JPH08504098A

JPH08504098A - 抗体−エンベロープ融合蛋白を含有するレトロウィルスベクターを用いた細胞種特異的な遺伝子転移

Info

Publication number: JPH08504098A
Application number: JP6513271A
Authority: JP
Inventors: シードーンバーグ，ラルフ
Original assignee: ユニバーシティーオブメディスンアンドデンティストリーオブニュージャージー
Priority date: 1992-11-20
Filing date: 1993-11-18
Publication date: 1996-05-07
Also published as: EP0672129A4; WO1994012626A1; CA2149889A1; EP0672129A1; US6146885A

Abstract

(57)【要約】本発明は、レトロウィルスベクターのエンベロープ蛋白に融合された抗体の抗原結合部位を有するレトロウィルスベクターから成る標的細胞特異性を有するレトロウィルスベクター粒子に関し、ここで抗体の抗原結合部位は本来のウィルスレセプター結合部位に取って代わっている。

Description

【発明の詳細な説明】抗体−エンベロープ融合蛋白を含有するレトロウィルスベクターを用いた細胞種特異的な遺伝子転移発明の背景発明の技術分野本発明は、標的細胞特異性を有するレトロウィルスベクター粒子に関する。レトロウィルスベクター粒子は、レトロウィルスベクターのエンベロープ蛋白に融合された抗体の抗原結合部位を有するレトロウィルスベクターから成る。抗体の抗原結合部位は、本来のウィルスのレセプター結合部位に取って代わっている。本発明はまた、レトロウィルスベクター粒子を作製する方法ならびにレトロウィルスベクターを用いて脊椎動物細胞へ遺伝子を導入する方法に関する。背景の記載発明の背景を説明し、その実施に関する追補の詳細を提供ずるこの内容に関する開示は、参考文献としてここに組み入れられる。便宜のため、それらの開示は以下の本文において参照され、添付の文献目録にそれぞれ分類されている。レトロウィルスベクターは、脊椎動物の細胞に遺伝子を導入するための最も効率的な手段である。ヒトの遺伝子病（アデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ））を治療するレトロウィルスベクターを用いた臨床実験が行われている。先天性の代謝異常を矯正する以外に、遺伝子治療は癌や様々な他の疾病を治療するために臨床試験において試行されている（Science 1992，Vol．258，pp.744-746）。レトロウィルスベクターは、基本的にレトロウィルス粒子であって、ウィルス蛋白をコードする全ての配列が興味の対象の遺伝子に置換されているゲノムを含有している。その結果、そのようなウィルスは一回目の感染の後さらに複製することができない。レトロウィルスベクター粒子はヘルパー細胞（図１）によって産生される。このようなヘルパー細胞は株化細胞であって、複製に必要なすべてのレトロウィルス蛋白を発現するプラスミド構造を含有している。このようなヘルパー細胞へベクターのゲノムが形質移入された後、そのベクターのゲノムはウィルス粒子中へキャプシド形成される（特異的なキャブシド形成配列の存在による）。ウィルス粒子はヘルパー細胞から放出され、興味の対象の遺伝子のみを含有するゲノムを運搬する（図１）。最近１０年間で、ニワトリやネズミ由来の幾つものレトロウィルスベクター系が様々な遺伝子を発現させるために開発されてきた（Temin，1987、Gilboa，1990の評論参照）。レトロウィルスベクターには幾つかの制限がある。ウィルス粒子中にキャプシド形成され得るゲノムサイズの制限の他に、レトロウィルスベクターの適用における大きな制限因子は、ベクター粒子の宿主範囲が制限されていることである。