FR2649119A1 - Procede de pilotage de retrovirus en utilisant des complexes bifonctionnels - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un procédé permettant d'infecter des cellules par des virus, caractérisé en ce qu'on infecte lesdites cellules à l'aide d'un complexe comportant au moins un élément bifonctionnel présentant au moins une fonction reconnaissant un élément spécifique accessible desdites cellules et une fonction reconnaissant un élément spécifique accessible desdits virus.
Description
La présente invention a été faite au Laboratoire de Biologie
Moléculaire de I'UNIVERSITE DES SCIENCES ET TECHNIQUES DU
LANGUEDOC, laboratoire associé au Centre National de la Recherche
Scientifique.
Moléculaire de I'UNIVERSITE DES SCIENCES ET TECHNIQUES DU
LANGUEDOC, laboratoire associé au Centre National de la Recherche
Scientifique.
La présente invention concerne un procédé permettant le pilotage de virus vers des cellules cibles grâce à des complexes spécifiques ainsi que les applications de ce procédé dans le domaine des biotechnologies.
Dans le domaine des biotechnologies, I'utilisation des rétrovirus recombinants est devenue maintenant très courante pour l'obtention de cellules eucaryotes supérieures exprimant, par exemple, des protéines particulières. Bien que ces rétrovirus -recombinants soient des vecteurs d'information génétique efficaces, ils présentent certaines limitations dans la mesure où ces virus ont une spécificité tissulaire d'infection et d'expression qui n'est pas actuellement maîtrisée.
L'objet de la présente invention est de permettre le pilotage de virus tels que les rétrovirus murins vers des cellules non murines, tout particulièrement des cellules humaines. Comme on pourra s'en rendre compte dans ce qui va suivre, l'intérêt du procédé selon la présente invention est considérable.
Plus particulièrement, il s'agit d'un procédé permettant d'infecter des cellules par des virus, caractérisé en ce que - on infecte lesdites cellules à l'aide d'un complexe comportant au moins
un élément bifonctionnel présentant au moins une fonction reconnais
sant un élément spécifique accessible desdites cellules et une fonction
reconnaissant un élément spécifique accessible desdits virus.
un élément bifonctionnel présentant au moins une fonction reconnais
sant un élément spécifique accessible desdites cellules et une fonction
reconnaissant un élément spécifique accessible desdits virus.
Bien que le procédé soit plus particulièrement destiné aux rétrovirus, il est certain qu'il peut être utilisé pour d'autres virus qui sont aussi tissus spécifiques, ceci afin de changer leur spécificité ou bien plus simplement pour augmenter le rendement d'infection dans le cas de virus ayant des taux d'infection relativement faibles.
Parmi les éléments -spécifiques accessibles du virus, il faudra essentiellement tenir compte des protéines d'enveloppe, la fonction correspondante de l'élément bifonctionnel sera alors l'anticorps reconnais sant cette protéine. Dans le cycle d'infection rétroviral, cette glycoprotéine d'enveloppe joue un rôle essentiel puisqu'elle assure la fixation du virus au récepteur membranaire cellulaire spécifique. Il s'agit donc là d'un élément particulièrement intéressant à mettre en oeuvre dans le cadre du procédé de la présente invention.
Pour ce qui concerne les éléments spécifiques accessibles des cellules cibles, il s'agira de façon générale d'un marqueur de la membrane cellulaire, plus particulièrement il peut s'agir d'un récepteur ou d'un antigène de surface, les fonctions correspondantes étant alors soit une protéine soit l'anticorps correspondant à l'antigène.
