CN101031651B - 用于产生反转录病毒载体的细胞 - Google Patents

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Abstract

在携带反转录病毒来源的gag-pol基因和env基因的细胞中增强了N-乙酰葡糖胺转移酶III活性。通过用上面的细胞构建反转录病毒载体，可以得到具有修饰的糖链结构的反转录病毒载体。通过该方法构建的反转录病毒载体尤其在功能物质存在下显示出高感染效率。

Description

用于产生反转录病毒载体的细胞
技术领域
本发明涉及医学、药剂学、农业-林业-渔业和食物科学领域中用于向用于转化的细胞中转移基因的反转录病毒载体、用于产生所述载体的细胞，和使用所述载体向细胞中转移基因的方法。
背景技术
用于将基因转移到真核生物中的已知方法包括使用病毒载体的方法、通过内吞作用、电穿孔或者基因枪转移裸DNA的技术等等。病毒载体用于基因治疗领域中以用于广泛的应用，包括基础和临床应用。例如，腺病毒载体适于在靶细胞中大量瞬时表达目的基因。反转录病毒载体由于稳定整合到宿主染色体中的功能而用于长期稳定表达。预期该载体可以用于遗传疾病的基因治疗领域，或者转基因动物生产领域中。然而，因为反转录病毒载体通过病毒感染导致基因转移，所以病毒的向性引起了问题。如果细胞不在细胞表面表达受体，那么就不发生基因转移。为了克服该问题，已经试图通过经由反转录病毒载体包膜的修饰进行的假型化(pseudotyping)改变宿主范围，或者增加效价。主要通过将常规反转录病毒载体(例如来自鼠白血病病毒的载体)中的包膜蛋白用来自另一病毒物种的包膜蛋白替代来实现反转录病毒载体的假型化。例如，已经开发了其中用水泡性口膜炎病毒包膜糖蛋白VSV-G感染宽范围宿主的反转录病毒载体(专利文件1，非专利文件1)，和其中用长臂猿白血病病毒(GaLV)包膜增加转移到人造血干细胞中的效率的载体(专利文件2，非专利文件2)。
已经检查了一种针对仅改变包膜(一种糖蛋白)的糖链修饰而不改变包膜蛋白的氨基酸序列的技术，在该技术中，减少反转录病毒表面上的α(1，3)半乳糖基表位以防止体液组分对反转录病毒载体的灭活(专利文件3)。其中提供了破坏反转录病毒生产细胞中的半乳糖基转移酶基因、利用糖链合成抑制剂、利用糖链降解酶等等。然而，基因破坏需要复杂的程序，并且必须确定使用糖链合成抑制剂或者糖链降解酶的合适条件。
N-乙酰葡糖胺转移酶III(GnT-III)是将等分的(bisecting)N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)残基转移到糖蛋白上的N-连接的糖链的酶。已经从大鼠和人克隆了编码GnT-III的基因(非专利文件3，非专利文件4)。
已经报导当将GnT-III基因转移到受乙型肝炎病毒感染的细胞中时，因为病毒基因表达的抑制而导致病毒的产生受到抑制(非专利文件5)。关于反转录病毒，GnT-III对病毒产生或者所产生的病毒的感染效率的影响还未知。
专利文件1：WO 94/29440
专利文件2：WO 94/23048
专利文件3：WO 96/03520
非专利文件1：J.C.Burns等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：8033-8037(1993)
非专利文件2：A.D.Miller等人，J.Virol.65：2220-2224(1991)
非专利文件3：A.Nishikawa等人，J.Biol.Chem.，267：18199-18204(1992)
非专利文件4：Y.Ihara等人，J.Biochem.，113：692-698(1993)
非专利文件5：E.Miyoshi等人，J.Biol.Chem.，270：28311-28315(1995)
发明内容
本发明解决的问题
预期通过修饰反转录病毒的包膜进行的假型化在改变宿主范围、提高感染效率或者提高病毒颗粒的稳定性中是有效的。然而，不能容易地得到增加感染效率的包膜。那么，本发明人不修饰反转录病毒的包膜，而是修饰生产细胞的细胞膜上的糖链的结构，旨在提高病毒的感染效率。
解决问题的手段
作为深入研究的结果，本发明已经有了下面的发现。如果使用一种细胞制备反转录病毒载体，那么在具有反转录病毒结合活性的功能物质(例如，纤连蛋白片段)的存在下，基因转移的效率显著提高，在所述细胞中，N-乙酰葡糖胺转移酶III活性增强并且从该细胞产生的反转录病毒用于基因转移。从而完成了本发明。
本发明的第一方面涉及具有来自反转录病毒的gag-pol基因和env基因的细胞，其中N-乙酰葡糖胺转移酶III活性被增强。
第一方面的细胞为例如其中来自反转录病毒的gag-pol基因和env基因被整合到染色体中的细胞，或者用含有来自反转录病毒的gag-pol基因和env基因的质粒转化的细胞。
根据第一方面，可以将N-乙酰葡糖胺转移酶III基因人工转移到细胞中。例如，可以使用其中N-乙酰葡糖胺转移酶III基因整合到染色体中的细胞，或者用含有所述基因的质粒转化的细胞。N-乙酰葡糖胺转移酶III基因可以置于异源启动子控制下。
例如，第一方面的细胞可以来自选自293细胞和293T细胞的细胞。
本发明的第二方面涉及反转录病毒生产细胞，其通过用重组反转录病毒载体转化第一方面的细胞得到。
本发明的第三方面涉及产生反转录病毒载体的方法，其包括培养第二方面的反转录病毒生产细胞；和收集培养物上清液。
本发明的第四方面涉及反转录病毒载体，其根据第三方面的用于产生反转录病毒载体的方法产生。
