許または公開物は、本発明が属する分野の
当業者のレベルを示す。さらに、それら特許および公開物は、各公開物が特別に
および個別的に参照によって組み込まれることが表示されているのと同様に、参
照によってこの中に組み込まれる。
【００８７】 当業者は、本発明の目的を達成し、かつ記述されたその目的および利点、なら
びにこの中に本体備わっている目的および利点を得るために、本発明をうまく適
合させることを容易に理解するであろう。この中に記載された方法、手順、処理
、分子、および特定化合物と共に、本実施例は好ましい実施形態の現在における
代表的なものであり、模範的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図
していない。その中における変更および他の用途を当業者は思いつくであろうが
、それらは請求項の範囲によって定められる本発明の精神の範囲内であると考え
られる。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ】 図１Ａは、Fab−抗CD40によって標的化されたアデノウィルスが増強された量
のCD40特異的遺伝子導入を仲介することを示す（単球由来樹状細胞）。
【図１Ｂ】 図１Ｂは、Fab−抗CD40によって標的化されたアデノウィルスが増強された量
のCD40特異的遺伝子導入を仲介することを示す（神経膠腫細胞株D65）。
【図２】 図２は、CD40に対するアデノウィルスの標的化が、所定のレベルの遺伝子発現
を達成するのに必要であるウィルスのMOIを減らすことを示す。
【図３】 図３は、CD40標的化アデノウィルス、β１インテグリン標的化アデノウィルス
、およびリポソーム標的化アデノウィルスが、単球由来樹状細胞への類似の遺伝
子導入を仲介することを示す。
【図４】 図４は、CD40標的化が、樹状細胞成熟マーカーの発現を仲介することを示す。
【図５】 図５は、抗CD40抗体またはFab−抗CD40結合体で処理した後、IL−12の産生が
増強されることを示す。
【図６】 図６は、CD40に対する標的化が、同種混合リンパ球反応を形成する能力の増強
を仲介することを示す。
【図７Ａ】 図７Ａは、初期Ｂ細胞がCARを欠いていることを示す。
【図７Ｂ】 図７Ｂは、初期Ｂ細胞がインテグリンαvβ５を欠いていることを示す。
【図８】 図８はFab−抗CD40またはFab−抗β１インテグリンによって標的化されたアデ
ノウィルスが初期の正常なＢ細胞への増強された量の遺伝子導入を仲介すること
を示す。
【図９】 図９は、自然状態において、樹状細胞の活性化が、樹状細胞を成熟化し得るヘ
ルパーT細胞上に発現しているCD40リガンドによって仲介され、そのような樹状
細胞が適切に細胞傷害性T細胞(CTL)を刺激し得ることを示す。
【図１０】 図１０は、CD40標的化アデノウィルスが、樹状細胞の成熟化につながるCD40の
活性化を介してCD4+ヘルパーT細胞の機能の代用となり得ることを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/00 Ａ６１Ｐ 37/06 37/06 Ｃ１２Ｒ 1:91 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ティルマン，ブライアン ウォルター アメリカ合衆国 アラバマ州 35205 バ ーミンガム イレヴンス アヴェニュー サウス 1123 アパートメント ４ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA32 BA36 BA44 CA04 FA02 GA11 HA17 4B065 AA93X AA93Y AA94X AA95Y AB01 AC15 BA02 CA24 CA25 CA44 4C084 AA13 ZB02 ZB08 ZB26 ZB32 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 ZB02 ZB08 ZB26 ZB32

Claims (33)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 免疫細胞の遺伝子操作のための遺伝子送達系であって： (a) アデノウィルス；および (b) CD40抗原を認識する成分： を含むことを特徴とする遺伝子送達系。
  2. 【請求項２】 前記CD40抗原を認識する成分が、アデノウィルスのファイバ
    ー−ノブに結合した三量体のCD40リガンド、およびCD40抗原に対する第２抗体ま
    たはその断片に結合したアデノウィルスのファイバー−ノブタンパク質に対する
    第１抗体またはその断片より成る群から選択されることを特徴とする請求項１記
    載の遺伝子送達系。
  3. 【請求項３】 前記CD40抗原に対する抗体がG28.5であることを特徴とする
    請求項２記載の遺伝子送達系。
  4. 【請求項４】 前記第１抗体および第２抗体が、遺伝子的に融合しているこ
    とを特徴とする請求項２記載の遺伝子送達系。
  5. 【請求項５】 免疫細胞に形質導入し、および該免疫細胞を遺伝子調節する
    ために用いられ得ることを特徴とする請求項１記載の遺伝子送達系。
  6. 【請求項６】 さらに治療遺伝子を含むことを特徴とする請求項１記載の遺
    伝子送達系。
  7. 【請求項７】 前記治療遺伝子が、腫瘍抗原をコードする遺伝子、病原菌の
    抗原をコードする遺伝子、自己免疫抗原をコードする遺伝子、免疫調節物質をコ
    ードする遺伝子、ならびに細胞傷害性物質をコードする遺伝子より成る群から選
    択されることを特徴とする請求項６記載の遺伝子送達系。
