JPH11510050A

JPH11510050A - 標的遺伝子送達のための方法および手段

Info

Publication number: JPH11510050A
Application number: JP9507496A
Authority: JP
Inventors: ファレリオ、ドメニコ; ボーセヘム、フィクトルウィレムファン
Original assignee: イントロヘーネベスローテンフェンノートシャップ
Priority date: 1995-07-25
Filing date: 1996-07-25
Publication date: 1999-09-07
Also published as: US20010055586A1; US20060134123A1; EP0840797B1; EP0840797A1; AU727531B2; CA2224907A1; US7033834B2; AU6535096A; US6261554B1; US7781208B2; WO1997005266A1

Abstract

(57)【要約】本発明は標的指向コンジュゲートを用いることにより予備選択した細胞タイプに導入することができるウイルス性遺伝子送達ビヒクルを生産する方法を提供する。前記遺伝子送達ビヒクルは、１）（送達されるべき）関心のある遺伝子、２）特異的結合対のメンバーを保持するウイルスキャプシドまたはエンベロープ（前記メンバーの相手部分は標的細胞の表面に直接的に結合しない）からなる。これらのビヒクルは前記細胞上のそれらの天然のレセプターに結合できないようにできる。標的指向コンジュゲートは細胞のタイプに特異的なリガンド（またはその断片）である標的指向部に連結する特異的結合対の相手部分メンバーからなる。ウイルス性ビヒクル上に存在する特異的結合対のメンバーは、たとえばイムノグロブリン結合部（たとえば、Fcフラグメントに結合できるプロテインＡ、プロテインＧ、FcR、または抗−Ig抗体）、またはビオチン、アビジンまたはストレプトアビジンでありうる。ウイルスの外側の膜またはキャプシドは標的細胞への遺伝子送達ビヒクルの進入を媒介する物質を含みうる。リガンドの特異性、結合対の高アフィニティゆえに、そして単独で用いられた際は遺伝子送達ビヒクルが標的に向けられることがないゆえに、遺伝子送達の方法の普遍性さは、その細胞のタイプの高い選択性とともに様々な相応の標的指向コンジュゲートの使用により容易に達成されうる。

Description

【発明の詳細な説明】標的遺伝子送達のための方法および手段発明の分野本発明は、組換えDNA技術によって細胞に付加的な遺伝情報を与える分野に関する。具体的には、本発明は、（とくに遺伝子治療に関連して）特定の細胞群に付加的な遺伝情報を与える方法およひ手段に関する。遺伝子治療は最近開発された概念であり、哺乳類タンパク質群の欠乏（通常、遺伝子の疾患に起因するもの）を補うことから、癌、（自己）免疫疾患または（ウイルス）感染症の処置（通常、原因となる細胞または生物群の除去もしくは抑制によるもの）まで、極めて広い応用範囲を有する。遺伝子治療において主要な課題の1つは、遺伝物質を標的細胞に送達すると共に、他の細胞には送達しないことである。遺伝子治療におけるもう1つの問題は、一定の細胞タイプが現行の遺伝子導入技術には極めて馴染みにくいことにある。本発明は、概して遺伝子送達ビヒクル（gene delivery vehicle）と遺伝子治療におけるそれらの使用に関し、より具体的には、感受性標的細胞に向けることができる組換えウイルスに関する。レトロウイルスは、逆転写されたDNA中間体を介してその遺伝情報を感染細胞のゲノムDNAに効率よく組込むRNAウイルスである。レトロウイルスの生活環のこの特性と、レトロウイルスの遺伝物質の一部を外来DNA配列で置換することができるという事実から、レトロウイルスは、人間の遺伝子治療（とくに分裂組識への遺伝子導入による遺伝子治療）における遺伝子送達用ベクターとして最も有望なものの1つとなっている。ほとんどのレトロウイルスベクター系はマウスレトロウイルスに基づいており、2つの成分、すなわち（i）目的の外来配列を保持する組換えレトロウイルスベクターと（ii）ウイルス構造タンパク質（レトロウイルスベクターがそのコード配列を欠くもの）を発現させるいわゆるパッケージング細胞とからなる。（ii）における（i）の発現は、感受性標的細胞を形質導入することができる組換えウイルス粒子の生産をもたらす。レトロウイルス粒子の感染性と宿主細胞域は、標的細胞膜上のレセプター分子に特異的に結合するエンベロープ糖タンパク質によって付与される。既知レトロウイルスのエンベロープ糖タンパク質はすべて、レトロウイルスenv遺伝子によってコードされる同じ前駆体タンパク質からタンパク質分解的切断によって生じる2つの結合したペプチドからなる（Dicksonら，Weissら編Molecular biology o f tumor viruses(1984)，Cold Spring Harbor Press，513〜648頁）。そのアミノ末端ペプチドは、標的細胞膜上のそのレセプターに対する特異的結合部位を含むので、ウイルス宿主域を決定する（HunterおよびSwanstrom，Curr．Top．Micr obiol．Immunol．157(1990)：187）。膜貫通アンカー配列を含むカルボキシ末端ペプチドは、ウイルス粒子中のエンベロープ糖タンパク質の選択的取り込みに寄与し、ウイルス膜と標的細胞の原形質膜または細胞内小胞膜（ウイルスのタイプに依存する）の融合を媒介すると考えられる。哺乳類細胞に対して異なる感染スペクトルを有するいくつかのエンベロープ糖タンパク質変種が同定されている。既知のenv変種はすべて一般にかなり広い感染スペクトルを有する。ここに、現在の組換えレトロウイルス技術の主な欠点の 1つがある。多くの遺伝子治療では、特定の細胞に遺伝子を選択的に送達することが望まれ、細胞混合物中に低密度で存在する細胞タイプにin vitroで遺伝子を導入する場合や、生きている哺乳動物の体内の細胞に遺伝子を導入するin vivo の方法ではとくにそうである。従来の遺伝子導入技術は、そのような応用において所望の標的細胞に対する遺伝子導入効率が低いという欠点を有する。なぜなら遺伝子導入ビヒクルが他の細胞にも同様に取り込まれるからである。また、細胞の混合物または生きている哺乳動物の身体には、遺伝子導入が絶対的に望ましくない細胞が含まれる場合もある。たとえば、化学治療の薬に対する保護を与える遺伝子は、悪性細胞中には導入すべきでない。そこで、レトロウイルスの感染スペクトルを制限するための操作の発明に注目が集まっている。特定のenv変種を使用することにより、形質導入スペクトルをある程度制限することはできるが、この方法では目的とするほとんどの標的細胞に対して真の特異性をうることはできない。一方、いくつかの細胞タイプの表面では、レトロウイルス進入のためのレセプターの発現が極めて低い。レトロウイルスレセプター発現の低い細胞タイプの重要な具体例は、造血系の多能性幹細胞である（Orlicら，Blood 86 suppl 1（1995）:628a）。標的送達（targeted delivery）を達成するための好ましい戦略は、天然のエンベロープ糖タンパク質レセプターとは異なる細胞膜分子（所望の標的細胞の膜上に特異的に発現するもの）にレトロウイルス粒子を向けることである。これを行ないうる方法についての現在の考え方は、１．標的細胞分子に対するリガンドをウイルスエンベロープ糖タンパク質に直接化学結合すること（Nedaら，J．Biol．Chem．266(1991):14143）、２．2つの抗体（1つはウイルスエンベロープ糖タンパク質に対するもので、もう 1つは標的細胞上の分子に対するもの）の複合体によって、ウイルスエンベロープ糖タンパク質を標的細胞上の分子に架橋すること（Goudら，Virology 163(198 8)：251；Rouxら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86(1989)：9079；Etienne-Jula nら，J．Gen．Virol．73(1992)：3251）、３．ウイルスエンベロープ糖タンパク質に対する抗体と標的細胞上の分子に対するペプチドリガンドの複合体によって、ウイルスエンベロープ糖タンパク質を標的細胞上の分子に架橋すること（Etienne-Julanら，J．Gen．Virol．73(1992)： 3251）、４．ウイルスエンベロープ糖タンパク質のレセプターに対する前記タンパク質の特異的結合部位を、標的細胞表面分子に対するペプチドリガンドで置換すること、５．天然のウイルスエンベロープ糖タンパク質と標的細胞表面分子に対するリガンドとを、ウイルス膜上に同時発現させること（Youngら，Science 250(1990)： 1421）、６．天然のウイルスエンベロープ糖タンパク質と改変したウイルスエンベロープ糖タンパク質（そのレセプターに対する特異的結合部位が標的細胞表面分子に対するペプチドリガンドで置換されているもの）とを、ウイルス膜上に同時発現させること（Youngら，Science 250(1990)：1421；Russel lら，Nucl．Acid Res．5(1993)：1081；Chuら，Gene Ther．1(1994)：292；Kasa haraら，Science 266(1994)：1373；ChuおよびDornburg，J．Virol．69(1995)： 2659）である。標的細胞特異的分子に対し高い特異性とアフィニティを示すモノクローナル抗体またはその断片は、標的送達のためにはとりわけ好ましいリガンドである。前記2と3の方法は抗体に依存し、前記4と6の方法で使用される有望な道具はウイルスエンベロープ糖タンパク質とイムノグロブリンの可変抗原結合ドメインの一本鎖抗体断片（scFV）とのキメラ分子である（Russellら，Nucl．