本发明的第五方面涉及将基因转移到靶细胞中的方法，其包括在具有反转录病毒结合活性的功能物质存在下，用第四方面的反转录病毒载体感染靶细胞。
根据第五方面，具有反转录病毒结合活性的功能物质的例子是纤连蛋白或其片段。
发明效果
本发明提供了重组反转录病毒载体，其在具有反转录病毒结合活性的功能物质存在下，导致高基因转移效率。通过使用该载体，目的基因可以高效率地稳定转移到靶细胞中。因为反转录病毒不仅可以用于治疗遗传疾病，还可以用于治疗其他各种疾病，所以本发明可广泛用于医学治疗领域中。
附图简述
图1代表用来自各种克隆的病毒观察到的基因转移效率。
图2代表用来自各种克隆的病毒观察到的基因转移效率。
图3代表用来自各种克隆的病毒观察到的基因转移效率。
图4代表用来自各种克隆的病毒观察到的基因转移效率。
图5代表用来自各种克隆的病毒观察到的基因转移效率。
图6代表用来自各种克隆的病毒观察到的基因转移效率。
图7代表用来自各种克隆的病毒观察到的基因转移效率。
图8代表用来自各种克隆的病毒观察到的基因转移效率。
图9代表用来自各种克隆的病毒观察到的基因转移效率。
图10代表根据各种感染方法使用来自293T或者细胞系293T/hG3-1的双嗜性反转录病毒的基因转移效率。
图11代表根据各种感染方法使用来自293T或者细胞系293T/hG3-1的双嗜性反转录病毒的基因转移效率。
图12代表根据各种感染方法使用来自293T或者细胞系293T/hG3-1的双嗜性反转录病毒的基因转移效率。
图13代表根据各种感染方法使用来自293T或者细胞系293T/hG3-1的亲嗜性反转录病毒的基因转移效率。
图14代表根据各种感染方法使用来自293T或者细胞系293T/hG3-1的亲嗜性反转录病毒的基因转移效率。
本发明的最佳实施方式
通常根据本发明使用重组反转录病毒载体。具体地，优选复制缺陷型重组反转录病毒载体。消除这种载体的可复制性从而使得它不能在受感染的细胞中自主复制，并且因此该载体是不致病的。载体可以侵入宿主细胞如脊椎动物细胞(尤其哺乳动物细胞)并且将插入载体的外源基因稳定整合到染色体DNA中。
对于外源基因没有具体限制。可以插入希望在目的细胞中表达的任何基因。其实例包括编码多肽(酶、生长因子、细胞因子、受体、结构蛋白等等)、反义RNA、核酶、诱饵(decoy)和导致RNA干扰的RNA的基因。根据本发明，可能使用插入重组反转录病毒载体中的外源基因，从而使得其表达处于合适的启动子(例如，反转录病毒载体中的LTR启动子或者外源启动子)的控制下。在载体中可以存在与启动子和转录起始位点协作的另一种调节元件(例如，增强子序列)以便完成外源基因的转录。优选地，所转移的基因可以含有置于下游的终止子序列。此外，可以包括合适的标记基因，其使得能够选择具有所转移的基因的细胞(例如，药物抗性基因、编码荧光蛋白的基因、编码起报道分子功能的酶(如β-半乳糖苷酶或者萤光素酶)的基因)。
对于根据本发明使用的重组反转录病毒载体(此处也称作重组反转录病毒)也没有具体限制。可以使用已知的反转录病毒载体，如反转录病毒载体(例如，MFG载体、α-SGC载体(WO 92/07943)、pBabe(Nucleic Acids Research，18：3587-3596(1990))、pLXIN(Clontech)或pDON-AI(Takara Bio))、慢病毒载体(人免疫缺陷病毒(HIV)-衍生的载体、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)-衍生的载体等等)或者其修饰形式。
本发明的反转录病毒载体是通过N-乙酰葡糖胺转移酶III(下文中称作GnT-III)的作用进行糖链修饰的反转录病毒载体。反转录病毒颗粒的表面上糖链的修饰在反转录病毒生产细胞中发生。用反转录病毒载体或者对应于该载体的反转录病毒载体质粒转化细胞产生反转录病毒生产细胞，所述细胞具有来自反转录病毒的gag-pol基因和env基因并且其中N-乙酰葡糖胺转移酶III基因活性被增强。
用于产生反转录病毒载体的一般方法包括通过将携带外源基因并且具有包装信号的重组反转录病毒载体质粒转移到反转录病毒包装细胞中的生产方法，所述反转录病毒包装细胞中已经转移了编码反转录病毒结构蛋白的gag-pol基因和env基因；和用gag-pol基因和env基因的表达载体质粒和携带外源基因并且具有包装信号的重组反转录病毒载体质粒同时转染入没有反转录病毒结构蛋白的正常细胞中的生产方法。两种方法都可以用于本发明。
根据前一种方法，如果选择有效方法转染重组反转录病毒载体质粒，那么可以瞬时产生病毒载体，或者可能确立长期稳定的表达细胞系以获得反转录病毒生产细胞系。已知的包装细胞系如PG13(ATCCCRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86或GP+envAM-12(US 5,278,056)或Psi-Crip(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85：6460-6464(1988))可以用于该方法。
关于后一种方法，在大多数情况中预期瞬时病毒产生，并且得到高效价病毒需要更高的转染效率。例如，在多数情况中将转染效率高的293细胞或者293T细胞用作宿主。
为了防止出现复制型反转录病毒颗粒，优选在根据本发明使用的细胞中，gag-pol基因和env基因的位置不接近。例如，本发明优选使用gag-pol基因和env基因整合在染色体上的不同位置的细胞，或者其中转移了含有gag-pol基因的质粒和含有env基因的另一质粒的细胞。
