KR20070060119A - 레트로바이러스 벡터 생산용 세포 - Google Patents

레트로바이러스 벡터 생산용 세포 Download PDF

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Abstract

레트로바이러스 유래의 gag-pol 유전자, env 유전자를 가지는 세포에 있어서 N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 활성을 증강시킨다. 상기 세포를 사용해서 레트로바이러스 벡터를 제조하는 것에 의해, 당쇄 구조가 변형된 레트로바이러스 벡터를 얻을 수 있다. 상기 방법으로 제조된 레트로바이러스 벡터는 특히 기능성 물질의 존재 하에서 높은 감염효율을 나타낸다.

Description

레트로바이러스 벡터 생산용 세포{CELL FOR PRODUCING RETROVIRUS VECTOR}
본 발명은 의학, 약학, 농림수산학, 식품학 분야에 있어서, 세포에 유전자 도입해서 형질전환시키기 위해서 사용하는 레트로바이러스 벡터, 상기 벡터를 생산하기 위한 세포, 및 상기 벡터를 사용하는 세포 내로의 유전자 도입방법에 관한 것이다.
진핵생물 내로의 유전자 도입방법으로서는 바이러스 벡터를 사용하는 방법, 네이키드(naked) DNA를 엔도사이토시스나 전기 천공법, 유전자총에 의해 도입하는 기술 등이 알려져 있다. 바이러스 벡터는 유전자치료 분야에서 기초에서 임상까지 폭넓게 사용되고 있는 기술로서, 예를 들면 아데노바이러스 벡터는 표적세포에서 목적 유전자를 일과성으로 대량 발현시키는데 적합하며, 레트로바이러스 벡터는 숙주 염색체로의 안정된 통합 기능에 의해 장기 안정 발현이 가능하고, 유전병의 유전자 치료의 분야에서 기대되고 있는 벡터이며. 또한 트랜스제닉 동물 생산 분야에서도 기대되고 있는 기술이다. 그러나, 바이러스 벡터는 바이러스 감염을 매체로 하여 유전자 도입된다는 점에서 바이러스의 지향성이 문제가 되어, 리셉터를 세포표면에 발현되어 있지 않은 세포에는 유전자 도입되지 않는다. 이러한 문제를 극복하기 위해서, 레트로바이러스 벡터의 엔벨로프(envelope)를 변형시켜, 슈도타입화 함으로써 숙주영역을 변형시키는, 혹은 역가를 올리는 노력이 수행되고 있다. 레트로바이러스 벡터의 슈도타입화는 주로 종래 레트로바이러스 벡터, 예를 들면 마우스 백혈병 바이러스 유래의 벡터의 엔벨로프 단백질을 다른 바이러스 종의 엔벨로프 단백질로 바꾸어 놓는 것에 의해서 수행되고 있다. 예를 들면 수포성 구내염 바이러스(Vesicular stomatitis virus)의 외피 당 단백질 VSV-G를 이용한 광범위한 숙주영역에 감염 가능한 레트로바이러스 벡터[특허문헌 1, 비특허문헌 1]나, 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(Gibbon ape leukemia virus; GaLV)의 엔벨로프를 이용해서 인간 조혈간 세포 내로의 도입 효율을 향상시킨 벡터[특허문헌 2, 비특허문헌 2]가 개발되고 있다.
한편, 엔벨로프 단백질의 아미노산 서열을 바꾸지 않고, 당 단백질인 엔벨로프의 당쇄 변형만을 변형시키는 시도로서, 체액성분에 의한 레트로바이러스 벡터의 불활화를 방지하기 위해서 레트로바이러스 표면의 α(1,3)갈락토실 에피토프(galactosyl epitope)를 감소시키는 기술이 검토되고 있다[특허문헌 3]. 여기에서는, 레트로바이러스 생산세포의 갈락토실 트랜스페라아제 유전자의 파괴, 당쇄 합성 저해제의 이용, 당쇄 분해효소의 이용 등이 제안되고 있다. 그러나, 유전자 파괴는 번잡한 작업이고, 당쇄 합성 저해제, 당쇄 분해효소의 사용에 대해서는 적절한 사용조건의 설정이 필요하다.
N-아세틸글루코사미닐트랜스페라아제 III(N-acetylglucosaminyltransferase III; GnT-III)는 당 단백질의 N-결합형 당쇄에 바이섹트 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기를 전이하는 효소이다. GnT-III을 코딩하는 랫트 및 인간의 유전자 는 이미 클로닝되어 있다[비특허문헌 3, 비특허문헌 4].
B 형 간염 바이러스에 감염된 세포에 GnT-III 유전자를 도입하면 상기 바이러스의 유전자의 발현 억제에 의해, 바이러스의 생산이 저해된다는 것이 보고되어 있다[비특허문헌 5]. 레트로바이러스에 관해서, GnT-III의 바이러스 생산에 대한 영향, 생산된 바이러스의 감염효율에 관한 지견은 없다.
특허문헌 1: 국제공개 제94/29440호 팸플릿
특허문헌 2: 국제공개 제94/23048호 팸플릿
특허문헌 3: 국제공개 제96/03520호 팸플릿
비특허문헌 1: J. C. Burns, 외 4명, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제 90권, 제 8033∼8037쪽 (1993)
비특허문헌 2: A. D. Miller, 외 5명, J. Virol., 제 65권, 제 2220∼2224쪽 (1991)
비특허문헌 3: A. Nishikawa, 외 4명, J. BioI. Chern., 제 267권, 제 18199∼18204쪽 (1992)
비특허문헌 4: Y. lhara, 외 5명, J. Biochern., 제 113권, 제 692∼698쪽 (1993)
비특허문헌 5: E. Miyoshi, 외 5명, J. BioI. Chern., 제 270권, 제 28311∼28315쪽 (1995)
[발명의 개시]
[발명이 해결하고자 하는 과제]
레트로바이러스의 엔벨로프의 변형에 의한 슈도타이핑은 숙주영역의 변형이나, 감염효율의 향상, 바이러스 입자의 안정성 향상 등의 효과를 기대할 수 있지만, 감염효율을 향상시킬 수 있는 엔벨로프의 취득은 용이하지 않다. 그래서, 본 발명자들은 레트로바이러스의 엔벨로프를 변형시키는 것이 아니라, 생산세포의 세포막의 당쇄 구조를 변형시키는 것에 의한 바이러스의 감염효율의 향상을 목표로 하였다.
[과제를 해결하기 위한 수단]
본 발명자들은 예의 연구한 결과, N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 활성이 증강된 세포를 사용하여 레트로바이러스 벡터를 조제하였을 경우에, 이 세포로부터 생산되는 레트로바이러스 벡터는 피브로넥틴의 프래그먼트와 같은 레트로바이러스 결합활성을 갖는 기능성 물질의 공존 하에서의 유전자 도입 효율이 유의하게 향상시키는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 제 1 발명은 레트로바이러스 유래의 gag-pol 유전자, env 유전자를 가지며, 또한, N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 활성이 증강된 세포에 관한 것이다.
본 발명의 제 1 발명의 세포로서는 레트로바이러스 유래의 gag-pol 유전자, env 유전자가 염색체상에 통합되어 있는 세포, 또는 레트로바이러스 유래의 gag-pol 유전자, env 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질전환되어 있는 세포가 예시된다.
제 1 발명에 있어서, 상기 세포에는 N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 유전자가 인위적으로 도입될 수 있고, 예를 들면 N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 유전자가 염색체상에 통합되어 있는 세포, 상기 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질전환되어 있는 세포가 예시된다. 여기에서, N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 유전자는 이종의 프로모터의 제어하에 있을 수도 있다.
또한, 제 1 발명의 세포는 예를 들면 293 세포 및 293T 세포에서 선택되는 세포에 유래하는 것일 수도 있다.
본 발명의 제 2 발명은 제 1 발명의 세포가 재조합 레트로바이러스 벡터로 형질전환되어 이루어지는 레트로바이러스 생산세포에 관한 것이다.
본 발명의 제 3 발명은 제 2 발명의 레트로바이러스 생산세포를 배양하고, 그 배양액 상청액을 회수하는 것을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 4 발명은 제 3 발명의 레트로바이러스 벡터의 제조방법에 의해 제조된 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 제 5 발명은 제 4 발명의 레트로바이러스 벡터를 레트로바이러스 결합활성을 가지는 기능성 물질의 존재 하에 표적세포에 감염시키는 공정을 포함하는 표적세포 내로의 유전자 도입방법에 관한 것이다.