Parmi les marqueurs des membranes cellulaires, il faut citer plus particulièrement les marqueurs suivants qui sont essentiellement des marqueurs de cellules humaines, dans la mesure où le procédé selon la présente invention est plus particulièrement intéressant pour infecter des cellules humaines avec des virus écotropes non humains - tout d'abord les marqueurs d'histocompatibilité de classe 1 ou 2, - les récepteurs spécifiques de certains virus tels que la protéine CD4, la
protéine CD21, - des récepteurs de différents facteurs comme le facteur de croissance
épidermique, - des récepteurs à l'interleukîne tel que le récepteur de l'interleukine 2, - et de façon générale, l'ensemble des récepteurs qui s'expriment à
l'extérieur de la membrane comme par exemple les récepteurs à
l'acétylcholine, les récepteurs béta-adrénergiques, ainsi que les
glycoprotéines comme par exemple les sialoglycoprotéines.
protéine CD21, - des récepteurs de différents facteurs comme le facteur de croissance
épidermique, - des récepteurs à l'interleukîne tel que le récepteur de l'interleukine 2, - et de façon générale, l'ensemble des récepteurs qui s'expriment à
l'extérieur de la membrane comme par exemple les récepteurs à
l'acétylcholine, les récepteurs béta-adrénergiques, ainsi que les
glycoprotéines comme par exemple les sialoglycoprotéines.
Les récepteurs mentionnés précédemment sont des récepteurs qui sont connus pour être reconnus par certains virus ou intervenir dans le processus d'infection.
L'un des objets de la présente invention est de pouvoir utiliser ce type de récepteur pour l'infection par des virus différents.
Ainsi, bien que cela ne soit qu'un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, il peut être intéressant d'utiliser comme récepteur au niveau cellulaire les récepteurs qui sont déjà connus pour être des récepteurs de virus ou intervenir dans le processus d'infection.
De même, les récepteurs qui peuvent être internalisés par endocytose doivent favoriser l'infection par le virus fixé au complexe.
C'est d'ailleurs pourquoi dans les exemples qui suivent on a infecté des cellules humaines naturellement résistantes avec un rétrovirus recombinant écotropique murin en utilisant l'antigène d'histocompatibilité
HLA classe 1 car, - cet antigène est représenté dans la plupart des cellules humaines, - il est internalisé par endocytose, et - il est connu pour être le récepteur de virus ADNa, notamment le virus à
ADN "Semliki Forest".
HLA classe 1 car, - cet antigène est représenté dans la plupart des cellules humaines, - il est internalisé par endocytose, et - il est connu pour être le récepteur de virus ADNa, notamment le virus à
ADN "Semliki Forest".
Le virus recombinant murin utilisé est un virus dérivant du virus de Moloney 191LU qui a été très largement utilisé dans la technique des
ADN recombinants, notamment à titre de véhicule du gène de résistance au
G418, lequel confère ainsi une caractéristique aisément sélectionnable aux cellules infectées.
ADN recombinants, notamment à titre de véhicule du gène de résistance au
G418, lequel confère ainsi une caractéristique aisément sélectionnable aux cellules infectées.
De façon plus précise, I'élément bifonctionnel est en général un composé chimique susceptible de se lier par des liaisons covalentes ou non covalentes à des protéines ou à des anticorps qui constituent les fonctions reconnaissant les éléments spécifiques des cellules et des virus.
II existe deux possibilités pour la mise en oeuvre du procédé.
Il est possible d'infecter les cellules avec le complexe qui a été préparé préalablement, c'est-à-dire que les deux fonctions ont été placées sur l'élément bifonctionnel, le complexe étant alors ajouté aux cellules soit dans le milieu de culture soit par tout moyen approprié, mais il est également possible de construire le complexe au sein de la culture contenant les cellules ou sur les cellules par ajout des éléments constituant le complexe.
Les techniques permettant de greffer des chaînes carbonées sur les anticorps monoclonaux notamment sont connues.