レトロウィルスの中には一つの生物種の細胞にしか感染できない（同種志向性レトロウィルス）ものや、一つの生物種の一つの細胞種にしか感染できないもの（例えばＨＩＶ）さえ存在する。他のレトロウィルスは非常に広範な宿主範囲を有し、多くの異なる生物種の多くの異なる細胞種に感染することができる（アンホトロピックレトロウィルス）。レトロウィルス感染の初期段階は、ウィルスエンベロープ（env）の糖蛋白の特異的な細胞膜レセプターへの結合であるが、その性質については多くのレトロウィルスにおいて知られていない。しかしながら、ウィルスenv蛋白と細胞表面レセプターとの相互作用は非常に特異的であり、特定のウィルスについては細胞種特異性が決定されている（Weiss et al．1985）。すべての既知のレトロウィルスのエンベロープ蛋白は二つの関連するペプチドから構成されている（例えばＳＮＶにおけるgp70およびgp20(E)）。これらのペプチドはレトロウィルスenv遺伝子によってコードされる同じ前駆物質（gPR90env）の蛋白分解開裂により生成する。一方のペプチドp20(E)は、ＴＭとも呼ばれ、その蛋白をウィルスの膜に固着させ、そしてＨＩＶでみられるように、ウィルスと細胞膜との融合を媒介する。第二のペプチドgp70は、ＳＵとも呼ばれ、ウィルスのそのレセプターへの結合を媒介し、そしてそれ故に宿主範囲を決定する（Weiss et al.，1985；Varmus and Brown，1988）。図面の簡単な説明図１は、レトロウィルス蛋白を発現するヘルパー細胞を説明する図解である。Ａ）ヘルパー細胞は、感染性ウィルス粒子の形成に必要な全てのレトロウィルス蛋白を発現するプラスミドの形質移入によって作製される。Ｂ）レトロウィルスベクターの形質移入の後、ベクターＲＮＡゲノムはコア構造中へキャプシド形成される。Ｃ）プラスミドを含有するヘルパー細胞は、修飾エンベロープ遺伝子を発現する。図２は、脾臓壊死ウィルス（ＳＮＶ）の変異エンベロープ遺伝子を発現するプラスミドを説明する図解である。図３は、ハプテンＤＮＰに対する一本鎖抗体遺伝子（scFv）の配列を示す。発明の要約一つの実施例において、本発明は、レトロウィルスベクターのエンベロープ蛋白に融合された抗体の抗原結合部位を有するレトロウィルスベクターから成る標的細胞特異性を有するレトロウィルスベクター粒子に関係し、ここで抗体の抗原結合部位は本来のウィルスレセプター結合部位に取って代わっている。もう一つの実施例において、本発明は、レトロウィルスベクターを用いた遺伝子を脊椎動物細胞に導入するための細胞種特異的な方法に関係し、それは、レトロウィルスベクターのエンベロープ蛋白に融合する抗体の抗原結合部位を有するレトロウィルスベクターから成る標的細胞特異性を有するレトロウィルスベクター粒子を細胞に注入することから成り、ここで抗体の抗原結合部位は本来のウィルスレセプター結合部位に取って代わっている。さらにもう一つの実施例において、本発明は、レトロウィルスベクターのエンベロープ蛋白に融合する抗体の抗原結合部位を有するレトロウィルスベクターから成る標的細胞特異性を有するレトロウィルスベクター粒子を作製するための方法に関係し、ここで抗体の抗原結合部位は本来のウィルスレセプター結合部位に取って代わっている。その方法は、（ａ）一本鎖の抗体遺伝子を用意し、（ｂ）ウィルスのレセプター結合部位をコードするエンベロープ遺伝子の部分を、抗体遺伝子で置き換え、キメラエンベロープ遺伝子を形成し、（ｃ）真核遺伝子発現ベクター中のキメラエンベロープ遺伝子をクローニングし、そして、（ｄ）キメラエンベロープ発現プラスミド、レトロウィルスコア蛋白発現プラスミドおよび選択可能な標識遺伝子発現プラスミドを真核細胞中へ同時形質移入することから成る。発明の詳細な説明本発明は、標的細胞特異性を有するレトロウィルスベクター粒子に関する。