KR20070101372A - 레트로 바이러스의 보존 방법 - Google Patents

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KR20070101372A
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히로미 오쿠야마
준이치 미네노
키요조 아사다
이쿠노신 카토
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다카라 바이오 가부시키가이샤
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Abstract

고형상으로 고정화된 레트로 바이러스 결합 활성을 함유하는 물질의 존재하에 레트로 바이러스를 유지하는 것을 특징으로 하는 레트로 바이러스의 보존 방법. 레트로 바이러스 결합 활성을 가지는 물질이 고정화된 고형상을 보유하는 용기에, 상기 레트로 바이러스 결합 활성을 가지는 물질과 결합된 상태로 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 레트로 바이러스 조성물.

Description

레트로 바이러스의 보존 방법{METHOD OF RETROVIRUS STORAGE}
본 발명은 의학, 약학, 농림 수산학, 식품학의 분야에 있어서, 세포에 유전자를 도입하여 형질전환시키기 위해서 이용하는 레트로 바이러스 벡터의 정제 방법, 보존 방법 및 여기에 관련된 일련의 기술에 관한 것이다.
레트로 바이러스 벡터는 숙주 염색체에 표적 유전자를 확실히 도입할 수 있는 벡터로, 유전자 치료의 영역에 있어서 조혈줄기세포나 말초피임파구 등을 표적으로 한 체외 유전자 치료 프로토콜을 중심으로 광범위하게 이용되고 있는 벡터이다. 또한, 이들은 기초 연구의 분야에서도 안정된 외래(삽입) 유전자 발현 레벨을 획득할 수 있으므로, 유전자 발현 해석의 툴로서 광범위하게 이용되고 있는 벡터이다. 통상, 레트로 바이러스 벡터는 생산 세포의 배양 상청액을 필터로 여과하여 이용하지만, 체외 유전자 치료 프로토콜에 이용하는 경우에는 한층 더 정제되는 경우도 있다. 그러나, 바이러스 벡터의 정제는 번잡하며, 회수율이 나쁜 문제점이 있어 정제한 바이러스 벡터의 안정성에 관한 학술 논문의 보고는 눈에 띄지 않는다.
레트로 바이러스 생산 세포의 배양 상청액은, 통상, 필터로 여과된 후, 초저온 냉동고에 동결된 상태로 보존된다. 융해 후의 용액 상태에서 벡터의 안정성은 낮으며, 보고되고 있는 반감기는 4℃에서 92 시간, 0℃에서 18 ~ 64 시간, 32℃ 에서 11 ~ 39 시간, 37℃에서 7 ~ 9시간이다(비특허 문헌 1, 비특허 문헌 2). 이와 같이 레트로 바이러스 벡터의 안정성은 낮으므로, 통상, 동결 보존된 레트로 바이러스 벡터는 사용시에 용해하여 즉시 사용한다.
또한, 특허 문헌 1에는 재조합 레트로 바이러스를 동결건조하여 보존하는 방법이 기재되어 있다. 이 방법은 동결건조를 위한 설비를 필요로 하며, 또한, 보존된 재조합 레트로 바이러스의 이용에 있어서는 이의 복원 조작이 필요하다.
한편, 특허 문헌 2, 특허 문헌 3, 비특허 문헌 3에는 레트로 바이러스 결합활성을 갖는 물질, 특히 피브로넥틴의 절편 공존 하에 레트로 바이러스를 감염시키는 유전자 도입 방법이 기재되어 있다. 그러나, 상기 물질의 레트로 바이러스의 안정성에 대한 영향은 알려지지 않다.
특허 문헌 1: 미국 특허 제 5792643호 명세서
특허 문헌 2: 국제 공개 제 95/26200호 팜플렛
특허 문헌 3: 국제 공개 제 97/18318호 팜플렛
비특허 문헌 1: McTaggart, S., Al-Rubeai, M., Biotechnol . Prog ., 16(5):859-865(2000)
비특허 문헌 2: Kaptein, L.C., et al ., Gene Ther ., 4(2):172-176(1997)
비특허 문헌 3: Hanenberg, H. et al., Nat. Med ., 2(8):876-882(1996)
발명이 해결하려고 하는 과제
상기와 같이, 동결 보존된 레트로 바이러스 벡터는 융해 후에는 신속히 취급하여, 단시간 내에 세포로의 감염에 사용해야 한다. 따라서, 감염 공정의 스케줄이 어떠한 요인, 예를 들면 레트로 바이러스 벡터를 감염시켜야 할 세포의 생장의 지연 등 때문에 혼란하여, 융해 후의 레트로 바이러스 벡터를 곧바로 세포로의 감염에 사용할 수 없었던 경우에는 만족스러운 감염 효율을 수득할 수 없는 경우가 있다.
이와 같이, 레트로 바이러스 벡터에 대해서는 즉시 사용 가능한 상태에서 안정적으로 보존할 수 있는 방법이 바람직하다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 레트로 바이러스의 유전자 도입 활성을 유지한 채로, 저온에서 동결하는 일 없이 안정적으로 보존하는 방법의 개발을 목표로 하였다. 열심히 연구의 결과, 본 발명자들은 바이러스에 대한 결합 활성을 갖는 물질을 코팅한 고형상에 레트로 바이러스를 결합시켜 저온에 유지하는 것으로써, 비동결 상태에서도 레트로 바이러스를 즉시 사용 가능한 상태로 안정적으로 보존 가능한 것을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 제 1의 발명은 레트로 바이러스의 보존 방법이며, 고형상에 고정화된 레트로 바이러스의 결합 활성을 갖는 물질의 존재 하에 레트로 바이러스를 유지하는 것을 특징으로 한다.
제 1의 발명에 있어서, 레트로 바이러스는 비동결 상태로 유지되는 것이 가능하다. 상기 보존 방법의 하나의 구체적인 예로서 레트로 바이러스를 함유하는 용액이 공기와 접촉하지 않는 상태로 유지되는 방법이 예시된다.
제1의 발명에 있어서, 레트로 바이러스는 레트로 바이러스 생산 세포 유래의 다른 성분과 분리되어 있어도 괜찮다. 이 구체적인 예에 대한 레트로 바이러스는, 예를 들면 인산염을 완충 성분으로 함유하는 완충액에서 레트로 바이러스가 유지되는 것이 가능하다. 더 나아가, 상기 완충액은 단백질 및 당질로부터 선택되는 물질을 함유하는 용액에서 유지되어도 좋다.
제 1 발명의 레트로 바이러스의 보존 방법에서 사용되는 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질로서는 피브로넥틴의 헤파린 II 도메인을 갖는 폴리펩티드, 섬유아세포 증식 인자, V형 콜라겐의 인슐린 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드, DEAE-덱스트란, 폴리리신이 예시된다.