제 5 발명에 있어서, 레트로바이러스 결합활성을 가지는 기능성 물질로서는 피브로넥틴 혹은 그 프래그먼트가 예시된다.
[발명의 효과]
본 발명에 따르면, 레트로바이러스 결합활성을 가지는 기능성 물질의 존재 하에서 높은 유전자 도입 효율을 나타내는 재조합 레트로바이러스 벡터가 제공된다. 상기 벡터를 사용하는 것에 의해, 표적세포에 고효율로 원하는 유전자를 안정적으로 도입할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 유전병에 한하지 않는 여러 가지 질병의 치료에 사용할 수 있기 때문에, 본원 발명은 넓게 의료분야에 있어서 유용하다.
[발명을 실시하기 위한 최량의 형태]
본 발명에는 통상, 재조합 레트로바이러스 벡터가 사용되며, 특히, 복제능 결손 재조합 레트로바이러스 벡터가 바람직하다. 이 벡터는 감염된 세포 중에서 자기 복제할 수 없도록 복제능을 결손시키는 것으로서 비병원성이다. 이들 벡터는 척추동물 세포, 특히, 포유동물 세포와 같은 숙주세포에 침입하고, 그 염색체 DNA 속에, 벡터에 삽입된 외래 유전자를 안정되게 통합할 수 있다.
상기한 외래 유전자에는 특별하게 한정은 없고, 목적 세포에서 발현시키는 것이 요망되는 임의의 유전자를 삽입할 수 있고, 폴리펩티드(효소, 성장인자, 사이토카인, 리셉터, 구조 단백질 등), 안티센스 RNA, 리보자임, 디코이, RNA 간섭을 일으키는 RNA 등을 코딩하는 유전자가 예시된다. 본 발명에서는 상기한 외래 유전자는 적당한 프로모터, 예를 들면 레트로바이러스 벡터 중에 존재하는 LTR의 프로모터나 외래 프로모터에 의해 발현이 제어되도록, 재조합 레트로바이러스 벡터 내에 삽입하여 사용할 수 있다. 또한 외래 유전자의 전사를 달성하기 위해서는 프로모터 및 전사 개시부위와 공동하는 다른 조절요소, 예를 들면 인핸서 서열이 벡터 내에 존재할 수도 있다. 또, 바람직하게는 도입된 유전자는 그 하류에 터미네이터 서열을 함유할 수 있다. 또, 유전자 도입된 세포의 선택을 가능하게 하는 적당한 마커 유전자(예를 들면 약제 내성 유전자, 형광 단백질을 코딩하는 유전자, β-갈락토시다아제나 르시페라제와 같은 리포터로서 기능할 수 있는 효소를 코딩하는 유전자 등)을 가질 수도 있다.
본 발명에 사용되는 재조합 레트로바이러스 벡터(재조합 레트로바이러스 벡터, 본 명세서에서는 재조합 레트로바이러스라고 기재하는 경우가 있다)에도 한정은 없고, 공지 레트로바이러스 벡터, 예를 들면 MFG 벡터나 α-SGC 벡터(국제공개 제92/07943호 팸플릿), pBabe[Nucleic Acids Research, 제18권, 제3587∼3596쪽 (1990)], pLXIN(클론테크사 제), pDON-AI(다카라바이오사 제)등 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터[인간 면역부전 바이러스(HIV) 유래 벡터, 원숭이 면역부전 바이러스(SIV) 유래 벡터 등], 혹은 이것들을 변형한 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명 레트로바이러스 벡터는 N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III(이하, GnT-III라고 기재한다)의 작용에 의해 당쇄 변형을 받은 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 입자표면의 당쇄 변형은 레트로바이러스 생산세포에 있어서 이루어진다. 해당 레트로바이러스 생산세포는 레트로바이러스 유래의 gag-pol 유전자, env 유전자를 가지며, 또한, N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 유전자 활성이 증강된 세포를 레트로바이러스 벡터, 또는 상기 벡터에 대응하는 레트로바이러스 벡터 플라스미드로 형질전환하는 것에 의해 제작된다.
일반적인 레트로바이러스 벡터의 생산방법으로서는, 미리 레트로바이러스의 구조 단백질을 코딩하는 gag-pol 유전자와 env 유전자를 도입된 레트로바이러스 패키징 세포에, 외래 유전자를 탑재하고 패키징 시그널을 가지는 재조합 레트로바이러스 벡터 플라스미드를 도입하는 것에 의해서 생산시키는 방법과, 레트로바이러스의 구조 단백질을 가지지 않는 통상의 세포에 gag-pol, env 유전자의 발현 벡터 플라스미드와 동시에, 외래 유전자를 탑재하고 패키징 시그널을 가지는 재조합 레트로바이러스 벡터 플라스미드를 트랜스펙션하여 생산시키는 방법을 들 수 있다. 본 발명에는 상기 방법 중 어떤 방법도 사용할 수 있다.
전자의 경우, 효율이 좋은 방법을 선택해서 재조합 레트로바이러스 벡터 플라스미드의 트랜스펙션을 실시하면 일과성으로 바이러스 벡터를 생산시키는 것이 가능하고, 또 장기안정 발현주를 수립해서 레트로바이러스 생산세포 주를 취득하는 것도 가능하다. 이 방법에는 공지의 패키징 세포주, 예를 들면 PG13(ATCC CRL-10686), PA317(ATCC CRL-9078), GP+E-86이나 GP+envAm-12(미국특허 제5,278,056호), Psi-Crip[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 제85권, 제6460∼6464쪽 (1988)] 등의 세포주를 사용할 수 있다.
후자의 경우, 대부분의 경우가 일과성의 바이러스 생산을 목적으로 하고 있으며, 역가가 높은 바이러스를 얻기 위해서는 더 높은 트랜스펙션 효율이 요구된다. 예를 들면 트랜스펙션 효율이 높은 293 세포나 293T 세포를 숙주로 사용하는 경우가 많다.
자기복제 가능 레트로바이러스 입자의 출현을 방지하는 관점에서는, 본 발명에 사용되는 세포에서는 gag-pol 유전자와 env 유전자는 근접해서 존재하지 않는 것이 바람직하다. 예를 들면 gag-pol 유전자와 env 유전자가 염색체상의 다른 위치에 통합된 세포나, gag-pol 유전자를 함유하는 플라스미드와 env 유전자를 함유하는 다른 플라스미드의 양자가 도입된 세포가 본 발명에는 바람직하다.
또한 env 유전자는 생산하려고 하는 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 유래의 엔벨로프 단백질을 코딩하는 것에 한정되는 것이 아니라, 이종 바이러스 유래의 env 유전자를 가지는 슈도타입(pseudotyped) 패키징을 위한 세포도 본 발명에 포함된다. 상기한 env 유전자로서는 예를 들면 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(MoMLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 수포성 구내염 바이러스(VSV), 고양이 내재성 바이러스(feline endogenous virus) 유래의 env 유전자나 env로서 기능할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자를 사용할 수 있다.
또, 본 발명은 레트로바이러스 벡터를 생산하는 세포에 한정되는 것은 아니다. 재조합 레트로바이러스 벡터의 게놈이 되는, 패키징 시그널을 가지는 DNA(트랜스퍼 벡터)을 가지고 있지 않은 세포라고 하여도, 상기 DNA를 도입하는 것에 의해 레트로바이러스 벡터를 생산할 수 있는 것이라면 본 발명의 세포에 포함된다.
본원 발명에 있어서는 레트로바이러스를 생산하는 세포에 있어서 GnT-III 활성을 증강시키는 것에 의해, 바이러스 표면 단백질의 당쇄가 변형된 레트로바이러스 벡터가 제작된다.
여기에서, GnT-III 활성의 증강이란, 세포에 있어서의 GnT-III의 효소활성이 그 통상의 량에 비교해서 증가하고 있는 것을 의미한다. 특히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 본 발명에 레트로바이러스 생산세포로서 사용되는 세포의 GnT-III 활성은 해당 세포의 본래의 GnT-III 활성에 비교해서 5배 이상, 바람직하게는 10배 이상 높은 GnT-III 활성을 가진다. GnT-III의 효소활성의 증가는 예를 들면 GnT-III 활성을 측정하거나, 혹은 GnT-III를 코딩하는 유전자에서 전사되는 mRNA량을 공지의 방법, 예를 들면 RT-PCR법이나 노던 하이브리다이제이션 등에 의해 측정하는 것에 의해 확인할 수 있다.
