JP3564461B2

JP3564461B2 - レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入方法

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Publication number: JP3564461B2
Application number: JP2002066834A
Authority: JP
Inventors: 起代蔵浅田; 隆司上森; 高嗣上野; 信人小山; 仁一橋野; 郁之進加藤
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1995-11-13
Filing date: 2002-03-12
Publication date: 2004-09-08
Anticipated expiration: 2016-11-07
Also published as: JP2002325595A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医学、細胞工学、遺伝子工学、発生工学などの分野において標的細胞への遺伝子導入効率を向上させ、標的細胞の形質転換を効率良く行うことを可能にする方法およびそれに関連する一連の技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】
多数のヒト疾病についてその機構が解明され、また、組換えＤＮＡ技術、および細胞への遺伝子導入技術が急速に進歩したことより、近年、重篤な遺伝病を治療するための体細胞遺伝子治療法のプロトコールの開発が進められている。また、最近では遺伝病のみならずＡＩＤＳのようなウイルス感染症やガンの治療にも遺伝子治療を適用しようという試みがなされている。
【０００３】
これまでに米国食品医薬品局（ＦＤＡ）が承認したヒトでの遺伝子導入試験の大部分は組換えレトロウイルスベクターを用いて細胞への遺伝子導入を行うものである。レトロウイルスベクターは目的の外来遺伝子を細胞内に効率的に導入し、その染色体ＤＮＡ中に安定に組み込むので、特に長期にわたる遺伝子発現が望まれる遺伝子治療にとって好ましい遺伝子導入手段である。該ベクターは遺伝子導入された生物に悪影響を与えないように様々な工夫が施されている。例えば、遺伝子導入に用いられたベクター自体が細胞内で複製を行い、無制限な感染（遺伝子導入）を繰り返さないよう、ベクター中の複製機能は欠損させてある。これらのベクター（複製能欠損レトロウイルスベクター）は自己複製できないため、一般的にはレトロウイルス産生細胞（パッケージング細胞）を使用してウイルス粒子に包まれたレトロウイルスベクターを調製する。
【０００４】
一方、骨髄細胞はイン−ビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）での取り扱いが可能なこと、および自己複製能を有する造血幹細胞を含有していることから、体細胞遺伝子治療法の良好な標的細胞である。また、臍帯血液も造血幹細胞を含む多数の原始前駆細胞を含有していることがこれまでに証明されている。これらの標的細胞に遺伝子を導入して生体に移植する遺伝子治療を行うことにより、導入された遺伝子が血液細胞中で長期にわたり発現され、疾病を生涯治癒することができる。
【０００５】
しかし、多数のグループによって研究が進められているにもかかわらず、造血幹細胞は高効率の遺伝子導入の難しい細胞の一つである。これまで、マウスやその他の動物の造血幹細胞に関して最も効率の良い遺伝子導入のプロトコールは、造血幹細胞をレトロウイルス産生細胞とともに共培養するという方法であったが、安全性についての懸念から、ヒトにおける臨床的な遺伝子治療法には、レトロウイルス産生細胞の混入の危険性の低い無細胞系での遺伝子導入が望まれている。残念ながら、レトロウイルス産生細胞との共培養を行わずに造血幹細胞に効率的に遺伝子を導入することは容易ではない。
【０００６】
最近、細胞外マトリックスの成分であるフィブロネクチンや、そのフラグメントが、単独でレトロウイルスによる細胞への遺伝子導入効率を向上させることが報告されている（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、第９３巻、第１４５１〜１４５７頁、１９９４年、Ｂｌｏｏｄ、第８８巻、第８５５〜８６２頁、１９９６年）。また、遺伝子工学的に生産されたフィブロネクチンフラグメントも同様の性質を有しており、これを利用して造血幹細胞に効率よく外来遺伝子を導入させることが可能であることも示された（ＷＯ９５／２６２００号）。こうしたフィブロネクチンによる遺伝子導入効率の向上には、フィブロネクチン中のヘパリン結合領域と、レトロウイルスとの結合が関与していることが示唆されている。これらのフィブロネクチンや、フィブロネクチンフラグメントを利用した方法は、全てフィブロネクチンや、そのフラグメントを固定化したプレート中で細胞にレトロウイルスベクターを感染させるものである。
【０００７】
上記のフィブロネクチンや、フィブロネクチンフラグメントを利用した遺伝子導入法は、レトロウイルス結合部位と標的細胞部位を同一の分子上に有するフィブロネクチンあるいはそのフラグメント分子によって達成されると考えられている（ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅ、第２巻、第８７６〜８７２頁、１９９６年）。したがって、上記の方法を応用して種々の標的細胞に効率良く遺伝子を導入するためには、細胞に応じて一つの分子上にウイルスと細胞の結合部位を有する機能性物質を作製する必要があり、普遍的な遺伝子導入法として利用するためには、なお問題を有している。
【０００８】
また、上記の方法は、レトロウイルス感染時に標的細胞の培養に使用するプレートの表面にフィブロネクチンあるいはフィブロネクチンフラグメントを固定化することによって達成されているが、プレートへの固定化は煩雑な操作を要し、簡便な遺伝子導入法とは言えない。
【０００９】
さらに、上記の方法に使用される機能性物質は、レトロウイルス結合部位としてフィブロネクチン由来のヘパリン結合領域を含むものに限られている。このため、これ以外のレトロウイルス結合物質を見いだすことにより、さらに優れた遺伝子導入方法を開発する可能性がある。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、このような問題を解決し、より簡便かつ効率のよい遺伝子導入法を提供すべくなされたものである。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、フィブロネクチンあるいはそのフラグメントに代表される機能性物質によるレトロウイルス感染促進作用が、レトロウイルス結合部位を有する領域と、細胞結合部位を有する領域とが同一分子上に存在しない場合においても認められることを見いだした。すなわち、レトロウイルス結合部位を有する有効量の機能性物質と、遺伝子導入の標的細胞への結合部位を有する機能性物質とを混合して使用することにより、標的細胞へのレトロウイルスによる遺伝子導入効率を向上させることができることを見いだした。
【００１２】
また、本発明者らは、機能性物質によるレトロウイルス感染促進作用が、機能性物質をプレートの表面に固定化しない状態であっても認められることも見いだした。また、機能性物質を固定化したビーズの存在下にレトロウイルスを標的細胞に接触させた場合にも、標的細胞への遺伝子導入効率が向上されることを見いだした。
【００１３】
本発明者らは、また、フィブロネクチン由来のヘパリン結合領域を含まないレトロウイルス結合性物質を見いだし、該物質およびそれらの誘導体がレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入に有用であることも見いだした。さらに、本発明者らは、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入に有用な機能性物質を創成することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【００１４】
かくして、本発明の第１の発明はレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる方法に関し、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入において、レトロウイルス結合部位を有する有効量の機能性物質と、標的細胞結合部位を有する他の有効量の機能性物質との混合物の存在下で、標的細胞をレトロウイルスで感染させることを特徴とする。
【００１５】
本発明の第１の発明のレトロウイルス結合部位を有する機能性物質は特に限定するものではなく、例えば、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域、線維芽細胞増殖因子、コラーゲン、ポリリジンまたはそれらと機能的な同等物から選択される機能性物質である。また、標的細胞結合部位を有する機能性物質とは、標的細胞に結合するリガンドを含有する物質であればよい。当該リガンドとしては、細胞接着性のタンパク質、ホルモン、サイトカイン、抗体、糖鎖、炭水化物または標的細胞の代謝物等があり、細胞接着性のタンパク質としては、例えば、フィブロネクチンの細胞結合領域ポリペプチドがある。当該フィブロネクチンの細胞結合領域としては、ＶＬＡ−５および／またはＶＬＡ−４への結合領域ポリペプチドがある。また、他のリガンドとしてはエリスロポエチンが挙げられる。
【００１６】
第１の発明に使用する機能性物質は非固定化でも、固定化されていてもよく、特にビーズに固定化することにより、簡便に使用できる。また、標的細胞に結合部位を有する機能性物質として、標的細胞に特異的なリガンドを選択することにより、第１の発明により、簡便に標的細胞への遺伝子導入のターゲッテングが可能になる。
【００１７】
上記のごとく、従来のＷＯ９５／２６２００号や、ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅに開示される方法においては、レトロウイルスと標的細胞が、レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位とを同一分子上に有する機能性物質上で共配置することが、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる機構において必須とされている。しかしながら、本発明により、レトロウイルス結合部位を有する有効量の機能性物質と、標的細胞結合部位を有する他の有効量の機能性物質との混合物の存在下でレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入を行うと、遺伝子導入効率が向上する。
【００１８】
本発明の第２の発明は、レトロウイルス結合部位を有する有効量の機能性物質と、標的細胞結合部位を有する他の有効量の機能性物質との混合物を含有するレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入に使用する標的細胞の培養培地に関する。
【００１９】
第２の発明の培地を使用することにより、第１の発明が簡便に実施することができる。
【００２０】
本発明の第３の発明はレトロウイルスの配置方法に関し、レトロウイルス結合部位を有する有効量の機能性物質と、標的細胞結合部位を有する他の有効量の機能性物質との混合物と接触したレトロウイルスを含有する培地を、インキュベートすることを特徴とする。
【００２１】
本発明の第４の発明は、標的細胞内へのレトロウイルス介在遺伝子導入の実施に使用するためのキットであって、
（ａ）レトロウイルス結合部位を有する有効量の機能性物質および／または標的細胞結合部位を有する他の有効量の機能性物質、
（ｂ）レトロウイルスと接触した標的細胞をインキュベートするための人工基質、および
（ｃ）上記標的細胞を予備刺激するための標的細胞増殖因子、
を含んでなることを特徴とするキットに関する。
【００２２】
第４の発明のキットを使用することにより、第１および第３の態様をそれぞれ簡便に行うことができる。
【００２３】
本発明の第５の発明は、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる方法に関し、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入に際し、標的細胞結合部位と、線維芽細胞増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス結合部位またはそれらと機能的な同等物とを同一分子上に有する有効量の機能性物質の存在下で、標的細胞をレトロウイルスで感染させることを特徴とするレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入を向上させる方法である。
【００２４】
上記のＷＯ９５／２６２００号公報およびＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅに記載される従来の方法においては、最も効率よく、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入を向上させる方法に使用できる物質として、フィブロネクチンのフラグメントが開示されている。しかしながら、フィブロネクチンフラグメント以外の機能性物質でどのような機能性物質が効率よくレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入を向上させる方法に使用できるかについては、具体的な開示はない。特に、この従来の方法において、レトロウイルス結合部位とは、フィブロネクチンのリピート１２−１４が開示されているのみである。
【００２５】
本発明者らは、このフィブロネクチンのリピート１２−１４とは、構造的相関の全くない、線維芽細胞増殖因子、コラーゲン、ポリリジン等が、意外にも、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入を向上させる方法において有効に使用できることを見いだした。したがって、これらの物質と機能的な同等物、すなわち、これらの物質と機能的に同等のレトロウイルス結合部位を有し、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる能力を有する物質は、いずれも第５の発明において使用することができる。
【００２６】
第５の発明において、標的細胞結合部位には、標的細胞に結合するリガンドを含有する物質が使用でき、これはレトロウイルス結合部位と結合している。
【００２７】
当該リガンドとしては、例えば、細胞接着性のタンパク質、ホルモン、サイトカイン、抗体、糖鎖、炭水化物または標的細胞の代謝物等が挙げられる。細胞接着性のタンパク質の一例としては、フィブロネクチンの細胞結合領域ポリペプチドが挙げられ、例えば、ＶＬＡ−５および／またはＶＬＡ−４への結合領域ポリペプチドが使用できる。他のリガンドとしては、エリスロポエチンが挙げられる。
【００２８】
第５の発明において、レトロウイルス結合部位として供される線維芽細胞増殖因子としては、例えば、配列表の配列番号３で表される線維芽細胞増殖因子、該因子の機能的同等物や、該因子または該因子の機能的同等物を含有するポリペプチドから選択される線維芽細胞増殖因子がある。
【００２９】
これらの機能性物質としては、例えば、配列表の配列番号４または５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。
【００３０】
第５の発明において、レトロウイルス結合部位として供されるコラーゲンとしては、例えば、Ｖ型コラーゲン由来のインスリン結合部位を含有するフラグメント、該フラグメントの機能的同等物や、該フラグメントまたは該フラグメントの機能的同等物を含有するポリペプチドから選択されるコラーゲンがある。また、当該フラグメントとしては、例えば、配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列を含有するフラグメントが挙げられる。
【００３１】
これらの機能性物質としては、配列表の配列番号７または８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。
【００３２】
第５の発明において、レトロウイルス結合部位として供されるポリリジン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎｅ）とはＬ−リジン（ｌｙｓｉｎｅ）の重合体であって、例えば、市販のポリリジンより適当な重合度のポリリジンを選択し使用することができる。
【００３３】
線維芽細胞増殖因子、コラーゲン、またはポリリジン由来のレトロウイルス結合部位が同時に標的細胞結合部位を有する場合においては、この線維芽細胞増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス結合部位を有する有効量の機能性物質の存在下で、標的細胞をレトロウイルスで感染させることによって、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させることができる。また、標的細胞が接着性細胞の場合には、該機能性物質にレトロウイルスと標的細胞とがそれぞれ結合、接着し、この線維芽細胞増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス結合部位を有する有効量の機能性物質の存在下で、標的細胞をレトロウイルスで感染させることによって、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させることができる。
【００３４】
なお、配列表の配列番号１で表されるポリペプチド（以下、Ｈ−２７１と称す）が同時に標的細胞結合部位を有する場合、すなわち、標的細胞が該ポリペプチド、Ｈ−２７１、に結合性を有する場合においても、有効量のこのポリペプチドの存在下で、標的細胞をレトロウイルスで感染させることによって、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させることができることも見いだした。
【００３５】
すなわち、上記ＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅによれば、フィブロネクチンのリピート１２−１４がレトロウイルス結合部位と開示されているが、本発明者らは、意外にも、このＨ−２７１が標的細胞の種類によっては、標的細胞結合部位として、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率の向上に有効に機能することを見いだした。また、標的細胞が接着性細胞の場合にも、このポリペプチドにレトロウイルス、標的細胞がそれぞれ結合、接着し、有効量のこのポリペプチドの存在下で、標的細胞をレトロウイルスで感染させることによって、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させることができることも見いだした。
【００３６】
第５の発明において当該機能性物質は固定化されていてもよく、固定化されていなくてもよいが、標的細胞が接着性細胞の場合は、固定化して用いるのが効率の良い方法である。
【００３７】
本発明の第６の発明は、標的細胞結合部位と、線維芽細胞増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス結合部位またはそれらと機能的な同等物とを同一分子上に有する有効量の機能性物を含有するレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入に使用する標的細胞の培養培地に関する。
【００３８】
本発明の第７の発明は、上記した線維芽細胞増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス結合部位を有する有効量の機能性物質と接触したレトロウイルスを含有する培地をインキュベートするレトロウイルスの配置方法に関する。これらの機能性物質は、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入を向上させる方法において、レトロウイルスの配置に有効に使用できる。
【００３９】
また、本発明のレトロウイルスの配置方法では、標的細胞結合部位と線維芽細胞増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス結合部位またはそれらと機能的な同等物とを同一分子上に有する有効量の機能性物質と接触したレトロウイルスを含有する培地をインキュベートすることも包含する。
【００４０】
本発明の第８の発明は、標的細胞内へのレトロウイルス介在遺伝子導入の実施に使用するためのキットであって、
（ａ）標的細胞結合部位と、線維芽細胞増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス結合部位またはそれらと機能的な同等物とを同一分子上に有する有効量の機能性物質、
（ｂ）レトロウイルスと接触した標的細胞をインキュベートするための人工基質、および
（ｃ）上記標的細胞を予備刺激するための標的細胞増殖因子、
を含んでなることを特徴とするキットに関する。
【００４１】
これらの第１および第５の方法の発明、第２および第６の培地の発明、第３および第７の方法の発明ならびに第４および第８のキットの発明、いずれにおいても、機能性物質のビーズ固定化物が好適に使用できる。
【００４２】
本発明の第９の発明は、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる方法に関し、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入において、実質的に純粋なフィブロネクチン、実質的に純粋なフィブロネクチンフラグメントおよびそれらの混合物より選択される有効量のビーズに固定化された機能性物質の存在下で、標的細胞をレトロウイルスで感染させることを特徴とする。
【００４３】
本発明の第１０の発明もレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる方法に関し、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入において、実質的に純粋なフィブロネクチン、実質的に純粋なフィブロネクチンフラグメントおよびそれらの混合物より選択される有効量の固定化されていない機能性物質の存在下で、標的細胞をレトロウイルスで感染させることを特徴とする。
【００４４】
上記のＷＯ９５／２６２００号およびＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅの方法においては、レトロウイルスと標的細胞が、レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位を同一分子上に有する機能性物質上で共配置することが、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる機構において必須である。この方法において、レトロウイルスと標的細胞を、レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位を同一分子上に有する機能性物質上に共配置させるには、レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位を同一分子上に有する機能性物質を培養基に固定化させることによりはじめて可能になる。
【００４５】
しかしながら、本発明によれば、これらの実質的に純粋なフィブロネクチン、実質的に純粋なフィブロネクチンフラグメントおよびそれらの混合物を用いる場合においても、意外にも、上記レトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位を同一分子上に有する機能性物質上が培養基に固定化された状態でなくても、効率よく、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率が向上する。
【００４６】
第１、第５、第９および第１０の発明において、標的細胞としては、例えば、幹細胞（ｓｔｅｍｃｅｌｌｓ）、造血細胞、非接着性低密度単核細胞、接着性細胞、骨髄細胞、造血幹細胞、末梢血幹細胞、臍帯血液細胞、胎児性造血幹細胞、胚形成幹細胞、胚細胞、プライモディアル・ジャーム・セル（ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌｇｅｒｍｃｅｌｌ）、卵母細胞、卵原細胞、卵子、精母細胞、精子、ＣＤ３４＋細胞、Ｃ−ｋｉｔ＋細胞、多能性造血前駆細胞、単能性造血前駆細胞、赤血球系前駆細胞、リンパ球母細胞、成熟血球、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、線維芽細胞、神経芽細胞、神経細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝細胞、筋芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、ガン細胞、骨髄腫細胞および白血病細胞から選択される細胞が使用できる。
