JP2002320475A - 標的化感染特異性を有するポックスウイルス - Google Patents

標的化感染特異性を有するポックスウイルス

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ジャン−マルク・バロール
Stephane Paul
ステファン・ポール
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Abstract

(57)【要約】 （修正有） 【課題】遺伝子治療、特に哺乳動物におけるがんの予防
又は治療に有効なポックスウイルス粒子とその使用法を
提供する。 【解決手段】ポックスウイルス粒子の表面に存在し、か
つ標的細胞の表面に局在する抗リガンド分子を特異的に
認識し結合し得る異種リガンド部分により付与される、
標的化感染特異性を有するポックスウイルス粒子。さら
に、この異種リガンド部分、および天然型ポックスウイ
ルス粒子表面ポリペプチドの全部もしくは一部を含有す
るキメラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
含むベクター。さらに、このポックスウイルス粒子また
はこのベクターを含有する組成物、ならびに、その治療
および予防目的の使用。本発明は、遺伝子治療におい
て、特に哺乳動物のガンの予防、治療において非常に有
用である。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、ポックスウイルス粒子の表面に
存在し、標的細胞の表面に局在する抗リガンド分子を特
異的に認識し結合しうる異種リガンド部分により付与さ
れる標的化感染特異性 (targeted infection specifici
ty) を有するポックスウイルス粒子に関する。本発明は
さらに、かかる異種リガンド部分および天然型ポックス
ウイルスの表面ポリペプチドの全部または一部を含むキ
メラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む
ベクターに関する。本発明はまた、該ポックスウイルス
粒子または該ベクターを含む組成物、およびその治療お
よび予防目的の用途に関する。本発明は、遺伝子治療、
特に哺乳動物におけるガンの予防または治療に非常に特
別な有用性を有する。
【０００２】遺伝子治療は、遺伝物質の細胞または生物
体への導入として定義することができる。遺伝子治療に
よりヒトの疾病を治療する可能性は、この数年で理論的
考察の段階から臨床応用の段階まで変化した。ヒトに適
用された最初のプロトコルは米国においてアデノシンデ
アミナーゼ (ADA)欠損症の患者に対して1990年９月に開
始された。この最初の有望な実験に続いて、多数の新た
な適用が行われ、遺伝子治療に基づく将来性のある臨床
試験が現在進行中である (例えば、http://cnetdb.nci.
nih.gov/trialsrch.shtml またはhttp://www.wiley.co.
uk/genetherapy/clinical/に挙げられた臨床試験を参
照) 。
【０００３】成功的遺伝子治療は、主として、目的の治
療用遺伝子をその発現を可能にするように生きている生
物の細胞中に効率的に送り込むことに依る。治療用遺伝
子は、広範な種類のベクターを用いて細胞中に導入する
ことができ、その結果、一過性発現 (トランスフェクシ
ョン) かまたは宿主ゲノムの恒久的形質転換を生じる。
過去10年間に、非常に多くのウイルスベクター、および
非ウイルスベクターが遺伝子導入のために開発された
(例えば、総説としてRobbins et al., 1998, Tibtech 1
6,35-40および Rolland, 1998, Therapeutic Drug Carr
ier Systems 15,143-198参照) 。
【０００４】最も広く用いられているウイルスベクター
は、レトロウイルスおよびアデノウイルス由来である
(総説としてMiller, 1997, Human Gene Therapy 8, 803
-815参照) 。しかし、シンドビスウイルス由来ベクター
やポックスウイルス由来ベクターなどのその他のウイル
スベクターもin vivo 遺伝子導入のための有望な候補と
なりつつある。
【０００５】ポックスウイルスは、主にその異常な形
態、大きいDNA ゲノムおよび複製の細胞質部位を特徴と
する、エンベロープを持つ複雑なウイルスの一群であ
る。コペンハーゲンワクシニアウイルス (VV) 株 (Goeb
el et al., 1990, Virol, 179, 247-266 and 517-563;
Johnson et al., 1993, Virol, 196, 381-401)および改
変されたワクシニアウイルスアンカラ(MVA) 株(Antoine
et al., 1998, Virol. 244,365-396)を含む、ポックス
ウイルス科の数種のメンバーのゲノムは、マッピングさ
れ配列決定されている。VVは約200 のタンパク質をコー
ドする約192kb の２本鎖DNA ゲノムを有し、そのうちの
約100 のタンパク質はウイルスの組み立てに関与してい
る。MVA は、鶏胚繊維芽細胞でワクシニアウイルスのア
ンカラ(Ankara)株(CVA) を500 回以上の連続継代培養に
より作製された高度に弱毒化されたワクシニアウイルス
株である (Mayr et al., 1975, Infection 3, 6-16) 。
MVA は受託番号Ｉ-721としてCollection Nationale de
Cultures de Microorganismes(CNCM)に寄託された。MVA
ゲノムの完全な配列決定およびコペンハーゲン (Copen
hagen) VVゲノムとの比較により、ウイルスゲノムに生
じた変化の正確な同定、およびいくつかの断片化された
ORF (オープンリーディングフレーム) にいたる欠失(I
からVII)と多数の突然変異の規定が可能になる (Antoin
e et al., 1998,Virology 244, 365-396)。
【０００６】エンベロープをもつウイルスの細胞内取り
込みのための自然の経路には、ウイルス表面において露
出されたウイルスポリペプチドの細胞受容体への結合、
およびウイルス膜と細胞膜との間の融合機構、それによ
り生じる感染細胞の細胞質へのウイルスゲノムの放出を
含む一連の過程が含まれる。
【０００７】しかし、ポックスウイルスの特別な場合で
は、正確な送達経路の分析は、細胞内成熟ウイルス(IM
V) および細胞外エンベロープ含有ウイルス(EEV) と称
される、二つの形態学的に異なる形態の感染性ウイルス
の存在により複雑である。その他の特徴の中で、IMV 形
態は、ウイルスコアを囲む単脂質(monolipid) エンベロ
ープを特徴とし (図１) 、感染細胞の溶菌後に細胞外に
放出されるにもかかわらず、感染細胞の細胞質に主とし
て局在する。IMV 脂質エンベロープの表面に露出された
天然のポリペプチドの多くは同定され、例えばp14kDaや
p21kDaタンパク質があり、それぞれA27L遺伝子(Rodrigu
ez at al., 1985, J., Virol, 56, 482-488; Rodriguez
et Estaban, 1987, J. Virol. 61, 3550-3554) および
A17L遺伝子によりコードされており、またL1R 、A14L、
D8L 、A9L (Yeh et al., 2000, J.Virol, 74, 9701-971
1) 、E10R (Senkevich et al., 2000, Virol, 5, 244-2
52)およびH3L 遺伝子よりコードされるタンパク質があ
る。IMV に比べて、EEV 形態は、トランスゴルジ網嚢か
ら得られた追加の外部脂質膜エンベロープ (二重脂質
層) を有する。これは、感染細胞の外側に放出されるウ
イルス形態に相当する。EEV 表面膜エンベロープは、IM
V 表面にはない約10種のタンパク質を示し、例えばコー
ドされたB5R,A34Rおよび赤血球凝集素(HA)遺伝子産物(
図１) などがある。このIMV およびEEV 形態の共存は、
ワクシニア株のほとんど (例えばコペンハーゲンおよび
MVA 株) 、およびニワトリポックスウイルス (鶏痘ウイ
ルス) などのその他のポックスウイルスについて報告さ
れている(Boulanger et al., 2000,J. Gen. Virol. 81,
675-687)。
【０００８】IMV とEEV の異なる形態は、これらのポッ
クスウイルス形態の宿主細胞への侵入の異なる機構を示
唆する。EEV 供給経路はエンドサイトーシスおよびそれ
に続くpH依存性膜融合経路により媒介されるが、IMV 形
態はpH非依存的に細胞膜と直接融合することが最近提案
された (Vanderplasschen et al., 1998, J. Gen. Viro
l. 79, 877-887) 。IMV 結合と細胞内取り込みを媒介す
る二つの細胞受容体が最近同定された: 細胞表面プロテ
オグリカンのグリコサミノグリカン(GAG) 側鎖であるヘ
パラン硫酸(Chung et al., 1998, J. Virol. 72, 1577-
1585) および別のGAG 成分であるコンドロイチン硫酸
(Hsiao et al., 1999, J. Virol. 73, 8750-8761)。両
受容体は異なるIMV 表面ポリペプチド、それぞれp14(ヘ
パラン硫酸と結合) およびD8L 遺伝子産物 (コンドロイ
チン硫酸と結合) と相互作用し、これは異なる種類のウ
イルス-GAG相互作用を示している。
【０００９】ワクシニアウイルス14-kDaタンパク質(p1
4) は、ウイルスの感染性において重要な役割を果たし
ている。p14 タンパク質は21-kDaタンパク質(p21) との
会合によりIMV 脂質エンベロープに固定されている(anc
hored)。p14 タンパク質は、おそらく細胞表面ヘパラン
硫酸への結合に関与することによりIMV 供給経路に関与
している (Chung et al., 1998, J.Virol. 72, 1577-15
85) 。さらに、融合過程はこのp14 タンパク質によるも
のであった。さらに、一般的に言うと、IMV 表面ポリペ
プチドがIMV 感染性に密接に関与し、その変異または欠
失がIMV の伝播を劇的に損なうことが示されてきた(Dal
lo et al., 1987, Virology 159, 423-32)。p14 タンパ
ク質はまた、EEV の形成および感染細胞外でのウイルス
拡散に必要である。
【００１０】最近、細胞表面ヘパラン硫酸受容体への結
合、ウイルス/ 細胞膜融合およびウイルス放出に必要と
される機能性ドメインがp14 の最初の43のＮ末端アミノ
酸内でマッピングされた (Vazquez an Esteban, 1999,
J.Virol. 73, 9098-9109)。さらに、Vazquez 等 (199
8, J.Virol. 72, 10126-10137) は、p14 のＣ末端ドメ
インがp21 タンパク質との結合に関与していることを示
した。
【００１１】各種の治療用遺伝子を発現する多数の組換
えポックスウイルスベクターが文献において報告されて
きた。特に、サイトカイン遺伝子を発現するVV(Peplins
ki et al., 1995, Ann. Surg. Oncol. 2, 151-159; Whi
tman et al., 1994, Surgery116, 183-188)、B7.1免疫
刺激遺伝子(Hodge et al., 1994,Cancer Res. 54, 5552
-5555)、1CAM-1(Uzendoski et al., 1997, Hum. Gene T
her. 8, 851-860)または、単純ヘルペスウイルス-1(TK
HSV-1)のチミジンキナーゼ遺伝子 (Puhlmann et al., 1
999, Hum, Gene Ther. 10, 649-657) や、シトシンデア
ミナーゼ遺伝子(Gnant et al., 1999, Cancer Res. 59,
3396-3403) などの自殺遺伝子を発現するVVがガンの治
療に提案されてきた。さらに、それらの抗腫瘍活性が動
物モデルで実証された。MVA 株に基づくベクターもまた
提案された(Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 89, 10847-10851; Carroll and Moss, 199
5,Bio Techniques 19, 352-355; Antoine et al., 199
6, Gene 177, 43-46;Schleiflinger et al., 1996, Arc
h. Virol. 141, 663-669)。
【００１２】しかしながら、ワクシニアウイルスは非常
に広い宿主範囲を示し、ほとんどの脊椎動物細胞に感染
する。また、IMV とEEV 形態は伝播性に関して異なる。
なぜなら、EEV はその表面にIMV 表面よりもより多くの
種類のポリペプチドを提示しており、IMV よりも広範に
伝播する傾向がより大きいからである。どの形態を考え
ても、感染選択性の欠如は、非標的化細胞中に導入され
た遺伝子 (すなわち、細胞障害性遺伝子) の発現から生
じ得る悪影響を制限するのが望ましい特別な用途に対し
ては不利であると見なされ得る。従って、標的細胞集団
への感染を指令するために宿主範囲を限定するにはウイ
ルスを改変するのが有用であろう。
【００１３】ウイルスの指向性 (tropism)の改変はすで
にある種のウイルスで行われている。例えばWO93/09221
では、モノクローナル抗体により細胞受容体へのウイル
スの結合を正常に媒介するウイルス赤血球凝集素ポリペ
プチドの阻害により、および標的化細胞上に発現された
トランスフェリン受容体と相互作用し得る抗体とウイル
スとを結合させることにより、インフルエンザウイルス
指向性を改変している。
【００１４】Roux等(1989, Proc. Natl. Acad Sci. USA
86, 9079-9083) はレトロウイルスエンベロープgp70お
よびヒト主要組織適合抗原 (MHC) のそれぞれに対する
２つのビオチニル化抗体を用いてマウス同種指向性組換
えレトロウイルスをヒト細胞に感染させることを報告し
ている。
【００１５】WO94/10323は、抗体に認識される抗原を発
現する細胞にアデノウイルスの感染を指示するために、
単鎖 (single chain) 抗体との融合により改変された繊
維タンパク質をその表面に提示する標的化アデノウイル
スベクターを記載している。
【００１６】しかしながら、ポックスウイルス粒子の制
御された標的化は、ポックスウイルスの固有の複雑さお
よび異なる２つの感染性形態の存在により阻害されたき
た。これに関して、Galmiche (1997,J. Gen. Virol. 7
8, 3019-3027)は、腫瘍細胞標的化のためのEEV 粒子の
構築を報告している。腫瘍関連抗原ErbB-2に対する単鎖
抗体を、EEV 表面に発現されるようにウイルス赤血球凝
集素 (HA) に融合させた。ErbB-2は、ヒト腺がん細胞上
に過発現される上皮増殖因子受容体である。融合タンパ
ク質はEEV 粒子の表面に露出され、in vivo で培養ヒト
腺ガン細胞に結合し得るが、著者等は、抗体-HA 融合体
を有するEEV のErbB-2発現細胞への優先的感染を観察し
なかった。改変EEV 粒子は、広範囲な細胞の感染を可能
にする未同定のタンパク質をまだ含有していると推定さ
れる。
【００１７】従って、本発明の基礎となる技術的課題
は、ポックスウイルスの特定細胞への標的化のための改
良された方法および手段の提供である。この技術的課題
は、ここに明らかにする態様の提供により解決される。
【００１８】本発明は、標的細胞への標的化感染特異性
を有するポックスウイルス粒子であり、この粒子はこの
標的細胞に優先的に感染するものであり、この特異性
は、ポックスウイルス粒子の表面に局在し、かつ標的細
胞の表面に局在する抗リガンド分子に結合し得る、少な
くとも１つの異種リガンド部分により付与される（ただ
しポックスウイルス粒子がEEV ワクシニアウイルス粒子
であるときリガンドはErbB-2に対する抗体ではない）。
【００１９】ここで用いる「標的細胞に対する標的化感
染特異性」なる用語は、本発明のポックスウイルス粒子
が、関連する非改変 (即ち野生型) ポックスウイルス粒
子に比べ、標的細胞に対して新たな、または向上した指
向性を示すように操作されている、制御された感染特異
性を指す。その結果、本発明のポックスウイルス粒子
は、その関連する非改変ポックスウイルス粒子と異なり
標的細胞に感染する傾向を示し、これは本発明のポック
スウイルス粒子は、標的細胞 (本発明のポックスウイル
ス粒子の表面に提示されるリガンド部分により認識され
る抗リガンドをその表面に提示する) に、非標的細胞
(前記の抗リガンドをその表面に提示しない) よりもよ
り効率的またはより迅速に感染するが、一方、関連する
非改変ポックスウイルス粒子は非標的細胞に比べより低
いか同じ程度の効率で標的細胞に感染するだろうことを
意味する。この好ましい感染性は、標的細胞および非標
的細胞に対する本発明のポックスウイルス粒子の感染性
を、その関連非改変ポックスウイルス粒子の感染性とin
vitro (例、培養細胞において) またはin vivo(例、動
物モデルにおいて) で、同じ実験条件下で比較すること
により容易に決定できる。感染性を分析するためのin v
itro実験条件は、本明細書の実施例５において提供され
るが、その他の方法も当業者には周知であり、従って、
本発明に関して使用できる。例えば、本発明によるポッ
クスウイルス粒子および関連非改変ポックスウイルス粒
子の混合物を、比較的短い感染時間(30 分以下、特に１
〜10分) で培養標的細胞に感染させるのに用いると、最
初の混合物に含まれる本発明によるポックスウイルス粒
子の大多数 (少なくとも60％、好ましくは少なくとも70
％、そしてより好ましくは少なくとも80％) は前記標的
細胞に感染することができるが、一方、最初の混合物中
の関連非改変ポックスウイルス粒子の少量(40 ％以下、
好ましくは30％以下、より好ましくは20％以下) しか前
記標的細胞に感染することができない。これは、各感染
操作毎に、混合物中に存在する本発明によるポックスウ
イルス粒子の量を増やす結果となる。このような濃縮
は、標準的技術により各ポックスウイルス粒子のウイル
ス力価を測定して評価することができる。
【００２０】本発明において用いる「リガンド部分」と
いう用語は、標的細胞の表面において発現または露出さ
れた少なくとも１つの抗リガンド分子を認識して結合し
得る任意の部分を意味する。これは、標的細胞結合およ
び本発明のポックスウイルス粒子への感染特異性を提供
する。本明細書を読むことにより、前記抗リガンド分子
は、ポックスウイルスの取り込みを媒介する天然型細胞
受容体( 例、ヘパラン硫酸またはコンドロイチン硫酸)
とは異なることが明らかである。本発明によれば、リガ
ンド部分は、請求されたポックスウイルス粒子の表面に
局在する。使用する結合方法 (下記参照) によって、こ
のリガンド部分は、ウイルス粒子表面上に付加され露出
している (例えば化学的結合による) 部分であるか、又
は粒子エンベロープ構造において融合した部分 (例えば
遺伝子結合により) である。「異種 (heterologous) 」
とは、このリガンド部分が野生型ポックスウイルス粒子
の表面には見出されないことを意味する。広く、「同種
(homologous) 」とは、野生型ポックスウイルス粒子の
表面に見出されるポリペプチド又は天然部分をいう。標
的細胞の表面に局在する抗リガンド分子は、好ましく
は、野生型ポックスウイルス粒子が結合しないものであ
るか、又は、野生型ポックスウイルス粒子が本発明の改
変ポックスウイルス粒子よりも低い特異性でしか結合し
ないものである。リガンドとある抗リガンド分子間の結
合特異性は、ELISA 、免疫蛍光及び表面プラズモン共鳴
に基づく技術(Biacore AB)を含む当分野の技術によって
測定できる。
【００２１】一般に、本発明の範囲において用いられる
リガンド部分は広く文献に記載されている; これは、本
発明の改変ポックスウイルス粒子に、少なくとも１つの
標的細胞の表面に局在するある抗リガンド分子又は一群
の抗リガンド分子に結合する能力を付与しうる部分であ
る。適当な抗リガンド分子には、細胞特異的マーカー、
組織特異性マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原
性エピトープ及び腫瘍関連マーカーよりなる群から選ば
れるポリペプチドがあるが、これらに限定されない。抗
リガンド分子は、さらに糖質、脂質、糖脂質、抗体等が
ある。本発明によれば、リガンド部分は、例えば脂質、
糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー (例、PEG 、ポリリシ
ン、PEI 等) 、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ビ
タミン、抗原、レクチン、JTS1(WO94/40958)などの標的
化特性を示すポリペプチド部分、抗体又はそれらの組み
合わせであってもよい。前述のリガンド部分の断片もま
た、それが天然分子の標的化特性を保持していれば使用
できる。
【００２２】好ましくは、本発明において用いられるリ
ガンド部分は、最小で７アミノ酸の長さのポリペプチド
である。これは天然のポリペプチドか、天然のポリペプ
チド由来のポリペプチドである。「由来」とは、(i) 天
然の配列に関して１又は２以上の改変 (例、１又は２以
上の残基の付加、欠失及び／又は置換) 、(ii)非天然ア
ミノ酸を含むアミノ酸類似体、又は(iii) 置換された結
合、並びに(vi)当分野で既知のその他の改変を含むこと
を意味する。この用語は、変異物及び各種起源の配列を
融合させることにより得られるキメラポリペプチドも含
む。さらに、このリガンド部分は直鎖でも環状構造を有
していてもよい (例、システイン残基によりポリペプチ
ドリガンドを両端に配置することにより) 。さらに、本
発明で用いるリガンド部分は、化学的部分を置換または
付加することにより (例、グリコシル化、アルキル化、
アセチル化、アミド化、リン酸化、スルフヒドリル基の
付加等) 、そのもとの構造を修飾することを含む。本発
明はさらに、リガンド部分を検出可能にする修飾も含
む。この目的のためには、検出しうる部分による修飾が
検討された (すなわち、シンチグラフィー、放射能、蛍
光又は染料標識等) 。適当な放射能標識には、Ｔc99m、
Ｉ123 及びＩn111があるが、これらに限定されない。こ
のような検出可能な標識は任意の慣用技術によりリガン
ド部分に結合してもよく、診断目的に用いてもよい
(例、腫瘍細胞の画像化) 。
【００２３】１つの好ましい態様において、抗リガンド
分子は抗原 (例、細胞特異的抗原、疾病特異的抗原、遺
伝子操作された標的細胞の表面に特異的に発現される抗
原等) であり、リガンド部分は抗体、その断片又は最小
認識単位 (すなわち、抗原特異性を依然として示す断
片) であり、例えば免疫学マニュアル (例えば、Immuno
logy, ３版, 1993, Roitt,Brostoff and Male,編 Gambl
i,Mosby 参照) に詳細に記載されているものがある。リ
ガンド部分はモノクローナル抗体であってもよい。これ
らの抗原の多くに結合するであろうモノクローナル抗体
は、既に知られているが、いずれの場合もモノクローナ
ル抗体技術に関する現在の手法を用いて、ほとんどの抗
原に対する抗体で製造できる。リガンド部分は抗体の一
部 (例えばＦab断片) であっても、合成抗体断片 (例え
ばScFv) であってもよい。
【００２４】選択された抗原に対する適当なモノクロー
ナル抗体は既知の方法、例えば "Monoclonal Antibodie
s: A manual of techniques", H. Zola(CRC Press, 198
8)および "Monoclonal Hydridoma Antibodies: Techniq
ues and Applications", J. G. R. Hurrell (CRC Pres
s, 1982) に記載の方法により製造してもよい。適切に
製造された非ヒト抗体は既知のやり方で「ヒト化」して
もよく、例えばマウス抗体のCDR 領域をヒト抗体のフレ
ームワーク中に挿入することにより行える。さらに、抗
体の可変重(VH)ドメイン及び可変軽 (VL) ドメインは抗
原の認識に関与し、齧歯動物起源の可変ドメインは、得
られる抗体が齧歯動物の親抗体の抗原特異性を保時する
ようにヒト起源の定常ドメインに融合していてもよい(M
orrisonet al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
1, 6851-6855)。
【００２５】抗体の抗原特異性は、Ｆab様分子(Better
et al., (1988) Science 240, 1041);Fv分子(Skerra et
al., (1988) Science 240, 1038); VH 及びVLの対ドメ
インが、可撓性オリゴペプチドを介して連結していても
よいScFv分子(Bird et al.,1988) Science 242, 423; H
uston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85,
5879)、及び分離Ｖドメインを含むdAb(Ward et al.,
(1989) Nature 341,544)などの可変ドメインにより付与
される。その特異的結合部位を保持する抗体断片の合成
に関与する技術の総説はWinter & Milstein (1991) Nat
ure 349, 293-299にみられる。
【００２６】有利な態様によれば、リガンド部分は全抗
体よりもむしろ抗体断片から選択される。補体結合のよ
うな全抗体のエフエクター機能は除かれる。ScFv部位及
びdAb 抗体断片は、その他のポリペプチドとの融合体と
して発現されていてもよい。最小認識単位は、Fv断片の
相補的決定領域 (CDR)の１又は２以上の配列由来であっ
てもよい。全抗体及びＦ(ab')2 断片は「２価」であ
る。「２価」とは、この抗体及びＦ(ab')2 断片が２つ
の抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Fa
b 、Fv、ScFv、dAb 断片及び最小認識単位は１価であ
り、ただ１つの抗原結合部位を有する、別の態様では、
リガンド部分は天然の細胞表面受容体結合に関する特異
的部分の少なくとも一部である。当然、この天然の受容
体 (例、ホルモン受容体) はそれ自身が標的細胞特異的
抗原であってもよく、またモノクローナル抗体、ＳｃＦ
ｖ、ｄＡｂ又は最小認識単位のいずれか１つの性質を有
するリガンド部分により認識されてもよい。
【００２７】好ましい態様では、リガンド部分がウイル
ス感染細胞の標的化を可能にし、ウイルス成分 (例、エ
ンベロープ糖タンパク質) を認識して結合できるか、あ
るいはウイルスの生態 (例、侵入、複製) を妨げること
ができる。例えば、ＨＩＶ (ヒト免疫不全症ウイルス)
感染細胞の標的化は、ＨＩＶエンベロープのエピトープ
に特異的なリガンド部分、例えば、膜貫通糖タンパク質
ｇp41 の高度に保存されたエピトープを認識する２Ｆ５
抗体由来のリガンド部分(Buchacher et al., 1992, Vac
cines 92, 191-195)、又は細胞受容体CD4 へのHIV 結合
を妨げるリガンド部分 (例、CD４分子の細胞外ドメイ
ン) を用いて行うことができる別の好ましい態様におい
ては、リガンド部分は腫瘍細胞を標的化することを可能
にし、腫瘍特異的抗原、腫瘍細胞において特異的にもし
くは過剰に発現される細胞タンパク質、又はガン関連ウ
イルスの遺伝子産物などの腫瘍状態に関連する分子を認
識して結合しうる。
【００２８】腫瘍特異的抗原の例には、乳ガンに関連す
るMUC-1(Hareuveni et al., 1990,Eur. J. Biochem 18
9, 475-486) 、乳及び卵巣ガンに関連する変異BRCA１及
びBRCA２遺伝子によりコードされる産物(Miki et al.,1
994, Science 226, 66-71; Futreal et al., 1994, Sci
ence 226, 120-122; Wooster et al., 1995, Nature37
8, 789-792) 、大腸ガン関連APC(Polakis, 1995, Curr.