env基因不局限于编码来自与将产生的反转录病毒载体相同的病毒的包膜蛋白的基因。本发明还包括假型包装细胞，其具有来自异种病毒的env基因。例如，来自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、水泡性口膜炎病毒(VSV)或者猫内源性病毒的env基因或者编码可以作为env发挥功能的蛋白质的基因都可以用作env基因。
本发明不限于反转录病毒载体生产细胞。本发明的细胞包括不含具有包装信号的DNA的细胞，所述DNA是重组反转录病毒载体(转移载体)的基因组，前提是它可以通过转移这种DNA而产生反转录病毒载体。
通过增强反转录病毒生产细胞的GnT-III活性，根据本发明产生了反转录病毒载体，其中病毒表面蛋白上的糖链被修饰。
本文使用的GnT-III活性的增强指与正常水平相比，细胞中GnT-III酶促活性增加。尽管不预期限制本发明，但是用作根据本发明的反转录病毒生产细胞的细胞中的GnT-III活性为该细胞的固有GnT-III活性的5倍或者更高，优选10倍或者更高。例如，通过测量GnT-III活性或者通过使用已知方法(例如，RT-PCR或者RNA印迹杂交)测量从编码GnT-III的基因转录的mRNA的量，可以证实GnT-III酶促活性的增加。
通过已知的方法可以完成GnT-III活性的增强，所述方法为诸如染色体上编码GnT-III的基因的表达诱导、染色体上GnT-III基因的修饰(增加拷贝数、插入启动子、增强子等等)、将GnT-III基因转移到细胞中或者通过细胞的诱变得到GnT-III基因高表达细胞系。
编码人GnT-III的基因的结构是已知的(J.Biochem.，113：692-698(1993))。可能基于该信息修饰染色体上的GnT-III基因。例如，确定将用作反转录病毒生产细胞的细胞中编码GnT-III的基因的位置；向该基因的上游区插入与天然位于该基因上游并且控制该基因的表达的启动子不同的异源启动子(例如，强启动子或者诱导型启动子)；并且然后可能增加该基因的表达水平。可能得到这样的细胞，其中根据如实施例中描述的用于将编码GnT-III的基因人工转移到细胞中的方法更容易地增强GnT-III活性。
通过将插入载体中的基因转移到宿主中，可以将编码GnT-III的基因转移到细胞。合适的载体可以选自已知的载体。例如，可以使用质粒载体、病毒载体等等。如果将使用质粒载体，那么例如使用常规转染方法(磷酸钙方法、阳离子脂质体方法，等等)可以将它转移到细胞中。此外，可以使用将转移的编码GnT-III的基因整合到细胞中的染色体DNA中的方法。根据本发明，反转录病毒生产细胞中GnT-III的表达可以是瞬时表达或者稳定表达。
膜定位信号存在于反转录病毒包膜蛋白的N末端。如下进行考虑：将糖链附着到细胞中的包膜蛋白；通过蛋白水解酶将蛋白质切割成TM蛋白质和SU蛋白质；形成多聚体并在细胞膜表面上表达所述多聚体。gag-pol融合蛋白和gag蛋白形成刚好位于细胞膜下的壳体，并且将基因组RNA整合入以完成装配，从而导致从细胞出芽。反转录病毒芽被宿主细胞的脂双层包装。预期从高表达糖基转移酶的细胞产生的反转录病毒的病毒颗粒的表面蛋白进行糖链修饰。从而，尽管不希望限制本发明，但是如下进行考虑。如果在病毒生产细胞中GnT-III活性增强，那么将具有如下化学式1的等分GlcNAc结构的糖链附着到来自细胞的膜蛋白或者病毒包膜蛋白。通过GnT-III的作用产生糖链。备选地，可以增加寡甘露糖(oligomannose)型或者杂合型糖链修饰的比率。
[化学式1]
Figure G2005800331319D00081
例如，可以从稳定表达GnT-III的细胞系的培养物上清液得到具有用GnT-III修饰的糖链的反转录病毒，通过将GnT-III表达载体质粒转移到反转录病毒生产细胞中得到所述细胞系。还可能如下所述得到GnT-III修饰的反转录病毒：将GnT-III表达载体质粒转移到293细胞、293T细胞等等以得到稳定表达GnT-III的细胞系；并用gag-pol和env基因的表达载体质粒和携带外源基因并且具有包装信号的重组反转录病毒载体质粒同时转染具有转移的GnT-III的293细胞、293T细胞等等。备选地，可能用GnT-III表达载体质粒和gag-pol和env基因的表达载体质粒和携带外源基因并且具有包装信号的重组反转录病毒载体质粒同时转染293细胞、293T细胞等等得到GnT-III修饰的反转录病毒。所得到的反转录病毒载体可以通过0.45-μm过滤器过滤并保存在低温冰箱中待用。
从其中根据本发明的方法增强了GnT-III活性的细胞制备的重组反转录病毒导致卓越的感染效率，尤其在具有反转录病毒结合活性的功能物质存在下，在基因转移中的优良的感染效率。
在例如WO 95/26200、WO 97/18318或者Nature Medicine，2：876-882(1996)中描述了基因转移方法，其中使用具有反转录病毒结合活性的功能物质。此类方法包括其中使用在相同分子中具有反转录病毒结合位点和靶细胞结合位点两者的功能物质的方法，和其中使用具有反转录病毒结合位点的功能物质和具有靶细胞结合位点的功能物质的混合物的方法。根据本发明的方法制备的反转录病毒可以用于这两种方法。
对功能物质没有具体的限制，只要它具有反转录病毒结合活性和/或靶细胞结合活性。具有反转录病毒结合活性的功能物质的实例包括来自纤连蛋白的肝素结合结构域(肝素-II结构域)、成纤维细胞生长因子、V型胶原片段、上述多肽的衍生物和变体、聚赖氨酸和DEAE-葡聚糖。能够结合目的靶细胞的任何物质都可以用作具有靶细胞结合活性的功能物质。尽管不希望限制本发明，但具有靶细胞结合活性的功能物质的实例包括具有细胞结合活性的多肽(细胞骨架蛋白，等等)、识别细胞或者细胞表面上的生物分子的抗体、生长因子、细胞因子和糖链。