【００４７】
第１、第３、第５、第７、第９および第１０の発明において、レトロウイルスとしては、外来遺伝子を含有するレトロウイルスを使用することができ、また、レトロウイルスとしては、例えば、組換え体レトロウイルスベクターが使用できる。さらに、レトロウイルスとしては、例えば、複製能を欠損した組換え体レトロウイルスベクターを使用することができる。
【００４８】
本発明の第１１の発明は、上記の第１、第５、第９および第１０の発明で得られる遺伝子導入細胞に関する。
【００４９】
本発明の第１２の発明は、第１１の発明の遺伝子導入細胞を脊椎動物に移植する細胞移植方法に関する。
【００５０】
本発明の第１３の発明は、配列表の配列番号１３で表されるレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させるポリペプチドまたはその機能的同等物に関する。
【００５１】
本発明の第１４の発明は、第１３の発明のポリペプチドをコードする遺伝子に関する。かかる遺伝子の例としては、配列表の配列番号１７で表される遺伝子または厳密な条件下で該遺伝子にハイブリダイズし、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させるポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。
【００５２】
上記ＷＯ９５／２６２００号およびＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅの方法において、最も効率よく遺伝子導入に使用できるのはＣＨ−２９６である。一方、本発明者らは、ＶＬＡ−５結合部位、ＶＬＡ−４結合部位を有さない、上記ポリペプチドが意外にも、本発明に使用できることを見いだした。
【００５３】
本発明の第１５の発明は、配列表の配列番号３０で表されるレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させるポリペプチドまたはその機能的同等物に関する。
【００５４】
本発明の第１６の発明は、第１５の発明のポリペプチドをコードする遺伝子に関する。かかる遺伝子の例としては、配列表の配列番号３３で表される遺伝子または厳密な条件下で該遺伝子にハイブリダイズし、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させるポリペプチドをコードする遺伝子が挙げられる。
【００５５】
本発明の第１７の発明は配列表の配列番号５で表されるレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させるポリペプチドまたはその機能的同等物に関する。
【００５６】
本発明の第１８の発明は、第１７の発明のポリペプチドをコードする遺伝子に関する。かかる遺伝子の例としては、配列表の配列番号２６で表される遺伝子または厳密な条件下で該遺伝子にハイブリダイズし、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させるポリペプチドをコードする遺伝子がある。
【００５７】
【発明の実施の形態】
本発明の遺伝子導入方法には、通常、組換えレトロウイルスベクターが使用され、特に、複製能欠損組換えレトロウイルスベクターが好適である。該ベクターは感染した細胞中で自己複製できないように複製能を欠損させてあり、非病原性である。これらのベクターは脊椎動物細胞、特に、哺乳動物細胞のような宿主細胞に侵入し、その染色体ＤＮＡ中にベクターに挿入された外来遺伝子を安定に組み込むことができる。
【００５８】
本発明では、細胞に導入しようとする外来遺伝子は適当なプロモーター、例えば、レトロウイルスベクター中に存在するＬＴＲのプロモーターや外来プロモーターの制御下に、組換えレトロウイルスベクター内に挿入して使用することができる。また、外来遺伝子の転写を達成するためにはプロモーターおよび転写開始部位と共同する他の調節要素、例えば、エンハンサー配列がベクター内に存在していてもよい。さらに、好ましくは、導入された遺伝子はその下流にターミネーター配列を含有することができる。導入される外来遺伝子は天然のものでも、または人工的に作製されたものでもよく、あるいは起源を異にするＤＮＡ分子が、ライゲーションや当該技術分野で公知の他の手段によって結合されたものであってもよい。
【００５９】
レトロウイルスベクターに挿入される外来遺伝子は、細胞中に導入することが望まれる任意の遺伝子を選ぶことができる。例えば、外来遺伝子は、治療の対象となる疾患に関連している酵素や、タンパク質、アンチセンス核酸もしくはリボザイムまたはフォルスプライマー（例えば、ＷＯ９０／１３６４１号参照）、細胞内抗体（例えば、ＷＯ９４／０２６１０号参照）、増殖因子等をコードするものを使用することができる。
【００６０】
本発明で用いるレトロウイルスベクターは、遺伝子導入された細胞の選択を可能にする適当なマーカー遺伝子を有していてもよい。マーカー遺伝子としては、例えば、細胞に抗生物質に対する耐性を付与する薬剤耐性遺伝子や、酵素活性の検出によって遺伝子導入された細胞を見分けることができるレポーター遺伝子が利用できる。
【００６１】
使用できるベクターには、例えば、公知のＭＦＧベクター（ＡＴＣＣＮｏ．６８７５４）やα−ＳＧＣ（ＡＴＣＣＮｏ．６８７５５）等のレトロウイルスベクターがある。また、本願明細書の下記の実施例において使用したＮ２／ＺｉｐＴＫＮＥＯベクター（ＴＫＮＥＯ、Ｂｌｏｏｄ、第７８巻、第３１０〜３１７頁、１９９１年）およびＰＭ５ｎｅｏベクター（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、第２３巻、第６３０〜６３８頁、１９９５年）は、いずれもマーカー遺伝子としてネオマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子）を含有している。したがって、これらのベクターによって遺伝子導入された細胞は該遺伝子産物により不活化される抗生物質（ネオマイシン、Ｇ４１８等）に対する耐性を有する細胞として確認することができる。また、これらのベクターは公知のパッケージング細胞株、例えば、公知のＰＧ１３（ＡＴＣＣＣＲＬ−１０６８６）、ＰＧ１３／ＬＮｃ８（ＡＴＣＣＣＲＬ−１０６８５）、ＰＭ３１７（ＡＴＣＣＣＲＬ−９０７８）や米国特許５，２７８，０５６号に記載の細胞株、ＧＰ＋Ｅ−８６（ＡＴＣＣＣＲＬ９６４２）やＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２（ＡＴＣＣＣＲＬ９６４１）等の細胞株を使用することにより、該ベクターがパッケージングされたウイルス粒子として調製することができる。
【００６２】
本明細書において、機能性物質の有効量とは、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入により、標的細胞の形質転換が生じるのに有効な量であり、用いる機能性物質、レトロウイルスおよび標的細胞の種類により、本明細書記載の方法により、選定することができる。また、遺伝子導入効率とは、形質転換効率を意味する。
【００６３】
レトロウイルスと結合し、その結果、本発明で有効に役立つ機能性物質の能力は、下記実施例に記載したような、定型的な方法を使用して確認することができる。
【００６４】
これらのアッセイは、レトロウイルス粒子がマトリックス上に固定された本発明に使用できる機能性物質と結合して、その結果、レトロウイルスがマトリックスからの洗い流しに抵抗する程度を測定する。簡単に言えば、例えば、ウイルス含有上清液を、レトロウイルス結合部位を有する機能性物質の固定物を含有するウエル中でインキュベートする。ついで、このウエルを生理的食塩緩衝液で徹底的に洗浄し、その後、標的細胞をウエル内でインキュベートしてウエル内に残存しているウイルスの感染活性値を測定する。最初にウエルに添加されたウイルス上清液と比較して、感染活性または力価の減少を評価し、類似する対照実施（例えば、ＢＳＡ固定化ウエルを使用して）と比較する。対照ウエルと比較して、本発明の機能性物質を固定化したウエル内の残存力価が顕著に高いことは、当該物質が本発明のレトロウイルス結合部位を有する機能性物質として用いることができることを意味する。
【００６５】
このスクリーニング方法を促進するために、ウイルスベクターは選択可能なマーカー遺伝子を含有することができる。
【００６６】
この方法により、本発明で使用するレトロウイルス結合部位を有する機能性物質のスクリーニングを行うことができる。
【００６７】
このようなレトロウイルス結合部位を有する機能性物質としては、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域、線維芽細胞増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス結合部位を有する機能性物質が挙げられる。
【００６８】
本発明で使用される機能性物質の細胞結合部位、すなわち、標的細胞結合性のリガンドを含有する物質と、細胞との結合は慣用の方法を使用して同様にアッセイすることができる。例えば、このような方法には、Ｎａｔｕｒｅ３５２：４３８〜４４１（１９９１年）に記載された方法が含まれる。
【００６９】
簡単に言えば、細胞結合部位を有する機能性物質を培養プレート上に固定化し、アッセイすべき細胞集団は培地に重層して３０分から２時間置く。このインキュベーション期間後に、機能性物質に接着していない細胞を回収し、計数し、生存性についてアッセイする。機能性物質と接着した細胞もトリプシンまたは細胞解離緩衝液（例えば、Ｇｉｂｃｏ）を使用して回収し、計数し、そして生存性を試験する。場合によっては、例えば、造血コロニー形成細胞では、細胞をさらに１２〜１４日間培養して細胞のコロニー形成特性を確認する。ついで、接着細胞の割合を計算し、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を固定化した培養プレートのような標準ないし標準対照と比較する。標的細胞とアッセイした機能性物質の実質的な結合によって、機能性物質／細胞の組合せが本発明に適しており、この標的細胞結合部位を有する機能性物質を、レトロウイルス結合部位を有する機能性物質と結合または共存させて、ウイルスベクターによる標的細胞の感染を測定することによって、本発明に使用する機能性物質を構築することができる。
【００７０】
本発明に使用できるレトロウイルス結合部位を有する機能性物質としては、上記のように、線維芽細胞増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス結合部位が選択できるが、これらの物質と同等のレトロウイルス結合活性を有し、標的細胞結合部位を有するリガンドとの結合または共存において、レトロウイルスによる標的細胞の遺伝子導入効率を向上させる物質は全て、線維芽細胞増殖因子、コラーゲンまたはポリリジン由来のレトロウイルス結合部位と機能的な同等物に包含される。
【００７１】
上記方法により、選定されたレトロウイルス結合部位を有する機能性物質と、標的細胞結合部位を有する機能性物質との結合または共存下において、本発明の遺伝子導入方法に使用する標的細胞、レトロウイルスを使用し、その遺伝子導入効率の向上性を測定することにより本発明に使用する機能性物質の有効量が決定できる。
【００７２】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の１つの態様は、レトロウイルスベクターによる標的細胞への遺伝子導入効率を高める方法である。この方法は、レトロウイルスベクターによる細胞への遺伝子導入効率を高めるのに有効な、レトロウイルス結合部位を有する機能性物質と、標的細胞結合部位を有する他の機能性物質との混合物の共存下にレトロウイルスベクターを生存可能な標的細胞に感染させることを特徴とする。
【００７３】
この方法は、レトロウイルスベクターによって遺伝子導入された遺伝子導入細胞を得る方法として使用でき、該細胞を生物個体に移植することによる生物個体への遺伝子導入を可能にする。
【００７４】
用いるレトロウイルス結合部位を有する機能性物質としては、特に限定はなく、例えば、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域、線維芽細胞増殖因子、コラーゲン、ポリリジン等があり、またこれらの機能性物質と機能的に同等な物質、例えば、ヘパリン結合性部位を有する機能性物質も使用することができる。また、該機能性物質の混合物、該機能性物質を含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体、該機能性物質の誘導体等を使用することができる。これらの機能性物質は、天然起源の物質から得ることができ、また、人為的に作製する（例えば、遺伝子組換え技術や化学合成技術によって作製する）ことができ、さらに、天然起源の物質と人為的に作製された物質との組合せにより作製することもできる。
【００７５】
なお、用いる機能性物質は、本明細書中に示される高効率での遺伝子導入の達成が可能なレトロウイルス結合部位および／または標的細胞結合部位を有している範囲においては、天然起源のポリペプチドのアミノ酸配列に変異が生じたものであってもよい。本明細書においては天然起源のポリペプチドのアミノ酸配列中の１あるいは、例えば、数個までの複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されていても、所望のレトロウイルス結合部位および／または標的細胞結合部位を有する限り、そのポリペプチドを天然アミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的同等物と呼ぶ。これらの機能的同等物は、該機能的同等物をコードする遺伝子を作製、使用して当該機能的同等物を作製したうえ、その生物活性を確認することにより得ることができる。
【００７６】
この点に関して、関連バイオテクノロジー技術は、対象の機能的領域中のアミノ酸の欠失、置換、付加または他の修飾を定型的に実施することができる状態にまで進歩している。つぎに、得られたアミノ酸配列は、所望の細胞結合活性またはウイルス結合活性について定型的に上記のスクリーニングに付すことができる。
【００７７】
また、該機能性同等物をコードする遺伝子は、上記の機能性物質をコードする遺伝子にハイブリダイズする遺伝子を検索することにより、得ることができる。
【００７８】
すなわち、上記の機能性物質をコードする遺伝子またはその塩基配列の一部をハイブリダイゼーションのプローブまたはＰＣＲ等の遺伝子増幅法のプライマーに用いることにより、本酵素類似の活性を有するタンパクをコードする遺伝子をスクリーニングすることができる。なお、該方法では目的の遺伝子の一部のみを含むＤＮＡ断片が得られることがあるが、その際には、得られたＤＮＡ断片の塩基配列を調べてそれが目的の遺伝子の一部であることを確かめた上、該ＤＮＡ断片またはその一部をプローブとしてハイブリダイゼーションを行うか、または該ＤＮＡ断片の塩基配列に基づいて合成されたプライマーを用いてＰＣＲを行うことにより、目的の遺伝子全体を取得することができる。
【００７９】
上記のハイブリダイゼーションは、例えば、以下の条件で行うことができる。すなわち、ＤＮＡを固定したメンブレンを０．５％ＳＤＳ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００、０．０１％変性サケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を示す）中で、５０℃にて１２〜２０時間、プローブとともにインキュベートする。インキュベーション終了後、０．５％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、３７℃での洗浄から始めて、ＳＳＣ濃度は０．１×までの範囲で、また、温度は５０℃までの範囲で変化させ、固定されたＤＮＡ由来のシグナルがバックグラウンドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄する。
【００８０】
また、こうして得られた新たな遺伝子について、そこにコードされているタンパクの有する活性を、上記と同様の方法によって調べることにより、得られた遺伝子が目的とするものであるかどうかを確認することができる。
【００８１】
上記ＷＯ９５／２６２００号に記載のように、フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域はレトロウイルス結合部位を有するポリペプチドである。繊維芽細胞増殖因子、コラーゲン、ポリリジンはフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域との間に構造的な類似（例えば、アミノ酸配列上の類似性）が見られる物質ではないが、本発明者らは、これらの物質がレトロウイルス結合部位を有していることを見いだした。
【００８２】
本発明に使用される標的細胞結合部位を有する機能性物質も、特に限定はないが、標的細胞に結合するリガンドを有する物質であり、該リガンドとしては細胞接着性のタンパク質、ホルモンやサイトカイン、細胞表面の抗原に対する抗体、多糖類や糖タンパク、糖脂質中の糖鎖、あるいは標的細胞の代謝物などが挙げられる。また、該機能性物質を含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体、該機能性物質の誘導体、該機能性物質の機能的同等物等を使用することもできる。これらの機能性物質は天然起源の物質から得ることができ、また、人為的に作製する（例えば、遺伝子組換え技術や化学合成技術によって作製する）ことができ、さらに、天然起源の物質と人為的に作製された物質との組合せにより作製することもできる。
【００８３】
使用される細胞接着タンパク質としては、フィブロネクチンやそのフラグメントがある。例えば、米国特許第５，１９８，４２３号に記載の、Ｐｒｏ１２３９−Ｓｅｒ１５１５に対応するヒトフィブロネクチンの細胞結合ドメインは、本明細書に記載のポリペプチドＣ−２７４と同等の機能を有しており、ＢＨＫおよびＢ１６−Ｆ１０細胞等と結合することが示されている（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第１１０巻、第２８５〜２９１頁、１９９１年）。これらのポリペプチド中に存在するＲＧＤＳの４アミノ酸からなる配列はＶＬＡ−５レセプターのリガンドである。ＶＬＡ−５レセプターの発現は広範な細胞において見られるが、分化した細胞よりも未分化なものによく発現している。また、フィブロネクチン中のＣＳ−１領域はＶＬＡ−４レセプターのリガンドとして知られており、該レセプターを発現している細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、ＮＫ細胞、好酸球、好塩基球、胸腺細胞、骨髄単球系細胞、赤芽球系前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、メラノーマ、筋細胞等）に結合する。特開平３−２８４７００号に記載のポリペプチドで、配列表の配列番号２９で表されるポリペプチド（以下Ｃ２７７−ＣＳ１と称す）は上記のＶＬＡ−５、およびＶＬＡ−４レセプターのリガンドの両方を含有するポリペプチドであり、本発明の方法において、これらのレセプターを有する細胞への遺伝子導入に使用することができる。さらに、ヘパリン−ＩＩ領域は繊維芽細胞、内皮細胞および腫瘍細胞と結合することが示されている。ヘパリン−ＩＩ領域の細胞結合部位ポリペプチド配列はレトロウイルス結合部位を有する機能性物質のポリペプチドの存在下で、レトロウイルスベクターの感染を予め定められた細胞に向けるうえで有用である。
【００８４】
細胞特異的な作用を有するホルモンやサイトカイン類は本発明の方法に使用される細胞結合部位を有する機能性物質として適している。例えば、造血系のサイトカインであるエリスロポエチンを使用することにより、赤血球系の細胞への遺伝子導入を行うことができる。エリスロポエチンは公知の方法にて作製し、使用することができる。また、該エリスロポエチンの機能的同等物およびエリスロポエチンまたは該エリスロポエチンの機能的同等物を含有するポリペプチドも使用することができる。
【００８５】
下記実施例に示されるように、レトロウイルス結合活性を有する機能性物質（例えば、Ｈ−２７１や繊維芽細胞増殖因子）をフィブロネクチン由来の細胞結合活性を有するポリペプチドＣ−２７４等との混合物で使用した場合には高い遺伝子導入効率を得ることができる。これらの実験に用いたＮＩＨ／３Ｔ３細胞はＣ−２７４と結合可能なＶＬＡ−５レセプターを発現しており、この両者の相互作用が遺伝子導入効率の向上に寄与している。
【００８６】
さらに、同様な現象はエリスロポエチンレセプターを発現するＴＦ−Ｉ細胞（Ｂｌｏｏｄ、第７３巻、第３７５〜３８０頁、１９８９年）への遺伝子導入にエリスロポエチン誘導体を共存させた場合にも観察される。しかも、この効果はエリスロポエチンレセプターを有していない細胞では認められない。
【００８７】
これらの結果より、レトロウイルス結合部位を有する機能性物質と細胞結合部位を有する他の機能性物質との共存による細胞特異的な遺伝子導入効率の上昇が起こることが明らかにされた。
【００８８】
本発明のこの態様においては、レトロウイルス結合部位を有する機能性物質を、他の標的細胞との結合部位を有する機能性物質との混合物として使用する。これによって、当該機能性物質に親和性を有する標的細胞へのレトロウイルスベクターによる遺伝子導入の効率を顕著に高めることができる。こうして、遺伝子導入効率が向上することにより、ウイルス産生細胞との共培養の回避が可能となることは、本発明の１つの利点である。
【００８９】
目的とする細胞に選択的に遺伝子を導入する手段は利用価値が高く、これまでにも様々な方法が研究されており、例えば、目的細胞の表面に存在するレセプターに結合する物質とＤＮＡ結合性物質とを結合させた非ウイルスベクター（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎｖｅｃｔｏｒ）がある。該ベクターを利用した遺伝子導入の例としては、アシアロ糖タンパクを用いた肝ガン細胞への導入（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６２巻、第４４２９〜４４３２頁、１９８７年）、トランスフェリンを用いたリンパ芽球細胞への導入（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第８９巻、第６０９９〜６１０３頁、１９９２年）、抗ＥＧＦレセプター抗体を用いたガン細胞への導入（ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、第３３８巻、第１６７〜１６９頁、１９９４年）等が知られている。このような非ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法は、導入された遺伝子が細胞の染色体ＤＮＡ上に組み込まれないため、導入された遺伝子の長期にわたる発現が望まれる場合には好ましい方法ではない。染色体上への遺伝子組み込みが可能なベクターとして繁用されるレトロウイルスベクターを用い、これを特定の細胞に感染させようとする試みも行われており、例えば、レトロウイルス粒子を直接化学修飾してラクトースを結合させることによる肝細胞への遺伝子導入（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、第２６６巻、第１４１４３〜１４１４６頁、１９９１年）、エリスロポエチンとの融合タンパクとしたエンベロープタンパクを有する組換えウイルス粒子を利用したエリスロポエチンレセプター発現細胞への遺伝子導入（Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６６巻、第１３７３〜１３７６頁、１９９４年）等が開発されている。しかし、この目的のためには標的細胞に応じて特別なウイルス粒子の調製を要する。さらに、ウイルス粒子の化学修飾は煩雑な操作を必要とする上に、ウイルスの不活化を招くおそれがあり、また、遺伝子工学的に改変したウイルスエンベロープについては、必ずしも必要な機能（標的細胞への結合、およびウイルス粒子の構築）を有するものが得られるとは限らない。
【００９０】
上記ＷＯ９５／２６２００号には、細胞結合活性を有する適当なリガンドを共有結合させたフィブロネクチンのフラグメント共存下においては、特別な修飾をしていないレトロウイルスベクターを目的とする細胞に導入することが可能であることが示唆されている。しかし、該方法ではウイルス結合活性と細胞への結合活性の両方を有する機能性分子を用いるため、標的細胞ごとに個別の機能性物質を作製しなければならない。また、作製された機能性物質に両活性が保持されているかどうかは明らかでない。