Lorsque le complexe est préparé in situ, on peut utiliser par exemple des fonctions comportant un élément permettant une liaison avec l'autre fonction, par exemple cette fonction peut être biotinylée, ce sera le cas d'un anticorps ou d'une protéine, et elle pourra être fixée à la seconde fonction de reconnaissance qui pourra être pourvue d'une fonction avidine ou streptavidine afin de former la liaison avidine/biotine. Il est possible également de prévoir que les deux fonctions seront biotinylées, qu'elles seront alors reliées par un pont streptavidine par exemple.
L'intérêt de la préparation in situ du complexe doit être considéré en particulier lors de l'infection de cellules humaines. En effet, grâce à la préparation in situ du complexe, le manipulateur n'a jamais à manipuler un système complet potentiellement infectieux pour des cellules humaines, en effet, il ne manipule d'un côté qu'un virus ayant une spécificité murine et de l'autre une protéine ou un anticorps reconnaissant des cellules humaines mais ne présentant évidemment aucune potentialité infectieuse.
Lorsque le complexe est formé, la fonction reconnaissant le site spécifique des cellules vient s'accrocher sur son site de reconnaissance et entraîne le virus fixé à l'autre extrémité de l'élément, ce qui conduit généralement à une pénétration du virus, en particulier lorsque l'élément spécifique de reconnaissance est endocyté, ce qui conduit à l'endocytose de l'ensemble de l'élément, y compris le virus.
Ce procédé permet donc d'infecter des cellules par des virus qui aux origines présente une spécificité différente.
Les applications de ce procédé sont multiples.
Tout d'abord, les virus utilisables peuvent être de deux types, il peut s'agir de virus naturels ou de virus recombinants. Lorsqu;on utilise des virus naturels, le procédé selon la présente invention permettra des progrès considérables dans certains types d'études fondamentales ou même appliquées, dans la mesure où il sera possible de mettre en évidence l'interaction de virus avec des cellules qu'ils n'ont jamais pu infecter, mais bien évidemment il sera plus intéressant de pouvoir profiter de certaines des propriétés de ces virus naturels, comme par exemple leur potentiel oncogène, afin de permettre d'obtenir des lignées immortelles de cellules qui actuellement étaient soit non immortalisables car non spécifiques pour ce type de virus, soit présentes en si petites quantités que l'infection était pratiquement impossible.
Dans le cas de virus recombinants, il est bien entendu possible de prévoir l'expression de séquences d'ADN hétérologues par des cellules infectées, lesdites cellules étant les cellules exprimant naturellement l'ADN hétérologue en cause, mais leur infection par un virus recombinant n'étant pas possible compte tenu de sa spécificité cellulaire.
Ainsi, après infection in vitro de cellules souches du système hématopoltéique par des rétrovirus recombinants porteurs de gènes correcteurs, on peut envisager de guérir des patients atteints de déficits immunitaires absolus et d'anomalies de l'hémoglobine, par greffe de cette moëlie osseuse autologue. De la même manière, et dans l'hypothèse où les rétrovirus recombinants porteraient des informations génétiques permettant si elles étaient exprimées dans les lymphocytes T d'inhibier l'infection par des virus tels que le virus HIV, on pourrait éventuellement avoir là un moyen de lutte contre le SIDA.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lecture des exemples ci-après.
EXEMPLE I
Culture de cellules et production de virus
Les lignées de cellules HeLa, HePG2 et A431 sont disponibles auprès de "l'American Type Culture -Collection".
Culture de cellules et production de virus
Les lignées de cellules HeLa, HePG2 et A431 sont disponibles auprès de "l'American Type Culture -Collection".
Elles ont été cultivées dans du milieu de culture RPMI 164G (Gibco) additionné de 10 96 de sérum de foetus de veau (Boerhinger
Manheim).
Manheim).
La lignée cellulaire productrice des rétrovirus pZip-neo-Py
LT est disponible chez Jat et al., (1986) et a été cultivée dans du milieu de culture DMEM (Gibco) supplémenté avec 10 am de sérum de foetus de veau.