  8. 【請求項８】 前記免疫細胞が、樹状細胞およびＢ細胞より成る群から選択
    されることを特徴とする請求項１記載の遺伝子送達系。
  9. 【請求項９】 前記Ｂ細胞を前記系に接触させた後、該Ｂ細胞が成熟化され
    ることを特徴とする請求項８記載の遺伝子送達系。
  10. 【請求項１０】 免疫調節を必要とする個体において免疫細胞を遺伝子操作
    する方法であって、該個体に請求項１記載の遺伝子送達系を投与する処置を含む
    ことを特徴とする方法。
  11. 【請求項１１】 前記個体が癌、感染症、同種移植拒絶、異種移植拒絶、自
    己免疫疾患より成る群から選択される疾患を有することを特徴とする請求項１０
    記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記免疫細胞が、樹状細胞およびＢ細胞より成る群から選
    択されることを特徴とする請求項１０記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記Ｂ細胞を前記系に接触させた後、該Ｂ細胞が成熟化さ
    れることを特徴とする請求項１２記載の方法。
  14. 【請求項１４】 免疫調節を必要とする個体において免疫細胞を遺伝子操作
    する方法であって、該個体に請求項６記載の遺伝子送達系を投与する処置を含む
    ことを特徴とする方法。
  15. 【請求項１５】 前記個体が癌、感染症、同種移植拒絶、異種移植拒絶、自
    己免疫疾患より成る群から選択される疾患を有することを特徴とする請求項１４
    記載の方法。
  16. 【請求項１６】 前記免疫細胞が、樹状細胞およびＢ細胞より成る群から選
    択されることを特徴とする請求項１４記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記Ｂ細胞を前記系に接触させた後、該Ｂ細胞が成熟化さ
    れることを特徴とする請求項１６記載の方法。
  18. 【請求項１８】 免疫細胞の遺伝子操作のための組換えアデノウィルスベク
    ターであって、ファイバー−ノブタンパク質をコードするアデノウィルス遺伝子
    がCD40抗原を認識するタンパク質をコードする遺伝子で置換されていることを特
    徴とする組換えアデノウィルスベクター。
  19. 【請求項１９】 前記CD40抗原を認識するタンパク質をコードする遺伝子が
    、三量体CD40リガンドをコードする遺伝子および該CD40抗原に対する抗体または
    その断片をコードする遺伝子より成る群から選択されることを特徴とする請求項
    １８記載の組換えアデノウィルスベクター。
  20. 【請求項２０】 前記CD40抗原に対する抗体がG28.5であることを特徴とす
    る請求項１９記載の組換えアデノウィルスベクター。
  21. 【請求項２１】 免疫細胞に形質導入するために用い得る請求項１８記載の
    組換えアデノウィルスベクターであって、該形質導入が該免疫細胞を免疫調節す
    ることを特徴とする組換えアデノウィルスベクター。
  22. 【請求項２２】 さらに治療遺伝子を含むことを特徴とする請求項１８記載
    の組換えアデノウィルスベクター。
  23. 【請求項２３】前記治療遺伝子が、腫瘍抗原をコードする遺伝子、病原菌の
    抗原をコードする遺伝子、自己免疫抗原をコードする遺伝子、免疫調節物質をコ
    ードする遺伝子、ならびに細胞傷害性物質をコードする遺伝子より成る群から選
    択されることを特徴とする請求項２２記載の組換えアデノウィルスベクター。
  24. 【請求項２４】 前記免疫細胞が、樹状細胞およびＢ細胞より成る群から選
    択されることを特徴とする請求項１８記載の組換えアデノウィルスベクター。
  25. 【請求項２５】 前記Ｂ細胞を前記系に接触させた後、該Ｂ細胞が成熟化さ
    れることを特徴とする請求項２４記載の組換えアデノウィルスベクター。
  26. 【請求項２６】 免疫調節を必要とする個体において免疫細胞を遺伝子操作
    する方法であって、該個体に請求項１８記載の組換えアデノウィルスベクターを
    投与する処置を含むことを特徴とする方法。
  27. 【請求項２７】 前記個体が癌、感染症、同種移植拒絶、異種移植拒絶、自
    己免疫疾患より成る群から選択される疾患を有することを特徴とする請求項２６
    記載の方法。
  28. 【請求項２８】 前記免疫細胞が、樹状細胞およびＢ細胞より成る群から選
    択されることを特徴とする請求項２６記載の方法。
  29. 【請求項２９】 前記処置が前記免疫細胞を成熟化させることを特徴とする
    請求項２８記載の方法。
  30. 【請求項３０】 免疫調節を必要とする個体において免疫細胞を遺伝子操作
    する方法であって、該個体に請求項２２記載の組換えアデノウィルスベクターを
    投与する処置を含むことを特徴とする方法。
  31. 【請求項３１】 前記個体が癌、感染症、同種移植拒絶、異種移植拒絶、自
    己免疫疾患より成る群から選択される疾患を有することを特徴とする請求項３０
    記載の方法。
  32. 【請求項３２】 前記免疫細胞が、樹状細胞およびＢ細胞より成る群から選
    択されることを特徴とする請求項３０記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記処置が免疫細胞を成熟化させることを特徴とする請求
    項３２記載の方法。
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