【００９１】
本発明によるレトロウイルス結合部位を有する機能性物質と、標的細胞との結合部位を有する他の機能性物質との組み合わせは、広範囲の細胞種に対してレトロウイルスベクターを用いた遺伝子の送達系が提供できる。この目的のためには、レトロウイルス結合部位を有する機能性物質と、標的細胞との結合部位を有する機能性物質とが共有結合によって結合されている必要はない。したがって、標的となる細胞ごとに、レトロウイルス結合部位を有する機能性物質と、標的細胞との結合部位を有する機能性物質とが共有結合によって結合された、特定の機能性物質を作製する必要がなく、目的の細胞への遺伝子導入を簡便、かつ効率よく行うことができる。
【００９２】
本発明の方法を用いた標的細胞への遺伝子導入の例としては、造血系の細胞への遺伝子導入が挙げられる。上記のフィブロネクチンのＣＳ−１細胞接着領域は造血幹細胞への遺伝子導入に有用なことが知られている。また、造血系の細胞の分化には上記のエリスロポエチンの他にも多数の細胞特異的なサイトカインが関与していることが知られており、これらを利用することによって目的とする細胞（細胞系）に特異的に遺伝子を導入できる。例えば、Ｇ−ＣＳＦを用いた場合には巨芽球、および顆粒球前駆細胞を標的とすることが可能である。
【００９３】
細胞結合活部位を有する機能性物質として、悪性細胞と、特異的または優先的に結合する物質を用いることにより、これらの細胞を標的として遺伝子導入を行うこともできる。
【００９４】
例えば、ある種の肺癌細胞においてはＨＥＲ−２、ＨＥＲ−４というレセプターが過剰発現していることが知られている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、第９２巻、第９７４７〜９７５１頁、１９９５年）。したがって、該レセプターに対するリガンドのヘリグリン（ｈｅｒｅｇｕｌｉｎ）をレトロウイルス結合部位を含有する機能性物質と組み合わせることにより、肺癌細胞の増殖を制御することが可能となる。
【００９５】
また、例えば、甲状腺（癌）細胞に対してはヨウ素を有する機能性物質を、また、肝臓（癌）細胞は高密度リポタンパク質（Ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＨＤＬ）やアシアロ糖タンパク質またはこれらの一部を含有する機能性物質を使用することによって遺伝子導入の標的とすることができる。
【００９６】
さらに、標的細胞の表面に存在する抗原に対する抗体、好適にはモノクローナル抗体を、細胞結合活性を有する機能性物質として使用することにより、抗体が入手できる任意の細胞を標的とすることが可能となる。こうして、本発明により開示されるレトロウイルスベクターと標的細胞との配置方法を使用することにより、広範囲の種類の細胞を標的とすることができる。
【００９７】
特に、好ましい態様は、レトロウイルスベクターによる標的細胞への遺伝子導入効率を高める方法において、新規な機能性物質を用いて遺伝子導入を行う。
【００９８】
これまでレトロウイルスによる細胞への遺伝子導入に有効とされたレトロウイルス結合部位を有する機能性物質はフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ領域のみである。
【００９９】
上記のように該領域は、それ自体特定の細胞に対して結合部位を有しており、標的細胞によってはこの活性が望ましくない場合がある。このような場合には、この結合部位を他の標的細胞結合部位に置き換えることにより、目的を達成することが可能となる。このように、性質の異なる複数の機能性物質が使用可能なことは、本発明による遺伝子治療の適用範囲を広げることにつながり、目的の標的細胞へのターゲッテングも容易に行うことができる。
【０１００】
本発明により提供される、新規なレトロウイルス結合部位を有する機能性物質としては、線維芽細胞増殖因子、該因子を含有するポリペプチド、コラーゲンのフラグメント、該フラグメントの混合物、該フラグメントを含有するポリペプチド、該機能性物質の重合体等が挙げられる。また、ポリリジンも本発明の目的に使用することができる。これらの機能性物質は、天然起源の物質から得ることができ、また、人為的に作製する（例えば、遺伝子組換え技術または化学合成技術によって作製する）ことができ、さらに、天然起源の物質と化学的に合成された物質との組合せにより作製することもできる。該機能性物質は、本発明の第１の発明の遺伝子導入方法にも使用でき、また、該機能性物質と細胞結合活性を有する機能性物質とのキメラ分子も細胞への遺伝子導入に有用である。
【０１０１】
上記の新規な機能性物質はいずれもレトロウイルス結合活性を有している。しかしながら、これらの物質は上記ＷＯ９５／２６２００号に記載の、ヒトフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域またはそれに類似したアミノ酸配列を有するポリペプチドを含有するものではない。
【０１０２】
本発明に使用される線維芽細胞増殖因子としては、実質的に純化された天然物を使用しても良く、また、遺伝子工学的に作製されたものを使用しても良い。本発明には、配列表の配列番号３で表される線維芽細胞増殖因子を使用することができ、さらに、これらのポリペプチドの機能を損なうことなく改変された誘導体も使用することができる。線維芽細胞増殖因子誘導体の例としては、配列表の配列番号４で表されるポリペプチド（以下、Ｃ−ＦＧＦ・Ａと称する）がある。これは配列番号３で表される線維芽細胞増殖因子のＮ末端にフィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドが結合したポリペプチドであり、米国特許第５，３０２，７０１号に記載の方法により遺伝子工学的に製造することができる。該ポリペプチドは該米国特許にＦＥＲＭＰ−１２６３７として記載され、現在はブタペスト条約の下、ＦＥＲＭＢＰ−５２７８の受託番号で茨城県つくば市東１丁目１番３号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（ＮＩＢＨ）に寄託されている大腸菌（原寄託日：平成３年１２月９日）を使用することによって得ることができる。
【０１０３】
また、配列番号５で表される、フィブロネクチン由来のＣＳ−１細胞接着領域を有する上記のＣ−ＦＧＦ・Ａの誘導体ポリペプチド（以下、Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１と称する）は、上記の茨城県つくば市東１丁目１番３号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に、ブタペスト条約の下、ＦＥＲＭＢＰ−５６５４の受託番号で寄託されている大腸菌（原寄託日：平成８年９月６日）を使用し、本願明細書に記載の方法で得ることができる。このＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１はＣＳ−１結合性を有する標的細胞、特に造血幹細胞への遺伝子導入において特に有用である。
【０１０４】
コラーゲンのフラグメントとしては、天然型のコラーゲンを酵素学的、化学的に分解し、実質的に純化したフラグメントを使用しても良く、また、遺伝子工学的に作製されたものを使用しても良い。さらに、これらのフラグメントの機能を損なうことなく改変されたものも使用することができる。コラーゲンの中で、ヒトＶ型コラーゲンは強いインスリン結合活性を有し（特開平２−２０９８９９号）、インスリン結合部位を含有するポリペプチドとしては配列表の配列番号２８で表されるアミノ酸配列を含有するポリペプチドがあり（特開平５−９７６９８号）、その例としては、配列表の配列番号６で表されるポリペプチド（以下、ＣｏｌＶと称する）が挙げられる。ＣｏｌＶは本願明細書実施例に開示の方法で作製することができる。ＣｏｌＶを含有するポリペプチドであって、配列番号７で表されるポリペプチド（以下、Ｃ２７７−ＣｏｌＶと称する）は、ＣｏｌＶのＮ末端にフィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドが結合したポリペプチドであり、上記特開平５−９７６９８号に記載されているように遺伝子工学的に製造することができる。Ｃ２７７−ＣｏｌＶは該公開公報にＦＥＲＭＰ−１２５６０として記載され、現在はブタペスト条約の下、ＦＥＲＭＢＰ−５２７７の受託番号で茨城県つくば市東１丁目１番３号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている大腸菌（原寄託日：平成３年１０月７日）を使用することによって得ることができる。
【０１０５】
配列番号８で表される、フィブロネクチン由来のＣＳ−１細胞接着領域を有する上記のＣ２７７−ＣｏｌＶの誘導体ポリペプチド（以下、Ｃ−ＣｏｌＶ−ＣＳ１と称する）は以下に示す方法によって作製することができる。ブタペスト条約の下、ＦＥＲＭＢＰ−２８００の受託番号で茨城県つくば市東１丁目１番３号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている大腸菌（原寄託日：平成１年５月１２日）より調製されるプラスミドｐＣＨ１０２を鋳型とし、プライマーＣＳ１−Ｓ（配列表の配列番号９にその塩基配列を示す）およびＭ４を用いたＰＣＲ反応により増幅されるＤＮＡ断片を制限酵素ＮｈｅＩ、ＳａｌＩで消化した後に単離する。
【０１０６】
一方、上記Ｃ２７７−ＣｏｌＶをコードする遺伝子を含み、上記大腸菌ＦＥＲＭＢＰ−５２７７より調製されるプラスミドｐＴＦ７５２０ＣｏｌＶを鋳型とし、プライマーＣＦ、およびＣＮＲを用いたＰＣＲ反応により増幅されるＤＮＡ断片を制限酵素ＡｃｃＩＩＩ、ＮｈｅＩで消化した後に単離する。配列表の配列番号１０および１２にＣＦおよびＣＮＲのそれぞれの塩基配列を示す。上記の２つのＤＮＡ断片を、プラスミドｐＴＦ７５２０ＣｏｌＶを制限酵素ＡｃｃＩＩＩ、ＳａｌＩで消化して得られる約４．４ｋｂのＤＮＡ断片と混合し、ライゲーションを行って得られる組換えプラスミドはＣ２７７−ＣｏｌＶのＣ末端側にＣＳ−１細胞接着領域を有し、ＣｏｌＶのＣ末端より２番目のグルタミン酸がアラニンに、Ｃ末端のスレオニンがセリンにそれぞれ置換されたポリペプチド、Ｃ−ＣｏｌＶ−ＣＳ１をコードしている。このプラスミドで形質転換された大腸菌を培養した後、培養物より目的のポリペプチドを取得することができる。このＣ−ＣｏｌＶ−ＣＳ１はＣＳ−１結合性を有する標的細胞、特に幹細胞への遺伝子導入において特に有用である。
【０１０７】
ポリリジンとしては、上記のごとく、市販のポリリジンより適当な重合度のポリリジンを選択し、使用することができる。
【０１０８】
本発明で使用する機能性物質としては、上記の機能性物質の誘導体も使用することができる。上記のＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１またはその機能的同等物、Ｃ−ＣｏｌＶ−ＣＳ１またはその機能的同等物はその例である。また、これらの機能性物質を複数の分子結合させた重合体や、機能性物質を公知方法により修飾したもの（糖鎖の付加等）も本発明に使用することができる。これら誘導体および該誘導体の機能的同等物は、該誘導体をコードする遺伝子および該誘導体の機能的同等物をコードする遺伝子を用いて遺伝子工学的に製造することもできる。さらに、これらの機能性物質のアミノ酸配列中にシステインを付加、挿入、置換することにより、機能性物質の誘導体の作製に有用なシステイン化機能性物質を作製することができる。また、システイン化機能性物質であって、レトロウイルス結合部位を有する分子と、システイン化機能性物質であって標的細胞結合部位を有する他の分子とを結合させることも容易である。さらに、システイン化機能性物質のシステイン残基の反応性を利用して他の機能性物質との結合体を作製することができる。
【０１０９】
別の好ましい態様では、レトロウイルスベクターによる標的細胞への遺伝子導入効率を高めるフィブロネクチンのレトロウイルス結合部位ポリペプチドの重合体を用いて遺伝子導入を行う。
【０１１０】
該機能性物質は上記ＷＯ９５／２６２００号に記載の、ヒトフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域を一分子内に複数個有するポリペプチド、および該ポリペプチドの誘導体である。なお、本発明に使用する機能性物質としては、該機能性物質と同等の活性を有する範囲内で、天然起源のポリペプチドとはそのアミノ酸配列が一部異なっている機能的同等物を含むことができる。
【０１１１】
用いる機能性物質の重合体としては上記のフィブロネクチン由来のポリペプチドを酵素学的または化学的に重合させたものや、遺伝子工学的に作製されたものがある。フィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域を一分子内に２個有するポリペプチドとしては配列表の配列番号１３にアミノ酸配列を示すポリペプチド（以下、Ｈ２−５４７と称す）が挙げられる。Ｈ２−５４７はブタペスト条約の下、ＦＥＲＭＢＰ−５６５６の受託番号で茨城県つくば市東１丁目１番３号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている大腸菌（原寄託日：平成８年９月６日）を使用し、本明細書に記載の方法によって取得することができる。また、配列表の配列番号１４にアミノ酸配列を示すポリペプチドは、Ｈ２−５４７のＮ末端にフィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドが結合した誘導体ポリペプチド（以下、ＣＨ２−８２６と称す）である。該ポリペプチドは本明細書に記載の方法にしたがって取得することができる。さらに、配列表の配列番号３０にアミノ酸配列を示すポリペプチドは、Ｈ２−５４７のＣ末端にフィブロネクチンのＣＳ−１細胞接着領域を結合した誘導体ポリペプチド（以下、Ｈ２Ｓ−５７３と称す）である。該ポリペプチドはブタペスト条約の下、ＦＥＲＭＢＰ−５６５５の受託番号で茨城県つくば市東１丁目１番３号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている大腸菌（原寄託日：平成８年９月６日）を使用し、本明細書に記載の方法によって取得することができる。ＣＳ−１細胞接着領域を有するＨ２Ｓ−５７３は造血幹細胞への遺伝子導入に有用である。
【０１１２】
また、別の好ましい態様においては、、レトロウイルスベクターによる標的細胞への遺伝子導入において、レトロウイルスベクターによる細胞への遺伝子導入効率を向上させるのに有効な、ビーズ上に固定された機能性物質との共存下に複製能欠損組換えレトロウイルスベクターを生存可能な標的細胞に感染させる。
【０１１３】
従来の、上記のＷＯ９５／２６２００号およびＮａｔｕｒｅＭｅｄｉｃｉｎｅに記載の機能性物質を用いてレトロウイルスベクターによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる方法は、これまではウイルスを細胞に感染させる際に使用する容器（細胞培養用のプレート）の表面に該機能性物質を固定化することにより実施されてきた。この方法では、プレートを機能性物質を含有する溶液で処理した後、さらに余分の機能性物質を洗い流すなど、煩雑な操作を要する。
【０１１４】
このように、機能性物質が固定化されたプレートを使用する遺伝子導入方法は簡便な方法とは言い難い。これに対して、機能性物質をビーズ上に固定して使用する方法はつぎのような利点を有している。
【０１１５】
機能性物質をビーズに固定する操作はプレートの場合に比べて小さなスペースで行うことができ、また、ビーズを密閉可能な容器中で取り扱える。機能性物質が固定化されたプレートはその表面が空気にさらされるため、安定性の低い機能性物質の場合には保存中の乾燥による機能性物質の変質等に気を配る必要があるが、ビーズは溶液中に懸濁して保存することができるため、乾燥の危険はない。さらにビーズの使用は機能性物質の存在する表面積を大きくすることから、プレート使用に比べて高い遺伝子導入効率を得ることも可能となる。
【０１１６】
機能性物質の固定化は常法により行えばよく、例えば、標的細胞培養容器に固定化しても良く、例えば、細胞培養用のビーズに固定化しても良い。ビーズの素材、材質等は使用する目的によって選択することができる。ビーズとしては、例えば、中心の丸い、または球状の核を持ち、核の表面は親水性のポリマーで被覆されているものでもよい。この核やポリマーの素材としては、例えば、特表平８−５０１０９２号に記載のものが例示される。例えば、生分解性ビーズを使用し、これらの機能性物質が固定化されたビーズを生体内に投与することもできる。また、レトロウイルス結合部位を有する分子が固定化されたビーズと、標的細胞結合部位を有する他の分子が固定化されたビーズとを混合して使用するのも効率の良い方法である。
【０１１７】
これらの機能性物質を固定化せずに使用する場合は、例えば、標的細胞培養容器を、予め、該機能性物質の吸着を防止する物質、例えば、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）で前処理し、これらの機能性物質の非特異的吸着を防止して使用すればよい。
【０１１８】
本発明によれば、このような非固定の系においても、本発明に使用する機能性物質により、遺伝子導入が効率良く達成される。
【０１１９】
また、後に説明する、本発明の方法の実施用に設計されたキットは、細胞への遺伝子導入を極めて簡便に実施することを可能にする。
【０１２０】
上記のごとく、本発明の方法によって遺伝子を導入された細胞は生体に移植することが可能であり、これによって生体内で外来遺伝子を発現させる遺伝子治療を行うことができる。
【０１２１】
例えば、造血幹細胞を標的細胞とした遺伝子治療は以下のような操作によって実施することができる。まず、ドナーより造血幹細胞を含有する材料、例えば、骨髄組織、末梢血液、臍帯血液等を採取する。これらの材料はそのまま遺伝子導入操作に用いることも可能であるが、通常は、密度勾配遠心分離等の方法により造血幹細胞が含まれる単核細胞画分を調製するか、さらに、ＣＤ３４および／またはＣ−ｋｉｔといった細胞表面のマーカー分子を利用した造血幹細胞の精製を行う。これらの造血幹細胞を含有する材料について、必要に応じて適当な細胞増殖因子等を用いた予備刺激を行った後、本発明の方法、とりわけ、造血幹細胞への結合活性を有する機能性物質の存在下に、目的とする遺伝子を挿入された組換えレトロウイルスベクターを感染させる。こうして得られた遺伝子導入された細胞は、例えば、静脈内投与によってレシピエントに移植することができる。レシピエントは、好ましくはドナー自身であるが、同種異系移植を行うことも可能であり、例えば、臍帯血液を材料とした場合には同種異系移植が行われる。
【０１２２】
造血幹細胞を標的とした遺伝子治療としては、患者において欠損しているか、異常が見られる遺伝子を補完するものがあり、例えば、ＡＤＡ欠損症やゴーシェ病の遺伝子治療がこれにあたる。この他、例えば、ガンや白血病の治療に使用される化学療法剤による造血細胞の障害を緩和するために、造血幹細胞への薬剤耐性遺伝子の導入が行われることがある。
【０１２３】
造血幹細胞はＶＬＡ−４レセプターを発現していることが知られており、本発明により開示されたＣＳ−１細胞接着領域を有する機能性物質を利用して効率よく遺伝子導入を行うことが可能である。また、造血幹細胞表面には上記のようにＣＤ３４、Ｃ−ｋｉｔといった分子も発現されており、これらの分子に対する抗体やＣ−ｋｉｔのリガンドである幹細胞因子（ｓｔｅｍｃｅｌｌｆａｃｔｏｒ）をレトロウイルス結合部位を有する機能性物質と組み合わせることによっても、遺伝子導入効率を向上させることができる。
【０１２４】
また、癌の遺伝子治療法としては、癌細胞にサイトカイン類の遺伝子を導入した後にその増殖能力を奪って患者の体内に戻し、腫瘍免疫を増強させる腫瘍ワクチン療法が研究されている（ＨｕｍａｎＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ、第５巻、第１５３〜１６４頁、１９９４年）。癌細胞に高い親和性を有する機能性物質を用いて本発明の方法を適用することにより、このような遺伝子治療も、より効果の高いものとなる。
【０１２５】
また、ＡＩＤＳを遺伝子治療法によって治療しようという試みも行われている。この場合には、ＡＩＤＳの原因であるＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）の感染するＴ細胞に、ＨＩＶの複製や遺伝子発現を妨げるような核酸分子（アンチセンス核酸やリボザイム等）をコードする遺伝子を導入することが考えられている（例えば、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第６９巻、第４０４５〜４０５２頁、１９９５年）。Ｔ細胞への遺伝子導入は、Ｔ細胞表面に存在する分子に結合する機能性物質、例えば抗ＣＤ４抗体等を利用し、本発明の方法により達成することができる。
【０１２６】
このように、遺伝子導入される標的細胞としては、上記した本発明の態様に従って、該標的細胞結合部位を有する機能性物質が入手、あるいは作製可能な範囲の任意の細胞を使用することができる。
【０１２７】
また、本発明の方法は標的細胞をレトロウイルス産生細胞の存在下で共培養する必要のないこと、およびヒトにおいては臨床での使用に問題のあるヘキサジメトリン・ブロミドを使用しないこと等の点から、臨床における遺伝子治療のプロトコールとしても適したものといえる。
【０１２８】
さらに、遺伝子治療以外の分野への本発明の適用として、例えば、標的細胞として胚形成幹細胞、プライモディアル・ジャーム・セル、卵母細胞、卵原細胞、卵子、精母細胞、精子等を使用した、トランスジェニック脊椎動物の簡便な作成を挙げることができる。
【０１２９】
すなわち、本発明は、その１つの態様として、本発明の方法で得られる形質転換細胞を脊椎動物に移植する細胞移植方法も提供する。形質転換細胞が移植される脊椎動物としては、哺乳類（例、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、サル、チンパンジー、ヒト等）、鳥類（例、ニワトリ、七面鳥、ウズラ、アヒル、カモ等）、爬虫類（例、ヘビ、ワニ、カメ等）、両生類（例、カエル、サンショウウオ、イモリ等）、魚類（例、アジ、サバ、スズキ、タイ、ハタ、ブリ、マグロ、サケ、マス、コイ、アユ、ウナギ、ヒラメ、サメ、エイ、チョウザメ等）が挙げられる。
【０１３０】
かくして、本発明のこの態様によれば、実質的に純粋なフィブロネクチン、実質的に純粋なフィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物と同様に、本発明に使用する機能性物質のレトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位により、レトロウイルスによる遺伝子導入が効率良く行われる。それにより、従来の方法の限界を有していない、遺伝子材料の脊椎動物細胞内への効率的な導入可能な技術が提供できる。
【０１３１】
本発明のさらなる別の態様においては、レトロウイルス結合部位と、標的細胞結合部位とを同一分子中に有する、実質的に純粋なフィブロネクチン、実質的に純粋なフィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物と同等の機能を有する物質の有効量を機能性物質として使用する。
【０１３２】
かかる機能性物質としては、フィブロネクチン、フィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物と同等の効率で遺伝子導入を行う物質であり、典型的には、上記した本発明による新規なレトロウイルス結合部位と標的細胞結合部位とを同一分子中に有する機能性物質が挙げられる。これらの機能性物質を使用する場合は、少なくとも１以上の機能性物質にレトロウイルスと標的細胞とが結合すると考えられる。
【０１３３】
上記したレトロウイルス結合部位と、標的細胞結合部位とを同一分子中に有する機能性物質は、例えば、配列表の配列番号２１および２２で表されるポリペプチド（以下、各々、ＣＨＶ−１８１およびＣＨＶ−１７９と称する）が包含される。
【０１３４】
これらのペプチドはＨ−２７１中に含まれるＩＩＩ型類似配列（ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４）を含むものであり、ＣＨＶ−１８１はＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３配列が、また、ＣＨＶ−１７９はＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４配列がそれぞれフィブロネクチンの細胞接着ポリペプチド（Ｐｒｏ１２３９−Ｓｅｒ１５１５）のＣ末端にメチオニンを介して付加されたものである。
【０１３５】
ポリペプチドＣＨＶ−１８１を発現するためのプラスミドは、例えば、以下に示す方法によって構築することができる。
【０１３６】