본 발명의 제 2 발명은 레트로 바이러스 조성물로서, 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질이 고정화된 고형상을 보유하는 용기 내에, 레트로 바이러스가 상기 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질과 결합한 상태로 봉입되어 있는 것을 특징으로 한다.
제 2 발명의 조성물로서는 레트로 바이러스를 함유하는 용액이 공기와 접촉하지 않는 상태로 용기에 봉입되어 있는 것이 예시된다.
제 2 발명의 조성물은 레트로 바이러스 생산 세포 유래의 다른 성분과 분리된 레트로 바이러스가 봉입되어 있어도 괜찮다. 또한, 상기 조성물은 인산염을 완충 성분으로 함유하는 완충액을 함유할 수 있다. 더 나아가, 상기 조성물은 단백질 및 당질로부터 선택되는 물질을 함유한 용액을 함유하는 것일 수 있다.
제 2 발명의 레트로 바이러스의 보존 방법에서 사용되는 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질로서는 피브로넥틴의 헤파린 II 도메인을 갖는 폴리펩티드, 섬유아세포 증식 인자, V형 콜라겐의 인슐린 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드, DEAE-덱스트란, 폴리리신이 예시된다.
발명의 효과
본 발명에 의하면, 레트로 바이러스 벡터를 즉시 유전자 도입가능한 상태로, 안정적으로 보존하는 것이 가능하다. 같은 품질의 레트로 바이러스 결합 용기를 안정적으로 보존함으로써, 재현성이 좋은 유전자 도입을 실시하는 것이 가능하다. 또한, 보존 용기로서 가스 투과성의 세포 배양 가방이나 분리 가방을 이용하면, 폐쇄계가 유지되므로, 저온 하에서의 수송도 가능하다.
도 1은 대조군의 도입 효율에 대한, 유전자 도입 효율의 상대치를 나타내는 그림이다.
도 2는 대조군의 도입 효율에 대한, 유전자 도입 효율의 상대치를 나타내는 그림이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명에 사용되는 레트로 바이러스는 특별히 한정되지 않는다. 유전자 도입을 목적으로 하는 경우에는 통상, 인위적으로 변경된 재조합 레트로 바이러스, 즉 레트로 바이러스 벡터가 본 발명에 사용된다. 특히, 무제한적인 감염, 유전자 도입을 방지하는 관점에서 복제능 결손 레트로 바이러스 벡터가 매우 적합하다. 해당 벡터는 감염된 세포에서 자기 복제를 할 수 없도록 복제능을 결손시켰으므로, 비병원성이다. 이러한 벡터는 척추동물 세포, 특히, 포유동물 세포와 같은 숙주 세포에 침입하여, 이의 염색체 DNA 중에, 벡터에 삽입된 외래 유전자를 안정적으로 도입할 수 있다. 공지의 복제능 결손 레트로 바이러스 벡터로서는, MFG 벡터나 α-SGC 벡터(국제공개 제 92/07943호 팜플렛), pBabe[Morgenstern J. P., Land, H., Nucleic Acids Research, 18(12):3587-3596 (1990)], pLXIN(크로텍크 사), pDON-AI(다카라 바이오 사) 등의 레트로 바이러스 벡터, 렌티 바이러스 벡터[인간 면역 부전 바이러스(HIV) 유래 벡터, 원숭이 면역 부전 바이러스(SIV) 유래 벡터 등], 또는 이것들을 변이시킨 벡터가 예시된다.
상기 레트로 바이러스 벡터에 보유시키는 외래 유전자에는 특별한 제한은 없으며, 표적의 세포로 발현시키는 것이 바람직한 임의의 유전자를 삽입하는 것이 가능하며, 폴리펩티드(효소, 성장 인자, 사이토카인, 리셉터, 구조 단백질 등), 안티센스 RNA, 리보자임, 미끼, RNA 간섭을 일으키는 RNA 등을 코딩하는 유전자가 예시 된다. 본 발명에서, 상기 외래 유전자는 적당한 프로모터, 예를 들면, 레트로 바이러스 벡터 내에 존재하는 LTR의 프로모터나 외래 프로모터의 제어 하에서, 레트로 바이러스 벡터 내에 삽입하여 사용할 수 있다. 또한, 외래 유전자의 전사를 달성하기 위해서, 프로모터 및 전사 개시 부위와 공동으로 작용하는 다른 조절 요소, 예를 들면, 인핸서 서열이 벡터 내에 존재하고 있어도 괜찮다. 더 나아가 바람직하게는, 도입된 유전자는 그 하류에 종결 서열을 함유할 수 있다. 더 나아가, 유전자가 도입된 세포의 선택을 가능하게 하는 적당한 마커 유전자(예를 들면 약제 내성 유전자, 형광 단백질을 코딩하는 유전자, β-갈락토시다아제 또는 루시퍼라아제와 같은 리포터로서 기능할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자 등)를 가지고 있어도 괜찮다.
상기 레트로 바이러스는 공지의 방법으로 조제하여, 본 발명에 사용하면 좋다. 조제 방법에 특별한 제한은 없으며, 레트로 바이러스 벡터를 사용하는 경우에는 해당 레트로 바이러스에 적절한 레트로 바이러스 생산 세포를 배양하고, 그 배양 상청액을 채취해서 본 발명에 사용할 수 있다. 상기 레트로 바이러스 생산 세포는 안정적으로 레트로 바이러스 입자를 상청액에 생산하는 것, 레트로 바이러스 백터 플라스미드의 트랜스펙션에 의해 한시적으로 레트로 바이러스 입자를 생산하는 것 등의 어떠한 것이라도 무방하다.
상기의 레트로 바이러스 생산 세포의 제작에는 공지의 팩킹 세포주, 예를 들면 PG13(ATCC CRL-10686), PA317(ATCC CRL-9078), GP+E-86이나 GP+envAm-12(미국특허 제 5,278,056호), Psi-Crip[Danos, O., Mulligan, R.C., Proc . Natl . Acad . Sci. USA, 85(17):6460-6464(1988)] 등을 사용해도 괜찮다. 또한, 트랜스펙션 효율이 높은 293 세포나 293T 세포를 이용하여 레트로 바이러스 생산 세포를 제작할 수도 있다.
본 발명에서는, 해당 레트로 바이러스 벡터의 게놈에서 유래하는 것과는 다른 이종의 바이러스 유래의 외피를 갖는 슈도타입(pseudotyped) 패키징에 의해 제작된 레트로 바이러스를 사용하는 것도 가능하다. 예를 들면 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(MoMLV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 수포성 구내염 바이러스(VSV), 고양이 내재성 바이러스(feline endogenous virus) 유래의 외피나 외피로 기능할 수 있는 단백질을 갖는 슈도 타입 레트로 바이러스를 사용할 수 있다. 더 나아가, 당쇄 합성에 관여하는 효소 유전자 등을 도입한 레트로 바이러스 생산 세포를 이용하여 제작된, 당쇄 수식을 받은 단백질을 그 표면에 갖는 레트로 바이러스 벡터도 본 발명에서 사용 가능하다.
