WO2006082958A1

WO2006082958A1 - レトロウイルスの保存方法

Info

Publication number: WO2006082958A1
Application number: PCT/JP2006/301971
Authority: WO
Inventors: Hideto Chono; Yasushi Katayama; Hiromi Okuyama; Junichi Mineno; Kiyozo Asada; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc.
Priority date: 2005-02-07
Filing date: 2006-02-06
Publication date: 2006-08-10
Also published as: EP1847596A1; KR101100691B1; US20130102048A1; JP5615321B2; EP1847596A4; EP1847596B1; CN101115830B; JP2012210218A; KR20110123813A; US8852915B2; JPWO2006082958A1; KR20070101372A; KR101174341B1; CN101115830A; US20090011485A1

Abstract

　固相に固定化されたレトロウイルス結合活性を有する物質の存在下にレトロウイルスを維持することを特徴とするレトロウイルスの保存方法。レトロウイルス結合活性を有する物質が固定化された固相を保持する容器内に、前記レトロウイルス結合活性を有する物質と結合した状態で封入されていることを特徴とするレトロウイルス組成物。

Description

明細書

レトロウイルスの保存方法

技術分野

[0001] 本発明は医学、薬学、農林水産学、食品学の分野において、細胞に遺伝子導入して形質転換するために用いるレトロウイルスベクターの精製方法、保存方法、ならびにそれに関連する一連の技術に関する。

背景技術

[0002] レトロウイルスベクターは宿主染色体に目的遺伝子を確実に組み込むことができるベクターであることから、遺伝子治療の領域にぉ、ては造血幹細胞や末梢血リンパ球などを標的とした Ex vivo遺伝子治療プロトコールを中心に広範に用いられてヽるベクターである。また、基礎研究の分野においても、安定した外来 (挿入)遺伝子発現レベルが獲得できることから、遺伝子発現解析のツールとして広範に用いられてヽるベクターである。通常、レトロウイルスベクターは産生細胞の培養上清をフィルターろ過して用いられる力 Ex vivo遺伝子治療プロトコールに用いる場合には、更なる精製がなされる場合もある。しかし、ウィルスベクターの精製は煩雑であること、回収率が悪いことが問題点として挙げられ、精製したウィルスベクターの安定性に関して、学術論文での報告は見当たらない。

[0003] レトロウイルスベクター産生細胞の培養上清は、通常、フィルターろ過された後、超低温フリーザーで凍結された状態で保存される。融解後の溶液状態でのベクターの安定性は低ぐ報告されている半減期は 4°Cで 92時間、 0°Cで 18〜64時間、 32°C で 11〜39時間、 37°Cで 7〜9時間である（非特許文献 1、非特許文献 2)。このようにレトロウイルスベクターの安定性は低いことから、通常、凍結保存されたレトロウイルスベクターは使用時に溶解され、直ちに使用される。

[0004] また、特許文献 1には組換えレトロウイルスを凍結乾燥して保存する方法が記載されている。この方法は凍結乾燥のための設備を要し、また、保存された組換えレトロゥィルスの使用にあたってはその復元操作が必要である。

[0005] 一方、特許文献 2、特許文献 3、非特許文献 3にはレトロウイルス結合活性を有する物質、特にフイブロネクチンのフラグメント共存下にレトロウイルスを感染させる遺伝子導入方法が記載されている。しかし、前記物質のレトロウイルスの安定性への影響は知られていない。

[0006] 特許文献 1：米国特許第 5792643号明細書

特許文献 2：国際公開第 95Z26200号パンフレット

特許文献 3 :国際公開第 97Z18318号パンフレット

非特許文献 l : McTaggart S.、 Al—Rubeai M.、バイオテクノロジープログレス（Biotechnol. Prog. )、第 16卷、第 5号、第 859〜865頁（2000年）非特許文献 2 :Kaptein L. C.ら、ジーンセラピー（Gene Ther. )、第 4卷、第 2 号、第 172〜176頁（1997年）

非特許文献 3 :Hanenberg H.ら、ネイチヤーメデイシン（Nat. Med. )、第 2卷、第 8号、第 876〜882頁（1996年）

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0007] 上記のように、凍結保存されたレトロウイルスベクターは融解後には迅速に取り扱い、短時間のうちに細胞への感染に使用しなければならない。従って、感染工程のスケジュールが何らかの要因、例えばレトロウイルスベクターを感染させるべき細胞の成育の遅れなどのために混舌 Lし、融解後のレトロウイルスベクターをすぐに細胞への感染に使用できな力つた場合には満足な感染効率を得られない恐れがある。

このように、レトロウイルスベクターについては即時使用可能な状態で安定に保存できる方法が望まれて、た。

課題を解決するための手段

[0008] 本発明者らはレトロウイルスの遺伝子導入活性を保持したまま、低温下、凍結することなく安定に保存する方法の開発を目指した。鋭意研究の結果、本発明者らはウイルスに対する結合活性を有する物質をコートした固相にレトロウイルスを結合させて低温に維持することにより、非凍結状態でもレトロウイルスを即時使用可能な状態で安定に保存可能であることを見出し、本発明を完成させた。

[0009] 本発明の第 1の発明はレトロウイルスの保存方法であって、固相に固定ィ匕されたレトロウィルス結合活性を有する物質の存在下にレトロウイルスを維持することを特徴とする。

[0010] 第 1の発明において、レトロウイルスは非凍結状態で維持されることができる。前記の保存方法のひとつの態様として、レトロウイルスを含有する溶液が空気と接触しな

Vヽ状態で維持される方法が例示される。

[0011] 第 1の発明において、レトロウイルスはレトロウイルス産生細胞由来の他の成分と分離されていてもよい。この態様においてレトロウイルスは、例えばリン酸塩を緩衝成分として含有する緩衝液中でレトロウイルスを維持されることができる。さらに、前記緩衝液はタンパク質および糖質から選択される物質を含有する溶液中で維持されてもよい。