Acid Res．5(199 3)：1081；Chuら，Gene Ther．1(1994)：292；ChuおよびDornburg，J．Virol．6 9(1995)：2659）。前記5の方法には、前記scFv断片とウイルスエンベロープ糖タンパク質以外の膜固定タンパク質とのキメラ分子を使用することができるだろう。過去に発明された全てのこれらの方法には、各標的細胞タイプごとに、特異的標的指向リガンド（化学的または遺伝子的に修飾されたエンベロープ糖タンパク質または同時発現されたリガンド）を有する新しいウイルスもしくは新しい特異的２成分抗体複合体を調製する必要があるという重大な制約がある。本発明はこの制約を回避するものである。アデノウイルスキャプシドは252サブユニット（そのうち240個はいわゆるヘキソンであり、12個はいわゆるペントンである）からなる正二十面体である。ペントンは正二十面体の頂点に位置する。これらはキャプシドの表面に5分子の85kD ポリペプチドからなるペントン基部を含有する。62kDポリペプチドのホモ三量体からなるファイバーは、ペントン基部から外側に突き出ている。このファイバータンパク質はアデノウイルスがそのレセプターに結合する原因となる（Horwitz による総説、Virology，第２版（Fieldsら編），Raven Press，ニューヨーク，1 990，1679-1721頁）。Stevensonら（J．Virol．69(1995):2850）は、抗原型が異なる２つのアデノウイルスのファイバータンパク質ドメインを交換することにより、レセプター特異性がファイバータンパク質のヘッドドメイン（head domain ）によって決まることを明らかにした。アデノ関連ウイルス（AAV）キャプシドは３つのウイルスタンパク質（VP）、すなわちVP-1、VP-2およびVP-3からなる。これらのタンパク質はそれぞれ87kD、 73kDおよび62kDの分子量を有する。成熟ビリオンには、VP-1、VP-2およびVP-3が約1：1：10の相対量で認められる。in vitroではこれら3つのタンパク質は、自発的に会合してビリオン様構造を形成する。したがって、感染細胞におけるキャプシド形成はウイルスDNA合成とは無関係に進行するようである（Kotinによる総説、Hum．Gene Ther．5(1994)：793）。キャプシドタンパク質をコードする遺伝子に配列を挿入して、無傷のAAVキャプシドの表面にHis残基を露出させうることが示されている。その結果として、これらの改変AAVビリオンはニッケルカラムに結合できるようになった（Dr．R．Samulski（ノースカロライナ大学；ノースカロライナ州、チャペルヒル）のグループによる未公表結果）。本発明は、前記キャプシド遺伝子中に配列を挿入できるということを利用する。すなわち、本発明は、標的細胞に遺伝物質を送達するための遺伝子送達ビヒクルであって、目的の遺伝子産物をコードする発現可能な組換え核酸分子、ウイルス由来のキャプシドまたはエンベロープ、および特異的結合対のメンバー（このメンバーの相手部分（counterpart）は標的細胞の表面に直接的には結合していない）からなる遺伝子送達ビヒクルを提供する。この遺伝子送達ビヒクル自体は、標的細胞に特異的に結合できない（つまり、もはや感染性ウイルス粒子でない）ことが好ましい。前記ビヒクルは通常の感染性を持たない代わりに、そのエンベロープの一部分としてもしくはそのキャプシドの一部分として特異的結合対のメンバーを備えている。この遺伝子送達ビヒクルは、本来は標的細胞に向けられることはできないが、標的指向遺伝子送達ビヒクル（targeting gene delivery vehicle）を調製する方法における新規かつ進歩的な中間体であり、それは標的指向成分（targeting component）とともに標的細胞のみに遺伝子を送達すること、もしくは少なくとも標的細胞に対して非標的細胞（または他の標的、たとえば感染性生物など）よりもはるかに多量の遺伝子を送達すること、もしくはウイルスレセプターの発現が低いために形質導入することが困難であった細胞に遺伝子を送達することができる。したがって、本発明は前記遺伝子送達ビヒクルを標的細胞にむける際に使用するコンジュゲート（conjugate ）である標的指向成分をも提供する。このコンジュゲートは、特異的結合対の前記メンバー（前記遺伝子送達ビヒクル上または前記遺伝子送達ビヒクル中に存在する）の相手部分であって、標的細胞の表面に関連する（associated）標的分子に結合することができる標的指向部（targeting moiety）に結合する相手部分からなる。したがって、前記コンジュゲートは二重の特異性を有する。一方では、前記相手部分が遺伝子送達ビヒクル上または遺伝子送達ビヒクル中に存在する特異的結合対のメンバーを認識し、他方では、標的細胞の表面に関連する標的分子を認識する。このようなコンジュゲートを遺伝子送達ビヒクルと組合せると、標的指向遺伝子送達ビヒクルがえられる。したがって、本発明は前記コンジュゲートに結合した前記遺伝子送達ビヒクルからなる標的指向遺伝子送達ビヒクルをも提供する。本発明の遺伝子送達ビヒクルの主な利点は、それらが遺伝子を送達する必要がある標的細胞とは独立した認識可能部を有することである。このことは、異なるコンジュゲート（これらはいずれも前記ビヒクルを認識する（コンジュゲートの一定部分）と共に、他の部位で標的細胞に関連する多くの異なる標的をも認識する）を使用することにより、それらが数多くの異なる標的細胞に向けられうることを意味する。したがって、新しいビヒクルを調製しなくても、目的の遺伝子を数多くの異なる細胞に送達することができる。前記方法3のように、これと類似する方法は既に開示され、記載されている。しかしながら、この方法ではそのビヒクルに追加の特異的結合対のメンバーが与えられておらず、ウイルス抗原（エンベロープ糖タンパク質）自体が抗体によって認識される特異的結合対のメンバーになっている。全ての送達系のための新しい特異的2成分抗体複合体を調製する必要があるという欠点の他に、すべての抗原を抗体に結合する必要があるということがさらに重大な欠点である。そうでなければ、当該ビヒクルはその通常の宿主細胞に感染する能力を維持することになるからである。これに対し、本発明の遺伝子送達ビヒクルの場合は、これらの糖タンパク質は存在しないか、その正常な機能が損なわれるように改変されていることが（必須ではないとしても）好ましい。本発明の好ましい態様が、遺伝子送達ビヒクルを1つの部品とし、かつ少なくとも1つの標的指向部をもう1つの部品とするいわゆるキット（部品のキット）であることは、以下の説明から明らかになるだろう。したがって、本発明のもう1つ部分は本発明の遺伝子送達ビヒクル、および標的細胞の表面に関連する標的分子に結合することができる標的指向部に結合した特異的結合対の相手メンバーの少なくとも1つのコンジュゲートからなる遺伝物質を標的細胞に送達するための部分のキットである。前記態様は本発明の一般的形式である。したがって、遺伝子送達ビヒクルそのものだけでなく、コンジュゲート、コンジュゲートに結合した送達ビヒクル、およびコンジュゲートと送達ビヒクルの両方を含むキットはいずれも、キットのみについて具陳する特定の態様に適応させうることは明らかである。すなわち、送達ビヒクルを伴わない特定のコンジュゲートと、コンジュゲートを伴わない特定のビヒクルとは、特定の標的指向ビヒクルと同様に、やはり本発明の一部を構成する。たとえば、メンバーとしてイムノグロブリン結合タンパク質、およびその相手部分としてイムノグロブリンからなる部分のキットを開示する場合、それはそのイムノグロブリンからなるコンジュゲートがそのイムノグロブリン結合タンパク質からなる遺伝子送達ビヒクルと同様に本発明の一部分であることを意味する。請求の範囲における定義はそれ自体当技術分野では明確に理解される。たとえば、特異的結合対とは2つのメンバーのあいだに高アフィニティ特異的相互作用を有する任意の２分子（以下、これらをしばしばメンバーおよびその相手部分という）であると見なされる。これらは抗体（断片または誘導体）とそれに対応する抗原であってもよいし、レセプターとそのリガンド（この場合はとくにタンパク質性リガンド）であってもよく、また、アビジン／ビオチンやストレプトアビジン／ビオチンなどの周知の結合対、溶液中で特異的に相互作用できるペプチド構造などであってもよい。多くの場合、これら結合対のメンバーは通常はウイルスのエンベロープまたはキャプシド中に存在せず、したがって、本発明の遺伝子送達ビヒクル上にも通常は存在しないだろう。そのためには、それらを適当な方法で（たとえば化学的に）修飾する必要があるか、もしくはそれらがキャプシドまたはエンベロープの中または上にそれらを存在させるための成分に連結した融合分子またはハイブリッド分子として存在する必要があるだろう。それらが元の結合対メンバーとして同じ機能（量的にではなく質的に）を有するかぎり（すなわちそれらがその相手部分と結合するかぎり）、それらは元の結合対のメンバーの誘導体または等価体とみなすべきであり、したがって本発明の一部である。このことは、特異的結合対のメンバーの相手部分、およびコンジュゲートのもう1つの側面である標的指向部についてもいえる。以下に、キャプシドまたはエンベロープに特異的結合対のメンバーの機能を与えるいくつかの可能性について記述し、好ましいビヒクルについて例証するが、当業者は本発明から逸脱することなくこれらの教示を他のビヒクルおよび／または他の特異的結合対のメンバーに適用することができ、また、エンベロープおよび／またはキャプシドにこれらのメンバーを与える他の方法にも適用することができる。本発明の目的を達成するためのコンジュゲートとは、何らかの方法で連結した少なくとも2つの異なる特異的認識部位を有する任意の分子と定義される。