GnT-III 활성의 증강은 염색체상의 GnT-III를 코딩하는 유전자의 발현유도 이외에, 염색체상의 GnT-III 유전자의 변형(카피수의 증가나 프로모터, 인핸서 등의 삽입), GnT-III 유전자의 세포 내로의 도입, 세포의 변이처리에 의한 GnT-III 유전자 고발현주의 취득 등, 공지의 수법에 의해 달성될 수 있다.
인간 GnT-III를 코딩하는 유전자의 구조는 공지이며[J. Biochem., 제113권, 제692∼698쪽 (1993)], 이 정보를 바탕으로 염색체상의 GnT-III 유전자의 변형을 실시할 수 있다. 예를 들면 레트로바이러스 생산세포로서 사용되는 세포에 있어서의, GnT-III를 코딩하는 유전자의 위치를 결정하고, 그 유전자의 상류에 천연에 있어서 그 유전자의 상류에 존재하여 그 유전자의 발현을 제어하고 있는 것과는 다른 이종의 프로모터, 예를 들면 강력한 프로모터나 유도 가능한 프로모터를 삽입하고, 해당 유전자의 발현량을 증가시킬 수 있다. 또, 본원 실시예에 기재된 인위적으로 GnT-III를 코딩하는 유전자를 세포에 도입하는 방법에 따르면, 더 간편하게 GnT-III 활성이 증강된 세포를 취득할 수 있다.
GnT-III를 코딩하는 유전자의 세포 내로의 도입은 상기 유전자를 벡터에 삽입해서 숙주 내로 도입하여, 실시할 수 있다. 벡터는 공지의 것에서 적절한 것을 선택 하면 되고, 예를 들면 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 등을 사용할 수 있다. 플라스미드 벡터를 사용하는 경우, 예를 들면 통상의 트랜스펙션법(인산 칼슘법이나 카티오닉 리포솜 법 등)으로 세포 내로의 도입을 실시할 수 있다. 또한, 도입된 GnT-III를 코딩하는 유전자가 세포의 염색체 DNA 상에 통합되도록 하는 수법을 사용할 수도 있다. 또, 본 발명에 있어서, 레트로바이러스 생산세포에 있어서의 GnT-III의 발현은 일과성 발현일 수도, 안정 발현일 수도 있다.
레트로바이러스 엔벨로프 단백질의 N 말단에는 막 이행 시그널이 있고, 엔벨로프 단백질은 세포 내에서 당쇄가 부가된 후, 단백질 분해효소에 의해 TM 단백질과 SU 단백질로 절단되어, 다량체를 형성해서 세포막 표면에 발현된다고 생각되고 있다. 세포막 직하에서는 gag-pol 융합 단백질이나 gag 단백질이 캡시드를 형성하고, 게놈 RNA를 통합하여 어셈블리를 완료하고, 세포로부터 출아시킨다. 이때 레트로바이러스는 숙주세포의 지질 이중막을 감싼 형태로 출아한다. 당전이 효소를 고발현하는 세포로부터 생산되는 레트로바이러스는 바이러스 입자의 표면 단백질이 당쇄 변형을 받고 있는 것임을 기대할 수 있다. 따라서 특히 본 발명의 한정을 의미하는 것은 아니지만, 바이러스 생산세포의 GnT-III 활성이 증강되어 있는 경우에는 세포 유래의 막 단백질, 바이러스의 엔벨로프 단백질에는 GnT-III의 작용에 의해 생성되는, 하기식(1)으로 나타내는 바이섹트-GlcNAc 구조를 가지는 당쇄가 부가된다고 생각된다. 또는, 올리고 만노스형이나 하이브리드형의 당쇄 변형의 비율이 증가하는 것도 생각된다.
Figure 112007029062875-PCT00001
GnT-III로 당쇄를 변형된 레트로바이러스는 예를 들면 레트로바이러스 생산세포에 GnT-III 발현 벡터 플라스미드를 도입하여 GnT-III 안정 발현주를 얻고, 그 배양 상청액으로부터 얻는 것이 가능하다. 또한 293 세포, 293T 세포 등에 GnT-III 발현 벡터 플라스미드를 도입하여 GnT-III안정 발현주를 얻고, 이 GnT-III 도입 293 세포, 293T 세포 등에 gag-pol, env 유전자의 발현 벡터 플라스미드와 외래 유전자를 탑재하고 패키징 시그널을 가지는 재조합 레트로바이러스 벡터 플라스미드를 동시에 트랜스펙션하고, GnT-III 변형 레트로바이러스를 얻는 것이 가능하다. 혹은 293 세포, 293T 세포 등에 GnT-III 발현 벡터 플라스미드와 gag-pol, env 유전자의 발현 벡터 플라스미드와 외래 유전자를 탑재하고 패키징 시그널을 가지는 재조합 레트로바이러스 벡터 플라스미드를 동시에 트랜스펙션하고, GnT-III 변형 레트로바이러스를 얻는 것이 가능하다. 이렇게 하여 수득된 레트로바이러스 벡터는 0.45 ㎛ 필터로 여과하고, 사용할 때까지 초저온 프리저에서 보존 가능하다.
본 발명의 방법에 의해, GnT-III 활성이 증강된 세포로부터 조제된 재조합 레트로바이러스는 특히 레트로바이러스 결합활성을 가지는 기능성 물질의 존재 하에 실시되는 유전자 도입에 있어서 우수한 감염효율을 나타낸다.
레트로바이러스 결합활성을 가지는 기능성 물질을 사용하는 유전자 도입방법은, 예를 들면 국제공개 제95/26200호 팸플릿, 국제공개 제97/18318호 팸플릿, Nature Medicine, 제2권, 제876∼882쪽 (1996) 등에 기재되어 있다. 당해 방법에는 레트로바이러스 결합부위와 표적세포 결합부위의 양쪽을 동일분자 상에 가지는 기능성 물질을 사용하는 방법, 레트로바이러스 결합부위를 가지는 기능성 물질과 표적세포 결합부위를 가지는 기능성 물질과의 혼합물을 사용하는 방법이 있지만, 본 발명의 방법에 의해 조제된 레트로바이러스는 어느 쪽의 방법에도 사용할 수 있다.
상기의 기능성 물질은 레트로바이러스 결합활성 및/또는 표적세포 결합활성을 가지는 것이라면 특별하게 한정은 없다. 예를 들면 피브로넥틴 유래의 헤파린 결합 도메인(헤파린-II 도메인), 섬유아세포 증식인자, V형 콜라겐의 프래그먼트, 상기의 폴리펩티드의 유도체나 변형체, 폴리리진, DEAE 덱스트란 등이 레트로바이러스 결합활성을 가지는 기능성 물질로서 예시된다. 또한 표적세포 결합활성을 가지는 기능성 물질에는 소망의 표적세포에 결합하는 능력을 가지는 임의의 물질을 사용할 수 있다. 특히 본 발명을 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면 세포결합 활성을 가지는 폴리펩티드(세포골격 단백질 등), 세포 혹은 세포표면의 생체분자를 인식하는 항체, 성장인자, 사이토카인, 당쇄 등이 표적세포 결합활성을 가지는 기능성 물질로서 예시된다.
본 발명의 형태의 하나로서, 피브로넥틴 유래의 헤파린 결합 도메인을 함유하는 기능성 물질의 존재 하에, 상기의 GnT-III 활성이 증강된 세포로부터 조제된 재조합 레트로바이러스를 표적세포에 감염시키는, 표적세포 내로의 유전자 도입방법을 들 수 있다. 상기 기능성 물질은 적합하게는 세포 접착 도메인과 헤파린 결합 도메인의 양자를 가지는 피브로넥틴 프래그먼트가 예시된다. 상기 세포 접착 도메인으로서는 VLA-5 및/또는 VLA-4에 결합하는 세포 접착 도메인이 특히 바람직하다. 상기의 피브로넥틴 프래그먼트는 생체에서 정제된 피브로넥틴으로부터 프로테아제 소화 등의 수단에 의해 조제할 수 있고, 또, 재조합 DNA 기술에 의해 제작할 수 있다. 예를 들면 레트로넥틴으로서 다카라바이오사에서 시판되고 있는 재조합 피브로넥틴 프래그먼트는 헤파린 결합 도메인, VLA-5 결합 도메인, VLA-4 결합 도메인을 가지고 있어, 본 발명에 바람직하다.