[0012] 第 1の発明のレトロウイルスの保存方法に使用されるレトロウイルス結合活性を有する物質としては、フイブロネクチンのへパリン Πドメインを有するポリペプチド、線維芽細胞増殖因子、 V型コラーゲンのインシュリン結合ドメインを有するポリペプチド、 D EAEデキストラン、ポリリジンが例示される。

[0013] 本発明の第 2の発明はレトロウイルス組成物であって、レトロウイルス結合活性を有する物質が固定ィ匕された固相を保持する容器内に、レトロウイルスが前記レトロウィルス結合活性を有する物質と結合した状態で封入されていることを特徴とする。

[0014] 第 2の発明の組成物としては、レトロウイルスを含有する溶液が空気と接触しない状態で容器に封入されたものが例示される。

[0015] 第 2の発明の糸且成物は、レトロウイルス産生細胞由来の他の成分と分離されたレトロウィルスが封入されていてもよい。また、前記組成物はリン酸塩を緩衝成分として含有する緩衝液を含有することができる。さらに、前記組成物はタンパク質および糖質から選択される物質を含有する溶液を含有するものであってもよい。

[0016] 第 2の発明のレトロウイルスの保存方法に使用されるレトロウイルス結合活性を有する物質としては、フイブロネクチンのへパリン Πドメインを有するポリペプチド、線維芽細胞増殖因子、 V型コラーゲンのインシュリン結合ドメインを有するポリペプチド、 D EAEデキストラン、ポリリジンが例示される。

発明の効果 [0017] 本発明によれば、レトロウイルスベクターを直ちに遺伝子導入できる状態で安定に保存することが可能である。同じ品質のレトロウイルス結合容器を安定に保存できることから、再現性のよい遺伝子導入を実施することが可能である。また、保存容器をガス透過性の細胞培養バッグや分離バッグにすることによって閉鎖系が保たれることから、低温下での輸送も可能である。

図面の簡単な説明

[0018] [図 1]対照での導入効率に対する、遺伝子導入効率の相対値を示す図である。

[図 2]対照での導入効率に対する、遺伝子導入効率の相対値を示す図である。

発明を実施するための最良の形態

[0019] 本発明に使用されるレトロウイルスには特に限定はない。遺伝子導入を目的とする場合には、通常、人為的に改変された組換えレトロウイルス、すなわちレトロウイルスベクターが本発明に使用される。特に、無制限な感染、遺伝子導入を防止する観点力もは複製能欠損レトロウイルスベクターが好適である。該ベクターは感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させてあり、非病原性である。これらのベクタ一は脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞のような宿主細胞に侵入し、その染色体 DNA中に、ベクターに挿入された外来遺伝子を安定に組み込むことができる。公知の複製能欠損レトロウイルスベクターとしては、 MFGベクターや α—SGCベクター (国際公開第 92Ζ07943号パンフレット）、 pBabe[Morgenstern J. P. , Land Η. 、ヌクレイックァシッズリサーチ（Nucleic Acids Research)、第 18卷、第 12 号、第 3587〜3596頁（1990年）]、 pLXIN (クロンテック社製）、 pDON— AI (タカラバイオ社製)等のレトロウイルスベクター、レンチウィルスベクター [ヒト免疫不全ウイルス (HIV)由来ベクター、サル免疫不全ウィルス（SIV)由来ベクター等]、あるいはこれらを改変したベクターが例示される。

[0020] 前記のレトロウイルスベクターに保持させる外来遺伝子には特に限定はなぐ目的の細胞で発現させることが望まれる任意の遺伝子を挿入することができ、ポリべプチド (酵素、成長因子、サイト力イン、レセプター、構造タンパク質等）、アンチセンス RN A、リボザィム、デコイ、 RNA干渉を起こす RNA等をコードする遺伝子が例示される。本発明では、前記の外来遺伝子は適当なプロモーター、例えば、レトロウイルスべクタ一中に存在する LTRのプロモーターや外来プロモーターの制御下で、レトロウイルスベクター内に挿入して使用することができる。また、外来遺伝子の転写を達成するためにはプロモーターおよび転写開始部位と共同する他の調節要素、例えば、ェンハンサー配列がベクター内に存在していてもよい。さらに、好ましくは、導入された遺伝子はその下流にターミネータ一配列を含有することができる。さらに、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子 (例えば薬剤耐性遺伝子、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、 j8—ガラクトシダーゼゃルシフェラーゼのようなレポーターとして機能しうる酵素をコードする遺伝子等）を有して、てもよ、。

[0021] 前記のレトロウイルスは公知の方法で調製し、本発明に使用すればよい。調製方法には特に限定はなぐレトロウイルスベクターを使用する場合には当該レトロウイルスに適したレトロウイルス産生細胞を培養し、その培養上清を採取して本発明に使用することができる。前記のレトロウイルス産生細胞は安定にレトロウイルス粒子を上清中に生産するもの、レトロウイルスベクタープラスミドのトランスフエクシヨンにより一過性にレトロウイルス粒子を生産するものの、ずれでも構わな!/、。

[0022] 上記のレトロウイルス産生細胞の作製には公知のパッケージング細胞株、例えば P G13 (ATCC CRL— 10686)、 PA317 (ATCC CRL— 9078)、 GP+E— 86や GP + envAm— 12 (米国特許第 5, 278, 056号）、 Psi— Crip [Danos O.、 Mulli gan R. C.、プロシーディングスォブザナショナルアカデミーォブサイエンシズォブザユナイテッドステーッォブアメリカ（Proc. Natl. Acad. S ci. USA)、第 85卷、第 17号、第 6460〜6464頁（1988年）]等を使用してもよい。また、トランスフエクシヨン効率の高い 293細胞や 293T細胞を用いてレトロウイルス産生細胞を作製することもできる。