このことは、それが化学的な結合または融合タンパク質（これらは本発明のコンジュゲートではあるが）を必然的に含むわけではなく、それが常態でこの二重の特異的認識を有する分子（たとえば抗原を特異的に認識し、かつその定常領域がたとえばFcレセプターなどによって特異的に認識される抗体など）をも包含することを意味する。目的の遺伝子をコードする核酸とは、タンパク質をコードするものだけでなく、アンチセンス核酸や他の有用な核酸をもコードする（普通はこれらは遺伝子とは見なされないが）と解釈すべきである。核酸がタンパク質をコードする場合、当該技術分野（とくに遺伝子治療の分野）では数多くの目的遺伝子が知られている。これらの遺伝子はすべて本発明の方法および手段を用いて標的細胞に送達することができる。自殺遺伝子（たとえばWO93/07281に開示されている単純疱疹ウイルスチミジンキナーゼおよびその他など）はとくに興味深い。目的の遺伝子を送達することができる標的細胞は、標的指向部を用いることにより他の細胞からそれらを識別する手段となりうる標的分子をその表面に有する本質的に任意の標的細胞である。識別する能力は細胞の特定のサブセットにおける特定の標的分子の存在量にありうる。さらに、本発明の応用にとってその標的分子の性質が既知である必要はない。標的指向部は異なる細胞タイプの表面に発現する分子に対する弁別的な結合に基づいて組合せペプチドライブラリー（comb inatorial peptide libraries）から選択することができる。本発明に有用な組合せペプチドライブラリーには、極めて多様なペプチドが繊維状バクテリオファージの表面にディスプレイされるもの（たとえばScottおよびSmith，Science 24 9(1990):386）がある。所望の標的細胞と相互作用する個々のライブラリー構成メンバーをスクリーニングすることにより、本発明において標的指向部として使用すべきペプチド構造をコードするヌクレオチド配列を単離することができる。この目的には、scFv変種をディスプレイするライブラリーがとくに有用である。さらに、該ライブラリーの組合せ多様性（combinatorial diversity）を増大させる方法により本発明で応用するために調製できる標的指向部の数はほとんど無制限となる。該方法としては、PCRに基づくランダム突然変異導入技術（Stemmer，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91(1994):10747 ; CrameriおよびStemmer，Biotechniques 18(1995):194）が挙げられる。したがって、本発明がその識別の性質が明らかでない場合であっても、表現型で他の細胞と識別することができる任意の標的細胞への特異的な遺伝子送達法を開示することは、前述の説明から理解される。重要な標的細胞は腫瘍細胞、造血系の細胞、肝細胞、内皮細胞、肺細胞、中枢神経系の細胞、筋細胞、および胃腸路の細胞である。通常の標的分子はレセプター、表面抗原などである。前述のように、本発明は特異的結合対のメンバーがイムノグロブリン結合部であり、その相手部分がイムノグロブリンまたはその誘導体もしくは断片である部分のキットをも包含する。このイムノグロブリン結合部はイムノグロブリンの定常領域に結合できることが好ましい。著しく好ましいイムノグロブリン結合部はプロテインA、プロテインG、またはFcレセプターである。最も一般的に使用されるイムノグロブリン結合性タンパク質の1つは黄色ブドウ球菌（Staphylicoccus aureus）プロテインA である。この42kDポリペプチドはヒトのIgG1、IgG2およびIgG4とマウスのIgG2a およびIgG2bを含む多くのIgG分子のFc領域に対して強い結合性を示し、その抗原結合部位には干渉しない(Suroliaら，Trends Biochem．Sci．7(1981):74; Lindm arkら，J．Immunol．Meth．62(1983):1)。グループCブドウ球菌（Streptococcus ）種から単離されるプロテインGは、より広範囲の哺乳類イムノグロブリンに結合する。これはすべてのヒトおよびマウスIgGサブクラスに対して強い結合能を有する（BjorkおよびKron vall， Chem．266(1991)：399)。プロテインAとプロテインGは、哺乳類細胞の表面またはウイルスの膜もしくはキャプシドとは本来結合しない。したがって、これらの分子（の部分）を遺伝子送達ビヒクルの表面で発現させるには、ハイブリッド分子の調製が必要だろう。ストレプトアビジンとプロテインAの2つのIgG結合ドメインとのハイブリッドは既に調製されており、これは1ハイブリッドあたり1つの IgG分子を結合する（SanoおよびCantor，Bio/Technol．9(1991):1378）。しかし、イムノグロブリンのFcドメインに対する哺乳類レセプター（FcR）は膜貫通分子である（Van de WinkelとCapelによる総説、Immunol．Today 14(1993 )：215）。これらのレセプターは、体液性免疫反応と細胞性免疫反応の間のフィードバックを提供する。これらのレセプターとイムノグロブリンの相互作用は、食作用、細胞傷害性、サイトカイン放出および抗原提示の増進などといったイムノ機能を誘発する。FcRはイムノグロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、ヒトではIgGのFcドメインに対して3種類のレセプター（FcgR）が知られている（hFcgRI、 hFcgRIIおよびhFcgRIII）。hFcgRIは単量体IgGに高アフィニティで結合できる点でユニークである（Ka＝10⁸〜10⁹M^-1）。その結合はヒトのIgG3 、IgG1およびIgG4（この順にアフィニティが減少する）と、マウスのIgG2aおよびIgG3に対して強く、ヒトのIgG2とマウスのIgG1およびIgG2bははるかに弱く結合する。hFcgRIは単球とマクロファージでは構成的に発現し、好中球と好酸球ではその発現が誘導されうる。hFcgRI には3つの高度に相同な遺伝子が同定されている。これらのうち、hFcgRIAは3つの細胞外イムノグロブリン様ドメイン（そのうちの1つはhFcgRファミリーの他のメンバーには認められない）、21アミノ酸膜貫通領域および61アミノ酸の荷電細胞質テールからなる膜貫通分子hFcgRIa（a-鎖）をコードする。いくつかの細胞タイプの膜では、このhFcgRIa a-鎖が、ジスルフィド結合したg-鎖のホモ二量体（これはFcRファミリーの別のメンバーの成分でもある）に関連して見つかる（S chollおよびGeha，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90(1993)：8847）。g-鎖の存在がhFcgRIa a-鎖の膜発現とリガンド結合にとって絶対的に必須であるかどうかについては多少の議論がある（Takaiら，Cell 76(1994):519）。a-鎖に対してイムノグロブリンが結合した後の細胞内部へのシグナル変換は、g-鎖によって媒介される。a-鎖の細胞質ドメインがシグナル変換に何らかの役割を果たすということはないようである（Indikら，Exp．Hematol．22(1994)：599）。イムノグロブリンの定常領域は種間で異なるので、抗イムノグロブリン抗体は種間免疫によって調製することができる。いくつかの種については、個々のイムノグロブリン鎖またはサブクラスに対してさえ特異性を示す抗体が生じている。これらの抗体をコードする配列の分子クローニングにより、柔軟なペプチド橋で連結されたイムノグロブリン分子の重鎖および軽鎖の可変領域からなるscFvを構築することができる。このようなscFvは、抗原結合に関してイムノグロブリンFab断片と同じぐらい強力であることが示されている（Birdら，Science 242(1988)：423）。scFvとウイルスエンベロープ分子とのハイブリッド分子が調製され、哺乳類細胞の表面上に発現しており、これらは抗原結合能と標的指向遺伝子送達能を持つことが示された（Chuら，Gene Ther ．1(1994)：292; ChuおよびDornburg，J．Virol．69(1995)：2659）。遺伝子送達ビヒクルにイムノグロブリン結合部を与える場合、完全なコンジュゲートとして必要なものは、適切な抗体（または誘導体もしくは断片（当該イムノグロブリン結合性タンパク質に対する結合部位を保持しているもの））だけである。したがって、標的細胞を他の細胞から識別できる抗体を入手できる場合、前記遺伝子送達ビヒクルはすぐに該抗体を用いて該細胞に目的の遺伝子を向けるために使用することができる。したがって、抗体を用いて他の細胞から識別することができる任意の細胞に、標的指向遺伝子送達系（targeted gene delivery s ystem）が提供される。このことは、特異的結合対のメンバーがビオチンであり、かつその相手部分がアビジンまたはストレプトアビジンであるか、もしくは特異的結合対のメンバーがアビジンまたはストレプトアビジンであり、かつその相手部分がビオチンである本発明のもう1つの態様についても当てはまる。この態様では送達ビヒクルに（ストレプト）アビジン/ビオチン対の一方のメンバーが与えられるので、コンジュゲートは他方のメンバーを含むことになる。したがって、ビオチニル化することができるまたは（ストレプト）アビジンに結合することができる任意の標的指向部を、本発明の遺伝子送達ビヒクルと共に使用できる。これにより、適用できる標的指向部の数はほとんど無制限となる。標的細胞の表面に関連する任意の分子であって、それに対する特異的結合パートナーが知られているかそれを生産することができるものは、細胞のサブセットごとにその存在または存在量が異なるならば、原則的に本発明遺伝子送達系の標的として有用である。もちろん抗体は、先の態様の場合と同様に、この態様でも、好適な標的指向部の良い例である。