在根据本发明的用于将基因转移到靶细胞的方法的一个实施方案中，在含有来自纤连蛋白的肝素结合结构域的功能物质存在下，用从GnT-III活性增强的细胞制备的重组反转录病毒感染靶细胞。优选的示例性功能物质是具有细胞粘附结构域和肝素结合结构域两者的纤连蛋白片段。结合VLA-5和/或VLA-4的细胞粘附结构域作为细胞粘附结构域尤其优选。使用诸如用蛋白酶消化的方法，可以从自活体纯化的纤连蛋白制备这种纤连蛋白片段，或者它可以用重组DNA技术制备。例如，Takara Bio以RetroNectin名称销售的重组纤连蛋白片段优选用于本发明，所述片段具有肝素结合结构域、VLA-5-结合结构域和VLA-4-结合结构域。
实施例
下面的实施例更详细地阐明本发明，但是不应理解为限制其范围。
实施例1
用于表达人GnT-III的质粒载体的构建
制备含有编码人GnT-III的DNA的DNA片段(GenBank E13194，SEQ ID NO：1)并将其插入用于基因表达的质粒载体pTriEx-3Hygro(Novagen)中的NcoI和Sse8387I位点中以构建重组质粒。将该重组质粒称作phG3-Hygro。
将该质粒用于转化大肠杆菌(Escherichia coli)JM109，并且将一个转化体菌落在5ml LB培养基中于37℃摇动下培养8小时。然后，将其在80ml LB培养基中进行扩大培养，并用QIA filter Plasmid MaxiKit(Qiagen)纯化质粒DNA。
实施例2
1.分离293T细胞转移克隆
使用含有10％胎牛血清(JRH)的Dulbecco氏改进的Eagle培养基(DMEM，Sigma)作为生长培养基在37℃、5％CO2下培养人293T细胞(Mol.Cell Biol.，7：379-387(1987))。将3×106个人293T细胞接种到每个6cm组织培养板(Iwaki Glass)中并过夜培养。第二天，证实人293T细胞达到半汇合，通过抽吸取出培养基，并向每板加入3ml新鲜生长培养基。
将10μg phG3-Hygro和62μl 2M CaCl2与最多500μl无菌蒸馏水在聚苯乙烯圆底管(Falcon)中混合。紧在加入500μl转染缓冲液(50mM HEPES、10mM KCl、12mM D-葡萄糖、280mM NaCl、1.5mMNa2HPO4(pH 7.10))后，利用从电移液器排出将混合物起泡20秒。将制备的溶液均匀地逐滴加入到含有293T细胞的上述平板中。制备具有以相似的方式转移的pTriEx-3Hygro(模拟试验)的293T细胞作为对照。将这些细胞在37℃、5％CO2下培养9小时。然后，通过抽吸取出培养物上清液，向每板加入4ml新鲜生长培养基，并在37℃、5％CO2下培养细胞。转染后2天通过用胰蛋白酶(Gibco)处理使每个人293T细胞从平板脱附，并悬浮在10ml生长培养基中。计数细胞数目，并将细胞以6×106、4×106或2×106个细胞/板的密度接种到每个10cm组织培养板(Iwaki Glass)中，并在37℃、5％CO2下培养。将含有浓度为0.3mg/ml的潮霉素(Invitrogen)的生长培养基用于从第二天培养。
用潮霉素选择培养基培养16天(同时每3或4天一次更换培养基)后，用克隆环(Iwaki Glass)克隆出现的潮霉素抗性菌落，并将其接种到48孔组织培养板(Iwaki Glass)的孔中。培养各自克隆的人293T细胞，同时根据生长速率使用24孔组织培养板(Iwaki Glass)、6-cm板和10-cm板传代。最后，得到如下：10个模拟转移的人293T细胞克隆，其中转移了pTriEx-3Hygro作为对照(293T/M)；和20个人293T细胞克隆，其中转移了phG3-Hygro(293T/hG3)。
2.表达的证实
使用TRIzol(Invitrogen)从上面“1”得到的每个293T/hG3克隆的1×107个细胞提取总RNA。如下用总RNA作为模板合成cDNA。通过混合1μl AMV反转录酶(Reverse Transcriptase)XL(5U/μl，Life Sciences)、2μl 10x RNA PCR缓冲液(Takara Bio)、0.5μl RNA酶抑制剂(40U/μl)、1μl随机9聚体(Random 9mers)(50pmol/μl)、2μl dNTP混合物(每种10mM)、4μl 25mM MgCl2、1μl模板(对应于1μg)和无RNA酶的蒸馏水到20μl总体积来制备反应混合物。反应混合物如下进行反应：30℃10分钟；42℃30分钟；99℃5分钟；和4℃5分钟。反应后，使用1μl反应混合物作为模板和一对人GnT-III-特异引物(hG3-F1(SEQ ID NO：2)和hG3-R4(SEQ ID NO：3))通过PCR反应进行人GnT-III基因的检测。如下进行反应：94℃5分钟；30个循环的94℃30秒，56℃30秒和72℃30秒；最后72℃7分钟。将phG3-Hygro用作阳性对照，并将以相似的方式从293T/M克隆制备的1μl RT-PCR产物用作阴性对照。PCR反应后，将8μl每种反应混合物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳以观察扩增的片段。结果，尽管甚至对阴性对照也观察到人GnT-III基因片段的扩增，但是与阴性对照相比，使用从293T/hG3克隆制备的模板得到的扩增产物的量更大。从而，表明在上面“1”中分离的293T/hG3克隆中表达了来自phG3-Hygro的人GnT-III。
3.GnT-III酶促活性的定量