まず、フィブロネクチンのヘパリン結合ポリペプチド（Ｈ−２７１）をコードするＤＮＡ断片を含有するプラスミドｐＨＤ１０１をエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＨＢ１０１／ｐＨＤ１０１（ＦＥＲＭＢＰ−２２６４）より調製する。このプラスミド上のＩＩＩ−１３配列のＣ末端をコードする領域に部位特異的変異導入方法によってＨｉｎｄＩＩＩサイトを導入した後、これをＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３配列をコードするＤＮＡ断片を得る。一方、プラスミドベクターｐＩＮＩＩＩ−ｏｍｐＡ１をＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩで消化し、リポプロテインターミネーター領域をコードするＤＮＡ断片を得る。
【０１３７】
つぎに、フィブロネクチンの細胞接着ポリペプチド（Ｃ−２７９）をコードするＤＮＡ断片を含有するプラスミドｐＴＦ７０２１をエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９／ｐＴＦ７０２１（ＦＥＲＭＢＰ−１９４１）より調製し、このプラスミド上のＣ−２７９の停止コドンの直前に部位特異的変異導入方法によってＮｃｏＩサイトを導入したプラスミドｐＴＦ７５２０を作製する。このプラスミドをＮｃｏＩ、ＳａｌＩで消化した後、上記のＩＩＩ−１２、ＩＩＩ−１３配列をコードするＤＮＡ断片、およびリポプロテインターミネーター領域をコードするＤＮＡ断片と混合してライゲーションを行うことにより、ポリペプチドＣＨＶ−１８１を発現するためのプラスミドｐＣＨＶ１８１を得ることができる。配列表の配列番号２７にプラスミドｐＣＨＶ１８１上のポリペプチドＣＨＶ−１８１をコードする領域の塩基配列を示す。
【０１３８】
また、ポリペプチドＣＨＶ−１７９を発現するためのプラスミドは、例えば、以下に示す方法によって構築することができる。
【０１３９】
まず、上記のプラスミドｐＨＤ１０１上のＩＩＩ−１３配列のＮ末端をコードする領域に部位特異的変異導入方法によってＮｃｏＩサイトを導入した後、これをＮｃｏＩ、ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＩＩＩ−１３、ＩＩＩ−１４配列をコードするＤＮＡ断片を得る。これと、上記のリポプロテインターミネーター領域をコードするＤＮＡ断片と、ＮｃｏＩおよびＳａｌＩで消化したプラスミドｐＴＦ７５２０とを混合してライゲーションを行うことにより、ポリペプチドＣＨＶ−１７９を発現するためのプラスミドｐＣＨＶ１７９を得ることができる。
【０１４０】
ＣＨＶ−１８１およびＣＨＶ−１７９はそれぞれ上記のプラスミドで形質転換された大腸菌を培養した後、得られた培養物より精製を行って取得することができる。
【０１４１】
これらの機能性物質も、非固定でも、上記と同様に、例えば、ビーズに固定しても使用できる。
【０１４２】
さらに別の態様では、本発明は、（１）上記のレトロウイルス結合部位を有する有効量の機能性物質と、標的細胞結合部位を有する他の有効量の機能性物質の混合物または（２）上記の本発明の新規なレトロウイルス結合部位および標的細胞結合部位の有効量を同一分子中に有する機能性物質を含有するレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入に使用する標的細胞の培養培地を提供するもので、機能性物質は非固定でも、固定化されていてもよい。
【０１４３】
本発明の培養培地の他の成分は、標的細胞の培養に使用できるものであれば特に制限はなく、市販の細胞培養用培地を使用してもよい。また、本発明の培地は、血清や標的細胞の生育に必要な細胞増殖因子、微生物などによる汚染を防ぐための抗生物質等を含むことができる。例えば、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞の場合には、１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）と、５０単位／ｍｌのペニシリン、５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（共にギブコ社製）とを含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＪＲＨバイオサイエンス社製）を培養培地に用いることができる。
【０１４４】
さらに別の態様では、本発明は、（１）上記したレトロウイルス結合部位を有する分子と、標的細胞結合部位を有する他の分子との混合物、（２）上記した本発明による新規なレトロウイルス結合部位と、標的細胞結合部位とを同一分子中に有する機能性物質、または（３）上記したレトロウイルス結合部位を有する機能性物質と接触したレトロウイルスを含有する培地をインキュベートすることを特徴とするレトロウイルスの配置方法を提供する。
【０１４５】
該機能性物質は、非固定でも、上記のごとく、固定化されていてもよい。インキュベーションは、常法に従って行うことができ、例えば、３７℃、ＣＯ_２濃度５％、湿度９９．５％の条件で行うことができる。この条件は、使用する標的細胞に応じて適宜調整し、また、培養時間も細胞や目的に応じて変更することができる。
【０１４６】
本発明の方法を使用すれば、例えば、標的細胞にウイルスを送達する広範囲の構築物中にウイルス粒子を配置させることができる。
【０１４７】
本発明の別の態様では、標的細胞内へのレトロウイルス介在遺伝子導入の実施に使用するためのキットを提供する。
【０１４８】
該キットは、
（ａ）有効量の、（１）上記したレトロウイルス結合部位を有する分子と、標的細胞結合部位を有する他の分子との混合物または（２）上記した本発明による新規なレトロウイルス結合部位と、標的細胞結合部位とを同一分子中に有する機能性物質、
（ｂ）標的細胞と接触したレトロウイルスをインキュベートするための人工基質、および
（ｃ）上記標的細胞を予備刺激するための標的細胞増殖因子、
を含んでなるキットを提供するもので、（ａ）の機能性物質は、非固定でも、固定化されていてもよく、このキットは、さらに、遺伝子導入に使用する組換えレトロウイルスベクターや、必要な緩衝剤等を含有していてもよい。
【０１４９】
人工基質としては、細胞培養用のプレート、ペトリ皿、フラスコ等を用いることができ、例えば、ポリスチレン製のものを使用できる。
【０１５０】
標的細胞がＧ０期の細胞である場合には、レトロウイルスが感染しないため、予備刺激によって細胞周期に誘導することが好ましく、この目的で、レトロウイルスの感染に先立って、標的細胞を適当な標的細胞増殖因子の存在下で培養する。例えば、骨髄細胞や造血幹細胞に遺伝子導入を行う場合の予備刺激には、インターロイキン−６および幹細胞因子のような標的細胞増殖因子が使用される。
【０１５１】
キットの各構成成分は、各々、自体公知の方法により、水溶液の他、凍結乾燥物、顆粒、錠剤等の剤形とすることができ、
【０１５２】
本発明のキットを使用することにより、例えば、形質転換された生存可能な標的細胞培養物を得ることができ、標的細胞内へのレトロウイルス介在の遺伝子導入を簡便に実施することができる。
【０１５３】
本発明はまた、実質的に純粋なフィブロネクチン、実質的に純粋なフィブロネクチンフラグメントおよびそれらの混合物より選択される機能性物質またはその重合体の有効量の非固定化物またはビーズ固定化物を使用する、レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入も包含する。
【０１５４】
本発明は、上記のＣＨ２−８２６およびその機能的同等物を包含する。また、本発明は、ＣＨ２−８２６をコードする遺伝子を提供し、配列表の配列番号２０で表される遺伝子がその１例である。本発明はこれらの遺伝子の機能的同等物も包含する。
【０１５５】
さらに、本発明は、上記のＣＨＶ−１８１を提供し、本発明はその機能的同等物を包含する。また、ＣＨＶ−１８１をコードする遺伝子を提供し、配列表の配列番号２７で表される遺伝子がその１例である。本発明はこの遺伝子の機能的同等物を包含する。
【０１５６】
本発明はまた、レトロウイルス結合部位の重合体および／または標的細胞結合部位の重合体を含有する重合体を提供することができる。重合体の具体例としては線維芽細胞増殖因子の重合体、Ｖ型コラーゲン由来のインスリン結合部位を有するポリペプチドの重合体が例示される。これらの重合体をコードする遺伝子も提供する。
【０１５７】
以下に考察するように、本発明は特定の理論によって限定されるものではないが、レトロウイルスと細胞とをそれぞれの機能領域部位に結合させることによって、レトロウイルスによる細胞への遺伝子導入、すなわち形質転換が促進される。
【０１５８】
レトロウイルスと結合し、その結果、本発明で有効に役立つ機能性物質としては、実質的に純粋なフィブロネクチン、実質的に純粋なフィブロネクチンフラグメントまたはそれらの混合物があるが、本発明者らは、上記したような、これらと実質的に同等な機能を有する本発明の機能性物質が標的細胞のレトロウイルスによる遺伝子導入効率、すなわち形質転換効率を向上させることを見出したのである。
【０１５９】
本明細書中に記載のフィブロネクチンのフラグメントは天然または合成起源のものであることができ、例えば、ルオスラチ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ）ら（１９８１年）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６：７２７７；パテル（Ｐａｔｅｌ）およびロディッシュ（Ｌｏｄｉｓｈ）（１９８６年）、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０２：４４９；およびベルナルディ（Ｂｅｒｎａｒｄｉ）等（１９８７年）、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：４８９によって既に記載されたようにして、天然起源の物質から実質的に純粋な形態で製造することができる。この点に関して、本明細書で実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントと称しているのは、これらが天然においてフィブロネクチンと一緒に存在する他のタンパク質を本質的に含有していないことを意味する。
【０１６０】
本明細書中に記載の実質的に純粋なフィブロネクチンまたはフィブロネクチンフラグメントは、例えば、米国特許第５，１９８，４２３号に一般的に記載されているようにして、遺伝子組換え体より製造することもできる。特に、下記実施例でＨ−２７１、Ｈ−２９６、ＣＨ−２７１（配列番号２３）およびＣＨ−２９６（配列番号２４）として同定された組換え体フラグメントならびにこれらを取得する方法はこの特許に詳細に記載されている。下記実施例で使用したＣ−２７４フラグメントは米国特許第５，１０２，９８８号に記載されているようにして得た。これらフラグメントまたはこれらフラグメントから定型的に誘導できるフラグメントは、米国特許第５，１９８，４２３号にも記載されているように、ブタペスト条約の下、茨城県つくば市東１丁目１番３号の工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１０７２１（Ｈ−２９６）（原寄託日：平成１年５月１２日）、ＦＥＲＭＢＰ−２７９９（メチオニンを介してＨ−２７１と結合したＣ−２７７、すなわち、ＣＨ−２７１）（原寄託日：平成１年５月１２日）、ＦＥＲＭＢＰ−２８００（メチオニンを介してＨ−２９６と結合したＣ−２７７、すなわち、ＣＨ−２９６）（原寄託日：平成１年５月１２日）およびＦＥＲＭＢＰ−２２６４（Ｈ−２７１）（原寄託日：平成１年１月３０日）の受託番号のもとで寄託された大腸菌を培養することによって入手することができる。
【０１６１】
さらに、本明細書で使用できるフィブロネクチンフラグメントまたはこのようなフラグメントの出発物質に関する有用な情報は、キミヅカ（Ｋｉｍｉｚｕｋａ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１０、２８４〜２９１（１９９１年）（これは上記した組換体フラグメントに関してさらに報告している）；ＥＭＢＯＪ．、４、１７５５〜１７５９（１９８５年）（これはヒトフィブロネクチン遺伝子の構造を報告している）；およびＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２５、４９３６〜４９４１（１９８６年）（これはヒトフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域について報告している）中に見ることができる。例えば、下記実施例に報告されているような種々の組換え体フラグメント中に含まれるようなＣＳ−１細胞接着領域とヘパリン−ＩＩ結合領域との両方を有するフィブロネクチンフラグメントは、これまでの研究で造血細胞内への遺伝子導入効率を顕著に高めることが分かっている。
【０１６２】
かくして、本明細書中に記載のフィブロネクチン関連ポリペプチドは、フィブロネクチンのＣＳ−１細胞接着領域の細胞結合活性を提供するアミノ酸配列ならびにウイルスと結合するフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域のアミノ酸配列を提供する。
【０１６３】
なお、上記ＷＯ９５／２６２００号に記載の、レトロウイルスベクターによる形質転換を高めるために使用されるウイルス結合ポリペプチドは
（ｉ）ヒトフィブロネクチンのヘパリン−ＩＩ結合領域のＡｌａ１６９０−Ｔｈｒ１９６０に相当する、下記の式（配列番号１）で表される第１のアミノ酸配列：

またはレトロウイルスと結合する能力を有し、上記の配列に十分類似したアミノ酸配列および（ｉｉ）ヒトフィブロネクチンのＩＩＩＣＳ結合ドメインの１部分に相当する、下記の式（配列番号２）で表される第２のアミノ酸配列（ＣＳ−１）：

または原始前駆細胞および／または長期再定住（幹）細胞のような造血細胞と結合する能力を有し、上記の配列に十分類似したアミノ酸配列を含む。
【０１６４】
なお、上記の配列表の配列番号１で表されるポリペプチド（Ｈ−２７１）のレトロウイルス結合活性は濃度依存性を示し、実施例８に示すように高濃度下においては、ＣＨ−２７１と実質的に同等の活性を示す。すなわち、高濃度の有効量のＨ−２７１の存在下ではじめてレトロウイルスと標的細胞とは、少なくとも１分子以上のＨ−２７１に結合することが本発明により見い出された。
【０１６５】
本発明で使用する機能性物質中のレトロウイルス結合部位とレトロウイルスとの強力な結合は、広範囲の細胞種においてウイルスを用いた治療法のための送達系を構築するために使用することができる。この目的のために、本発明で使用する機能性物質のレトロウイルス結合部位を含むポリペプチドは、構築物として標的細胞特異性を与える任意の細胞結合部位を含む物質と結合させる場合もあり、またはその細胞接着部位を含む物質と共存させる場合もある。すなわち、レトロウイルス結合部位を有する機能性物質性と、細胞結合部位を有する機能性物質性物質は結合していても良く、また異なる分子として共存していても良い。
【０１６６】
この方法は、各標的細胞用に特別のレトロウイルス細胞株を構築するこれまでの必要性を回避することができ、目的の標的細胞の種類により、最適の標的細胞結合部位を有する機能性物質の選択が容易になる。したがって、本発明の機能性物質を使用することにより、使用する標的細胞に特異的なターゲティングが容易に実施され、特にレトロウイルス結合部位を有する機能性物質性と、細胞結合部位を有する機能性物質性物質の混合物を使用する本発明の方法は、目的の標的細胞への目的の遺伝子導入効率の向上に、極めて有用である。また本発明が提供する新規機能性物質はレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率の向上させる方法および関連の技術において、極めて有用である。
【０１６７】
【実施例】
以下に実施例を挙げて、さらに詳しく本発明を説明するが、本発明は下記実施例の範囲のみに限定されるものではない。
【０１６８】
実施例１
（１）ウイルス上清液の調製
レトロウイルスプラスミド、ＰＭ５ｎｅｏベクター（Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．、第２３巻、第６３０〜６３８頁、１９９５年）を含有するＧＰ＋Ｅ−８６細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−９６４２）は１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ギブコ社製）ならびに５０単位／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（共にギブコ社製）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、ＪＲＨバイオサイエンス社製）中で培養した。なお、以降の操作に使用したＤＭＥＭはすべて５０単位／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含んだものである。ＰＭ５ｎｅｏウイルス含有上清液は上記産生細胞をセミコンフルエントに生育させたプレート（１０ｃｍ径のゼラチンコート細胞培養用ディシュ、岩城硝子社製）に１０％ＦＣＳを含有する４ｍｌのＤＭＥＭを添加し、一夜培養した後に採集して調製した。採集した培地上清を０．４５ミクロンのフィルター（ミリポア社製）でろ過してウイルス上清液ストックとし、使用するまでは−８０℃で保存した。
【０１６９】
また、レトロウイルスプラスミド、ＴＫＮＥＯベクター（Ｂｌｏｏｄ、第７８巻、第３１０〜３１７頁、１９９１年）についてはＧＰ＋ｅｎｖＡｍ−１２細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−９６４１）を使用し、上記同様の操作を行ってＴＫＮＥＯウイルス上清液を調製した。
【０１７０】
（２）上清液のウイルス力価の測定
上清液のウイルス力価はＮＩＨ／３Ｔ３細胞を使用して標準的な方法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．、第６２巻、第１１２０〜１１２４頁、１９８８年）に従って測定した。すなわち、６ウエルの組織培養プレートの１ウエルあたりに２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１６５８）を含むＤＭＥＭを添加し、一夜培養した後、系列希釈したウイルス上清液と終濃度７．５μｇ／ｍｌのヘキサジメトリン・ブロミド（ポリブレン：アルドリッチ社製）とを各ウエルに加えた。これを３７℃で２４時間インキュベートした後、培地を終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ギブコ社製）を含有するものと交換してさらにインキュベートを続けた。１０〜１２日後に生育したＧ４１８耐性（Ｇ４１８ｒ）コロニーをクリスタルバイオレットで染色しその数を記録した。ウエルあたりのコロニー数にウイルス上清液の希釈倍率を乗じた値より、上清１ｍｌ当たりに含まれる感染性粒子数（ｃｆｕ／ｍｌ）を算出し、これを上清液の力価として以降の実験におけるウイルス上清液の添加量を決定した。
【０１７１】
実施例２
（１）フィブロネクチン由来ポリペプチドの調製
ヒトフィブロネクチン由来のポリペプチド、Ｈ−２７１（配列表の配列番号１にそのアミノ酸配列を示す）は該ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組換えプラスミド、ｐＨＤ１０１を含有する大腸菌、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢ１０１／ｐＨＤ１０１（ＦＥＲＭＢＰ−２２６４）より、米国特許第５，１９８，４２３号公報に記載の方法により調製した。
【０１７２】
また、ポリペプチドＣＨ−２７１（配列表の配列番号２３にそのアミノ酸配列を示す）は以下に示す方法により調製した。すなわち、大腸菌、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢ１０１／ｐＣＨ１０１（ＦＥＲＭＢＰ−２７９９）を用い、これを上記の公報に記載の方法で培養し、該培養物よりＣＨ−２７１を得た。
【０１７３】
また、ポリペプチドＣＨ−２９６（配列表の配列番号２４にそのアミノ酸配列を示す）は以下に示す方法により調製した。すなわち、大腸菌、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭＢＰ−２８００）を用い、これを上記の公報に記載の方法で培養し、該培養物よりＣＨ−２９６を得た。
【０１７４】
ポリペプチドＣ−２７４（配列表の配列番号２５にそのアミノ酸配列を示す）は以下に示す方法により調製した。すなわち、大腸菌、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＴＦ７２２１（ＦＥＲＭＢＰ−１９１５）を用い、これを米国特許第５，１０２，９８８号公報に記載の方法で培養し、該培養物よりＣ−２７４を得た。
【０１７５】
さらに、ポリペプチドＣ２７７−ＣＳ１（配列表の配列番号２９にそのアミノ酸配列を示す）は以下に示す方法により調製した。すなわち、特開平３−２８４７００号公報にＦＥＲＭＰ−１１３３９として記載され、現在はブタペスト条約の下、上記の茨城県つくば市東１丁目１番３号の通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５７２３として寄託されている大腸菌、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢ１０１／ｐＣＳ２５（原寄託日；平成２年３月５日）を用い、これを上記公報に記載の方法で培養し、該培養物よりＣ２７７−ＣＳ１を得た。
【０１７６】
（２）Ｃ−ＦＧＦ・Ａの調製
ポリペプチドＣ−ＦＧＦ・Ａ（配列表の配列番号４にそのアミノ酸配列を示す）は以下に示す方法に従って調製した。すなわち、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組み換えプラスミド、ｐＹＭＨ−ＣＦ・Ａを含む大腸菌、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＹＭＨ−ＣＦ・Ａ（ＦＥＲＭＢＰ−５２７８）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で８時間培養した。この前培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を含むＬＢ培地５００ｍｌに接種し、３７℃で一夜培養した後集菌した。得られた菌体を１ｍＭＰＭＳＦ（フェニルメタンスルホニウムフルオリド）、０．０５％ノニデットＰ−４０を含む１０ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し、超音波処理を行って菌体を破砕した後、遠心分離を行って上清を得た。この上清の２６０ｎｍにおける吸光度を測定して、これに上清の液量（ｍｌ）を乗じた値を算出し、この値４０００に対して１ｍｌの割合で５％ポリエチレンイミンを加えた後、遠心分離して上清を得た。この上清をあらかじめＰＢＳで平衡化したハイトラップ−ヘパリンカラム（ファルマシア社製）にかけ、ＰＢＳで非吸着の画分を洗浄した後、０．５Ｍから２ＭのＮａＣｌ濃度勾配を持つＰＢＳで吸着画分の溶出を行った。溶出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析すると約４７ｋｄのポリペプチドを含む２つの画分が存在していたが、このうちの高ＮａＣｌ濃度で溶出された方の画分を集めて１．５ＭＮａＣｌを含むＰＢＳで平衡化したスーパーロース６カラム（ファルマシア社製）にかけた。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、約４７ｋｄのポリペプチドを含む画分を集めて精製Ｃ−ＦＧＦ・Ａを調製し、以下の操作に使用した。
【０１７７】
（３）Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１の調製
まず、ポリペプチドＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１（配列表の配列番号５にそのアミノ酸配列を示す）を大腸菌を宿主として発現させるためのプラスミドを構築した。
【０１７８】
ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭＢＰ−２８００）を培養し、得られた菌体よりアルカリ−ＳＤＳ法によってプラスミドｐＣＨ１０２を調製した。このプラスミドを鋳型とし、プライマーＭ４（宝酒造社製）及び配列表の配列番号９に塩基配列を示すプライマーＣＳ１−Ｓを用いたＰＣＲ反応を行った後、エタノール沈殿によって反応液中の増幅ＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片をＮｈｅＩ、ＳａｌＩ（ともに宝酒造社製）で消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い約９７０ｂｐのＤＮＡ断片をゲルより回収した。