[0023] 本発明には、当該レトロウイルスベクターのゲノムが由来するものとは異種のウィルス由来のエンベロープを有する、シユードタイプ（pseudotyped)パッケージングによつて作製されたレトロウイルスも使用することができる。例えばモロニ一マウス白血病ウィルス (MoMLV)、テナガザル白血病ウィルス (GaLV)、水泡性口内炎ウィルス ( VSV)、ネコ内在性ウィルス (feline endogenous virus)由来のエンベロープゃェンべロープとして機能しうるタンパク質を有するシユードタイプレトロウイルスを使用することができる。さらに、糖鎖合成に関与する酵素遺伝子などを導入したレトロウィルス産生細胞を用いて作製された、糖鎖修飾を受けたタンパクをその表面に有するレトロウィルスベクターも本発明に使用できる。

[0024] (A)本発明のレトロウイルスの保存方法

本発明は、固相に固定ィ匕されたレトロウイルス結合活性を有する物質の存在下に、非凍結状態でレトロウイルスを維持することを特徴とするレトロウイルスの保存方法を提供する。

[0025] 本発明の方法に使用されるレトロウイルスを保存するための容器は、細胞や体液試料のような生物学的材料の保存に適したもの、もしくは細胞培養が可能なものであれば特に限定はなぐ例えば培養プレート、培養フラスコ、分離バッグ、ガス透過性培養ノッグ等が挙げられる。

[0026] 本発明における、レトロウイルス結合活性を有する物質が固定ィ匕される固相には特に限定はなぐビーズ状、繊維状等の種々の形状の固相を使用することができる。細胞培養時に細胞と接触させた場合、細胞の維持、増殖に悪影響を与えない材質の固相が本発明には好適である。一つの好適な態様として、前記のレトロウイルスを保存するための容器がレトロウイルス結合活性を有する物質を固定ィ匕するための固相として使用される。この態様において前記容器は、その内容物に接触する面がレトロゥィルス結合活性を有する物質で被覆されて!ヽる。レトロウイルス結合活性を有する物質としてはフイブロネクチン、へパリン IIドメインを有するフイブロネクチンフラグメント [CH— 296 (レトロネクチン: RetroNectin)や CH— 271、 H— 296など]、線維芽細胞増殖因子、 V型コラーゲンのインシュリン結合ドメインを有するポリペプチド、 DEA E デキストラン、ポリリジン等が例示される。固相表面にレトロウイルス結合活性を有する物質を固定ィヒする方法には特に限定はなぐ使用するレトロウイルス結合活性を有する物質に適した方法を選択すればょヽ。例えば前記物質を含有する緩衝液を使用する固相と接触させ、一定時間静置する方法が挙げられる。また、特許文献 2、 3にも前記物質の固定ィ匕操作について記載されている。

[0027] 本発明を特に限定するものではないが、本発明においてはレトロウイルスを含有する溶液と接触する空気の量を低減することが好ましい。従って、本発明のひとつの態様として、前記溶液を空気と接触しない状態で保持できる構造の容器を使用した保存方法が挙げられる。容量が固定された容器を使用する場合には、前記容器をレトロウィルスを含有する溶液で満たすことによって前記の態様を実施することができる。また、液量に応じて内容量を変更できる、フィルム状の基材で構成された袋状、バッグ状の容器を使用すれば任意の液量の溶液を空気と接触させずに保持することができる。本発明に使用される容器は、密封もしくは気密状態でレトロウイルスを含有する溶液を保持できるものが好ましい。特に好適には、市販の細胞培養用バッグを本発明に使用することができる。

[0028] 本発明で保存されるレトロウイルスとしては、レトロウイルス産生細胞力採取された上清、該上清力も精製されたレトロウイルス等を使用することができる。例えば、一旦凍結保存された前記の上清や精製レトロウイルスを本発明の方法により非凍結状態で保存してもよヽ。

[0029] 本発明のひとつの態様では、レトロウイルスはレトロウイルス産生細胞由来の他の成分と分離された状態で保存される。前記の態様は通常、下記の工程により実施される

(1)レトロウイルス結合活性を有する物質が固定化された固相とレトロウイルスを含有するレトロウイルス産生細胞培養液上清を接触させる工程；

(2)工程（1)の固相を洗浄する工程;及び

(3)工程 (2)で得られた固相を緩衝液と接触させた状態で維持する工程。

あら力じめ精製されたレトロウイルスをレトロウイルス産生細胞の上清にかえて使用する場合には、上記（2)の工程を省略してもよい。

この態様では、レトロウイルス産生細胞の上清に含有される成分に起因するレトロゥィルスの不活ィ匕が抑制されるため、レトロウイルスの感染能力がより高く維持される。

[0030] レトロウイルスをレトロウイルス結合活性を有する物質に結合させる方法には特に限定はない。例えば、レトロウイルス産生細胞培養液上清を前記物質を固定化した固相と接触させ、放置する他、遠心力によってレトロウイルスを固相表面に沈降させる方法、固相とレトロウイルスの入った容器を振盪する方法等により実施すればよい。

[0031] 前記操作により、レトロウイルス結合物質を介してレトロウイルスが結合した容器から上清を除き、必要により固相（例えば容器自体)を洗浄し、次いでレトロウイルスの保存に適した溶液を容器に添加する。

[0032] レトロウイルスが結合した固相の洗浄に使用する溶液は、保存しょうとするレトロウイルスの感染性を大きく低下させな!/、ものであれば特に限定はな、。例えば生理食塩水、燐酸緩衝生理食塩水、レトロウイルス産生細胞の培養に使用されたものと同じ培地などが使用できる。特に好ましくは、下記に示すレトロウイルスの保存に使用される溶液が使用される。レトロウイルス産生細胞の上清にはレトロウイルスの細胞への感染を阻害する物質が存在することから、レトロウイルス産生細胞由来の他の成分と分離された状態で保存されたレトロウイルスは、細胞への感染を実施するうえで有利である。