したがって、本発明の好ましい態様は標的指向部が標的細胞の表面に関連する標的分子を認識する抗体またはその断片もしくは誘導体である部品のキットを包含する。好適な標的指向部のもう1つのグループはリガンドであり、この場合、標的分子は細胞の表面に関連する（その標的指向部をリガンドとする）レセプターである。多くの細胞タイプ特異的抗原について、高い特異性および／またはアフィニティで結合するタンパク質リガンドが同定されている（たとえば細胞レセプターに結合するサイトカイン類）。ほとんどのタンパク質は、簡単な方法を使って、水溶性ビタミンであるビオチンで標識することができる。ほとんどのビオチニル化はビオチンのスクシンイミドエステルを用いて行われる。タンパク質に対する結合は、遊離のアミノ基（通常はリジン残基の遊離アミノ基）を介して進行する。ビオチニル化された分子はアビジンおよびストレプトアビジンの両方と極めて高いアフィニティ（Ka＝10¹⁴〜10¹⁵M^-1）で結合する（WilchekおよびBayer，Immunol．Today 5(1984)：39）。アビジンは卵白から単離される68kD糖タンパク質であり、ストレプトアビジンはストレプトミセス・アビジニ（Streptonyces avidinii）由来の60kDタンパク質である。これらの分子は共にヘテロ四量体であり、各サブユニットが1つのビオチン結合部位を含有する。それらの結合はアフィニティが高いので、ビオチン−アビジンまたはビオチン−ストレプトアビジン相互作用は本質的に不可逆的である。機能的なストレプトアビジン遺伝子はクローン化されており（SanoおよびCantor，Proc．Natl．Ac ad．Sci．USA 87(1990)：142）、ビオチン結合アフィニティが減少（約Ka＝10⁸M^-1 ）しているために、特異的かつ強固であってしかも可逆的にビオチンを結合するストレプトアビジン突然変異体も調製されている（SanoおよびCantor，Proc． Natl．Acad．Sci．USA 92(1995)：3180）。プロテインAおよびプロテインGの場合と同様に、アビジンとストレプトアビジンは、本来は哺乳類細胞の表面もしくはウイルスの膜またはキャプシドに結合しない。したがって、これらの分子（の部分）を遺伝子送達ビヒクルの表面に発現させるためには、やはりハイブリッド分子の調製が必要だろう。ストレプトアビジンと異種タンパク質とのハイブリッドは既に調製されており、それらは完全なビオチン結合能を保持していた（Sano およびCantor，Bio/Technol．9(1991)：1378；Sanoら，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 89(1992)：1534）。本発明のもう1つの態様では、特異的結合対のメンバーとその相手部分が共に溶液中で相互作用できる三次元構造を形成するペプチドである。本発明のこの側面で有用なペプチドには、二量体を形成することが知られているタンパク質（たとえば酵母転写因子GCN4、哺乳類転写因子C/EBPおよび核形質転換性癌遺伝子産物fos、 junおよびmycなど）内に同定される二量化モチーフがあるが、これらに限るわけではない。別法として、タンパク質間およびタンパク質内相互作用の知見に基づいて設計される合成ペプチドを使用することもできる。二量化することが知られているペプチドモチーフの典型は、コイルドコイル構造（いわゆるロイシンジッパーはそのサブセット）である（Landschultzら，Science 240(1988)：1759；O ′Sheaら，Science 243(1989)：538；O′Sheaら，Science 254(1991)：539）。ロイシンジッパーモチーフを含有するいくつかのタンパク質はホモ二量体を形成できるばかりでなく、ヘテロ二量体をも形成することができる（Haiら，Genes & Dev．3(1989)：2083；Romanら，Genes & Dev．4(1990)：1404）。ロイシンジッパー二量化領域はそれ自体が、二量化特異性を決定する構造的情報のすべてを含有する（Agreら，Science 246(1989)：922；KouzaridesおよびZiff，Nature 340 (1989)568；O′Sheaら，Science 245(1989)：646）。本発明の特異的結合対のメンバーとその相手部分の設計には、使用するペプチドがホモ二量体ではなくヘテロ二量体を（排他的にではないにしても）優先的に形成することが好ましい。Vi nsonら（Genes & Dev．7(1993)：1047）は、ヘテロ二量体を優先的に形成するロイシンジッパーモチーフの合理的設計に関する規則を提案し、検証した。したがって、本発明のこの側面で使用されるペプチドは、このいわゆる「i＋5塩橋(i+5 salt bridge)」則に従って設計されることが好ましい。送達ビヒクルと、標的指向部へのその二量化性相手部分のコンジュゲートとの表面に二量化ペプチドモチーフを発現させるには、ハイブリッド分子を調製する必要があるだろう。機能的なロイシンジッパードメインを有する数多くの異なるハイブリッドタンパク質が既に生産されており、それらにはscFv に基づく二量 1579）、モノクローナルFab′断片に基づく二量化抗体（Kostelnyら，J．Immuno l．148(1992)：1547）およびロイシンジッパー（一方はファージミドpIIIコートタンパク質に結合しており、他方はcDNAライブラリーからの産物に結合しているものであり、それは組合わせファージミドcDNAライブラリーの生産に用いられうる）を有する一組のヘテロ二量化タンパク質（CrameriおよびSuter，Gene 137(1 994)：69）がある。遺伝子送達ビヒクルに溶液中で相手部分と二量化することのできるペプチド構造を与える場合は、該相手部分に結合しうる任意の標的指向部と組合せてそれを使用することができる。当該技術分野で知られる一般的な技術を用いることにより、ロイシンジッパー末端ドメインを含有する融合タンパク質の翻訳をもたらす外来配列挿入用の発現構築物を調製することができる。該結合は直接行なってもよいし、該標的指向部および相手部分の各折りたたみドメインを分離する介在リンカー配列を介して行なってもよい。コンフォメーション的な自由度を有するペプチド主鎖を与えることによって各折りたたみドメインを分離する当該技術分野公知のリンカー配列は、通常、グリシン残基を豊富に含む。本発明で有用なリンカーペプチド配列の例には、(Gly₄-Ser)₃（Batraら，J．Biol．Chem.，265(1990): 15198）や(Gly₄-Thr)₃(Birdら、Science 242(1988)：423）があるがこれらに限るわけではない。したがって前述の説明から理解されるように、本発明のこの側面でも適用できる標的指向部の数はほとんど無制限である。前述のように、異なるコンジュゲート（抗体、ビオチニル化標的指向部、または溶液中で相互作用できるペプチド構造にコンジュゲートした標的指向部）を用いることにより、遺伝子送達ビヒクルを多くの異なる細胞に向けることができる。したがって、同じ相手部分メンバーといくつかの異なる標的指向部からなる多数の異なるコンジュゲートを含む本発明の部品のキットを提供することが好ましい。前述のように、当業者は本発明の教示を本明細書に例示するウイルス以外のウイルスに適用できるだろうが、本明細書に例示するウイルスは遺伝子治療の概念で使用されてきた経緯があるので、これらは好ましい態様である。レトロウイルスは複製細胞への遺伝子導入にとりわけ適している。レトロウイルスによって導入された外来遺伝子は、標的細胞とその子孫のゲノムの安定な成分になる。一方、アデノウイルスは非分裂標的細胞に効率よく外来遺伝物質を導入する。アデノ関連ウイルスは現在知られる唯一の非病原性DNAウイルスである。これは一定の遺伝子導入応用においてレトロウイルスとアデノウイルスの両方の代替物となりうる。したがって、遺伝子送達ビヒクルはアデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたはレトロウイルス由来であることが好ましい。図面の簡単な説明図1は、DG-CSFRをその膜上に発現させるマウス繊維芽細胞に対するビオチニル化G-CSFの特異的結合を表わす。ビオチニル化G-CSF結合のFACSヒストグラム（対数目盛り）が記載されている。実線はビオチニル化G-CSF、PE-ストレプトアビジン、ビオチニル化ヤギ抗ストレプトアビジン、およびPE-ストレプトアビジン中で培養した後の測定を表わす。破線はビオチニル化G-CSFを含まない対照培養の結果を表わす。ビオチニル化G-CSFの特異的結合を示す細胞の百分率を、各パネルの上右隅に示す。パネルA：非操作マウス繊維芽細胞。パネルB：LNCX-GRDcyt ウイルスで形質導入し、G418で選択したマウス繊維芽細胞。パネルC：LNCX-GRDc ytウイルスで形質導入し、G418で選択し、GRDcyt発現についてFACS選別し、限界希釈法でクローン化したマウス繊維芽細胞。図２は、8週間までのin vitro培養中にPA317細胞の膜上に発現するhFcgRIaのレベルを表わす。非操作PA317細胞と、hFcgRIa発現についてFACSで選別したトランスフェクトされたPA317細胞の混成集団2種（PAFcR選別315とPAFcR選別216）とを、抗FcgRI MoAb22または無関係な抗KLHイソタイプ対照で染色した。前記対照で染色した後のメジアン（median）シグナル強度に対するMoAb22で染色した後のメジアンシグナル強度の比を記載する。図３は、２つのハイブリッドhFcgRIa/Mo-MuLVenv分子と、それらの親hFcgRIa およびMo-MuLVenvタンパク質の構造を表わす。タンパク質分解的切断によって形成するMo-MuLVenvペプチドgp70およびp15Eを個別に示し、前駆体ペプチドにおけるそれらの物理的関係を破線で表わす。