(A) 본 발명의 레트로 바이러스의 보존 방법
본 발명은 고형상에 고정화된 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질의 존재 하에, 비동결 상태로, 레트로 바이러스를 유지하는 것을 특징으로 하는 레트로 바이러스의 보존 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 레트로 바이러스를 보존하기 위한 용기는, 세포나 체액 시료와 같은 생물학적 재료의 보존에 적절한 것, 또는 세포 배양이 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 배양 플레이트, 배양 플라스크, 분리 가방, 가스 투과성 배양 가방 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질이 고정화되는 고형상은 특별히 한정되지는 않고, 비드, 섬유 등의 여러 가지의 형상의 고형상을 사용할 수 있다. 세포 배양 시에 세포와 접촉시켰을 경우, 세포의 유지, 증식에 악영향을 주지 않는 재질의 고형상이 본 발명에는 매우 적합하다. 하나의 적절한 구체적인 예로서는 상기 레트로 바이러스를 보존하기 위한 용기가 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질을 고정화하기 위한 고형상으로서 사용된다. 상기 용기는 그 내용물이 접촉하는 면이 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질로 코팅되어 있다. 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질로서는 피브로넥틴, 헤파린 II 도메인을 갖는 피브로넥틴 절편[CH-296(레트로넥틴: RetroNectin)이나 CH-271, H-296 등], 섬유아세포 증식 인자, V형 콜라겐의 인슐린 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드, DEAE-덱스트란, 폴리리신 등이 예시된다. 고형상 표면에 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질을 고정화하는 방법에 특별한 제한은 없고, 사용하는 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질에 적절한 방법을 선택하면 좋다. 예를 들면 상기 물질을 함유하는 완충액을 사용하는 고형상과 접촉시켜, 일정시간 정치하는 방법을 들 수 있다. 또한, 특허 문헌 2, 3에도 상기 물질의 고정화 절차에 대하여 기재되어 있다.
본 발명을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 본 발명에 있어서 레트로 바이러스를 함유하는 용액과 접촉하는 공기의 양을 저감하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 구체적인 예로서 상기 용액을 공기와 접촉하지 않는 상태로 보관 유지할 수 있는 구조의 용기를 사용하는 보존 방법을 들 수 있다. 용량이 고정된 용기를 사용하는 경우에는 상기 용기를 레트로 바이러스를 함유하는 용액으로 채우는 것에 의해 실시하는 것이 가능하다. 또한, 용액량에 대해서는 내용량을 변경할 수 있는 필름상의 기질로 구성된 주머니 또는 가방 등의 용기를 사용하면 임의의 용액량의 용액을 공기와 접촉시키지 않고 유지할 수 있다. 본 발명에 사용되는 용기는 밀봉 또는 기밀 상태로, 레트로 바이러스를 함유하는 용액을 보관 유지할 수 있는 것이 바람직하다. 특히 매우 적합하게는 시판되는 세포 배양용 가방을 본 발명에 사용할 수 있다.
본 발명에서 보존되는 레트로 바이러스로서는 레트로 바이러스 생산 세포로부터 채취된 상청액, 해당 상청액으로부터 정제된 레트로 바이러스 등을 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 일단 동결 보존된 상기 상청액이나 정제 레트로 바이러스를 본 발명의 방법에 의해 비동결 상태로 보존해도 괜찮다.
본 발명의 하나의 구체적인 예에서, 레트로 바이러스는 레트로 바이러스 생산 세포 유래의 다른 성분과 분리된 상태로 보존된다. 상기 예는 통상, 하기와 같은 공정으로 실시된다.
(1) 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질이 고정화된 고형상과 레트로 바이러스를 함유하는 레트로 바이러스 생산 세포 배양 상청액을 접촉시키는 공정;
(2) 공정(1)의 고형상을 세정하는 공정; 및
(3) 공정(2)로 수득한 고형상을 완충액과 접촉시킨 상태로 유지하는 공정.
미리 정제된 레트로 바이러스를 레트로 바이러스 생산 세포 상청액으로 바꾸 어 사용하는 경우에는 상기(2)의 공정을 생략해도 괜찮다.
이 구체적인 예에서는 레트로 바이러스 생산 세포 상청액에 함유되는 성분에 의해 레트로 바이러스의 불활성화가 억제되기 때문에, 레트로 바이러스의 감염 능력이 보다 높게 유지된다.
레트로 바이러스를 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질에 결합시키는 방법에 특별한 제한은 없다. 예를 들면, 레트로 바이러스 생산 세포 배양 상청액을 상기 물질을 고정화한 고형상과 접촉시켜, 방치하는 것 외에, 원심력에 의해 레트로 바이러스를 고형상 표면에 침강시키는 방법, 고형상과 레트로 바이러스가 들어간 용기를 진동시키는 방법 등에 의해 실시하면 좋다.
상기 절차에 의해, 레트로 바이러스 결합 물질을 개입시켜 레트로 바이러스가 결합된 용기로부터 상청액을 제거하고, 필요하면, 고형상(예를 들면 용기 자체)을 세정하고, 그 다음으로, 레트로 바이러스의 보존에 적절한 용액을 용기에 첨가한다.
레트로 바이러스가 결합된 고형상의 세정에 사용하는 용액은 보존하려고 하는 레트로 바이러스의 감염성을 크게 저하시키지 않는 것이라면, 특별한 제한은 없다. 예를 들면 생리 식염수, 인산 완충 생리 식염수, 레트로 바이러스 생산 세포의 배양에 사용된 것과 같은 배지 등을 사용할 수 있다. 특히 바람직하게는 하기에 나타내는 레트로 바이러스의 보존에 사용되는 용액이 사용된다. 레트로 바이러스 생산 세포 상청액에는 레트로 바이러스의 세포로의 감염을 저해하는 물질이 존재하므로, 레트로 바이러스 생산 세포 유래의 다른 성분과 분리된 상태로 보존된 레트로 바이러스는 세포로의 감염을 실시하는데 유리하다.