Opin. Genet. Dev. 5, 66-71)、前立腺ガン関連前立腺
特異的抗原 (PSA)(Stamey et al., 1987, NewEngland
J. Med. 317, 909) 、大腸ガン関連ガン腫胚性抗原 (ca
rcinoma embryonic antigen related to colon cancer)
(CEA)(Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10,
2738-2748)、黒色腫関連チロシナーゼ(Vile et al., 19
93, Cancer Res. 53, 3860-3864)、黒色腫細胞において
多数発現するメラノサイト刺激ホルモン(MSH) の受容
体、乳ガン及びすい臓ガン関連ErbB-2(Harris et al.,
1994, Gene Therapy 1, 170-175)、及び肝ガン関連α−
フェトプロテイン(Kanai etal., 1997, Cancer Res. 5
7, 461-465) があるが、それらには限定されない。
【００２９】本発明で用いるのに好ましいリガンド部分
は、MUC-1 抗原を認識して結合し、従ってMUC-1 陽性腫
瘍細胞を標的化しうる抗体の断片である。より好ましい
リガンド部分は、MUC-1 抗原の縦列反復領域を認識する
SM3 モノクローナル抗体のseＦv 断片(Burshell et a
l., 1987, Cancer Res. 47, 476-5482; Girling et a
l., 1989, Int J. Cancer 43, 1072-1076; Dokurno et
al., 1998, J. Mol.Biol.284, 713-728) である。
【００３０】腫瘍細胞において特異的にもしくは過剰に
発現される細胞タンパク質の例には、ある種のリンパ球
腫瘍において過剰に発現するインターロイキン２ (IL-
2) の受容体、肺ガン細胞、膵臓、前立腺及び胃ガンに
おいて過剰に発現するGRP ( ガストリン放出ペプチド)
(Michael et al., 1995, Gene Therapy 2, 660-668)、T
NF(腫瘍壊死因子) 受容体、表皮増殖因子受容体、Fas
受容体、CD40受容体、CD30受容体、CD27受容体、OX−4
0、∀v インテグリン(Brooks et al., 1994, Science 2
64, 569) 及びある種の血管新生増殖因子(Hanahan, 199
7, Science 277, 48)に対する受容体があるが、これら
に限定されない。これらの示唆に基づき、上記タンパク
質を認識して結合しうる適宜リガンド部分を決定するこ
とは当業者の範囲内である。例えば、IL-2はIL-2受容体
に結合するための適当なリガンド部分である。
【００３１】適当なガン関連ウイルスの遺伝子産物に
は、子宮頸ガンにおいて発現するヒトパピローマウイル
ス (HPV)E6及びE7初期ポリペプチド、並びにL1及びL2後
期ポリペプチド (EP 0 462 187、US 5,744,133及びWO98
/04705) 、及びバーキットリンパ腫に関連するエプスタ
インバールウイルス (EBV)のEBNA-1抗原(Evans et al.,
1997, Gene Therapy 4, 264-267) があるが、これらに
は限定されない。
【００３２】さらに別の好ましい態様では、リガンド部
分は組織特異的分子の標的化を可能にする。例えば、肝
細胞を標的化するのに適したリガンド部分には、LDL 受
容体に結合しうるApoB (アポリポタンパク質) 、LPR 受
容体に結合しうるα-2- マクログロブリン、アシアロ糖
タンパク質受容体に結合しうるα-1酸糖タンパク質及び
トランスフェリン受容体に結合しうるトランスフェリン
由来のものがあるが、これらに限定されない。活性化内
皮細胞を標的化するためのリガンド部分は、シリアル−
ルイス−Ｘ抗原 (ELAM-1に結合しうる) 由来、VLA-4(VC
AM-1受容体に結合しうる) 由来、またはLFA-1(ICAM-1受
容体に結合しうる) 由来であってもよい。CD34由来のリ
ガンド部分は、CD34受容体への結合を通して造血前駆細
胞を標的化するのに有用である。ICAM-1由来のリガンド
部分は、ＬＦＡ−１受容体への結合を通してリンパ球を
標的化するのに有用である。最後に、Ｔヘリパー細胞の
標的化には、HIVgp-120 由来のリガンド部分又はCD４受
容体に結合しうるMHCCクラスII抗原を用いてもよい。
【００３３】ポリペプチドであるリガンド部分が組換え
DNA 技術を用いて好都合に作製できることは当業者には
認められるだろう。リガンド部分は、以下に示すように
ウイルス粒子の表面のタンパク質に融合していてもよ
く、あるいは、例えば新たな(de novo) 合成、又は真核
及び原核細胞における適宜DNA 断片の発現により独立に
合成され、次いで以下に開示するようにウイルス粒子に
結合してもよい。多くのリガンド部分をコードする核酸
配列は既知であり、例えばペプチドホルモン類、増殖因
子類、サイトカイン類等の核酸配列があり、そしてEMBL
及びGenBank などの公的に利用しうるヌクレオチド配列
データベースを参照することにより容易に見出されるか
もしれない。ヌクレオチド配列が一旦分かれば、例えば
ＤＮＡの化学合成技術、またはポリメラーゼ連鎖反応を
用いて、ゲノムDNA からもしくは組織特異的cDNAから必
要なDNA を増幅することにより、選択したリガンド部分
をコードするDNA を作製する方法は当業者には自明であ
る。ペプチドホルモン類、増殖因子類、抗体の全体又は
一部、サイトカイン類等をコードする多くのcDNAは、リ
ガンド部分として有用であり、一般に市販されている。
【００３４】「標的細胞」とは、本発明の改変ポックス
ウイルス粒子が優先的に感染しうる細胞をいう。リガン
ド部分及び／又は抗リガンド分子の性質により、「標的
細胞」は、本発明のポックスウイルス粒子上に存在する
リガンド部分により認識される抗リガンド分子をその表
面に共通の特徴として有する特別な種類の細胞または異
なる種類の一群の細胞を意味するかもしれない。本発明
の目的にとっては、標的細胞は、本発明のポックスウイ
ルス粒子に感染しうる任意の哺乳動物細胞 (好ましくは
ヒト細胞) からなる。この細胞は初代細胞、形質転換細
胞又は任意の起源の腫瘍細胞でもよい。適当な標的細胞
には造血細胞 (全能性幹細胞、白血球、リンパ球、単
球、マクロファージ、樹状細胞等) 、筋細胞 (衛生細
胞、ミオサイト、筋芽細胞、骨格及び平滑筋細胞、心筋
細胞) 、肺細胞、気管細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細
胞又は繊維芽細胞があるが、これらに限定されない。
【００３５】「リガンド部分 (または抗リガンド分子)
がポックスウイルス粒子の (又は標的細胞の) 表面に局
在する」とは、このリガンド部分 (又は抗リガンド分
子) が、該ポックスウイルス粒子を該標的細胞に接触さ
せたときに、その特異的抗リガンド分子 (又はそれぞ
れ、リガンド分子) と結合するためにポックスウイルス
粒子の (又は標的細胞の) 表面に接近可能であることを
意味する。この接近可能性は、文献に広く開示された方
法を用いて過度の実験なしにin vitroで測定できる。
【００３６】本発明のポックスウイルス粒子は、ポック
スウイルス科の任意のメンバー、特にワクシニアウイル
ス、カナリアポックス、ニワトリポックス (鶏痘) 、ウ
シポックス、昆虫ポックス、サルポックス、ブタポック
ス又はペンギンポックスから得ることができる。好まし
くは、コペンハーゲン、ワイエス(Wyeth) 又はアンカラ
改変 (MVA)株のワクシニアウイルス粒子である。一般的
に、多数の刊行物が上で引用したポックスウイルス及び
ポックスウイルス株の配列及び生物学に関する。さら
に、それらは、ATCC (鶏痘 ATCC VR−251 、サルポック
ス ATCC VR−267、ブタポックス ATCC VR-363、カナリ
アポックス ATCC VR−111 、ウシポックスATCC VR−30
2)又はＩＣＴＶ (オーストラリア、キャンベラ) ( コペ
ンハーゲンウイルスコード58.1.1.0.001; GenBank 受託
番号Ｍ35027)などの認定されたコレクションにおいて入
手できる。
【００３７】本発明のポックスウイルス粒子はIMV でも
EEV 形態のどちらでもよい。好ましい態様においては、
それはIMV 粒子である。前述したように、IMV 粒子は、
A27L(p14タンパク質) 、L1R 、A14L、A17L(p21タンパク
質) 、D8L 、A9L 、E10R及びH3L 遺伝子によりコードさ
れる産物などの、その表面に存在するウイルスのポリペ
プチドを有する単層脂質エンベロープにより囲まれたウ
イルスゲノムを含むウイルス核を含む。「EEV 」なる用
語は、B5R 、A34R及びHA遺伝子によりコードされる産物
などの細胞およびウイルスポリペプチドをその細胞表面
に露出している、追加の２層脂質エンベロープに囲まれ
るIMV 粒子を意味する。
【００３８】有利な態様において、ポックスウイルスゲ
ノムは、EEV 粒子の産生に関与する少なくとも１つの遺
伝子において欠損性であり、好ましくはF13L遺伝子(p37
タンパク質をコードする) において欠損性である。F13L
遺伝子の欠失が、正常レベルのIMV が産生されるにもか
かわらず、EEV の包みこみ(wrapping)過程において重大
な欠陥をもたらすことがBorrego 等により示された(199
9,J.Gen.Virol.80,425-432) 。従って、ポックスウイル
スF13L遺伝子を変化させることによりＩＭＶ産生を増加
させることが可能である。このF13L遺伝子は、コーディ
ング配列内またはプロモーター内の任意の配列の完全も
しくは部分的欠失、変異又は挿入により改変することが
できる。ポックスウイルスゲノムは、任意に、その産物
がポックスウイルス取り込みを媒介する天然の細胞受容
体 (例、ヘパラン硫酸又はコンドロイチン硫酸) との相
互作用に関与する少なくとも１つの遺伝子において改変
されていてもよい。これらの遺伝子改変技術は当分野で
は既知であり、Borrego 等(1999、前出) に説明されて
いる。
【００３９】ここで用いる遺伝子の名称は、コペンハー
ゲンワクシニア株において使用されているものであり、
特に指定がない限り他のポックスウイルス科 (例、MVA)
の相同遺伝子に対しても用いられる。しかし、遺伝子の
名称はポックス株により異なる。参考のために、コペン
ハーゲン及びMVA 遺伝子の間の対応がAntoine 等(1998,
Virol. 244, 365-396) の表１に示されている。例え
ば、コペンハーゲンＡ27Ｌ遺伝子はMVA では138 Ｌと呼
ばれるが、これら両遺伝子は同様の機能とIMV 表面にお
ける局在を有する相同p14-kDa タンパク質をコードす
る。
【００４０】本発明によれば、ポックスウイルス粒子は
本発明で用いる異種リガンド部分と作動的に結合してい
る。「作動的に結合している」とは、この粒子とリガン
ド部分が、それらが意図したように機能する (すなわ
ち、リガンド部分が、所望の細胞へのポックスウイルス
粒子の標的化感染特異性を促進する) ことを可能にする
関係にあることを意味する。結合は、共有結合、非共有
結合または遺伝的手段を含む、当業者に周知の各種手段
により行うことができる。
【００４１】ポックスウイルス粒子の表面へのリガンド
部分の共有結合は、反応性官能基を介して直接に、ある
いはスペーサー基もしくは他の活性化部分により間接に
行ってもよい。具体的には、結合は、(i) ホモ二官能
性、もしくは(ii)ヘテロ二官能性架橋剤により、(iii)
カルボジイシドにより、(iv)還元的アミノ化により、も
しくは(vi)カルボキシレートの活性化により行ってもよ
い (例えば、Bioconjugate techniques 1996; G Herman
son 編; Academic Press参照) 。
【００４２】グルタルアルデヒド及びＤＭＳ (ジメチル
スーベルイミデート) のようなビス- イミドエステルを
含むホモ二官能性架橋剤を、リガンド部分のアミノ基を
ジアシルアミンを含む脂質構造 (例、IMV エンベロープ
の) に結合するのに用いてもよい。
【００４３】本発明においては多くのヘテロ二官能性架
橋剤を用いることができ、詳しくは、アミノ反応基とス
ルフヒドリル反応基を有するもの、カルボニル反応基と
スルフヒドリル反応基を有するもの、及びスルフヒドリ
ル反応基と光反応性リンカーを含むものがある。適当な
ヘテロ二官能性架橋剤はBioconjugate techniques (199
6) 229-285; G Hermanson 編; Academic Press および
WO99/40214に記載されている。第一のカテゴリーの例に
は、SPDP(N−スクシンイミジル3-(2−ピリジルジチオ)
プロピオネート) 、SMBP (スクシンイミジル-4-(p-マレ
イミドフェニル) ブチレート) 、SMPT (スクシンイミジ
ルオキシカルボニル- ∀- メチル-(∀-2- ピリジルジチ
オ) トルエン) 、MBS (m- マレイミドベンゾイル-N- ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル) 、SIAB(N- スクシン
イミジル (4-ヨードアセチル) アミノベンゾエート) 、
GMBS (マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステ
ル) 、SIAX (スクシンイミジル−６−ヨードアセチルア
ミノヘキソネート) 、SIAC(スクシンイミジル−４−ヨ
ードアセチルアミノメチル) 、NPIA(P−ニトロフェニル
ヨードアセテート) があるが、これらには限らない。第
二のカテゴリーは、炭水化物含有分子 (例、env 糖タン
パク質、抗体) をスルフヒドリル反応性基に結合するの
に有用である。例としてはMPBH (4-(4- N-マレイミドフ
ェニル) 酪酸ジドラジド) 及びPDPH (4-(N- マレイミド
メチル) シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジ
ド、M2C2H 及び3-2(2-ピリジルジチオ) プロピオニルヒ
ドラジド) がある。第三のカテゴリーの例としては、AS
IB (1-(p- アジドサリシルアミド)-4- (ヨードアセトア
ミド) ブチレート) を挙げることができる。別の例に
は、Frisch等(Bioconjugate Chem. 7 (1996) 180-186)
に記載のチオール反応性試薬がある。
【００４４】結合(iii) には、リガンド部分のカルボキ
シレート基とのカルボジイミド反応に関与しうる脂質構
造中に存在するジアシルアミンのアミノ基がある。結合
(iv)は、例えばイミン形成、次いでシアノボロハイドレ
ート(cyanoborohydrate)を介して行われてもよい。
【００４５】結合(vi)は、例えば、安定なアミド結合連
結を生じるリガンド部分のNHS エステル誘導体とポック
スウイルスアミノ基を含む。別の例では、スルフヒドリ
ル基とスルフヒドリル反応性基を含むマレイミド−スル
フヒドリル結合を用いる。例えば、SATA(N−スクシンイ
ミジルＳ−アセチルチオアセテート) を用いてスルフヒ
ドリル基を導入でき、一方、スルホSMCC (スルホスクシ
ンイミジル４−(N−マレイミドメチル) シクロヘキサン
１−カルボキシレート) を用いてマレイミド基を導入し
てチオエーテル共有結合を生じさせることができる。
【００４６】共有結合は、ポリエチレングリコール (PE
G)やその誘導体などのポリマーを用いて生じさせてもよ
い。好ましくは、ポリマーは 200〜20000 Daの間の平均
分子量をもつ。例えば、トレシル(tresyl)−MPEGを用い
てLys 残基中に存在するアミノ基を結合させることがで
きる (例えばWO99/40214参照) 。PEG を介した２つの相
手を結合させる他の手段は文献に記載されている(Bioco
njugate techniques (1996) 606-618; G Hermanson編;
Academic Pressおよび Frisch et al. Bioconjugate Ch
em. 7 (1996) 180-186) 。
【００４７】非共有結合には、静電気的相互作用、例え
ば陽イオン性リガンド部分と負に帯電したポックスウイ
ルスとの間のものがある。別の例は、両パートナーを非
共有的に又は親和性により会合させうる、プロテイン
Ａ、ビオチン/ アビジン、抗体などの親和性成分を用い
ることからなる。例えば、ペプチドリガンド部分とポッ
クスウイルス粒子間の結合には、Roux等(1989, Proc. N
atl. Acad Sci USA 86,9079) により開示された技法に
より、表面に提示されたエピトープに対するビオチニル
化抗体及び、ペプチドリガンド部分に対するストレプト
アビジン標識抗体を用いてもよい。結合相手のそれぞれ
に対する二官能性抗体もまた、この目的に適している。
【００４８】遺伝子連結は、ポリペプチド又はその断片
であるリガンド部分を連結するためである。有利にはこ
のリガンド部分をコードする核酸を、非改変ポックスウ
イルス粒子の表面に局在する同種ポックスウイルスポリ
ペプチドをコードするウイルス核酸配列に融合させる。
しかし、本発明はさらに、リガンド部分をコードする核
酸が、ポックスウイルス粒子の表面にこのリガンド部分
を局在化させることを可能にする異種ポリペプチド
(例、膜固定ポリペプチド) をコードする核酸配列に融
合している遺伝子連結に関する。好ましくは、このリガ
ンド部分をコードする核酸はポックスウイルスの完全さ
には必須でないウイルスゲノムの領域において融合して
いる。
【００４９】第一の方法によれば、遺伝子連結は、表面
に露出した同種ポックスウイルスポリペプチドの少なく
とも一部が除去され、本発明で用いる異種リガンド部分
で置換されたキメラポリペプチドを生ずる。第二の方法
では、遺伝子連結は、本発明で用いる異種リガンドポリ
ペプチド部分が、表面に露出した同種ポックスウイルス
ポリペプチドに導入されたキメラポリペプチドを生じ
る。遺伝子連結から生じるポリペプチド融合は、任意の
位置、Ｎ末端、Ｃ末端又はウイルスポリペプチドの２つ
のアミノ酸残基の間で生じる。好ましくは、選ばれた遺
伝子連結部位 (すなわち、リガンド部分コーディング配
列が挿入されたウイルス核酸の部位) は対応するオープ
ンリーディングフレームを破壊しない。
【００５０】本発明のポックスウイルスがＩＭＶである
とき、これらの遺伝子連結に適した同種表面露出ポック
スウイルスポリペプチドには、A27L(p14タンパク質) 、
LIR、A14L、A17L(p21タンパク質) 、D8L 、A9L 、E10R
及びH3L 遺伝子の発現産物があるが、これらに限定され
ない。好ましい態様によれば、リガンド部分をコードす
るヌクレオチド配列を、このリガンド部分が最終的にp1
4 のＮ末端に位置するように、A27L遺伝子配列に融合さ
せる。好ましくは、このリガンド部分のコーディングヌ
クレオチド配列は、A27L遺伝子開始コドンのすぐ下流に
融合させる。
【００５１】本発明のポックスウイルス粒子がEEV であ
る場合、これらの遺伝子連結に適した同種表面露出ポッ
クスウイルスポリペプチドには、B5R 、A34R及びHA遺伝
子の発現産物があるが、これらに限定されない。好まし
い態様によれば、リガンド部分をコードするヌクレオチ
ド配列を、このリガンド部分が最終的に対応する発現産
物のＮ末端に位置するようにB5R 遺伝子配列に融合させ
る。好ましくは、このリガンド部分のコーディングヌク
レオチド配列を、B5R 遺伝子開始コドンのすぐ下流に融
合させる。
【００５２】本発明によれば、リガンド部分及びポック
スウイルス粒子は連結を改善または安定化するためにさ
らに改変されてもよい。詳しくは、リガンド部分は、標
的細胞への接近を容易にするためにその末端の一方にス
ペーサー部分を提示してもよい。さらに、本発明のポッ
クスウイルス粒子は、順次結合してもしなくてもよい、
例えば縦列構造の１又は２以上のリガンド部分を含んで
いてもよい。例えば、ポックスウイルス粒子の特定標的
細胞への特異性を増すことが望ましい場合は、この標的
細胞を認識し結合しうるリガンド部分の組み合わせを用
いることが有利であるかもしれない。
【００５３】本発明が求める目的に従い、リガンド部分
はポックスウイルス粒子のエンベロープ中への挿入を容
易にするシグナルペプチドを含んでよい。膜固定を可能
にする疎水性配列の使用が考えられるが、トランスゴル
ジ網への移動を可能にするシグナルペプチドを用いるの
が好ましい。かかるペプチドはゴルジ区画に天然に存在
する任意のタンパク質から分離又は同定出来る (例え
ば、Mochamer et Rose,1987, J. Cell Biol. 105, 1205
-1214; Mochamer, 1993, Curr. Opin. Cell Biol. 5, 6
06-612; Muesch et al., 1990, Trends Biochem sci 1
5, 86-88参照) 。シグナルペプチドは、その機能があま
り改変されていないという条件で、天然の配列に関して
１又は複数の改変を含みうる。本発明で用いる好ましい
シグナルペプチドは、ヒトのトランスゴルジ網糖タンパ
ク質TGN51(Kain et al., 1997, J.Biol. Chem. 273, 98
1-988) 由来である。これは、好ましくはリガンド部分
のＮ末端において遺伝子連結により導入される。好まし
くは、リガンド部分はウイルスポリペプチドに遺伝子連
結している。
【００５４】上記の特異的感性性を示す中空のポックス
ウイルス粒子 (偽ポックスウイルス粒子ともいう) を得
ることは可能だが、好ましい態様によれば本発明のポッ
クスウイルス粒子は、少なくとも１つの関心ある核酸、
詳しくは真核標的細胞においてその発現を可能にするエ
レメントの制御下に位置する少なくとも１つの治療用遺
伝子を含む組換え核酸を含む。しかしながら、本発明の
中空のポックスウイルス粒子、すなわち偽ポックスウイ
ルス粒子は、US5,928,944 及びWO9521259 に開示されて
いるような、標的化細胞の取り込みを容易にするため
の、関心ある核酸との複合体を形成させるのに用いても
よい。
【００５５】本発明において「核酸」という用語は、任
意のありうる核酸、特に、DNA 、RNA もしくは雑種形
態、一本鎖もしくは二本鎖、直鎖もしくは環状、天然も
しくは合成、改変されたもしくはされていない (改変例
についてはUS5525711 、US4711955 又はEP-A302 175 参
照) ものを意味する。それはとりわけ、ゲノムDNA 、ゲ
ノムRNA 、cDNA、mRNA、アンチセンスRNA 、リボソーム
RNA 、リボザイム、転移RNA もしくはこのRNA をコード
するDNA であってもよい。核酸は、細胞に供給すると、
ポリペプチド、リボザイム、アンチセンスRNA 又は関心
ある他の分子を産生しうる少なくとも１つの発現可能な
配列を含む、プラスミド又は直鎖核酸の形態であっても
よい。核酸はまた、細胞へ、例えばアンチセンスもしく
はリボザイム機能のために供給されるべきオリゴヌクレ
オチド (すなわち、100bp 以下の短いサイズの核酸) で
あってもよい。好ましくは、核酸はポックスウイルスゲ
ノムDNA の形態である。
【００５６】核酸が、遺伝子発現に適した環境に置かれ
た場合に適切な遺伝情報を含むならば、その転写単位は
コードされた遺伝子産物を発現するだろう。発現のレベ
ル及び細胞特異性は、関連プロモーターの強さと起源、
及び関連エンハンサーエレメントの存在及び活性化にか
なりの程度依存するであろう。従って好ましい態様にお
いては、転写制御エレメントは、CMV プロモーター／エ
ンハンサーなどのプロモーター／エンハンサー配列を含
む。しかしながら、当業者であれば、任意のウイルス、
原核細胞 (例、細菌の) もしくは真核細胞から得られて
もよく、構成性でも制御可能なものでもよく、また真核
細胞、特に標的細胞において発現に適した多様なその他
のプロモーター及び／又はエンハンサー配列が知られて
いることが分かる。より正確には、標的細胞による発現
に必要なこれらの遺伝情報は、該DNA をmRNAに転移する
のに、そして必要であればmRNAをポリペプチドに翻訳す
るのに必要なエレメントを含む。各種の脊椎系における
使用に適した転写プロモーターは、文献に広く記載され
ている。例えば、適当なプロモーターには、RSV 、MPS
V、SV40、CMV 又は7.5kのようなウイルスプロモータ
ー、ワクシニアプロモーター、誘導性プロモーター等が
ある。好ましいプロモーターはポックスウイルスから分
離されたもので、例えばワクシニアウイルスの7.5k、H5
R 、TK、p21 、ｐ11又はK1L がある。あるいは、Chakra
barti 等(1997, Biotechniques 23, 1094-1097) 、Hamm
ound等(1997, J. Virological Methods 66, 135-138)及
びKuman とBoyle(1990, Virology 179, 151-158)に記載
されたような合成プロモーター、また、初期及び後期ポ
ックスウイルスプロモーターの間のキメラプロモーター
を用いてもよい。
【００５７】核酸はさらに、追加の機能性要素を含んで
いてもよく、例えばイントロン配列、標的化配列、輸送
配列、分泌シグナル、核局在化シグナル、IRES、polyＡ
転写終結配列、三部分(tripartite)リーダー配列、複製
又は組み込みに関与する配列がある。この配列は文献に
報告されており、当業者により容易に得ることができ
る。
【００５８】好ましい態様において、関心ある核酸は、
治療用分子である遺伝子産物をコードする関心ある少な
くとも１つの配列 (すなわち、治療用遺伝子) を含む。
「治療用分子」は、患者、殊にある疾病や病状にかかっ
ている、又はこの疾病もしくは病状に対して防御される
べき患者に適切に投与された場合に薬理的もしくは防御
的活性を有するものである。このような薬理的もしくは
防御的活性は、この疾病もしくは病状の過程又は微候に
対する有益な効果に関連すると期待されるものである。
本発明の過程で当業者が、治療用分子をコードする遺伝
子を選択した場合、当業者は一般にその選択を以前に得
られた結果に関連づけ、請求された本発明を実施する以
外の過度の実験なしに該薬理特性を得ることを合理的に
期待しうる。本発明によれば、関心ある配列は、それが
導入される標的細胞と同種又は異種でありうる。有利に
は、この関心ある配列はポリペプチド、殊に治療もしく
は予防特性を与える治療用又は予防用ポリペプチドの全
部又は一部をコードする。ポリペプチドは、大きさに、
またグリコシル化されているかどうかにかかわらない、
ポリヌクレオチドの任意の翻訳産物であり、ペプチドと
タンパク質を含む。治療用ポリペプチドには、主な例と
して、動物又はヒト生体において欠陥もしくは欠損タン
パク質を補償しうるポリペプチド、又は生体から有害な
細胞を制限又は除去するために毒性の作用を通して作用
するものがある。それらはまた、体液性又は細胞性応
答、又は両方を引き起こす内在性抗原として作用する免
疫付与ポリペプチドであってもよい。
【００５９】治療用遺伝子によりコードされるポリペプ
チドの例には、サイトカイン (インターフェロンα、β
もしくはγ、インタロイキン、特にIL−２、IL−６、IL
−10もしくはIL−12、腫瘍壊死因子 (TNF)、コロニー刺
激因子(GM-CSF 、C-CSF 、M-CSF 等) 、免疫刺激ポリペ
プチド (B7.1、B7.2等) 、凝固因子 (FVIII 、FIX 等)
、増殖因子 (トランスフォーミング増殖因子TGF 、繊
維芽増殖因子FGF 等) 、酵素 (ウレアーゼ、レニン、ト
ロンビン、メタロプロテイナーゼ、酸化チッ素シンター
ゼNOS 、SOD 、カタラーゼ等) 酵素阻害剤 (α１−アン
チトリプシン、アンチトロンビンIII 、ウイルスプロテ
アーゼ阻害剤、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤
PAI-1)、CFTR (嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質) タ
ンパク質、インスリン、ジストロフィン、MHC 抗原クラ
スＩもしくはII、細胞遺伝子の発現を変化／調節しうる
ポリペプチド、細菌、寄生虫もしくはウイルス感染又は
その増殖を阻害しうるポリペプチド (抗原性ポリペプチ
ド、抗原性エピトープ、競合により天然のタンパク質の
作用を阻害するトランスドミナント(transdominant)変
異物、アポトーシス誘導剤もしくは阻害剤 (Bax 、Bc1
2、Bc1X等) 、細胞分裂抑制剤(p21、p16 、Rb等) 、ア
ポリポタンパク質 (ApoAI 、ApoAIV、ApoE等) 、血管生
成の阻害剤 (アンギオスタチン、エンドスタチン等) 、
血管生成ポリペプチド (血管内皮増殖因子VEGFのファミ
リー、FGF ファミリー、CTGFを含むCCN ファミリー、Cy
r61 及びNov)、酸素ラジカル除去剤、抗腫瘍効果をもつ
ポリペプチド、抗体、毒素、イムノトキシン及びマーカ
ー (β又はガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等) 又は
当分野で臨床症状の治療もしくは予防に有用であると認
められている関心ある任意の他の遺伝子がある。
【００６０】遺伝子機能不全の治療を考慮すると、欠陥
遺伝子の機能的対立遺伝子、例えば血友病ＡもしくはＢ
に関して因子VIIIもしくはIXをコードする遺伝子、筋疾
患に関してジストロフィン (もしくはミニジストロフィ
ン) 、糖尿病に関してインスリン、嚢疱性繊維病に関し
てＣＦＴＲを使用してもよい。
【００６１】適当な抗腫瘍遺伝子には、腫瘍抑制遺伝子
(例、Rb、p53 、DCC 、NF-1、ウィルムス腫瘍、NM23、
BRUSH-1 、ｐ16、ｐ21、ｐ56、ｐ73、またそれらの各変
異体) をコードするもの、自殺遺伝子産物、抗体、細胞
分裂もしくは形質導入シグナルを阻害するポリペプチド
をコードする遺伝子があるが、これらに限定されない。
【００６２】好ましい態様において、治療用遺伝子は、
不活性物質 (プロドラッグ) を細胞障害性物質へ変化さ
せ、それにより細胞死を生じさせうる発現産物をコード
する自殺遺伝子である。TK HSV-1をコードする遺伝子
は、自殺遺伝子ファミリーの始原型を構成する(Caruso
et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-
7028) 。TKポリペプチドは非毒性である一方、アシクロ
ビルやガンシクロビルなどのヌクレオシド類似体 (プロ
ドラッグ) の変換を触媒する。変換されたヌクレオチド
は伸長の過程にあるDNA 鎖に取り込まれ、この伸長を妨
害し、従って細胞分裂を阻害する。多数の自殺遺伝子／
プロドラッグの組み合わせが現在利用できる。より具体
的に言及できるのは、ラットシトクロームｐ450 及びシ
クロホスホファミド(Wei et al., 1994, Human Gene Th
er. 5, 969-978) 、Escherichia coli (E.coli) プリン