各区間上の数字は、アミノ酸の数を示す。アステリスクはCys残基の位置を表わす。矢印はPCR増幅に用いたプライマーを表わす。影付きの四角形で示すFcRenv-15 とFcRenv-70中の領域を、PCR増幅によって調製した。関連する制限酵素切断部位の位置を示す。Mo-MuLVenv配列を灰色で示し、hFcgRIa配列を白色で示す。黒い四角形は非コードMo-MuLV配列を表わす。S，シグナルペプチド；Pro，プロリン高含有ヒンジ様領域；TM，膜貫通ドメイン；C，細胞質ドメイン；EC1、EC2、EC3 ，それぞれ1つのイムノグロブリン様ループを形成する細胞外ドメイン1、2および3。図４は、ハイブリッドhFcgRIa/Mo-MuLVenv分子FcRenv-15およびFcRenv-70によるin vitroイムノグロブリン結合を示す。陽性および陰性タンパク質対照はそれぞれ野生型hFcgRIa（wt-FcR）と無関係なホタルルシフェラーゼタンパク質である。³H-標識ロイシンの存在下に、これらのタンパク質をコードするDNA配列のin vitro共役転写および翻訳を行なった後またはDNA鋳型なしで対照反応（DNAなし）を行なった後、IgG2a抗体を負荷したセファロースビーズを用いて形成したタンパク質を沈降させた。全反応産物（T）、沈降した物質（P）および沈降上清（ S）を10%SDS-ポリアクリルアミドゲルで分離した。そのゲル中のシグナルを増幅し、X線フィルムに暴露した。延長暴露（extended exposure）をバンド上のaで示す。マーカータンパク質混合物の分子量（MW）をゲルの右側に示す。発明の詳細な説明本発明は、多くの異なる細胞タイプに対する遺伝物質の標的送達に組換えウイルス調製物を普遍的に利用する方法を提供する。この目的のため、本発明は一組の二次分子（secondary molecule；特異的結合対のメンバーの相手部分からなるコンジュゲート）と特異的に相互作用することができる分子（特異的結合対のメンバー）をその表面に保持する組換えウイルスの製造法を記述する。該二次分子は標的細胞特異的抗原に対してリガンド特異性を持つ。1つの二次分子を介する標的細胞と前記組換えウイルスとの間接的結合（これは付加した二次分子に依存して同じ組換えウイルス調製物を異なる標的細胞に対して再方向づけ（redirect ion）することを可能にする）は、本発明の極めて重要な側面である。本発明での使用に有用な二次分子としては、イムノグロブリンまたはその断片、化学修飾したイムノグロブリンまたはその断片、標的細胞抗原に対する化学修飾天然タンパク質リガンド、その断片またはその組換え誘導体、および懸濁液中で特異的相手部分と相互作用することができるペプチドモチーフに結合したイムノグロブリン、その断片、その組換え誘導体、標的細胞抗原に対する天然タンパク質リガンド、その断片またはその組換え誘導体が挙げられる。ビオチニル化は使用しうる化学修飾の典型である。通例、標的細胞抗原に対する二次分子の特異性は高く、好ましくは標的細胞抗原に対する二次分子のアフィニティも高い。実施例１に、哺乳類細胞表面上に発現したサイトカインレセプター分子とビオチニル化サイトカインリガンドの間の特異的相互作用を記述する。本発明は、標的指向遺伝子送達を媒介するために使用できた標的細胞抗原の範囲に限定されない。原則的に、それに対する特異的二次分子を入手できるか入手可能にすることができる標的細胞抗原ならいずれも本発明の応用に好適である。しかし、どの標的細胞特異的分子でもそれに結合するウイルスのインターナリゼーション部位として機能しうるわけではないことは理解される。さらに、遺伝子送達の効率は、そのウイルスと標的細胞特異的分子の間の分子架橋の組成に依存しうる（Etienne-Julanら，J．Gen．Virol．73(1992)：3251）。したがって、特異的標的細胞リガンドを野生型分子としてまたは異種タンパク質とのハイブリッドとしてウイルス粒子の表面上に発現させる方法により特定の細胞タイプに対して遺伝子送達ビヒクルを向ける試みでは、選択した方法のいくつかは失敗する運命にありうるから、著しくコストと時間がかかるだろう。しかし、本発明が開示する方法は同じ遺伝子送達ビヒクル調製物に付加される多くの異なる二次分子を使用することによる有用な標的分子の包括的なスクリーニングを考慮している。したがって、本発明の応用は標的指向遺伝子送達が成功するチャンスを著しく増大させ、比較的低コストでその操作の最適化を可能にする。また、本遺伝子送達調製物の規格化と実証は抗体-抗体または抗体-リガンド複合体を用いる戦略、もしくはウイルスのエンベロープまたはキャプシドの直接的化学修飾に依存する方法に比べて簡単になるだろう。組換えウイルスに対する二次分子の結合は、ウイルス表面上に露出した物質であってその二次分子に対する特異的結合能を有する物質によって媒介される。該物質は高アフィニティで二次分子に結合することが好ましい。該物質は、プロテインA、プロテインG、FcR、抗イムノグロブリンscFv、アビジン、ストレプトアビジン、ペプチドドメイン相手部分と特異的に相互作用できる構造ペプチドドメインを含有するタンパク質、およびそれらの組換え誘導体などといった（ただしこれらに限らない）タンパク質から選択されるか、それらタンパク質の領域を含有する。組換えウイルスの表面におけるそれらの露出にはいくつかの方法が考えられるが、それらを以下に列挙する。Ａ．エンベロープを有する組換えウイルスの場合：本発明では、組換え包膜ウイルスの典型として、組換えレトロウイルスについて記述する。しかし、本発明はレトロウイルスに限定されるわけではない。本発明は、たとえばラブドウイルスやヘルペスウイルスのような他の包膜ウイルスにも適用される。１．結合性物質がそれ自体、膜貫通分子（たとえばFcR）である場合は、完全な野生型結合性物質をレトロウイルス生産細胞系の表面上に発現させることができる。別法として、その結合性物質を自然に発現させる細胞中で、レトロウイルスパッケージング構築物を発現させてもよい。これらの方法がそのレトロウイルス粒子中に当該結合性物質の包含をもたらすかどうかは、少なくとも部分的に、その物質の性質に依存する。細胞表面におけるネズミレトロウイルスの会合においては、例外も観察されているものの、単に細胞膜分子がウイ Virol．63(1982)：15；Calafatら，J．Gen．Virol．64(1983)：1241）。また、ウイルス膜からの結合性物質の排除はそれをレトロウイルス生産性細胞系の膜上で極めて高密度に発現させることによって克服することができる（SuomalainenおよびGaroff，J．Virol．6 8(1994)：4879）。２．1の方法を適用する場合は、その膜貫通結合性物質がレトロウイルス生産細胞系内の細胞内過程またはウイルス粒子内のウイルス内過程を引き出すかもしれない配列を欠くことが好ましい。このような現象は、二次標的指向分子の結合時に起こるかもしれない。したがって、結合性物質は野生型分子の修飾された誘導体であってもよい。修飾としては、その結合性物質によるシグナルプロセシングを防止する任意の突然変異が挙げられる。また、そのような先端欠失型結合性物質の使用は、レトロウイルス生産細胞系中の細胞性タンパク質との相互作用を防止するためにも好ましい。細胞質タンパク質との相互作用は、レトロウイルス粒子からの宿主細胞表面タンパク質の排除に部分的に寄与するかもしれないことが示唆されている（Youngら，Science 250(1990)：1421）。３．感染性レトロウイルス粒子と標的細胞の間の融合過程は、カルボキシ末端エンベロープペプチド中のまだ不確定な領域によって媒介されると考えられるので、1または2の方法による標的細胞結合は、標的細胞内への遺伝子送達ビヒクルのインターナリゼーションを達成するには不充分であるかもしれないと考えることができる。したがって、膜貫通結合性物質と、レトロウイルスに融合能を与える野生型レトロウイルスエンベロープ分子またはその断片とを、レトロウイルス表面上に同時発現させる必要があるかもしれない。実施例2と実施例3に、組換えレトロウイルス生産細胞系の表面におけるhFcgRIaと野生型レトロウイルスエンベロープ分子の同時発現と、露出したhFcgRIa分子による機能的IgF Fc結合について記述する。同時発現したエンベロープ分子は、遺伝子送達調製物にさらされる細胞の混合物中または生きている動物の体内に存在する細胞上のレセプター分子を認識する能力を持たないことが好ましい。これは、そのレセプター認識部位を欠く先端欠失型エンベロープ分子、もしくは遺伝子送達調製物にさらされる細胞混合物中または生きている動物の体内に存在しない細胞にそのアフィニティが限定されているレトロウイルス種の野生型エンベロープ分子を使用することによって、達成することができる。４．ハイブリッド分子（結合性物質（の断片）とそのハイブリッド分子をレトロウイルス生産細胞系の膜中に固定する異種タンパク質（の断片）とを含有するもの）を調製することができる。この方法はそれ自体は膜貫通タンパク質でない結合性物質にも適用される。膜アンカーとして機能する分子は天然の膜貫通タンパク質（サイトカインまたはホルモンのレセプター、細胞接着または相互作用分子、補体レセプターおよびイムノグロブリンレセプターなどを含むが、これらに限るわけではない）に由来しうる。別法として、ハイブリッド分子がグリコシルホスファチジルイノシトール固定タンパク質（glycosylphosphatidylinositol-anc hored protein）由来の膜付着領域を含んでもよい。本発明は異種分子間の特定の接合部位に限定されない。５．4の方法を適用する場合は、その膜アンカー分子が、レトロウイルス生産細胞系中の細胞内過程またはウイルス粒子中のウイルス内過程を引き出すかもしれない配列、またはレトロウイルス生産細胞系中の細胞性タンパク質と相互作用するかもしれない配列を欠くことが好ましい。