收集上面“1”中得到的两种293T/hG3克隆(细胞系293T/hG3-1和293T/hG3-67)和两种293T/M克隆(细胞系293T/M2和293T/M3)以及293T细胞的每一种的106到107个细胞，并用PBS洗涤。向通过离心得到的沉淀中加入100μl CelLyticTM M细胞裂解试剂(Cell LysisReagent)(Sigma)，并在室温混合15分钟。以20400xg离心15分钟后，收集上清液作为GnT-III粗酶溶液并进行活性测量。用BCA ProteinAssay Reagent试剂盒(Pierce)对部分粗酶溶液进行蛋白质定量。
将3μl GnT-III粗酶溶液、5μl 2x缓冲液(250mM MES-NaOH(pH 6.25)、200mM MnCl2、400mM N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、1.0％Triton X-100)、1μl 0.2M UDP-GlcNAc和1μl Gn，Gn-bi-PA(385pmol/μl，Takara Bio，PA-糖链(Sugar Chain)O12，结构在下面的化学式2中显示)的混合物在37℃反应2小时。反应后，向其中加入10μl反应终止溶液(2％四硼酸钠、250mM EDTA)，通过在98℃加热5分钟灭活酶，并通过以20400xg离心3分钟得到上清液。用HPLC如下所述分析10μl上清液：柱：PALPAK Type R(CA8000：
Figure G2005800331319D00121
x 250mm，Takara Bio)；洗脱液：含有0.5％1-丁醇的100mM乙酸三乙胺缓冲液(pH 4.0)；柱温度：40℃；和流速：1.0ml/分钟。用荧光检测器以320nm的激发波长和400nm的发射波长进行检测。在这些条件下，糖链Gn，Gn-bi-PA在9.6分钟时洗脱，而糖链Gn(Gn)Gn-bi-PA在18.1分钟时洗脱。将GnT-III活性鉴定为基于所产生的Gn(Gn)Gn-bi-PA(其结构在下面的化学式3中显示)的量和以前确定的粗酶溶液的蛋白质量计算的GnT-III的比活性。结果，GnT-III活性如下：定义293T细胞的活性为1.0：细胞系293T/M2：2.4；细胞系293T/M3：1.0；细胞系293T/hG3-1：32.2；和细胞系293T/hG3-67：59.3。根据上面的内容，表明由于来自phG3-Hygro的人GnT-III基因，在293T/hG3克隆中GnT-III酶促活性被增强。
[化学式2]
Figure G2005800331319D00122
[化学式3]
Figure G2005800331319D00123
实施例3
从293T/hG3克隆制备病毒
1.制备病毒上清液
在上面实施例2中分离的293T/hG3克隆中，选择证实了GnT-III基因表达的7个克隆，并从它们制备双嗜性反转录病毒上清液。在对照实验中，用293T细胞和两个293T/M克隆进行相同的程序。向6孔组织培养板(Iwaki Glass)的每孔中接种每个细胞克隆的1.5×106个细胞，并在含有10％胎牛血清的2ml DMEM中在37℃、5％CO2下过夜培养。第二天，证实每种细胞克隆达到半汇合，通过抽吸从每孔取出培养基，并向每孔加入1.5ml含有10％胎牛血清的新鲜DMEM。向每孔还加入终浓度为25μM的氯喹(Wako Pure ChemicalIndustries)。在聚苯乙烯圆底管中组合下面的：用于表达反转录病毒结构蛋白gag-pol的27.5μg质粒载体pGP(Takara Bio)；用于表达双嗜性env的27.5μg质粒载体pE-ampho(Takara Bio)；用于反转录病毒生产的55μg质粒载体，其中质粒pQBI25(Quantum Biotechnologies)中的水母来源的红移绿色荧光蛋白(rsGFP)的基因插入到反转录病毒质粒pDON-AI(Takara Bio)中；341μl 2M CaCl2；和无菌蒸馏水至2750μl。将混合物分成两个1300-μl部分。紧在向每管加入1300μl转染缓冲液后，利用从电移液器排出将混合物起泡20秒。向每孔中逐滴均匀加入500μl混合物。将平板在37℃、5％CO2下温育9小时。然后，取出1.5ml培养物上清液，向每孔加入2ml含有10％胎牛血清的新鲜DMEM，并继续培养。基因转移后24小时，将每孔中的培养基用含有10％胎牛血清的2ml新鲜DMEM更换。再培养24小时后，收集培养物上清液，通过0.45-μm过滤器(Millipore)过滤，并作为病毒上清液原种在-80℃保存备用。
2.病毒上清液效价的测量
根据标准方法(J.Virol.，62：1120-1124(1988))用NIH/3T3细胞(ATCC CRL-1658)测量病毒上清液的效价。具体地，向6孔组织培养板的每孔加入在含有10％牛血清(Gibco)的2ml DMEM中的5×104个NIH/3T3细胞，并在37℃、5％CO2下培养过夜。通过抽吸取出培养基，向孔中加入病毒上清液的1ml连续稀释液，并向其中还加入终浓度为8μg/ml的海地美溴铵(溴化己二甲铵(polybrene)，Aldrich)。将细胞在37℃、5％CO2下培养4到6小时。向其中还加入含有10％牛血清的1ml DMEM，并继续培养72小时。用流式细胞仪FACS