レトロウィルスベクター粒子は、レトロウィルスベクターのエンベロープ蛋白に融合された抗体の抗原結合部位を有するレトロウィルスベクターから成る。抗体の抗原結合部位は、本来のウィルスのレセプター結合部位に取って代わっている。本発明はまた、レトロウィルスベクター粒子を作製する方法ならびにレトロウィルスベクターを用いて脊椎動物細胞へ遺伝子を導入する方法に関する。ベクター粒子の宿主範囲を変化させるために、レトロウィルスベクター粒子は、興味の対象である標的細胞に特異的なただ一つの細胞表面構造（レセプター）を認識する修飾されたエンベロープ蛋白を含有するように構築され得る。蛋白の特異的な構造を認識することが知られている蛋白は、抗体分子である。従って、レトロウィルスベクター粒子を興味の対象である細胞種に特異的であるようにさせるために、ウィルスのレセプター結合ペプチドが抗体分子の抗原結合部位と置き換えられ得る。そのような抗原結合部位を含有するベクター粒子が感染する能力を有するかどうかを調べるために、脾臓壊死ウィルス（ＳＮＶ）のエンベロープ遺伝子に融合されたハプテンジニトロフェノール（ＤＮＰ）に対する抗体の抗原結合ペプチドを用いたモデル系が開発された。抗ハプテン（抗ＤＮＰ）抗体の使用は多くの有利点を有する。（１）この抗原と抗体の相互作用がよく特徴づけられている（Davles and Metzger，1983）。（２）ハプテンは簡単に利用できる。（３）広範な種類の細胞（野生種のベクター粒子に感染し得ない）がこのハプテンと抱合させ得る。ＤＮＰ抱合細胞はこのハプテンに対する抗体を結合する。従って、ハプテンは、キメラベクター粒子に対するレセプターの（豊富な）存在を模倣し得る。（４）抗ハプテン抗体は頻繁に細胞に取り込まれる。従って、その場合、キメラエンベロープ蛋白の構築はＴＭの膜融合領域を破壊し、この特性はこの機能喪失を代償し得る。（５）in vitroの結合検定は、ウィルス粒子形成ならびにＤＮＰへのこのようなウィルスの結合を調べるために簡単に確立され得る。実施例材料及び方法抗体−エンベロープ融合遺伝子の構築脾臓壊死ウィルス（ＳＮＶ）のエンベロープ蛋白をコードする遺伝子は、抗体 −エンベロープ融合遺伝子の構築を可能にするための適当な制限酵素部位を含有していない。そのため、ＳＮＶenv遺伝子中で、異なる位置で制限酵素認識部位を作製するために点変異が（部位特異的突然変異誘発によって）導入された。この目的のために、ＳＮＶenv遺伝子（Hind III-Sal I断片）はpSelect（部位特異的突然変異誘発用に特に設計されたベクター）中にサブクローニングされた。平滑断端を生じる酵素のための制限部位は制限酵素が２つのコドン間を切断するような方法で導入された。この一貫した計略に従うと、解読枠を変化させることなく全ての変異体は、欠損、挿入、およびあらゆる組み合わせにおける融合を引き起こすために用いられ得る。さらに、制限酵素部位は疎水性および親水性部分をコードする領域の間に入れられた。ある部分の欠損がそれに続く部分の正しい折り畳み構造を障害しないものと仮定された。この仮定は、成長過程の多くの蛋白が、機能する領域のエキソンの移し替えによって生成されていくという知見に基づいている。作製された幾つかの変異エンベロープを図２に示した。pSNV-env-mC（図２ａ）は、疎水性および親水性ペプチド領域の間に位置する新しい制限酵素部位を含有している。この変異体において、ヌクレオチド配列の変化はアミノ酸配列を変化させていない。従って、pSNV-env-mCは陽性対照と見なされうる。 PSNV-env-mDはエンベロープ前駆体の開裂部位中に新しい制限酵素部位を含有する。この変異の導入はアミノ酸配列もまた変化させ、調べられた全てのレトロウィルスの全ての開裂部位で認められている共通の発動因子を破壊している。従って、結果得られたエンベロープ前駆体は開裂されず、そのため感染力のあるウィルス粒子が増殖しないことが予想された。変異env遺伝子は、真核遺伝子発現ベクターであるpHB3へ挿入された。