ヌクレオシドホスホリラーゼ及び６−メチルプリンデオ
キシリボヌクレオシド(Sorscher et al., 1994, Gene T
herapy 1, 223-238)、E.coliグアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ及び６−チオキサンチン(Mzoz et a
l., 1993, Human Gene Ther. 4, 589-595)である。しか
しながら、より好ましい態様では、本発明のポックスウ
イルス粒子は、プロドラッグの5-フルオロシトシン (5-
FC) と共に使用できる、シトシンデアミナーゼ (CDase)
もしくはウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ
(UPRTase)活性又はCDase をUPRTＴase の両方の活性を
有するポリペプチドをコードする自殺遺伝子を含む。自
殺遺伝子、例えばCDase とUPRTase 活性を有するポリペ
プチドをコードするもの、の組み合わせを用いることも
本発明に関して考えられる。
【００６３】CDase とUPRTase 活性は原核生物及び下等
真核生物で証明されているが、哺乳動物には存在しな
い。CDase は、通常は、外生シトシンが加水分解性脱ア
ミノによりウラシルに変換されるピリミジン代謝経路に
関与し、一方UPRTase はUMP 中でウラシルを変換する。
しかしながら、CDase はまたシトシン類似体、５−FCを
脱アミノして、５−フルオロウラシル (５−FU) を生成
させ、これはUPRTase 作用により５−フルオロ−UMP(５
−FUMP) に変換されると細胞障害性が高い。
【００６４】適当なＣＤase コーディング遺伝子には、
Saccharomyces cerevisiaeFCＹ1 遺伝子(Erbs et al.,
1997, Curr. Genet. 31, 1-6; WO93/01281) 及びE.coli
codＡ遺伝子(EP 402 108)があるが、これらに限定され
ない。適当なUPRTase コード遺伝子には、E.coli由来
(upp 遺伝子; Anderson et al., 1992, Eur. J. Bioche
m. 204, 51-56) 、Lactococcus lactis由来(Martinusse
n and Hammer, 1994, J. Bacteriol. 176, 6457-646
3)、Mycobacterium bovis 由来(Kim et al., 1997,Bioc
hem Mol. Biol. Int 41, 1117-1124)、Bacillus subtil
is 由来(Martinussen et al., 1995, J. Bacteriol. 17
7, 271-274)、及びSaccharomyces cerevisiae由来 (FUR
-1 遺伝子;Kern et al., 1990, Gene 88, 149-157) が
あるが、これらに限定されない。好ましくはCDase コー
ディング遺伝子はFCY1遺伝子由来であり、UPRTase コー
ディング遺伝子はFUR-1 遺伝子由来である。
【００６５】本発明はまた、その遺伝子産物の細胞障害
活性が保存されるならば、１又は複数のヌクレオチドの
付加、欠失及び／又は置換により改変された変異自殺遺
伝子の使用も含む。いくつかのCDase 及びUPRTase 変異
体、例えばCDase とUPRTaseの両方の活性を有する２ド
メイン酵素をコードする融合タンパク質 (WO96/16183)
、及び最初の35残基が欠失したFUR-1 遺伝子によりコ
ードされるUPRTase の変異体 (WO99/54481に開示の変異
TFCU-1) などが文献に報告されている。
【００６６】上述のように、治療用遺伝子にはまた、ガ
ン遺伝子や原ガン遺伝子 (c-myc, c-fos, c-jun, c-my
b, c-ras, Kc 及びJE) などの、選択された正に作用す
る増殖調節遺伝子のRNA に結合して破壊しうるアンチセ
ンス配列及びリボザイムコーディング遺伝子が含まれ
る。
【００６７】本発明のポックスウイルス粒子中に取り込
まれる核酸は１又は２以上の治療用遺伝子を含んでいて
もよい。これに関して、自殺遺伝子産物をコードする遺
伝子及びサイトカイン遺伝子 (例、インタフェロンα、
∃もしくはγ、インターロイキン、好ましくはIL−２、
IL−４、IL−６、IL−10もしくはIL−12の中から選択し
たもの、TNF 因子、GM-CSF、C-CSF 、M-CSF 等) 、免疫
刺激遺伝子 (例、Ｂ7.1 、Ｂ7.2 、ICAM) 又はchimioki
ne遺伝子 (例、MIP 、RANTES、MCP1等) の組み合わせが
有利である。異なる遺伝子発現はユニークプロモーター
(ポリシストロン性カセット) により、または独立のプ
ロモーターにより制御されてもよい。さらに、それらは
核酸と共に、同じもしくは反応の方向に、単一の部位も
しくは各種部位に挿入されてもよい。
【００６８】別の態様では、本発明はさらに、(i) 上述
の少なくとも１つの異種リガンド部分、および(ii)上述
のポックスウイルス粒子表面に天然に局在する同種ウイ
ルスポリペプチドの全部もしくは一部を含有するキメラ
タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド
配列を含むベクターに関する。当然、ヌクレオチド配列
は、その発現に必要なエレメントの制御下に置かれる。
本発明のベクターの選択は広範囲にわたり、当業者には
容易に入手できる。ベクターはプラスミドでも、任意の
動物ウイルス、殊に、アデノウイルス、レトロウイル
ス、AAV(アデノ随伴ウイルス) もしくはポックスウイル
ス由来のウイルスベクターでもよい。好ましい態様によ
れば、本発明のベクターはポックスウイルスベクター
(すなわち、ポックスウイルスゲノム DNA、殊にVVまた
はMVA ゲノム DNA) である。ここで用いる「一部」なる
用語は、ウイルスベクターの表面にリガンド部分の提示
を可能にするウイルスポリペプチドの断片を意味する。
さらに、本発明のベクターはまた、関心ある少なくとも
１つののヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００６９】関心ある配列および発現に必要な関連要素
をウイルスゲノムに挿入するための基本的技術は当業者
が利用できる多数の文献に記載されている (Piccini et
al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563; US
4,769,330; US 4,772,848;US 4,603,112; US 5,100,58
7 およびUS 5,179,993) 。この技術は、ウイルスゲノ
ム中の重複配列 (すなわち所望の挿入部位) と関心ある
配列を含むプラスミドとの間の相同的組換えに関する。
【００７０】ポックスウイルスゲノム内の挿入部位は、
組換えポックスウイルスが生きて感染性であり続けるよ
うに、好ましくは非必須遺伝子座である。適当な非必須
領域は、非コーディング遺伝子間領域、またはその不活
性化もしくは欠失がウイルスの増殖、複製もしくは感染
にあまり害を及ぼさない任意の遺伝子などであるが、こ
れらに限定されない。例えば、ポックスウイルスゲノム
中の欠失配列に対応する相補的配列を有するヘルパー細
胞系を用いることにより、ウイルス粒子の産生の間に欠
損機能がトランスに (in trans) 供給される条件で、必
須のウイルスの遺伝子座に挿入することも考えられる。
【００７１】例えば、コペンハーゲンワクシニアウイル
スを用いる場合、好ましくはチミジンキナーゼ遺伝子(t
k)内に位置する挿入部位を選べばよい(Hruby et al., 1
983,Proc. Natl.Acad. Sci USA 80, 3411-3415; Weir e
t al., 1983, J. Virol. 46, 530-537)。しかしなが
ら、その他の挿入部位も適しており、例えば、赤血球凝
集素遺伝子内のもの(Guo et al., 1989, J. Virol 63,
4189-4198)、K1L 遺伝子座内のもの、u 遺伝子内のもの
(Zhou et al., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190)
または多様な自然のもしくは操作された欠失が文献に報
告されているワクシニアウイルスゲノムの左端(Altenbu
rger et al., 1989, Archives Virol. 105, 15-27; Mos
s et al., 1981, J. Virol. 40, 387-395; Panicali et
al., 1981, J. Virol. 37, 1000-1010; Perkus et a
l., 1989, J. Virol. 63, 3829-3836;Perkus et al., 1
990, Virol. 179, 276-286; Perkus et al., 1991, Vir
ol. 180, 406-410)のものがある。
【００７２】MVA を用いる場合、同定された欠失Ｉ〜VI
I のいずれか内に、好ましくは欠失IIまたはIII に位置
する挿入部位(Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 7
2, 1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 103
2-1040)、およびD4R 遺伝子座内のものを選択するのが
好ましい。
【００７３】鶏痘ウイルスを用いる場合、チミジンキー
ゼ遺伝子内の挿入が考えられるが、関心ある配列は好ま
しくは非コーティング遺伝子間領域、例えば鶏痘ウイル
スゲノムの1.3kb Hind III断片のORF 7 と９の間に位置
する遺伝子間領域に導入される (EP 314 569およびUS
5,180,675参照) 。
【００７４】本発明はさらに、下記工程を含む本発明の
ポックスウイルス粒子を作製する方法を提供する： a)該ポックスウイルス粒子の種 (seed、接種物) を得
る、 b)許容細胞の培養物を調製する、 c)該細胞培養物に該ポックスウイルス粒子の種を感染さ
せる、 d)この感染細胞を適当な時間培養する、 e)細胞培養物および／または培養上清から、産生された
ポックスウイルス粒子を回収する、そして f)任意に、回収したポックスウイルス粒子を精製する。
【００７５】特別な態様では、a)とc)の工程を結合する
ことができる。この場合、本発明の方法は下記工程を含
む： a)許容細胞の培養物を調製する、 b)該細胞培養物に、野生型ポックスウイルス粒子を感染
させ、該細胞に該ポックスウイルスの DNAゲノムと相同
的組換えが可能な重複配列を両端に有する関心ある配列
を含むプラスミドをトランスフェクトする、 c)この感染細胞を適当な時間培養する、 d)細胞培養物および／または培養上清から、産生された
ポックスウイルス粒子を回収する、そして f)任意に、回収したポックスウイルス粒子を精製する。
【００７６】好ましい態様において、「許容細胞」と
は、受精卵から得た鶏胚より調製した初代鶏胚繊維芽細
胞(CEF) である。粒子のポックスウイルスゲノムが１ま
たは２以上のウイルス機能が欠損している (例、EEV 粒
子の産生に関与する少なくとも１つのの遺伝子において
欠損) 特定の態様によれば、トランスに欠損機能を付与
するヘルパー細胞を用いるのが有利であるかもしれい。
特に、F13L遺伝子によりコードされる機能が欠損したポ
ックスウイルスをF13L発現産物を発現する細胞系におい
て培養するのが好ましい。このよう細胞系はBorrego 等
(1999, J. Gen.Virol. 80, 425-432) に記載のようにF
13Lポリペプチドを発現する適宜ベクターのトランスフ
ェクションにより作製することができる。有利な態様で
は、本発明のポックスウイルス粒子の分離および増殖
は、本発明のリガンド部分により認識される抗リガンド
分子を表面に提示する標的細胞系上で行うことができ
る。これにより、野生型ゲノムの起こりうる混入を最小
にすることができる。例えば、MUC-1 ポリペプチドに特
異的なリガンド部分を有するポックスウイルス粒子は好
ましくはMUC-1 発現標的細胞上で増殖させる。表面に抗
リガンド分子を発現するかかる細胞系の構築は当業者の
なしうる範囲内である。
【００７７】「ポックスウイルス粒子の種」は、通常の
技術により、ポックスウイルスゲノムと関心ある配列を
取り込んでいるプラスミドとの間の相同的組換えの最後
に得られる。これに関し、例えば、本明細書の実験の項
を参照できる。
【００７８】プラスミドによる細胞の追加のトランスフ
ェクションが必要な場合、各種の広く使用されている細
胞トランスフェクション法 (例、DNA カルシウム沈降、
エレクトロトランスフェクション、…) を任意にプラス
ミド取り込みを容易にするグリセロールと組み合わせて
用いることができる。さらに、組換えウイルスが選択遺
伝子 (例、E.coli gtp遺伝子) を含んでいる場合、選択
工程を含むことができ、例えば工程Ｃにおいてミコフェ
ノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンの混合物を
含む選択的培地を用いることにより行える。
【００７９】ウイルス粒子は培養上清から回収できる
が、それらはまた細胞からも回収できる。慣用的に使用
される方法の１つは、任意の手段 (化学的、凍結／解
凍、浸透圧衝撃、機械的衝撃、音波処理等) により細胞
を溶解することからなる。本発明のポックスウイルス粒
子は、プラーク精製の連続操作により分離し、次いで従
来の技術 (クロマトグラフィー法、塩化セシウムまたは
ショ糖勾配上での超遠心)を用いて精製することができ
る。あるいは、ウイルス表面に提示されたリガンド部分
とその抗リガンドとの親和性を本発明のポックスウイル
ス粒子の精製に用いてもよい。例えば、精製は、a)固体
支持体上に関連抗リガンドを固定化し、b)ウイルス調製
物を、抗リガンドとリガンド部分の間の特異的結合を可
能にするのに十分な時間、固定化抗リガンドと接触さ
せ、c)結合していない材料を捨て、d)結合した材料を溶
離させ、そしてe)溶離した材料を回収することにより行
ってもよい。このような精製は、本発明のポックスウイ
ルス粒子に野生型もしくはヘルパーポックスウイルスが
最終的に混入することを減少させるのに有利である。
【００８０】本発明の方法は、IMV およびEEV 両方のポ
ックスウイルス粒子を産生するのに使用できる。本発明
の好ましい態様によれば、本方法は、EEV の追加のエン
ベロープを破壊し、IMV の選択産生を可能にする追加工
程を含む。好ましくは、この追加の工程は音波処理工程
または穏やかな洗浄剤 (例、Brij-58)における可溶化工
程からなる。
【００８１】本発明はまた、少なくとも１種のポックス
ウイルス粒子および／または少なくとも１種の本発明の
ベクターを含む組成物に関する。特別な場合には、この
組成物は、２またはそれ以上のポックスウイルス粒子、
および／または２またはそれ以上の本発明ベクターを含
み、ここで、それらは(i) 異種リガンド部分の性質およ
び／または(ii)関心ある配列の核酸の性質および／また
は(iii) ポックスウイルスの起源および／または(iv)粒
子の型 (IMV/EEV)により互いに異なる。この組成物は、
例えば、固体、液体、粉末、水性、凍結乾燥形態の各種
形態でありうる。好ましい態様では、この組成物はさら
に薬剤的に許容しうる担体を含み、ヒトまたは動物の治
療的処置のための方法に使用することを可能にする。こ
の特定の場合では、担体は好ましくは薬剤的に適した注
射可能な担体または希釈剤である(例えば、Remington's
Pharmaceutical Sciences, 第16版, 1980, Mack Publ
ishing Co参照) 。このような担体または希釈剤は薬剤
的に許容しうる、すなわち、使用する用量および濃度に
おいて受容者に非毒性である。これは好ましくは、等
張、低張または少し高張であり、例えばショ糖溶液によ
り供給される比較的低いイオン強度を有する。さらに組
成物は、任意の関連溶媒、滅菌、発熱物質を含まない水
を含む水性もしくは部分的に水性の液体担体、分散媒、
被覆物および同等物または希釈剤 (例、Tris-HCl、酢酸
塩、リン酸塩) 、乳化剤、可溶化剤もしくはアジュバン
トを含んでいてもよい。薬剤調製物のpHは、in vivo で
の適用に有用となるように適宜調整して緩衝剤で処理す
る。組成物は、液体溶液として、または投与前に溶液中
に懸濁されうる固体の形態 (例、凍結乾燥) として調製
してもよい。注射可能な組成物のための担体または希釈
剤の代表的例には、水、好ましくは生理的pHに緩衝液で
処理された等張生理食塩水 (例えばリン酸塩緩衝化生理
食塩水またはトリス緩衝化生理食塩水) 、マンニトー
ル、デキストロース、グリセロールおよびエタノール、
またヒト血清アルブミンなどのポリペプチドまたはタン
パク質がある。例えば、このような組成物は、10mg/ml
マンニトール、１mg/ml HSA 、20mM Tris pH7.2 および
150mM NaClを含んでいてもよい。
【００８２】本発明の組成物は、局所、全身、経口、直
腸、または局部投与用に常法によって製造することがで
きる。適した投与経路には、胃内、皮下、エアロゾル、
点滴、吸入、心臓内、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜
内、腫瘍内、鼻腔内、肺内または気管内経路があるが、
これらに限定されない。投与は一回であるいは一定時間
の間隔をあけて１または数回繰り返す量で行ってもよ
い。適当な投与経路および用量は、各種パラメーターに
より、例えば、関連する症状や疾病、予防もしくは治療
の必要度、進行の段階および導入する治療用遺伝子によ
って異なる。指標としては、ポックスウイルス粒子は10
4 〜1014 pfu (プラーク形成単位) 、有利には105 〜10
13 pfu、そして好ましくは106 〜1012 pfuの量で剤に配
合してもよい。力価は慣用の技術により決定される。ベ
クターの量は好ましくは、0.01〜10mg/kg 、特に0.1 〜
２mg/kg 含まれる。
【００８３】さらに、本発明の組成物は、脂質 (例、陽
イオン性脂質、リポソーム、WO98/44143に記載の脂質)
、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマー、キレート剤などの
１または２以上の安定化物質を、動物／ヒト体内での分
解から保護するために含有してもよい。
【００８４】別の態様では、本発明は遺伝子治療による
ヒトまたは動物生体の治療のための薬剤の調製のため
の、本発明のポックスウイルス粒子またはベクターの使
用を提供する。本発明の範囲において、「遺伝子治療」
とは、任意の治療用の遺伝子を細胞に導入する方法であ
ると理解すべきである。従って、これは、細胞性もしく
は体液性または両者でありうる免疫応答を誘導するため
に、潜在的抗原性エピトープを細胞に導入することに関
する免疫治療も含む。
【００８５】本発明の使用は、ポックスウイルス粒子の
表面に提示されるか、本発明のベクターにより発現する
リガンド部分の標的化特性に依存する。従って、病原因
子 (細菌、ウイルスまたは寄生虫) に感染した細胞の表
面に存在する分子を認識して結合しうるリガンド部分
は、このような感染により生じる任意の病状や疾病の治
療または予防に適している。腫瘍標的化リガンド部分
は、ガンの治療または予防により意図される。「ガン」
の用語は、拡散もしくは局在化腫瘍、転移、ガン性ポリ
ープおよびプレ新生物病変 (例、形成異常) を含む任意
のガン性病状、ならびに望ましくない細胞増殖から生じ
る病気を含む。より詳しくは、胸部、子宮頸部 (特にパ
ピローマウイルスにより引き起こされるもの) 、前立
腺、肺、膀胱、肝臓、結腸直腸、膵臓、胃、食道、喉
頭、中枢神経系、血液 (リンパ腫、白血病等) 、黒色
腫、肥満細胞腫等を挙げることができる。
【００８６】本発明はさらに、治療に有効な量の本発明
のポックスウイルス粒子、ベクターまたは組成物をヒト
または動物生体に投与することを含む、ヒトまたは動物
生体の治療方法を提供する。「治療に有効な量」とは、
治療することが望まれる疾病や病状に通常関連した１ま
たは２以上の症状の軽減に十分な量である。予防的使用
に関する場合、この用語は疾病や病状の発症を予防また
は遅延させるのに十分な量を意味する。
【００８７】本発明の方法は、上に挙げた疾病や病状に
関する予防目的および治療用途に用いることができる。
本発明方法は、ここに記載したと同様の方法を用いて、
任意の型の腫瘍の発症を防止するか、または既存の腫瘍
を逆転させるのに特に有用である。本発明方法が多様な
任意の方法により実施できることは当然である。有利に
は、本発明のポックスウイルス粒子、ベクターまたは組
成物は任意の慣用の生理学的に許容しうる投与経路によ
り、例えば静脈内注射により接近可能な腫瘍へ、噴霧や
点滴の手段により肺へ、適宜カテーテルを用いて血管系
へ、等によりinvivo で直接投与することができる。ex
vivo の方法を採用してもよく、これは患者から細胞
(骨髄細胞、末梢血リンパ球、筋芽細胞等) を採取し、
従来の技術により本発明のポックスウイルス粒子または
ベクターを導入し、そしてこれを患者に再投与すること
からなる。
【００８８】本発明によるin vivo 治療の場合では、ト
ランスフェクション率を改善するために、上記薬剤調製
物の投与の前に患者はマクロファージ低減処置をうけて
もよい。このような手法は文献に記載されている (特に
Van Rooijen et al., 1997,TibTech, 15, 178-184参照)
。
【００８９】好ましい態様によれば、本発明の方法が、
本発明の特徴を示し、かつ自殺遺伝子を発現する組換え
ポックスウイルス粒子を用いる場合、発現した自殺遺伝
子産物に特異的なプロドラッグを薬剤的に許容しうる量
でさらに投与するのが有利でありうる。２回の投与は同
時にまたは連続して行うことができるが、好ましくは本
発明のポックスウイルス粒子の後にプロドラッグを投与
する。例えば、50〜500 mg/kg/日の量でプロドラッグを
使用することが可能であるが、200 mg/kg/日の量が好ま
しい。プロドラッグは標準的実施法に従って投与され
る。経口投与が好ましい。プロドラッグは１回で、また
は宿主生物または標的細胞内で毒性代謝物が産生されう
るように十分長い期間で複数回を反復投与することが可
能である。上述のように、プロドラッグのガンシクロビ
ルまたはアシクロビルを、TK HSV-1遺伝子産物と組み合
わせて、そして5-FCをFCY1、FUR1および／またはFCU1遺
伝子産物と組み合わせて用いることができる。
【００９０】腫瘍の治療のために意図される方法を説明
すると、まず、自殺遺伝子を発現し、その表面に腫瘍細
胞により発現される腫瘍抗原を認識し、結合しうるリガ
ンド部分を提示すポックスウイルス粒子を投与してもよ
い。一旦感染すると、ガン性細胞は自殺遺伝子を発現す
るであろう。選ばれた自殺遺伝子産物により代謝される
プロドラッグを投与することにより、感染細胞を殺すこ
とができる。MUC-1 陽性胸部ガン (乳ガン) の予防また
は逆転が望ましい個体においては、FCU-1 を発現し、そ
の表面にMUC-1 腫瘍抗原を認識し結合しうるSM3 scFvリ
ガンドを有するポックスウイルス粒子を用いることがで
きる。プロドラッグ5-FCをさらに投与してMUC-1 陽性感
染細胞を殺してもよい。
【００９１】さらに本発明の方法の１つの特徴は、本発
明のポックスウイルス粒子が治療される生体においてin
vivo で産生されうることである。これに関して、リガ
ンド部分をその表面に提示しないが、EEV ポックスウイ
ルス粒子の表面に局在するポリペプチドをコードする配
列 (例、B5R 遺伝子) 中に上記リガンド部分をコードす
る核酸を挿入して遺伝子操作されたポックスウイルスゲ
ノムを含む、IMV ポックスウイルス粒子を患者に投与す
ることが考えられるかもしれない。従って、この特別の
態様では、組換えポックスウイルスゲノムはin vivo に
おいて (すなわち、患者への投与後に) 本発明に従って
EEV 粒子を産生することができ、一方、投与されたIMV
形態は依然として野生型ポックスウイルスの性質を示
す。投与されたこのIMV 粒子は非特異的に患者細胞 (非
標的化細胞) に感染するので、ウイルスゲノムは宿主の
感染した細胞中で複製し、標的細胞のみに感染しうるEE
V 粒子を放出するであろう。
【００９２】本方法を単独で用い、あるいは所望により
現在利用しうる方法 (例、放射線照射、化学療法および
外科手術) と組み合わせて、疾病もしくは病状の予防も
しくは治療を行うことができる。
【００９３】本発明のポックスウイルス粒子の感染特異
性は実際に、その表面に局在するリガンド部分の結合特
異性に関連している。従って、このポックスウイルス粒
子は、このリガンド部分と抗リガンド分子間の特異的結
合に基づく方法において使用することができる。このよ
うに、本発明はまた、試料中に存在する任意の抗リガン
ド分子、または拡張して、抗リガンド分子を含む任意の
化合物を、検出及び／又は分離及び／又は濃縮及び／又
は精製及び／又は解析する方法に関し、この方法では、
本発明のポックスウイルス粒子 (すなわち、その表面に
該分子に特異的に結合しうる異種リガンド部分を提示し
ている) が、もし試料中に存在する場合、該抗リガンド
分子または該化合物と結合複合体を形成するのに使用さ
れる。
【００９４】本発明はまた、試料中の任意の抗リガンド
分子、または拡張してこの抗リガンド分子を含む任意の
化合物を、検出及び／又は濃縮及び／又は分離及び／又
は精製及び／又は解析するための試薬に関し、この試薬
は本発明のポックスウイルス粒子 (すなわち、その表面
に該分子または化合物に特異的に結合しうる異種リガン
ド部分を提示している) を含む。
【００９５】本発明は特に、試料中の任意の抗リガンド
分子、または拡張して、この抗リガンド分子を含む任意
の化合物を、検出及び／又は濃縮及び／又は分離及び／
又は精製及び／又は解析する方法に関し、これは以下の
工程を含む：この試料を結合反応を可能にする条件下で
本発明の試薬と接触させ、次いで形成された何らかの結
合複合体を分離し、可能であれば検出し及び／又は定量
する。
【００９６】さらに詳しくは、本発明は、下記工程を含
む、試料中に存在する任意の抗リガンド分子または広
く、この抗リガンド分子を含む任意の化合物を、本発明
の試薬を用いて検出及び／又は濃縮及び／又は分離及び
／又は精製及び／又は解析する方法に関する： a)固体支持体に該試薬を固定化する、 b)該試料を、抗リガンド分子またはこの抗リガンド分子
を含む化合物を該試薬の異種リガンド部分と特異的に結
合させるのに十分な時間、該固定化試薬と、接触させ
る、 c)結合していない試料を捨てる、 d)工程b)で保持された抗リガンド分子または抗リガンド
分子を含む化合物を溶離させる、そして、 e)工程d)において溶離した該抗リガンド分子または抗リ
ガンド分子を含む化合物を解析する。
【００９７】ここで用いる「固体支持体」とは、マイク
ロ滴定スライド、ホイル、カラム、シート、コーン、ウ
ェル、ビーズまたはその他の任意の適当なミクロもしく
はマクロ粒子基体の形態のもの (ただし、これらに限定
されない) であり、本発明のウイルス粒子を固定化しう
る任意の材料を含む。これは、化学的に変性された合成
材料であってもよく、さもなくば殊に多糖類、例えばセ
ルロース材料 (例、紙) 、セルロース誘導体 (例、ニト
ロセルロース及び酢酸セルロース) 又はデキストラン(B
IAcore、スウェーデン、ウプサラ);ポリマー類 (例、塩
化ビニル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリレ
ート又は共重合体 (例、プロピレン- 塩化ビニル共重合
体、塩化ビニル−酢酸ビニル共重合体、スチレンを主成
分とする共重合体);天然繊維 (例、綿) 及び合成繊維
(例、ナイロン) であってもよい。
【００９８】好ましくは、「固体支持体」はポリスチレ
ンポリマー、ブタジエン／スチレン共重合体、又はブタ
ジエン／スチレン共重合体をポリスチレン、スチレン／
アクリロニトリル又はスチレン／メチルメタクリレート
共重合体から選ばれた１又は２以上の重合体と混合した
もの、ポリプロピレン、ポリカーボネート等である。
【００９９】試薬 (すなわち、本発明のウイルス粒子を
含む) は固体支持体に直接又は間接に結合しうる。直接
法を用いると、２つのやり方が可能である。固体支持体
上への試薬の吸着による、すなわち非共有結合 (主に水
素、ファンデルワールス又はイオン型の)によるか、又
は試薬と支持体との間の共有結合の形成による方法であ
る。間接的には、基体へ「抗試薬」化合物を予め結合
(吸着又は共有結合により) しておくことが可能であ
り、該化合物は、試薬と相当作用しうる、例えばこの系
を固体基体に固定化することができる。例を挙げると、
抗リガンド分子との結合に関与する部分とは異なるポッ
クスウイルス粒子の部分と免疫学的に反応性であること
を条件として抗体; 例えば、ポックスウイルス粒子上に
ビタミンなどの分子をグラフトし、そして固体相上には
対応する受容体 (例えばビオチン- ストレプトアビジン
系) を固定化することによるリガンド−受容体系があ
る。間接法はまた、タンパク質もしくはこのタンパク質
の断片またはポリペプチドのポックスウイルス粒子タン
パク質の一端への遺伝的連結による予備的グラフト又は
融合と、グラフト又は融合されたタンパク質又はポリペ
プチドの受動的吸着又は共有結合によるポックスウイル
ス粒子タンパク質の前記支持体への固定化も意味するこ
とは理解されよう。
【０１００】本発明方法に関連して、「抗リガンド分子
又は広く、この抗リガンド分子を含む任意の化合物」な
る用語は、試料又は前に定義した標的細胞中に含まれて
いるかもしれない薬剤やポリペプチドなどの有機化学物
質を広く意味し、より詳しくは腫瘍細胞である。例え
ば、in vitro又は合成法の結果作製されうる非天然分子
を意味しうる。これは、細胞又は生物学的試料 (培養細
胞、細胞、器官又は組織生検材料、体液等) に存在する
天然の分子、例えば抗体、細胞受容体、ウイルス受容体
及び腫瘍マーカーなどでありうる。所望により、試料を
HPLCなどの方法を用いて加工することが可能であり、こ
れは、ある決まった範囲の分子量、親水性等を有する分
子中で濃縮された画分を提供できる。濃縮の条件は、そ
の分子の化学構造及び技術により当業者により決めるこ
とができる。
【０１０１】溶離工程は、結合したリガンド部分／抗リ
ガンド分子を分離することが可能な任意の技術を用いて
行うことができる。これらの技術は、文献に十分に記載
されており、前記結合の物理化学的性質に基づく。例え
ば、pH又はイオン強度の条件を変化させることができ
る。さらに、リガンド及び分子の特異的結合と競合しう
る溶離化合物を用いることも可能である。
【０１０２】本発明の別の目的は、抗リガンド分子、又
は広くは該抗リガンド分子を含む任意の化合物 (例、腫
瘍細胞) を検出するためのキットであり、これは、試薬