[0033] 本発明にお、ては、レトロウイルスはレトロウイルス結合物質に結合した状態で、適切な溶液に接触した状態で保存される。ここで使用される溶液は、保存しょうとするレトロウィルスの感染性を大きく低下させな、ものであれば特に限定はな、が、好ましくはリン酸塩 (リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）を緩衝成分として含有する緩衝液が使用される。さらに、レトロウイルスを安定ィ匕するための成分として糖類 (ブドウ糖、ガラタトース、乳糖、マン-トール等）、タンパク質 [アルブミン、コラーゲン (ゼラチン)等] やその他の成分 (無機塩類、ポリオール類、ヒト血清等)を前記の溶液に含有させてちょい。

[0034] 前記の保存方法により、非凍結状態での保存であってもレトロウイルスの細胞への感染能力はレトロウイルス培養液上清をそのまま保存する場合に比べて高く維持される。特に本発明を限定するものではないが、本発明では低温条件下 24時間以上、好適には 48時間以上、さらに好適には 72時間以上の期間にわたってレトロウイルスの保存が実施される。なお、本発明でいう低温とは 15°C以下であって保存される溶液の凍結が起こらない温度を指す。好適には、レトロウイルスは 0〜10°Cで保存される。

[0035] 本発明の方法により容器中に保存されたレトロウイルスは、そのまま感染に用いることができる。レトロウイルスが外来遺伝子を保持した組換えレトロウイルスであった場合には、この操作によって細胞への遺伝子導入が可能となる。レトロウイルスの感染は、例えば容器中の溶液を細胞へのレトロウイルス感染に適した溶液に置換した後（保存用の溶液がレトロウイルスの感染に適したものであった場合にはそのまま）、感染が望まれる細胞を前記容器に添加することによって実施することができる。あるいは、当該保存容器力も溶液を除き、細胞懸濁液を加えることによってレトロウイルスの感染を実施することができる。上記の感染の工程は静置培養でも良ぐ遠心力を加えて細胞をレトロウイルス結合活性を有する物質が固定化された固相表面上に沈降させることによってレトロウイルスと細胞を接触させる方法で実施しても良い。レトロウィルスを感染させた標的細胞は当該容器でそのまま培養を実施してもよぐ前記の操作実施後別の容器に移して培養を行っても良い。

[0036] レトロウイルス結合物質が標的細胞に対しても親和性を有する物質であった場合、上記の操作により標的細胞とレトロウイルスが容器表面上に共配置されることから、高い効率で標的細胞へのレトロウイルス感染が起こる。例えば、前記の CH— 296ポリペプチドは造血幹細胞に対する結合活性を有して、ることから、当該ポリペプチドと所望の外来遺伝子を保持する組換えレトロウイルスを使用することにより、造血幹細胞への遺伝子導入を簡便、かつ高、効率で行うことが可能となる。

[0037] 本発明の別の態様として、レトロウイルス結合活性を有する物質とともに標的細胞に結合する活性を有する物質を固定化した固相を使用するレトロウイルスの保存方法が例示される。当該方法はレトロウイルス結合活性を有する物質と標的細胞に結合する活性を有する物質とともにレトロイルスが保存された容器を標的細胞へのレトロゥィルス感染のための容器として使用できることから、高効率および Zまたは細胞選択的な遺伝子導入が望まれる遺伝子治療分野において特に有用である。

[0038] 上記の態様において使用される、標的細胞に結合する活性を有する物質としては、特に限定するものではないが、例えば標的細胞を認識しうるタンパク質やペプチド [ 標的細胞表面の成分を認識する抗体やレセプター、標的細胞表面のレセプターのリガンド (成長因子、ホルモン、サイト力イン等) ]、レクチン類、糖鎖や糖脂質等が例示される。前記物質、ならびにその固定ィ匕方法については上記の非特許文献 3にも記載されている。

[0039] (B)本発明の組成物

本発明は、保存に適した形態の、レトロウイルスを含有する組成物を提供する。前記組成物においてレトロウイルスは、容器内に、固相に固定ィ匕されたレトロウィルス結合活性を有する物質と結合した状態で封入されてヽることを特徴とする。当該組成物は前記のレトロウイルスの保存方法の記載に準じて調製することができる。また、上記のレトロウイルス結合活性を有する物質としては、前記のレトロウイルスの保存方法において使用可能なものが例示される。

[0040] 本発明のひとつの態様として、レトロウイルスを含有する溶液が空気と接触しない状態で維持されている組成物が例示される。さらに、前記組成物はレトロウイルス産生細胞由来の他の成分と分離されていてもよぐこの場合にはさらにレトロウイルスの保存に適した溶液を含有する組成物が好適である。前記のレトロウイルスの保存に適した溶液も、前記のレトロウイルスの保存方法において使用できるものを使用すればよい。

[0041] 本発明に使用される容器は、細胞や体液試料のような生物学的材料の保存に適したもの、もしくは細胞培養が可能なものであれば特に限定はないが、密封もしくは気密状態でレトロウイルスを含有する溶液を保持できるものが好ましい。例えば、市販の細胞培養用バッグ等を使用することができる。

[0042] 本発明のレトロウイルス組成物は、保存性に優れるとともに即時に細胞へのレトロゥィルスの感染を実施できることから、レトロウイルスに関する研究の他、医療分野、特に組換えレトロウイルスベクターを使用する遺伝子治療分野において有用である。実施例

[0043] 以下に実施例により、さらに詳細に本発明を説明するが、本発明は実施例の範囲内に限定されるものではない。

[0044] 実施例 1

1. CH— 296コートプレートの作製

表面未処理 24ゥエルプレート（ファルコン社製）〖こ 1ゥエルあたり 500 μ 1の 20 μ gZ mlのフイブロネクチンフラグメントである CH— 296 (商品名レトロネクチン；タカラバィォ社製）を添カ卩して 4°Cでー晚放置した後、 2%BSAZPBSで室温にて 30分間ブロッキングし、さらに PBSで洗浄した。このプレートを CH— 296コートプレートとし、必要に応じて作製した。 [0045] 2. レトロウイルスベクターの調製