도 1 은 각종 클론 유래 바이러스에 의한 유전자 도입 효율을 나타내는 도면이다.
도 2 는 각종 클론 유래 바이러스에 의한 유전자 도입 효율을 나타내는 도면이다.
도 3 은 각종 클론 유래 바이러스에 의한 유전자 도입 효율을 나타내는 도면이다.
도 4 는 각종 클론 유래 바이러스에 의한 유전자 도입 효율을 나타내는 도면이다.
도 5 는 각종 클론 유래 바이러스에 의한 유전자 도입 효율을 나타내는 도면이다.
도 6 은 각종 클론 유래 바이러스에 의한 유전자 도입 효율을 나타내는 도면 이다.
도 7 은 각종 클론 유래 바이러스에 의한 유전자 도입 효율을 나타내는 도면이다.
도 8 은 각종 클론 유래 바이러스에 의한 유전자 도입 효율을 나타내는 도면이다.
도 9 는 각종 클론 유래 바이러스에 의한 유전자 도입 효율을 나타내는 도면이다.
도 10 은 293T 및 293T/hG3-1주 유래 암포트로픽 레트로바이러스에 의한 각종 감염방법에 있어서의 유전자 도입 효율을 나타내는 도면이다.
도 11 은 293T 및 293T/hG3-1주 유래 암포트로픽 레트로바이러스에 의한 각종 감염방법에 있어서의 유전자 도입 효율을 나타내는 도면이다.
도 12 는 293T 및 293T/hG3-1주 유래 암포트로픽 레트로바이러스에 의한 각종 감염방법에 있어서의 유전자 도입 효율을 나타내는 도면이다.
도 13 은 293T 및 293T/hG3-1주 유래 에코트로픽 레트로바이러스에 의한 각종 감염방법에 있어서의 유전자 도입 효율을 나타내는 도면이다.
도 14 는 293T 및 293T/hG3-1주 유래 에코트로픽 레트로바이러스에 의한 각종 감염방법에 있어서의 유전자 도입 효율을 나타내는 도면이다.
이하에 실시예에 의해, 더욱 상세하게 본 발명에 관하여 설명하지만, 본 발명은 실시예의 범위 내에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
인간 GnT-III 발현 플라스미드 벡터의 구축
인간 GnT-III를 코딩하는 DNA(GenBank E13194, 서열번호 1)를 포함하는 DNA단편을 조제하고, 유전자 발현용 플라스미드 벡터 pTriEx-3 Hygro(노바젠사 제)의 NcoI 사이트-Sse8387I 사이트 사이에 삽입한 재조합 플라스미드를 제작하였다. 이 재조합 플라스미드를 phG3-Hygro라고 명명하였다.
이 플라스미드를 사용하여 대장균 JM109을 형질전환하고, 형질전환체 1 콜로니를 5 ㎖의 LB 배지 중에서 37℃, 8시간, 진탕 배양하였다. 그 후에 80 ㎖의 LB 배지에서, 확대 배양하고, QIA filter Plasmid Maxi Kit(퀴아젠사 제)를 사용하여 플라스미드 DNA를 정제하였다.
실시예 2
1. 293T 세포도입 클론의 분리
인간 293T 세포[Mol. Cell BioI., 제7권, 제379∼387쪽 (1987)]의 배양은 10% 소 태아 혈청(JRH사 제)을 함유하는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM, 시그마사 제)를 증식 배지로 하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 실시하였다. 조직 배양용 직경 6㎝ 플레이트(이와키글라스사 제)에, 1 플레이트당 3×106개의 인간 293T 세포를 파종하고 하룻밤 배양하였다. 다음날, 인간 293T 세포가 세미컨플루언트(semi-confluent)인 것을 확인하고, 배지를 흡인 제거하고, 새롭게 1 플레이트당 3 ㎖의 증식 배지를 첨가하였다.
폴리스틸렌제 둥근바닥 튜브(팔콘사 제)에 phC3-Hygro 10 ㎍과 2M CaCl2 62 ㎕을 넣고 멸균 증류수를 첨가하여 500 ㎕로 하고, 추가로 트랜스펙션 버퍼(50mM HEPES, 10mM KCl, 12mM D-Glucose, 280mM NaCl, 1.5mM Na2HPO4, pH 7.10) 500 ㎕을 첨가 후 곧바로 전동 피펫터의 배출을 이용하여 20초간 버블링하였다. 이렇게 해서 조제한 용액을 상기 293T 세포의 플레이트에 균일하게 적하하였다. 대조로서 pTriEx-3 Hygro(Mock)을 동일한 조작으로 도입한 293T 세포를 조제하였다. 이것들의 세포를 37℃, 5% CO2에서 9시간 배양한 후, 배양 상청액을 흡인 제거하고, 새롭게 1 플레이트당 4 ㎖의 증식 배지를 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 유전자 도입 조작으로부터 2일 후, 각 인간 293T 세포를 트립신(기브코사 제) 처리로 플레이트로부터 벗겨내고, 10 ㎖ 의 증식 배지에 현탁 후, 세포수를 계수하여 조직배양용 직경 10㎝ 플레이트(이와키글라스사 제)에 1 플레이트당 6×106개, 4×106개, 2×106개로 파종하고, 37℃, 5% CO2 에서 배양하였다. 익일부터 하이그로마이신(인비트로젠사 제)을 0.3 mg/㎖ 함유하는 증식 배지에서 배양하였다.
하이그로마이신 선택 배지에서 3∼4일 단위로 배지 교환하면서 16일간 배양후, 출현한 하이그로마이신 내성 콜로니를 클로닝 링(이와키글라스사 제)로 클로닝하고, 48웰의 조직 배양용 플레이트(이와키글라스사 제)의 1 웰에 파종하였다. 클론화한 각 인간 293T 세포는 증식 속도에 맞추어서 24 웰의 조직 배양용 플레이트 (이와키글라스사 제), 직경 6㎝ 플레이트, 직경 10㎝ 플레이트로 계대하면서 배양을 계속하고, 최종적으로 Mock도입(즉 대조로서의 pTriEx-3 Hygro를 도입하였다) 인 293T 세포(293T/M)를 10 클론, phG3-Hygro를 도입한 인간 293T 세포(293T/hG3)를 20 클론 얻었다.
2. 발현확인
상기 1에서 수득된 293T/hG3의 각 클론 1×107개에서 TRIzol(인비트로젠사 제)을 사용하여 total RNA를 추출하였다. 이것을 주형으로 하기의 조작에 의해 cDNA 합성반응을 실시하였다. 5 U/㎕ AMV Reverse Transcriptase XL(라이프사이언스사 제) 1 ㎕, 10×RNA PCR 버퍼(다카라바이오사 제) 2 ㎕, 40 U/㎕ RNase Inhibitor 0.5 ㎕, 50 pmol/㎕ Random 9mers 1 ㎕, 각 10mM dNTP 혼합액 2 ㎕, 25mM MgCl2 4 ㎕, 1 ㎍ 상당의 주형 1 ㎕을 혼합하고, RNase free 증류수로 20 ㎕으로 메스업하여 조제한 반응액을 30℃에서 10분, 42℃에서 30분, 99℃에서 5분, 4℃에서 5분 반응시켰다. 반응 후, 이 반응액 1 ㎕을 주형으로 인간 GnT-III 유전자 특이적 프라이머 쌍(hG3-F1, hG3-R4; 서열번호 2, 3에 각각 hG3-F1, hG3-R4의 염기서열을 나타낸다)을 사용한 PCR 반응에 의해, 인간 GnT-III 유전자의 검출을 실시하였다. 반응은 94℃에서 5분간 반응 후, 94℃에서 30초간, 56℃에서 30초간, 72℃에서, 30초간의 사이클을 30 사이클 수행하고, 마지막으로 72℃에서 7분간 반응하였다. 양성 대조군으로서 phG3-Hygro를 사용하고, 음성 대조군에는 293T/M 클론으로부터 상기와 같이 조제한 RT-PCR 산물 1 ㎕을 사용하였다. PCR 반응 후, 반응액 8 ㎕을 2% 아가로스겔 전기영동에 제공하고, 증폭 단편을 확인하였다. 그 결과, 음성 대조군에서도 인간 GnT-III 유전자 유래의 단편의 증폭이 확인되었지만, 293T/hG3 클론으로부터 조제한 주형을 사용하였을 경우, 음성 대조군보다도 증폭 산물량이 증가하고 있으며, 상기 1에서 분리한 293T/hG3 클론에서는 phG3-Hygro 유래의 인간 GnT-III이 발현되어 있음이 확인되었다.