본 발명에 있어서, 레트로 바이러스는 레트로 바이러스 결합 물질에 결합한 상태로, 적절한 용액에 접촉한 상태로 보존된다. 여기서 사용되는 용액은 보존하려고 하는 레트로 바이러스의 감염성을 크게 저하시키지 않는 것이라면, 특별히 제한은 없지만, 바람직하게는 인산염(인산 나트륨, 인산 칼륨 등)을 완충 성분으로 함유하는 완충액이 사용된다. 더 나아가, 레트로 바이러스를 안정화하기 위한 성분으로서 당류(포도당, 갈락토오스, 유당, 만니톨 등), 단백질[알부민, 콜라겐(젤라틴) 등]이나 그 외의 성분(무기 염류, 폴리올, 인간 혈청 등)을 상기 용액에 함유시켜도 좋다.
상기 보존 방법에 의해, 비동결 상태로 보존되어도 레트로 바이러스의 세포로의 감염 능력은 레트로 바이러스 배양 상청액을 그대로 보존하는 경우에 비해 높게 유지된다. 특별히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 본 발명에서는 저온 조건 하에서 24 시간 이상, 매우 적합하게는 48 시간 이상, 한층 더 적합하게는 72 시간 이상의 기간에 걸쳐서 레트로 바이러스의 보존이 실시된다. 덧붙여 본 발명에서 언급한 저온은 15℃ 이하이며, 보존되는 용액의 동결이 일어나지 않는 온도를 가리킨다. 매우 적합하게는 레트로 바이러스는 O ~ 10℃에서 보존된다.
본 발명의 방법에 의해, 용기에 보존된 레트로 바이러스는 그대로 감염에 이용할 수 있다. 레트로 바이러스가 외래 유전자를 보유한 재조합 레트로 바이러스일 경우에는 이 조작에 의해 세포로의 유전자 도입이 가능해진다. 레트로 바이러스의 감염은, 예를 들면 용기 중의 용액을 세포로의 레트로 바이러스 감염에 적절 한 용액으로 치환한 후(보존 용액의 용액이 레트로 바이러스의 감염에 적절한 것인 경우에는 그대로), 감염이 바람직한 세포를 상기 용기에 첨가하는 것에 의해 실시하는 것이 가능하다. 또는, 해당 보존 용기로부터 용액을 제거하고, 세포 현탁액을 추가하는 것으로 레트로 바이러스의 감염을 실시할 수 있다. 상기 감염의 공정은 정치 배양도 무방하고, 원심력으로 세포를 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질이 고정화된 고형상 표면상에 침강시키는 것에 의한 레트로 바이러스와 세포를 접촉시키는 방법으로 실시해도 좋다. 레트로 바이러스를 감염시킨 표적 세포는 해당 용기에 그대로 배양을 실시해도 좋고, 상기 조작 실시 후, 별도의 용기에 옮겨 배양을 실시해도 좋다.
레트로 바이러스 결합 물질이 표적 세포에 대해서도 친화성을 갖는 물질이었을 경우에는 상기의 조작에 의해 표적 세포와 레트로 바이러스가 용기 표면상에 함께 배치되므로, 높은 효율로 표적 세포로의 레트로 바이러스 감염이 일어난다. 예를 들면, 상기 CH-296 폴리펩티드는 조혈줄기세포에 대한 결합 활성을 가지므로, 해당 폴리펩티드와 원하는 외래 유전자를 보유하는 재조합 레트로 바이러스를 사용함으로써, 조혈줄기세포로의 유전자 도입을 간편하고 높은 효율로 실시하는 것이 가능해진다.
본 발명의 다른 구체적인 예로서 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질과 함께 표적 세포에 결합하는 활성을 갖는 물질을 고정화한 고형상을 사용하는 레트로 바이러스의 보존 방법이 예시된다. 해당 방법은 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질과 표적 세포에 결합하는 활성을 갖는 물질과 함께 레트로 바이러스가 보 존된 용기를 표적 세포로의 레트로 바이러스 감염을 위한 용기로 사용하는 것이 가능하므로, 고효율 및/또는 세포 선택적인 유전자 도입이 바람직한 유전자 치료 분야에 있어서 특히 유용하다.
상기의 구체적인 예에서 사용되는 표적 세포에 결합하는 활성을 갖는 물질로는 특별히 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 표적 세포를 인식할 수 있는 단백질이나 펩티드[표적 세포 표면의 성분을 인식하는 항체나 리셉터, 표적 세포 표면 리셉터의 리간드(성장 인자, 호르몬, 사이토카인 등)], 렉틴류, 당쇄나 당지질 등이 예시된다. 상기 물질 및 그 고정화 방법에 대해서는 상기의 비특허 문헌 3에도 기재되어 있다.
(B) 본 발명의 조성물
본 발명은 보존에 적절한 형태의 레트로 바이러스를 함유하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물에 있어서, 레트로 바이러스는 용기 내의 고형상에 고정화된 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질과 결합한 상태로 봉입되어 있는 것을 특징으로 한다. 해당 조성물은 상기 레트로 바이러스의 보존 방법의 기재에 준하여 조제하는 것이 가능하다. 또한, 상기 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질로서는 상기 레트로 바이러스의 보존 방법에서 사용 가능한 것이 예시된다.
본 발명의 하나의 구체적인 예로서 레트로 바이러스를 함유하는 용액이 공기와 접촉하지 않는 상태로 유지되고 있는 조성물이 예시된다. 더 나아가, 상기 조성물은 레트로 바이러스 생산 세포 유래의 다른 성분과 분리되어 있어도 좋다. 이 경우에는 한층 더 레트로 바이러스의 보존에 적절한 용액을 함유하는 조성물인 것이 매우 적합하다. 상기 레트로 바이러스의 보존에 적절한 용액도 상기 레트로 바이러스의 보존 방법에서 사용가능한 것을 이용하면 좋다.
본 발명에 사용되는 용기는 세포나 체액 시료와 같은 생물학적 재료의 보존에 적절한 것, 또는 세포 배양이 가능한 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 밀봉 또는 기밀 상태로, 레트로 바이러스를 함유하는 용액을 보유가능한 것이 바람직하다. 예를 들면, 시판되는 세포 배양용 가방 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 레트로 바이러스 조성물은 보존성이 뛰어남과 동시에 즉시 세포로의 레트로 바이러스의 감염이 실시가능하므로, 레트로 바이러스에 관한 연구 외, 의료 분야, 특히 재조합 레트로 바이러스 벡터를 사용하는 유전자 치료 분야에 있어서 유용하다.
하기의 실시예에 의해, 한층 더 상세하게 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 실시예의 범위로 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
1. CH -296 코팅 플레이트의 제작
표면 미처리 24 웰 플레이트(팔콘 사)에 한개의 웰 당 500 ㎕의 20 ㎍/㎖의 피브로넥틴 절편인 CH-296(상품명 레트로넥틴; 다카라 바이오 사)를 첨가하여 4℃ 에서 하룻밤 방치한 후, 2% BSA/PBS로 실온에서 30분간 차단한 다음, PBS로 세정하였다. 이 플레이트를 CH-296 코팅 플레이트로 이용하였고, 필요에 따라서 제작하였다.