Vantage(Becton-Dickinson)分析从板收集的细胞，并确定表达rsGFP的NIH/3T3细胞的比率。根据将每孔输入细胞数乘以rsGFP表达性细胞的比率所得的值和病毒上清液的稀释率来计算1ml上清液中感染性颗粒数目(I.V.P./ml)来确定病毒效价。几次制备病毒以用来测量病毒效价。来自293T/hG3克隆的病毒上清液的效价为1.9×105I.V.P./ml到2.8×106I.V.P./ml。来自用于对照实验中的293T细胞的病毒上清液的效价为9.4×105I.V.P./ml到1.6×106I.V.P./ml，且来自用于对照实验中的293T/M克隆的病毒上清液的效价为1.8×106I.V.P./ml到2.6×106I.V.P./ml。
实施例4
1.制备CH-296包被的平板
向24孔非组织培养物处理的平板(Falcon)的每孔加入浓度为32μg/ml的500μl纤连蛋白片段CH-296(RetroNectin，Takara Bio)。让平板在4℃静置过夜，在室温下用2％BSA/PBS封闭30分钟，并用PBS洗涤。将该平板用作CH-296-包被的平板并且在必要时制备。
2.基因转移到NIH/3T3细胞中
在实施例3中制备的病毒上清液中，从细胞系293T/hG3-1和293T/hG3-67制备的作为人GnT-III修饰的病毒的病毒被选择用于基因转移到NIH/3T3细胞中。将从293T细胞制备的病毒用作对照，并将从细胞系293T/M2制备的病毒选择用作模拟病毒。将这些病毒用于感染CH-296-包被的平板中的NIH/3T3细胞，并如下所述检查从具有转移的人GnT-III基因的细胞制备的反转录病毒的感染性的改变。
将在10cm平板中生长到半汇合的NIH/3T3细胞通过用胰蛋白酶处理从平板脱附，悬浮在含有10％牛血清的10ml DMEM中，并通过以190x g离心3分钟收集。计数活细胞数目，并将细胞密度调节为在含有10％牛血清的DMEM中为2×105个细胞/ml。将实施例3中所得各自病毒上清液通过用含有10％胎牛血清(JRH)的DMEM稀释调节到2×104I.V.P./ml。向CH-296-包被的平板的每孔中加入100μlNIH/3T3细胞悬浮液、200μl稀释的病毒上清液和200μl含有10％牛血清的DMEM。将细胞在37℃、5％CO2下培养3天。3天后，用流式细胞仪FACS Vantage分析NIH/3T3细胞，并确定表达rsGFP的NIH/3T3细胞的比率为基因转移效率。在使用CH-296-包被的平板的感染对照实验中，向24孔组织培养板的每孔加入在含有10％牛血清的500μl DMEM中的2×104个NIH/3T3细胞。在37℃、5％CO2下培养过夜后，通过抽吸取出培养基，并向每孔加入如上述制备的2×104I.V.P./ml的200μl病毒上清液和含有10％牛血清的300μlDMEM。以8μg/ml的终浓度进一步加入溴化己二甲铵。将细胞在37℃、5％CO2下培养3天。3天后，用流式细胞仪FACS Vantage分析NIH/3T3细胞以确定表达rsGFP的NIH/3T3细胞的比率。
上述实验的结果在图1中显示。在图中，用以制备病毒上清液的细胞沿着横轴示出。(Pb)代表溴化己二甲铵存在下的感染组，而(RN)代表使用CH-296-包被的平板的感染组。纵轴代表基因转移效率(％)。
关于其中使用溴化己二甲铵进行感染的对照实验，各自病毒的表达rsGFP的NIH/3T3细胞的比率彼此几乎相等。当使用CH-296-包被的平板时，用人GnT-III修饰的病毒感染的NIH/3T3细胞的表达rsGFP的细胞的比率与用未修饰的病毒感染的NIH/3T3细胞的比率相比增加了1.7到2.2倍(图1)。这表明当使用CH-296包被的平板时，用人GnT-III修饰膜表面的反转录病毒的感染性增加了。
3.基因转移到血细胞中
用含有10％胎牛血清的RPMI-1640(Sigma)作为生长培养基在37℃、5％CO2下培养人K562细胞(ATCC CCL-243)。用含有10％胎牛血清的RPMI-1640作为生长培养基在终浓度为2ng/ml的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，Schering-Plough)的存在下，在37℃、5％ CO2下培养人TF-1细胞(ATCC CRL-2003)。根据上面“2”中描述的方法用CH-296包被的平板以M.O.I.(感染复数)＝0.2感染实施例3中制备的病毒上清液。将各自细胞的生长培养基用于制备细胞和稀释病毒。感染后3天将细胞进行流式细胞仪FACS Vantage分析以测定表达rsGFP的细胞的比率。结果在图2和3中显示。图2显示了K562细胞的结果，且图3显示了TF-1细胞的结果。在图中，用以制备病毒上清液的克隆的名称在横轴上示出。纵轴代表基因转移效率(％)。
用人GnT-III-修饰的病毒感染的K562和TF-1细胞的表达rsGFP的细胞的比率与用未修饰的病毒感染的K562和TF-1细胞的比率相比，增加了1.5到1.7倍。
4.基因转移到各种细胞中
在37℃、5％CO2下进行培养，其中对于HT1080细胞(ATCCCCL-121)、293细胞(ATCC CRL-1573)、A375M细胞(Cancer Lett.，38：137-147(1987))、KB细胞(ATCC CCL-17)和MDA-MB-435S细胞(ATCC HTB-129)，使用含有10％胎牛血清的DMEM作为生长培养基，或者对于MKN1细胞(BRC RCB1003)，用含有10％胎牛血清的RPMI-1640作为生长培养基。在实施例3中制备的病毒上清液中，使用从293T/hG3-1制备的病毒作为人GnT-III-修饰的病毒，而使用从293T和293T/M2制备的病毒作为对照。如上面“2”中描述的在M.O.I.＝0.2的条件下，用溴化己二甲铵或者CH-296-包被的平板进行各种细胞的感染。感染后3天将各自细胞进行流式细胞仪FACSVantage分析以测定表达rsGFP的细胞的比率。结果在图4-9中显示。图4-9中分别显示了HT1080细胞、293细胞、A375M细胞、KB细胞、MDA-MB-435S细胞和MKN1细胞的结果。在图中，用以制备病毒上清液的克隆的名称沿着横轴示出。(Pb)代表溴化己二甲铵存在下的感染组，而(RN)代表使用CH-296-包被的平板的感染组。纵轴代表基因转移效率(％)。