3. GnT-III 효소활성의 정량
상기 1에서 수득된 293T/hG3의 2 클론(293T/hG3-1주 및 293T/hG3-67주), 293T/M의 2 클론(293T/M2주 및 293T/M3주), 293T 세포를 각각 106∼107개 회수하고, PBS로 세정 후, 원심분리하여 얻은 침전에 100 ㎕의 CelLyticTM M Cell Lysis Reagent(시그마사 제)을 첨가하고, 실온에서 15분간 교반하였다. 20400×g, 15분간의 원심분리 후 상청액을 회수하여 GnT-III 조효소액으로 하고, 활성측정을 실시하였다. 조효소액의 일부는, BCA Protein Assay Reagent kit(피어스사 제)를 사용하여 단백질 정량을 실시하였다.
3 ㎕의 GnT-III 조효소액, 5 ㎕의 2×완충액[250mM MES-NaOH(pH 6.25), 200mM MnCl2, 400mM N-아세틸글루코사민(GlcNAc), 1.0% Triton X-100], 1 ㎕의 0.2M UDP-GlcNAc, 1 ㎕의 385 pmol/㎕ Gn, Gn-bi-PA [다카라바이오사 제, PA-Sugar Chain O12, 하기식(2)에 그 구조를 나타냄]을 혼합하고, 37℃에서 2시간 반응시켰다. 반응 후, 10 ㎕의 반응 정지액[2% sodium tetraborate, 250mM EDTA]을 첨가하고, 98℃에서 5분간 가열하여 효소를 실활시키고, 20400×g, 3분간 원심분리해서 상청액을 얻었다. 그 상청액 10 ㎕을 HPLC에 의해 분석하였다. 칼럼은 PALPAK Type R(CA8000: 4.6 mmφ×250 mm, 다카라바이오사 제), 용리액은 0.5% 1-부탄올을 함유하는 100mM 아세트산 트리에틸아민 완충액(pH 4.0)을 사용하고, 칼럼온도는 40℃, 유속은 1.0 ㎖/분으로 설정하였다. 검출에는 형광검출기를 사용하고, 여기 파장을 320 nm, 검출파장을 400 nm으로 설정하였다. 이 조건에서 Gn, Gn-bi-PA 당쇄는 9.6분에, Gn(Gn)Gn-bi-PA 당쇄는 18.1분에 용출되었다. GnT-III의 활성은 Gn(Gn)Gn-bi-PA[하기식(3)에 그 구조를 나타낸다]의 생성량과 앞서 정량한 조효소액의 단백량에 의거하여 산출한 GnT-III의 비활성으로부터 판정하였다. 그 결과, 293T 세포의 활성을 1.0으로 한 GnT-III의 활성은 293T/M2주에서 2.4, 293T/M3주에서 1.0, 293T/hG3-1주에서 32.2, 293T/hG3-67주에서 59.3이었다. 이것으로부터 293T/hG3 클론에서는 phG3-Hygro 유래의 인간 GnT-III 유전자 때문에, GnT-III 효소활성이 증강되어 있음이 확인되었다.
Figure 112007029062875-PCT00002
Figure 112007029062875-PCT00003
실시예 3
293T/hG3 클론으로부터의 바이러스 조제
1. 바이러스액의 조제
상기 실시예 2에서 분리한 293T/hG3 클론 중, GnT-III 유전자의 발현이 확인된 7 클론을 선택하고, 암포트로픽 레트로바이러스액을 조제하였다. 대조실험으로서 293T 세포와 293T/M의 2 클론에 대해서도 동일한 조작을 실시하였다. 6 웰의 조직 배양용 플레이트(이와키글라스사 제)의 1 웰당 상기의 각 세포 클론의 각각을 1.5×106개씩 파종하고, 2 ㎖ 의 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 중, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, 각 세포 클론이 세미컨플루언트인 것을 확인하고, 각 웰의 배지를 흡인 제거하고, 새롭게 1 웰당 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM을 1.5 ㎖ 첨가하였다. 추가로 클로로킨(와코쥰야쿠사 제)을 최종농도 25 μM이 되도록 각 웰에 첨가하였다. 폴리스틸렌제 둥근바닥 튜브 내에서 레트로바이러스의 구성 단백질 gag-pol을 발현시키는 벡터, pGP 플라스미드 벡터(다카라 바이오사 제)를 27.5 ㎍과, 동일하게 암포트로픽 env를 발현시키기 위한 pE-ampho 플라스미드 벡터(다카라 바이오사제)을 27.5 ㎍, 레트로바이러스 벡터 플라스미드 pDON-AI(다카라바이오사 제)에 플라스미드 pQBI25(Quantum Biotechnologies Inc. 제)에 삽입되어 있는 해파리 유래의 형광 단백질(Red-shift Green Fluorescent Protein: rsGFP) 유전자를 삽입한 레트로바이러스 생산용 플라스미드 벡터를 55 ㎍, 2M CaCl2 341 ㎕을 합쳐서 멸균 증류수로 2750 ㎕로 조제하고, 이것을 1300 ㎕ 씩 2개로 나누었다. 1 개의 튜브에 대해서 트랜스펙션 버퍼 1300 ㎕을 첨가 후 곧바로 전동 피펫터의 배출을 이용해서 20초간 버블링하고, 각 웰에 500 ㎕씩 균일하게 적하하였다. 이 플레이트를 37℃, 5% CO2에서 9시간 배양한 후, 배양 상청액 1.5 ㎖을 제거하고, 새롭게 1 웰당 2 ㎖의 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM을 첨가하고 배양을 계속하였다. 유전자 도입조작으로부터 24시간 후, 각 웰의 배지를 신선한 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 2 ㎖과 교환하고, 추가로 24시간 배양한 후, 배양 상청액을 채취하고, 0.45 ㎛의 필터(밀리포어사 제)로 여과해서 바이러스 상청액 스톡으로 하고, 사용할 때까지는 -80℃에서 보존하였다.
2. 바이러스 상청액의 역가 측정
바이러스 상청액의 역가 측정은 NIH/3T3 세포(ATCC CRL-1658)를 사용하여 표준적인 방법[J. Virol., 제62권, 제1120∼1124쪽 (1988년 )]에 따라서 측정하였다. 즉, 6 웰의 조직 배양용 플레이트에 1 웰당 5×104개의 NIH/3T3 세포를 포함하는 10% 소 혈청(기브코사 제)을 함유하는 DMEM 2 ㎖을 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 배양한 후, 배지를 흡인 제거하고, 각 웰에 계열 희석한 바이러스 상청액 1 ㎖을 첨가하고, 추가로 헥사디메트린ㆍ브로마이드(폴리브렌: 앨드리치사 제)를 최종농도 8 ㎍/㎖이 되도록 첨가하였다. 이것을 37℃, 5% CO2에서 4∼6시간 배양하고, 추가로 10% 소 혈청을 함유하는 DMEM을 1 ㎖ 첨가해서 72시간 배양하였다. 이 플레이트에서 회수한 세포를 플로우 사이트미터 FACS Vantage(벡튼디킨슨사 제)에 의한 해석을 하고, rsGFP 발현 NIH/3T3 세포의 비율을 측정하였다. 웰 당의 투입 세포 수에 rsGFP 발현 세포의 비율과 바이러스 상청액의 희석 배율을 곱한 값에서, 상청액 1 ㎖당의 감염성 입자 수(I.V.P./㎖)를 산출하고, 바이러스 역가로 하였다. 바이러스 조제를 수회 수행하고, 바이러스 역가를 측정한 바, 293T/hG3 클론 유래의 바이러스액의 역가는 1.9×105I.V.P./에서 2.8×106I.V.P./㎖ 의 범위이고, 대조 실험으로서 이용한 293T 세포 유래의 바이러스액의 역가는 9.4×105I.V.P./㎖에서 1.6×106I.V.P./㎖, 293T/M 클론 유래의 바이러스액 역가는 1.8×106I.V.P./㎖에서 2.6×106I.V.P./㎖ 의 범위이었다.