ＤＮＰに対する抗体のＨ鎖ならびにＬ鎖をコードする遺伝子は、Dr．Ogawa（S crips Clinic，La Jolla，Ca）の御好意により提供を受けた。その遺伝子は、配列決定がなされ、公表されている（Riley et al.，1986）。記載（Whitlow and Filpula，1990）のようにＰＣＲ技術を用い、一本鎖抗体遺伝子はＤＮＰに対するシグナルペプチドを抱合するように構築された。ＰＣＲ産物は、pBluescript のSmaI部位にクローニングされた。ＤＮＡ配列決定により、様々な抗原結合領域をコードする２つの遺伝子断片が成功裏に組み合わされていたことが確認された。抗ＤＮＰscFv遺伝子の完全な配列を図３に示した。SacII（pBluescriptのポリリンカーに位置する）からSmaI（３’ＰＣＲプライマーに位置する）の断片は真核発現ベクターに挿入され、以下のようにエンベロープ遺伝子のアミノ末端部分を置換した。pTC4においては、SacII（env遺伝子のＡＴＧコドンの上流に位置する）からSmaIのenv断片が、scFv遺伝子で置換され、pTC5においては、SacIIから MscIのenv断片が、scFv遺伝子で置換された（それぞれ図２Ｃおよび図２Ｄ）。クローニングの後、抗体−エンベロープ連結物は配列決定され、キメラ遺伝子の正しい解読枠が維持されていることを確認した。 In vitro結合検定 in vitro結合検定は、以下の様式で実施された。ＤＮＰはＢＳＡに抱合された（ＤＮＰ−ＢＳＡはscFv遺伝子が由来する初期の抗体を上昇させるために使用した）。ＤＮＰ−ＢＳＡは、販売元（Sigma）が推奨する方法に従って活性化セファロースに結着された。抗ＤＮＰ抗体（Dr．S．Pestkaの御好意により提供を受けた）を用いたＥＬＩＳＡ検定によって、連結反応が成功していたことを確認した。100mlの組織培養上清を50mlのＤＮＰ−ＢＳＡ−セファロースと３０分間３７℃で孵置した。孵置後、セファロース粒子をQualitronミニ遠心機で３０秒間遠心分離してペレット化した。ペレットをＰＢＳで一度洗浄した。ＰＢＳを除去し、逆転写検定を反応系をセファロースに添加することにより実行した。逆転写検定は常法を用いて行った。32PdＴＴＰのｃＤＮＡへの組み込みは、記述（Schl eif and Wensink，1981）のようにＴＣＡ沈殿により定量した。抗体−エンベロープ融合蛋白を含有する粒子の感染力試験図２に示したエンベロープ発現プラスミドを、それぞれレトロウィルスコア蛋白を発現し、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子の発現を担うレトロウィルスベクターを含有するプラスミドであるpBR1とpJD214HY（図２）との同時形質移入により、Ｄ１７細胞（イヌ骨肉腫株化細胞）に形質移入した（図１もまた参照）。ハイグロマイシン耐性の細胞を選択した。ハイグロマイシン耐性で選択した後、融合性の培養細胞からをウィルスを回収し、感染力検定を実行した（以下参照）。感染した標的細胞はハイグロマイシン耐性で選択され（Ｄ１７細胞は60mg/mlのハイグロマイシンを含有する培養液で、ＣＨＯ細胞は250mg/ml のハイグロマイシンを含有する培養液で孵置した）。ハイグロマイシン耐性細胞のコロニーは、感染力のあるウィルス粒子を示している。感染力検定は、ＤＮＰ抱合した、或いはしない、Ｄ１７細胞とＣＨＯ細胞について実行した。ＤＮＰは次のように細胞に抱合した。ココジレート（cocodylate ）ナトリウム緩衝液（0.25M）中に1.4mg/mlのＤＮＢＳ（2，4，−ジニトロベンゼンスルホン酸二水和物；Kodak社製）を含有する溶液500mlに、３乃至５分間室温で細胞を孵置した。抱合反応は５mlの培養液を細胞に添加して停止させた。未抱合細胞の感染は、常法を用い、50mMポリブレンの存在下で実施した。