2. 레트로 바이러스 벡터의 제조
레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pDOG-polII는 하기의 절차로 작제하였다. 우선, rsGFP 발현 벡터 pQBI25(Qbiogene)를 제한 효소 NheI 및 NotI으로 절단하여 775-bp의 GFP 유전자 절편을 수득하였다. 다음으로, pQBI polII(Qbiogene)를 제한 효소 NheI 및 NotI으로 절단하여 rsGFP-NeoR 융합 유전자를 제거하고, 앞서 수득한 775 bp의 rsGFP 유전자 절편을 삽입하여, polII 프로모터 제어하에 rsGFP 유전자가 발현되는 벡터 pQBI polII(neo-)를 수득하였다. pQBI polII(neo-)를 제한 효소 XhoI으로 제한하여 polII 프로모터 제어하에, GFP 발현 유닛을 포함하는 DNA 졀편을 수득하였고, 이 말단을 DNA 블런팅 키트(다카라 바이오 사)를 이용하여 평활화시켰다. 레트로 바이러스 벡터 플라스미드 pDOG-AⅠ(다카라 바이오 사)을 제한 효소 XhoI 및 SphI으로 제한하여 수득한 벡터 절편 4.58 kbp의 말단을 DNA 블런팅 키트(다카라 바이오 사)를 이용하여 평활화시킨 다음, 알카라인 포스파타아제(다카라 바이오 사)를 이용하여 탈인산화시켰다. 이 평활화된 백터에 앞서 평활화된 polII 프로모터 제어하에 rsGFP 발현 유닛을 포함하는 DNA 졀편을 DNA 라이게이션 키트(다카라 바이오 사)를 이용하여 삽입하고, rsGFP 발현 재조합 레트로 바이러스 벡터 pDOG-polII를 수득하였다.
pDOG-polII 벡터와 Retrovirus Packaging Kit Eco(다카라 바이오 사)를 사용하여 한시적으로 바이러스를 생산하였고, 에코트로픽 pDOG-polII 바이러스를 수득하였다. 에코트로픽 pDOG-polII 바이러스를 GaLV 레트로 바이러스 패키징 세포 PG13(ATCC CRL-10686)에 레트로넥틴(다카라 바이오 사) 존재 하에 감염시키고, 유전자 도입 세포 PG13/pDOG-polII를 수득하였다. PG13/pDOG-polII는 10% 우태아혈청(Thermo Trace 사)을 함유한 Dulbecco'의 변형된 Eagle 배지(DMEM, Sigma)에서 배양하였다. 세포의 성장이 반 정도의 합류상태에 이르면, 0.1 ㎖/㎠의 신선한 10% 우태아혈청을 함유한 DMEM과 교환하고, 24 시간 후에 상청액을 0.45 ㎛ 필터(Millipore)에 통과시켜 GaLV/pDOG-polII 바이러스 액을 수득하였다. 수득한 바이러스 액은 같은 양으로 분주하여 -80℃ 냉동고에 보관하고, 다음에 따르는 보존 및 유전자 도입 실험에 이용하였다.
3.바이러스 상청액 역가의 측정
바이러스 상청액 역가의 측정은 HT-1080 세포(ATCC CCL-121)를 사용하는 표준적인 방법[Markowitz, D. et al., J. Virol., 62(4):1120-1124 (1988)]에 따라 측정하였다. 즉, 6 웰 조직 배양용 플레이트의 1 웰 당 5 X 104개의 HT-1080 세포를 포함하는 10% 우태아혈청을 함유한 DMEM 2 ㎖을 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 동안 배양한 후, 배지를 흡인 제거하였다. 다음으로, 각 웰에 순차적으로 희석한 바이러스 상청액 1 ㎖를 첨가하고, 헥사디메틸렌 브로마이드(폴리브렌, 알드 리치 사)를 최종 농도 8 ㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. 이를 37℃, 5% CO2에서 4 ~ 6 시간 배양한 후, 10% 우태아혈청을 함유하는 DMEM를 1 ㎖ 첨가하여 72 시간 동안 배양하였다. 이 플레이트에서 회수한 세포를 유세포 분석기 FACS Vantage(벡톤·디킨슨 사)로 분석하고, rsGFP 발현 HT-1080 세포의 비율을 측정하였다. 웰 당 주입된 세포수에 rsGFP 발현 세포의 비율과 바이러스 상청액의 희석 배율을 곱한 값에서 상청액 1 ㎖당 감염성 입자수(I. V. P./㎖)를 산출한 것을 바이러스 역가로 하였다. 실시예 1 ~ 2에서 제조된 바이러스 액의 역가는 1.9 ×105 I. V. P./㎖부터 4.5×105 I. V. P./㎖의 범위에 있었다.
< 실시예 2>
CH-296 코팅 플레이트 를 이용한 레트로 바이러스의 보존(1)
GaLV/DOG-polII 바이러스 액의 활성은 K-562 세포(ATCC CCL-243)를 이용하여 평가하였다. K-562 세포는 10% 우태아혈청(Ther㎖ Trace 사)을 포함한 RPMI-1640 배지(시그마 사)에서 배양하였다.
24 웰 CH-296 코팅 플레이트의 1 웰 당 250 ㎕의 GaL V /DOG-polII 바이러스액(원액)을 첨가하여, 5% CO2 배양기에서 37℃, 4 시간 동안 배양하고, 레트로 바이러스 벡터를 결합시켰다. 다음으로, 각 웰 당 500 ㎕의 PBS(인산 완충 생리 식염수), 0.1% 우혈청알부민(BSA, Fraction V, 시그마 사)을 함유한 PBS 용액, 1% 우혈 청알부민을 함유한 PBS 용액, X-VIVO 15(Cambrex 사), X-VIVO 10(Cambrex 사), IMDM(인비트로젠 사) 또는 RPMI1640(시그마 사)로 2회 세정하고, 500 ㎕의 각 용매로 웰을 채워, 4℃에서 7일간 배양하였다. 한편, 상기 플레이트의 웰에 바이러스액을 첨가한 것은 세정하지 않고 7일간 배양하였다(바이러스 상청액 그대로를 배양). 7 일째에 각각의 용매를 제거하고, 4 × 104개/㎖이 되도록 제조한 K-562 세포 현탁액을 500 ㎕ 첨가하고, 5% CO2 존재 하에, 37℃에서 배양하여 유전자 도입을 실시하였다. 대조군으로서 같은 양의 바이러스 액으로, 같은 순서로, 바이러스 결합플레이트를 제조하고, 4 ℃에서 배양하지 않고 즉시 K-562 세포를 첨가하고 유전자 도입을 실시하였다. 이 세포에 대하여, rsGFP 유전자의 발현을 지표로 하여 유전자 도입 효율을 측정하였다. 대조군의 도입 효율에 대한 7일간 배양한 바이러스로의 유전자 도입 효율의 상대치를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타내었듯이, 모든 용매에서 바이러스 상청액을 그대로 방치했을 경우보다 높은 활성이 보유되므로, 레트로 바이러스 생산 세포 상청액으로부터 분리한 레트로 바이러스를 보존하는 것이 유효한 것으로 나타났다. 특히, 우혈청 알부민을 함유하는 용매는 보존 안정성이 효과적인 것으로 나타났다.