と適合性 (すなわち、リガンド部分と抗リガンド分子と
の結合を妨げない) である固体基体に結合した前記試薬
を含む。
【０１０３】最後に、本発明のポックスウイルス粒子
は、以下の工程を用いて同定してもよい。まず、ポック
スウイルス粒子ライブラリーを用意する。このポックス
ウイルス粒子ライブラリーは、ランダムポリペプチドリ
ガンド部分をクローニングし、それらをポックスウイル
ス表面に正しい折り畳まれ方で発現するように設計され
る。ここで用いるように、「ライブラリー」の用語は、
約10〜数10億までの、少数から多数の異なるリガンド部
分を表面に提示するポックスウイルス粒子のコレクショ
ンを意味する。好ましくは、リガンド部分は抗体又はペ
プチドの単鎖断片である。ウイルス表面にリガンドの多
様な集団を発現するポックスウイルス粒子ライブラリー
が、ファージ展示ライブラリー(WO97/10507)又はワクシ
ニア直接連結ベクター(Merchlinsky et al., 1997, Vir
ol 238, 444-451)に記載したようにして製造できる。あ
るいは、発現ライブラリーからの核酸配列 (ゲノム断
片、選択した器官及び組織由来のcDNA) 又はペプチドモ
チーフを発現しているランダムライブラリーを用いても
よい。このようなライブラリーは文献に記載され、市販
されている(Invitrogene, USA 参照番号 K1125-01; Clo
ntech Laboratories Inc参照番号 NL4000AA)。
【０１０４】好ましくは、上記のように、ポリペプチド
リガンド部分をコードする核酸配列を、ポックスウイル
ス粒子の表面に天然に局在するタンパク質をコードする
適宜ポックスウイルス遺伝子にクローニングする。好ま
しい態様において、ポリペプチドリガンド部分を、IMV
又はEEV 表面ポリペプチドの１つとの融合タンパク質と
して発現させる。より好ましい態様では、ポリペプチド
リガンド部分を、IMV表面上に存在するp14 タンパク質
か又は、EEV 表面上に存在するB5R 遺伝子産物のＮ末端
に枠内で融合させる。
【０１０５】次いで、前記ポックスウイルス粒子ライブ
ラリーを、同定された抗リガンド分子、又は広く、この
抗リガンド分子を含む同定された化合物 (例、MUC1を発
現している腫瘍細胞) からなる固定化試薬と接触させて
おく。この接触は、ポックスウイルス粒子ライブラリー
の表面に存在するリガンド部分と、固定化された試薬中
に存在する同定抗リガンド分子との特異的結合を可能に
するのに十分な時間行う。特異的結合は、適当なpHと容
量オスモル濃度により向上させることができる。好まし
くは、ポックスウイルス粒子ライブラリーを、約６〜約
9.5 、より好ましくは約７〜約8.5 のpHを有する緩衝液
中におく。さらに各種方法が、非特異的結合を防止する
のに有用であり、例えば接触工程前に非特異的結合のブ
ロックに有用な任意の物質 (例、血清アルブミン、デキ
ストラン硫酸等) を用いて予備吸着工程を行うことによ
る方法がある。
【０１０６】非結合粒子を除去し、結合粒子を溶離させ
る。試薬の固定及び溶離条件は上記のように行う。固定
化試薬上に結合により保持されたライブラリーからのポ
ックスウイルス粒子を次に解析する。より詳しくは、こ
の解析は、分離されたポックスウイルス粒子のゲノム中
に挿入された核酸をコードするリガンド部分の配列決定
により行う。この方法の中で同定されたリガンド部分の
結合特異性は、(i) 標的細胞及び非標的細胞を用い、そ
して、実験の項に開示された方法に従い、このリガンド
部分を提示するポックスウイルス粒子の感染性を制御す
ることにより、又は(ii)本発明の試薬を調製し、それを
固体支持体に固定化し、そして、上記のように標的細胞
及び非標的細胞を解析する方法を実施することにより、
容易に確認できる。
【０１０７】これらの及びその他の態様は、本発明の記
載及び実施例に開示され、これらから明らかであり、ま
たこれに含まれる。本発明により用いられる方法、用途
及び化合物のいずれかに関する別の文献は、例えば電子
機器を用いて公開のライブラリーから引き出してもよ
い。例えば、公共のデータベース「Medline 」を用いて
もよく、これは、インターネットで利用でき、例えば、
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html.で
利用できる。さらに、http://www.ncbi.nlm.nih.gov, h
ttp://www.infobiogen.fr, http://www.fmi.ch/biology
/research tools.html, http://www.tigr.org のような
データベースやアドレスも当業者に知られており、また
http://www.lycos.com.を用いても得られる。バイテク
ノロジーにおける特許情報の全体、及び過去の検索及び
現在の事情を知るのに有用な関連の特許情報源の調査
は、Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364 に示されてい
る。
【０１０８】本発明はまた、本発明のポックスウイルス
粒子と野生型ポックスウイルス粒子の両方を含むウイル
ス調製物から本発明のポックスウイルス粒子を精製する
方法にも関し、このウイルス調製物を、異種リガンド部
分を結合しうる抗リガンド分子で被覆した固体支持体に
結合する工程、このポックスウイルス粒子を回収する工
程を含む。好ましくは、結合工程は、表面プラズモン共
鳴により行い、より好ましくはBIAcore X TMバイオセン
サーシステム(BIAcore AB 、スウェーデン、ウプサラ)
を製造者の指示に従って用いて行う。好ましい態様で
は、アミン結合キット(BIAcore AB 、Uppsala 、スウェ
ーデン) を用いたアミン結合により、ストレプトアビジ
ンをSAセンサーチップの固体支持体に共有結合させる。
次に、ビオチニル化抗リガンド分子を、ストレプトアビ
ジンで被覆されたSAセンサーチップ上にフローセル(flo
w cell) 内で固定化する。フローセル１は参照として働
く。本発明の流体相ポックスウイルス粒子の結合を１×
104 〜１×1010 pfu/ml の範囲にわたり測定した。注入
量は５〜100 μl であり、流速は２〜10μl/mlである。
特異的標的化粒子の回収のために表面をNaOH(2〜50mM)
で再生させる。好ましくは、固体支持体はデキストラン
支持体である。好ましくは抗リガンド分子はMUC-1 由来
ペプチドであり、特にMUC-1 の３縦列反復を提示する60
マ−である。
【０１０９】本発明の方法はさらに、許容細胞にこの回
収ポックスウイルス粒子を感染させる工程を含む。この
工程は標準技術により行う。好ましくは、感染工程はED
TA(0.1〜10mMであり、１mMが好ましい) の存在下で行
う。
【０１１０】上記で引用した特許、刊行物およびデータ
ベースの開示は、各特許、刊行物またはエントリーが参
照として援用されるように具体的にかつ個別に指示され
ている限り、すべて具体的に、その全体を参照として本
明細書に援用する。
【０１１１】以下の実施例は本発明を説明するためのも
のである。
【０１１２】
【実施例】以下に記載の構築は、Maniatis等 (1989, La
boratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, Cold Spring Harbor NY)に詳しく説明されている一
般的遺伝子操作及び分子クローニング手法により、又は
市販のキットを用いる場合には製造者の推奨に従い、行
われる。PCR 増幅技術は当業者に知られている (例え
ば、PCR プロトコル−方法及び応用への指針、1990, In
nis, Gelfand, Sninsky 及びWhite, Academic Press 発
行、参照) 。
【０１１３】組換えM13 バクテリオファージを寒天系最
小培地又は液体の多いLBM 培地中でE. coli NM522 株
(Strategene) 上で増殖させる。アンピシリン耐性遺伝
子を有する組換えプラスミドを、抗生物質を100 μg/ml
添加した寒天又は液体培地で,E. coli C600 (Stratagen
e) 、BJ5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557
-580)及びNM522 株中で複製させる。クローニングを相
同的組換え(Bubek et al., 1993, Nucleic acid Res. 2
1, 3601-3602) によって行う場合はBJ5183株を用いるの
が好ましい。
【０１１４】組換えワクシニアウイルスの構築は、上で
引用した文献及びMackett 等(1982,Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 79, 7415-7419)及びMackett 等 (1984, J. Vi
rol. 49, 857-864)における当分野の慣用的手法により
行われる。E. coli の選択遺伝子gpt(キサンチングアニ
ンホスホリボシルトランスフェラーゼ)(Falkner andMos
s, 1988, J. Virol. 62, 1849-1854)を、組換えワクシ
ニアウイルスの選択を容易にするために用いる。
【０１１５】実施例１：MUC1陽性細胞を標的化するMVA
の構築 ２つの異なる構築物を操作した：MVATG14519は、SM３モ
ノクローナル抗体のscFv鎖がMVA 138L ORF (p14-KDa)の
Ｎ末端にその天然の形態で融合しているキメラp14 タン
パク質を発現するMUC-1陽性腫瘍細胞を標的化するよう
に操作されたMVA ベクターである。
【０１１６】MVATG14552 (図２) は、MUC-1 陽性腫瘍細
胞を標的化するように操作されたMVA ベクターであり、
SM３モノクローナル抗体のscFv鎖のＮ末端に融合したヒ
トトランスゴルジ網糖タンパク質TGN51(Kain et al., 1
997, J. Biol. Chem 273, 981-988 により記載された配
列) のシグナルペプチドの存在を除いて、MVATG14519に
類似している。
【０１１７】Ａ. MVA138L 遺伝子改変 scFv配列の挿入のためのクローニングベクターはPCR に
基づく方策を用いて組立てられている。MVA138L 遺伝子
の3'末端及び3'フランキング領域を、プライマーOTG123
40 (配列番号１) 及びOTG12343 (配列番号２) を用いて
増幅し、断片Ｃを作成する。初期−後期プロモーターpH
5R (Goevel et al., 1990, Virol 179,247-266, 517-56
3) の制御下におかれたE. coli gpt をコードする選択
マーカー発現カセットをpH5R-GPT (FR 98 13279) (以降
pTG9996 と称する) などの従来のプラスミドDNA から、
プライマーOTG12342 (配列番号３) 及びOTG12341 (配列
番号４) を用いてPCR により分離し、断片Ｅを得る。断
片ＣとＥの融合を、両断片とプライマーOTG12340及び12
342 (断片Ｆ) を混合することによりPCR によって行
う。
【０１１８】scFvを天然のp14-kDa と融合させ断片Ａを
生成させ、次いでこれをM13TG6131のEcoRI とHindIII
部位間でクローニングし (WO99/03885の実施例７) 、M1
3TG14025を生じさせる場合は、MVA138L の上流領域を縦
列プライマーOTG12338 (配列番号５) 及びOTG12359 (配
列番号６) を用いて増幅する。scFvをそのＮ末端でトラ
ンスゴルジ網糖タンパク質TGN51 転座シグナルに融合さ
せる場合は、増幅をプライマーOTG12338 (配列番号５)
及びOTG12346 (配列番号７) を用いて行う。得られた断
片 (断片Asp)を、M13TG6131 のEcoRI とHindIII 部位間
にクローニングし、M13TG14027を得る。両構築物はMVA1
38Ｌコーディング配列の上流にユニークHindIII 部位を
有する。
【０１１９】MVA138L とMVA138L の下流領域とを、プラ
イマーOTG12380 (配列番号８) 及びOTG12339 (配列番号
９) を用いて増幅する。得られた断片 (断片Ｄ) をM13T
G6131 のEcoRI とHindIII 部位の間でクローニングし、
M13TG14026を得る。断片A/D又はAsp/D をHindIII とEco
RI での消化により分離し、ベクターpTG1E (WO99/03885
の実施例２) のEcoRI 部位に挿入して、pTG14359 (A/D
断片を含有) 及びpTG14359 (Asp/D 断片を含有) をそ
れぞれ生じる。次いで断片ＦをPacI部位で、pTG14359ま
たはpTG14358のいずれかの中に挿入する。最終の構築物
をpTG14366及びpTG14365と称する。
【０１２０】Ｂ. SM3 scFvの分離 SM3 ハイブリドーマはBurschell 等 (1987, Cancer Res
47, 5476-5482) 、Girling 等 (1989, Int J Cancer 4
3, 1072-1076) 及びDokurno 等 (1998, J. Mol. Biol.
284, 713-728) により報告されている。MUC-1 腫瘍関連
形態上で認識されるエピトープはP-D-T-R-P である。SM
3 scFvは、SM3 抗体軽鎖 (GeneBank、受託番号AF04214
3) の可変領域が後に続く10残基のスペーサーに連結し
た、SM3 抗体重鎖 (GeneBank、受託番号AF042142) の可
変領域を含む。各可変領域は、pMAL-SM3のような従来の
プラスミドから、例えば、pTG14366のHindIII 部位内へ
のSM3-scFv配列の挿入には、縦列プライマーOTG12360
(配列番号10) 及びOTG12361 (配列番号11) を用いて、
又は、pTG14365のHindIII 部位内へのSM3-scFv配列の挿
入には縦列プライマーOTG12344 (配列番号12) 及びOTG1
2361 (配列番号11) を用いてPCR により分離することが
できる。得られる構築物はpTG14519及びpTG14552(図２)
と称する。
【０１２１】Ｃ. MVA 感染性粒子の分離 MVA のサブクローンはStickl等 (1974, Deutsch Med Wo
chenschr 99, 2386-2392;Mayr et al., 1978, Zentralb
l Bakteriol 167, 375-390) の記載のように粗製材料か
らGMP 条件で分離されている。このサブクローンはMVAT
GN33.1と称される。この親MVA は通常通りCEF 上で増殖
させ、力価決定する。
【０１２２】CEF は、予じめ湿気のある雰囲気中37℃に
おいて11日間培養しておいた受精卵から得た鶏胚から調
製する。鶏胚を小片に切断し、トリプシンの2.5 ％ (w/
v)溶液で処理する。次いでCEF を、10％ウシ血清加イー
グル系培地 (MBE)／トリプトース (Gibco BRL)中 1.5×
106 細胞／シャーレの細胞密度でFalcon 3001 プラスチ
ックシャーレに入れる。48時間後、単層細胞に、細胞上
にウイルスを吸着させるために、PBS + 陽イオン (酢酸
マグネシウム及びCaCl2 をそれぞれ１mg/ml)＋１％ウシ
血清中で30分間MVATGN33.1を感染させる。感染細胞を次
いで、37℃５％CO2 でMBE ＋５％ウシ血清中で１時間培
養する。次いで、１〜5gのプラスミド (pTG14519又はpT
G14552) をヘペス及びCaCl2 の溶液中で析出させる。析
出DNA を感染細胞単層上に置き、37℃、５％CO2 で２時
間インキュベートする。プラスミド移行を容易にするた
めに、グリセロール衝撃を１分間行うことができる。こ
の目的には、グリセロールのMBE/トリプトース中の10％
溶液を、１分間細胞単層上に置く。次に単層をPBS ＋陽
イオンで洗浄し、37℃５％CO2 でMBE ＋５％ウシ血清中
でインキュベートする。48時間後シャーレを凍結する。
【０１２３】組換えプラークの分離を次のように行う。
シャーレを解凍し、感染細胞を回収し、MBE/ウシ血清内
で超音波処理する。次に組換えウイルスを、Falkner 及
びMoss (1988, J. Virol. 62, 1849-1854)に既報のよう
に、250 μg/mlキサンチン、15μg/mlヒポキサンチン及
び25μg/mlミコフェノール酸の存在下で選択マーカーの
圧力下でCEF 中でのプラーク精製の連続回により分離す
る。
【０１２４】ストック (ウイルス種) を、MVA を感染さ
せた108 CEF を含むF175フラスコ中で調製することがで
きる。ウイルスを48〜72時間増殖させる。感染細胞及び
培地をプールし、懸濁液を超音波処理する。粗抽出物を
まず、36％ショ糖のクッション上で分画する。ウイルス
ペレットを次いで、Joklik (1962, Virology 18, 9-18)
に記載のようにして不連続ショ糖勾配上で分画する。
【０１２５】実施例２：FCU-1 を発現し、MUC1陽性細胞
を標的化する組換えMVA の構築 DNA プラスミドpTG13046(WO99/54481 においてpCI-neo
FCU1と称される) のHindIII/KpnI消化によりFCU-1 遺伝
子を分離した。pTG6019 (WO99/03885 の実施例２) と称
される欠失III のフランキング領域への相同配列を含む
導入ベクターを次のようにして改変した。初期後期pH5R
ワクシニアウイルスプロモーターの制御下におかれE. c
oli gpt をコードする発現カセットをSacI消化によりDN
A プラスミドpTG9996 から分離した。このDNA 断片を次
に、DNA プラスミドpTG6019 のSacI部位内に挿入して、
pTG14033を生じる。合成初期後プロモーターp11K75 (配
列番号13) を、プライマーOTG12271 (配列番号14) とOT
G12272 (配列番号15) を用いて鋳型Ｍ13TG4052からPCR
により分離する。M13TG4052 はM13TG130 (Kieny etal.,
1983, Gene 26, 91-99) に基づいている。プロモータ
ー11K7.5は、5'から3'方向に、転写開始部位のヌクレオ
チド＋４までの後期プロモーター11K の配列(Geobel et
al., 1990,前出) を−18位にＡの代わりにＣを有する
ヌクレオチド−28〜−13からのTKプロモーター配列、及
び初期7.5Kプロモーターのヌクレオチド−12〜＋６間の
領域を含有する。
【０１２６】増幅断片を、pTG14033のBamHI 部位内に挿
入する前にBamHI 及びBg1II 制限酵素で消化して、pTG1
4084を得る。FCU-1 遺伝子を、次のようにして相同的組
換えによりp11K75プロモーター下流にクローニングす
る。まず、合成配列を、OTG12522 (配列番号16) 及びOT
G12523 (配列番号17) を用いてpTG14084のPstI及びBamH
I 部位間に挿入する。次にDNA プラスミドをXhoIで直鎖
とし、FCU-1 遺伝子との相同的組換えをE. coli 中で行
う。得られたDNA プラスミドをpTG14322と呼ぶ。
【０１２７】MVATG14552に感染し、pTG14322でトランス
フェクトしたCEF における相同的組換えにより、自殺遺
伝子FCU-1 を発現するMUC1標的化MVA が得られる結果と
なる。
【０１２８】実施例３：F13LE がノックアウトされたMV
A の産生 5' F13L フランキング領域を、縦列プライマーOTG13192
(配列番号18) 及びOTG13194 (配列番号19) を用いて標
準PCR 法によりMVATGN33ウイルスDNA より分離し、pBS
(Stratagene) (pTG14746) のBamHI とEcoRI 部位間に挿
入する。3' F13L フランキング領域を、縦列プライマー
OTG13190 (配列番号20) 及びOTG13191 (配列番号21) を
用いて標準PCR 法によりMVATGN33ウイルスDNA より分離
し、M13TG6131 のBamHI とEcoRI 部位間に挿入し、M13T
G14101を得る。次に、5'及び3' F13L フランキング領域
をpTG1E のEcoRI 部位にクローニングする。得られる構
築物をpTG14783と称する。
【０１２９】実施例４：MUC-1 抗原を発現するプロデュ
サー細胞系の作製 上述のように、p14-kDa タンパク質にSM3 scFvリガンド
部分を挿入すると、ウイルス産生に影響を与えるかもし
れない (ウイルス収量が減少) 。従って、野生型MVATGN
33.1の混入を減らすために、実施例１の標的化MVA は好
ましくは、ウイルス表面に存在するSM3 抗体により認識
されるMUC-1 抗原を細胞表面に提示する細胞系上で分離
して増殖させる。
【０１３０】膜固定形態のMUC-1 抗原をコードするcDNA
を、Bg1II 及びEcoRI 制限酵素による２重消化によりpP
OLYII-ETAtm (Hareuveni et al., 1990, Eur. J. Bioch
em 189, 475-486)より分離し、CMV プロモーター下流で
pcDNA3発現ベクター (InVitrogen、米国) のBamHI 及び
EcoRI 部位間に挿入する。得られるプラスミドをpTG507
7 と称する。
【０１３１】１×106 BHK-21 (ATCC CCL-10)細胞に、５
μg のpTG5077 をトランスフェクトし、次いで20g/l の
ゲンタマイシン(Gentamycin)と10％ウシ胎児血清を含む
GMEM(グラスゴー修飾イーグル培地、Gibco BRL)におい
て培養する。５％CO2 雰囲気中37℃で24時間後に、１mg
/ml のG418 (Gibco BRL)を添加する。次に、限定希釈に
よりネオマイシン耐性クローンを分離し、H23 モノクロ
ーナル抗体 (Tsarfatyet al., 1989, Breast cancer im
munodiagnosis and Immunotherapy所載, Ceriani 編, P
lenum NY)を用いて細胞表面におけるMUC-1 発現につい
てFACSにより試験する。興味深いことに、MUC-1 陽性ク
ローンのほとんどは、親のBHK-21細胞系の可塑的接着能
を失い、懸濁液中で増殖し始める。この知見は、本発明
の組換えウイルスをバイオリアクター中での増殖と薬剤
産生を容易にするだろう。
【０１３２】実施例５：標的化性能の評価 実施例１のMVATG14552のクローンを、上記のようにキサ
ンチン、ヒポキサンチン及びミコフェノール酸の存在下
の選択的条件下でCEF におけるプラーク精製を連続反復
して分離する。
【０１３３】まず、一定数のクローンを、PCR により解
析して、TG51/SM3scFv/p14KDa 融合タンパク質をコード
するキメラ遺伝子のウイルスゲノム中の存在を検出す
る。９つのクローンを選択し、さらにウエスタンブロッ
トにより解析し、ポックスウイルス粒子の表面の融合タ
ンパク質の発現を確認する。感染細胞又は上清から得た
粗抽出物中のp14-KDa 特異的ウサギポリクローナル血清
で免疫ブロッティングすることによりECL キット(Amers
han)を用いて検出を行う。精製p14-KDa タンパク質を対
照として用いる。クローンC5を除いて、選択したクロー
ンはすべて、46kDa の分子量を有するキメラ融合タンパ
ク質を発現している。予想したように、標識の強さは、
培養上清中よりも粗抽出物における方が強く、ポックス
ウイルス粒子の細胞内の状況を反映している。これらの
結果は、TG51/SM3scFv/p14-KDa融合タンパク質をその表
面に提示しているポックスウイルスのほとんどがIMV 粒
子であることを示している。培養上清中の融合タンパク
質の少量の検出は、EEV エンベロープの破壊かまたはク
ローン調製中の細胞溶解により説明できる。
【０１３４】次に、MVATG14552の感染特性を異なる細胞
系で検討した： −ネズミ肥満細胞腫P815 (ATCC CRL6448) 、 −親P815細胞に膜固定形態のMUC-1 抗原を発現するベク
ターでトランスフェクションすることにより得られる、
MUC-1 抗原を発現するP815 (P815-MUC1)、 −BHK 21 (仔ハムスター腎臓) 、 −親BHK 21細胞に, 膜固定系形態のMUC1抗原を発現する
ベクターでトランスフェクションすることにより得られ
る、MUC-1 抗原を発現するBHK 21 (BHK 21-MUC1)。
【０１３５】細胞に、MVATG14552クローン９又は対照ウ
イルス (MVAN33) を約0.1 のMOI で24時間感染させる。
感染効率は、希釈率1/100 でのMVA 免疫の後に得られる
ポリクローナルネズミ血清とインキュベート後にフロー
サイトメトリー (FACS) により測定する。モノクローナ
ルFITCヤギ抗マウスIgG (Pharmingen 、10μg/ml) でイ
ンキュベートすることにより顕示を行う。図３Ａに示す
ように、MVATG14552は、親細胞P815及びBHK-21に比べ
て、MUC-1 発現細胞の方に感染しやすい。これに対し、
対照MVA はMUC-1 発現及び非発現細胞の両方に同じ程度
の効率で感染する(図３Ｂ) 。
【０１３６】総合すると、これらの結果は、リガンド部
分SM3 scFvはポックスウイルス (IMV)粒子の表面におい
て発現すること、及び、これはその標的 (MUC-1 抗原)
を認識して、それに結合することができ、改変ウイルス
によりこの細胞の特異的感染が生じることを示してい
る。
【０１３７】MUC-1 60マーペプチドと、２つのSM3 scFv
発現クローン (A3及びA9) との間の相互作用を、BIAcor
e XTM バイオセンサーシステム (BIAcore AB, スウェー
デン、ウプサラ) を用いて表面プラズモン共鳴 (SPR)に
より調べた。すべての実験は25℃で行った。ステプトア
ビジンを、アミン結合キット (BIAcore AB, スウェーデ
ン、ウプサラ) を用いたアミン結合により、SAセンサー
チップのカルボキシル化デキストランマトリックスに共
有結合させた。次に、MUC-1 の３つの縦列反復を提示し
ているビオチニル化60マーペプチド(10 μg/ml、HBSS緩
衝液中) をステプトアビジンで被覆されたSAセンサーチ
ップ上のフローセル２内で固定化した。フローセル１は
参照として用いた。流体相組換えSM3 の結合を陽性対照
として用いた。流体相組換えウイルスの結合は、HBSS緩
衝液中１×106 〜１×108 pfu/mlの範囲にわたって測定
した。この目的のために、初代ニワトリ繊維芽細胞に、
ウイルス懸濁液を１のMOI で24時間感染させた。注入量
は15μl で、流速は５μl/分であった。表面を10mM NaO
H で再生した。速度解析をBIAevaluation 3.0 ソフトウ
エアを用いて行った。組換えウイルスと60マーMUC-1 ペ
プチド間の特異的かつ再現性ある相互作用が見られた。
測定値はウイルス濃度と相関することが見出された。対
照MVA(MVAN33) の同じペプチドへの結合は全く見られな
かった。
【０１３８】これらの結果は、SM3 scFv/p14融合タンパ
ク質がMVA 粒子と会合すること、及び組換えウイルスが
MUC-1 由来ペプチドを特異的に認識することを実証して
いる。
【０１３９】実施例６：SM3 scFv発現ウイルス粒子の精
製 組換え体から非組換え野生型ウイルス粒子を分離するた
めに、選択プロトコルを、MUC-1 ペプチドを結合する能
力に基づいて組換えSM3 scFv発現ウイルス粒子を精製す
るようにBIAcore の技術により行った。クローンA3から
作製したウイルス調製物を上記のようにしてBIAcore X
システムに注入した。60マーMUC-1 ペプチドに高い親和
性を示すウイルスを、BIAcore X Instrument Handbook
に記載のように、20mM NaOH を用いて再生段階中に表面
で回収した。次いで、回収したウイルスを許容細胞に、
ウイルス凝集体の形成を避けるためにEDTA (1mM)の存在
下で感染させ、組換えウイルスをGUS/GPT の二重選択に
より選択した。野生型非組換えウイルスの不在は、PCR
により分離クローン中で評価した。この新規な精製及び
選択プロトコルにより、野生型ウイルスの混入のない複
数のクローンを得ることができた。
【図面の簡単な説明】
【図１】ポックスウイルス粒子の構造を説明する図であ
る。IMV エンベロープは細線で表され、その表面にD8L
遺伝子産物および、p21-kDタンパク質 (p21)とp14-kDタ
ンパク質 (p21)との複合体を提示している。EEV エンベ
ロープは太線で表されその表面にA34R、HAおよびB5R 遺
伝子産物を提示している。
【図２】プラスミドpTG14552を図式的に示した図であ
る。
【図３】MVATG14552(A) または対照 MVAN33(B)による、
P815、MUC-1 発現P815 (P815-MUC-1) 、BHK-21およびMU
C-1 発現BHK-21 (BHK-21-MUC-1) の感染後のフローサイ
トメトリー解析を示す図である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成１３年６月２５日（２００１．６．２
５）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正内容】
【書類名】 明細書
【発明の名称】 標的化感染特異性を有するポックスウ
イルス
【特許請求の範囲】
【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、ポックスウイルス粒子の表面に
存在し、標的細胞の表面に局在する抗リガンド分子を特
異的に認識し結合しうる異種リガンド部分により付与さ
れる標的化感染特異性 (targeted infection specifici
ty) を有するポックスウイルス粒子に関する。本発明は
さらに、かかる異種リガンド部分および天然型ポックス
ウイルスの表面ポリペプチドの全部または一部を含むキ
メラポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む
ベクターに関する。本発明はまた、該ポックスウイルス
粒子または該ベクターを含む組成物、およびその治療お
よび予防目的の用途に関する。本発明は、遺伝子治療、
特に哺乳動物におけるガンの予防または治療に非常に特
別な有用性を有する。
【０００２】遺伝子治療は、遺伝物質の細胞または生物
体への導入として定義することができる。遺伝子治療に
よりヒトの疾病を治療する可能性は、この数年で理論的
考察の段階から臨床応用の段階まで変化した。ヒトに適
用された最初のプロトコルは米国においてアデノシンデ
アミナーゼ (ADA)欠損症の患者に対して1990年９月に開
始された。この最初の有望な実験に続いて、多数の新た
な適用が行われ、遺伝子治療に基づく将来性のある臨床
試験が現在進行中である (例えば、http://cnetdb.nci.
nih.gov/trialsrch.shtml またはhttp://www.wiley.co.