用人GnT-III-修饰的病毒感染的细胞的表达rsGFP的细胞的比率与用未修饰的病毒感染的细胞的比率相比增加了。
实施例5
从293T/hG3克隆制备病毒和基因转移到靶细胞中
1.制备病毒上清液
在实施例2中分离的证实了表达的293T/hG3克隆中，选择细胞系293T/hG3-1，并制备双嗜性病毒上清液和亲嗜性病毒上清液。在对照实验中用293T细胞进行相同的程序。将293T或293T/hG3克隆的3×106个细胞接种到6cm组织培养板(Iwaki Glass)中，并在含有10％胎牛血清的4ml DMEM中于37℃、5％CO2下培养过夜。第二天，证实293T或293T/hG3克隆的细胞达到半汇合，通过抽吸取出平板中含有10％胎牛血清的DMEM，并向每板加入含有10％胎牛血清的3ml新鲜DMEM。向每板还加入终浓度为25μM的氯喹(Wako PureChemical Industries)。在两个聚苯乙烯圆底管中的每一个中组合下面的组分以用于制备双嗜性反转录病毒：5μg质粒载体pGP(TakaraBio)；用于表达双嗜性env的5μg质粒载体pE-ampho(Takara Bio)；用于反转录病毒生产的10μg质粒载体(携带rsGFP基因的反转录病毒载体质粒pDON-AI(Takara Bio))；62μl 2M CaCl2；和无菌蒸馏水至500μl。类似地，在两个聚苯乙烯圆底管的每一个中组合下面的组分以用于制备亲嗜性反转录病毒：5μg质粒载体pGP；用于表达亲嗜性env的5μg质粒载体pE-eco(Takara Bio)；用于反转录病毒生产的10μg质粒载体(携带rsGFP基因的反转录病毒载体质粒pDON-AI(Takara Bio))；62μl 2M CaCl2；和无菌蒸馏水至500μl。紧在向每管加入500μl转染缓冲液后，用从电移液器排出将混合物起泡20秒。向每板均匀逐滴加入1ml混合物。将平板在37℃、5％CO2下温育9小时。9小时后，取出3ml培养物上清液，向每板加入4ml含有10％胎牛血清的新鲜DMEM，并在37℃、5％CO2下培养细胞。转染后24小时，将每板中的培养基用含有10％胎牛血清的4ml新鲜DMEM更换。再在37℃、5％CO2下培养24小时后，通过0.45-μm过滤器(Millipore)过滤培养物上清液，并作为病毒上清液原种在-80℃保存备用。
2.病毒上清液效价的测量
如实施例3的“2”(病毒上清液效价的测量)中描述的用NIH/3T3细胞测量病毒上清液的效价。双嗜性反转录病毒的效价为1.9×106I.V.P./ml(来自293/hG3克隆的病毒上清液)和1.1×106I.V.P./ml(来自用于对照实验的293T细胞的病毒上清液)。亲嗜性反转录病毒的效价为3.7×106I.V.P./ml(来自293/hG3克隆的病毒上清液)和6.0×106I.V.P./ml(来自用于对照实验的293T细胞的病毒上清液)。
3.用人GnT-III修饰的双嗜性反转录病毒进行基因转移
在实施例5的“1”中制备的病毒上清液中，将使用细胞系293T/hG3-1制备的人GnT-III-修饰的双嗜性反转录病毒和作为对照的用293T细胞制备的双嗜性反转录病毒用于根据溴化己二甲铵(Pb)方法或者上清液(SN)方法，用CH-296-包被的平板在M.O.I.＝0.2的条件下，基因转移到NIH/3T3细胞中。此外，使用CH-296-包被的平板，根据下面的三种方法之一进行向HT1080细胞和K562细胞的基因转移：Pb方法、SN方法和结合的病毒(BV)方法。在每种方法中，在M.O.I.＝0.2的条件下感染HT1080细胞，并在M.O.I.＝2.0的条件下感染K562细胞。根据实施例4的“2”中描述的方法进行Pb方法和SN方法。如下所述进行BV方法。用含有10％胎牛血清的RPMI-1640将病毒上清液调节到8×103I.V.P./ml(用于感染HT1080细胞)或8×104I.V.P./ml(用于感染K562细胞)，并向CH-296-包被的平板的每孔中加入500-μl等分试样。然后使平板在5％CO2培养箱中于37℃下静置4小时以促进病毒对CH-296的吸附。4小时后，取出病毒上清液，用0.5ml/孔的1x PBS洗涤平板，并向每孔加入调节到4×104/ml的500μl细胞悬浮液以用于感染。在37℃、5％CO2的条件下培养细胞3天。3天后，对各自细胞进行流式细胞仪FACS Vantage(Becton-Dickinson)分析以确定表达GFP的细胞的比率。结果在图10-12中显示。NIH/3T3细胞、HT1080细胞和K562细胞的结果分别在图10-12中显示。在图中，在横轴示出感染方法。Pb代表溴化己二甲铵存在下的感染组，SN代表使用CH-296包被的平板，根据上清液方法的感染组，且BV代表使用CH-296包被的平板，根据结合的病毒方法的感染组。纵轴代表基因转移效率(％)。
在CH-296存在下用人GnT-III修饰的病毒感染的细胞中表达rsGFP的细胞的比率与用未修饰的病毒感染的细胞的比率相比增加了。
4.用人GnT-III修饰的亲嗜性反转录病毒进行基因转移