실시예 4
1. CH-296 코팅 플레이트의 제작
표면 미처리 24웰 플레이트(팔콘사 제)에 1 웰 당 500 ㎕의 32 ㎍/㎖의 피브로넥틴 프래그먼트인 CH-296(레트로넥틴; 다카라바이오사 제)을 첨가하고 4℃에서 하룻밤 방치한 후, 2% BSA/PBS에서, 실온에서 30분간 블록킹하고, 추가로 PBS로 세정하였다. 이 플레이트를 CH-296 코팅 플레이트로 하고, 필요에 따라서 제작하였다.
2. NIH/3T3 세포 내로의 유전자 도입
NIH/3T3 세포 내로의 유전자 도입에 사용한 바이러스는 실시예 3에서 조제한 바이러스액 중, 인간 GnT-III 변형 바이러스로서 293T/hG3-1주 및 293T/hG3-67주에서 조제한 바이러스를 선택하였다. 대조로서 293T 세포에서 조제한 바이러스, 및 Mock 바이러스로서 293T/M2 주에서 조제한 바이러스 1 종을 선택하였다. 이들 바이러스를 사용하고, 상기의 CH-296 코팅 플레이트를 사용하여 NIH/3T3 세포에 감염시키고, 인간 GnT-III 유전자가 도입된 세포에서 조제된 레트로바이러스의 감염성의 변화를 이하에 나타나 있는 조작에 의해 조사하였다.
직경 10㎝ 플레이트에서 세미컨플루언트하게 생육한 NIH/3T3 세포를 트립신 처리로 플레이트로부터 벗겨내고, 10 ㎖ 의 10% 소 혈청을 함유하는 DMEM에 현탁 후, 190×g, 3분간 원심하여서 세포를 모으고, 생 세포 수를 계수하여 10% 소 혈청을 함유하는 DMEM에서 2×105 개/㎖로 조제하였다. 또한 실시예 3에서 수득된 각 바이러스액을 10% 소 태아 혈청(JRH사 제) 함유의 DMEM으로 희석하고, 2×104I.V.P./㎖로 조제하였다. CH-296 코팅 플레이트의 1 웰에 상기의 NIH/3T3 세포액 100 ㎕, 희석 바이러스액 200 ㎕, 10% 소 혈청을 함유하는 DMEM 200 ㎕을 첨가하고, 3 일간37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 3일 후의 NIH/3T3 세포를 플로우 사이트미터 FACS Vantage에 의해 해석을 하고, rsGFP 발현 NIH/3T3 세포의 비율을 측정하여 유전자 도입 효율로 하였다. CH-296 코팅 플레이트를 사용한 감염의 대조 실험으로 조직 배양용 24웰 플레이트에 1 웰 당 2×104개의 NIH/3T3 세포를 포함하는 10% 소 혈청을 함유하는 DMEM 500 ㎕을 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 배양한 후, 배지를 흡인 제거하고, 각 웰에 상기에서 조제한 2×104I.V.P./㎖의 바이러스액 200 ㎕과 10% 소 혈청을 함유하는 DMEM 300 ㎕을 첨가하고, 추가로 폴리브렌을 최종농도 8 ㎍/㎖가 되도록 첨가하였다. 이것을 37℃, 5% CO2에서 3일간 배양하고, 3일 후의 NIH/3T3 세포를 플로우 사이트미터 FACS Vantage에 적용하여, rsGFP 발현 NIH/3T3세포의 비율을 측정하였다.
상기의 실험의 결과를 도 1에 나타낸다. 도 1 중, 횡축에는 바이러스액이 조제된 세포가 기재되고 있으며, (Pb) 는 폴리브렌 존재 하에 감염이 실시된 그룹을, (RN)은 CH-296 코팅 플레이트에서 감염이 실시된 그룹을 각각 나타낸다. 종축은 유전자 도입 효율(%)을 나타낸다.
폴리브렌을 사용하여 감염시킨 대조실험의 경우, rsGFP 발현 NIH/3T3 세포의 비율은 각 바이러스 사이에서 거의 동등하였지만, CH-296 코팅 플레이트를 사용하였을 경우, 인간 GnT-III 변형 바이러스를 감염시킨 NIH/3T3 세포에서는 rsGFP 발현 세포의 비율이 비변형 바이러스감염 NIH/3T3 세포에 대해서 1.7∼2.2배로 상승하였다(도 1). 이것은, CH-296 코팅 플레이트를 사용하였을 경우, 인간 GnT-III에 의해 막 표면이 변형된 레트로바이러스에서는 그 감염성이 향상하고 있음을 나타내는 것이다.
3. 혈구계 세포 내로의 유전자 도입
인간 K562세포(ATCC CCL-243)은 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640(시그마사 제)을 증식 배지로 하고, 37℃, 5% CO2의 조건 하에서 배양을 실시하였다. 또한 인간 TF-1 세포(ATCC CRL-2003)는 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640을 증식 배지로 하고 최종농도 2 ng/㎖의 과립구/대식구 집락 자극 인자(GM-CSF: 셰링ㆍ푸라우사 제) 존재 하에서, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 배양을 실시하였다. 실시예 3에서 조제한 바이러스액을 상기 2에 기재된 방법으로 CH-296 코팅 플레이트를 사용하여 M.O.I.(multiplicity of infection) = 0.2의 조건으로 감염시켰다. 세포의 조제, 바이러스의 희석에는 각 세포의 증식 배지를 사용하였다. 감염으로부터 3일 후의 각 세포를 플로우 사이트미터 FACS Vantage에 적용하여, rsGFP 발현 각 세포의 비율을 측정하였다. 그 결과를 도 2, 3에 나타낸다. 도 2는 K562세포, 도 3은 TF-1 세포에 관한 결과를 나타내고 있고, 도 중, 횡축에는 바이러스액이 조제된 클론 명이 기재되어 있다. 종축은 유전자 도입 효율(%)을 나타낸다.
인간 GnT-III 변형 바이러스를 감염시킨 K562, 및 TF-1 세포에서는 rsGFP 발현 세포의 비율이 비변형 바이러스감염 K562, 및 TF-1 세포에 대하여 1.5∼1.7배로 상승하였다.
4. 각종 세포 내로의 유전자 도입
HT1080 세포(ATCC CCL-121), 293 세포(ATCC CRL-1573), A375M 세포[Cancer Lett., 제38권, 제137∼147쪽 (1987)], KB 세포(ATCC CCL-17), MDA-MB-435S 세포(ATCC HTB-129)는 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM을 증식 배지로 하고, MKN1 세포(BRC RCB1003)는 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640을 증식 배지로 하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 배양을 실시하였다. 실시예 3에서 조제한 바이러스 액 중, 인간 GnT-III 변형 바이러스로서 293T/hG3-1에서 조제한 바이러스, 대조로서 293T 및 293T/M2에서 조제한 바이러스를 사용하고, 상기 2 와 동일하게 M.O.I.= 0.2의 조건에서, 폴리브렌 혹은 CH-296 코팅 플레이트를 사용하여 각종 세포에 감염시켰다. 감염으로부터 3일 후의 각 세포를 플로우 사이트미터 FACS Vantage에 적용하고, rsGFP 발현 각 세포의 비율을 측정하였다. 그 결과를 도 4∼9에 나타낸다. 도 4∼9에는 각각 HT1080 세포, 293 세포, A375M 세포, KB 세포, MDA-MB-435S 세포, MKN1 세포에서의 결과가 나타나 있다. 도 중, 횡축에는 바이러스액이 조제된 클론명이 기재되고 있으며, (Pb) 는 폴리브렌 존재 하에 감염이 실시된 그룹을, (RN)은 CH-296 코팅 플레이트에서 감염이 실시된 그룹을 각각 나타낸다. 종축은 유전자 도입 효율(%)을 나타낸다.
인간 GnT-III 변형 바이러스를 감염시킨 각 세포에서는 rsGFP 발현 세포의 비율이 비변형 바이러스감염 각 세포에 대해서 상승하였다.