LT est disponible chez Jat et al., (1986) et a été cultivée dans du milieu de culture DMEM (Gibco) supplémenté avec 10 am de sérum de foetus de veau.
Les stocks viraux et ont préparés comme suit
Les surnageants de cultures de cellules confluentes pendant 24 heures ont été filtrés deux fois à travers des filtres de nitrocellulose de 0,2 llm. Les suspensions virales sont congelées dans l'azote liquide et entreposées à -800C jusqu'à leur utilisation. Le complément sérique a été inactivé à la chaleur par passage à 560C pendant 30 minutes AnticorPs
Les anticorps MHC classe I tu.9.12.1) et classe Il (S Classe 11) sont produits respectivement par Immunotech et Sanofi Recherche. Les anticorps correspondant à l'antigène T du polyome proviennent de
Oncoscience. Les hybridomes 273, 500 et 615 anti-gp70 proviennent de
Chesebro et al., (1981, 1983, 1985).Les anticorps ont été purifiés par chromatographie par affinité sur une protéine A sépharose (Pharmacia) comme décrit par le founisseur. La biotinylation est conduite en présence d'ester biotinyl-N-hydroxy-succimide (Sigma) suivant la méthode de Lee et
Conrad (1984). De un à trois résidus sont couplés de manière covalente à chaque molécule d'immunoglobuline. La Streptavidine provient de
Amersham. Les anticorps immunofluorescents de lapin dirigés contre les immunoglobulines de souris proviennent de chez Tebu et sont utilisés selon les spécifications du fournisseur.
Les surnageants de cultures de cellules confluentes pendant 24 heures ont été filtrés deux fois à travers des filtres de nitrocellulose de 0,2 llm. Les suspensions virales sont congelées dans l'azote liquide et entreposées à -800C jusqu'à leur utilisation. Le complément sérique a été inactivé à la chaleur par passage à 560C pendant 30 minutes AnticorPs
Les anticorps MHC classe I tu.9.12.1) et classe Il (S Classe 11) sont produits respectivement par Immunotech et Sanofi Recherche. Les anticorps correspondant à l'antigène T du polyome proviennent de
Oncoscience. Les hybridomes 273, 500 et 615 anti-gp70 proviennent de
Chesebro et al., (1981, 1983, 1985).Les anticorps ont été purifiés par chromatographie par affinité sur une protéine A sépharose (Pharmacia) comme décrit par le founisseur. La biotinylation est conduite en présence d'ester biotinyl-N-hydroxy-succimide (Sigma) suivant la méthode de Lee et
Conrad (1984). De un à trois résidus sont couplés de manière covalente à chaque molécule d'immunoglobuline. La Streptavidine provient de
Amersham. Les anticorps immunofluorescents de lapin dirigés contre les immunoglobulines de souris proviennent de chez Tebu et sont utilisés selon les spécifications du fournisseur.
Expériences d'infection Dans une expérience typique, 1 G5 cellules sont placées dans une boîte de culture de 2 cm de diamètre et incubées à 37"C pendant approximativement 24 heures (un temps de doublement). Le milieu de culture est retiré et d'autres expériences sont pratiquées à 0 C. Les cellules sont lavées trois fois avec 5 ml de PPS froid (130 mM de Nazi, 3,7 mM de KCl, 6,4 mM de NaH2PO4, 1,5 mM de KH2PO4, pH 7,2) et laissées sur de la glace pendant une période de 15 minutes en présence de 0,5 ml de
PBS pour stopper tous les processus d'internalisation.Les anticorps biotinylés anti-HLA sont ajoutés à une concentration de 200 ng/ml. 1 heure plus tard, les cellules sont lavées trois fois avec du PBS et ensuite incubées en présence de 2 ug/ml de streptavidine (Pierce) dans un volume final de 0,5 ml de PBS. Pendant le même temps, 2 IJg/ml d'anticorps biotinylés anti-gp70 sont ajoutés à 5 x 104 virus dans 1 ml de milieu de culture. Les cellules sont lavées trois fois avec du PBS et la suspension de virus est ajoutée. I heure plus tard les boîtes de culture sont transférées dans un incubateur à 370C pour permettre l'internalisation du virus et on laisse ainsi pour une période supplémentaire de 2 heures.Les cellules sont lavées à nouveau, mais avec le milieu de culture, et sont finalement cultivées dans des conditions standard Du G418 (Gibco-BRL) est ajouté 2 jours plus tard à une concentration de 1 mg/ml. Le milieu sélectif est changé tous les trois à quatre jours. Les clones résistants sont dénombrés après 10 à 12 jours.