uk/genetherapy/clinical/に挙げられた臨床試験を参
照) 。
【０００３】成功的遺伝子治療は、主として、目的の治
療用遺伝子をその発現を可能にするように生きている生
物の細胞中に効率的に送り込むことに依る。治療用遺伝
子は、広範な種類のベクターを用いて細胞中に導入する
ことができ、その結果、一過性発現 (トランスフェクシ
ョン) かまたは宿主ゲノムの恒久的形質転換を生じる。
過去10年間に、非常に多くのウイルスベクター、および
非ウイルスベクターが遺伝子導入のために開発された
(例えば、総説としてRobbins et al., 1998, Tibtech 1
6,35-40および Rolland, 1998, Therapeutic Drug Carr
ier Systems 15,143-198参照) 。
【０００４】最も広く用いられているウイルスベクター
は、レトロウイルスおよびアデノウイルス由来である
(総説としてMiller, 1997, Human Gene Therapy 8, 803
-815参照) 。しかし、シンドビスウイルス由来ベクター
やポックスウイルス由来ベクターなどのその他のウイル
スベクターもin vivo 遺伝子導入のための有望な候補と
なりつつある。
【０００５】ポックスウイルスは、主にその異常な形
態、大きいDNA ゲノムおよび複製の細胞質部位を特徴と
する、エンベロープを持つ複雑なウイルスの一群であ
る。コペンハーゲンワクシニアウイルス (VV) 株 (Goeb
el et al., 1990, Virol, 179, 247-266 and 517-563;
Johnson et al., 1993, Virol, 196, 381-401)および改
変されたワクシニアウイルスアンカラ(MVA) 株(Antoine
et al., 1998, Virol. 244,365-396)を含む、ポックス
ウイルス科の数種のメンバーのゲノムは、マッピングさ
れ配列決定されている。VVは約200 のタンパク質をコー
ドする約192kb の２本鎖DNA ゲノムを有し、そのうちの
約100 のタンパク質はウイルスの組み立てに関与してい
る。MVA は、鶏胚繊維芽細胞でワクシニアウイルスのア
ンカラ(Ankara)株(CVA) を500 回以上の連続継代培養に
より作製された高度に弱毒化されたワクシニアウイルス
株である (Mayr et al., 1975, Infection 3, 6-16) 。
MVA は受託番号Ｉ-721としてCollection Nationale de
Cultures de Microorganismes(CNCM)に寄託された。MVA
ゲノムの完全な配列決定およびコペンハーゲン (Copen
hagen) VVゲノムとの比較により、ウイルスゲノムに生
じた変化の正確な同定、およびいくつかの断片化された
ORF (オープンリーディングフレーム) にいたる欠失(I
からVII)と多数の突然変異の規定が可能になる (Antoin
e et al., 1998,Virology 244, 365-396)。
【０００６】エンベロープをもつウイルスの細胞内取り
込みのための自然の経路には、ウイルス表面において露
出されたウイルスポリペプチドの細胞受容体への結合、
およびウイルス膜と細胞膜との間の融合機構、それによ
り生じる感染細胞の細胞質へのウイルスゲノムの放出を
含む一連の過程が含まれる。
【０００７】しかし、ポックスウイルスの特別な場合で
は、正確な送達経路の分析は、細胞内成熟ウイルス(IM
V) および細胞外エンベロープ含有ウイルス(EEV) と称
される、二つの形態学的に異なる形態の感染性ウイルス
の存在により複雑である。その他の特徴の中で、IMV 形
態は、ウイルスコアを囲む単脂質(monolipid) エンベロ
ープを特徴とし (図１) 、感染細胞の溶菌後に細胞外に
放出されるにもかかわらず、感染細胞の細胞質に主とし
て局在する。IMV 脂質エンベロープの表面に露出された
天然のポリペプチドの多くは同定され、例えばp14kDaや
p21kDaタンパク質があり、それぞれA27L遺伝子(Rodrigu
ez at al., 1985, J., Virol, 56, 482-488; Rodriguez
et Estaban, 1987, J. Virol. 61, 3550-3554) および
A17L遺伝子によりコードされており、またL1R 、A14L、
D8L 、A9L (Yeh et al., 2000, J.Virol, 74, 9701-971
1) 、E10R (Senkevich et al., 2000, Virol, 5, 244-2
52)およびH3L 遺伝子よりコードされるタンパク質があ
る。IMV に比べて、EEV 形態は、トランスゴルジ網嚢か
ら得られた追加の外部脂質膜エンベロープ (二重脂質
層) を有する。これは、感染細胞の外側に放出されるウ
イルス形態に相当する。EEV 表面膜エンベロープは、IM
V 表面にはない約10種のタンパク質を示し、例えばコー
ドされたB5R,A34Rおよび赤血球凝集素(HA)遺伝子産物(
図１) などがある。このIMV およびEEV 形態の共存は、
ワクシニア株のほとんど (例えばコペンハーゲンおよび
MVA 株) 、およびニワトリポックスウイルス (鶏痘ウイ
ルス) などのその他のポックスウイルスについて報告さ
れている(Boulanger et al., 2000,J. Gen. Virol. 81,
675-687)。
【０００８】IMV とEEV の異なる形態は、これらのポッ
クスウイルス形態の宿主細胞への侵入の異なる機構を示
唆する。EEV 供給経路はエンドサイトーシスおよびそれ
に続くpH依存性膜融合経路により媒介されるが、IMV 形
態はpH非依存的に細胞膜と直接融合することが最近提案
された (Vanderplasschen et al., 1998, J. Gen. Viro
l. 79, 877-887) 。IMV 結合と細胞内取り込みを媒介す
る二つの細胞受容体が最近同定された: 細胞表面プロテ
オグリカンのグリコサミノグリカン(GAG) 側鎖であるヘ
パラン硫酸(Chung et al., 1998, J. Virol. 72, 1577-
1585) および別のGAG 成分であるコンドロイチン硫酸
(Hsiao et al., 1999, J. Virol. 73, 8750-8761)。両
受容体は異なるIMV 表面ポリペプチド、それぞれp14(ヘ
パラン硫酸と結合) およびD8L 遺伝子産物 (コンドロイ
チン硫酸と結合) と相互作用し、これは異なる種類のウ
イルス-GAG相互作用を示している。
【０００９】ワクシニアウイルス14-kDaタンパク質(p1
4) は、ウイルスの感染性において重要な役割を果たし
ている。p14 タンパク質は21-kDaタンパク質(p21) との
会合によりIMV 脂質エンベロープに固定されている(anc
hored)。p14 タンパク質は、おそらく細胞表面ヘパラン
硫酸への結合に関与することによりIMV 供給経路に関与
している (Chung et al., 1998, J.Virol. 72, 1577-15
85) 。さらに、融合過程はこのp14 タンパク質によるも
のであった。さらに、一般的に言うと、IMV 表面ポリペ
プチドがIMV 感染性に密接に関与し、その変異または欠
失がIMV の伝播を劇的に損なうことが示されてきた(Dal
lo et al., 1987, Virology 159, 423-32)。p14 タンパ
ク質はまた、EEV の形成および感染細胞外でのウイルス
拡散に必要である。
【００１０】最近、細胞表面ヘパラン硫酸受容体への結
合、ウイルス/ 細胞膜融合およびウイルス放出に必要と
される機能性ドメインがp14 の最初の43のＮ末端アミノ
酸内でマッピングされた (Vazquez an Esteban, 1999,
J.Virol. 73, 9098-9109)。さらに、Vazquez 等 (199
8, J.Virol. 72, 10126-10137) は、p14 のＣ末端ドメ
インがp21 タンパク質との結合に関与していることを示
した。
【００１１】各種の治療用遺伝子を発現する多数の組換
えポックスウイルスベクターが文献において報告されて
きた。特に、サイトカイン遺伝子を発現するVV(Peplins
ki et al., 1995, Ann. Surg. Oncol. 2, 151-159; Whi
tman et al., 1994, Surgery116, 183-188)、B7.1免疫
刺激遺伝子(Hodge et al., 1994,Cancer Res. 54, 5552
-5555)、1CAM-1(Uzendoski et al., 1997, Hum. Gene T
her. 8, 851-860)または、単純ヘルペスウイルス-1(TK
HSV-1)のチミジンキナーゼ遺伝子 (Puhlmann et al., 1
999, Hum, Gene Ther. 10, 649-657) や、シトシンデア
ミナーゼ遺伝子(Gnant et al., 1999, Cancer Res. 59,
3396-3403) などの自殺遺伝子を発現するVVがガンの治
療に提案されてきた。さらに、それらの抗腫瘍活性が動
物モデルで実証された。MVA 株に基づくベクターもまた
提案された(Sutter and Moss, 1992, Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 89, 10847-10851; Carroll and Moss, 199
5,Bio Techniques 19, 352-355; Antoine et al., 199
6, Gene 177, 43-46;Schleiflinger et al., 1996, Arc
h. Virol. 141, 663-669)。
【００１２】しかしながら、ワクシニアウイルスは非常
に広い宿主範囲を示し、ほとんどの脊椎動物細胞に感染
する。また、IMV とEEV 形態は伝播性に関して異なる。
なぜなら、EEV はその表面にIMV 表面よりもより多くの
種類のポリペプチドを提示しており、IMV よりも広範に
伝播する傾向がより大きいからである。どの形態を考え
ても、感染選択性の欠如は、非標的化細胞中に導入され
た遺伝子 (すなわち、細胞障害性遺伝子) の発現から生
じ得る悪影響を制限するのが望ましい特別な用途に対し
ては不利であると見なされ得る。従って、標的細胞集団
への感染を指令するために宿主範囲を限定するにはウイ
ルスを改変するのが有用であろう。
【００１３】ウイルスの指向性 (tropism)の改変はすで
にある種のウイルスで行われている。例えばWO93/09221
では、モノクローナル抗体により細胞受容体へのウイル
スの結合を正常に媒介するウイルス赤血球凝集素ポリペ
プチドの阻害により、および標的化細胞上に発現された
トランスフェリン受容体と相互作用し得る抗体とウイル
スとを結合させることにより、インフルエンザウイルス
指向性を改変している。
【００１４】Roux等(1989, Proc. Natl. Acad Sci. USA
86, 9079-9083) はレトロウイルスエンベロープgp70お
よびヒト主要組織適合抗原 (MHC) のそれぞれに対する
２つのビオチニル化抗体を用いてマウス同種指向性組換
えレトロウイルスをヒト細胞に感染させることを報告し
ている。
【００１５】WO94/10323は、抗体に認識される抗原を発
現する細胞にアデノウイルスの感染を指示するために、
単鎖 (single chain) 抗体との融合により改変された繊
維タンパク質をその表面に提示する標的化アデノウイル
スベクターを記載している。
【００１６】しかしながら、ポックスウイルス粒子の制
御された標的化は、ポックスウイルスの固有の複雑さお
よび異なる２つの感染性形態の存在により阻害されたき
た。これに関して、Galmiche (1997,J. Gen. Virol. 7
8, 3019-3027)は、腫瘍細胞標的化のためのEEV 粒子の
構築を報告している。腫瘍関連抗原ErbB-2に対する単鎖
抗体を、EEV 表面に発現されるようにウイルス赤血球凝
集素 (HA) に融合させた。ErbB-2は、ヒト腺がん細胞上
に過発現される上皮増殖因子受容体である。融合タンパ
ク質はEEV 粒子の表面に露出され、in vivo で培養ヒト
腺ガン細胞に結合し得るが、著者等は、抗体-HA 融合体
を有するEEV のErbB-2発現細胞への優先的感染を観察し
なかった。改変EEV 粒子は、広範囲な細胞の感染を可能
にする未同定のタンパク質をまだ含有していると推定さ
れる。
【００１７】従って、本発明の基礎となる技術的課題
は、ポックスウイルスの特定細胞への標的化のための改
良された方法および手段の提供である。この技術的課題
は、ここに明らかにする態様の提供により解決される。
【００１８】本発明は、標的細胞への標的化感染特異性
を有するポックスウイルス粒子であり、この粒子はこの
標的細胞に優先的に感染するものであり、この特異性
は、ポックスウイルス粒子の表面に局在し、かつ標的細
胞の表面に局在する抗リガンド分子に結合し得る、少な
くとも１つの異種リガンド部分により付与される（ただ
しポックスウイルス粒子がEEV ワクシニアウイルス粒子
であるときリガンドはErbB-2に対する抗体ではない）。
【００１９】ここで用いる「標的細胞に対する標的化感
染特異性」なる用語は、本発明のポックスウイルス粒子
が、関連する非改変 (即ち野生型) ポックスウイルス粒
子に比べ、標的細胞に対して新たな、または向上した指
向性を示すように操作されている、制御された感染特異
性を指す。その結果、本発明のポックスウイルス粒子
は、その関連する非改変ポックスウイルス粒子と異なり
標的細胞に感染する傾向を示し、これは本発明のポック
スウイルス粒子は、標的細胞 (本発明のポックスウイル
ス粒子の表面に提示されるリガンド部分により認識され
る抗リガンドをその表面に提示する) に、非標的細胞
(前記の抗リガンドをその表面に提示しない) よりもよ
り効率的またはより迅速に感染するが、一方、関連する
非改変ポックスウイルス粒子は非標的細胞に比べより低
いか同じ程度の効率で標的細胞に感染するだろうことを
意味する。この好ましい感染性は、標的細胞および非標
的細胞に対する本発明のポックスウイルス粒子の感染性
を、その関連非改変ポックスウイルス粒子の感染性とin
vitro (例、培養細胞において) またはin vivo(例、動
物モデルにおいて) で、同じ実験条件下で比較すること
により容易に決定できる。感染性を分析するためのin v
itro実験条件は、本明細書の実施例５において提供され
るが、その他の方法も当業者には周知であり、従って、
本発明に関して使用できる。例えば、本発明によるポッ
クスウイルス粒子および関連非改変ポックスウイルス粒
子の混合物を、比較的短い感染時間(30 分以下、特に１
〜10分) で培養標的細胞に感染させるのに用いると、最
初の混合物に含まれる本発明によるポックスウイルス粒
子の大多数 (少なくとも60％、好ましくは少なくとも70
％、そしてより好ましくは少なくとも80％) は前記標的
細胞に感染することができるが、一方、最初の混合物中
の関連非改変ポックスウイルス粒子の少量(40 ％以下、
好ましくは30％以下、より好ましくは20％以下) しか前
記標的細胞に感染することができない。これは、各感染
操作毎に、混合物中に存在する本発明によるポックスウ
イルス粒子の量を増やす結果となる。このような濃縮
は、標準的技術により各ポックスウイルス粒子のウイル
ス力価を測定して評価することができる。
【００２０】本発明において用いる「リガンド部分」と
いう用語は、標的細胞の表面において発現または露出さ
れた少なくとも１つの抗リガンド分子を認識して結合し
得る任意の部分を意味する。これは、標的細胞結合およ
び本発明のポックスウイルス粒子への感染特異性を提供
する。本明細書を読むことにより、前記抗リガンド分子
は、ポックスウイルスの取り込みを媒介する天然型細胞
受容体( 例、ヘパラン硫酸またはコンドロイチン硫酸)
とは異なることが明らかである。本発明によれば、リガ
ンド部分は、請求されたポックスウイルス粒子の表面に
局在する。使用する結合方法 (下記参照) によって、こ
のリガンド部分は、ウイルス粒子表面上に付加され露出
している (例えば化学的結合による) 部分であるか、又
は粒子エンベロープ構造において融合した部分 (例えば
遺伝子結合により) である。「異種 (heterologous) 」
とは、このリガンド部分が野生型ポックスウイルス粒子
の表面には見出されないことを意味する。広く、「同種
(homologous) 」とは、野生型ポックスウイルス粒子の
表面に見出されるポリペプチド又は天然部分をいう。標
的細胞の表面に局在する抗リガンド分子は、好ましく
は、野生型ポックスウイルス粒子が結合しないものであ
るか、又は、野生型ポックスウイルス粒子が本発明の改
変ポックスウイルス粒子よりも低い特異性でしか結合し
ないものである。リガンドとある抗リガンド分子間の結
合特異性は、ELISA 、免疫蛍光及び表面プラズモン共鳴
に基づく技術(Biacore AB)を含む当分野の技術によって
測定できる。
【００２１】一般に、本発明の範囲において用いられる
リガンド部分は広く文献に記載されている; これは、本
発明の改変ポックスウイルス粒子に、少なくとも１つの
標的細胞の表面に局在するある抗リガンド分子又は一群
の抗リガンド分子に結合する能力を付与しうる部分であ
る。適当な抗リガンド分子には、細胞特異的マーカー、
組織特異性マーカー、細胞受容体、ウイルス抗原、抗原
性エピトープ及び腫瘍関連マーカーよりなる群から選ば
れるポリペプチドがあるが、これらに限定されない。抗
リガンド分子は、さらに糖質、脂質、糖脂質、抗体等が
ある。本発明によれば、リガンド部分は、例えば脂質、
糖脂質、ホルモン、糖、ポリマー (例、PEG 、ポリリシ
ン、PEI 等) 、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ビ
タミン、抗原、レクチン、JTS1(WO94/40958)などの標的
化特性を示すポリペプチド部分、抗体又はそれらの組み
合わせであってもよい。前述のリガンド部分の断片もま
た、それが天然分子の標的化特性を保持していれば使用
できる。
【００２２】好ましくは、本発明において用いられるリ
ガンド部分は、最小で７アミノ酸の長さのポリペプチド
である。これは天然のポリペプチドか、天然のポリペプ
チド由来のポリペプチドである。「由来」とは、(i) 天
然の配列に関して１又は２以上の改変 (例、１又は２以
上の残基の付加、欠失及び／又は置換) 、(ii)非天然ア
ミノ酸を含むアミノ酸類似体、又は(iii) 置換された結
合、並びに(vi)当分野で既知のその他の改変を含むこと
を意味する。この用語は、変異物及び各種起源の配列を
融合させることにより得られるキメラポリペプチドも含
む。さらに、このリガンド部分は直鎖でも環状構造を有
していてもよい (例、システイン残基によりポリペプチ
ドリガンドを両端に配置することにより) 。さらに、本
発明で用いるリガンド部分は、化学的部分を置換または
付加することにより (例、グリコシル化、アルキル化、
アセチル化、アミド化、リン酸化、スルフヒドリル基の
付加等) 、そのもとの構造を修飾することを含む。本発
明はさらに、リガンド部分を検出可能にする修飾も含
む。この目的のためには、検出しうる部分による修飾が
検討された (すなわち、シンチグラフィー、放射能、蛍
光又は染料標識等) 。適当な放射能標識には、Ｔc99m、
Ｉ123 及びＩn111があるが、これらに限定されない。こ
のような検出可能な標識は任意の慣用技術によりリガン
ド部分に結合してもよく、診断目的に用いてもよい
(例、腫瘍細胞の画像化) 。
【００２３】１つの好ましい態様において、抗リガンド
分子は抗原 (例、細胞特異的抗原、疾病特異的抗原、遺
伝子操作された標的細胞の表面に特異的に発現される抗
原等) であり、リガンド部分は抗体、その断片又は最小
認識単位 (すなわち、抗原特異性を依然として示す断
片) であり、例えば免疫学マニュアル (例えば、Immuno
logy, ３版, 1993, Roitt,Brostoff and Male,編 Gambl
i,Mosby 参照) に詳細に記載されているものがある。リ
ガンド部分はモノクローナル抗体であってもよい。これ
らの抗原の多くに結合するであろうモノクローナル抗体
は、既に知られているが、いずれの場合もモノクローナ
ル抗体技術に関する現在の手法を用いて、ほとんどの抗
原に対する抗体で製造できる。リガンド部分は抗体の一
部 (例えばＦab断片) であっても、合成抗体断片 (例え
ばScFv) であってもよい。
【００２４】選択された抗原に対する適当なモノクロー
ナル抗体は既知の方法、例えば "Monoclonal Antibodie
s: A manual of techniques", H. Zola(CRC Press, 198
8)および "Monoclonal Hydridoma Antibodies: Techniq
ues and Applications", J. G. R. Hurrell (CRC Pres
s, 1982) に記載の方法により製造してもよい。適切に
製造された非ヒト抗体は既知のやり方で「ヒト化」して
もよく、例えばマウス抗体のCDR 領域をヒト抗体のフレ
ームワーク中に挿入することにより行える。さらに、抗
体の可変重(VH)ドメイン及び可変軽 (VL) ドメインは抗
原の認識に関与し、齧歯動物起源の可変ドメインは、得
られる抗体が齧歯動物の親抗体の抗原特異性を保時する
ようにヒト起源の定常ドメインに融合していてもよい(M
orrisonet al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
1, 6851-6855)。
【００２５】抗体の抗原特異性は、Ｆab様分子(Better
et al., (1988) Science 240, 1041);Fv分子(Skerra et
al., (1988) Science 240, 1038); VH 及びVLの対ドメ
インが、可撓性オリゴペプチドを介して連結していても
よいScFv分子(Bird et al.,1988) Science 242, 423; H
uston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA85,
5879)、及び分離Ｖドメインを含むdAb(Ward et al.,
(1989) Nature 341,544)などの可変ドメインにより付与
される。その特異的結合部位を保持する抗体断片の合成
に関与する技術の総説はWinter & Milstein (1991) Nat
ure 349, 293-299にみられる。
【００２６】有利な態様によれば、リガンド部分は全抗
体よりもむしろ抗体断片から選択される。補体結合のよ
うな全抗体のエフエクター機能は除かれる。ScFv部位及
びdAb 抗体断片は、その他のポリペプチドとの融合体と
して発現されていてもよい。最小認識単位は、Fv断片の
相補的決定領域 (CDR)の１又は２以上の配列由来であっ
てもよい。全抗体及びＦ(ab')2 断片は「２価」であ
る。「２価」とは、この抗体及びＦ(ab')2 断片が２つ
の抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Fa
b 、Fv、ScFv、dAb 断片及び最小認識単位は１価であ
り、ただ１つの抗原結合部位を有する、別の態様では、
リガンド部分は天然の細胞表面受容体結合に関する特異
的部分の少なくとも一部である。当然、この天然の受容
体 (例、ホルモン受容体) はそれ自身が標的細胞特異的
抗原であってもよく、またモノクローナル抗体、ＳｃＦ
ｖ、ｄＡｂ又は最小認識単位のいずれか１つの性質を有
するリガンド部分により認識されてもよい。
【００２７】好ましい態様では、リガンド部分がウイル
ス感染細胞の標的化を可能にし、ウイルス成分 (例、エ
ンベロープ糖タンパク質) を認識して結合できるか、あ
るいはウイルスの生態 (例、侵入、複製) を妨げること
ができる。例えば、ＨＩＶ (ヒト免疫不全症ウイルス)
感染細胞の標的化は、ＨＩＶエンベロープのエピトープ
に特異的なリガンド部分、例えば、膜貫通糖タンパク質
ｇp41 の高度に保存されたエピトープを認識する２Ｆ５
抗体由来のリガンド部分(Buchacher et al., 1992, Vac
cines 92, 191-195)、又は細胞受容体CD4 へのHIV 結合
を妨げるリガンド部分 (例、CD４分子の細胞外ドメイ
ン) を用いて行うことができる別の好ましい態様におい
ては、リガンド部分は腫瘍細胞を標的化することを可能
にし、腫瘍特異的抗原、腫瘍細胞において特異的にもし
くは過剰に発現される細胞タンパク質、又はガン関連ウ
イルスの遺伝子産物などの腫瘍状態に関連する分子を認
識して結合しうる。
【００２８】腫瘍特異的抗原の例には、乳ガンに関連す
るMUC-1(Hareuveni et al., 1990,Eur. J. Biochem 18
9, 475-486) 、乳及び卵巣ガンに関連する変異BRCA１及
びBRCA２遺伝子によりコードされる産物(Miki et al.,1
994, Science 226, 66-71; Futreal et al., 1994, Sci
ence 226, 120-122; Wooster et al., 1995, Nature37
8, 789-792) 、大腸ガン関連APC(Polakis, 1995, Curr.
Opin. Genet. Dev. 5, 66-71)、前立腺ガン関連前立腺
特異的抗原 (PSA)(Stamey et al., 1987, NewEngland
J. Med. 317, 909) 、大腸ガン関連ガン腫胚性抗原 (ca
rcinoma embryonic antigen related to colon cancer)
(CEA)(Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10,
2738-2748)、黒色腫関連チロシナーゼ(Vile et al., 19
93, Cancer Res. 53, 3860-3864)、黒色腫細胞において
多数発現するメラノサイト刺激ホルモン(MSH) の受容
体、乳ガン及びすい臓ガン関連ErbB-2(Harris et al.,
1994, Gene Therapy 1, 170-175)、及び肝ガン関連α−
フェトプロテイン(Kanai etal., 1997, Cancer Res. 5
7, 461-465) があるが、それらには限定されない。
【００２９】本発明で用いるのに好ましいリガンド部分
は、MUC-1 抗原を認識して結合し、従ってMUC-1 陽性腫
瘍細胞を標的化しうる抗体の断片である。より好ましい
リガンド部分は、MUC-1 抗原の縦列反復領域を認識する
SM3 モノクローナル抗体のseＦv 断片(Burshell et a
l., 1987, Cancer Res. 47, 476-5482; Girling et a
l., 1989, Int J. Cancer 43, 1072-1076; Dokurno et
al., 1998, J. Mol.Biol.284, 713-728) である。
【００３０】腫瘍細胞において特異的にもしくは過剰に
発現される細胞タンパク質の例には、ある種のリンパ球
腫瘍において過剰に発現するインターロイキン２ (IL-
2) の受容体、肺ガン細胞、膵臓、前立腺及び胃ガンに
おいて過剰に発現するGRP ( ガストリン放出ペプチド)
(Michael et al., 1995, Gene Therapy 2, 660-668)、T
NF(腫瘍壊死因子) 受容体、表皮増殖因子受容体、Fas
受容体、CD40受容体、CD30受容体、CD27受容体、OX−4
0、∀v インテグリン(Brooks et al., 1994, Science 2
64, 569) 及びある種の血管新生増殖因子(Hanahan, 199
7, Science 277, 48)に対する受容体があるが、これら
に限定されない。これらの示唆に基づき、上記タンパク
質を認識して結合しうる適宜リガンド部分を決定するこ
とは当業者の範囲内である。例えば、IL-2はIL-2受容体
に結合するための適当なリガンド部分である。
【００３１】適当なガン関連ウイルスの遺伝子産物に
は、子宮頸ガンにおいて発現するヒトパピローマウイル
ス (HPV)E6及びE7初期ポリペプチド、並びにL1及びL2後
期ポリペプチド (EP 0 462 187、US 5,744,133及びWO98
/04705) 、及びバーキットリンパ腫に関連するエプスタ
インバールウイルス (EBV)のEBNA-1抗原(Evans et al.,
1997, Gene Therapy 4, 264-267) があるが、これらに
は限定されない。
【００３２】さらに別の好ましい態様では、リガンド部
分は組織特異的分子の標的化を可能にする。例えば、肝
細胞を標的化するのに適したリガンド部分には、LDL 受
容体に結合しうるApoB (アポリポタンパク質) 、LPR 受
容体に結合しうるα-2- マクログロブリン、アシアロ糖
タンパク質受容体に結合しうるα-1酸糖タンパク質及び
トランスフェリン受容体に結合しうるトランスフェリン
由来のものがあるが、これらに限定されない。活性化内
皮細胞を標的化するためのリガンド部分は、シリアル−
ルイス−Ｘ抗原 (ELAM-1に結合しうる) 由来、VLA-4(VC
AM-1受容体に結合しうる) 由来、またはLFA-1(ICAM-1受
容体に結合しうる) 由来であってもよい。CD34由来のリ
ガンド部分は、CD34受容体への結合を通して造血前駆細
胞を標的化するのに有用である。ICAM-1由来のリガンド
部分は、ＬＦＡ−１受容体への結合を通してリンパ球を
標的化するのに有用である。最後に、Ｔヘリパー細胞の
標的化には、HIVgp-120 由来のリガンド部分又はCD４受
容体に結合しうるMHCCクラスII抗原を用いてもよい。
【００３３】ポリペプチドであるリガンド部分が組換え
DNA 技術を用いて好都合に作製できることは当業者には
認められるだろう。リガンド部分は、以下に示すように
ウイルス粒子の表面のタンパク質に融合していてもよ
く、あるいは、例えば新たな(de novo) 合成、又は真核
及び原核細胞における適宜DNA 断片の発現により独立に
合成され、次いで以下に開示するようにウイルス粒子に
結合してもよい。多くのリガンド部分をコードする核酸
配列は既知であり、例えばペプチドホルモン類、増殖因
子類、サイトカイン類等の核酸配列があり、そしてEMBL
及びGenBank などの公的に利用しうるヌクレオチド配列
データベースを参照することにより容易に見出されるか
もしれない。ヌクレオチド配列が一旦分かれば、例えば
ＤＮＡの化学合成技術、またはポリメラーゼ連鎖反応を
用いて、ゲノムDNA からもしくは組織特異的cDNAから必
要なDNA を増幅することにより、選択したリガンド部分
をコードするDNA を作製する方法は当業者には自明であ
る。ペプチドホルモン類、増殖因子類、抗体の全体又は
一部、サイトカイン類等をコードする多くのcDNAは、リ
ガンド部分として有用であり、一般に市販されている。
【００３４】「標的細胞」とは、本発明の改変ポックス
ウイルス粒子が優先的に感染しうる細胞をいう。リガン
ド部分及び／又は抗リガンド分子の性質により、「標的
細胞」は、本発明のポックスウイルス粒子上に存在する
リガンド部分により認識される抗リガンド分子をその表
面に共通の特徴として有する特別な種類の細胞または異
なる種類の一群の細胞を意味するかもしれない。本発明
の目的にとっては、標的細胞は、本発明のポックスウイ
ルス粒子に感染しうる任意の哺乳動物細胞 (好ましくは
ヒト細胞) からなる。この細胞は初代細胞、形質転換細
胞又は任意の起源の腫瘍細胞でもよい。適当な標的細胞
には造血細胞 (全能性幹細胞、白血球、リンパ球、単
球、マクロファージ、樹状細胞等) 、筋細胞 (衛生細
胞、ミオサイト、筋芽細胞、骨格及び平滑筋細胞、心筋
細胞) 、肺細胞、気管細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細
胞又は繊維芽細胞があるが、これらに限定されない。
【００３５】「リガンド部分 (または抗リガンド分子)
がポックスウイルス粒子の (又は標的細胞の) 表面に局
在する」とは、このリガンド部分 (又は抗リガンド分
子) が、該ポックスウイルス粒子を該標的細胞に接触さ
せたときに、その特異的抗リガンド分子 (又はそれぞ
れ、リガンド分子) と結合するためにポックスウイルス
粒子の (又は標的細胞の) 表面に接近可能であることを
意味する。この接近可能性は、文献に広く開示された方
法を用いて過度の実験なしにin vitroで測定できる。
【００３６】本発明のポックスウイルス粒子は、ポック
スウイルス科の任意のメンバー、特にワクシニアウイル
ス、カナリアポックス、ニワトリポックス (鶏痘) 、ウ
シポックス、昆虫ポックス、サルポックス、ブタポック
ス又はペンギンポックスから得ることができる。好まし
くは、コペンハーゲン、ワイエス(Wyeth) 又はアンカラ
改変 (MVA)株のワクシニアウイルス粒子である。一般的
に、多数の刊行物が上で引用したポックスウイルス及び
ポックスウイルス株の配列及び生物学に関する。さら
に、それらは、ATCC (鶏痘 ATCC VR−251 、サルポック