< 실시예 3>
CH-296 코팅 플레이트를 이용한 레트로 바이러스의 보존(2)
실시예 2에서, 레트로 바이러스 결합 용기의 세정에 의한 보존 안정성의 향 상이 나타났다. 다음으로는, 보다 보존 안정성의 향상에 기여할 수 있는 용매를 탐색하기 위하여, 무기염 용매로서는 인산 나트륨, 염화 칼슘과 황산마그네슘의 혼합물, 인산 나트륨과 염화 칼슘과 황산마그네슘의 혼합물, 당류로서는 포도당, D-솔비톨, 정제 백설탕, 말토스, 과당, 유당, D-만니톨, 고분자 화합물로서는 칼멜로스 나트륨, 메틸 셀룰로오스, 히드록시 프로필 셀룰로오스, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 400, 단백질로서는 정제 젤라틴, 인간 혈청알부민(HSA)에 대하여 레트로 바이러스의 보존에 관한 영향을 조사하였다. 상기 각각의 물질을, 무기염은 주사용수, 그 이외는 PBS에 용해하여, 레트로 바이러스 보존 안정 효과에 대한 시험을 하였다. 탐색의 절차는 실시예 2에 준하지만, 레트로 바이러스 결합 용기의 보존 배양은 37℃에서 3 시간으로 실시하였다. 그 결과, 40 mM 인산 나트륨 완충액 pH7, 0.5 mM 염화 칼슘 및 1 mM 황산마그네슘 함유 20 mM 인산 완충액 pH7, 1.5 ~ 20% 인간 혈청알부민 함유 PBS 용액, O.5 ~ 2.5% 정제 젤라틴 함유 PBS 용액, 5% 유당 함유 PBS 용액에서, PBS 단독의 경우보다 레트로 바이러스 벡터의 보존 안정성의 향상이 확인되었다.
이상의 결과, 기본 용매로서는 PBS보다 40 mM 인산 나트륨 완충액이 우수한 경향 및 단백질, 당류에 의한 안정성의 향상이 나타났으므로 1% 우혈청 알부민을 함유한 PBS, 1.5% 인간 혈청 알부민을 함유한 40 mM 인산 나트륨 완충액, 0.5% 정제 젤라틴 40 mM 인산 나트륨 완충액을 이용하여, 7일간 레트로 바이러스 보존 안정성 실험을 실시예 2의 절차에 따라 실시하였다. 또한, 상기 인산 나트륨 완충액의 pH는 모두 7.0으로 하였다. 대조군에서의 도입효율에 대하여, 7일간 배양한 레 트로 바이러스의 유전자 도입효율의 상대치를 산출한 결과를 도 2에 나타내었다. 도면에 나타내었듯이, 각종 용매에 옮겨 보존하면, 레트로 바이러스 생산 세포 상청액을 그대로 보존하는 경우와 비교할 경우, 비약적으로 보존 안정성이 향상됨을 알 수 있었다.
< 실시예 4>
각종 기능성 물질의 존재하에서 레트로 바이러스의 보존
본 실시예에서는 레트로 바이러스 결합 활성과 세포 접착 활성을 나타내는 기능성 물질을 이용하여 보존 안정성 평가를 실시하였다. 레트로 바이러스 결합 활성과 세포 접착 활성을 나타내는 기능성 물질로서 상기 CH-296 외에, CH-271 및 H-296[Kimizuka, F. et al., J. Biochem., 110(2):284-291 (1991)], DEAE-덱스트란(시그마 사), 폴리-L-리신(평균 분자량 3만 ~ 7만, ICN 사), DEAE-덱스트란과 피브로넥틴 절편 C-CS1[Kimizuka, F. et al., J. Biochem., 110(2):284-291 (1991)]의 혼합물, 폴리-L-리신과 C-CS1의 혼합물을 이용해 실시하였다.
표면 미처리 24 웰 플레이트(팔콘 사)에 1 웰 당 500 ㎕의 20 ㎍/㎖의 피브로넥틴 절편인 CH-296, CH-271, H-296을 첨가하였다. DEAE-덱스트란은 0.9 ㎎/㎖의 PBS 용액을, 폴리-L-리신은 40 ㎍/㎖의 PBS 용액을, 각각 1 웰 당 500 ㎕ 첨가하였다. DEAE-덱스트란과 C-CS1의 혼합물, 폴리-L-리신과 C-CS1의 혼합물에 대해서는 상기 DEAE-덱스트란 용액, 또는 폴리-L-리신 용액에 C-CS1를 4.4 ㎍/㎖가 되도록 참기하였다. 4℃에서 하룻밤 동안 방치한 후, 2% BSA/PBS로 실온에서 30분간 차단한 다음, 한번 더 PBS로 세정하였다. 이 플레이트를 기능성 물질 코팅 플레이트로 이용하였으며, 레트로 바이러스 보존 안정성 시험에 제공하였다.
각각의 기능성 물질 코팅 플레이트의 레트로 바이러스 보존 안정성 시험은 실시예 2의 절차에 따라 실시하였다. 바이러스 보존의 형태로서 바이러스 상청액을 그대로 보존하는 군, 40 mM 인산 나트륨 완충액 pH7.0에 보존하는 군, 1.5% 인간 혈청알부민 함유 40 mM 인산 나트륨 완충액 pH7.0에 보존하는 군의 3가지 군에 대하여 시험하였다. 대조군에서의 도입 효율에 대한 7일간 배양한 바이러스로의 유전자 도입 효율의 상대치를 산출한 결과를 표 1에 나타내었다.
피브로넥틴의 헤파린 II 도메인을 갖는 폴리펩티드(CH-296, CH-27 1, H-296) 외, DEAE-덱스트란이나 폴리리신을 코팅한 플레이트에서도 유전자 도입 효율이 높게 유지되었므로, 이러한 물질을 사용한 레트로 바이러스의 보존이 유효한 것이 분명해졌다. 더 나아가 세포 결합 활성을 갖는 물질(C-CS1)이 공존하는 경우에 상기 물질의 보존에 대한 영향은 볼 수 없었다.