【０１７９】
次にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＹＭＨ−ＣＦ・Ａ（ＦＥＲＭＢＰ−５２７８）を培養し、得られた菌体よりアルカリ−ＳＤＳ法によってプラスミドｐＹＭＨ−ＣＦ・Ａを調製した。このプラスミドを鋳型とし、配列番号１０に塩基配列を示すプライマーＣＦ及び配列表の配列番号１１に塩基配列を示すプライマーＦＮＲを用いたＰＣＲ反応を行った後、エタノール沈殿によって反応液中の増幅ＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片をＥｃｏ５２Ｉ（宝酒造社製）、ＮｈｅＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動を行い約３２０ｂｐのＤＮＡ断片をゲルより回収した。
【０１８０】
上記のプラスミドｐＹＭＨ−ＣＦ・ＡをＥｃｏ５２Ｉ、ＳａｌＩで消化した後にアガロースゲル電気泳動を行って単離される約４．１ｋｂのＤＮＡ断片を上記の約９７０ｂｐのＤＮＡ断片及び約３２０ｂｐのＤＮＡ断片と混合し、ライゲーションを行って得られる組換えプラスミドを大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、上記の３つのＤＮＡ断片が１分子ずつ含まれたものを選んでプラスミドｐＣＦＳ１００と命名した。また、プラスミドｐＣＦＳ１００で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＣＦＳ１００と命名した。プラスミドｐＣＦＳ１００はＣ−ＦＧＦ・ＡのＣ末端側にフィブロネクチン由来のＣＳ−１細胞接着領域を有し、ＦＧＦのＣ末端より２番目のリジンがアラニンに置換されたポリペプチド、Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１をコードしている。
【０１８１】
ポリペプチドＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１は以下に示す方法に従って調製した。すなわち、上記の大腸菌、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＣＦＳ１００を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で８時間培養した。この前培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリン、１ｍＭのＩＰＴＧを含むＬＢ培地５００ｍｌに接種し、３７℃で一夜培養した後集菌した。得られた菌体を０．５ＭＮａＣｌ、１ｍＭＰＭＳＦ、０．０５％ノニデットＰ−４０を含む１０ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し、超音波処理を行って菌体を破砕した後、遠心分離を行って上清を得た。この上清をあらかじめ０．５ＭＮａＣｌを含むＰＢＳで平衡化したハイトラップ−ヘパリンカラムにかけ、０．５ＭＮａＣｌを含むＰＢＳで非吸着の画分を洗浄した後、０．５Ｍから２ＭのＮａＣｌ濃度勾配を持つＰＢＳで吸着画分の溶出を行った。溶出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析し、約５０ｋｄのポリペプチドを含む画分を集めて精製Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１を調製し、以下の操作に使用した。
【０１８２】
こうして得られた精製Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１のＮ末端から５番目までのアミノ酸配列を調べたところ、配列表の配列番号５に示されたアミノ酸配列のものと一致した。また、質量分析法によって測定された精製Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１の分子量も上記のアミノ酸配列から予想されるものと一致した。
【０１８３】
（４）Ｃ２７７−ＣｏｌＶの調製
ポリペプチドＣ２７７−ＣｏｌＶ（配列表の配列番号６にそのアミノ酸配列を示す）は以下に示す操作によって精製した。すなわち、上記ポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する組み換えプラスミド、ｐＴＦ７５２０ＣｏｌＶを含む大腸菌、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＴＦ７５２０ＣｏｌＶ（ＦＥＲＭＢＰ−５２７７）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で６．５時間培養した。この前培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地５００ｍｌに接種し、３７℃で培養した。６６０ｎｍにおける吸光度が０．６に達した時点でＩＰＴＧを終濃度１ｍＭになるように添加して一夜培養した後に集菌した。得られた菌体を１ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ノニデットＰ−４０、２ｍＭＰＭＳＦを含む１０ｍｌのＰＢＳに懸濁し、超音波処理を１０分間行って菌体を破砕した。この菌体破砕液を遠心分離して得た上清をＰＢＳで平衡化したリソースＱカラム（ファルマシア社製）にかけ、目的のポリペプチドを含む非吸着画分を得た。この画分をＰＢＳで平衡化したハイトラップ−ヘパリンカラムにかけ、ＰＢＳで非吸着の画分を洗浄した後、０Ｍから０．５ＭのＮａＣｌ濃度勾配を持つＰＢＳで吸着画分の溶出を行った。溶出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、４８ｋｄのポリペプチドを含む画分を集めて精製Ｃ２７７−ＣｏｌＶを調製し、以下の操作に使用した。
【０１８４】
（５）ＣｏｌＶの調製
まず、ポリペプチドＣｏｌＶ（配列表の配列番号６にそのアミノ酸配列を示す）を大腸菌を宿主として発現させるためのプラスミドを構築した。
【０１８５】
ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢ１０１／ｐＴＦ７５２０ＣｏｌＶ（ＦＥＲＭＢＰ−５２７７）を培養し、得られた菌体よりアルカリ−ＳＤＳ法によってプラスミドｐＴＦ７５２０ＣｏｌＶを調製した。このプラスミドをＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化後、アガロースゲル電気泳動を行い、約０．５８ｋｂのＤＮＡ断片をゲルより回収した。これをあらかじめＮｃｏＩとＢａｍＨＩで消化しておいたプラスミドベクターｐＥＴ８Ｃ（ノバジェン社製）と混合してライゲーションを行った。得られた組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１に導入して得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、上記の約０．５８ｋｂＤＮＡ断片１分子のみが含まれたものを選び、これをプラスミドｐＥＴＣｏｌＶと命名した。
【０１８６】
上記のプラスミドｐＥＴＣｏｌＶで形質転換された大腸菌ＢＬ２１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ−２１／ｐＥＴＣｏｌＶを５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０ｍｌのＬＢ培地中、３７℃で一夜培養した。この前培養液０．２ｍｌを５０μｇ／ｍｌのアンピシリン、を含むＬＢ培地１００ｍｌに接種し、３７℃で培養した。６００ｎｍの吸光度が０．４に達した時点でＩＰＴＧを終濃度１ｍＭとなるように添加し、一夜培養した後に集菌した。得られた菌体を１ｍＭＥＤＴＡ、０．０５％ノニデットＰ−４０、１０μｇ／ｍｌアプロチニン（ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）、１０μｇ／ｍｌロイペプチン（ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）、２ｍＭＰＭＳＦを含む５ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁し、超音波処理を行って菌体を破砕した後、遠心分離を行って上清を得た。この上清をＰＢＳで平衡化したハイトラップ−ヘパリンカラムにかけ、ＰＢＳで非吸着の画分を洗浄した後、０．５ＭのＮａＣｌを含むＰＢＳで吸着画分の溶出を行った。溶出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した結果、ほぼ単一な約１８ｋｄのポリペプチドが確認された。こうして得られた精製ＣｏｌＶを以下の操作に使用した。
【０１８７】
（６）Ｈ２−５４７の調製
ポリペプチドＨ２−５４７（配列表の配列番号１３にそのアミノ酸配列を示す）を発現させるためのプラスミドは以下に示す操作に従って構築した。ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢ１０１／ｐＣＨ１０２（ＦＥＲＭＢＰ−２８００）を培養し、得られた菌体よりアルカリ−ＳＤＳ法によってプラスミドｐＣＨ１０２を調製した。このプラスミドを鋳型とし、配列表の配列番号１５に塩基配列を示すプライマー１２Ｓと配列表の配列番号１６に塩基配列を示すプライマー１４Ａとを用いたＰＣＲ反応の後、アガロースゲル電気泳動を行い、フィブロネクチンのヘパリン結合ポリペプチドをコードする約０．８ｋｂのＤＮＡ断片をゲルより回収した。得られたＤＮＡ断片をＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化した後、ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化したｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）と混合してライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、上記のＤＮＡ断片を含むプラスミドを選んでこれをプラスミドｐＲＨ１とした。
【０１８８】
プラスミドベクターｐＩＮＩＩＩ−ｏｍｐＡ１（ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、第３巻、第２４３７〜２４４２頁、１９８４年）をＢａｍＨＩとＨｉｎｃＩＩ（宝酒造社製）とで消化し、リポプロテインターミネーター領域を含む約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。これをＢａｍＨＩとＨｉｎｃＩＩで消化した上記のプラスミドｐＲＨ１と混合してライゲーションを行い、ｌａｃプロモーター、ヘパリン結合ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片およびリポプロテインターミネーターをこの順に含むプラスミドｐＲＨ１−Ｔを得た。
【０１８９】
プラスミドｐＲＨ１−ＴをＮｈｅＩとＳｃａＩ（ともに宝酒造社製）で消化して得られる約３．１ｋｂのＤＮＡ断片と、ＳｐｅＩ（宝酒造社製）とＳｃａＩで消化して得られる約２．５ｋｂのＤＮＡ断片をそれぞれ調製し、この２つをライゲーションさせることによってｌａｃプロモーター、ヘパリン結合ポリペプチドが２個タンデムに連結されたポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、およびリポプロテインターミネーターをこの順に含むプラスミドｐＲＨ２−Ｔを得た。上記のオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号１７に示す。
【０１９０】
ポリペプチドＨ２−５４７は以下の方法により調製した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１２０ｍｌのＬＢ培地を入れた５００ｍｌバッフル付き三角フラスコを４本用意し、これに上記のプラスミドｐＲＨ２−Ｔで形質転換された大腸菌ＨＢ１０１、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢ１０１／ｐＲＨ２−Ｔを接種して３７℃で１晩培養した。培養液より遠心分離によって菌体を集め、４０ｍｌの破砕用緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波処理を行って菌体を破砕した。遠心分離を行って得られた上清を精製用緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で平衡化されたハイトラップ−ヘパリンカラム（ファルマシア社製）にかけた。同緩衝液でカラム内の非吸着画分を洗浄した後、０〜１ＭＮａＣｌ濃度勾配を持つ精製用緩衝液で溶出を行った。溶出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、分子量約６万のポリペプチドを含む画分を集めて精製Ｈ２−５４７標品を得た。得られた標品の蛋白量をＢＣＡプロテインアッセイリエージェント（ピアス社製）により、ウシ血清アルブミンをスタンダードとして測定したところ、約１０ｍｇのＨ２−５４７が得られていた。
【０１９１】
こうして得られた精製Ｈ２−５４７のＮ末端から５残基までののアミノ酸配列を調べたところ、配列表の配列番号１７に示される塩基配列から予想されるＨ２−５４７のアミノ酸配列よりＮ末端のメチオニンが除去されたもの（配列表の配列番号１３にその配列を示す）と一致した。また、質量分析法によって測定された精製Ｈ２−５４７の分子量は配列表の配列番号１３に示されるアミノ酸配列から予想されるものと一致した。
【０１９２】
（７）ＣＨ２−８２６の調製
ポリペプチドＣＨ２−８２６（配列表の配列番号１４にそのアミノ酸配列を示す）を発現させるためのプラスミドは以下に示す操作に従って構築した。上記のプラスミドｐＣＨ１０２を鋳型とし、配列表の配列番号１８に塩基配列を示すプライマーＣＬＳと配列表の配列番号１９に塩基配列を示すプライマーＣＬＡとを用いたＰＣＲ反応の後、アガロースゲル電気泳動を行い、フィブロネクチンの細胞接着ポリペプチドをコードする約０．８ｋｂのＤＮＡ断片をゲルより回収した。得られたＤＮＡ断片をＮｃｏＩ、ＢｇｌＩＩ（宝酒造社製）で消化した後、ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化したｐＴＶ１１８Ｎと混合してライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、上記のＤＮＡ断片を含むプラスミドを選んでこれをプラスミドｐＲＣ１とした。このプラスミドｐＲＣ１をＳｐｅＩとＳｃａＩで消化して得られる約２．５ｋｂのＤＮＡ断片と、上記のプラスミドｐＲＨ２−ＴをＮｈｅＩとＳｃａＩで消化して得られる約３．９ｋｂのＤＮＡ断片とを混合してライゲーションを行い、細胞接着ポリペプチドのＣ末端にヘパリン結合ポリペプチドが２個タンデムに連結されたポリペプチドをコードするプラスミドｐＲＣＨ２−Ｔを得た。このポリペプチドをコードするプラスミドｐＲＣＨ２−Ｔ上のオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号２０に示す。
【０１９３】
ポリペプチドＣＨ２−８２６は実施例２−（６）に記載のポリペプチドＨ２−５４７について用いられたものと同様の方法により調製した。ハイトラップヘパリンカラムの溶出液のうち分子量約９万のポリペプチドを含む画分を集めて精製ＣＨ２−８２６標品を得た。
【０１９４】
（８）Ｈ２Ｓ−５３７の調製
ポリペプチドＨ２Ｓ−５３７（配列表の配列番号３０にそのアミノ酸配列を示す）を発現させるためのプラスミドは以下に示す操作に従って構築した。上記のプラスミドｐＣＨ１０２を鋳型とし、配列表の配列番号３１に塩基配列を示すプライマーＣＳ１Ｓと、配列表の配列番号３２に塩基配列を示すプライマーＣＳ１Ａとを用いたＰＣＲ反応の後、アガロースゲル電気泳動を行ってフィブロネクチンのＣＳ−１細胞接着領域をコードする約０．１ｋｂのＤＮＡ断片をゲルより回収した。得られたＤＮＡ断片をＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化した後、ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩで消化したプラスミドベクターｐＴＶ１１８Ｎと混合してライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体よりプラスミドを調製し、上記のＤＮＡ断片を含むプラスミドを選んでこれをプラスミドｐＲＳ１とした。
【０１９５】
プラスミドベクターｐＩＮＩＩＩ−ｏｍｐＡ１をＢａｍＨＩとＨｉｎｃＩＩとで消化し、リポプロテインターミネーター領域を含む約０．９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。これをＢａｍＨＩとＨｉｎｃＩＩとで消化した上記のプラスミドｐＲＳ１と混合してライゲーションを行い、ｌａｃプロモーター、ＣＳ−１領域ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片及びリポプロテインターミネーターをこの順に含むプラスミドｐＲＳ１−Ｔを得た。
【０１９６】
プラスミドｐＲＳ１−ＴをＮｈｅＩとＳｃａＩで消化して得られる約２．４ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＲＨ２−ＴをＳｐｅＩ、ＳｃａＩ、ＰｓｔＩ（宝酒造社製）で消化して得られる約３．３ｋｂのＤＮＡ断片をそれぞれ調製し、この２つをライゲーションさせることによってｌａｃプロモーター、タンデムに並んだ２個のヘパリン結合ポリペプチドのＣ末端側にさらにＣＳ−１領域が連結された構造のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、及びリポプロテインターミネーターをこの順に含むプラスミドｐＲＨ２Ｓ−Ｔを得た。上記のオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号３２に示す。
【０１９７】
ポリペプチドＨ２Ｓ−５７３は実施例２−（６）に記載のポリペプチドＨ２−５４７について用いられたものと同様の方法により調製した。ハイトラップヘパリンカラムの溶出液のうち分子量約６万のポリペプチドを含む画分を集めて精製Ｈ２Ｓ−５７３標品を得た。
【０１９８】
（９）機能性物質のプレートへの固定化
機能性物質を固定化されたプレート（６ウエルの組織培養プレート、ファルコン社製）をレトロウイルスの細胞への感染実験に使用する場合には、以下に示す操作にしたがって固定化操作を行った。すなわち、上記の実施例に記載の各種機能性物質を適当な濃度となるようにＰＢＳに溶解した溶液を１ウエル（底面積９．６ｃｍ^２）あたり２ｍｌ添加し、紫外線の照射下においてプレートのふたを開けて１時間、さらにふたを閉めて１時間、室温でインキュベートした。次に機能性物質溶液を２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、ベーリンガー・マンハイム社製）を含むＰＢＳ２ｍｌに交換してさらに３０分間、室温でインキュベートした後、２５ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）を含むＰＢＳでプレートを洗浄した。ＢＳＡを固定化した対照プレートは、上記の操作のうちポリペプチド溶液とのインキュベーションを省略して作製した。
【０１９９】
なお、以降に示す実施例での遺伝子導入（ウイルス感染）実験においては、特に断らない限り上記の６ウエルの組織培養プレートを使用し、プレートへの固定化に使用した機能性物質の濃度を示す場合には、ウエルの単位底面積あたりの機能性物質量をｐｍｏｌ／ｃｍ^２（およびμｇ／ｃｍ^２）を単位として記載する。たとえば上記のプレート（底面積９．６ｃｍ^２）について４８μｇ／ｍｌのＨ−２７１溶液２ｍｌを用いて固定化を行った場合には、「３３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１０μｇ／ｃｍ^２）のＨ−２７１を用いて固定化した」と記載する。また、遺伝子導入後の浮遊細胞（ＴＦ−１、ＨＬ−６０）を培養する際に用いるＣＨ−２９６を固定化したプレートは、４８ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（３μｇ／ｃｍ^２）のＣＨ−２９６溶液を用い、上記の操作によって固定化を行ったものである。以降の実施例において、標的細胞へのウイルス感染はすべてポリブレンを含有しない培地中で行った。また、使用するウイルス、細胞、培地等の量を示す場合には特に断らない限り１ウエルあたりの量を記載する。
【０２００】
実施例３
（１）機能性物質の混合物を用いた遺伝子導入
細胞に結合する物質と、レトロウイルスに結合する物質とを混合してプレートに固定化した場合の遺伝子導入効率への影響を調べるために以下に示す実験を行った。まず、実施例２−（９）に記載の方法に従って３２ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１．５μｇ／ｃｍ^２）のＣ−ＦＧＦ・Ａ、３２ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１μｇ／ｃｍ^２）のＣ−２７４と３２ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（０．５μｇ／ｃｍ^２）のＦＧＦとの混合物、および３２ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（０．５μｇ／ｃｍ^２）のＦＧＦ（ベクトン・ディッキンソン社製）のそれぞれを用い、各ポリペプチドをプレートに固定化した。これらのプレート、およびＢＳＡを固定化した対照プレートのそれぞれに１０００ｃｆｕのＰＭ５ｎｅｏウイルスを含む２ｍｌのウイルス上清液を加えて３７℃、３０分間プレインキュベーションした後、ＰＢＳを用いてプレートを徹底的に洗浄した。このプレートに２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む２ｍｌのＤＭＥＭ培地を加え、ポリブレンの非存在下に３７℃、２時間インキュベーションした後、非付着細胞はデカンテーションによって、またプレートに付着した細胞はトリプシン処理の後にプレートから剥がすことによってそれぞれ採取し、これらを合わせた。得られた細胞懸濁液を二分して一方をＤＭＥＭ、もう一方を終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭとともに３７℃で１０日間培養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８を含まない培地で得られたコロニー数に対するＧ４１８耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率とし、その結果を図１に示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。
【０２０１】
図１に示されるように、レトロウイルスの感染時間を２時間とした場合にはＦＧＦ単独ではＣ−ＦＧＦ・Ａに比べて低い遺伝子導入効率しか得られないが、Ｃ−２７４とＦＧＦの混合物を固定化したプレートを用いた場合には、この２つのポリペプチドが共有結合したＣ−ＦＧＦ・Ａを用いた場合と同様の効率でＧ４１８耐性コロニーが得られた。
【０２０２】
詳細な検討を行うために、Ｃ−２７４のみ、およびＦＧＦのみを固定化した場合とこれらの混合物を固定化した場合との比較を行った。すなわち３２ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１μｇ／ｃｍ^２）のＣ−２７４、３２ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（０．５μｇ／ｃｍ^２）のＦＧＦ、および３２ｐｍｏｌ／ｃｍ^２のＣ−２７４と３２ｐｍｏｌ／ｃｍ^２のＦＧＦとの混合物のそれぞれを用いて実施例２−（９）に記載の方法によってプレートへの固定化を行い、これらのプレートを用いて上記同様の操作でレトロウイルス感染への効果を調べた。得られた結果を図２に示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。
【０２０３】
図２に示されるようにＣ−２７４とＦＧＦとの混合物を固定化したプレートを用いた場合にはＦＧＦのみを固定化したものに比べて高い遺伝子導入効率を示した。またレトロウイルス結合部位を有しないＣ−２７４のみを固定化したプレートではＧ４１８耐性コロニーは得られなかった。以上の実験結果より、レトロウイルス結合部位を有するＦＧＦに細胞結合部位を有するＣ−２７４を組み合わせることによってＦＧＦ単独で使用した場合に比べて高い感染効率が得られること、およびこのようなポリペプチドの組み合わせによる効果の発現には必ずしもポリペプチド鎖が共有結合で結ばれている必要がないことが示された。