ス ATCC VR−267、ブタポックス ATCC VR-363、カナリ
アポックス ATCC VR−111 、ウシポックスATCC VR−30
2)又はＩＣＴＶ (オーストラリア、キャンベラ) ( コペ
ンハーゲンウイルスコード58.1.1.0.001; GenBank 受託
番号Ｍ35027)などの認定されたコレクションにおいて入
手できる。
【００３７】本発明のポックスウイルス粒子はIMV でも
EEV 形態のどちらでもよい。好ましい態様においては、
それはIMV 粒子である。前述したように、IMV 粒子は、
A27L(p14タンパク質) 、L1R 、A14L、A17L(p21タンパク
質) 、D8L 、A9L 、E10R及びH3L 遺伝子によりコードさ
れる産物などの、その表面に存在するウイルスのポリペ
プチドを有する単層脂質エンベロープにより囲まれたウ
イルスゲノムを含むウイルス核を含む。「EEV 」なる用
語は、B5R 、A34R及びHA遺伝子によりコードされる産物
などの細胞およびウイルスポリペプチドをその細胞表面
に露出している、追加の２層脂質エンベロープに囲まれ
るIMV 粒子を意味する。
【００３８】有利な態様において、ポックスウイルスゲ
ノムは、EEV 粒子の産生に関与する少なくとも１つの遺
伝子において欠損性であり、好ましくはF13L遺伝子(p37
タンパク質をコードする) において欠損性である。F13L
遺伝子の欠失が、正常レベルのIMV が産生されるにもか
かわらず、EEV の包みこみ(wrapping)過程において重大
な欠陥をもたらすことがBorrego 等により示された(199
9,J.Gen.Virol.80,425-432) 。従って、ポックスウイル
スF13L遺伝子を変化させることによりＩＭＶ産生を増加
させることが可能である。このF13L遺伝子は、コーディ
ング配列内またはプロモーター内の任意の配列の完全も
しくは部分的欠失、変異又は挿入により改変することが
できる。ポックスウイルスゲノムは、任意に、その産物
がポックスウイルス取り込みを媒介する天然の細胞受容
体 (例、ヘパラン硫酸又はコンドロイチン硫酸) との相
互作用に関与する少なくとも１つの遺伝子において改変
されていてもよい。これらの遺伝子改変技術は当分野で
は既知であり、Borrego 等(1999、前出) に説明されて
いる。
【００３９】ここで用いる遺伝子の名称は、コペンハー
ゲンワクシニア株において使用されているものであり、
特に指定がない限り他のポックスウイルス科 (例、MVA)
の相同遺伝子に対しても用いられる。しかし、遺伝子の
名称はポックス株により異なる。参考のために、コペン
ハーゲン及びMVA 遺伝子の間の対応がAntoine 等(1998,
Virol. 244, 365-396) の表１に示されている。例え
ば、コペンハーゲンＡ27Ｌ遺伝子はMVA では138 Ｌと呼
ばれるが、これら両遺伝子は同様の機能とIMV 表面にお
ける局在を有する相同p14-kDa タンパク質をコードす
る。
【００４０】本発明によれば、ポックスウイルス粒子は
本発明で用いる異種リガンド部分と作動的に結合してい
る。「作動的に結合している」とは、この粒子とリガン
ド部分が、それらが意図したように機能する (すなわ
ち、リガンド部分が、所望の細胞へのポックスウイルス
粒子の標的化感染特異性を促進する) ことを可能にする
関係にあることを意味する。結合は、共有結合、非共有
結合または遺伝的手段を含む、当業者に周知の各種手段
により行うことができる。
【００４１】ポックスウイルス粒子の表面へのリガンド
部分の共有結合は、反応性官能基を介して直接に、ある
いはスペーサー基もしくは他の活性化部分により間接に
行ってもよい。具体的には、結合は、(i) ホモ二官能
性、もしくは(ii)ヘテロ二官能性架橋剤により、(iii)
カルボジイシドにより、(iv)還元的アミノ化により、も
しくは(vi)カルボキシレートの活性化により行ってもよ
い (例えば、Bioconjugate techniques 1996; G Herman
son 編; Academic Press参照) 。
【００４２】グルタルアルデヒド及びＤＭＳ (ジメチル
スーベルイミデート) のようなビス- イミドエステルを
含むホモ二官能性架橋剤を、リガンド部分のアミノ基を
ジアシルアミンを含む脂質構造 (例、IMV エンベロープ
の) に結合するのに用いてもよい。
【００４３】本発明においては多くのヘテロ二官能性架
橋剤を用いることができ、詳しくは、アミノ反応基とス
ルフヒドリル反応基を有するもの、カルボニル反応基と
スルフヒドリル反応基を有するもの、及びスルフヒドリ
ル反応基と光反応性リンカーを含むものがある。適当な
ヘテロ二官能性架橋剤はBioconjugate techniques (199
6) 229-285; G Hermanson 編; Academic Press および
WO99/40214に記載されている。第一のカテゴリーの例に
は、SPDP(N−スクシンイミジル3-(2−ピリジルジチオ)
プロピオネート) 、SMBP (スクシンイミジル-4-(p-マレ
イミドフェニル) ブチレート) 、SMPT (スクシンイミジ
ルオキシカルボニル- ∀- メチル-(∀-2- ピリジルジチ
オ) トルエン) 、MBS (m- マレイミドベンゾイル-N- ヒ
ドロキシスクシンイミドエステル) 、SIAB(N- スクシン
イミジル (4-ヨードアセチル) アミノベンゾエート) 、
GMBS (マレイミドブチリルオキシスクシンイミドエステ
ル) 、SIAX (スクシンイミジル−６−ヨードアセチルア
ミノヘキソネート) 、SIAC(スクシンイミジル−４−ヨ
ードアセチルアミノメチル) 、NPIA(P−ニトロフェニル
ヨードアセテート) があるが、これらには限らない。第
二のカテゴリーは、炭水化物含有分子 (例、env 糖タン
パク質、抗体) をスルフヒドリル反応性基に結合するの
に有用である。例としてはMPBH (4-(4- N-マレイミドフ
ェニル) 酪酸ジドラジド) 及びPDPH (4-(N- マレイミド
メチル) シクロヘキサン−１−カルボキシル−ヒドラジ
ド、M2C2H 及び3-2(2-ピリジルジチオ) プロピオニルヒ
ドラジド) がある。第三のカテゴリーの例としては、AS
IB (1-(p- アジドサリシルアミド)-4- (ヨードアセトア
ミド) ブチレート) を挙げることができる。別の例に
は、Frisch等(Bioconjugate Chem. 7 (1996) 180-186)
に記載のチオール反応性試薬がある。
【００４４】結合(iii) には、リガンド部分のカルボキ
シレート基とのカルボジイミド反応に関与しうる脂質構
造中に存在するジアシルアミンのアミノ基がある。結合
(iv)は、例えばイミン形成、次いでシアノボロハイドレ
ート(cyanoborohydrate)を介して行われてもよい。
【００４５】結合(vi)は、例えば、安定なアミド結合連
結を生じるリガンド部分のNHS エステル誘導体とポック
スウイルスアミノ基を含む。別の例では、スルフヒドリ
ル基とスルフヒドリル反応性基を含むマレイミド−スル
フヒドリル結合を用いる。例えば、SATA(N−スクシンイ
ミジルＳ−アセチルチオアセテート) を用いてスルフヒ
ドリル基を導入でき、一方、スルホSMCC (スルホスクシ
ンイミジル４−(N−マレイミドメチル) シクロヘキサン
１−カルボキシレート) を用いてマレイミド基を導入し
てチオエーテル共有結合を生じさせることができる。
【００４６】共有結合は、ポリエチレングリコール (PE
G)やその誘導体などのポリマーを用いて生じさせてもよ
い。好ましくは、ポリマーは 200〜20000 Daの間の平均
分子量をもつ。例えば、トレシル(tresyl)−MPEGを用い
てLys 残基中に存在するアミノ基を結合させることがで
きる (例えばWO99/40214参照) 。PEG を介した２つの相
手を結合させる他の手段は文献に記載されている(Bioco
njugate techniques (1996) 606-618; G Hermanson編;
Academic Pressおよび Frisch et al. Bioconjugate Ch
em. 7 (1996) 180-186) 。
【００４７】非共有結合には、静電気的相互作用、例え
ば陽イオン性リガンド部分と負に帯電したポックスウイ
ルスとの間のものがある。別の例は、両パートナーを非
共有的に又は親和性により会合させうる、プロテイン
Ａ、ビオチン/ アビジン、抗体などの親和性成分を用い
ることからなる。例えば、ペプチドリガンド部分とポッ
クスウイルス粒子間の結合には、Roux等(1989, Proc. N
atl. Acad Sci USA 86,9079) により開示された技法に
より、表面に提示されたエピトープに対するビオチニル
化抗体及び、ペプチドリガンド部分に対するストレプト
アビジン標識抗体を用いてもよい。結合相手のそれぞれ
に対する二官能性抗体もまた、この目的に適している。
【００４８】遺伝子連結は、ポリペプチド又はその断片
であるリガンド部分を連結するためである。有利にはこ
のリガンド部分をコードする核酸を、非改変ポックスウ
イルス粒子の表面に局在する同種ポックスウイルスポリ
ペプチドをコードするウイルス核酸配列に融合させる。
しかし、本発明はさらに、リガンド部分をコードする核
酸が、ポックスウイルス粒子の表面にこのリガンド部分
を局在化させることを可能にする異種ポリペプチド
(例、膜固定ポリペプチド) をコードする核酸配列に融
合している遺伝子連結に関する。好ましくは、このリガ
ンド部分をコードする核酸はポックスウイルスの完全さ
には必須でないウイルスゲノムの領域において融合して
いる。
【００４９】第一の方法によれば、遺伝子連結は、表面
に露出した同種ポックスウイルスポリペプチドの少なく
とも一部が除去され、本発明で用いる異種リガンド部分
で置換されたキメラポリペプチドを生ずる。第二の方法
では、遺伝子連結は、本発明で用いる異種リガンドポリ
ペプチド部分が、表面に露出した同種ポックスウイルス
ポリペプチドに導入されたキメラポリペプチドを生じ
る。遺伝子連結から生じるポリペプチド融合は、任意の
位置、Ｎ末端、Ｃ末端又はウイルスポリペプチドの２つ
のアミノ酸残基の間で生じる。好ましくは、選ばれた遺
伝子連結部位 (すなわち、リガンド部分コーディング配
列が挿入されたウイルス核酸の部位) は対応するオープ
ンリーディングフレームを破壊しない。
【００５０】本発明のポックスウイルスがＩＭＶである
とき、これらの遺伝子連結に適した同種表面露出ポック
スウイルスポリペプチドには、A27L(p14タンパク質) 、
LIR、A14L、A17L(p21タンパク質) 、D8L 、A9L 、E10R
及びH3L 遺伝子の発現産物があるが、これらに限定され
ない。好ましい態様によれば、リガンド部分をコードす
るヌクレオチド配列を、このリガンド部分が最終的にp1
4 のＮ末端に位置するように、A27L遺伝子配列に融合さ
せる。好ましくは、このリガンド部分のコーディングヌ
クレオチド配列は、A27L遺伝子開始コドンのすぐ下流に
融合させる。
【００５１】本発明のポックスウイルス粒子がEEV であ
る場合、これらの遺伝子連結に適した同種表面露出ポッ
クスウイルスポリペプチドには、B5R 、A34R及びHA遺伝
子の発現産物があるが、これらに限定されない。好まし
い態様によれば、リガンド部分をコードするヌクレオチ
ド配列を、このリガンド部分が最終的に対応する発現産
物のＮ末端に位置するようにB5R 遺伝子配列に融合させ
る。好ましくは、このリガンド部分のコーディングヌク
レオチド配列を、B5R 遺伝子開始コドンのすぐ下流に融
合させる。
【００５２】本発明によれば、リガンド部分及びポック
スウイルス粒子は連結を改善または安定化するためにさ
らに改変されてもよい。詳しくは、リガンド部分は、標
的細胞への接近を容易にするためにその末端の一方にス
ペーサー部分を提示してもよい。さらに、本発明のポッ
クスウイルス粒子は、順次結合してもしなくてもよい、
例えば縦列構造の１又は２以上のリガンド部分を含んで
いてもよい。例えば、ポックスウイルス粒子の特定標的
細胞への特異性を増すことが望ましい場合は、この標的
細胞を認識し結合しうるリガンド部分の組み合わせを用
いることが有利であるかもしれない。
【００５３】本発明が求める目的に従い、リガンド部分
はポックスウイルス粒子のエンベロープ中への挿入を容
易にするシグナルペプチドを含んでよい。膜固定を可能
にする疎水性配列の使用が考えられるが、トランスゴル
ジ網への移動を可能にするシグナルペプチドを用いるの
が好ましい。かかるペプチドはゴルジ区画に天然に存在
する任意のタンパク質から分離又は同定出来る (例え
ば、Mochamer et Rose,1987, J. Cell Biol. 105, 1205
-1214; Mochamer, 1993, Curr. Opin. Cell Biol. 5, 6
06-612; Muesch et al., 1990, Trends Biochem sci 1
5, 86-88参照) 。シグナルペプチドは、その機能があま
り改変されていないという条件で、天然の配列に関して
１又は複数の改変を含みうる。本発明で用いる好ましい
シグナルペプチドは、ヒトのトランスゴルジ網糖タンパ
ク質TGN51(Kain et al., 1997, J.Biol. Chem. 273, 98
1-988) 由来である。これは、好ましくはリガンド部分
のＮ末端において遺伝子連結により導入される。好まし
くは、リガンド部分はウイルスポリペプチドに遺伝子連
結している。
【００５４】上記の特異的感性性を示す中空のポックス
ウイルス粒子 (偽ポックスウイルス粒子ともいう) を得
ることは可能だが、好ましい態様によれば本発明のポッ
クスウイルス粒子は、少なくとも１つの関心ある核酸、
詳しくは真核標的細胞においてその発現を可能にするエ
レメントの制御下に位置する少なくとも１つの治療用遺
伝子を含む組換え核酸を含む。しかしながら、本発明の
中空のポックスウイルス粒子、すなわち偽ポックスウイ
ルス粒子は、US5,928,944 及びWO9521259 に開示されて
いるような、標的化細胞の取り込みを容易にするため
の、関心ある核酸との複合体を形成させるのに用いても
よい。
【００５５】本発明において「核酸」という用語は、任
意のありうる核酸、特に、DNA 、RNA もしくは雑種形
態、一本鎖もしくは二本鎖、直鎖もしくは環状、天然も
しくは合成、改変されたもしくはされていない (改変例
についてはUS5525711 、US4711955 又はEP-A302 175 参
照) ものを意味する。それはとりわけ、ゲノムDNA 、ゲ
ノムRNA 、cDNA、mRNA、アンチセンスRNA 、リボソーム
RNA 、リボザイム、転移RNA もしくはこのRNA をコード
するDNA であってもよい。核酸は、細胞に供給すると、
ポリペプチド、リボザイム、アンチセンスRNA 又は関心
ある他の分子を産生しうる少なくとも１つの発現可能な
配列を含む、プラスミド又は直鎖核酸の形態であっても
よい。核酸はまた、細胞へ、例えばアンチセンスもしく
はリボザイム機能のために供給されるべきオリゴヌクレ
オチド (すなわち、100bp 以下の短いサイズの核酸) で
あってもよい。好ましくは、核酸はポックスウイルスゲ
ノムDNA の形態である。
【００５６】核酸が、遺伝子発現に適した環境に置かれ
た場合に適切な遺伝情報を含むならば、その転写単位は
コードされた遺伝子産物を発現するだろう。発現のレベ
ル及び細胞特異性は、関連プロモーターの強さと起源、
及び関連エンハンサーエレメントの存在及び活性化にか
なりの程度依存するであろう。従って好ましい態様にお
いては、転写制御エレメントは、CMV プロモーター／エ
ンハンサーなどのプロモーター／エンハンサー配列を含
む。しかしながら、当業者であれば、任意のウイルス、
原核細胞 (例、細菌の) もしくは真核細胞から得られて
もよく、構成性でも制御可能なものでもよく、また真核
細胞、特に標的細胞において発現に適した多様なその他
のプロモーター及び／又はエンハンサー配列が知られて
いることが分かる。より正確には、標的細胞による発現
に必要なこれらの遺伝情報は、該DNA をmRNAに転移する
のに、そして必要であればmRNAをポリペプチドに翻訳す
るのに必要なエレメントを含む。各種の脊椎系における
使用に適した転写プロモーターは、文献に広く記載され
ている。例えば、適当なプロモーターには、RSV 、MPS
V、SV40、CMV 又は7.5kのようなウイルスプロモータ
ー、ワクシニアプロモーター、誘導性プロモーター等が
ある。好ましいプロモーターはポックスウイルスから分
離されたもので、例えばワクシニアウイルスの7.5k、H5
R 、TK、p21 、ｐ11又はK1L がある。あるいは、Chakra
barti 等(1997, Biotechniques 23, 1094-1097) 、Hamm
ound等(1997, J. Virological Methods 66, 135-138)及
びKuman とBoyle(1990, Virology 179, 151-158)に記載
されたような合成プロモーター、また、初期及び後期ポ
ックスウイルスプロモーターの間のキメラプロモーター
を用いてもよい。
【００５７】核酸はさらに、追加の機能性要素を含んで
いてもよく、例えばイントロン配列、標的化配列、輸送
配列、分泌シグナル、核局在化シグナル、IRES、polyＡ
転写終結配列、三部分(tripartite)リーダー配列、複製
又は組み込みに関与する配列がある。この配列は文献に
報告されており、当業者により容易に得ることができ
る。
【００５８】好ましい態様において、関心ある核酸は、
治療用分子である遺伝子産物をコードする関心ある少な
くとも１つの配列 (すなわち、治療用遺伝子) を含む。
「治療用分子」は、患者、殊にある疾病や病状にかかっ
ている、又はこの疾病もしくは病状に対して防御される
べき患者に適切に投与された場合に薬理的もしくは防御
的活性を有するものである。このような薬理的もしくは
防御的活性は、この疾病もしくは病状の過程又は微候に
対する有益な効果に関連すると期待されるものである。
本発明の過程で当業者が、治療用分子をコードする遺伝
子を選択した場合、当業者は一般にその選択を以前に得
られた結果に関連づけ、請求された本発明を実施する以
外の過度の実験なしに該薬理特性を得ることを合理的に
期待しうる。本発明によれば、関心ある配列は、それが
導入される標的細胞と同種又は異種でありうる。有利に
は、この関心ある配列はポリペプチド、殊に治療もしく
は予防特性を与える治療用又は予防用ポリペプチドの全
部又は一部をコードする。ポリペプチドは、大きさに、
またグリコシル化されているかどうかにかかわらない、
ポリヌクレオチドの任意の翻訳産物であり、ペプチドと
タンパク質を含む。治療用ポリペプチドには、主な例と
して、動物又はヒト生体において欠陥もしくは欠損タン
パク質を補償しうるポリペプチド、又は生体から有害な
細胞を制限又は除去するために毒性の作用を通して作用
するものがある。それらはまた、体液性又は細胞性応
答、又は両方を引き起こす内在性抗原として作用する免
疫付与ポリペプチドであってもよい。
【００５９】治療用遺伝子によりコードされるポリペプ
チドの例には、サイトカイン (インターフェロンα、β
もしくはγ、インタロイキン、特にIL−２、IL−６、IL
−10もしくはIL−12、腫瘍壊死因子 (TNF)、コロニー刺
激因子(GM-CSF 、C-CSF 、M-CSF 等) 、免疫刺激ポリペ
プチド (B7.1、B7.2等) 、凝固因子 (FVIII 、FIX 等)
、増殖因子 (トランスフォーミング増殖因子TGF 、繊
維芽増殖因子FGF 等) 、酵素 (ウレアーゼ、レニン、ト
ロンビン、メタロプロテイナーゼ、酸化チッ素シンター
ゼNOS 、SOD 、カタラーゼ等) 酵素阻害剤 (α１−アン
チトリプシン、アンチトロンビンIII 、ウイルスプロテ
アーゼ阻害剤、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤
PAI-1)、CFTR (嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質) タ
ンパク質、インスリン、ジストロフィン、MHC 抗原クラ
スＩもしくはII、細胞遺伝子の発現を変化／調節しうる
ポリペプチド、細菌、寄生虫もしくはウイルス感染又は
その増殖を阻害しうるポリペプチド (抗原性ポリペプチ
ド、抗原性エピトープ、競合により天然のタンパク質の
作用を阻害するトランスドミナント(transdominant)変
異物、アポトーシス誘導剤もしくは阻害剤 (Bax 、Bc1
2、Bc1X等) 、細胞分裂抑制剤(p21、p16 、Rb等) 、ア
ポリポタンパク質 (ApoAI 、ApoAIV、ApoE等) 、血管生
成の阻害剤 (アンギオスタチン、エンドスタチン等) 、
血管生成ポリペプチド (血管内皮増殖因子VEGFのファミ
リー、FGF ファミリー、CTGFを含むCCN ファミリー、Cy
r61 及びNov)、酸素ラジカル除去剤、抗腫瘍効果をもつ
ポリペプチド、抗体、毒素、イムノトキシン及びマーカ
ー (β又はガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ等) 又は
当分野で臨床症状の治療もしくは予防に有用であると認
められている関心ある任意の他の遺伝子がある。
【００６０】遺伝子機能不全の治療を考慮すると、欠陥
遺伝子の機能的対立遺伝子、例えば血友病ＡもしくはＢ
に関して因子VIIIもしくはIXをコードする遺伝子、筋疾
患に関してジストロフィン (もしくはミニジストロフィ
ン) 、糖尿病に関してインスリン、嚢疱性繊維病に関し
てＣＦＴＲを使用してもよい。
【００６１】適当な抗腫瘍遺伝子には、腫瘍抑制遺伝子
(例、Rb、p53 、DCC 、NF-1、ウィルムス腫瘍、NM23、
BRUSH-1 、ｐ16、ｐ21、ｐ56、ｐ73、またそれらの各変
異体) をコードするもの、自殺遺伝子産物、抗体、細胞
分裂もしくは形質導入シグナルを阻害するポリペプチド
をコードする遺伝子があるが、これらに限定されない。
【００６２】好ましい態様において、治療用遺伝子は、
不活性物質 (プロドラッグ) を細胞障害性物質へ変化さ
せ、それにより細胞死を生じさせうる発現産物をコード
する自殺遺伝子である。TK HSV-1をコードする遺伝子
は、自殺遺伝子ファミリーの始原型を構成する(Caruso
et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7024-
7028) 。TKポリペプチドは非毒性である一方、アシクロ
ビルやガンシクロビルなどのヌクレオシド類似体 (プロ
ドラッグ) の変換を触媒する。変換されたヌクレオチド
は伸長の過程にあるDNA 鎖に取り込まれ、この伸長を妨
害し、従って細胞分裂を阻害する。多数の自殺遺伝子／
プロドラッグの組み合わせが現在利用できる。より具体
的に言及できるのは、ラットシトクロームｐ450 及びシ
クロホスホファミド(Wei et al., 1994, Human Gene Th
er. 5, 969-978) 、Escherichia coli (E.coli) プリン
ヌクレオシドホスホリラーゼ及び６−メチルプリンデオ
キシリボヌクレオシド(Sorscher et al., 1994, Gene T
herapy 1, 223-238)、E.coliグアニンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ及び６−チオキサンチン(Mzoz et a
l., 1993, Human Gene Ther. 4, 589-595)である。しか
しながら、より好ましい態様では、本発明のポックスウ
イルス粒子は、プロドラッグの5-フルオロシトシン (5-
FC) と共に使用できる、シトシンデアミナーゼ (CDase)
もしくはウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ
(UPRTase)活性又はCDase をUPRTＴase の両方の活性を
有するポリペプチドをコードする自殺遺伝子を含む。自
殺遺伝子、例えばCDase とUPRTase 活性を有するポリペ
プチドをコードするもの、の組み合わせを用いることも
本発明に関して考えられる。
【００６３】CDase とUPRTase 活性は原核生物及び下等
真核生物で証明されているが、哺乳動物には存在しな
い。CDase は、通常は、外生シトシンが加水分解性脱ア
ミノによりウラシルに変換されるピリミジン代謝経路に
関与し、一方UPRTase はUMP 中でウラシルを変換する。
しかしながら、CDase はまたシトシン類似体、５−FCを
脱アミノして、５−フルオロウラシル (５−FU) を生成
させ、これはUPRTase 作用により５−フルオロ−UMP(５
−FUMP) に変換されると細胞障害性が高い。
【００６４】適当なＣＤase コーディング遺伝子には、
Saccharomyces cerevisiaeFCＹ1 遺伝子(Erbs et al.,
1997, Curr. Genet. 31, 1-6; WO93/01281) 及びE.coli
codＡ遺伝子(EP 402 108)があるが、これらに限定され
ない。適当なUPRTase コード遺伝子には、E.coli由来
(upp 遺伝子; Anderson et al., 1992, Eur. J. Bioche
m. 204, 51-56) 、Lactococcus lactis由来(Martinusse
n and Hammer, 1994, J. Bacteriol. 176, 6457-646
3)、Mycobacterium bovis 由来(Kim et al., 1997,Bioc
hem Mol. Biol. Int 41, 1117-1124)、Bacillus subtil
is 由来(Martinussen et al., 1995, J. Bacteriol. 17
7, 271-274)、及びSaccharomyces cerevisiae由来 (FUR
-1 遺伝子;Kern et al., 1990, Gene 88, 149-157) が
あるが、これらに限定されない。好ましくはCDase コー
ディング遺伝子はFCY1遺伝子由来であり、UPRTase コー
ディング遺伝子はFUR-1 遺伝子由来である。
【００６５】本発明はまた、その遺伝子産物の細胞障害
活性が保存されるならば、１又は複数のヌクレオチドの
付加、欠失及び／又は置換により改変された変異自殺遺
伝子の使用も含む。いくつかのCDase 及びUPRTase 変異
体、例えばCDase とUPRTaseの両方の活性を有する２ド
メイン酵素をコードする融合タンパク質 (WO96/16183)
、及び最初の35残基が欠失したFUR-1 遺伝子によりコ
ードされるUPRTase の変異体 (WO99/54481に開示の変異
TFCU-1) などが文献に報告されている。
【００６６】上述のように、治療用遺伝子にはまた、ガ
ン遺伝子や原ガン遺伝子 (c-myc, c-fos, c-jun, c-my
b, c-ras, Kc 及びJE) などの、選択された正に作用す
る増殖調節遺伝子のRNA に結合して破壊しうるアンチセ
ンス配列及びリボザイムコーディング遺伝子が含まれ
る。
【００６７】本発明のポックスウイルス粒子中に取り込
まれる核酸は１又は２以上の治療用遺伝子を含んでいて
もよい。これに関して、自殺遺伝子産物をコードする遺
伝子及びサイトカイン遺伝子 (例、インタフェロンα、
∃もしくはγ、インターロイキン、好ましくはIL−２、
IL−４、IL−６、IL−10もしくはIL−12の中から選択し
たもの、TNF 因子、GM-CSF、C-CSF 、M-CSF 等) 、免疫
刺激遺伝子 (例、Ｂ7.1 、Ｂ7.2 、ICAM) 又はchimioki
ne遺伝子 (例、MIP 、RANTES、MCP1等) の組み合わせが
有利である。異なる遺伝子発現はユニークプロモーター
(ポリシストロン性カセット) により、または独立のプ
ロモーターにより制御されてもよい。さらに、それらは
核酸と共に、同じもしくは反応の方向に、単一の部位も
しくは各種部位に挿入されてもよい。
【００６８】別の態様では、本発明はさらに、(i) 上述
の少なくとも１つの異種リガンド部分、および(ii)上述
のポックスウイルス粒子表面に天然に局在する同種ウイ
ルスポリペプチドの全部もしくは一部を含有するキメラ
タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド
配列を含むベクターに関する。当然、ヌクレオチド配列
は、その発現に必要なエレメントの制御下に置かれる。
本発明のベクターの選択は広範囲にわたり、当業者には
容易に入手できる。ベクターはプラスミドでも、任意の
動物ウイルス、殊に、アデノウイルス、レトロウイル
ス、AAV(アデノ随伴ウイルス) もしくはポックスウイル
ス由来のウイルスベクターでもよい。好ましい態様によ
れば、本発明のベクターはポックスウイルスベクター
(すなわち、ポックスウイルスゲノム DNA、殊にVVまた
はMVA ゲノム DNA) である。ここで用いる「一部」なる
用語は、ウイルスベクターの表面にリガンド部分の提示
を可能にするウイルスポリペプチドの断片を意味する。
さらに、本発明のベクターはまた、関心ある少なくとも
１つののヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００６９】関心ある配列および発現に必要な関連要素
をウイルスゲノムに挿入するための基本的技術は当業者
が利用できる多数の文献に記載されている (Piccini et
al., 1987, Methods of Enzymology 153, 545-563; US
4,769,330; US 4,772,848;US 4,603,112; US 5,100,58
7 およびUS 5,179,993) 。この技術は、ウイルスゲノ
ム中の重複配列 (すなわち所望の挿入部位) と関心ある
配列を含むプラスミドとの間の相同的組換えに関する。
【００７０】ポックスウイルスゲノム内の挿入部位は、
組換えポックスウイルスが生きて感染性であり続けるよ
うに、好ましくは非必須遺伝子座である。適当な非必須
領域は、非コーディング遺伝子間領域、またはその不活
性化もしくは欠失がウイルスの増殖、複製もしくは感染
にあまり害を及ぼさない任意の遺伝子などであるが、こ
れらに限定されない。例えば、ポックスウイルスゲノム
中の欠失配列に対応する相補的配列を有するヘルパー細
胞系を用いることにより、ウイルス粒子の産生の間に欠
損機能がトランスに (in trans) 供給される条件で、必
須のウイルスの遺伝子座に挿入することも考えられる。
【００７１】例えば、コペンハーゲンワクシニアウイル
スを用いる場合、好ましくはチミジンキナーゼ遺伝子(t
k)内に位置する挿入部位を選べばよい(Hruby et al., 1
983,Proc. Natl.Acad. Sci USA 80, 3411-3415; Weir e
t al., 1983, J. Virol. 46, 530-537)。しかしなが
ら、その他の挿入部位も適しており、例えば、赤血球凝
集素遺伝子内のもの(Guo et al., 1989, J. Virol 63,
4189-4198)、K1L 遺伝子座内のもの、u 遺伝子内のもの
(Zhou et al., 1990, J. Gen. Virol. 71, 2185-2190)
または多様な自然のもしくは操作された欠失が文献に報
告されているワクシニアウイルスゲノムの左端(Altenbu
rger et al., 1989, Archives Virol. 105, 15-27; Mos
s et al., 1981, J. Virol. 40, 387-395; Panicali et
al., 1981, J. Virol. 37, 1000-1010; Perkus et a
l., 1989, J. Virol. 63, 3829-3836;Perkus et al., 1
990, Virol. 179, 276-286; Perkus et al., 1991, Vir
ol. 180, 406-410)のものがある。
【００７２】MVA を用いる場合、同定された欠失Ｉ〜VI
I のいずれか内に、好ましくは欠失IIまたはIII に位置
する挿入部位(Meyer et al., 1991, J. Gen. Virol. 7
2, 1031-1038; Sutter et al., 1994, Vaccine 12, 103
2-1040)、およびD4R 遺伝子座内のものを選択するのが
好ましい。
【００７３】鶏痘ウイルスを用いる場合、チミジンキー
ゼ遺伝子内の挿入が考えられるが、関心ある配列は好ま
しくは非コーティング遺伝子間領域、例えば鶏痘ウイル
スゲノムの1.3kb Hind III断片のORF 7 と９の間に位置
する遺伝子間領域に導入される (EP 314 569およびUS
5,180,675参照) 。
【００７４】本発明はさらに、下記工程を含む本発明の
ポックスウイルス粒子を作製する方法を提供する：a)該
ポックスウイルス粒子の種 (seed、接種物) を得る、b)
許容細胞の培養物を調製する、c)該細胞培養物に該ポッ
クスウイルス粒子の種を感染させる、d)この感染細胞を
適当な時間培養する、e)細胞培養物および／または培養
上清から、産生されたポックスウイルス粒子を回収す