바이러스 상청액 40 mM 인산나트륨 완충액 1.5% 인간 혈청 알부민 함유 40 mM 인산 나트륨 완충액
CH-296 9.27 54.69 88.58
CH-271 12.30 54.57 88.65
H-296 9.91 47.51 83.36
DEAE-덱스트란 10.96 81.63 106.49
DEAE-덱스트란+C-CS1 12.77 59.18 101.87
폴리리신 8.54 48.45 80.77
폴리리신+C-CS1 8.42 52.60 81.31
(표 수치의 단위는 %)
< 실시예 5>
가스 투과성 배양 가방을 이용한 레트로 바이러스의 보존
상기 CH-296에 대하여, 표면 미처리 24 웰 플레이트(파르콘 사) 및 가스 투과성 배양 가방(X-FOLDTM, 85 cm2, Nexell)을 이용하여 하기의 실험을 실시하였다.
X-FOLDTM은 하기의 절차로 CH-296로 코팅되었다.
우선, 20 ㎍/㎖의 CH-296을 가방 당 9 ㎖ 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 동안 방치하였다. 다음으로, 가방 당 30 ㎖의 PBS로 3회 세정하고, CH-296 코팅 가방을 수득하였다. 한편, 24 웰 플레이트는 실시예 1의 절차에 따라 CH-296으로 코팅하였다.
24 웰 CH-296 코팅 플레이트의 1 웰 당 500 ㎕의 GaLV/DOG-palII 바이러스액(4배 희석액)을 첨가하고, 5% CO2 배양기 37℃에서 4 시간 동안 배양하여, 레트로 바이러스 벡터를 결합시켰다. 한편, X-FOLDTM에는 같은 GaLV/DOG-palII 바이러스액을 22 ㎖ 첨가하고, 가방 내의 공기를 제거하고 밀봉한 후, 5% CO2 존재하의 37℃에서 4 시간 동안 배양하여, 레트로 바이러스 벡터를 결합시켰다. 다음으로, 각 용기를 40 mM 인산 나트륨 완충액(pH7.0) 또는 1.5% 인간 혈청알부민 함유 40 mM 인산 나트륨 완충액(pH7.0)으로, 2회 세정하고(24 웰 플레이트는 500 ㎕로, 가방은 30 ㎖로 세정), 같은 용매로, 웰 및 가방을 채운 후, 가방에 대해서는 공기를 제거하고 밀봉하여, 4℃에서 7일간 배양하였다. 더 나아가, 같은 바이러스 액을 CH-296 코팅 플레이트 및 CH-296 코팅 가방에 넣고, 가방에 대해서는 공기를 제거하고 밀봉하여, 그대로 4℃에서 7일간 배양하였다. 배양 7 일째에 각각의 용기로부터 용매를 제거하고, 4 × 104개/㎖이 되도록 제조한 K-562 세포 현탁액을 24 웰 플레이트에는 500 ㎕, 가방에는 22 ㎖을 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 존재하에서 배양하여 유전자 도입을 실시하였다. 대조군으로서는 같은 양의 바이러스 액으로 같은 절차로 바이러스 결합 용기를 제조하여, 4℃에서 배양하지 않고, 즉시 K-562 세포를 첨가하여 유전자 도입을 실시하였다. 대조군의 유전자 도입 효율에 대하여 7일간 배양했을 경우의 유전자 도입 효율의 상대치를 산출하였다.
레트로 바이러스 상청 희석액을 그대로 플레이트로 보존한 것에서는 대조군과 비교하여 10% 이하의 유전자 도입 효율 밖에는 얻을 수 없었다. 이것과 비교하여, 가방에 밀봉해 보존한 것, 레트로 바이러스를 CH-296에 결합시킨 후에 용기를 세정해 용매를 교환한 것(플레이트 및 가방)에서는 모두 대조군에 비하여 60%를 넘는 유전자 도입 효율을 얻을 수 있었다. 이 결과로 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질의 공존하에서 레트로 바이러스를 보존할 경우, 레트로 바이러스를 함유하는 용액을 공기에 접촉하지 않는 상태로 이용하는 것, 및/또는 레트로 바이러스를 레트로 바이러스 생산 세포 상청액으로부터 분리하여 이용하는 것에 의해 레트로 바이러스의 감염능의 저하를 비약적으로 억제하는 것이 분명해졌다.
< 실시예 6>
레트로 바이러스의 장기 보존
GaLV /DOG-polII 바이러스액(3.3 × 105 I. V. P./㎖)을 10% 우태아혈청을 함유한 RPMI-1640 배지에, 2배 희석한 것을 실시예 1 기재의 24 웰 CH-296 코팅 플레이트 1 웰 당 500 ㎕을 첨가하고, 5% CO2 배양기에서 37℃, 4 시간 동안 배양하여, 레트로 바이러스 벡터를 결합시켰다. 다음으로, 각 웰 당 500 ㎕의 40 mM 인산 나트륨 완충액 pH7.0 또는 1.5% 인간 혈청알부민을 함유한 40 mM 인산 나트륨 완충액 pH7.0을 이용해 플레이트를 2회 세정하고, 같은 완충액 500 ㎕로 웰을 채운 후, 4℃에서 배양하였다. 한편, 상기 플레이트의 웰에 바이러스 2배 희석액을 첨가한 것을 세정하지 않고, 4℃에서 배양하였다(바이러스 상청액을 그대로 배양). 배양 후, 1, 2, 3, 4주째에 각각의 웰의 용액을 제거하고, 4 × 104개/㎖이 되도록 제조한 K-562 세포 현탁액을 500 ㎕ 첨가하고, 37℃, 5% CO2 존재하에서 배양하여 유전자 도입을 실시하였다. 바이러스 상청액을 그대로 배양한 웰에는 500 ㎕의 40 mM 인산 나트륨 완충액 pH7.0으로 1회 세정하고, 4 × 104개/㎖이 되도록 제조한 K-562 세포 현탁액을 500 ㎕ 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 존재하에서 배양하여 유전자 도입을 실시하였다. 대조군으로서는 같은 양의 바이러스 액으로 같은 절차로 바이러스 결합 플레이트를 제조하고, 4℃에서 배양하지 않고, 즉시 K-562 세포를 첨가하여 유전자 도입을 실시하였다. 유전자 도입 효율은 유전자가 도입된 세포에서 측정하여 산출하였다. 대조군에서의 도입 효율에 대한 각각의 시험군에서 바이러스로의 유전자 도입 효율의 상대치, 즉 잔존 역가를 표 2에 나타내었다.