실시예 5
293T/hG3 클론으로부터의 바이러스 조제와 표적세포 내로의 유전자 도입
1. 바이러스액의 조제
실시예2에서 분리한 293T/hG3 클론 중, 발현이 확인된 것에서 293T/hG3-1주를 선택하고, 암포트로픽 레트로바이러스액, 및 에코트로픽 레트로바이러스액을 조제하였다. 대조실험으로 293T 세포에 대해서도 동일한 조작을 실시하였다. 조직 배 양용 직경 6cm 플레이트(이와키글라스사 제)에 3×106개의 293T 혹은 293T/hG3 클론을 파종하고, 4 ㎖ 의 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 중에서, 37℃, 5% CO2에서 하룻밤 배양하였다. 익일, 293T 및 293T/hG3 클론이 세미컨플루언트인 것을 확인하고, 각 플레이트의 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM을 흡인 제거하고, 새롭게 1 플레이트당 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM을 3 ㎖ 첨가하였다. 추가로 클로로킨(와코쥰야쿠사 제)을 최종농도 25 μM이 되도록 각 플레이트에 첨가하였다. 암포트로픽 레트로바이러스 조제용에 폴리스틸렌제 둥근바닥 튜브를 2개 준비하고, 각 튜브 내에서 pGP 플라스미드 벡터(다카라바이오사 제)을 5 ㎍과, 암포트로픽 env를 발현시키기 위한 pE-ampho 플라스미드 벡터(다카라바이오사 제)를 5 ㎍, 레트로바이러스 벡터 플라스미드 pDON-AI(다카라바이오사 제)에 rsgfp 유전자를 탑재한 레트로바이러스 생산용 플라스미드 벡터를 10 ㎍, 2M CaCl2 62 ㎕을 합쳐서 멸균증류수로 500 ㎕로 조제하였다. 동일하게 에코트로픽 레트로바이러스 조제용에 폴리스틸렌제 둥근바닥 튜브를 2개 준비하고, 각 튜브 내에서 pGP 플라스미드 벡터를 5 ㎍와, 에코트로픽 env를 발현시키기 위한 pE-eco 플라스미드 벡터(다카라바이오사 제)을 5 ㎍, 레트로바이러스 벡터 플라스미드 pDON-AI에 rsgfp 유전자를 탑재한 레트로바이러스 생산용 플라스미드 벡터를 10 ㎍, 2M CaCl2 62 ㎕을 합쳐서 멸균증류수로 500 ㎕로 조제하였다. 1 개의 튜브에 대해서 트랜스펙션 버퍼 500 ㎕을 첨가 후 곧바로 전동 피펫터의 배출을 사용하여 20초간 버블링하고, 각 플레이트에 1㎖ 씩 균일하게 적하하였다. 이것을 37℃, 5% CO2에서 9시간 배양하고, 9 시간 후, 배양 상청액 3 ㎖을 제거하고, 새롭게 1 플레이트당 4 ㎖의 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM을 첨가하고, 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 유전자 도입조작으로부터 24시간 후, 각 플레이트의 배지를 신선한 10% 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 4 ㎖과 교환하고, 37℃, 5% CO2에서 추가로 24시간 배양한 후, 배양 상청액을 0.45 ㎛의 필터(밀리포어사 제)로 여과해서 바이러스 상청액 스톡으로 하고, 사용할 때까지는 -80℃에서 보존하였다.
2. 바이러스 상청액의 역가 측정
바이러스 상청액의 역가 측정은 NIH/3T3 세포를 사용하고, 실시예 3의 2. 바이러스 상청액의 역가 측정에 준해서 수행하였다. 암포트로픽 레트로바이러스의 역가는 293T/hG3 클론 유래의 바이러스액이 1.9×106I.V.P./㎖, 대조실험으로 사용한 293T 세포 유래의 바이러스액이 1.1×106I.V.P./㎖ , 에코트로픽 레트로바이러스의 역가는 293T/hG3클론 유래의 바이러스액이 3.7×106I.V.P./㎖ , 대조실험으로 사용한 293T 세포 유래의 바이러스액이 6.0×106I.V.P./㎖ 이었다.
3. 인간 GnT-III 변형 암포트로픽 레트로바이러스를 이용한 유전자 도입
상기 실시예 5의 1에서 조제한 바이러스액 중, 293T/hG3-1주에서 조제된 인간 GnT-III 변형 암포트로픽 레트로바이러스와, 대조로서 293T 세포에서 조제된 암 포트로픽 레트로바이러스를 사용하고, NIH/3T3 세포 내로의 유전자 도입을 폴리브렌(Pb)법 및 CH-296 코팅 플레이트를 사용한 Supernatant(SN)법을 이용해서 M.0.1.= 0.2의 조건으로 실시하였다. 또한 HT1080 세포, K562 세포에는 동일하게 Pb법 및 SN법과, CH-296 코팅 플레이트를 이용한 Bound virus(BV)법의 3종으로 실시하였다. HT1080 세포에 대해서는 각종 방법에서 M.0.1.= 0.2의 조건으로 감염시키고, K562 세포에는 M.0.1.= 2.0의 조건으로 감염시켰다. Pb법, SN법은 각각 실시예 4의 2 기재의 방법에 따라서 수행하였다. BV법은 바이러스액을 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640을 사용하여 HT1080 세포에 대한 감염용으로 8×103I.V.P./㎖, K562 세포에 대한 감염용으로 8×104I.V.P./㎖ 에 조제하고, CH-296 코팅 플레이트의 1 웰에 500 ㎕ 씩 첨가한 후, 그 플레이트를 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 정치하고 CH-296에 대한 바이러스의 흡착을 재촉하고, 4시간 후, 바이러스 상청액을 제거하여 1 웰 0.5 ㎖씩의 1×PBS로 세정 후, 4×104/㎖로 조제한 각 세포를 1 웰에 500 ㎕ 씩 첨가해서 감염시켰다. 이것을 37℃, 5% CO2에서 3일간 배양하고, 3 일 후의 각 세포를 플로우 사이트미터 FACS Vantage(벡튼디킨슨사 제)에 적용하고, GFP 발현 각 세포의 비율을 측정하였다. 그 결과를 도 10∼12에 나타낸다. 도 10∼12는 각각 NIH/3T3 세포, HT1080 세포, K562 세포에서의 결과를 나타내고 있다. 도 중, 횡축에는 감염방법이 나타내고 있고, Pb는 폴리브렌 존재 하에 감염이 실시된 그룹을, SN은 CH-296 코팅 플레이트에서 Supernatant법을 이용해서 감염이 실시된 그룹을 나타내며, BV는 CH-296 코팅 플레이트에서 Bound virus법으로 감염이 실시된 그룹을 각각 나타낸다. 종축은 유전자 도입 효율(%)을 나타낸다.
인간 GnT-III 변형 바이러스를 감염시킨 각 세포에서는 CH-296 존재 하에서rsGFP 발현 세포의 비율이 비변형 바이러스감염 각 세포에 대하여 상승하였다.
4. 인간 GnT-III 변형 에코트로픽 레트로바이러스를 이용한 유전자 도입
상기 실시예 5의 1에서 조제한 바이러스액 중, 293T/hG3-1주에서 조제된 인간 GnT-III 변형 에코트로픽 레트로바이러스와, 대조로서 293T 세포에서 조제된 에코트로픽 레트로바이러스를 사용하고, NIH/3T3 세포 내로의 유전자 도입을 Pb법 및 CH-296 코팅 플레이트를 이용한 SN법을 이용해서 M.O.I.= 0.2의 조건으로 실시하였다. 또한 마우스 L1210 세포(ATCC CCL-219)은 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640을 증식 배지로 하고, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 배양을 실시하고, Pb법 및 SN법과, CH-296 코팅 플레이트를 이용한 BV법의 3종으로, M.O.I.= 2.0의 조건으로 감염을 실시하였다. Pb법, SN법은 각각 실시예 4의 2에 기재된 방법에 따라서 실시하고, BV법은 상기 3에 기재된 방법에 따라서 수행하였다. 이것을 37℃, 5% CO2에서 3일간 배양하고, 3일 후의 각 세포를 플로우 사이트미터 FACS Vantage(벡튼디킨슨사제)에 적용하고, GFP 발현 각 세포의 비율을 측정하였다. 그 결과를 도 13, 14에 나타낸다. 도 13, 14은 각각 NIH/3T3 세포, L1210 세포에서의 결과를 나타내고 있다. 도 중, 횡축에는 감염방법이 나타나 있고, Pb는 폴리브렌 존재 하에 감염이 실시된 그룹을, SN은 CH-296 코팅 플레이트에서 Supernatant법을 이용해서 감염이 실 시된 그룹을 나타내고, BV는 CH-296 코팅 플레이트에서 Bound virus법으로 감염이 실시된 그룹을 각각 나타내다. 종축은 유전자 도입 효율(%)을 나타낸다.