る、そしてf)任意に、回収したポックスウイルス粒子を
精製する。
【００７５】特別な態様では、a)とc)の工程を結合する
ことができる。この場合、本発明の方法は下記工程を含
む：a)許容細胞の培養物を調製する、b)該細胞培養物
に、野生型ポックスウイルス粒子を感染させ、該細胞に
該ポックスウイルスの DNAゲノムと相同的組換えが可能
な重複配列を両端に有する関心ある配列を含むプラスミ
ドをトランスフェクトする、c)この感染細胞を適当な時
間培養する、d)細胞培養物および／または培養上清か
ら、産生されたポックスウイルス粒子を回収する、そし
てf)任意に、回収したポックスウイルス粒子を精製す
る。
【００７６】好ましい態様において、「許容細胞」と
は、受精卵から得た鶏胚より調製した初代鶏胚繊維芽細
胞(CEF) である。粒子のポックスウイルスゲノムが１ま
たは２以上のウイルス機能が欠損している (例、EEV 粒
子の産生に関与する少なくとも１つのの遺伝子において
欠損) 特定の態様によれば、トランスに欠損機能を付与
するヘルパー細胞を用いるのが有利であるかもしれい。
特に、F13L遺伝子によりコードされる機能が欠損したポ
ックスウイルスをF13L発現産物を発現する細胞系におい
て培養するのが好ましい。このよう細胞系はBorrego 等
(1999, J. Gen.Virol. 80, 425-432) に記載のようにF
13Lポリペプチドを発現する適宜ベクターのトランスフ
ェクションにより作製することができる。有利な態様で
は、本発明のポックスウイルス粒子の分離および増殖
は、本発明のリガンド部分により認識される抗リガンド
分子を表面に提示する標的細胞系上で行うことができ
る。これにより、野生型ゲノムの起こりうる混入を最小
にすることができる。例えば、MUC-1 ポリペプチドに特
異的なリガンド部分を有するポックスウイルス粒子は好
ましくはMUC-1 発現標的細胞上で増殖させる。表面に抗
リガンド分子を発現するかかる細胞系の構築は当業者の
なしうる範囲内である。
【００７７】「ポックスウイルス粒子の種」は、通常の
技術により、ポックスウイルスゲノムと関心ある配列を
取り込んでいるプラスミドとの間の相同的組換えの最後
に得られる。これに関し、例えば、本明細書の実験の項
を参照できる。
【００７８】プラスミドによる細胞の追加のトランスフ
ェクションが必要な場合、各種の広く使用されている細
胞トランスフェクション法 (例、DNA カルシウム沈降、
エレクトロトランスフェクション、…) を任意にプラス
ミド取り込みを容易にするグリセロールと組み合わせて
用いることができる。さらに、組換えウイルスが選択遺
伝子 (例、E.coli gtp遺伝子) を含んでいる場合、選択
工程を含むことができ、例えば工程Ｃにおいてミコフェ
ノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンの混合物を
含む選択的培地を用いることにより行える。
【００７９】ウイルス粒子は培養上清から回収できる
が、それらはまた細胞からも回収できる。慣用的に使用
される方法の１つは、任意の手段 (化学的、凍結／解
凍、浸透圧衝撃、機械的衝撃、音波処理等) により細胞
を溶解することからなる。本発明のポックスウイルス粒
子は、プラーク精製の連続操作により分離し、次いで従
来の技術 (クロマトグラフィー法、塩化セシウムまたは
ショ糖勾配上での超遠心)を用いて精製することができ
る。あるいは、ウイルス表面に提示されたリガンド部分
とその抗リガンドとの親和性を本発明のポックスウイル
ス粒子の精製に用いてもよい。例えば、精製は、a)固体
支持体上に関連抗リガンドを固定化し、b)ウイルス調製
物を、抗リガンドとリガンド部分の間の特異的結合を可
能にするのに十分な時間、固定化抗リガンドと接触さ
せ、c)結合していない材料を捨て、d)結合した材料を溶
離させ、そしてe)溶離した材料を回収することにより行
ってもよい。このような精製は、本発明のポックスウイ
ルス粒子に野生型もしくはヘルパーポックスウイルスが
最終的に混入することを減少させるのに有利である。
【００８０】本発明の方法は、IMV およびEEV 両方のポ
ックスウイルス粒子を産生するのに使用できる。本発明
の好ましい態様によれば、本方法は、EEV の追加のエン
ベロープを破壊し、IMV の選択産生を可能にする追加工
程を含む。好ましくは、この追加の工程は音波処理工程
または穏やかな洗浄剤 (例、Brij-58)における可溶化工
程からなる。
【００８１】本発明はまた、少なくとも１種のポックス
ウイルス粒子および／または少なくとも１種の本発明の
ベクターを含む組成物に関する。特別な場合には、この
組成物は、２またはそれ以上のポックスウイルス粒子、
および／または２またはそれ以上の本発明ベクターを含
み、ここで、それらは(i) 異種リガンド部分の性質およ
び／または(ii)関心ある配列の核酸の性質および／また
は(iii) ポックスウイルスの起源および／または(iv)粒
子の型 (IMV/EEV)により互いに異なる。この組成物は、
例えば、固体、液体、粉末、水性、凍結乾燥形態の各種
形態でありうる。好ましい態様では、この組成物はさら
に薬剤的に許容しうる担体を含み、ヒトまたは動物の治
療的処置のための方法に使用することを可能にする。こ
の特定の場合では、担体は好ましくは薬剤的に適した注
射可能な担体または希釈剤である(例えば、Remington's
Pharmaceutical Sciences, 第16版, 1980, Mack Publ
ishing Co参照) 。このような担体または希釈剤は薬剤
的に許容しうる、すなわち、使用する用量および濃度に
おいて受容者に非毒性である。これは好ましくは、等
張、低張または少し高張であり、例えばショ糖溶液によ
り供給される比較的低いイオン強度を有する。さらに組
成物は、任意の関連溶媒、滅菌、発熱物質を含まない水
を含む水性もしくは部分的に水性の液体担体、分散媒、
被覆物および同等物または希釈剤 (例、Tris-HCl、酢酸
塩、リン酸塩) 、乳化剤、可溶化剤もしくはアジュバン
トを含んでいてもよい。薬剤調製物のpHは、in vivo で
の適用に有用となるように適宜調整して緩衝剤で処理す
る。組成物は、液体溶液として、または投与前に溶液中
に懸濁されうる固体の形態 (例、凍結乾燥) として調製
してもよい。注射可能な組成物のための担体または希釈
剤の代表的例には、水、好ましくは生理的pHに緩衝液で
処理された等張生理食塩水 (例えばリン酸塩緩衝化生理
食塩水またはトリス緩衝化生理食塩水) 、マンニトー
ル、デキストロース、グリセロールおよびエタノール、
またヒト血清アルブミンなどのポリペプチドまたはタン
パク質がある。例えば、このような組成物は、10mg/ml
マンニトール、１mg/ml HSA 、20mM Tris pH7.2 および
150mM NaClを含んでいてもよい。
【００８２】本発明の組成物は、局所、全身、経口、直
腸、または局部投与用に常法によって製造することがで
きる。適した投与経路には、胃内、皮下、エアロゾル、
点滴、吸入、心臓内、筋肉内、静脈内、動脈内、腹膜
内、腫瘍内、鼻腔内、肺内または気管内経路があるが、
これらに限定されない。投与は一回であるいは一定時間
の間隔をあけて１または数回繰り返す量で行ってもよ
い。適当な投与経路および用量は、各種パラメーターに
より、例えば、関連する症状や疾病、予防もしくは治療
の必要度、進行の段階および導入する治療用遺伝子によ
って異なる。指標としては、ポックスウイルス粒子は10
4 〜1014 pfu (プラーク形成単位) 、有利には105 〜10
13 pfu、そして好ましくは106 〜1012 pfuの量で剤に配
合してもよい。力価は慣用の技術により決定される。ベ
クターの量は好ましくは、0.01〜10mg/kg 、特に0.1 〜
２mg/kg 含まれる。
【００８３】さらに、本発明の組成物は、脂質 (例、陽
イオン性脂質、リポソーム、WO98/44143に記載の脂質)
、ヌクレアーゼ阻害剤、ポリマー、キレート剤などの
１または２以上の安定化物質を、動物／ヒト体内での分
解から保護するために含有してもよい。
【００８４】別の態様では、本発明は遺伝子治療による
ヒトまたは動物生体の治療のための薬剤の調製のため
の、本発明のポックスウイルス粒子またはベクターの使
用を提供する。本発明の範囲において、「遺伝子治療」
とは、任意の治療用の遺伝子を細胞に導入する方法であ
ると理解すべきである。従って、これは、細胞性もしく
は体液性または両者でありうる免疫応答を誘導するため
に、潜在的抗原性エピトープを細胞に導入することに関
する免疫治療も含む。
【００８５】本発明の使用は、ポックスウイルス粒子の
表面に提示されるか、本発明のベクターにより発現する
リガンド部分の標的化特性に依存する。従って、病原因
子 (細菌、ウイルスまたは寄生虫) に感染した細胞の表
面に存在する分子を認識して結合しうるリガンド部分
は、このような感染により生じる任意の病状や疾病の治
療または予防に適している。腫瘍標的化リガンド部分
は、ガンの治療または予防により意図される。「ガン」
の用語は、拡散もしくは局在化腫瘍、転移、ガン性ポリ
ープおよびプレ新生物病変 (例、形成異常) を含む任意
のガン性病状、ならびに望ましくない細胞増殖から生じ
る病気を含む。より詳しくは、胸部、子宮頸部 (特にパ
ピローマウイルスにより引き起こされるもの) 、前立
腺、肺、膀胱、肝臓、結腸直腸、膵臓、胃、食道、喉
頭、中枢神経系、血液 (リンパ腫、白血病等) 、黒色
腫、肥満細胞腫等を挙げることができる。
【００８６】本発明はさらに、治療に有効な量の本発明
のポックスウイルス粒子、ベクターまたは組成物をヒト
または動物生体に投与することを含む、ヒトまたは動物
生体の治療方法を提供する。「治療に有効な量」とは、
治療することが望まれる疾病や病状に通常関連した１ま
たは２以上の症状の軽減に十分な量である。予防的使用
に関する場合、この用語は疾病や病状の発症を予防また
は遅延させるのに十分な量を意味する。
【００８７】本発明の方法は、上に挙げた疾病や病状に
関する予防目的および治療用途に用いることができる。
本発明方法は、ここに記載したと同様の方法を用いて、
任意の型の腫瘍の発症を防止するか、または既存の腫瘍
を逆転させるのに特に有用である。本発明方法が多様な
任意の方法により実施できることは当然である。有利に
は、本発明のポックスウイルス粒子、ベクターまたは組
成物は任意の慣用の生理学的に許容しうる投与経路によ
り、例えば静脈内注射により接近可能な腫瘍へ、噴霧や
点滴の手段により肺へ、適宜カテーテルを用いて血管系
へ、等によりinvivo で直接投与することができる。ex
vivo の方法を採用してもよく、これは患者から細胞
(骨髄細胞、末梢血リンパ球、筋芽細胞等) を採取し、
従来の技術により本発明のポックスウイルス粒子または
ベクターを導入し、そしてこれを患者に再投与すること
からなる。
【００８８】本発明によるin vivo 治療の場合では、ト
ランスフェクション率を改善するために、上記薬剤調製
物の投与の前に患者はマクロファージ低減処置をうけて
もよい。このような手法は文献に記載されている (特に
Van Rooijen et al., 1997,TibTech, 15, 178-184参照)
。
【００８９】好ましい態様によれば、本発明の方法が、
本発明の特徴を示し、かつ自殺遺伝子を発現する組換え
ポックスウイルス粒子を用いる場合、発現した自殺遺伝
子産物に特異的なプロドラッグを薬剤的に許容しうる量
でさらに投与するのが有利でありうる。２回の投与は同
時にまたは連続して行うことができるが、好ましくは本
発明のポックスウイルス粒子の後にプロドラッグを投与
する。例えば、50〜500 mg/kg/日の量でプロドラッグを
使用することが可能であるが、200 mg/kg/日の量が好ま
しい。プロドラッグは標準的実施法に従って投与され
る。経口投与が好ましい。プロドラッグは１回で、また
は宿主生物または標的細胞内で毒性代謝物が産生されう
るように十分長い期間で複数回を反復投与することが可
能である。上述のように、プロドラッグのガンシクロビ
ルまたはアシクロビルを、TK HSV-1遺伝子産物と組み合
わせて、そして5-FCをFCY1、FUR1および／またはFCU1遺
伝子産物と組み合わせて用いることができる。
【００９０】腫瘍の治療のために意図される方法を説明
すると、まず、自殺遺伝子を発現し、その表面に腫瘍細
胞により発現される腫瘍抗原を認識し、結合しうるリガ
ンド部分を提示すポックスウイルス粒子を投与してもよ
い。一旦感染すると、ガン性細胞は自殺遺伝子を発現す
るであろう。選ばれた自殺遺伝子産物により代謝される
プロドラッグを投与することにより、感染細胞を殺すこ
とができる。MUC-1 陽性胸部ガン (乳ガン) の予防また
は逆転が望ましい個体においては、FCU-1 を発現し、そ
の表面にMUC-1 腫瘍抗原を認識し結合しうるSM3 scFvリ
ガンドを有するポックスウイルス粒子を用いることがで
きる。プロドラッグ5-FCをさらに投与してMUC-1 陽性感
染細胞を殺してもよい。
【００９１】さらに本発明の方法の１つの特徴は、本発
明のポックスウイルス粒子が治療される生体においてin
vivo で産生されうることである。これに関して、リガ
ンド部分をその表面に提示しないが、EEV ポックスウイ
ルス粒子の表面に局在するポリペプチドをコードする配
列 (例、B5R 遺伝子) 中に上記リガンド部分をコードす
る核酸を挿入して遺伝子操作されたポックスウイルスゲ
ノムを含む、IMV ポックスウイルス粒子を患者に投与す
ることが考えられるかもしれない。従って、この特別の
態様では、組換えポックスウイルスゲノムはin vivo に
おいて (すなわち、患者への投与後に) 本発明に従って
EEV 粒子を産生することができ、一方、投与されたIMV
形態は依然として野生型ポックスウイルスの性質を示
す。投与されたこのIMV 粒子は非特異的に患者細胞 (非
標的化細胞) に感染するので、ウイルスゲノムは宿主の
感染した細胞中で複製し、標的細胞のみに感染しうるEE
V 粒子を放出するであろう。
【００９２】本方法を単独で用い、あるいは所望により
現在利用しうる方法 (例、放射線照射、化学療法および
外科手術) と組み合わせて、疾病もしくは病状の予防も
しくは治療を行うことができる。
【００９３】本発明のポックスウイルス粒子の感染特異
性は実際に、その表面に局在するリガンド部分の結合特
異性に関連している。従って、このポックスウイルス粒
子は、このリガンド部分と抗リガンド分子間の特異的結
合に基づく方法において使用することができる。このよ
うに、本発明はまた、試料中に存在する任意の抗リガン
ド分子、または拡張して、抗リガンド分子を含む任意の
化合物を、検出及び／又は分離及び／又は濃縮及び／又
は精製及び／又は解析する方法に関し、この方法では、
本発明のポックスウイルス粒子 (すなわち、その表面に
該分子に特異的に結合しうる異種リガンド部分を提示し
ている) が、もし試料中に存在する場合、該抗リガンド
分子または該化合物と結合複合体を形成するのに使用さ
れる。
【００９４】本発明はまた、試料中の任意の抗リガンド
分子、または拡張してこの抗リガンド分子を含む任意の
化合物を、検出及び／又は濃縮及び／又は分離及び／又
は精製及び／又は解析するための試薬に関し、この試薬
は本発明のポックスウイルス粒子 (すなわち、その表面
に該分子または化合物に特異的に結合しうる異種リガン
ド部分を提示している) を含む。
【００９５】本発明は特に、試料中の任意の抗リガンド
分子、または拡張して、この抗リガンド分子を含む任意
の化合物を、検出及び／又は濃縮及び／又は分離及び／
又は精製及び／又は解析する方法に関し、これは以下の
工程を含む：この試料を結合反応を可能にする条件下で
本発明の試薬と接触させ、次いで形成された何らかの結
合複合体を分離し、可能であれば検出し及び／又は定量
する。
【００９６】さらに詳しくは、本発明は、下記工程を含
む、試料中に存在する任意の抗リガンド分子または広
く、この抗リガンド分子を含む任意の化合物を、本発明
の試薬を用いて検出及び／又は濃縮及び／又は分離及び
／又は精製及び／又は解析する方法に関する：a)固体支
持体に該試薬を固定化する、b)該試料を、抗リガンド分
子またはこの抗リガンド分子を含む化合物を該試薬の異
種リガンド部分と特異的に結合させるのに十分な時間、
該固定化試薬と、接触させる、c)結合していない試料を
捨てる、d)工程b)で保持された抗リガンド分子または抗
リガンド分子を含む化合物を溶離させる、そして、e)工
程d)において溶離した該抗リガンド分子または抗リガン
ド分子を含む化合物を解析する。
【００９７】ここで用いる「固体支持体」とは、マイク
ロ滴定スライド、ホイル、カラム、シート、コーン、ウ
ェル、ビーズまたはその他の任意の適当なミクロもしく
はマクロ粒子基体の形態のもの (ただし、これらに限定
されない) であり、本発明のウイルス粒子を固定化しう
る任意の材料を含む。これは、化学的に変性された合成
材料であってもよく、さもなくば殊に多糖類、例えばセ
ルロース材料 (例、紙) 、セルロース誘導体 (例、ニト
ロセルロース及び酢酸セルロース) 又はデキストラン(B
IAcore、スウェーデン、ウプサラ);ポリマー類 (例、塩
化ビニル、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリアクリレ
ート又は共重合体 (例、プロピレン- 塩化ビニル共重合
体、塩化ビニル−酢酸ビニル共重合体、スチレンを主成
分とする共重合体);天然繊維 (例、綿) 及び合成繊維
(例、ナイロン) であってもよい。
【００９８】好ましくは、「固体支持体」はポリスチレ
ンポリマー、ブタジエン／スチレン共重合体、又はブタ
ジエン／スチレン共重合体をポリスチレン、スチレン／
アクリロニトリル又はスチレン／メチルメタクリレート
共重合体から選ばれた１又は２以上の重合体と混合した
もの、ポリプロピレン、ポリカーボネート等である。
【００９９】試薬 (すなわち、本発明のウイルス粒子を
含む) は固体支持体に直接又は間接に結合しうる。直接
法を用いると、２つのやり方が可能である。固体支持体
上への試薬の吸着による、すなわち非共有結合 (主に水
素、ファンデルワールス又はイオン型の)によるか、又
は試薬と支持体との間の共有結合の形成による方法であ
る。間接的には、基体へ「抗試薬」化合物を予め結合
(吸着又は共有結合により) しておくことが可能であ
り、該化合物は、試薬と相当作用しうる、例えばこの系
を固体基体に固定化することができる。例を挙げると、
抗リガンド分子との結合に関与する部分とは異なるポッ
クスウイルス粒子の部分と免疫学的に反応性であること
を条件として抗体; 例えば、ポックスウイルス粒子上に
ビタミンなどの分子をグラフトし、そして固体相上には
対応する受容体 (例えばビオチン- ストレプトアビジン
系) を固定化することによるリガンド−受容体系があ
る。間接法はまた、タンパク質もしくはこのタンパク質
の断片またはポリペプチドのポックスウイルス粒子タン
パク質の一端への遺伝的連結による予備的グラフト又は
融合と、グラフト又は融合されたタンパク質又はポリペ
プチドの受動的吸着又は共有結合によるポックスウイル
ス粒子タンパク質の前記支持体への固定化も意味するこ
とは理解されよう。
【０１００】本発明方法に関連して、「抗リガンド分子
又は広く、この抗リガンド分子を含む任意の化合物」な
る用語は、試料又は前に定義した標的細胞中に含まれて
いるかもしれない薬剤やポリペプチドなどの有機化学物
質を広く意味し、より詳しくは腫瘍細胞である。例え
ば、in vitro又は合成法の結果作製されうる非天然分子
を意味しうる。これは、細胞又は生物学的試料 (培養細
胞、細胞、器官又は組織生検材料、体液等) に存在する
天然の分子、例えば抗体、細胞受容体、ウイルス受容体
及び腫瘍マーカーなどでありうる。所望により、試料を
HPLCなどの方法を用いて加工することが可能であり、こ
れは、ある決まった範囲の分子量、親水性等を有する分
子中で濃縮された画分を提供できる。濃縮の条件は、そ
の分子の化学構造及び技術により当業者により決めるこ
とができる。
【０１０１】溶離工程は、結合したリガンド部分／抗リ
ガンド分子を分離することが可能な任意の技術を用いて
行うことができる。これらの技術は、文献に十分に記載
されており、前記結合の物理化学的性質に基づく。例え
ば、pH又はイオン強度の条件を変化させることができ
る。さらに、リガンド及び分子の特異的結合と競合しう
る溶離化合物を用いることも可能である。
【０１０２】本発明の別の目的は、抗リガンド分子、又
は広くは該抗リガンド分子を含む任意の化合物 (例、腫
瘍細胞) を検出するためのキットであり、これは、試薬
と適合性 (すなわち、リガンド部分と抗リガンド分子と
の結合を妨げない) である固体基体に結合した前記試薬
を含む。
【０１０３】最後に、本発明のポックスウイルス粒子
は、以下の工程を用いて同定してもよい。まず、ポック
スウイルス粒子ライブラリーを用意する。このポックス
ウイルス粒子ライブラリーは、ランダムポリペプチドリ
ガンド部分をクローニングし、それらをポックスウイル
ス表面に正しい折り畳まれ方で発現するように設計され
る。ここで用いるように、「ライブラリー」の用語は、
約10〜数10億までの、少数から多数の異なるリガンド部
分を表面に提示するポックスウイルス粒子のコレクショ
ンを意味する。好ましくは、リガンド部分は抗体又はペ
プチドの単鎖断片である。ウイルス表面にリガンドの多
様な集団を発現するポックスウイルス粒子ライブラリー
が、ファージ展示ライブラリー(WO97/10507)又はワクシ
ニア直接連結ベクター(Merchlinsky et al., 1997, Vir
ol 238, 444-451)に記載したようにして製造できる。あ
るいは、発現ライブラリーからの核酸配列 (ゲノム断
片、選択した器官及び組織由来のcDNA) 又はペプチドモ
チーフを発現しているランダムライブラリーを用いても
よい。このようなライブラリーは文献に記載され、市販
されている(Invitrogene, USA 参照番号 K1125-01; Clo
ntech Laboratories Inc参照番号 NL4000AA)。
【０１０４】好ましくは、上記のように、ポリペプチド
リガンド部分をコードする核酸配列を、ポックスウイル
ス粒子の表面に天然に局在するタンパク質をコードする
適宜ポックスウイルス遺伝子にクローニングする。好ま
しい態様において、ポリペプチドリガンド部分を、IMV
又はEEV 表面ポリペプチドの１つとの融合タンパク質と
して発現させる。より好ましい態様では、ポリペプチド
リガンド部分を、IMV表面上に存在するp14 タンパク質
か又は、EEV 表面上に存在するB5R 遺伝子産物のＮ末端
に枠内で融合させる。
【０１０５】次いで、前記ポックスウイルス粒子ライブ
ラリーを、同定された抗リガンド分子、又は広く、この
抗リガンド分子を含む同定された化合物 (例、MUC1を発
現している腫瘍細胞) からなる固定化試薬と接触させて
おく。この接触は、ポックスウイルス粒子ライブラリー
の表面に存在するリガンド部分と、固定化された試薬中
に存在する同定抗リガンド分子との特異的結合を可能に
するのに十分な時間行う。特異的結合は、適当なpHと容
量オスモル濃度により向上させることができる。好まし
くは、ポックスウイルス粒子ライブラリーを、約６〜約
9.5 、より好ましくは約７〜約8.5 のpHを有する緩衝液
中におく。さらに各種方法が、非特異的結合を防止する
のに有用であり、例えば接触工程前に非特異的結合のブ
ロックに有用な任意の物質 (例、血清アルブミン、デキ
ストラン硫酸等) を用いて予備吸着工程を行うことによ
る方法がある。
【０１０６】非結合粒子を除去し、結合粒子を溶離させ
る。試薬の固定及び溶離条件は上記のように行う。固定
化試薬上に結合により保持されたライブラリーからのポ
ックスウイルス粒子を次に解析する。より詳しくは、こ
の解析は、分離されたポックスウイルス粒子のゲノム中
に挿入された核酸をコードするリガンド部分の配列決定
により行う。この方法の中で同定されたリガンド部分の
結合特異性は、(i) 標的細胞及び非標的細胞を用い、そ
して、実験の項に開示された方法に従い、このリガンド
部分を提示するポックスウイルス粒子の感染性を制御す
ることにより、又は(ii)本発明の試薬を調製し、それを
固体支持体に固定化し、そして、上記のように標的細胞
及び非標的細胞を解析する方法を実施することにより、
容易に確認できる。
【０１０７】これらの及びその他の態様は、本発明の記
載及び実施例に開示され、これらから明らかであり、ま
たこれに含まれる。本発明により用いられる方法、用途
及び化合物のいずれかに関する別の文献は、例えば電子
機器を用いて公開のライブラリーから引き出してもよ
い。例えば、公共のデータベース「Medline 」を用いて
もよく、これは、インターネットで利用でき、例えば、
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html.で
利用できる。さらに、http://www.ncbi.nlm.nih.gov, h
ttp://www.infobiogen.fr, http://www.fmi.ch/biology
/research tools.html, http://www.tigr.org のような
データベースやアドレスも当業者に知られており、また
http://www.lycos.com.を用いても得られる。バイテク
ノロジーにおける特許情報の全体、及び過去の検索及び
現在の事情を知るのに有用な関連の特許情報源の調査
は、Berks, TIBTECH 12 (1994), 352-364 に示されてい
る。
【０１０８】本発明はまた、本発明のポックスウイルス
粒子と野生型ポックスウイルス粒子の両方を含むウイル
ス調製物から本発明のポックスウイルス粒子を精製する
方法にも関し、このウイルス調製物を、異種リガンド部
分を結合しうる抗リガンド分子で被覆した固体支持体に
結合する工程、このポックスウイルス粒子を回収する工
程を含む。好ましくは、結合工程は、表面プラズモン共
鳴により行い、より好ましくはBIAcore X TMバイオセン
サーシステム(BIAcore AB 、スウェーデン、ウプサラ)
を製造者の指示に従って用いて行う。好ましい態様で
は、アミン結合キット(BIAcore AB 、Uppsala 、スウェ
ーデン) を用いたアミン結合により、ストレプトアビジ
ンをSAセンサーチップの固体支持体に共有結合させる。
次に、ビオチニル化抗リガンド分子を、ストレプトアビ
ジンで被覆されたSAセンサーチップ上にフローセル(flo
w cell) 内で固定化する。フローセル１は参照として働
く。本発明の流体相ポックスウイルス粒子の結合を１×
104 〜１×1010 pfu/ml の範囲にわたり測定した。注入
量は５〜100 μl であり、流速は２〜10μl/mlである。
特異的標的化粒子の回収のために表面をNaOH(2〜50mM)
で再生させる。好ましくは、固体支持体はデキストラン
支持体である。好ましくは抗リガンド分子はMUC-1 由来
ペプチドであり、特にMUC-1 の３縦列反復を提示する60
マ−である。
【０１０９】本発明の方法はさらに、許容細胞にこの回
収ポックスウイルス粒子を感染させる工程を含む。この
工程は標準技術により行う。好ましくは、感染工程はED
TA(0.1〜10mMであり、１mMが好ましい) の存在下で行
う。
【０１１０】上記で引用した特許、刊行物およびデータ
ベースの開示は、各特許、刊行物またはエントリーが参
照として援用されるように具体的にかつ個別に指示され
ている限り、すべて具体的に、その全体を参照として本
明細書に援用する。
【０１１１】以下の実施例は本発明を説明するためのも
のである。
【０１１２】
【実施例】以下に記載の構築は、Maniatis等 (1989, La
boratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pre
ss, Cold Spring Harbor NY)に詳しく説明されている一
般的遺伝子操作及び分子クローニング手法により、又は
市販のキットを用いる場合には製造者の推奨に従い、行
われる。PCR 増幅技術は当業者に知られている (例え
ば、PCR プロトコル−方法及び応用への指針、1990, In
nis, Gelfand, Sninsky 及びWhite, Academic Press 発
行、参照) 。
【０１１３】組換えM13 バクテリオファージを寒天系最
小培地又は液体の多いLBM 培地中でE. coli NM522 株
(Strategene) 上で増殖させる。アンピシリン耐性遺伝
子を有する組換えプラスミドを、抗生物質を100 μg/ml
添加した寒天又は液体培地で,E. coli C600 (Stratagen
e) 、BJ5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557
-580)及びNM522 株中で複製させる。クローニングを相
同的組換え(Bubek et al., 1993, Nucleic acid Res. 2
1, 3601-3602) によって行う場合はBJ5183株を用いるの
が好ましい。
【０１１４】組換えワクシニアウイルスの構築は、上で
引用した文献及びMackett 等(1982,Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 79, 7415-7419)及びMackett 等 (1984, J. Vi
rol. 49, 857-864)における当分野の慣用的手法により
行われる。E. coli の選択遺伝子gpt(キサンチングアニ
ンホスホリボシルトランスフェラーゼ)(Falkner andMos
s, 1988, J. Virol. 62, 1849-1854)を、組換えワクシ
ニアウイルスの選択を容易にするために用いる。
【０１１５】実施例１：MUC1陽性細胞を標的化するMVA
の構築 ２つの異なる構築物を操作した：MVATG14519は、SM３モ
ノクローナル抗体のscFv鎖がMVA 138L ORF (p14-KDa)の
Ｎ末端にその天然の形態で融合しているキメラp14 タン
パク質を発現するMUC-1陽性腫瘍細胞を標的化するよう
に操作されたMVA ベクターである。
【０１１６】MVATG14552 (図２) は、MUC-1 陽性腫瘍細
胞を標的化するように操作されたMVA ベクターであり、
SM３モノクローナル抗体のscFv鎖のＮ末端に融合したヒ
トトランスゴルジ網糖タンパク質TGN51(Kain et al., 1
997, J. Biol. Chem 273, 981-988 により記載された配
列) のシグナルペプチドの存在を除いて、MVATG14519に
類似している。
【０１１７】Ａ. MVA138L 遺伝子改変scFv配列の挿入の
ためのクローニングベクターはPCR に基づく方策を用い
て組立てられている。MVA138L 遺伝子の3'末端及び3'フ
ランキング領域を、プライマーOTG12340 (配列番号１)
及びOTG12343 (配列番号２) を用いて増幅し、断片Ｃを
作成する。初期−後期プロモーターpH5R (Goevel et a
l., 1990, Virol 179,247-266, 517-563) の制御下にお
かれたE. coli gpt をコードする選択マーカー発現カセ
ットをpH5R-GPT (FR 98 13279) (以降pTG9996 と称す
る) などの従来のプラスミドDNA から、プライマーOTG1
2342 (配列番号３) 及びOTG12341 (配列番号４) を用い
てPCR により分離し、断片Ｅを得る。断片ＣとＥの融合
を、両断片とプライマーOTG12340及び12342 (断片Ｆ)
を混合することによりPCR によって行う。
【０１１８】scFvを天然のp14-kDa と融合させ断片Ａを
生成させ、次いでこれをM13TG6131のEcoRI とHindIII
部位間でクローニングし (WO99/03885の実施例７) 、M1
3TG14025を生じさせる場合は、MVA138L の上流領域を縦
列プライマーOTG12338 (配列番号５) 及びOTG12359 (配
列番号６) を用いて増幅する。scFvをそのＮ末端でトラ
ンスゴルジ網糖タンパク質TGN51 転座シグナルに融合さ
せる場合は、増幅をプライマーOTG12338 (配列番号５)
及びOTG12346 (配列番号７) を用いて行う。得られた断
片 (断片Asp)を、M13TG6131 のEcoRI とHindIII 部位間
にクローニングし、M13TG14027を得る。両構築物はMVA1
38Ｌコーディング配列の上流にユニークHindIII 部位を
有する。
【０１１９】MVA138L とMVA138L の下流領域とを、プラ
イマーOTG12380 (配列番号８) 及びOTG12339 (配列番号
９) を用いて増幅する。得られた断片 (断片Ｄ) をM13T
G6131 のEcoRI とHindIII 部位の間でクローニングし、
M13TG14026を得る。断片A/D又はAsp/D をHindIII とEco
RI での消化により分離し、ベクターpTG1E (WO99/03885
の実施例２) のEcoRI 部位に挿入して、pTG14359 (A/D
断片を含有) 及びpTG14359 (Asp/D 断片を含有) をそ
れぞれ生じる。次いで断片ＦをPacI部位で、pTG14359ま
たはpTG14358のいずれかの中に挿入する。最終の構築物