1주일 후 2주일 후 3주일 후 4주일 후
40 mM 인산 완충액 80.46 63.44 47.55 40.76
인간 혈청알부민을 함유한 40 mM 인산 완충액 96.19 88.75 73.23 58.93
바이러스 상청액 56.89 6.24 2.87 1.98
(표 수치의 단위는 %)
표 2에 나타내었듯이, 바이러스 상청액을 그대로 보존한 경우에는 2주일 후에 역가가 1/10 이하로 저하하는데 비하여, 레트로 바이러스를 배양 상청액과 분리(배양 상청액을 다른 완충액에 치환)한 것에서는 4주간의 보존 후에도 4할 이상의 역가를 보유하고 있었다. 단백질(인간 혈청알부민)을 함유한 완충액을 사용한 경우에 특히, 양호한 보존 안정성을 얻을 수 있었다.
< 실시예 7>
희석한 레트로 바이러스의 보존
GaLV /DOG-polII 바이러스 액(3.3 × 105 I. V. P./㎖)을 10% 우태아혈청을 함유한 RPMI-1640 배지에서, 2, 4, 8, 16배로 각각 희석하여 제조한 희석액을 실시예 1 기재의 24 웰 CH-296 코팅 플레이트의 1 웰 당 500 ㎕ 첨가하고, 5% CO2 배양기에서, 37℃에서 4 시간 배양하여, 레트로 바이러스 벡터를 결합시켰다. 다음으로, 각각의 웰 당 500 ㎕의 40 mM 인산 나트륨 완충액 pH7.0, 또는 1.5% 인간 혈청알부민을 함유한 40 mM 인산 나트륨 완충액 pH7.0을 이용하여 플레이트를 2회 세정하고, 같은 완충액 500 ㎕로 웰을 채운 후, 4℃에서 배양하였다. 한편, 상기 플레이트의 웰에 바이러스 희석액을 참가한 것을 세정하지 않고, 4℃에서 배양하였다(바이러스 상청액을 그대로 배양). 배양 후, 1, 2, 3, 4주째에 각각의 웰에서 용액을 제거하고, 4 × 104개/㎖이 되도록 제조한 K-562 세포 현탁액을 500 ㎕ 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 존재하에서 배양하여 유전자 도입을 실시하였다. 바이러스 상청액을 그대로 배양한 웰에는 500 ㎕의 40 mM 인산 나트륨 완충액 pH7.0으로 1회 세정하고, 4 × 104개/㎖이 되도록 제조한 K-562 세포 현탁액을 500 ㎕ 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 존재하에서 배양하여 유전자 도입을 실시하였다. 대조군로서는 같은 양의 바이러스 액으로 같은 절차로 바이러스 결합 플레이트를 제조하여, 4℃에서 배양하지 않고, 즉시 K-562 세포를 첨가하여 유전자 도입을 실시하였다. 유전자 도입 효율은 유전자가 도입된 세포에서 측정하여 산출하였다. 대조군에서의 도입 효율에 대한 각각의 시험군에서 바이러스로의 유전자 도입 효율의 상대치, 즉 잔존 역가를 표 3에 나타내었다.
1주일 후 2주일 후
40mM 인산 완충액
2배 희석액 71.91 64.56
4배 희석액 64.48 50.69
8배 희석액 59.06 43.90
16배 희석액 58.94 44.28
인간 혈청알부민을 함유한 40mM 인산 완충액
2배 희석액 96.24 90.12
4배 희석액 94.56 85.16
8배 희석액 91.76 86.87
16배 희석액 101.96 99.02
바이러스 상청액
2배 희석액 48.30 8.34
4배 희석액 38.80 7.35
8배 희석액 29.80 6.65
16배 희석액 28.24 7.64
(표 수치의 단위는 %)
표 3에 나타내었듯이, 바이러스의 희석액을 그대로 보존한 경우에는 어떤 희석율에서도 역가의 빠른 저하가 인정되었다. 한편, 바이러스 액의 희석액을 플레이트에 결합한 후, 배양 상청액을 다른 완충액으로 치환한 경우에는 역가의 저하가 현저하게 억제되었다. 사용한 바이러스 액의 희석율은 바이러스 역가의 보존 안정성에 현저한 영향을 주지 않았고, 특히 단백질(인간 혈청알부민)을 함유하는 완충액을 사용한 경우에는 희석율의 영향은 전혀 볼 수 없었다. 이러한 결과로부터, 본 발명의 방법이 저역가, 또는 희석된 바이러스 액의 레트로 바이러스의 보존에도 유효한 것이 분명해졌다.
본 발명은 레트로 바이러스의 보존 방법 및 레트로 바이러스 조성물을 제공 한다. 상기 보존 방법은 레트로 바이러스를 즉시 세포로의 감염에 이용가능한 상태로 보존하는 것이므로, 레트로 바이러스의 연구, 유전자 치료를 포함하는 의료 분야에 유용하다. 또한, 상기 조성물도 상기와 같은 분야에 유용하다.

Claims (13)

  1. 고형상에 고정화된 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질의 존재하에 레트로 바이러스를 유지하는 것을 특징으로 하는 레트로 바이러스의 보존 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 비동결 상태로 레트로 바이러스가 유지되는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 레트로 바이러스를 함유하는 용액이 공기와 접촉하지 않는 상태로 유지되는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 레트로 바이러스 생산 세포 유래의 다른 성분과 분리되어 레트로 바이러스가 유지되는 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 인산염을 완충 성분으로서 함유하는 완충액에서 레트로 바이러스가 유지되는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 단백질 및 당류로부터 선택되는 물질을 함유하는 용액에서 레트로 바이러스가 유지되는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질은 피브로넥틴의 헤파린 II 도메인을 갖는 폴리펩티드, 섬유아세포 증식 인자, V형 콜라겐의 인슐린 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드, DEAE-덱스트란, 폴리리신으로부터 선택되는 물질인 방법.
  8. 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질이 고정화된 고형상을 유지하는 용기 내에, 상기 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질과 결합한 상태로 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 레트로 바이러스 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 레트로 바이러스를 함유하는 용액이 공기와 접촉하지 않는 상태로 용기에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  10. 제 8항에 있어서, 레트로 바이러스 생산 세포 유래의 다른 성분과 분리된 레트로 바이러스가 용기에 봉입되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 추가적으로 인산염을 완충 성분으로 함유하는 완충액을 함유하는 조성물.
  12. 제 10항에 있어서, 추가적으로 단백질 및 당류로부터 선택되는 물질을 함유하는 용액을 함유하는 조성물.
  13. 제 8항에 있어서, 레트로 바이러스 결합 활성을 갖는 물질은 피브로넥틴의 헤파린 II 도메인을 갖는 폴리펩티드, 섬유아세포 증식 인자, V형 콜라겐의 인슐린 결합 도메인을 갖는 폴리펩티드, DEAE-덱스트란, 폴리리신으로부터 선택되는 물질인 조성물.
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