【０２０４】
（２）機能性物質の混合物を用いた遺伝子導入
レトロウイルス結合部位を有するポリペプチドをＣｏｌＶに置き換えて、実施例３−（１）同様の実験を行った。本実験においてはＣ−２７４とＣｏｌＶとを種々のモル比で混合した場合を比較した。すなわち、３３０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（６μｇ／ｃｍ^２）のＣｏｌＶ、３３０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１０μｇ／ｃｍ^２）のＣ−２７４と３３０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２のＣｏｌＶとの混合物（Ｃ−２７４とＣｏｌＶのモル比は１０：１０）、１００ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（３μｇ／ｃｍ^２）のＣ−２７４と３３０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２のＣｏｌＶとの混合物（３：１０）、３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１μｇ／ｃｍ^２）のＣ−２７４と３３０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２のＣｏｌＶとの混合物（１：１０）、３３０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１６μｇ／ｃｍ^２）のＣ２７７−ＣｏｌＶ、および３３０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１０μｇ／ｃｍ^２）のＣ−２７４のそれぞれを用いて実施例２−（９）に記載の方法によってプレートへの固定化を行い、作製されたプレートを用いて上記同様の操作でレトロウイルス感染への効果を調べた。得られた結果を図３に示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。
【０２０５】
図３に示されるように感染時間を２時間とした場合にはＣｏｌＶを固定化したプレート上での感染効率はＣ２７７−ＣｏｌＶ固定化プレートの１／２以下であるが、ＣｏｌＶとその１／１０量（分子数として）のＣ２７４の混合物を固定化したプレートを用いた場合にはＣ２７７−ＣｏｌＶと同等の感染効率が得られており、ＦＧＦの場合同様にＣ−２７４分子のレトロウイルス感染の促進効果が確かめられた。なお、ＣｏｌＶ分子に対するＣ−２７４分子の割合が上昇した場合にはこの効果はむしろ低下し、等量のＣｏｌＶ、Ｃ−２７４を含む混合物を固定化した場合にはＣｏｌＶのみを固定化した場合とほとんど差はみられない。
【０２０６】
（３）機能性物質の混合物を用いた遺伝子導入
細胞結合部位を有する物質と、レトロウイルス結合部位を有する物質とを混合してプレートへの固定化を行った場合の遺伝子導入効率への影響を調べるために以下に示す実験を行った。まず、実施例２−（９）に記載の方法に従い、３２ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１μｇ／ｃｍ^２）のＣ−２７４、３３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１０μｇ／ｃｍ^２）のＨ−２７１、および３２ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１μｇ／ｃｍ^２）のＣ−２７４と３３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１０μｇ／ｃｍ^２）のＨ−２７１との混合物のそれぞれを用いてプレートへの固定化を行った。これらのプレートそれぞれに１０００ｃｆｕのＰＭ５ｎｅｏウイルスを含む２ｍｌのウイルス上清液を加え、３７℃、３０分間プレインキュベーションした後、ＰＢＳを用いてプレートを徹底的に洗浄した。このプレートに２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む２ｍｌのＤＭＥＭ培地を加えて３７℃、２時間インキュベーションした後、非付着細胞はデカンテーションによって、またプレートに付着した細胞はトリプシン処理の後にプレートから剥がすことによってそれぞれ採取し、これらを合わせた。得られた細胞懸濁液を二分して一方をＤＭＥＭ、もう一方を終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭとともに３７℃で１０日間培養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８を含まない培地で得られたコロニー数に対するＧ４１８耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率とし、その結果を図４に示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。
【０２０７】
図４に示されるように、Ｃ−２７４とＨ−２７１の混合物（モル比１：１０）を固定化したプレートを用いた場合にはＨ−２７１のみを固定化したものに比べて感染効率が大きく上昇した。なお、Ｃ−２７４のみを固定化したプレートでは遺伝子導入は見られなかった。
【０２０８】
（４）Ｃ２７７−ＣＳ１を用いた遺伝子導入
細胞結合部位を有する物質としてＣ２７７−ＣＳ１を用い、これとレトロウイルスに結合部位を有する物質とを混合してプレートへの固定化を行った場合の感染効率への影響を調べるために以下に示す実験を行った。レトロウイルスに結合する物質としてはポリリジン［（Ｌｙｓ）ｎ、ポリ−Ｌ−リジン臭化水素酸塩、分子量５万〜１０万、和光純薬社製］、およびＨ−２７１の２種を用い、また細胞には浮遊細胞であるＴＦ−１細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−２００３）を用いた。まず、実施例２−（９）に記載の方法に従い、以下に示す溶液でプレートへの固定化を行った。３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１．１μｇ／ｃｍ^２）のＣ２７７−ＣＳ１、１３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１０μｇ／ｃｍ^２）のポリリジン、３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２のＣ２７７−ＣＳ１と１３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２のポリリジンとの混合物、３３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１０μｇ／ｃｍ^２）のＨ−２７１、３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２のＣ２７７−ＣＳ１と３３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２のＨ−２７１との混合物、および３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（２．１μｇ／ｃｍ^２）のＣＨ−２９６。これらのプレートそれぞれに１×１０４ｃｆｕ／のＴＫＮＥＯウイルス、１×１０４個のＴＦ−１細胞を含むＲＰＭＩ１６４０培地［５ｎｇ／ｍｌＧＭ−ＣＦＳ（ペトロテック社製）、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むもの］を加えて３７℃で２４時間インキュベーションした。インキュベーション終了後、非付着細胞はデカンテーションによって、またプレートに付着した細胞はトリプシン処理を行ってそれぞれ採取し、これらを合わせた。得られた細胞懸濁液のうちの１／５づつをＣＨ−２９６を固定化したプレート２枚に移して２４時間インキュベートした後、培地を一方は上記の培地、またもう一方は終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む上記の培地に交換して３７℃で８日間培養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８の存在下、非存在下に出現したコロニー数よりＧ４１８耐性コロニーの出現率（遺伝子導入効率）を算出した。
【０２０９】
図５に得られた結果を示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。なお図５の（ａ）はレトロウイルス結合性物質としてポリリジンを用いた場合、（ｂ）はＨ−２７１を用いた場合である。細胞へ結合部位を有するＣ２７７−ＣＳ１をポリリジン、あるいはＨ−２７１と併用することにより、遺伝子導入効率はこれらのレトロウイルス結合性物質のみを固定化したプレートに比べて著しく上昇することが示された。
【０２１０】
（５）エリスロポエチン誘導体ポリペプチドの調製
エリスロポエチンに対するレセプターを有する細胞への遺伝子導入に使用するために、エリスロポエチンをグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼとの融合ポリペプチドとした誘導体ポリペプチド、ＧＳＴ−Ｅｐｏを調製した。配列表の配列番号３４にＧＳＴ−Ｅｐｏのアミノ酸配列を示す。該配列中２３３番目〜３９８番目のアミノ酸配列がエリスロポエチンに相当する。
【０２１１】
まず、ＧＳＴ−Ｅｐｏを発現させるためのプラスミドを以下に示す操作に従って構築した。ヒト胎児肝臓由来のｃＤＮＡライブラリー（クロンテック社製）を鋳型とし、プライマーＥＰＦ１、ＥＰＲ１（配列表の配列番号３５、３６にそれぞれプライマーＥＰＦ１、ＥＰＲ１の塩基配列を示す）を用いたＰＣＲを行った。この反応液の一部をとってこれを鋳型とし、プライマーＥＰＦ２、ＥＰＲ２（配列表の配列番号３７、３８にそれぞれプライマーＥＰＦ２、ＥＰＲ２の塩基配列を示す）を用いて再度ＰＣＲを行った。この反応液より増幅ＤＮＡ断片を回収し、これをＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化した後、アガロースゲル電気泳動を行ってエリスロポエチンをコードする領域を含む約５２０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。得られた断片をＥｃｏＲＩ（宝酒造社製）、ＢａｍＨＩで消化したプラスミドベクターｐＴＶ１１８Ｎ（宝酒造社製）と混合してライゲーションを行った後、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体より上記のＤＮＡ断片を含むプラスミドを保持するものを選択し、プラスミドを調製してこれをプラスミドｐＥＰＯと命名した。次に、こうして得られたプラスミドｐＥＰＯをＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ（宝酒造社製）で消化した後、アガロースゲル電気泳動を行って約０．５ｋｐのＤＮＡ断片を回収した。この断片をＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩで消化したプラスミドベクターｐＧＥＸ５Ｘ−３（ファルマシア社製）と混合してライゲーションを行った後、大腸菌ＪＭ１０９に導入した。得られた形質転換体より上記のＤＮＡ断片を含むプラスミドを保持するものを選択し、このプラスミドを調製してこれをプラスミドｐＧＳＴＥＰＯと命名した。該プラスミドにはベクター由来のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼのＣ末端部分にエリスロポエチンのアミノ酸配列が挿入された融合ポリペプチド、ＧＳＴ−Ｅｐｏがコードされている。プラスミドｐＧＳＴＥＰＯ上のＧＳＴ−ＥＰＯをコードする塩基配列を配列表の配列番号３９に示す。
【０２１２】
ポリペプチドＧＳＴ−Ｅｐｏは以下に示す操作によって調製した。１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地を７本準備し、それぞれに上記のプラスミドｐＧＳＴＥＰＯで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＪＭ１０９／ｐＧＳＴＥＰＯを接種して３７℃で１晩培養した。次に、同様の培地５００ｍｌずつを入れた２リットル容三角フラスコを７本用意し、これに上記の培養液５ｍｌずつを接種して３７℃で培養した。培養開始より３．５時間後に終濃度１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加し、さらに３．５時間培養した。培養終了後、遠心分離を行って培養液より菌体を回収し、これを１ｍＭＰＭＳＦおよび１ｍＭＥＤＴＡを含む１００ｍｌのＰＢＳに懸濁し、超音波処理を行って菌体を破砕した。得られた破砕液に１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭＥＤＴＡおよび２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含む１００ｍｌのＰＢＳを加え、氷上に３０分間静置した後に遠心分離を行って上清を集めた。得られた上清を０．４５μｍのフィルター（ミリポア社製）でろ過した後、ＰＢＳで平衡化したグルタチオン−セファロース４Ｂカラム（ファルマシア社製、３ｍｌ）にアプライした。カラムをＰＢＳで洗浄後、１０ｍＭグルタチオンを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を用いて溶出を行った。溶出液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析し、分子量約４．４万のポリペプチドを含む画分を集めてこれをＰＢＳに対して透析した。透析後の試料をＰＢＳで平衡化したリソースＱカラム（ファルマシア社製、６ｍｌ）にアプライし、カラムをＰＢＳで洗浄後、０〜０．６ＭＮａＣｌ濃度勾配を持つＰＢＳにより溶出を行った。上記同様にグルタチオンを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を用いて溶出を行った。分子量約４．４万のポリペプチドを含む画分を集め、これをセントリコン１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過によって約５０μｌまで濃縮し、さらにウルトラフリーＣ３ＧＶＳＴＲＬ（ミリポア社製）を用いてろ過した後、ろ液をスーパーデックス２００カラム（ファルマシア社製、ＰＢＳにて平衡化）を用いたゲルろ過クロマトグラフィーに供した。分子量約４．４万のポリペプチドを含む溶出画分を集め、これをＧＳＴ−Ｅｐｏポリペプチド溶液として以降の実験に使用した。このＧＳＴ−Ｅｐｏ溶液中には総タンパクの約５０％のＧＳＴ−Ｅｐｏが含まれていた。
【０２１３】
（６）エリスロポエチンレセプター発現細胞への遺伝子導入
細胞結合活性を有する機能性物質としてエリスロポエチンを使用した場合の遺伝子導入への効果を、エリスロポエチンのレセプターを発現するＴＦ−１、およびエリスロポエチンのレセプターを発現しないＨＬ−６０（ＡＴＣＣＣＣＬ−２４０）の２種の細胞を用いて調べた。なお、エリスロポエチンとしては上記のエリスロポエチン誘導体ポリペプチド（ＧＳＴ−Ｅｐｏ）を、また、レトロウイルスに結合する物質としてポリリジンをそれぞれ使用した。まず、実施例２−（９）に記載の方法に従って３４ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１．５μｇ／ｃｍ^２）相当のＧＳＴ−Ｅｐｏ、１３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１０μｇ／ｃｍ^２）のポリリジンおよび３４ｐｍｏｌ／ｃｍ^２のＧＳＴ−Ｅｐｏと１３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２のポリリジンとの混合物のそれぞれを用いてプレートへの固定化を行った。これらのプレートそれぞれに１×１０４ｃｆｕ／のＴＫＮＥＯウイルス、および１×１０４個の細胞を含む培地を加えて３７℃で２４時間インキュベーションした。なお培地としては、ＴＦ−１についてはＲＰＭＩ１６４０培地（５ｎｇ／ｍｌＧＭ−ＣＦＳ、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したもの）、ＨＬ−６０にはＲＰＭＩ培地（ニッスイ社製、１０％ＦＣＳ、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したもの）をそれぞれ使用した。インキュベーション終了後、非付着細胞はデカンテーションによって、またプレートに付着した細胞はトリプシン処理を行ってそれぞれ採取し、これらを合わせた。各プレートより得られた細胞懸濁液のうちの１／５づつをＣＨ−２９６を固定化したプレート２枚に移して２４時間インキュベートした後、培地を一方は上記の培地、またもう一方は終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む上記の培地に交換して３７℃で８日間培養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８の存在下、非存在下に出現したコロニー数よりＧ４１８耐性コロニーの出現率（遺伝子導入効率）を算出した。
【０２１４】
図６に結果を示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。図６（ａ）に示したＴＦ−１細胞の場合、ポリリジンのみを固定化したプレートにおいてもある程度の遺伝子導入が起こっているが、ＧＳＴ−Ｅｐｏが共存する場合にはこれよりも高い遺伝子導入効率が得られた。一方、図６（ｂ）に示したＨＬ−６０細胞では、ＧＳＴ−Ｅｐｏの共存による遺伝子導入効率の上昇は見られなかった。以上の結果より、エリスロポエチンを利用することにより、標的とする細胞に特異的な遺伝子導入が可能なことが示された。
【０２１５】
さらに、レトロウイルス結合部位を有する物質をＨ２−５４７にかえてＴＦ−１細胞への遺伝子導入実験を行った。実施例２−（９）に記載の方法に従って３３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（２０μｇ／ｃｍ^２）のＨ２−５４７、３４ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１．５μｇ／ｃｍ^２）相当のＧＳＴ−Ｅｐｏ、および３４ｐｍｏｌ／ｃｍ^２のＧＳＴ−Ｅｐｏと３３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（２０μｇ／ｃｍ^２）のＨ２−５４７との混合物のそれぞれを用いてプレートへの固定化を行った。同時にＢＳＡを固定化したプレートを使用した対照実験も行った。図７に得られた結果を示す。図中、横軸はプレートに固定化された機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。図に示されるようにＨ２−５４７を使用した場合にもＧＳＴ−Ｅｐｏの共存によってＴＦ−１細胞への遺伝子導入効率が向上することが示された。
【０２１６】
（７）機能性物質の混合物を固定化したビーズを用いた遺伝子導入
細胞結合部位を有する物質とレトロウイルス結合部位を有する物質の両者を固定化したビーズを用いて、レトロウイルス感染効率を上げることが可能かどうかを調べた。
【０２１７】
ポリペプチドを固定化したビーズは以下に示す方法により調製した。ビーズには粒子径１．１４μｍのポリスチレンビーズ（ポリビーズポリスチレンミクロスフェア、ポリサイエンス社製）を用いた。上記ビーズの２．５％懸濁液２０μｌにエタノール８０μｌ、および各種ポリペプチドのＰＢＳ溶液２ｍｌを加えて４℃で一夜静置した後、ＢＳＡおよびＰＢＳを加えて４ｍｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳ懸濁液とした。この懸濁液より遠心分離によって回収したビーズを再度５ｍｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁し、室温で１時間静置してポリペプチド固定化ビーズの懸濁液を得た。ポリペプチド溶液としては１００μｇ／ｍｌＣ−２７４、１００μｇ／ｍｌＨ−２７１、１００μｇ／ｍｌＣＨ−２７１、１００μｇ／ｍｌＣＨ−２９６、および１００μｇ／ｍｌＨ−２７１と１０μｇ／ｍｌＣ−２７４の混合物を用い、また対照として２％ＢＳＡ溶液を使用して固定化を行ったビーズも同様に調製した。
【０２１８】
調製されたポリペプチド固定化ビーズのうち１／１０量を上記の懸濁液より回収し、それぞれを２０００個のＴＦ−１細胞、１０００ｃｆｕのＴＫＮＥＯウイルス上清液とともに３７℃で一晩培養した。細胞を回収し、０．３％ＢａｃｔｏＡｇａｒ（ディフコ社製）を含むＲＰＭＩ培地［１０％ＦＣＳ、５ｎｇ／ｍｌＧＭ−ＣＦＳ（ペトロテック社製）、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むもの］に懸濁し、これを予め０．５％ＢａｃｔｏＡｇａｒを含む上記のＲＰＭＩ培地で作製した３５ｍｍプレート上にまいた。なお、培地は０．７５ｍｇ／ｍｌＧ４１８を含むもの、含まないものの２通りを使用した。プレートを５％ＣＯ_２中、３７℃で１４日間インキュベーションした後、Ｇ４１８の存在下、非存在下に出現したコロニーを計数し、Ｇ４１８耐性コロニーの出現率（遺伝子導入効率）を算出した。
【０２１９】
図８に結果を示す。図中、横軸はビーズに固定化された機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。Ｈ−２７１とＣ−２７４の混合物を固定化したビーズを使用した場合には、Ｈ−２７１のみを固定化されたビーズ、同一分子中にレトロウイルス結合部位と細胞結合部位の両方を有するＣＨ−２７１やＣＨ−２９６がそれぞれ固定化されたビーズを用いた場合に比べても高い遺伝子導入効率が得られた。
【０２２０】
実施例４
（１）ＦＧＦ、Ｃ−ＦＧＦ・Ａを用いた遺伝子導入
ＦＧＦ（ベクトン・ディッキンソン社製）、および配列表の配列番号４で表されるポリペプチド（Ｃ−ＦＧＦ・Ａ）のレトロウイルス感染に対する影響をＮＩＨ／３Ｔ３細胞コロニー形成アッセイによって調べた。すなわち、実施例２−（９）に記載の方法により１３２ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（２．２５μｇ／ｃｍ^２）のＦＧＦ、および１３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（６．３μｇ／ｃｍ^２）のＣ−ＦＧＦ・Ａのそれぞれを用いて固定化を行ったプレート、およびＢＳＡを固定化した対照プレートのそれぞれに１０００ｃｆｕのＰＭ５ｎｅｏウイルスを含む２ｍｌのウイルス上清液を加えて３７℃、３０分間プレインキュベーションした後、ＰＢＳを用いてプレートを徹底的に洗浄した。このプレートに２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む２ｍｌのＤＭＥＭ培地を加えて３７℃、２４時間インキュベーションし、その後０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む選択培地中で１０日間増殖させ、それに続いてコロニーを染色し、計数した。図９に得られた結果を示す。図中、横軸はプレートに固定化された機能性物質、縦軸は出現したＧ４１８耐性コロニー数をそれぞれ示す。
【０２２１】
図９に示されるように、対照として使用したＢＳＡ固定化プレートではコロニーが出現しなかったのに対し、ＦＧＦ、およびＣ−ＦＧＦ・Ａを固定化したプレートを用いた場合にはＧ４１８耐性コロニーの出現が確認された。この結果よりＦＧＦ、Ｃ−ＦＧＦ・Ａがレトロウイルス結合部位を有していること、および、フィブロネクチンの細胞結合部位ポリペプチドが付加されたＣ−ＦＧＦ・Ａは遺伝子導入においてＦＧＦより優れた効果を有することが示された。
【０２２２】
（２）プレートへの固定化に使用したＣ−ＦＧＦ・Ａ濃度と遺伝子導入効率との関係
種々の濃度のＣ−ＦＧＦ・Ａで固定化を行ったプレートでの遺伝子導入効率の比較を行った。すなわち実施例２−（９）に記載の方法に従い、０．５２１ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（０．０２４７μｇ／ｃｍ^２）〜５．２１ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（０．２４７μｇ／ｃｍ^２）のＣ−ＦＧＦ・Ａを用いて固定化を行ったプレート、およびＢＳＡ固定化プレート（対照プレート）を用い、実施例４−（１）と同様の操作でレトロウイルスの感染を行った。ウイルス感染処理後、非付着細胞はデカンテーションによって、またプレートに付着した細胞はトリプシン処理によってプレートから剥がすことによってそれぞれ採取し、両者を合わせた。得られた細胞懸濁液を２等分して一方をＤＭＥＭ、他方を終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭとともに３７℃で１０日間培養した後、出現したコロニー数を数え、Ｇ４１８を含まない培地で得られたコロニー数に対するＧ４１８耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率とした。