ＤＮＰ抱合細胞の場合は、感染はポリブレン不在下で実施した。結果 In vitro結合検定 in vitro結合検定により、pSNV-env-mDが形質移入された細胞のみがＤＮＰに結合可能なキメラエンベロープを含有するウィルスベクター粒子を産生することが示された（表１も参照）。感染力試験感染力試験の結果を表１に要約した。野生種エンベロープ（pSNV -env-mC）を含有するベクター粒子は、組織培養上清液1mlあたり105コロニー形成単位の効率でＤ１７細胞に感染した。このウィルス粒子はまた、ＤＮＰを抱合するＤ１７細胞にも感染した。しかしながら、感染効率はＤＮＰを抱合していない細胞の1000分の1未満であった。このウィルス力価の低下は主として抗生物質によってＤＮＰ抱合細胞を選択することが困難であることによる。抱合反応は、細胞を薬剤に対して脆弱にし、抱合反応の後、９０％を超える細胞が２、３日の間に死滅した。野生種エンベロープを有するウィルス粒子は、ＣＨＯ細胞には感染しなかった。エンベロープ前駆体蛋白（SNV-env-mD）の開裂部位の変異は感染力を完全に失わせた。ＤＮＰ抱合していないＤ１７細胞においてただ一つのコロニーが認められた。この知見は、エンベロープ前駆体開裂位置の変異により非感染性ウィルス粒子が導かれるという先行する報告と合致するものである。pTC4（図２）で形質移入された細胞は、有意な効率でＤ１７またはＣＨＯ細胞に感染できるベクター粒子を産生しなかった。pTC5で形質移入された細胞は、Ｄ１７またはＣＨＯ細胞に感染できないベクター粒子を産生した。しかしながら、これらの粒子はＤＮＰを抱合した細胞に有意に感染した。論考抗体−エンベロープ融合蛋白を含有するレトロウィルス粒子について得られたデータは、これらの粒子が感染力を有していることを示した。驚くべきことに、ＳＵの中間でenvと融合されたscFv遺伝子を含有するTC4は、ＤＮＰに結合することができるウィルス粒子を産生しなかった。これは不安定なＳＵ−ＴＭ複合物によるものかも知れない。この仮説は、これらの粒子がＤＮＰ−ＢＳＡ−セファロースに結合できなかったという知見によって支持されている。Ｄ１７細胞に対するこれらの粒子の低い感染性は、ＴＭのみを含有するウィルス粒子の非特異的な吸着の結果かも知れない。非特異的に吸着された（ＳＵを欠損した）ウィルス粒子は、時折細胞に貫入するのかも知れない。 pTC5で形質移入した細胞は、機能的なレトロウィルスの膜融合領域を持たないキメラエンベロープを有するウィルス粒子を産生する。この仮定は、未開裂エンベロープ前駆体蛋白（SNV-env-mD）を含有するウィルス粒子が感染性でないという知見に基づいている。しかしながら、抗体分子の中には、細胞に結合した後未知の機構によって細胞に取り込まれるものがあることが知られている。データは、この取り込み機構がウィルス粒子の取り込みや、結果的に首尾よい感染の確立をもたらすのに充分であろうことを示している。遺伝子治療における抗体−エンベロープ融合蛋白を有するベクター粒子の適用これまでヒトの遺伝子治療の適用全てにおいて、興味の対象となる細胞は患者から分離され、他の細胞種から純化され、そして、ヘルパー細胞から回収されるレトロウィルスベクターとの組織培養で感染された。組織培養において処置された細胞が展開した後、細胞は患者に再注入された。使用されるレトロウィルスベクター粒子（アンホトロピックなネズミレトロウィルス由来）は広範な宿主範囲を有するので、細胞の感染はin vitroで行われなくてはならない。従って、患者の血流中に直接注入されたならば、これらのウィルス粒子はあらゆる種類の組織に感染するであろう。他の危険以上に、この処置は、遺伝子がその適した標的細胞に到達する機会が非常に少ないため非効率的である。この臨床的遺伝子治療の手順は、遺伝子治療が患者のために如何に有効で有益となるかについての見識を得るのに充分なものであろう。実際、臨床データは、大変前途有望であるようである（Eglitis，私信）。