PBS pour stopper tous les processus d'internalisation.Les anticorps biotinylés anti-HLA sont ajoutés à une concentration de 200 ng/ml. 1 heure plus tard, les cellules sont lavées trois fois avec du PBS et ensuite incubées en présence de 2 ug/ml de streptavidine (Pierce) dans un volume final de 0,5 ml de PBS. Pendant le même temps, 2 IJg/ml d'anticorps biotinylés anti-gp70 sont ajoutés à 5 x 104 virus dans 1 ml de milieu de culture. Les cellules sont lavées trois fois avec du PBS et la suspension de virus est ajoutée. I heure plus tard les boîtes de culture sont transférées dans un incubateur à 370C pour permettre l'internalisation du virus et on laisse ainsi pour une période supplémentaire de 2 heures.Les cellules sont lavées à nouveau, mais avec le milieu de culture, et sont finalement cultivées dans des conditions standard Du G418 (Gibco-BRL) est ajouté 2 jours plus tard à une concentration de 1 mg/ml. Le milieu sélectif est changé tous les trois à quatre jours. Les clones résistants sont dénombrés après 10 à 12 jours.
Dans ces conditions, de 50 à 80 clones se sont développés (Tableau 1 A). De façon à écarter la possibilité d'une infection par des virus contaminants xénotropiques ou amphotropiques ou par ceux absorbés non spécifiquement sur la membrane hôte, toutes les combinaisons de cellules de virus et d'anticorps sont testées. En aucun cas, les cellules n'ont survécu au traitement au G418 en l'absence d'un quelconque des composants du complexe.De plus, la voie d'infection apparaît comme étant spécifique des antigènes MHC classe I puisque dans des expériences parallèles de contrôle les anticorps anti-MHC classe Il (également capables de conduire à une infection par le rétrovirus dans les conditions appropriées; voir ci-dessus) n'ont pas permis une infection des cellules HeLa MHC classe ll-négatives (tableau 1B).
On a confirmé que les provirus étaient intégrés dans le génome des cellules résistantes au G4l8. Les ADN provenant de différents clones choisis au hasard ont été extraits et analysés par la technique de "Southern blotting". Comme on s'y attendait, chaque clonie s'est révélé avoir intégré un seul provirus. Comme preuve supplémentaire de l'infection, on a montré par immunofluorescence que 100 % des cellules exprimaient l'antigène polyoma T après infection par le pZip-neo-PyLT. De manière surprenante, une analyse approfondie a permis de distinguer 3 groupes de clones : (i) ceux dans lesquels la protéine a été trouvée comme étant nucléaire, comme c'est habituellement le cas (Jat et api., 1986) ; (ii) ceux dans lesquels la protéine était essentiellement cytoplasmique, et (iii) ceux dans lesquels la protéine a été trouvée comme étant à la fois cytoplasmique et nucléaire. Il est peu probable que les différences correspondent à des artefacts expérimentaux puisque les cellules HeLa infectées par des rétrovirus n'exprimant pas l'antigène polyoma T réagissaient négativement aux expériences d'immunofluorescence.