【０２２３】
得られた結果を図１０に示す。図中、横軸はプレートの固定化操作に使用されたＣ−ＦＧＦ・Ａの濃度、縦軸は遺伝子導入効率をそれぞれ示す。なお、対照プレートでの実験結果はポリペプチド濃度０μｍｏｌ／ｃｍ^２としてプロットした。図１０に示されるように、固定化に使用したＣ−ＦＧＦ・Ａの濃度依存的に遺伝子導入効率の上昇が見られた。
【０２２４】
（３）ＨＬ−６０細胞への遺伝子導入
浮遊細胞であるＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−２４０）へのレトロウイルスの感染に関して、各種のポリペプチドの存在の効果を以下に示す操作によって調べた。すなわち、１００ｐｍｏｌ／ｃｍ^２のＣ−ＦＧＦ・Ａ（４．８μｇ／ｃｍ^２）、およびＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１（５．１μｇ／ｃｍ^２）を用いて実施例２−（９）に記載の方法で固定化を行ったプレート、およびＢＳＡを固定化した対照プレートのそれぞれに１×１０４ｃｆｕ／のＴＫＮＥＯウイルス、２０００個のＨＬ−６０細胞を含む２ｍｌのＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ、５０単位／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを添加して使用）を加えて３７℃で２４時間インキュベーションした。インキュベーション終了後、非付着細胞はデカンテーションによって、またプレートに付着した細胞はピペッティングによってそれぞれ採取し、これらを合わせた。得られた細胞懸濁液のうちの１／２づつをＣＨ−２９６固定化プレートに移して２４時間インキュベートした後、培地を終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む上記のＲＰＭＩ培地に交換し、３７℃で１２日間培養し、出現したコロニー数を数えた。各ポリペプチドを使用して得られたＧ４１８耐性コロニー数を図１１に示す。図中、横軸はプレートに固定化された機能性物質、縦軸は出現したＧ４１８耐性コロニー数をそれぞれ示す。
【０２２５】
図１１に示されるように、ＢＳＡ固定化プレートに比較してＣ−ＦＧＦ・ＡおよびＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１を固定化したプレートではＧ４１８耐性コロニー数が著しく上昇しており、これらのポリペプチドがＨＬ−６０細胞へのレトロウイルスの感染を促進していることが示された。
【０２２６】
（４）マウス骨髄細胞への遺伝子導入
骨髄細胞へのレトロウイルス感染に対するＦＧＦ、Ｃ−ＦＧＦ・ＡおよびＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１の効果を調べるため、以下に示す実験を行った。
【０２２７】
６〜８週齢のマウス（Ｃ３Ｈ／ＨｅＪ）に１５０ｍｇ／Ｋｇの５−フルオロウラシル（５−ＦＵ、アムレスコ社製）を腹腔内投与し、その２日後に大腿骨および脛骨を摘出して骨髄を採取した。得られた骨髄をフィコール−ハイパク（密度１．０８７５ｇ／ｍｌ、ファルマシア社製）を用いた密度勾配遠心分離に供し、低密度単核細胞画分を調製してこれをマウス骨髄細胞とした。
【０２２８】
マウス骨髄細胞はルスキー（Ｌｕｓｋｅｙ）等の方法（Ｂｌｏｏｄ、第８０巻、第３９６〜４０２頁、１９９２年）に従い、レトロウイルス感染前に予備刺激を行った。すなわち、２０％ＦＣＳ、１００単位／ｍｌ組換えヒトインターロイキン−６（ｒｈＩＬ−６、アムジェン社製）、１００ｎｇ／ｍｌ組換えマウス幹細胞因子（ｒｍＳＣＦ、アムジェン社製）、５０単位／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含有するα−ＭＥＭ（ギブコ社製）中に１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞密度で上記のマウス骨髄細胞を添加し、５％ＣＯ_２中、３７℃で４８時間インキュベートした。予備刺激した細胞は容器に付着したものを含め、ピペットを用いて吸引、採集した。
【０２２９】
実施例２−（９）に記載の方法に従って２３６μｍｏｌ／ｃｍ^２（４μｇ／ｃｍ^２）のＦＧＦ、１６９ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（８μｇ／ｃｍ^２）のＣ−ＦＧＦ・Ａ、あるいは１５９μｍｏｌ／ｃｍ^２（８μｇ／ｃｍ^２）のＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１を用いて固定化を行ったプレート、およびＢＳＡ固定化プレート（対照プレート）に１×１０６個の予備刺激した細胞と１×１０４ｃｆｕのＰＭ５ｎｅｏウイルスとを含む上記の予備刺激に用いられた培地２ｍｌを添加して３７℃でインキュベートした。２時間後に同量のウイルスを含む同様の培地（２ｍｌ）を新たにプレートに追加し、さらに２２時間インキュベートを続けた。インキュベート終了後、非接着細胞はデカンテーションによって、またプレートに接着した細胞は細胞解離緩衝液（ＣＤＢ、酵素を含まないもの、ギブコ社製）を使用してそれぞれ採集し、これらを合わせて同緩衝液で２回洗浄した後、細胞数を計数した。採集した細胞はＨＰＰ−ＣＦＣ（ＨｉｇｈＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅＰｏｔｅｎｔｉａｌ−ＣｏｌｏｎｙＦｏｒｍｉｎｇＣｅｌｌｓ、高増殖能コロニー形成細胞）アッセイに供した。
【０２３０】
ＨＰＰ−ＣＦＣアッセイはブラッドレー（Ｂｒａｄｌｅｙ）等の方法（Ａｕｓｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．、第４４巻、第２８７〜２９３頁、１９６６年）に従って行った。培地には１％／０．６６％重層軟寒天培地を使用し、終濃度１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むもの、および含まないものの２通りを用いた。１ウエルあたりに１×１０４個の感染細胞を添加し、１０％ＣＯ_２中、３７℃で１３日間インキュベートした。インキュベーション終了後、出現したコロニーを倒立顕微鏡で観察し、ＨＰＰ−ＣＦＣ由来の高密度コロニー（径０．５ｍｍ以上）を計数してＧ４１８耐性コロニーの出現率（遺伝子導入効率）を算出した。得られた結果を図１２に示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率を示す。
【０２３１】
図１２に示されるように、対照として使用したＢＳＡ固定化プレートではＧ４１８耐性コロニーは出現していないのに対し、上記の各ポリペプチドを固定化したプレートを使用した場合にはＧ４１８耐性コロニーが得られている。また、遺伝子導入効率はＦＧＦ、Ｃ−ＦＧＦ・Ａ、Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１の順に高くなっており、細胞への結合活性を持つフィブロネクチン由来の細胞結合部位ポリペプチド、およびＣＳ−１ポリペプチド部分の存在が骨髄細胞へのレトロウイルスの感染効率を高めた。
【０２３２】
（５）プレートの固定化に使用したＣ２７７−ＣｏｌＶ濃度と遺伝子導入効率との関係
種々の濃度のＣ２７７−ＣｏｌＶを用いて固定化を行ったプレートでの遺伝子導入効率の比較を以下に示す操作により行った。０．１ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（０．１μｇ／ｃｍ^２）〜４１６ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（２０μｇ／ｃｍ^２）のＣ２７７−ＣｏｌＶを用い、実施例２−（９）に記載の方法によってプレートへの固定化を行った。これらのプレートのそれぞれに１０００ｃｆｕのＰＭ５ｎｅｏウイルスを含む２ｍｌのウイルス上清液を加えて３７℃、３０分間プレインキュベーションした後、ＰＢＳを用いてプレートを徹底的に洗浄した。このプレートに２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む２ｍｌのＤＭＥＭ培地を加えて３７℃、２４時間インキュベーションした後、非付着細胞はデカンテーションによって、またプレートに付着した細胞はトリプシン処理の後にプレートから剥がすことによってそれぞれ採取し、これらを合わせた。得られた細胞懸濁液を二分し、一方にはＤＭＥＭ、もう一方には終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭを加えて３７℃で１０日間培養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８を含まない培地で得られたコロニー数に対するＧ４１８耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率とし、その結果を図１３に示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率を示す。
【０２３３】
図１３に示されるようにＣ２７７−ＣｏｌＶを固定化したプレートを用いた場合、固定化に使用したＣ２７７−ＣｏｌＶの濃度依存的に遺伝子導入効率が上昇した。
【０２３４】
（６）ポリリジンを用いた遺伝子導入
ポリリジン［（Ｌｙｓ）ｎ］とレトロウイルスとの結合を以下に示す操作により調べた。ポリリジンとしてはポリ−Ｌ−リジン臭化水素酸塩（分子量５万〜１０万、和光純薬社製）を使用した。まず、１３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１０μｇ／ｃｍ^２）のＰＢＳ溶液としたポリリジンを用い、実施例２−（９）に記載の方法によってプレートへの固定化を行った。このプレート、およびＢＳＡを固定化した対照プレートのそれぞれについて実施例４−（２）に記載の方法で遺伝子導入効率を評価した。その結果を図１４に示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率を示す。
【０２３５】
図１４に示されるようにＢＳＡを用いた対照プレートではコロニーが見られなかったのに対し、ポリリジンを固定化したプレートではＧ４１８耐性コロニーの出現が確認された。このことはレトロウイルスがプレートに固定化されたポリリジンに結合するために、洗浄後のプレート上にレトロウイルスが残存していることを示している。
【０２３６】
実施例５
（１）ポリペプチドの重合体を用いた遺伝子導入
ポリペプチドの重合体を用いた遺伝子導入は、各ポリペプチドをプレート上に固定しない状態で使用し、実施した。実施例２−（９）に記載の方法であらかじめＢＳＡを固定化しておいたプレートに１０００ｐｆｕのＰＭ５ｎｅｏウイルス、２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞、および終濃度０．６３ｎｍｏｌ／ｍｌの各ポリペプチド（Ｈ−２７１、ＣＨ−２７１、Ｈ２−５４７、ＣＨ２−８２６）を含む２ｍｌのＤＭＥＭ培地を加えて３７℃、２４時間インキュベートした後、非付着細胞はデカンテーションによって、またプレートに付着した細胞はトリプシン処理によってプレートから剥がすことによってそれぞれ採取し、両者を合わせた。また、対照としてポリペプチドを添加しないものについても同様の操作で導入実験を行った。得られた細胞懸濁液を２等分して一方をＤＭＥＭ、他方を終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭとともに３７℃で１０日間培養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８を含まない培地で得られたコロニー数に対するＧ４１８耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率とし、その結果を図１５に示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率を示す。
【０２３７】
図１５に示されるように、Ｈ２−５４７存在下での遺伝子導入効率はＣＨ−２７１存在下に比べて著しく高く、またＣＨ２−８２６でもＣＨ−２７１と同等あるいはそれ以上の遺伝子導入効率が得られた。
【０２３８】
さらに詳細な検討を行った。ポリペプチドとしてＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６、Ｈ２−５４７を使用し、それぞれプレートあたり０．１２６ｎｍｏｌ（終濃度０．０６３ｎｍｏｌ／ｍｌ）、１．２６ｎｍｏｌ（終濃度０．６３ｎｍｏｌ／ｍｌ）の２通りの量で用いた他は上記と同様に操作した。図１６に得られた結果を示す。図中、横軸は使用した機能性物質とその量、縦軸は遺伝子導入効率を示す。
【０２３９】
図１６に示されるようにＨ２−５４７を用いた場合には、用いた２通りのポリペプチド量のどちらでもＣＨ−２７１、ＣＨ−２９６に比べて有意に高い遺伝子導入効率が得られた。
【０２４０】
（２）Ｈ２Ｓ−５７３を用いたマウス骨髄細胞への遺伝子導入
骨髄細胞へのレトロウイルス感染に対するＨ２Ｓ−５７３の効果を調べるため、実施例４−（４）に記載の方法でマウス骨髄細胞への遺伝子導入を実験を行った。
【０２４１】
マウス骨髄細胞は上記実施例に記載の方法に従って調製し、予備刺激を行った。なお、レトロウイルス感染時のプレートにはＨ２Ｓ−５７３［１６０ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１０μｇ／ｃｍ^２）］を固定化したものの他、ＣＨ−２９６［１３２ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（８．３μｇ／ｃｍ^２）］を固定化したもの、および対照としてＢＳＡを固定化したものを用いた。ＨＰＰ−ＣＦＣアッセイにより得られた結果を図１７に示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率を示す。
【０２４２】
図１７に示されるように、対照として使用したＢＳＡ固定化プレートではＧ４１８耐性の高密度コロニーの出現は見られない。ＣＨ−２９６固定化プレートでは約５０％の遺伝子導入効率が得られているが、Ｈ２Ｓ−５７３固定化プレートを用いた場合にはこれよりも高い効率でＧ４１８耐性の高密度コロニーが得られた。
【０２４３】
実施例６
（１）非固定の機能性物質を用いた遺伝子導入
ポリペプチドがプレート上に固定されない状態で共存する場合にレトロウイルスの感染効率に与える影響について以下のようにして調べた。すなわち、実施例２−（９）に記載の方法によりあらかじめＢＳＡを固定化しておいたプレートに１００ｃｆｕのＰＭ５ｎｅｏウイルス、２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞、および終濃度１０、４０、２５０μｇ／ｍｌ（それぞれ０．１５８、０．６３２、３．９５０ｎｍｏｌ／ｍｌに相当）のＣＨ−２９６を含む２ｍｌのＤＭＥＭ培地を加えて２４時間インキュベーションした後、非付着細胞はデカンテーションによって、またプレートに付着した細胞はトリプシン処理の後にプレートから剥がすことによってそれぞれ採取し、両者を合わせた。得られた細胞懸濁液を１０ｃｍ細胞培養用プレートに移して２４時間インキュベートした後、培地を終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭに交換してさらに１０日間培養した。また、対照としてＣＨ−２９６を添加しないもの、および３２ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（２μｇ／ｃｍ^２）、１２７ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（８μｇ／ｃｍ^２）のＣＨ−２９６を固定化したプレートを用いてこれにウイルス上清液と細胞を加えたものについて上記同様に操作した。こうして得られたＧ４１８耐性コロニーの数を数え、結果を表１にまとめた。
【０２４４】
【表１】

【０２４５】
表１に示されるように溶液中に細胞、ウイルス、ＣＨ−２９６が共存する場合にはＣＨ−２９６非存在下に比べてＧ４１８耐性コロニー数が大幅に増加した。また、その数はＣＨ−２９６を固定化したプレートを用いた場合と同等か、もしくはそれよりも多かった。なお、ＢＳＡ固定化プレートに上記の各濃度のＣＨ−２９６溶液を添加してしばらく放置した後にプレートを洗浄してウイルス感染実験に用いた場合には、上記のＣＨ−２９６を添加しない場合と同程度のＧ４１８耐性コロニーしか得られないことから、ＢＳＡ固定化プレートにはＣＨ−２９６が結合しないことがわかる。従って上記のＣＨ−２９６によるレトロウイルス感染促進効果はインキュベート中に溶液中のＣＨ−２９６がプレートに結合してもたらされたものではないと考えられる。
【０２４６】
（２）非固定の機能性物質を用いた遺伝子導入
ポリペプチドがプレート上に固定されない状態で共存する場合にレトロウイルスの感染効率に与える影響について以下のようにして調べた。すなわち、実施例２−（９）に記載の方法によりあらかじめＢＳＡを固定化しておいたプレートに１０００ｃｆｕのＰＭ５ｎｅｏウイルス、２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞、および終濃度１．６７ｎｍｏｌ／ｍｌのＣ−ＦＧＦ・Ａ、ＣｏｌＶ、Ｃ２７７−ＣｏｌＶをそれぞれ含む２ｍｌのＤＭＥＭ培地を加えて３７℃、２４時間インキュベーションした後、非付着細胞はデカンテーションによって、またプレートに付着した細胞はトリプシン処理の後にプレートから剥がすことによってそれぞれ採取し、両者を合わせた。得られた細胞懸濁液を二分して一方をＤＭＥＭ、もう一方を終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭとともに３７℃で１０日間培養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８を含まない培地で得られたコロニー数に対するＧ４１８耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率とし、その結果を図１８に示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率を示す。
【０２４７】
図１８に示されるように、各ポリペプチドがウイルス感染時に共存する場合には高い遺伝子導入効率が得られており、これらのポリペプチドがプレート上に固定されない状態でもレトロウイルス感染の促進効果を有することが明らかとなった。
【０２４８】
（３）非固定の機能性物質を用いた浮遊細胞への遺伝子導入
非固定のポリペプチドが浮遊細胞への遺伝子導入効率に与える影響について以下のようにして調べた。すなわち、実施例２−（９）に記載の方法により３３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１０μｇ／ｃｍ^２）のＨ−２７１を固定化したプレート、およびＢＳＡを固定化したプレートのそれぞれに１×１０４ｃｆｕ／のＴＫＮＥＯウイルス、１×１０４個のＴＦ−１細胞を含む２ｍｌのＲＰＭＩ１６４０培地［５ｎｇ／ｍｌＧＭ−ＣＦＳ、５０単位／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むもの］を加え、さらにＢＳＡを固定化したプレートには終濃度５０μｇ／ｍｌ（１．６７ｎｍｏｌ／ｍｌ）のＨ−２７１を加えて３７℃で２４時間インキュベーションした。インキュベーション終了後、非付着細胞はデカンテーションによって、またプレートに付着した細胞はトリプシン処理を行ってそれぞれ採取し、これらを合わせた。得られた細胞懸濁液のうちの１／５づつをＣＨ−２９６を固定化したプレート２枚に移して２４時間インキュベートした後、培地を一方は上記の培地、またもう一方は終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む上記の培地に交換して３７℃で８日間培養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８の存在下、非存在下に出現したコロニー数よりＧ４１８耐性コロニーの出現率（遺伝子導入効率）を算出した。得られた結果を図１９に示す。図中、横軸は使用した機能性物質とその使用形態、縦軸は遺伝子導入効率を示す。
【０２４９】
図１９に示されるように、非固定のＨ−２７１を使用した場合にはＨ−２７１を固定化したプレートよりも高い遺伝子導入効率が得られており、ＴＦ−１細胞への遺伝子導入にＨ−２７１を使用する際には、非固定の状態の方が好ましいことが示された。
【０２５０】
（４）ポリペプチドによるレトロウイルス感染促進の機構の解明
上記実施例に示された、非固定のポリペプチドによる細胞へのレトロウイルス感染の促進が細胞とポリペプチドとの結合、およびポリペプチドとレトロウイルスとの結合を介して起こっていることを確かめるために以下に示すような実験を行った。まず実施例２−（９）に記載の方法で調製したＢＳＡ固定化プレートに１０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む２ｍｌのＤＭＥＭを加え、３７℃で２４時間生育させた。このプレートより培地を除き、それぞれ２ｍｌの１．６７ｎｍｏｌ／ｍｌのＨ−２７１、ＣＨ−２７１、Ｃ−ＦＧＦ・Ａおよび対照としてＰＢＳを加えて３７℃、２．５時間インキュベートした後、２５ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）を含むハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ社製）でプレートを洗浄した。次に１０００ｃｆｕのＰＭ５ｎｅｏウイルスを含む２ｍｌのウイルス上清液をプレートに加えて３７℃、３０分間インキュベートした後、ＰＢＳでプレートを洗浄した。このプレートに２ｍｌのＤＭＥＭを加えて３７℃、２４時間インキュベートした後に非付着細胞はデカンテーションによって、またプレートに付着した細胞はトリプシン処理の後にプレートから剥がすことによってそれぞれ採取し、両者を合わせた。得られた細胞懸濁液を二分して一方をＤＭＥＭ、もう一方を終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭとともに３７℃で１０日間培養し、出現したコロニー数を数えた。Ｇ４１８を含まない培地で得られたコロニー数に対するＧ４１８耐性コロニー数の割合を遺伝子導入効率とし、その結果を図２０に示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率を示す。
【０２５１】
図２０に示されるようにプレート上の細胞を上記のポリペプチド溶液で処理した後にウイルス感染を行った場合には著しい感染効率の上昇が見られた。このことは細胞にポリペプチドが結合し、さらに細胞上のポリペプチドにレトロウイルスが結合することによってレトロウイルスの感染効率の上昇が起こることを示唆している。
【０２５２】
さらに、添加するポリペプチドを、０．２９ｎｍｏｌ／ｍｌのＣ−ＦＧＦ・Ａ、および０．７９ｎｍｏｌ／ｍｌのＣＨ−２９６に変更し、上記同様の実験を行った。図２１にその結果を示す。図中、横軸は使用した機能性物質、縦軸は遺伝子導入効率を示す。図２１に示されるようにＣ−ＦＧＦ・Ａ、およびＣＨ−２９６を添加した場合には遺伝子導入効率の上昇が見られており、Ｃ−ＦＧＦ・Ａについて上記の活性が確認されるとともに、ＣＨ−２９６も同じ機構でレトロウイルスの感染を促進する活性を有することが示された。
【０２５３】
実施例７
（１）機能性物質を固定化したビーズを用いた遺伝子導入
機能性物質を固定化したビーズを用いてレトロウイルス感染効率を上げることが可能かどうかを以下に示す操作によって調べた。ビーズには粒子径１．１４μｍのポリスチレンビーズ（ポリビーズポリスチレンミクロスフェア、ポリサイエンス社製）を用いた。上記ビーズの２．５％懸濁液２０μｌにエタノール８０μｌ、および４０μｇ／ｍｌのＣＨ−２９６溶液２ｍｌを加えて４℃で一夜静置した後、ＢＳＡおよびＰＢＳを加えて４ｍｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳ懸濁液とした。この懸濁液より遠心分離によって回収したビーズを再度５ｍｌの１％ＢＳＡ／ＰＢＳに懸濁し、室温で１時間静置してＣＨ−２９６固定化ビーズの懸濁液を得た。なお対照としてＣＨ−２９６溶液のかわりに２％ＢＳＡを使用して固定化操作を行ったビーズも同様に調製した。
【０２５４】