인간 GnT-III 변형 바이러스를 감염시킨 각 세포에서는 CH-296 존재 하에서rsGFP 발현 세포의 비율이 비변형 바이러스감염 각 세포에 대하여 상승하였다.
본 발명에 따르면, 레트로바이러스 결합활성을 가지는 기능성 물질의 존재 하에서 높은 유전자 도입 효율을 나타내는 재조합 레트로바이러스 벡터가 제공된다. 상기 벡터를 사용하는 것에 의해, 표적세포에 높은 효율로 목적하는 유전자를 안정되게 도입할 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 유전병에 한정되지 않는 여러 가지의 질병의 치료에 사용할 수 있기 때문에, 본원 발명은 널리 의료분야에 있어서 유용하다.
서열표 프리텍스트
SEQ ID NO: 2; Synthetic primerh G3-Fl to amplify a gene encoding GNT-III.
SEQ ID NO: 3; Synthetic primerh G3-R4 to amplify a gene encoding GnT-III.
SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> Producer cell for retroviral vector <130> 666218 <150> JP 2004-283918 <151> 2004-09-29 <160> 3 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1593 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgagacgct acaagctctt tctcatgttc tgtatggccg gcctgtgcct catctccttc 60 ctgcacttct tcaagaccct gtcctatgtc accttccccc gagaactggc ctccctcagc 120 cctaacctgg tgtccagctt tttctggaac aatgccccgg tcacgcccca ggccagcccc 180 gagccaggag gccctgacct gctgcgtacc ccactctact cccactcgcc cctgctgcag 240 ccgctgccgc ccagcaaggc ggccgaggag ctccaccggg tggacttggt gctgcccgag 300 gacaccaccg agtatttcgt gcgcaccaag gccggcggcg tctgcttcaa acccggcacc 360 aagatgctgg agaggccgcc cccgggacgg ccggaggaga agcctgaggg ggccaacggc 420 tcctcggccc ggcggccacc ccggtacctc ctgagcgccc gggagcgcac ggggggccga 480 ggcgcccggc gcaagtgggt ggagtgcgtg tgcctgcccg gctggcacgg acccagctgc 540 ggcgtgccca ctgtggtgca gtactccaac ctgcccacca aggagcggct ggtgcccagg 600 gaggtgccgc gccgcgtcat caacgccatc aacgtcaacc acgagttcga cctgctggac 660 gtgcgcttcc acgagctggg cgacgtggtg gacgcctttg tggtgtgcga gtccaacttc 720 acggcttatg gggagccgcg gccgctcaag ttccgggaga tgctgaccaa tggcaccttc 780 gagtacatcc gccacaaggt gctctatgtc ttcctggacc acttcccgcc cggcggccgg 840 caggacggct ggatcgccga cgactacctg cgcaccttcc tcacccagga cggcgtctcg 900 cggctgcgca acctgcggcc cgacgacgtc ttcatcattg acgatgcgga cgagatcccg 960 gcccgtgacg gcgtcctttt cctcaagctc tacgatggct ggaccgagcc cttcgccttc 1020 cacatgcgca cgtcgctcta cggcttcttc tggaagcagc cgggcaccct ggaggtggtg 1080 tcaggctgca cggtggacat gctgcaggca gtgtatgggc tggacggcat ccgcctgcgc 1140 cgccgccagt actacaccat gcccaacttc agacagtatg agaaccgcac cggccacatc 1200 ctggtgcagt ggtcgctggg cagccccctg cacttcgccg gctggcactg ctcctggtgc 1260 ttcacgcccg agggcatcta cttcaagctc gtgtccgccc agaatggcga cttcccacgc 1320 tggggtgact acgaggacaa gcgggacctg aactacatcc gcggcctgat ccgcaccggg 1380 ggctggttcg acggcacgca gcaggagtac ccgcctgcag accccagcga gcacatgtat 1440 gcgcccaagt acctgctgaa gaactacgac cggttccact acctgctgga caacccctac 1500 caggagccca ggagcacggc ggcgggcggg tggcgccaca ggggtcccga gggaaggccg 1560 cccgcccggg gcaaactgga cgaggcggaa gtc 1593 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer hG3-F1 to amplify a gene encoding GnT-III. <400> 2 aaccatggcg atgagacgct acaagctc 28 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic primer hG3-R4 to amplify a gene encoding GnT-III. <400> 3 ctctccagca tcttggtgcc 20

Claims (13)

  1. 레트로바이러스 유래의 gag-pol 유전자, env 유전자를 가지며, 또한 N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 활성이 증강된 세포.
  2. 제 1 항에 있어서,
    레트로바이러스 유래의 gag-pol 유전자, env 유전자가 염색체상에 통합되어 있는 것을 특징으로 하는 세포.
  3. 제 1 항에 있어서,
    레트로바이러스 유래의 gag-pol 유전자, env 유전자를 함유하는 플라스미드로 형질전환되는 것을 특징으로 하는 세포.
  4. 제 1 항에 있어서,
    N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 활성의 증강이 N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 유전자의 인위적 도입에 의한 것을 특징으로 하는 세포.
  5. 제 4 항에 있어서,
    N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 활성의 증강이 N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 유전자의 염색체상에로의 통합에 의한 것을 특징으로 하 는 세포.
  6. 제 4 항에 있어서,
    N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 활성의 증강이 N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 유전자를 함유하는 플라스미드로의 형질전환에 의한 것을 특징으로 하는 세포.
  7. 제 1 항에 있어서,
    N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 유전자가 이종의 프로모터의 제어 하에 있는 것을 특징으로 하는 세포.
  8. 제 1 항에 있어서,
    293 세포 및 293T 세포에서 선택되는 세포에 유래하는 세포.
  9. 레트로바이러스 유래의 gag-pol 유전자, env 유전자를 가지고, N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 활성이 증강되고, 재조합 레트로바이러스 벡터 또는 재조합 레트로바이러스 벡터 플라스미드로 형질전환된 레트로바이러스 생산세포.
  10. 레트로바이러스 유래의 gag-pol 유전자, env 유전자를 가지고, N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 활성이 증강되고, 재조합 레트로바이러스 벡터 또는 재조합 레트로바이러스 벡터 플라스미드로 형질전환된 레트로바이러스 생산세포를 배양하는 공정, 및
    배양액 상청액을 회수하는 공정을 포함하는 레트로바이러스 벡터의 제조방법.
  11. 하기 공정을 포함하는 레트로바이러스 벡터의 제조방법에 의해 제조된 레트로바이러스 벡터:　
    레트로바이러스 유래의 gag-pol 유전자, env 유전자를 가지고, N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 활성이 증강되고, 재조합 레트로바이러스 벡터 또는 재조합 레트로바이러스 벡터 플라스미드로 형질전환된 레트로바이러스 생산세포를 배양하는 공정, 및
    배양액 상청액을 회수하는 공정.
  12. 레트로바이러스 유래의 gag-pol 유전자, env 유전자를 가지고, N-아세틸글루코사미닐 트랜스페라아제 III 활성이 증강되고, 재조합 레트로바이러스 벡터 또는 재조합 레트로바이러스 벡터 플라스미드로 형질전환된 레트로바이러스 생산세포를 배양하는 공정, 　
    배양액 상청액을 회수하여 레트로바이러스 벡터를 얻는 공정, 및 　
    그 레트로바이러스 벡터를 레트로바이러스 결합활성을 가지는 기능성 물질의 존재 하에 표적세포에 감염시키는 공정을 포함하는 표적세포 내로의 유전자 도입방 법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    레트로바이러스 결합활성을 가지는 기능성 물질이 피브로넥틴 혹은 그 프래그먼트인 표적 세포 내로의 유전자 도입방법.
KR1020077008675A 2004-09-29 2005-09-28 레트로바이러스 벡터 생산용 세포 KR101086822B1 (ko)

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