レトロウイルスベクタープラスミド pDOG—ροΙΠは、以下の手順で作製した。まず、 r sGFP発現ベクター pQBI25 (Qbiogene社製）を制限酵素 Nhel及び Notlで切断し、 775bpの GFP遺伝子断片を得た。次に pQBI ροΙΠ (Qbiogene社製）を制限酵素 Nhel及び Notlで切断して rsGFP— NeoR融合遺伝子を除去し、先に得た 775bp の rsGFP遺伝子断片を挿入し、 polllプロモーター制御下で rsGFP遺伝子が発現するベクター pQBI polll (neo - )を得た。 pQBI polll (neo - )を制限酵素 Xholで消化し、 polllプロモーター制御下、 GFP発現ユニットを含む DNA断片を得、その末端を DNA Blunting Kit (タカラバイオ社製）を用いて平滑化した。レトロウイルスべクタープラスミド pDON—AI (タカラバイオ社製)を制限酵素 Xholと Sphlで消化して得られたベクター断片 4. 58kbpの末端を DNA Blunting Kit (タカラバイオ社製）を用いて平滑化したのち、アルカリフォスファターゼ (タカラバイオ社製)を用いて脱リン酸化した。この平滑化したベクターに先の平滑化した polllプロモーター制御下 rsGF p発現ユニットを含む DNA断片を DNA Ligation Kit (タカラバイオ社製）を用いて挿入し、 rsGFP発現組換えレトロウイルスベクター pDOG— polllを得た。

[0046] pDOG— polllベクターと Retrovirus Packaging Kit Eco (タカラバイオ社製）を用いた一過性のウィルス産生を行、、ェコトロピック DOG— polllウィルスを獲得した。ェコトロピック DOG— polllウィルスを、 GaLVレトロウイルスパッケージング細胞 P G13 (ATCC CRL- 10686)にレトロネクチン（タカラバイオ社製）存在下に感染させ、遺伝子導入細胞 PG13ZDOG— polllを獲得した。 PG13ZDOG— polllは 10 %ゥシ胎仔血清（Thermo Trace社製）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DME M、シグマ社製)で培養し、セミコンフルェントに生育したところで 0. lmlZcm²の新鮮な 10%ゥシ胎仔血清含有 DMEMと交換し、 24時間後に上清を 0. 45 mフィルター（ミリポア社製)でろ過して GaLVZDOG— polllウィルス液を得た。得られたウイルス液は小分けして分注し、 80°Cフリーザーで保存し、以下の保存ならびに遺伝子導入実験に供した。

[0047] 3. ウィルス上清液の力価の測定

ウィルス上清液の力価の測定は HT— 1080細胞 (ATCC CCL- 121)を使用して標準的な方法 [Markowitz D.ら、ジャーナルォブヴイロロジー (J. Virol. ) 、第 62卷、第 4号、第 1120〜1124頁（1988年) ]に従って測定した。すなわち、 6ゥエルの組織培養用プレートに 1ゥエルあたり 5 X 10⁴個の HT— 1080細胞を含む 10 %ゥシ胎仔血清を含有する DMEM 2mlを添カ卩し、 37°C、 5%COにてー晚培養し

2

た後、培地を吸引除去し、各ゥエルに系列希釈したウィルス上清液 1mlを加え、更にへキサジメトリン'ブロミド (ポリプレン:アルドリッチ社製)を終濃度 8 μ gZmlとなるように加えた。これを 37°C、 5%COで 4

2 〜6時間培養し、更に 10%ゥシ胎仔血清を含有する DMEMを lml添カ卩して 72時間培養した。このプレートより回収した細胞をフロ一サイトメーター FACS Vantage (ベタトン'ディッキンソン社製）による解析に供し、 rsGFP発現 HT— 1080細胞の割合を測定した。ゥエルあたりの仕込み細胞数に rs GFP発現細胞の割合とウィルス上清液の希釈倍率を乗じた値より、上清 lmlあたりの感染性粒子数 (I. V. P. Zml)を算出し、ウィルス力価とした。実施例 1—2で調製されたウィルス液の力価は 1. 9 Χ 10⁵Ι. V. P. /mlから 4. 5 Χ 10⁵Ι. V. P. /mlの範囲であった。

[0048] 実施例 2

CH— 296コートプレートを用いたレトロウイルスの保存（1)

GaLVZDOG— polllウィルス液の活性評価には K— 562細胞 (ATCC CCL— 243)を用いた。 K- 562細胞は 10%ゥシ胎仔血清（Thermo Trace社製）を含む RPMI— 1640培地（シグマ社製)で培養した。

[0049] 24ゥエル CH— 296コートプレートに 1ゥエルあたり 250 μ 1の GaLVZDOG- ροΙΠ ウィルス液 (原液）をカ卩え、 5%COインキュベーター内、 37°Cで 4時間インキュベー

2

シヨンし、レトロウイルスベクターを結合させた。次に、各ゥエルあたり 500 1の PBS ( リン酸緩衝生理食塩水）、 0. 1%ゥシ血清アルブミン（BSA、 Fraction V、シグマ社製）含有 PBS溶液、 1%ゥシ血清アルブミン含有 PBS溶液、 X— VIVO 15 (Cambr ex社製）、 X— VIVO 10 (Cambrex社製）、 IMDM (インビトロジェン社製）、ある！/ヽは RPMI1640 (シグマ社製）で 2回洗浄し、 500 1の各溶媒でゥエルを満たして、 4 °Cで 7日間インキュベーションした。一方、前記プレートのゥエルにウィルス液をカロえたものを洗浄せずに 7日間インキュベーションした（ウィルス上清そのままのインキュベーシヨン)。 7日目に、各溶媒を除き、 4 X 10⁴個 Zmlになるように調製した K— 562 細胞懸濁液を 500 1加え、 5%CO存在下、 37°Cで培養し遺伝子導入を実施した