しかしながら、現在の臨床手順は非常に面倒で、時間がかかり、高価であり、そしてそのために一般的な臨床適用には向かないなものである。一般的な臨床適用のためには、遺伝子運搬媒介物を直接患者の体内に注入することが必要であろう。一つの特異的な細胞種にしか感染しないレトロウィルスベクター粒子の発達は、患者の血流中へのベクターの直接注入を可能にするであろう。抗体−エンベロープキメラを含有するベクター粒子の発達は、この目的のための第１歩であろうし、また、in vivoで可能な遺伝子治療適用の新しい領域を開くものであろう。ここにおいて用いられる用語「オリゴヌクレオチド」はプライマー、プローブ、検出されうるオリゴマー断片、オリゴマー対照、および未標識ブロッキングオリゴマーを言及する。オリゴヌクレオチドは２個以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから成る。ここにおいて用いられる用語「プライマー」はあるオリゴヌクレオチド、好適にはオリゴデオキシリボヌクレオチドを言及し、精製した制限酵素消化物のように天然に生ずるか、合成的に産生され、ある核酸鎖に相補的なプライマー伸展物の合成が誘導される条件、すなわちヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼのようなポリマー化物質、適当な温度やｐＨの存在、にさらされたときに合成開始点として機能することができる。プライマーはポリマー化物質の存在下で伸展物の合成を刺激するのに充分な長さを有していなくてはならない。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって核酸配列を複製したり検出したりする方法は、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、および第4,965,188号に詳しく記述されており、これらの開示はここに参照によって組み入れられる。図１はレトロウィルス蛋白を発現するヘルパー細胞を説明する図解である。Ａ）ヘルパー細胞は感染性ウィルス粒子を形成するのに必要な全てのレトロウィルス蛋白を発現するプラスミドの形質移入によって作製される。一つのプラスミドは全てのコア／蛋白を発現するように設計されている（gagおよびpolの発現）。他のプラスミドはエンベロープ前駆体／蛋白を発現するように設計されている。両方のプラスミド構造もウィルスの複製のためのレトロウィルスcis／作用配列（例えばキャプシド形成配列、プライマー結合部位など）を含有していない。ポリアデニル化が非／レトロウィルスポリアデニル化認識配列において生じる。Ｂ）レトロウィルスベクターの形質移入の後、ベクターのＲＮＡゲノムはコア構造中へキャプシド形成される。ヘルパー細胞は、興味の対象である遺伝子を有するベクターゲノムを含有しているだけのレトロウィルス粒子を産生する。ベクターは複製のための全てのcis／作用配列を含有している。従って、感染した標的細胞において、ベクターは逆転写され、そしてゲノムに統合される。ベクターゲノム中はレトロウィルス蛋白をコードする遺伝子が欠損しているため、ウィルス粒子は感染した標的細胞からは産生されない。Ｃ）プラスミドを含有するヘルパー細胞は修飾されたエンベロープ遺伝子を発現する。ヘルパー細胞は上記したものと非常に類似している。しかしながら、キメラのエンベロープ遺伝子は、エンベロープ遺伝子のカルボキシ末端と融合されるアミノ末端に、抗体の抗原結合領域を含有するように構築されている。これらの粒子は、キメラエンベロープ蛋白の抗体成分によって認識される抗原構造を含有する標的細胞にのみ結合し、感染するであろう。図２は、脾臓壊死ウィルス（ＳＮＶ）の変異エンベロープ遺伝子を発現するプラスミドを説明する図解である。