したがって、それを付与する配列をハイブリッド結合性物質から除去することが好ましい。６．レトロウイルスエンベロープ分子はレトロウイルス粒子中に選択的に取り込まれ、ウイルスと標的細胞の間の融合を媒介すると考えられるので、そのような過程に寄与するレトロウイルスエンベロープペプチド配列と二次標的分子に対する結合に寄与する結合性物質由来のペプチド配列とを含有するハイブリッド分子を構築することが、4および5の方法より好ましい。この方法はそれ自体は膜貫通タンパク質でない結合性物質にも適用される。本発明は、異種分子間の特定の接合部位に限定されない。実施例4にはそのような2つのハイブリッド結合性物質の構築を記述し、実施例5では該ハイブリッド結合性物質が二次標的分子に対する機能的結合能を保持することを示す。７．結合性物質（の断片）と、レトロウイルス生産細胞表面上の膜分子の細胞外領域と特異的に相互作用する異種タンパク質（の断片）とを含有するハイブリッド分子を調製することができる。このハイブリッド分子はレトロウイルス粒子中に特異的に取り込まれる膜分子と相互作用することが好ましい。通例、これらの膜分子はレトロウイルスエンベロープタンパク質（の断片）である。この方法は、それ自体は膜貫通タンパク質でない結合性物質にも適用される。８．細胞表面にウイルス膜タンパク質が発現するには、ウイルス生産細胞系の小胞体（ER: endoplasmatic reticulum）における正しい折りたたみと会合が必要である（Domsらによる総説、Virology 193(1993)：545）。レトロウイルスエンベロープ分子はそのレトロウイルス種によって、二量体、三量体または四量体に会合する。不適切なオリゴマー化はゴルジ装置への適切な輸送を妨げ、その分子の分解につながりうる。これは4〜7の方法に従って生産されるいくつかのハイブリッド物質の運命（faith）だと予想できる。これはそのハイブリッド物質を野生型エンベロープ分子またはその断片と同時発現させることによって防止できるだろう。ヘテロオリゴマーの形成によって、ERにおける正しいプロセシングが保証されうる。前記3に記述した同時発現エンベロープ分子に関する好ましい条件は、ここでもあてはまる。方法A 1〜8の原則は、あるウイルス種のエンベロープ糖タンパク質が異種ウイルス種の膜上に保持されている擬似型（pseudotyped）ウイルスにも適用される。エンベロープ糖タンパク質のこのような表現型の混合は、種る総説、J．gen．Virol．63(1982)：15）。本発明は、関係するウイルスまたは全く無関係なウイルスの断片を含むハイブリッドエンベロープタンパク質を有する包膜ウイルスにも適用される。たとえば、ハイブリッドインフルエンザ赤血球凝集素（hemaglutinin）/レトロウイルスエンベロープタンパク質を保持する感染性組換えレトロウイルスを調製できることが示されている（Dongら，J．Virol．66(1992)： 7374）。Ｂ．キャプシドを有するウイルスの場合：本発明を組換えアデノウイルスと組換えアデノ関連ウイルスに関して説明するが、本発明はこれらに限られるわけではない。結合性物質（の断片）とウイルスキャプシドタンパク質（の断片）とを含有するハイブリッド分子を調製することができる。アデノウイルスの場合は、その結合性物質をファイバータンパク質のヘッドドメインに置くことが好ましい。このドメインはレセプター認識部位を保持し、この部分を操作することによってアデノウイルスレセプター特異性を変化させうることが示されている（Stevensonら，J．Virol.69(1995)：2850）。一定のハイブリッド分子については、そのハイブリッド分子と野生型ファイバータンパク質を同時発現させることによって、適切なファイバー三量体化およびペントン基部コンジュゲートとの関連（association）を保証する必要があるかもしれない。別法として、アデノウイルスの他のキャプシドタンパク質を用いて結合性物質を組込んでもよい。たとえばCurielら（Hum．Gene Ther．3(1992)：147）は、ヘキソンタンパク質の一部として肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma Preumonia e）P1タンパク質エピトープを含有するキメラ抗原型5アデノウイルスを調製している。また、天然のアデノウイルスレセプター結合配列をハイブリッド分子から削除することがさらに好ましい。VP3（の断片）を用いて、結合特異性が変化したハイブリッドAAVキャプシドタンパク質を調製することが好ましい。というのは、AAVキャプシドは主にこの分子からなるからである。別法として、VP1またはVP2を使用してもよい。 AAVウイルスタンパク質は、キャプシド表面上に露出した挿入物を可能にする（D r．R．Samulski（ノースカロライナ大学：ノースカロライナ州チャペルヒル）のグループによる未公表結果）。一定のハイブリッド分子については、そのハイブリッド分子を野生型キャプシドタンパク質と同時発現させる必要があるだろう。本発明は異種タンパク質間の特定の接合部位に限定されない。多くのウイルスキャプシドはウイルスDNAの存在とは無関係に自己会合するので、空の擬似キャプシド（pseudocapsid）をin vitro内で調製することができる。空のAAV様粒子の会合には、3つのキャプシドタンパク質すべてが同等に必要なわけではない（Ruffingら，J．Virol．66(1992)：6922）。したがって、新規擬似キャプシドを設計する自由度はかなり大きい。空のウイルス様粒子は、外来性非ウイルスDNAのパッケージングと移送に使用することができる。これは、ポリオーマウイルス擬似 ene Ther．6(1995)：297）。さらに、外来性非ウイルスDNAをウイルスキャプシドの外側に化学結合することもできる（Curielら，Hum．Gene Ther．3(1992)：1 47；Cottenら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89(1992)：6099）。本発明はこれら２つの方法とそれらの組合せ（すなわち、空のキャプシドの外表面への外来性 DNAの化学結合）にもまさに適用される。実施例実施例１マウス繊維芽細胞の表面に発現したG-CSFR分子とビオチニル化G-CSFとの特異的結合ネズミ繊維芽細胞の細胞膜上に顆粒球‐コロニー刺激因子（G-CSF）に対するレセプターを発現させるため、PA317細胞（MillerおよびButtimore，Mol．Cell ．Biol．6(1986)：2895）を同種指向性LNCX/GRDcytウイルスで形質導入した。構築物pLNCX/GRDcyt（Dr．I．Touw（エラスムス大学；オランダ国、ロッテルダム）の研究室で調製されたもの）は、突然変異型G-CSFレセプター（DG-CSFR）のcD NA配列をpLNCX（MillerおよびRosman，BioTech niques 7(1989)：980）中に挿入することによって作られた。DG-CSFRは、細胞内ドメインがほとんど完全に欠失しているために、シグナル変換不能になっている点で、野生型分子とは異なる。 DG-CSFRの細胞外ドメインと膜貫通ドメインは野生型構造を有する。したがって、DG-CSFRはそのサイトカインリガンドに対して正常な結合能を示す。LNCX/GRDc yt中のneo^r遺伝子の発現によって付与される1mg/ml G418（ジェネティシン（Gen eticin）；ギブコ（Gibco）社（英国、ペーズリー））に対する耐性について選択することにより、形質導入されたPA317細胞を単離した。耐性PA317細胞をビオチニル化G-CSFと共に培養した。PE結合ストレプトアビジン（モレキュラープローブズ（Molecular Probes）社；オレゴン州、ユージーン）、ビオチニル化ヤギ抗ストレプトアビジン抗体（ベクターラボラトリーズ（Vector Laboratorie s）社；カリフォルニア州、バーリンゲーム）と共に培養し、PE-ストレプトアビジンと共に2回目の培養を行なった後、結合したG-CSFを蛍光活性化セルソーター（FACS）で可視化した。図１からわかるように、非形質導入PA317細胞はビオチニル化G-CSFを結合しなかったが、形質導入された細胞はその約27%がG-CSFを結合した。陽性細胞をFACS選別し、限界希釈法によってクローン化した後、ビオチニル化G-CSFを強く結合するクローンを単離した（図1C）。この実施例は、ビオチニル化されたサイトカインが哺乳類細胞系の膜上に発現したその天然のレセプターに特異的に結合することを示している。実施例２ hFcgRIa タンパク質をその細胞膜上に発現させる組換えレトロウイルスパッケージング細胞系の作成レトロウイルスパッケージング細胞系の表面に機能的なhFcgRIaを発現させるために、構築物pRc/CMV-hFcgRIaを使用した。この構築物は、クローンCDMからえられる全長p135 hFcgRIa-cDNA配列（AllenおよびSeed，Science 243(1989)：378 ；GenBank受託番号M21090）を含む1.3kb HindIII-NotI断片を、pRc/CMVのポリリンカー中に挿入することによって調製した。20μgのpRc/CMV-hFcgRIaを、同種指向性パッケージング細胞系GP+E-86（Markowitzら，J．Virol．62(1988)：1120）と、両種指向性パッケージング細胞系PA317に、ChenとOkayamaが記述した方法（ Mol．Cell．Biol．7(1987)：2745）に従ってトランスフェクションした。pRc/CM V-hFcgRIa構築物上のSV40pr-neo^r-p(A)カセットの発現によって付与される1mg/m lG418に対する耐性について、トランスフェクタントを選択した。抗FcgRIモノクローナル抗体（MoAb）22（Guyreら，J．Immunol．