在实施例5的“1”中制备的病毒上清液中，将使用细胞系293T/hG3-1制备的人GnT-III修饰的亲嗜性反转录病毒和作为对照的用293T细胞制备的亲嗜性反转录病毒用于根据Pb方法或者SN方法，用CH-296-包被的平板在M.O.I.＝0.2的条件下基因转移到NIH/3T3细胞中。此外，用含有10％胎牛血清的RPMI-1640作为生长培养基在37℃、5％CO2下培养小鼠L1210细胞(ATCC CCL-219)，并使用CH-296-包被的平板，根据下面的三种方法之一进行在M.O.I.＝2.0条件下的感染：Pb方法、SN方法和BV方法。根据实施例4的“2”中描述的方法进行Pb方法和SN方法。根据如上面“3”中描述的方法进行BV方法。将细胞在37℃、5％CO2下培养3天。3天后，对各自细胞进行流式细胞仪FACS Vantage(Becton-Dickinson)分析以确定表达GFP的细胞的比率。结果在图13和14中显示。NIH/3T3细胞和L1210细胞的结果分别在图13和14中显示。在图中，在横轴示出感染方法。Pb代表溴化己二甲铵存在下的感染组，SN代表使用CH-296包被的平板，根据上清液方法的感染组，而BV代表使用CH-296包被的平板，根据结合的病毒方法的感染组。纵轴代表基因转移效率(％)。
在CH-296存在下用人GnT-III修饰的病毒感染的细胞中表达rsGFP的细胞的比率与用未修饰的病毒感染的细胞的比率相比增加了。
工业适用性
本发明提供了重组反转录病毒载体，其在具有反转录病毒结合活性的功能物质存在下导致高的基因转移效率。通过使用该载体，目的基因可以高效率地稳定转移到靶细胞中。因为反转录病毒载体可以不仅用于治疗遗传疾病，还可以治疗其他各种疾病，所以本发明可广泛用于医学治疗领域中。
序列表自由文本
SEQ ID NO：2；用于扩增编码GnT-III的基因的合成引物hG3-F1。
SEQ ID NO：3；用于扩增编码GnT-III的基因的合成引物hG3-R4。
序列表
<110>TAKARA BIO INC.
<120>用于产生反转录病毒载体的细胞
<130>666218
<150>JP 2004-283918
<151>2004-09-29
<160>3
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1593
<212>DNA
<213>智人(Homo sapiens)
<400>1
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tcaggctgca cggtggacat gctgcaggca gtgtatgggc tggacggcat ccgcctgcgc  1140
cgccgccagt actacaccat gcccaacttc agacagtatg agaaccgcac cggccacatc  1200
ctggtgcagt ggtcgctggg cagccccctg cacttcgccg gctggcactg ctcctggtgc  1260
ttcacgcccg agggcatcta cttcaagctc gtgtccgccc agaatggcga cttcccacgc  1320
tggggtgact acgaggacaa gcgggacctg aactacatcc gcggcctgat ccgcaccggg  1380
ggctggttcg acggcacgca gcaggagtac ccgcctgcag accccagcga gcacatgtat  1440
gcgcccaagt acctgctgaa gaactacgac cggttccact acctgctgga caacccctac  1500
caggagccca ggagcacggc ggcgggcggg tggcgccaca ggggtcccga gggaaggccg  1560
cccgcccggg gcaaactgga cgaggcggaa gtc                               1593
<210>2
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增编码GnT-III的基因的合成引物hG3-F1
<400>2
aaccatggcg atgagacgct acaagctc                                     28
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于扩增编码GnT-III的基因的合成引物hG3-R4
<400>3
ctctccagca tcttggtgcc                                        20

Claims (2)

1.将基因转移到靶细胞中的方法，该方法包括：
培养反转录病毒生产细胞，其具有来自反转录病毒的gag-pol基因和env基因，该细胞中N-乙酰葡糖胺转移酶III活性被增强，并且该细胞被重组反转录病毒载体或者重组反转录病毒载体质粒转化；
收集培养物上清液以得到反转录病毒载体；和
在含有来自纤连蛋白的肝素结合结构域的功能物质存在下，用反转录病毒载体感染靶细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中所述含有来自纤连蛋白的肝素结合结构域的功能物质是具有肝素结合结构域和结合VLA-5和/或VLA-4的结构域两者的纤连蛋白片段。
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