2

。対照として同ロットのウィルス液で同様の手順でウィルス結合プレートを調製し、 4 °Cでインキュベーションすることなく直ちに K— 562細胞を加えて遺伝子導入を実施した。この細胞について、 rsGFP遺伝子の発現を指標として遺伝子導入効率を測定した。対照での導入効率に対する、 7日間インキュベーションしたウィルスでの遺伝子導入効率の相対値を図 1に示す。

[0050] 図 1に示すごとぐすべての溶媒において、ウィルス上清をそのまま放置した場合よりも高い活性が保持されており、レトロウイルス産生細胞の上清力分離したレトロウイルスを保存することが有効であることが示された。特にゥシ血清アルブミンを含有する溶媒は保存安定に効果的であることが明らかとなった。

[0051] 実施例 3

CH— 296コートプレートを用いたレトロウイルスの保存（2)

実施例 2において、レトロウイルス結合容器の洗浄による保存安定性の向上が示された。次に、より保存安定性の向上に寄与できる溶媒の探索を行うため、無機塩溶媒として、リン酸ナトリウム、塩ィ匕カルシウムと硫酸マグネシウムの混合物、リン酸ナトリウムと塩ィ匕カルシウムと硫酸マグネシウムの混合物、糖類としてブドウ糖、 D—ソルビトール、精製白糖、マルトース、果糖、乳糖、 D—マン-トール、高分子化合物として力ルメロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール 400、タンパク質として精製ゼラチン、ヒト血清アルブミン (HSA)についてレトロウイルスの保存に関する影響を調べた。前記物質の各物質を、無機塩は注射用水、それ以外は PBSに溶解し、レトロウイルス保存安定効果について試験した。探索の手順は実施例 2に準じるが、レトロウイルス結合容器の保存培養は 37°C、 3時間で実施した。その結果、 40mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH7 、 0. 5mM塩化カルシウムおよび ImM硫酸マグネシウム含有 20mMリン酸緩衝液 p H7、 1. 5〜20%ヒト血清アルブミン含有 PBS溶液、 0. 5〜2. 5%精製ゼラチン含有 PBS溶液、 5%乳糖含有 PBS溶液において、 PBS単独よりもレトロウイルスベクターの保存安定性の向上が確認された。 [0052] 以上の試験の結果、基本溶媒としては PBSよりも 40mMリン酸ナトリウム緩衝液が優れているとの傾向と、タンパク質、糖類による安定性の向上が示されたことから、 1 %ゥシ血清アルブミン含有 PBS、 1. 5%ヒト血清アルブミン含有 40mMリン酸ナトリウム緩衝液、 0. 5%精製ゼラチン含有 40mMリン酸ナトリウム緩衝液、 5%乳糖含有 40 mMリン酸ナトリウム緩衝液を用いて 4°Cにて 7日間のレトロウイルス保存安定性試験を実施例 2の手順に従って実施した。なお、前記のリン酸ナトリウム緩衝液の pHはすベて 7. 0とした。対照での導入効率に対する、 7日間インキュベーションしたウィルスでの遺伝子導入効率の相対値を算出した結果を図 2に示す。図に示すごとぐ各種溶媒に置き換えて保存することにより、レトロウイルス産生細胞上清をそのまま保存する場合と比較して飛躍的に保存安定性が向上していることが明らかとなった。

[0053] 実施例 4

各種の機能性物質の存在下でのレトロウイルスの保存

本実施例ではレトロウイルス結合活性と細胞接着活性を示す機能性物質を用いて保存安定性の評価を行った。レトロウイルス結合活性と細胞接着活性を示す機能性物質として前記の CH— 296のほかに、 CH— 271および H— 296 [Kimizuka F. ら、ジャーナルォブバイオケミストリー (J. Biochem. )、第 110卷、第 2号、第 28 4〜291頁（1991年）]、 DEAE デキストラン（シグマ社）、ポリ— L—リジン（平均分子量 3万〜 7万、 ICN社）、 DEAE デキストランとフイブロネクチンフラグメント C— C Sl[Kimizuka F.ら、ジャーナルォブバイオケミストリー（J. Biochem. )、第 1 10卷、第 2号、第 284〜291頁（1991年）]の混合物、ポリ— L リジンと C— CS1の混合物を用いて実施した。

[0054] 表面未処理 24ゥエルプレート（ファルコン社製）〖こ 1ゥエルあたり 500 μ 1の 20 μ gZ mlのフイブロネクチンフラグメントである CH— 296、 CH— 271、 H— 296を添加した。 DEAE デキストランは 0. 9mg/mlの PBS溶液を、ポリ一 L—リジン 40 gZml の PBS溶液を、それぞれ 1ゥヱルあたり 500 1添カ卩した。 DEAE デキストランと C -CS1の混合物、ポリ一 L リジンと C - CS 1の混合物につ!/ヽては上記 DEAE -デキストラン溶液、あるいはポリ L リジン溶液に C CS1を 4. 4 /z gZml〖こなる様に加えた。 4°Cでー晚放置した後、 2%BSAZPBSで室温にて 30分間ブロッキングし、さらに PBSで洗浄した。このプレートを機能性物質コートプレートとし、レトロウイルス保存安定性試験に供した。

[0055] 各機能性物質コートプレートでのレトロウイルス保存安定性試験は実施例 2の手順に従って実施した。ウィルス保存の形態として、ウィルス上清をそのまま保存する群、 40mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH7. 0中に保存する群、 1. 5%ヒト血清アルブミン含有 40mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH7. 0中に保存する群、の 3通りについて試験した。対照での導入効率に対する、 7日間インキュベーションしたウィルスでの遺伝子導入効率の相対値を算出した結果を表 1に示す。