EXEMPLE 2
Sensibilité différentielle des cellules humaines à l'infection rétrovirale par l'intermédiaire des antigènes MHC classe I
L'étape suivante des expériences a été d'examiner si l'infection par les rétrovirus par l'intermédiaire des antigènes MHC classe I pouvait être étendue à des types cellulaires autres que HeLa. Les expériences d'infection ont été conduites en parallèle avec deux autres lignées cellulaires humaines : l'hépatoma HepC2 et la tumeur épithéliale du cervix A431. Comme il est montré dans le tableau 1C, chaque type cellulaire s'est révélé être infecté, quoique avec des efficacités relativement différente (différence d'un facteur 100 entre HepG2 et A431). Ceci démontre que l'approche est d'un intérêt général.
Sensibilité différentielle des cellules humaines à l'infection rétrovirale par l'intermédiaire des antigènes MHC classe I
L'étape suivante des expériences a été d'examiner si l'infection par les rétrovirus par l'intermédiaire des antigènes MHC classe I pouvait être étendue à des types cellulaires autres que HeLa. Les expériences d'infection ont été conduites en parallèle avec deux autres lignées cellulaires humaines : l'hépatoma HepC2 et la tumeur épithéliale du cervix A431. Comme il est montré dans le tableau 1C, chaque type cellulaire s'est révélé être infecté, quoique avec des efficacités relativement différente (différence d'un facteur 100 entre HepG2 et A431). Ceci démontre que l'approche est d'un intérêt général.
EXEMPLE 3 infection de cellules humaines HeLa par des rétrovirus écotropiques murins sous la médiation des antigènes MHC classe II
On infecte ensuite des cellules humaines via les antigènes d'histocompatibilité HLA classe II. Au contraire des antigènes de classe I ces derniers ne sont probablement pas des récepteurs pour les virus mais sont vraisemblablement des molécules "helper" favorisant l'internalisation du virus d'Epstein-Barr (voir tableau 1). De plus, comme ils sont inductibles par l'înerféron gamma, ils offrent un excellent contrôle de la spécificité de la voie de pénétration du virus dans les cellules.
On infecte ensuite des cellules humaines via les antigènes d'histocompatibilité HLA classe II. Au contraire des antigènes de classe I ces derniers ne sont probablement pas des récepteurs pour les virus mais sont vraisemblablement des molécules "helper" favorisant l'internalisation du virus d'Epstein-Barr (voir tableau 1). De plus, comme ils sont inductibles par l'înerféron gamma, ils offrent un excellent contrôle de la spécificité de la voie de pénétration du virus dans les cellules.
L'induction d'antigènes HLA classe II est accomplie de la manière suivante : 5 x 104 cellules sont placées comme ci-dessus. Le jour suivant 50 unités/ml d'interféron gamma humain recombinant (Rhone
Poulenc) sont ajoutés pendant une période de 16 heures. Les expériences d'infection sont pratiquées 2 jours plus tard comme décrit ci-dessus. Une quantité de 50 unités/ml est déterminée comme étant la concentration optimale pour induire les antigènes MHC classe II à la surface de la cellule sans inhiber les croissances cellulaires et sans induire un état antiviral comme on l'a déterminé en dosant la production de virus Vesicular Stomatitis par des cellules HeLa (Michèle Silhol).
Poulenc) sont ajoutés pendant une période de 16 heures. Les expériences d'infection sont pratiquées 2 jours plus tard comme décrit ci-dessus. Une quantité de 50 unités/ml est déterminée comme étant la concentration optimale pour induire les antigènes MHC classe II à la surface de la cellule sans inhiber les croissances cellulaires et sans induire un état antiviral comme on l'a déterminé en dosant la production de virus Vesicular Stomatitis par des cellules HeLa (Michèle Silhol).