遺伝子はラウス肉腫ウィルスプロモータ（ＲＳＶ/pro）から発現し、単純ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ/p oly(A)）のポリアデニル化シグナル内でポリアデニル化される。pBluescript のポリリンカーがプロモータとポリアデニル化配列との間に挿入され、このベクター中への遺伝子の簡単なクローニングを可能にする（ベクターに接するプラスミドの配列は示されていない）。ａ／ｂ）点変異は部位志向変異によってenv遺伝子中に誘発され、新しい制限酵素認識部位を生じる（^*で標示）。全ての酵素が、解読枠を変化させることなく容易な核酸連結に適した平滑断端を生じるように、２つのコドンの間で正確に切断した。ｃ／ｄ）抗原結合ペプチドを含有するキメラエンベロープがenvのカルボキシ末端に融合した。ｅ）レトロウィルスベクター、pJD214Hyはレトロウィルスベクター粒子による遺伝子の転移を調べる全ての研究において使用された。図３は、ハプテンＤＮＰに対する一本鎖の抗体遺伝子（scFv）の配列を示している。参考文献本出願の全体にわたって、様々な発行物を参照したが、これらの発行物における開示は、技術の状況をより完全に記述するために参考文献としてここに組み入れられる。このようにして記述された発明が、多くの方法によって変更可能であることは明らかであろう。このような変更は、本発明の精神ならびに範囲から逸脱したものではなく、そして全ての変更は特許請求の範囲内に包含されるよう意図されたものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4Ｂ

Claims

【特許請求の範囲】１．レトロウィルスベクターのエンベロープ蛋白に融合された抗体の抗原結合部位を有するレトロウィルスベクターから成り、前記抗体の抗原結合部位は本来のウィルスレセプター結合部位に取って代わっている、標的細胞特異性を有するレトロウィルスベクター粒子。２．レトロウィルスベクター粒子が牌臓壊死ウィルス（ＳＮＶ）である請求の範囲１記載のレトロウィルスベクター粒子。３．抗体がハブテンジニトロフェノールに対する一本鎖抗体（anti-DNP-scFv)である請求の範囲１記載のレトロウィルスベクター粒子。４．レトロウィルスベクターを用いて遺伝子を脊椎動物細胞に導入する細胞種特異的な方法であって、レトロウィルスベクターのエンベロープ蛋白に融合された抗体の抗原結合部位を有するレトロウィルスベクターから成り、抗体の抗原結合部位は本来のウィルスレセプター結合部位に取って代わっている、標的細胞特異性を有するレトロウィルスベクター粒子を細胞に投与する工程から成る、細胞種特異的な方法。５．レトロウィルスベクター粒子が牌臓壊死ウィルス（ＳＮＶ）である請求の範囲４記載の方法。６．抗体がハブテンジニトロフェノールに対する一本鎖抗体（anti-DNP-scFv)である請求の範囲４記載の方法。７．レトロウィルスベクターのエンベロープ蛋白に融合された抗体の抗原結合部位を有するレトロウィルスベクターから成り、抗体の抗原結合部位は本来のウィルスレセプター結合部位に取って代わっている、標的細胞特異性を有するレトロウィルスベクター粒子を製造する方法であって、（ａ）一本鎖抗体遺伝子を供給する工程と、（ｂ）ウィルスレセプター結合部位をコードするエンベロープ蛋白の一部を抗体遺伝子で置換し、キメラエンベロープエンベロープ遺伝子を形成する工程と、（ｃ）キメラエンベロープ遺伝子を真核遺伝子発現ベクター中でクローニングする工程と、（ｄ）キメラエンベロープ発現ブラスミドと、レトロウィルスコア蛋白発現ブラスミドと、選択可能な標識遺伝子発現遺伝子プラスミドとを真核細胞に同時形質移入する工程とから成る、レトロウィルスベクター粒子を作製する方法。８．レトロウィルスベクター粒子が牌臓壊死ウィルス（ＳＮＶ）である請求の範囲７記載の方法。９．抗体がハブデンジニトロフェノールに対する一本鎖抗体（anti-DNP-scFv ) である請求の範囲７記載の方法。