[0056] フイブロネクチンのへパリン Πドメインを有するポリペプチド（CH— 296、 CH— 27 1、 H— 296)の他、 DEAEデキストランやポリリジンをコートしたプレートでも遺伝子導入効率が高く保たれており、これらの物質を使用したレトロウイルスの保存が有効であることが明らかとなった。さらに、細胞結合活性を有する物質 (C— CS1)が共存する場合でも前記物質の保存には影響は見られなかった。

[0057] [表 1]

〔表中の数値の単位は％) 実施例 5

ガス透過性培養バッグを用いたレトロウイルスの保存

前記の CH— 296を、表面未処理 24ゥエルプレート（ファルコン社製）およびガス透過性培養バッグ (X— FOLD™、 85cm², Nexell社製）を用いて以下の実験を実施した。

[0059] X— FOLD™の CH— 296でのコーティングは以下の手順で行った。

まず、 20 gZmlの CH— 296をバッグあたり 9ml添カ卩して 4°Cでー晚放置した。次にバッグあたり 30mlの PBSで 3回洗浄し、 CH— 296コートバッグとした。一方、 24ゥエルプレートは実施例 1の手順に従つて CH— 296でコートした。

[0060] 24ゥエル CH— 296コートプレートに 1ゥエルあたり 500 μ 1の GaLVZDOG- ροΙΠ ウィルス液 (4倍希釈液）を加え、 5%COインキュベーター内、 37°Cで 4時間インキュ

2

ベーシヨンし、レトロウイルスベクターを結合させた。一方、 X— FOLD™には、同じ G aLVZDOG— polllウィルス液を 22mlカ卩え、バック内力も空気を除いて密封し、 5% CO存在下、 37°Cで 4時間インキュベーションし、レトロウイルスベクターを結合させ

2

た。次に、各容器を 40mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7. 0)あるいは 1. 5%ヒト血清アルブミン含有 40mMリン酸ナトリウム緩衝液 (pH7. 0)で 2回洗浄し（24ゥエルプレートは 500 μ 1で、バッグは 30mlで洗浄）、同じ溶媒でゥエルおよびバッグを満たし、バッグについては空気を除いて密封して、 4°Cで 7日間インキュベーションした。さらに、同じウィルス液を CH— 296コートプレート、 CH— 296コートバッグに入れ、バッグについては空気を除いて密封して、そのまま 4°Cで 7日間インキュベーションした。 7日目に、各容器力も溶媒を除き、 4 X 10⁴個 Zmlになるように調製した K— 562細胞懸濁液を 24ゥエルプレートには 500 1、ノッグには 22ml加え、 37°C、 5%CO存

2 在下でインキュベートして遺伝子導入を実施した。対照として同ロットのウィルス液で同様の手順でウィルス結合容器を調製し、 4°Cでインキュベーションすることなく直ちに K 562細胞を加えて遺伝子導入を実施した。対照の遺伝子導入効率に対する、 7日間インキュベーションした場合の遺伝子導入効率の相対値を算出した。

[0061] レトロウイルス上清希釈液をそのままプレートで保存したものでは、対照に比較して 10%以下の遺伝子導入効率しか得られなかった。これに対し、バッグに密封して保存したもの、レトロウイルスを CH— 296に結合させた後に容器を洗浄して溶媒を交換したもの（プレートおよびバッグ)ではヽずれも対照の 60%を超える遺伝子導入効率が得られた。この結果より、レトロウイルス結合活性を有する物質の共存下でレトロゥィルスを保存する際に、レトロウイルスを含有する溶液を空気に接触しなヽ状態とすること、および Zまたはレトロウイルスをレトロウイルス産生細胞の上清力分離すること、によってレトロウイルスの感染能の低下を飛躍的に抑制することが明ら力となった

[0062] 実施例 6

レトロウイルスの長期保存

GaLV/DOG- polllウィルス液（3. 3 Χ 10⁵Ι. V. P. /ml)を 10%ゥシ胎仔血清含有 RPMI— 1640培地で 2倍希釈したものを実施例 1記載の 24ゥエル CH— 296コートプレートに 1ゥエルあたり 500 1加え、 5%COインキュベーター内、 37°Cで 4時

2

間インキュベーションし、レトロウイルスベクターを結合させた。次に、各ゥエルあたり 5 00 1の 40mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH7. 0、あるいは 1. 5%ヒト血清アルブミン含有 40mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH7. 0を用いてプレートを 2回洗浄し、同じ緩衝液 500 μ 1でゥエルを満たして 4°Cでインキュベーションした。一方、前記プレートのゥェルにウィルス 2倍希釈液をカ卩えたものを洗浄せずに 4°Cでインキュベーションした（ゥィルス上清そのままのインキュベーション）。インキュベーション開始から 1、 2、 3、 4週間目に各ゥエルの溶液を除き、 4 X 10⁴個 Zmlになるように調製した K— 562細胞懸濁液を 500 1加え、 37°C、 5%CO存在下で培養し遺伝子導入を実施した。ウィル

2

ス上清そのままでインキュベーションしたゥエルについては、 500 μ 1の 40mMリン酸ナトリウム緩衝液 PH7. 0で 1回洗浄し、 4 X 10⁴個/ mlになるように調製した K— 562 細胞懸濁液を 500 1カ卩え、 37°C、 5%CO存在下で培養し遺伝子導入を実施した

2

。対照として同ロットのウィルス液で同様の手順でウィルス結合プレートを調製し、 4 °Cでインキュベーションすることなく直ちに K— 562細胞を加えて遺伝子導入を実施した。遺伝子導入された細胞での遺伝子導入効率を測定して算出された、対照での導入効率に対する各試験群のウィルスでの遺伝子導入効率の相対値、すなわち残存カ価を表 2に示す。

[0063] [表 2] 1 週間後 2週間後 3週間後 4週間後

4 0 πι Μリン酸緩衝液 47. 55 40. 76

ヒト血清アルプミン含有 96. L9

4 0 πι Μリン酸緩衝液

ウィルス上清 6. 24 2. 87 1. 98

〔表中の数値の単位は。 /o )