143(1989)：1650）とFITC-結合-ヤギ抗マウスIgG抗体（GaM-FITC；ベクトンティッキンソンイムノサイトメトリーシステムズ（Becton Dickinson Immunocytometry Systems）［BDIS］社；カリフォルニア州、サンホセ）で染色した後、耐性細胞のプールをhFcgRIa発現についてFACSで分析した。表1は、わずかなG418耐性GP+E-86細胞（E86FcR）とG418 耐性PA317細胞（PAFcR）しか、その表面にFcgRIを発現させないことがわかったことを示している。FACSを用いてFcgRI発現細胞を選別し、それらを増殖させた。2週間培養した後、選別した集団をFcgRI発現について前記のように分析した。表1からわかるように、この選別操作によりFcgRIを発現するE86FcRおよびPAFcR 細胞集団が有意に濃縮された。 1 MoAb22およびGaM-FITCと共に培養した後にFITC蛍光を示す細胞の百分率。G aM-FITCのみと共に培養した対照は≦0.1%だった。 2 無関係な抗KLHイソタイプ対照MoAb（BDIS）およびGaM-FITCと共に培養した場合と比較したMoAb22およびGaM-FITCと共に培養した後の相対メジアンFITC蛍光。 3 2回の独立した測定の平均値。 4 PAFcR細胞を2回の独立した選別実験に供した。 N.D.: 不実施。 hFcgRIaがg-鎖の同時発現を欠く状況でもやはりパッケージング細胞表面上に安定して発現するかどうかを調べるために、無関係なイソタイプ対照による染色と比較したMoAb22染色後のメジアンFITCシグナルから推定して異なるレベルのhF cgRIaを発現させる２つの選別した細胞集団を、G418を含有する培養培地中で8週間まで培養した。定期的な再分析は、観測期間中常にかなり安定なメジアン蛍光シグナル（非トランスフェクションPA317細胞の1.0に対して、2つの選別した細胞集団では約1.5および2.3）を示した。野生型hFcgRIaのイムノ表現型分析により、3つの異なるエピトープ（そのうちの1つはFc結合ドメインを含む）が明らかになった（Guyreら，J．Immunol．143( 1989)：1650）。選別した細胞集団の1つを、それぞれ2つの非Fc結合エピトープのうちの1つを特定する直接FITC染色（directly FITC-stained）MoAb 22および3 2.2（メダレックス（Medarex）社；ニュージャージー州、アナンデール）を用いて分析した。表2は、両MoAbが細胞表面上に露出したhFcgRIa分子を認識したことを示している。両MoAbを組合わせた時に観測された蛍光の増大は、それらがパッケージング細胞表面上の異なるエピトープに結合することを立証している。IgG1またはIgG2aイソタイプの無関係な非染色（unstained）マウスイムノグロブリン（BDIS）と共に細胞を予備培養しても、MoAb 22および32.2の結合に影響はなかった（示していない）。これらの結果は、正しいイムノ表現型構造の hFcgRIaがレトロウイルスパッケージング細胞系の細胞表面上に発現したことを証明している。 PAFcRから選別された216細胞を表記のFITC標識MoAbと共に培養し、FACSで分析した。 1 陽性スコアに関する域値（treshold）は、抗KLH-FITC染色した試料に対して≧99%陰性細胞に設定した。同種指向性および両種指向性hFcgRIa発現集団を限界希釈法によってクローン化した。12個の独立したE86FcRクローンと11個の独立したPAFcRクローンを増殖し、hFcgRIa発現について分析した。各集団からえた最高レベルのhFcgRIaを発現させる2つのクローンを用いて、パッケージング細胞の細胞表面上でのhFcgRIa発現がレトロウイルス生産に影響を与えるかどうかを調べた。この目的のために、これら4つのクローンとその親パッケージング細胞系から、一般的な条件下に無細胞上清を収集した（コンフルエント細胞単層80cm²あたり10%BCSを含むアルファ改良DMEM 10ml中、32℃で72時間）。それらの上清を、2倍希釈滴定（two-fold dilution titration）で、逆転写酵素活性について分析した（Goffら，J．Viro l．38(1981)：339）。取り込まれた³²P-dTTPの放射強度をX線フィルムへの暴露によって比較したところ、hFcgRIaの発現がウイルス粒子の培養培地中への放出に、2.3倍を超える影響を与えないことがわかった（表3）。 1 抗KLH-FITCと比較したFITC標識化MoAb22+32.2で染色した後の相対メジアン蛍光シグナル。 2 培養上清中のRT活性は、PA317細胞によって放出されたRT活性に対する割合である。 N.D.: 不実施。実施例３組換えレトロウイルスパッケージング細胞系の細胞膜上に発現したhFcgRIaタンパク質によるイムノグロブリン結合レトロウイルスパッケージング細胞の表面上に発現したhFcgRIaが特異的なイムノグロブリン-Fc結合能を有するかどうかを調べるために、PAFcRから選別した 315細胞をIgG1またはIgG2aイソタイプの無関係なマウスイムノグロブリンと共に培養した。FcgRI分子はIgG2a分子と高アフィニティで結合し、IgG1分子と低アフィニティで結合するはずである。表4からわかるように、選別した細胞の約3分の1が少量のhFc gRIaを発現させていることが、低い相対メジアンシグナルを有するMoAb22染色によって示された。PAFcR細胞上のすべてのhFcgRIa分子もまたマウスIgG2aと結合した（同様の陽性細胞率とシグナル強度）が、マウスIgG1とはほとんど結合しなかった。陽性対照として使用したヒト初代単球では、hFcgRIa分子が強く発現し、マウスIgG2aイムノグロブリンを特異的に結合した。しかし、単球上のhFcgRIa 分子がイムノグロブリン類を結合する能力はpRc/CMV-hFcgRIaでトランスフェクションしたパッケージング細胞系で観測されたものより低かった（MoAb22陽性単球の55%がIgG2aとはるかに低いシグナル強度で結合した）。結論として、PAFcR 細胞の表面上に発現したMoAb22結合を特徴とするすべてのhFcgRIa分子は、イムノグロブリンの特異的高アフィニティ結合に関して正しい構造を示す。ヒト初代単球、PA317細胞、またはpRc/CMV-hFcgRIaでトランスフェクションした部分的にhFcgRIaを発現させるPA317細胞（PAFcR選別315）を、まずMoAb22（Ig G1イソタイプ）、抗KLH IgG1、抗KLH IgG2aまたはPBS/1%BSA（「なし」）と共に培養した後、GaM-FITCと共に培養した。陽性細胞率とメジアン蛍光強度をFACSで決定した。 1 GaM-FITCのみと共に培養した細胞と比較した、表記の一次抗体およびGaM-F ITCと共に培養した細胞の相対メジアン蛍光強度。実施例4 ハイブリッドhFcgRIa/MoMuLVエンベロープ遺伝子の構築 hFcgRIaのイムノグロブリン結合特性とエンベロープ糖タンパク質のウイルス取り込みおよび膜融合特性とを有するハイブリッド分子を構築するために、pRc/CMV-hFcgRIa（前記参照）をMo- MuLVenv配列と組合せて使用した（Shinnickら，Nature 293(1981)：543）。２つの異なるハイブリッドhFcgRIa/Mo-MuLV-env構築物を調製した（図3）。どちらの構築物でも、pRc/CVM-hFcgRIa構築物中の3′hFcgRIa配列を3′Mo-MuLVenv配列で置換した。両構築物は、リーダー配列から位置849-852のHinPII部位までのp135 配列を含有する。この断片は61カルボキシ末端ヌクレオチドを除くhFcgRIaの3つの細胞外ドメインを含む。ハイブリッド構築物pRc/CMV-FcRenv-15では、前記p13 5断片を、MoMuLVの位置7195-7200にあるHpaI部位から始まって3′LTRのIR配列中にある位置7823までの断片によってコードされるp15Eenv配列に結合させる。そのために、そのHpaI部位をPCRによってHinPII部位に変換し、NotI部位をPCRによって3′LTR中に導入した。内部SpeI-PvuII断片（nt7487-7747）をクローン化した配列と交換した。hFcgRIa/Mo-MuLV-env接合点の正しい配列と、PCRによって生成した全配列の正しい配列を、配列決定によって確認した。ハイブリッド遺伝子 FcRenv-15は、第3イムノグロブリン様細胞外ループを形成する3′Cys-残基の12 アミノ酸下流にあるArg残基までのhFcgRIaの細胞外ドメインと、最も5′側の5アミノ酸を除く全てのp15Eアミノ酸とを含むインフレーム（in-frame）融合タンパク質をコードする。ハイブリッド構築物pRc/CMV-FcRenv-70を調製するために、5 ′p135断片のHinPII部位を平滑末端にし、BamHI部位を平滑末端にした後のMo-Mu LVのBamHI（位置6537-6542）-PvuII（位置7745-7750）断片と、pRc/CMV-FcRenv- 15からえた3′PvuII-NotI PCR 断片に連結した。この平滑末端HinPIIおよびBamHI部位の連結によりBamHI部位が復活した。hFcgRIa/Mo-MuLV-env接合点の正しい構造を配列決定によって確認した。ハイブリッド遺伝子FcRenv-70は、gp70のアミノ末端ドメイン中のBamHI部位にあるIle残基から始まりgp70の完全なプロリン高含有ヒンジ様領域とカルボキシ末端ドメインおよび完全なp15Eペプチドを含むMo-MuLVenv配列に結合した、pR c/CMV-FcRenv-15について説明したものと同じhFcgRIa断片を含む。 