A cause du temps de latence avant l'apparition des antigènes de classe Il à la surface de la cellule, I'infection est pratiquée 72 heures plus tard. Les conditions expérimentales sont comme décrites ci-dessus, excepté qu'un anticorps monoclonal non polymorphe anti-classe Il (S-classe ll; Sanofi Recherche) est utilisé ici. De la même manière que que l'on a observé avec les antigènes HLA classe I, les clones G418 résistants sont obtenus seulement quand le complexe anticorps bifonctionnel entier est ajouté aux cellules traitées à l'interféron gamma. Le tableau 1B montre que l'infection des cellules HeLa via les antigènes HLA classe II est de 4 à 6 fois plus efficace que via les antigènes de HLA classe I
TABLEAU 1
INFECTION DE CELLULES HUMAINES PAR DES RETROVIRUS
A ECOTROPIE MURINE PAR L'INTERMEDIAIRE D'UN ANTIGENE
D'HISTOCOMPATIBILITE DE CLASSE I ET DE CLASSE II
(Les résultats sont en nombre de clones résistant au G418)
A B
Classe I Classe Il Interféron gamma complexe incomplet 0 0 0 complexe complet 50-80 0 350-5G0
C
Hela MepG2 A431
1 0,2 20
TABLEAU 1
INFECTION DE CELLULES HUMAINES PAR DES RETROVIRUS
A ECOTROPIE MURINE PAR L'INTERMEDIAIRE D'UN ANTIGENE
D'HISTOCOMPATIBILITE DE CLASSE I ET DE CLASSE II
(Les résultats sont en nombre de clones résistant au G418)
A B
Classe I Classe Il Interféron gamma complexe incomplet 0 0 0 complexe complet 50-80 0 350-5G0
C
Hela MepG2 A431
1 0,2 20
Claims (15)
1) Procédé permettant d'infecter des cellules par des virus, caractérisé en ce que : - on infecte lesdites cellules à l'aide d'un complexe comportant au moins
un élément bifonctionnel présentant au moins une fonction reconnais
sant un élément spécifique accessible desdites cellules et une fonction
reconnaissant un élément spécifique accessible desdits virus.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'élément spécifique accessible du virus est une protéine d'enveloppe et la fonction correspondante l'anticorps reconnaissant cette protéine.
3) Procédé selon l'une des revendications I et 2, caractérisé en ce que l'élément spécifique accessible desdites cellules est un marqueur de la membrane cellulaire.
4) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'élément spécifique accessible desdites cellules- est un récepteur ou un antigène de surface et en ce que la fonction correspondante est une protéine ou un anticorps correspondant à l'antigène.
5) Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que l'élément bifonctionnel est un composé chimique susceptible de se lier par des liaisons covalentes ou non covalentes à des protéines ou des anticorps.
6) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on infecte les cellules avec le complexe qui a été préparé préalablement.
7) Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'on infecte les cellules avec le complexe préparé au sein de la culture contenant les cellules par ajout des éléments constituant le complexe.
8) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'au moins l'une des fonctions comporte un élément permettant une liaison dans le milieu de culture avec l'autre fonction.
9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que les deux fonctions sont biotinylées et en ce que l'on forme le complexe avec de l'avidine ou de la streptavidine.
10) Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le virus est un virus recombinant comportant un ADN hétérologue.
11) Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que le virus est un rétrovirus et en ce que l'ADN hétérologue est cloné dans une partie non essentielle du rétrovirus.
12) Procédé selon l'une des revendications 10 et Il, caractérisé en ce que ltADN hétérologue est destiné à être exprimé par les cellules en cause.
13) Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le virus est un virus oncogène.
14) Procédé selon l'une des revendications t à 13, caractérisé en ce que le virus est un virus écotrope non humain et les cellules cibles des cellules humaines.
15) Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'élément spécifique accessible des cellules humaines est un antigène d'histocompatibilite.
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|---|---|---|---|
| FR8908839A FR2649119A1 (fr) | 1989-06-30 | 1989-06-30 | Procede de pilotage de retrovirus en utilisant des complexes bifonctionnels |
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| Publication Number | Publication Date |
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