上記のビーズ懸濁液のうち１／１０量（０．５ｍｌ）をとり、これより遠心分離によってビーズを回収した後、これに１０００ｃｆｕのＰＭ５ｎｅｏウイルスを含むＤＭＥＭを加えて３７℃、３０分間インキュベートした。ビーズを１％ＢＳＡ／ＰＢＳで２回洗浄後、２ｍｌのＤＭＥＭに懸濁して１ｍｌをプレートに移し、３×１０５個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む１ｍｌのＤＭＥＭを加え、ＣＯ_２インキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートした。その後、培地を終濃度０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含むＤＭＥＭに交換し、さらに１０日間培養し、出現したコロニーを染色、計数した。表２にその結果を示す。
【０２５５】
表２に示されるようにＣＨ−２９６を固定化したビーズを使用した場合には２６４個のＧ４１８耐性コロニーが出現したのに対し、対照として用いたＢＳＡ固定化ビーズではまったく耐性コロニーは得られなかった。このことはＣＨ−２９６をビーズ上に固定化した場合でもプレートの場合同様にレトロウイルスの感染効率を上げる効果を持つことを示している。
【０２５６】
【表２】

【０２５７】
（２）機能性物質を固定化したビーズを用いたマウス骨髄細胞への遺伝子導入機能性物質を固定化したビーズを用いてマウス骨髄細胞へのレトロウイルス感染効率を上げることが可能かどうかを以下に示す操作によって調べた。
【０２５８】
マウス骨髄細胞は実施例４−（４）に記載の方法に従って調製し、予備刺激を行った。
【０２５９】
実施例２−（９）に記載の方法に従ってＢＳＡを固定化したプレート、これに実施例７−（１）に記載の方法で調製したＣＨ−２９６固定化ビーズのうち１／１０量を添加したもののそれぞれに１×１０６個の予備刺激した骨髄細胞と１×１０４ｃｆｕのＰＭ５ｎｅｏウイルスとを含む上記の予備刺激に用いられた培地２ｍｌを添加して３７℃でインキュベートした。２時間後に同量のウイルスを含む同様の培地（２ｍｌ）を新たにプレートに追加し、さらに２２時間インキュベートを続けた。インキュベート終了後、非接着細胞はデカンテーションによって、またプレートに接着した細胞は細胞解離緩衝液（ＣＤＢ、酵素を含まない、ギブコ社製）を使用してそれぞれ採集し、これらを合わせて同緩衝液で２回洗浄した後、細胞数を計数した。採集した細胞は実施例４−（４）に記載の方法に従いＨＰＰ−ＣＦＣアッセイに供した。
【０２６０】
結果を図２２に示す。図中、横軸は使用された機能性物質とその使用形態、縦軸は遺伝子導入効率を示す。この結果より、ＣＨ−２９６固定化ビーズを用いた場合でもマウス骨髄細胞へのレトロウイルス感染効率を上げることが可能であることがわかった。
【０２６１】
実施例８
（１）Ｈ−２７１、およびＣＨ−２７１を用いた遺伝子導入
Ｈ−２７１のレトロウイルス感染に対する影響を、Ｈ−２７１、およびレトロウイルス感染の促進を示すことが知られているＣＨ−２７１を固定化したプレート中でウイルス上清液をプレインキュベーションした後、プレートを徹底的に洗浄し、そこに残存するウイルスの量をＮＩＨ／３Ｔ３細胞コロニー形成アッセイで測定し、両者の結果を比較することにより評価した。すなわち、実施例２−（９）記載の方法により種々の濃度のＨ−２７１［６７ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（２μｇ／ｃｍ^２）〜３３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（１０μｇ／ｃｍ^２）］、およびＣＨ−２７１［６７ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（４μｇ／ｃｍ^２）〜３３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（２０μｇ／ｃｍ^２）］を用いて固定化操作を行ったプレートのそれぞれに１０００ｃｆｕのＰＭ５ｎｅｏウイルスを含む２ｍｌのウイルス上清液を加えて３７℃、３０分間プレインキュベーションした後、ＰＢＳを用いてプレートを徹底的に洗浄した。このプレートに２０００個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を含む２ｍｌのＤＭＥＭ培地を加えて３７℃、２４時間インキュベーションし、その後０．７５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８を含む選択培地中で１０日間増殖させ、それに続いてコロニーを染色し、計数した。その結果を図２３に示す。図２３は機能性物質と遺伝子導入効率の関係を示す図であり、横軸はポリペプチドの使用量、縦軸はＧ４１８耐性コロニー数を示す。
【０２６２】
図２３に示されるように、ＣＨ−２７１を用いた場合には固定化操作に用いたポリペプチド濃度にかかわらずほぼ同程度のＧ４１８耐性コロニーが出現した。これに対し、Ｈ−２７１では固定化の際のポリペプチド濃度を上げることにより濃度依存的に出現コロニー数が増加しており、３３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２で固定化を行ったものではＣＨ−２７１と同程度のＧ４１８耐性コロニーが得られた。このことは十分量のＨ−２７１を用いてプレートの固定化を行うことにより、ＣＨ−２７１と実質上同等のウイルス感染効率が得られることを示している。
【０２６３】
（２）Ｃ−ＦＧＦ・Ａを用いた遺伝子導入
Ｃ−ＦＧＦ・Ａポリペプチドのレトロウイルス感染に対する影響をＮＩＨ／３Ｔ３細胞コロニー形成アッセイによって調べた。すなわち、実施例２−（９）に記載の方法により１２７ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（６μｇ／ｃｍ^２）のＣ−ＦＧＦ・Ａで固定化を行ったプレート、１２７ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（７．６μｇ／ｃｍ^２）のＣＨ−２７１で固定化を行ったプレート、１２７ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（８μｇ／ｃｍ^２）のＣＨ−２９６で固定化を行ったプレート、およびＢＳＡを固定化した対照プレートを使用した他は実施例８−（１）と全く同じ方法で評価した。その結果を図２４に示す。図２４は機能性物質と遺伝子導入効率の関係を示す図であり、横軸に使用した機能性物質およびＢＳＡを、縦軸にＧ４１８耐性コロニー数を示す。
【０２６４】
図２４に示されるように、対照として使用したＢＳＡを固定化したプレートではコロニーが出現しなかった。一方、Ｃ−ＦＧＦ・Ａを固定化したプレートを用いた場合にはＧ４１８耐性コロニーの出現が確認され、その数はＣＨ−２７１、およびＣＨ−２９６を用いたものと同程度であった。このことはＦＧＦ分子上にＣＨ−２７１、およびＣＨ−２９６と実質的に同等の機能を有するレトロウイルス結合部位が存在していることを示している。
【０２６５】
（３）Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１を用いた遺伝子導入
Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１ポリペプチドのレトロウイルス感染に対する影響を以下に示す操作によって調べた。すなわち、それぞれ１３３ｐｍｏｌ／ｃｍ^２のＣ−ＦＧＦ−ＣＳ１（６．７μｇ／ｃｍ^２）、Ｃ−ＦＧＦ・Ａ（６．３μｇ／ｃｍ^２）、ＣＨ−２７１（８μｇ／ｃｍ^２）、ＣＨ−２９６（８．４μｇ／ｃｍ^２）を用いて実施例２−（９）に記載の方法でプレートの固定化を行い、これを用いて実施例８−（１）同様のＮＩＨ／３Ｔ３細胞コロニー形成アッセイを行った。その結果を図２５に示す。図２５は機能性物質と遺伝子導入効率の関係を示す図であり、横軸に使用した機能性物質を、縦軸にＧ４１８耐性コロニー数を示す。
【０２６６】
図２５に示されるように、これら４種のポリペプチドを固定化したプレートではほぼ同数のＧ４１８耐性コロニーが出現しており、Ｃ−ＦＧＦ−ＣＳ１分子も他のポリペプチドと実質的に同等のレトロウイルス結合活性を有していることを示している。
【０２６７】
（４）Ｃ２７７−ＣｏｌＶを用いた遺伝子導入
Ｃ２７７−ＣｏｌＶポリペプチドのレトロウイルス感染に対する影響を、１２４ｐｍｏｌ／ｃｍ^２（６．４μｇ／ｃｍ^２）のＣ２７７−ＣｏｌＶで固定化を行ったプレート、およびＢＳＡを固定化した対照プレートを用いて実施例８−（１）と同様の方法で評価した。その結果を図２６に示す。図２６は機能性物質と遺伝子導入効率の関係を示す図であり、横軸に使用した機能性物質およびＢＳＡを、縦軸にＧ４１８耐性コロニー数を示す。
【０２６８】
図２６に示されるようにＢＳＡを用いた対照プレートではコロニーが見られなかったのに対し、Ｃ２７７−ＣｏｌＶを固定化したプレートではＧ４１８耐性コロニーの出現が確認された。このことはＣｏｌＶ分子上にレトロウイルス結合部位が存在しているために洗浄後のプレート上にレトロウイルスが残存していることを示している。
【０２６９】
【発明の効果】
以上記載したごとく、本発明により、レトロウイルスを用いて標的細胞に効率よく遺伝子導入する方法が提供される。目的とする標的細胞に適した細胞結合性の物質を選択して本発明の方法を実施することにより、特殊なレトロウイルスベクターを必要とせず、簡便かつ高効率で遺伝子導入された標的細胞を取得することができる。遺伝子導入された細胞の脊椎動物への移植により、形質転換動物が簡便に作製され、本発明の方法は医療的分野、細胞工学的分野、遺伝子工学的分野、発生工学的分野等において有用である。また本発明の機能性物質、およびその混合物を含有する培地、標的細胞へのレトロウイルス介在遺伝子導入を行うためのキットも提供され、これらの培地、キットを用いることにより、レトロウイルスの配置、標的細胞への外来遺伝子の導入などを簡便に効率よく行うことができる。
【０２７０】
【配列表フリーテキスト】

【０２７１】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質、および線維芽細胞増殖因子とフィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドの混合物による標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
【図２】線維芽細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子とフィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドの混合物、およびフィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドによる標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
【図３】コラーゲンフラグメント、フィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドとコラーゲンフラグメントの混合物、コラーゲンフラグメントを含有する機能性物質、およびフィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドによる標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
【図４】フィブロネクチンフラグメント、およびフィブロネクチンフラグメントとフィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドの混合物による標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
【図５】フィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチド、ポリリジン、ポリリジンとフィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドの混合物、フィブロネクチンフラグメント、およびフィブロネクチンフラグメントとフィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドの混合物による標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
【図６】エリスロポエチン誘導体、ポリリジン、およびエリスロポエチン誘導体とポリリジンの混合物による標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
【図７】エリスロポエチン誘導体、フィブロネクチンフラグメント重合体、およびエリスロポエチン誘導体とフィブロネクチンフラグメント重合体の混合物による標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
【図８】フィブロネクチンフラグメント固定化ビーズ、フィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチド固定化ビーズ、およびフィブロネクチンフラグメントとフィブロネクチンの細胞接着部位ポリペプチドの混合物を固定化したビーズによる標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
【図９】線維芽細胞増殖因子、および線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質による標的細胞への遺伝子導入を示すグラフである。
【図１０】線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質の使用量と、標的細胞への遺伝子導入の関係を示すグラフである。
【図１１】線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質による標的細胞への遺伝子導入を示すグラフである。
【図１２】線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質による標的細胞への遺伝子導入効率を示すもう一つのグラフである。
【図１３】コラーゲンフラグメントを含有する機能性物質の使用量と、標的細胞への遺伝子導入の関係を示すグラフである。
【図１４】ポリリジンによる標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
【図１５】フィブロネクチンフラグメントおよびフィブロネクチンフラグメント重合体による標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
【図１６】フィブロネクチンフラグメントおよびフィブロネクチンフラグメント重合体による標的細胞への遺伝子導入効率を示すもうひとつのグラフである。
【図１７】フィブロネクチンフラグメントおよびフィブロネクチンフラグメント重合体による標的細胞への遺伝子導入効率を示すさらにもうひとつのグラフである。
【図１８】線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質、コラーゲンフラグメント、およびコラーゲンフラグメントを含有する機能性物質による標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
【図１９】フィブロネクチンフラグメントによる標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
【図２０】フィブロネクチンフラグメントおよび線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質による標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
【図２１】線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質およびフィブロネクチンフラグメントによる標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
【図２２】フィブロネクチンフラグメント固定化ビーズによる標的細胞への遺伝子導入効率を示すグラフである。
【図２３】フィブロネクチンフラグメント使用量と、標的細胞への遺伝子導入の関係を示すグラフである。
【図２４】線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質およびフィブロネクチンフラグメントによる標的細胞への遺伝子導入を示すグラフである。
【図２５】線維芽細胞増殖因子を含有する機能性物質およびフィブロネクチンフラグメントによる標的細胞への遺伝子導入を示すもう１つのグラフである。
【図２６】コラーゲンフラグメントを含有する機能性物質による標的細胞への遺伝子導入を示すグラフである。

Claims

レトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる方法において、ＶＬＡ−５への結合領域ポリペプチドであるフィブロネクチンの細胞結合領域ポリペプチドと、配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する線維芽細胞増殖因子、配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するＶ型コラーゲン由来のインスリン結合部位を含有するフラグメント、または該配列に１または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加がなされたアミノ酸配列を有し、かつレトロウイルス結合活性を有するポリペプチドとを同一分子上に有する有効量の機能性物質の存在下で、標的細胞をレトロウイルスで感染させることを特徴とするレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入効率を向上させる方法。
機能性物質がさらにＶＬＡ−４への結合領域ポリペプチドであるフィブロネクチンの細胞結合領域ポリペプチドを有している請求項１記載の方法。
機能性物質が配列表の配列番号４または５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１記載の方法。
機能性物質が配列表の配列番号７または８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１記載の方法。
機能性物質が固定化されている請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
機能性物質が固定化されていない請求項１〜４いずれか１項記載の方法。
ＶＬＡ−５への結合領域ポリペプチドであるフィブロネクチンの細胞結合領域ポリペプチドと、配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する線維芽細胞増殖因子、配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するＶ型コラーゲン由来のインスリン結合部位を含有するフラグメント、または該配列に１または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加がなされたアミノ酸配列を有し、かつレトロウイルス結合活性を有するポリペプチドとを同一分子上に有する有効量の機能性物質を含有するレトロウイルスによる標的細胞への遺伝子導入に使用する標的細胞の培養培地。
機能性物質がさらにＶＬＡ−４への結合領域ポリペプチドであるフィブロネクチンの細胞結合領域ポリペプチドを有している請求項７記載の培養培地。
機能性物質が、配列表の配列番号４または５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項７記載の培養培地。
機能性物質が、配列表の配列番号７または８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項７記載の培養培地。
機能性物質が固定化されている請求項７〜１０いずれか１項記載の培養培地。
ＶＬＡ−５への結合領域ポリペプチドであるフィブロネクチンの細胞結合領域ポリペプチドと、配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する線維芽細胞増殖因子、配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するＶ型コラーゲン由来のインスリン結合部位を含有するフラグメント、または該配列に１または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加がなされたアミノ酸配列を有し、かつレトロウイルス結合活性を有するポリペプチドとを同一分子上に有する有効量の機能性物質と接触したレトロウイルスを含有する培地をインキュベートすることを特徴とするレトロウイルスの配置方法。
機能性物質がさらにＶＬＡ−４への結合領域ポリペプチドであるフィブロネクチンの細胞結合領域ポリペプチドを有している請求項１２記載の配置方法。
機能性物質が、配列表の配列番号４または５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１２記載の配置方法。
機能性物質が、配列表の配列番号７または８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１２記載の配置方法。
機能性物質が固定化されている請求項１２〜１５いずれか１項記載の配置方法。
標的細胞内へのレトロウイルス介在遺伝子導入の実施に使用するためのキットであって、
（ａ）ＶＬＡ−５への結合領域ポリペプチドであるフィブロネクチンの細胞結合領域ポリペプチドと、配列表の配列番号３で表されるアミノ酸配列を有する線維芽細胞増殖因子、配列表の配列番号６で表されるアミノ酸配列を有するＶ型コラーゲン由来のインスリン結合部位を含有するフラグメント、または該配列に１または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加がなされたアミノ酸配列を有し、かつレトロウイルス結合活性を有するポリペプチドとを同一分子上に有する有効量の機能性物質、
（ｂ）レトロウイルスと標的細胞をインキュベートするための人工基質、および
（ｃ）上記標的細胞を予備刺激するための標的細胞増殖因子、
を含んでなることを特徴とするキット。
機能性物質がさらにＶＬＡ−４への結合領域ポリペプチドであるフィブロネクチンの細胞結合領域ポリペプチドを有している請求項１７記載のキット。
機能性物質が、配列表の配列番号４または５で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１７記載のキット。
機能性物質が配列表の配列番号７または８で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドである請求項１７記載のキット。
機能性物質が固定化されている請求項１７〜２０いずれか１項記載のキット。
機能性物質がビーズに固定化されている請求項５記載の方法。
機能性物質がビーズに固定化されている請求項１１記載の培養培地。
機能性物質がビーズに固定化されている請求項１６記載の配置方法。
機能性物質がビーズに固定化されている請求項２１記載のキット。
標的細胞が、幹細胞（stem cells）、造血細胞、非接着性低密度単核細胞、接着性細胞、骨髄細胞、造血幹細胞、末梢血幹細胞、臍帯血液細胞、胎児性造血幹細胞、胚形成幹細胞、胚細胞、プライモディアルジャームセル（primordial germ cell）、卵母細胞、卵原細胞、卵子、精母細胞、精子、ＣＤ３４＋細胞、Ｃ−ｋｉｔ＋細胞、多能性造血前駆細胞、単能性造血前駆細胞、赤血球系前駆細胞、リンパ球母細胞、成熟血球、リンパ球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、線維芽細胞、神経芽細胞、神経細胞、内皮細胞、血管内皮細胞、肝細胞、筋芽細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、ガン細胞、骨髄腫細胞及び白血病細胞から選択される細胞である請求項１〜６および２２いずれか１項記載の方法。
レトロウイルスが、外来遺伝子を含有するレトロウイルスである請求項１〜６、１２〜１６、２２、２４および２６いずれか１項記載の方法。
レトロウイルスが、組換体レトロウイルスベクターである請求項２７記載の方法。
レトロウイルスが、複製能を欠損した組換え体レトロウイルスベクターである請求項２７記載の方法。
配列表の配列番号５で表されるポリペプチド、または該配列に１または数個のアミノ酸の欠失、置換、挿入および／または付加がなされたアミノ酸配列を有し、かつレトロウイルス結合活性を有するポリペプチド。
請求項３０記載のポリペプチドをコードする遺伝子。
配列表の配列番号２６で表される請求項３１記載の遺伝子。