をpTG14366及びpTG14365と称する。
【０１２０】Ｂ. SM3 scFvの分離SM3 ハイブリドーマは
Burschell 等 (1987, Cancer Res 47, 5476-5482) 、Gi
rling 等 (1989, Int J Cancer 43, 1072-1076) 及びDo
kurno 等 (1998, J. Mol. Biol. 284, 713-728) により
報告されている。MUC-1 腫瘍関連形態上で認識されるエ
ピトープはP-D-T-R-P である。SM3 scFvは、SM3 抗体軽
鎖 (GeneBank、受託番号AF042143) の可変領域が後に続
く10残基のスペーサーに連結した、SM3 抗体重鎖 (Gene
Bank、受託番号AF042142) の可変領域を含む。各可変領
域は、pMAL-SM3のような従来のプラスミドから、例え
ば、pTG14366のHindIII 部位内へのSM3-scFv配列の挿入
には、縦列プライマーOTG12360 (配列番号10) 及びOTG1
2361 (配列番号11) を用いて、又は、pTG14365のHindII
I 部位内へのSM3-scFv配列の挿入には縦列プライマーOT
G12344 (配列番号12) 及びOTG12361 (配列番号11) を用
いてPCR により分離することができる。得られる構築物
はpTG14519及びpTG14552(図２) と称する。
【０１２１】Ｃ. MVA 感染性粒子の分離MVA のサブクロ
ーンはStickl等 (1974, Deutsch Med Wochenschr 99, 2
386-2392;Mayr et al., 1978, Zentralbl Bakteriol 16
7, 375-390) の記載のように粗製材料からGMP 条件で分
離されている。このサブクローンはMVATGN33.1と称され
る。この親MVA は通常通りCEF 上で増殖させ、力価決定
する。
【０１２２】CEF は、予じめ湿気のある雰囲気中37℃に
おいて11日間培養しておいた受精卵から得た鶏胚から調
製する。鶏胚を小片に切断し、トリプシンの2.5 ％ (w/
v)溶液で処理する。次いでCEF を、10％ウシ血清加イー
グル系培地 (MBE)／トリプトース (Gibco BRL)中 1.5×
106 細胞／シャーレの細胞密度でFalcon 3001 プラスチ
ックシャーレに入れる。48時間後、単層細胞に、細胞上
にウイルスを吸着させるために、PBS + 陽イオン (酢酸
マグネシウム及びCaCl2 をそれぞれ１mg/ml)＋１％ウシ
血清中で30分間MVATGN33.1を感染させる。感染細胞を次
いで、37℃５％CO2 でMBE ＋５％ウシ血清中で１時間培
養する。次いで、１〜5gのプラスミド (pTG14519又はpT
G14552) をヘペス及びCaCl2 の溶液中で析出させる。析
出DNA を感染細胞単層上に置き、37℃、５％CO2 で２時
間インキュベートする。プラスミド移行を容易にするた
めに、グリセロール衝撃を１分間行うことができる。こ
の目的には、グリセロールのMBE/トリプトース中の10％
溶液を、１分間細胞単層上に置く。次に単層をPBS ＋陽
イオンで洗浄し、37℃５％CO2 でMBE ＋５％ウシ血清中
でインキュベートする。48時間後シャーレを凍結する。
【０１２３】組換えプラークの分離を次のように行う。
シャーレを解凍し、感染細胞を回収し、MBE/ウシ血清内
で超音波処理する。次に組換えウイルスを、Falkner 及
びMoss (1988, J. Virol. 62, 1849-1854)に既報のよう
に、250 μg/mlキサンチン、15μg/mlヒポキサンチン及
び25μg/mlミコフェノール酸の存在下で選択マーカーの
圧力下でCEF 中でのプラーク精製の連続回により分離す
る。
【０１２４】ストック (ウイルス種) を、MVA を感染さ
せた108 CEF を含むF175フラスコ中で調製することがで
きる。ウイルスを48〜72時間増殖させる。感染細胞及び
培地をプールし、懸濁液を超音波処理する。粗抽出物を
まず、36％ショ糖のクッション上で分画する。ウイルス
ペレットを次いで、Joklik (1962, Virology 18, 9-18)
に記載のようにして不連続ショ糖勾配上で分画する。
【０１２５】実施例２：FCU-1 を発現し、MUC1陽性細胞
を標的化する組換えMVA の構築 DNA プラスミドpTG13046(WO99/54481 においてpCI-neo
FCU1と称される) のHindIII/KpnI消化によりFCU-1 遺伝
子を分離した。pTG6019 (WO99/03885 の実施例２) と称
される欠失III のフランキング領域への相同配列を含む
導入ベクターを次のようにして改変した。初期後期pH5R
ワクシニアウイルスプロモーターの制御下におかれE. c
oli gpt をコードする発現カセットをSacI消化によりDN
A プラスミドpTG9996 から分離した。このDNA 断片を次
に、DNA プラスミドpTG6019 のSacI部位内に挿入して、
pTG14033を生じる。合成初期後プロモーターp11K75 (配
列番号13) を、プライマーOTG12271 (配列番号14) とOT
G12272 (配列番号15) を用いて鋳型Ｍ13TG4052からPCR
により分離する。M13TG4052 はM13TG130 (Kieny etal.,
1983, Gene 26, 91-99) に基づいている。プロモータ
ー11K7.5は、5'から3'方向に、転写開始部位のヌクレオ
チド＋４までの後期プロモーター11K の配列(Geobel et
al., 1990,前出) を−18位にＡの代わりにＣを有する
ヌクレオチド−28〜−13からのTKプロモーター配列、及
び初期7.5Kプロモーターのヌクレオチド−12〜＋６間の
領域を含有する。
【０１２６】増幅断片を、pTG14033のBamHI 部位内に挿
入する前にBamHI 及びBg1II 制限酵素で消化して、pTG1
4084を得る。FCU-1 遺伝子を、次のようにして相同的組
換えによりp11K75プロモーター下流にクローニングす
る。まず、合成配列を、OTG12522 (配列番号16) 及びOT
G12523 (配列番号17) を用いてpTG14084のPstI及びBamH
I 部位間に挿入する。次にDNA プラスミドをXhoIで直鎖
とし、FCU-1 遺伝子との相同的組換えをE. coli 中で行
う。得られたDNA プラスミドをpTG14322と呼ぶ。
【０１２７】MVATG14552に感染し、pTG14322でトランス
フェクトしたCEF における相同的組換えにより、自殺遺
伝子FCU-1 を発現するMUC1標的化MVA が得られる結果と
なる。
【０１２８】実施例３：F13LE がノックアウトされたMV
A の産生 5' F13L フランキング領域を、縦列プライマーOTG13192
(配列番号18) 及びOTG13194 (配列番号19) を用いて標
準PCR 法によりMVATGN33ウイルスDNA より分離し、pBS
(Stratagene) (pTG14746) のBamHI とEcoRI 部位間に挿
入する。3' F13L フランキング領域を、縦列プライマー
OTG13190 (配列番号20) 及びOTG13191 (配列番号21) を
用いて標準PCR 法によりMVATGN33ウイルスDNA より分離
し、M13TG6131 のBamHI とEcoRI 部位間に挿入し、M13T
G14101を得る。次に、5'及び3' F13L フランキング領域
をpTG1E のEcoRI 部位にクローニングする。得られる構
築物をpTG14783と称する。
【０１２９】実施例４：MUC-1 抗原を発現するプロデュ
サー細胞系の作製 上述のように、p14-kDa タンパク質にSM3 scFvリガンド
部分を挿入すると、ウイルス産生に影響を与えるかもし
れない (ウイルス収量が減少) 。従って、野生型MVATGN
33.1の混入を減らすために、実施例１の標的化MVA は好
ましくは、ウイルス表面に存在するSM3 抗体により認識
されるMUC-1 抗原を細胞表面に提示する細胞系上で分離
して増殖させる。
【０１３０】膜固定形態のMUC-1 抗原をコードするcDNA
を、Bg1II 及びEcoRI 制限酵素による２重消化によりpP
OLYII-ETAtm (Hareuveni et al., 1990, Eur. J. Bioch
em 189, 475-486)より分離し、CMV プロモーター下流で
pcDNA3発現ベクター (InVitrogen、米国) のBamHI 及び
EcoRI 部位間に挿入する。得られるプラスミドをpTG507
7 と称する。
【０１３１】１×106 BHK-21 (ATCC CCL-10)細胞に、５
μg のpTG5077 をトランスフェクトし、次いで20g/l の
ゲンタマイシン(Gentamycin)と10％ウシ胎児血清を含む
GMEM(グラスゴー修飾イーグル培地、Gibco BRL)におい
て培養する。５％CO2 雰囲気中37℃で24時間後に、１mg
/ml のG418 (Gibco BRL)を添加する。次に、限定希釈に
よりネオマイシン耐性クローンを分離し、H23 モノクロ
ーナル抗体 (Tsarfatyet al., 1989, Breast cancer im
munodiagnosis and Immunotherapy所載, Ceriani 編, P
lenum NY)を用いて細胞表面におけるMUC-1 発現につい
てFACSにより試験する。興味深いことに、MUC-1 陽性ク
ローンのほとんどは、親のBHK-21細胞系の可塑的接着能
を失い、懸濁液中で増殖し始める。この知見は、本発明
の組換えウイルスをバイオリアクター中での増殖と薬剤
産生を容易にするだろう。
【０１３２】実施例５：標的化性能の評価 実施例１のMVATG14552のクローンを、上記のようにキサ
ンチン、ヒポキサンチン及びミコフェノール酸の存在下
の選択的条件下でCEF におけるプラーク精製を連続反復
して分離する。
【０１３３】まず、一定数のクローンを、PCR により解
析して、TG51/SM3scFv/p14KDa 融合タンパク質をコード
するキメラ遺伝子のウイルスゲノム中の存在を検出す
る。９つのクローンを選択し、さらにウエスタンブロッ
トにより解析し、ポックスウイルス粒子の表面の融合タ
ンパク質の発現を確認する。感染細胞又は上清から得た
粗抽出物中のp14-KDa 特異的ウサギポリクローナル血清
で免疫ブロッティングすることによりECL キット(Amers
han)を用いて検出を行う。精製p14-KDa タンパク質を対
照として用いる。クローンC5を除いて、選択したクロー
ンはすべて、46kDa の分子量を有するキメラ融合タンパ
ク質を発現している。予想したように、標識の強さは、
培養上清中よりも粗抽出物における方が強く、ポックス
ウイルス粒子の細胞内の状況を反映している。これらの
結果は、TG51/SM3scFv/p14-KDa融合タンパク質をその表
面に提示しているポックスウイルスのほとんどがIMV 粒
子であることを示している。培養上清中の融合タンパク
質の少量の検出は、EEV エンベロープの破壊かまたはク
ローン調製中の細胞溶解により説明できる。
【０１３４】次に、MVATG14552の感染特性を異なる細胞
系で検討した：−ネズミ肥満細胞腫P815 (ATCC CRL644
8) 、−親P815細胞に膜固定形態のMUC-1 抗原を発現す
るベクターでトランスフェクションすることにより得ら
れる、MUC-1 抗原を発現するP815 (P815-MUC1)、−BHK
21 (仔ハムスター腎臓) 、−親BHK 21細胞に, 膜固定系
形態のMUC1抗原を発現するベクターでトランスフェクシ
ョンすることにより得られる、MUC-1 抗原を発現するBH
K 21 (BHK 21-MUC1)。
【０１３５】細胞に、MVATG14552クローン９又は対照ウ
イルス (MVAN33) を約0.1 のMOI で24時間感染させる。
感染効率は、希釈率1/100 でのMVA 免疫の後に得られる
ポリクローナルネズミ血清とインキュベート後にフロー
サイトメトリー (FACS) により測定する。モノクローナ
ルFITCヤギ抗マウスIgG (Pharmingen 、10μg/ml) でイ
ンキュベートすることにより顕示を行う。図３Ａに示す
ように、MVATG14552は、親細胞P815及びBHK-21に比べ
て、MUC-1 発現細胞の方に感染しやすい。これに対し、
対照MVA はMUC-1 発現及び非発現細胞の両方に同じ程度
の効率で感染する(図３Ｂ) 。
【０１３６】総合すると、これらの結果は、リガンド部
分SM3 scFvはポックスウイルス (IMV)粒子の表面におい
て発現すること、及び、これはその標的 (MUC-1 抗原)
を認識して、それに結合することができ、改変ウイルス
によりこの細胞の特異的感染が生じることを示してい
る。
【０１３７】MUC-1 60マーペプチドと、２つのSM3 scFv
発現クローン (A3及びA9) との間の相互作用を、BIAcor
e XTM バイオセンサーシステム (BIAcore AB, スウェー
デン、ウプサラ) を用いて表面プラズモン共鳴 (SPR)に
より調べた。すべての実験は25℃で行った。ステプトア
ビジンを、アミン結合キット (BIAcore AB, スウェーデ
ン、ウプサラ) を用いたアミン結合により、SAセンサー
チップのカルボキシル化デキストランマトリックスに共
有結合させた。次に、MUC-1 の３つの縦列反復を提示し
ているビオチニル化60マーペプチド(10 μg/ml、HBSS緩
衝液中) をステプトアビジンで被覆されたSAセンサーチ
ップ上のフローセル２内で固定化した。フローセル１は
参照として用いた。流体相組換えSM3 の結合を陽性対照
として用いた。流体相組換えウイルスの結合は、HBSS緩
衝液中１×106 〜１×108 pfu/mlの範囲にわたって測定
した。この目的のために、初代ニワトリ繊維芽細胞に、
ウイルス懸濁液を１のMOI で24時間感染させた。注入量
は15μl で、流速は５μl/分であった。表面を10mM NaO
H で再生した。速度解析をBIAevaluation 3.0 ソフトウ
エアを用いて行った。組換えウイルスと60マーMUC-1 ペ
プチド間の特異的かつ再現性ある相互作用が見られた。
測定値はウイルス濃度と相関することが見出された。対
照MVA(MVAN33) の同じペプチドへの結合は全く見られな
かった。
【０１３８】これらの結果は、SM3 scFv/p14融合タンパ
ク質がMVA 粒子と会合すること、及び組換えウイルスが
MUC-1 由来ペプチドを特異的に認識することを実証して
いる。
【０１３９】実施例６：SM3 scFv発現ウイルス粒子の精
製 組換え体から非組換え野生型ウイルス粒子を分離するた
めに、選択プロトコルを、MUC-1 ペプチドを結合する能
力に基づいて組換えSM3 scFv発現ウイルス粒子を精製す
るようにBIAcore の技術により行った。クローンA3から
作製したウイルス調製物を上記のようにしてBIAcore X
システムに注入した。60マーMUC-1 ペプチドに高い親和
性を示すウイルスを、BIAcore X Instrument Handbook
に記載のように、20mM NaOH を用いて再生段階中に表面
で回収した。次いで、回収したウイルスを許容細胞に、
ウイルス凝集体の形成を避けるためにEDTA (1mM)の存在
下で感染させ、組換えウイルスをGUS/GPT の二重選択に
より選択した。野生型非組換えウイルスの不在は、PCR
により分離クローン中で評価した。この新規な精製及び
選択プロトコルにより、野生型ウイルスの混入のない複
数のクローンを得ることができた。
【０１４０】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TRANSGENE S.A. <120> Poxvirus with targeted infection specificity <130> D18836 <150> EP 00 44 0109 <151> 2000-04-14 <150> EP 01 44 0009 <151> 2001-01-22 <150> US 60/246 080 <151> 2000-11-07 <160> 21 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer to amplify the MVA 138L gene and flanking region <400> 1 cagactggac ggcgtccata tgag 24 <210> 2 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> gene <222> Complement((1)..(61)) <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisens PCR primer to amplify the 3' end of MVA 138L gene and 3' flanking region <400> 2 cattttttaa gtatagaata aaagatcccg ggagtaccat cgtgattctt accagatatt 60 a 61 <210> 3 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer to amplify E. coli gpt gene and H5R promoter <220> <221> gene <222> (1)..(61) <400> 3 taatatctgg taagaatcac gatggtactc ccgggatctt ttattctata cttaaaaaat 60 g 61 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense PCR primer to amplify E. coli GPT gene and pH5R promoter <400> 4 ggggttaatt aaggaagtta aaaagaacaa cgccc 35 <210> 5 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer to amplify the upstream region of MVA 138L gene. <400> 5 gggggaattc gagcttatag cgtttagttc aggtacgg 38 <210> 6 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense PCR primer to amplify the upstream region of the MVA 138L gene <400> 6 ggggaagctt ttaaagtaca gattttagaa actgacactc tgcg 44 <210> 7 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:antisense primer to amplify the upstream region of the MVA 138L gene <400> 7 ggggaagctt caagagcggc acggctcccg ccgctgcgac gttcaggagg accaaggcaa 60 ccacgaac 68 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer to amplify the MVA 138L gene and its downstream region <400> 8 ggggaagctt atggacggaa ctcttttccc c 31 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense PCR primer to amplify the MVA 138L gene and its downstream region <400> 9 gggggaattc gcttatcgtt atcgggttta gcttctg 37 <210> 10 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer to amplify SM3 scFv sequence <400> 10 cgcagagtgt cagtttctaa aatctgtact ttaaatggtg cagctgcagg agtctggagg 60 aggcttgg 68 <210> 11 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense PCR primer to amplify the SM3 scFv sequence <400> 11 gatcgtcatc tccggggaaa agagttccgt ccatcagttt ggttcctcca ccgaacac 58 <210> 12 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer to amplify the SM3 scFv sequence <400> 12 cctgaacgtc gcagcggcgg gagccgtgcc gctcttggtg cagctgcagg agtctgg 57 <210> 13 <211> 111 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: sequence of the synthetic p11k7.5 promoter <400> 13 ataaaaatat agtagaattt catttgtttt tttctatgct ataaatagga tccgataaag 60 tgaaaaataa ttctaattta ttgcacggta aggaagtaga atcataaaga a 111 <210> 14 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer to amplify the p11k7.5 promoter <400> 14 gggggatccc ccgggctgca gaagcttttc tttatgattc tacttcctta ccg 53 <210> 15 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense PCR primer to amplify the p11k7.5 promoter <400> 15 ggggggagat ctaagcttgt cgacataaaa atatagtaga atttcatttg 50 <210> 16 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic sequence <400> 16 gatggtgaca gggggaatgg caagcaagtg ggatctcgag ttgggtgact ttggtgacag 60 atactactgt gtttaag 77 <210> 17 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: synthetic sequence <400> 17 gatccttaaa cacagtagta tctgtcacca aagtcaccca actcgagatc ccacttgctt 60 gccattcccc ctgtcaccat ctgca 85 <210> 18 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:PCR primer to amplify the 5' F13L flanking region of MVA <400> 18 gagaggatcc gggtatctag ccacagtaaa tc 32 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Description of Artificial Sequence :antisense PCR primer to amplify the 5' F13L flanking region of MVA <400> 19 tttcgaattc ggaatctgta ttctcaatac cg 32 <210> 20 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: PCR primer to amplify the 3' F13L flanking region of MVA <400> 20 atctgaattc gtggagatga tgatagttta agc 33 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: antisense PCR primer to amplify the 3' F13L flanking region of MVA <400> 21 aacaggatcc cttatacatc ctgttctatc aacg 34
【図面の簡単な説明】
【図１】ポックスウイルス粒子の構造を説明する図であ
る。IMV エンベロープは細線で表され、その表面にD8L
遺伝子産物および、p21-kDタンパク質 (p21)とp14-kDタ
ンパク質 (p21)との複合体を提示している。EEV エンベ
ロープは太線で表されその表面にA34R、HAおよびB5R 遺
伝子産物を提示している。
【図２】プラスミドpTG14552を図式的に示した図であ
る。
【図３】MVATG14552(A) または対照 MVAN33(B)による、
P815、MUC-1 発現P815 (P815-MUC-1) 、BHK-21およびMU
C-1 発現BHK-21 (BHK-21-MUC-1) の感染後のフローサイ
トメトリー解析を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 37/00 35/00 43/00 １１１ 37/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 43/00 １１１ 7/02 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:93 7/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｒ 1:93） (Ｃ１２Ｎ 7/02 Ｃ１２Ｒ 1:93） (72)発明者 ステファン・ポール フランス国、67000ストラスブール、リュ ー・デュ・ビョー・マルシェ・オ・ポワソ ン、７ (72)発明者 ミッシェル・ジェスト フランス国、67380ランゴルシェイム、リ ュー・マルスラン・ベルテロット、16 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA43 BA80 CA04 CA07 DA02 EA02 GA11 4B065 AA87Y AA95X AB01 AC20 BD14 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 BA44 CA01 CA53 CA56 DA01 DA27 DA41 NA13 NA14 ZB01 ZB07 ZB11 ZB26 ZC35 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 MA02 NA13 NA14 ZB01 ZB07 ZB11 ZB26 ZC35

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 標的細胞への標的化感染特異性を有する
    ポックスウイルス粒子であり、ここで、該粒子は該標的
    細胞に優先的に感染し、この特異性は、該ポックスウイ
    ルス粒子の表面に局在し、かつ該標的細胞の表面に局在
    する抗リガンド分子に結合し得る少なくとも１つの異種
    リガンド部分により付与される (ただし、ポックスウイ
    ルス粒子がEEV ワクシニアウイルス粒子である場合に
    は、該リガンドはErbB-2に対する抗体ではない) ことを
    特徴とするポックスウイルス粒子。
  2. 【請求項２】 前記ポックスウイルス粒子が、ワクシニ
    アウイルス、カナリアポックス、ニワトリポックス (鶏
    痘) 、ウシポックス、昆虫ポックス、サルポックス、ブ
    タポックス又はペンギンポックス粒子である請求項１記
    載のポックスウイルス粒子。
  3. 【請求項３】 前記ワクシニアウイルスが、コペンハー
    ゲン、ワイエス(Wyeth) およびアンカラ改変 (MVA)株よ
    りなる群から選択される請求項１または２記載のポック
    スウイルス粒子。
  4. 【請求項４】 前記ポックスウイルス粒子がIMV である
    請求項１〜３のいずれかに記載のポックスウイルス粒
    子。
  5. 【請求項５】 前記標的細胞が腫瘍細胞であり、前記異
    種リガンド部分が腫瘍特異的抗原、該腫瘍細胞で特異的
    にまたは過剰に発現する細胞タンパク質、またはガン関
    連ウイルスの遺伝子産物に結合しうる、請求項１〜４の
    いずれかに記載のポックスウイルス粒子。
  6. 【請求項６】 前記異種リガンド部分が、MUC-1 抗原を
    認識し結合しうる抗体の断片である、請求項１〜５のい
    ずれかに記載のポックスウイルス粒子。
  7. 【請求項７】 前記異種リガンド部分が、SM3 モノクロ
    ーナル抗体のscFv断片である、請求項６記載のポックス
    ウイルス粒子。
  8. 【請求項８】 前記異種リガンド部分がポリペプチドで
    あり、これが該異種リガンド部分およびポックスウイル
    スポリペプチドを含むキメラタンパク質の一部である、
    請求項１記載のポックスウイルス粒子。
  9. 【請求項９】 前記ポックスウイルス粒子がIMV であ
    り、前記ポックスウイルスポリペプチドがA27L、L1R 、
    A14L、A17L、D8L およびH3L 遺伝子の発現産物よりなる
    群から選択される、請求項８記載のポックスウイルス粒
    子。
  10. 【請求項10】 前記異種リガンド部分が、A27L遺伝子の
    発現産物のＮ末端に融合している、請求項８または９記
    載のポックスウイルス粒子。
  11. 【請求項11】 前記異種リガンド部分が、該ポックスウ
    イルス粒子のエンベロープへの挿入を容易にするシグナ
    ルペプチドを含有する、請求項１〜10のいずれかに記載
    のポックスウイルス粒子。
  12. 【請求項12】 前記シグナルペプチドがトランスゴルジ
    網における該異種リガンド部分の移動を可能にする、請
    求項11記載のポックスウイルス粒子。
  13. 【請求項13】 前記シグナルペプチドがヒトトランスゴ
    ルジ網の糖タンパク質TGN51 由来である請求項12記載の
    ポックスウイルス粒子。
  14. 【請求項14】 前記ポックスウイルス粒子が、関心ある
    核酸を少なくとも含んでいる、請求項１〜13のいずれか
    に記載のポックスウイルス粒子。
  15. 【請求項15】 前記関心ある核酸が自殺遺伝子である、
    請求項14記載のポックスウイルス粒子。
  16. 【請求項16】 (i) 請求項１および５〜８のいずれかに
    記載の少なくとも１つの異種リガンド部分、および(ii)
    ポックスウイルス粒子表面に天然に局在する同種ウイル
    スポリペプチドの全部もしくは一部、を含有するキメラ
    タンパク質をコードする少なくとも１つのヌクレオチド
    配列を含むベクター。
  17. 【請求項17】 前記同種ウイルスポリペプチドが請求項
    ９記載のものである、請求項16記載のベクター。
  18. 【請求項18】 請求項１〜15のいずれかに記載の少なく
    とも１つのポックスウイルス粒子、または請求項16もし
    くは17記載の少なくとも１つののベクターと、薬剤的に
    許容しうる賦型剤とを含有する組成物。
  19. 【請求項19】 請求項１〜15のいずれかに記載のポック
    スウイルス粒子の、遺伝子治療によるヒトまたは動物生
    体の治療に用いる薬剤の製造のための使用。
  20. 【請求項20】 請求項１〜15のいずれかに記載のポック
    スウイルス粒子を、該ポックスウイルス粒子と野生型ポ
    ックスウイルス粒子とを含むウイルス調製物から精製す
    る方法であり、異種リガンド部分に結合しうる抗リガン
    ド分子で被覆された固体支持体に該ウイルス調製物を結
    合させる工程および該ポックスウイルス粒子を回収する
    工程を含む、前記精製方法。
  21. 【請求項21】 前記結合工程をデキストラン支持体上で
    表面プラズモン共鳴により行う、請求項20記載の方法。
  22. 【請求項22】 さらに、前記回収したポックスウイルス
    粒子を許容細胞に感染させる工程を含む、請求項20また
    は21記載の方法。
  23. 【請求項23】 前記感染工程をEDTAの存在下で行う、請
    求項22記載の方法。
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