1996年7月24日、出願人らはthe European Collection of Cell Cultures（ECA CC）（英国、ウィルトシア州、ソールズベリー）に、プラスミドpRc/CMV-FcRenv -15（ECACC受託番号P96072515）とプラスミドpRc/CMV-FcRenv-70（ECACC受託番号P96072514）を寄託した。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の規定とその規則のもとになされた。実施例5 ハイブリッドhFcgRIa/Mo-MuLVエンベロープ遺伝子FcRenv-15およびFcRenv-70はイムノグロブリン結合能を有する正しい分子量のタンパク質をコードする融合遺伝子FcRenv-15およびFcRenv-70がイムノグロブリン結合特性を有する機能的なハイブリッド分子をコードするかどうかを調べるために、pRc/CMV-FcRenv -15およびpRc/CMV-FcRenv-70構築物（実施例4）を鋳型として、共役in vitor転写-翻訳を行なった。転写はpRc/CMVベクター中の遺伝子挿入物の上流にあるT7プロモーターで開始された。1μgのpRc/CMV-FcRenv-15またはpRc/CMV-FcRenv-70 D NAを、20単位のRNasinリボヌクレアーゼ阻害剤（プロメガ（Promega）社；ウィスコンシン州、マディソン）と20μCiの³H-ロイシン（アマルシャム（Amersham）社；英国、バッキンガムシア）を含む25μlのロイシン非含有T7 TnT共役網状赤血球溶解液反応混合物（プロメガ（Promega）社）に加えた。その反応を製造者が提供する指針に従って30℃で120分間進行させた。対照反応は、DNA鋳型なしで、あるいは無関係な対照DNA鋳型（T7 TnT共役網状赤血球溶解液系と共に提供されたホタルルシフェラーゼ対照DNA）を使って、あるいは野生型hFCgRIaをコードする陽性対照pRc/CMV-hFcgRIaを使って行なった。その反応混合物の5μlに、（最終濃度が62.5mMトリスpH6.8、10%グリセロール、2%β-メルカプトエタノール、0.5%SDS、0.0025%ブロモフェノールブルーとなるように）20μlのSDS-PAGE充填緩衝液を加えた。残りの20μlを180μlの沈降緩衝液（0.1mMのプロテアーゼ阻害剤PMSF、10μg/mlのアプロチニン、5μg/mlのペプスタチン、10μg/mlのトリプシン阻害剤および10μg/mlのロイペプチンを含む10mMトリス塩酸pH7.5、150mM NaCl、5mM EDTA、1%トリトン-100）で希釈した。次に、10μlのKLH-aKLH-IgG2a-セファローススラリーを加え、室温で90分間の傾斜回転によって混合した。該スラリーは次の操作に従って調製した。まず、16 .4mgのキーホールリムペットヘモシアニン（KLH；シグマ（Sigma）社；ミズーリ州、セントルイス）を1.8mg/mlの濃度で、1gのCNBr活性化セファロース4B（ファルマシアバイオテク（Pharmacia Biotech）；スウェーデン、ウプサラ）に、製造者の指示に従って結合した。そのKLH-セファロース生成物を、0.002%アジ化ナトリウムの入ったPBS中、4℃ で保存した。次に、KLH-セファロースを50μg/mlの抗KLH-IgG2aモノクローナル抗体（ベクトン−ディキンソンイムノサイトメトリーシステムズ（Beckton-Di ckinson Immunocytometry Systems）社；カリフォルニア州、サンホセ）と1:1の比で混合し、室温で30分間保温した。最後に、そのKLH-aKLH-IgG2a-セファロースビーズを20体積のPBSで2回洗浄した。この操作により、外側に突き出たFcドメインを有するIgG2aイソタイプのイムノグロブリンで覆われたセファロースビーズがえられるはずである。in vitro転写-翻訳反応産物をKLH-aKLH-IgG2a-セファロースと共に保温した後、そのKLH-aKLH-IgG2a-セファロースビーズを遠心分離し、その沈降上清を取り出した。5μlの沈降上清に20μlのSDS-PAGE充填緩衝液を前述のように加えた。ペレット化したKLH-aKLH-IgG2a-セファロースビーズを1 mlの沈降緩衝液で6回洗浄した。最後の遠心分離後、25μlのSDS-PAGE充填緩衝液をそのペレットに加えた。前述の操作により、3種類の異なる各共役in vitro転写-翻訳反応試料（すなわち全反応産物、イムノグロブリンに結合した沈降産物および沈降上清中の残りの物質）がえられるはずである。これら試料の10μlを2 分間85℃で加熱した後、一般的な操作（Laemmli，Nature 227(1970)：680）に従って、10%ゲルによるSDS-PAGEで分離した。分離後、ゲル中のタンパク質を水／イソプロパノール／酢酸（65%/25%/10%体積）中、室温で30分間固定した後、シグナルの蛍光間接撮影増幅のため、アンプリファイ（Amplify）（アマルシャム（Amerhsam）社）中、室温で15分間保温した。最後に、そのゲルを減圧下に80℃ で90分間乾燥し、増幅スクリーンを使ってX線フィルムに暴露した。第5図にこの実験の結果を示す。これからわかるように、野生型hFcgRIaまたはhFcgRIa/Mo-MuLVエンベロープ融合分子をコードする遺伝子を有する構築物はすべて、予想される分子量（すなわちhFcGRIaについては42.5kD、FcRevn-15については52kD、およびFcRenv-70については75.6kD）に相当する移動パターンを示すタンパク質を発現させた。後者の遺伝子はさらに、より小さいタンパク質産物をもコードする。この分子はおそらくp15Eペプチド放出後の約60kDのタンパク質分解的にプロセシングされたタンパク質を表わすのだろう。また第5図からわかるように、これらのタンパク質産物はすべて、無関係な対照タンパク質ルシフェラーゼとは対照的に、KLH-aKLH-IgG2a-セファロースビーズによって沈降した。このことは、野生型hFcgRIaのイムノグロブリン結合特性が、hFcgRIaの3つの細胞外ドメインをMo-MuLVエンベロープ配列に融合した後にも保持されることを立証している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ファンボーセヘム、フィクトルウィレムオランダ王国、エヌエル−2288 ヘーイェーリースヴィーク、ランゲクレイウェッヒ 151

Claims

【特許請求の範囲】１．標的細胞に遺伝物質を送達する方法であって、、目的の遺伝子をコードする分子、ウイルス由来のキャプシドまたはエンベロープおよび特異的結合対の第１のメンバーからなる遺伝子送達ビヒクルを調製すること、該特異的結合対の相補的なメンバーである部分および標的細胞の表面に関連する分子にアフィニティを有する部分からなるコンジュゲートを調製すること、該特異的結合対のメンバーが結合できるように該遺伝子送達ビヒクルと該コンジュゲートを接触させること、および該コンジュゲートと該遺伝子送達ビヒクルの複合体を該標的細胞に送達することからなる方法。２．該特異的結合対の第１のメンバーが標的細胞の表面に関連する分子に特異的なアフィニティを有しない請求の範囲第１項記載の方法。３．目的の遺伝子産物をコードする発現組換え核酸分子、ウイルス由来のキャプシドまたはエンベロープ、およびその相手部分が標的細胞の表面に直接的に関連していない特異的結合対のメンバーからなる請求の範囲第１項または第２項記載の方法に用いるための遺伝子送達ビヒクル。４．エンベロープまたはキャプシド物質が標的細胞に特異的に結合できない請求の範囲第３項記載の遺伝子送達ビヒクル。５．標的細胞の表面に関連する標的分子に結合することができる標的指向部と連結した特異的結合対のメンバーの相手部分からなる標的細胞に、請求の範囲第３項または第４項記載の標的指向遺伝子送達ビヒクルを向かわせる、請求の範囲第１項または第２項記載の方法に用いるためのコンジュゲート。６．請求の範囲第５項記載のコンジュゲートと連結した、請求の範囲第３項または第４項記載の遺伝子送達ビヒクルからなる、標的指向遺伝子送達ビヒクル複合体。７．請求の範囲第３項乃至第４項のいずれかに記載の遺伝子送達ビヒクルおよび標的指向部に連結した特異的結合対の相手メンバーの少なくとも１つのコンジュゲートからなり、該標的指向部は標的細胞の表面に関連する標的分子に結合することができる、標的細胞に遺伝物質を送達するための部品のキット。８．該特異的結合対のメンバーがイムノグロブリン結合部であり、かつその相手部分がイムノグロブリンまたはその誘導体もしくは断片である請求の範囲第７項記載の部品のキット。９．該イムノグロブリン結合部がイムノグロブリンの定常領域に結合することができる請求の範囲第８項記載の部品のキット。 10．該イムノグロブリン結合部がプロテインＡ、プロテインＧまたはFcレセプターである請求の範囲第９項記載の部品のキット。 11．該特異的結合対のメンバーがビオチンであり、かつその相手部分がアビジンまたはストレプトアビジンである請求の範囲第７項記載の部品のキット。 12．該特異的結合対のメンバーがアビジンまたはストレプトアビジンであり、かつその相手部分がビオチンである請求の範囲第７項記載の部品のキット。 13．該標的指向部が抗体またはその断片もしくは誘導体であり、標的細胞の表面に関連する標的分子を認識する請求の範囲第７項乃至第12項のいずれかに記載の部品のキット。 14．該標的分子がレセプターであり、そのレセプターのリガンドが標的指向部である請求の範囲第７項乃至第１２項のいずれかに記載の部品のキット。 15．該遺伝子送達ビヒクルがアデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたはレトロウイルスに由来する請求の範囲第７項乃至第14項のいずれかに記載の部品のキット。 16．同じ相手部分メンバーであるが異なる標的指向部からなる多数の異なるコンジュゲートからなる請求の範囲第７項乃至第15項のいずれかに記載の部品のキット。