[0064] 表 2に示すごとぐウィルス上清をそのまま保存した場合には 2週間後に力価が 1Z

10以下に低下するのに対し、レトロウイルスを培養上清と分離 (培養上清を他の緩衝液に置換)したものでは 4週間の ο保存後にも 4割以上の力価を保持していた。タンパク質 (ヒト血清アルブミン)を含有する緩衝液を使用した場合、特に良好な保存安定性が得られた。

ト

[0065] 実施例 7

希釈したレトロウイルスの保存

GaLV/DOG- polllウィルス液（3. 3 Χ 10⁵Ι. V. P. /ml)を 10%ゥシ胎仔血清含有 RPMI— 1640培地で 2、 4、 8、 16倍にそれぞれ希釈して作製した希釈液を実施例 1記載の 24ゥエル CH— 296コートプレートの 1ゥエルあたり 500 1加え、 5%C Oインキュベーター内、 37°Cで 4時間インキュベーションし、レトロウイノレスベクターを

2

結合させた。次に、各ゥエルあたり 500 /z lの 40mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH7. 0、あるいは 1. 5%ヒト血清アルブミン含有 40mMリン酸ナトリウム緩衝液 pH7. 0を用いてプレートを 2回洗浄し、同じ緩衝液 500 1でゥエルを満たして 4°Cでインキュベーシヨンした。一方、前記プレートのゥエルにウィルス希釈液を加えたものを洗浄せずに 4 °Cでインキュベーションした（ウイノレス上清そのままのインキュベーション）。インキュべーシヨン開始から 1、 2、 3、 4週間目に各ゥヱルの溶液を除き、 4 X 10⁴個 Zmlになるように調製した K— 562細胞懸濁液を 500 1加え、 37°C、 5%CO存在下で培養し

2

遺伝子導入を実施した。ウィルス上清そのままでインキュベーションしたゥエルにつヽては、 500 1の 40mMリン酸ナトリウム緩衝液 ρΗ7. 0で 1回洗浄し、 4 Χ 10⁴個/ ml になるように調製した K— 562細胞懸濁液を 500 1加え、 37°C、 5%CO存在下で

2 培養し遺伝子導入を実施した。対照として同ロットのウィルス液で同様の手順でウイルス結合プレートを調製し、 4°Cでインキュベーションすることなく直ちに K— 562細胞を加えて遺伝子導入を実施した。遺伝子導入された細胞での遺伝子導入効率を測定して算出された、対照での導入効率に対する保存後のウィルスでの遺伝子導入効率の相対値、すなわち残存力価を表 3に示す。

[0066] [表 3]

(表中の数値の単位は％)

[0067] 表 3に示すごとぐウィルスの希釈液をそのまま保存した場合には、どの希釈率でも速やかな力価の低下が認められた。一方、ウィルス液の希釈液をプレートへの結合に供したうえで培養上清を他の緩衝液に置換した場合には力価の低下が著しく抑制された。使用したウィルス液の希釈率はウィルス力価の保存安定性に顕著な影響を与えておらず、特にタンパク質 (ヒト血清アルブミン)を含有する緩衝液を使用した場合には希釈率の影響は全く見られな力つた。このことから、本発明の方法が低力価、もしくは希釈されたウィルス液中のレトロウイルスの保存にも有効であることが明らかとなった。

産業上の利用可能性

[0068] 本発明により、レトロウイルスの保存方法ならびにレトロウイルス組成物が提供される。該保存方法は、レトロウイルスを即時に細胞への感染に使用できる状態で保存できること力、レトロウイルスの研究、遺伝子治療を含む医療分野において有用である。また、該組成物も上記同様の分野に有用である。

Claims

請求の範囲

[I] 固相に固定ィ匕されたレトロウイルス結合活性を有する物質の存在下にレトロウィルスを維持することを特徴とするレトロウイルスの保存方法。

[2] 非凍結状態でレトロウイルスが維持される請求項 1記載のレトロウイルスの保存方法

[3] レトロウイルスを含有する溶液が空気と接触しな!ヽ状態で維持される請求項 1記載の方法。

[4] レトロウイルス産生細胞由来の他の成分と分離されたレトロウイルスが維持される請求項 1記載のレトロウイルスの保存方法。

[5] リン酸塩を緩衝成分として含有する緩衝液中でレトロウイルスを維持することを特徴とする請求項 4記載の方法。

[6] タンパク質および糖類カゝら選択される物質を含有する溶液中でレトロウイルスを維持することを特徴とする請求項 4記載の方法。

[7] レトロウイルス結合活性を有する物質力フイブロネクチンのへパリン IIドメインを有するポリペプチド、線維芽細胞増殖因子、 V型コラーゲンのインシュリン結合ドメィンを有するポリペプチド、 DEAEデキストラン、ポリリジン力も選択される物質である請求項 1記載の方法。

[8] レトロウイルス結合活性を有する物質が固定化された固相を保持する容器内に、前記レトロウイルス結合活性を有する物質と結合した状態で封入されていることを特徴とするレトロウイルス組成物。

[9] レトロウイルスを含有する溶液が空気と接触しな、状態で容器に封入されて、ることを特徴とする請求項 8記載のレトロウイルス組成物。

[10] レトロウイルス産生細胞由来の他の成分と分離されたレトロウイルスが容器に封入されていることを特徴とする請求項 8記載のレトロウイルス組成物。

[II] さらにリン酸塩を緩衝成分として含有する緩衝液を含有する請求項 10記載の組成物。

[12] さらにタンパク質および糖類から選択される物質を含有する溶液を含有する請求項 10記載の組成物。レトロウイルス結合活性を有する物質力 s、フイブロネクチンのへパリン πドメインを有するポリペプチド、線維芽細胞増殖因子、 V型コラーゲンのインシュリン結合ドメィンを有するポリペプチド、 DEAEデキストラン、ポリリジン力も選択される物質である請求項 8記載の組成物。