BR112019020941A2 - célula de empacotamento retroviral e produtora de retrovirais, vetor de ácido nucleico, métodos para produzir uma linhagem celular de empacotamento retroviral estável, uma linhagem de células produtoras de retrovirais estáveis e uma partícula de vetor retroviral com defeito de replicação, e, partícula de vetor retroviral com defeito de replicação - Google Patents
célula de empacotamento retroviral e produtora de retrovirais, vetor de ácido nucleico, métodos para produzir uma linhagem celular de empacotamento retroviral estável, uma linhagem de células produtoras de retrovirais estáveis e uma partícula de vetor retroviral com defeito de replicação, e, partícula de vetor retroviral com defeito de replicação Download PDFInfo
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Abstract
a invenção se refere a células produtoras de retrovirais compreendendo sequências de ácidos nucleicos que codificam: proteínas gag e pol; proteína de envelope ou um substituto funcional da mesma; marcador de seleção amplificável; e o genoma de rna da partícula de vetor retroviral, em que as referidas sequências de ácidos nucleicos são todas integradas em um único local dentro do genoma da célula produtora de retrovirais. a invenção também se refere a vetores de ácidos nucleicos que compreendem uma origem de replicação não mamífera e à capacidade de reter pelo menos 25 kilobases (kb) de dna, distinguida por o referido vetor de ácidos nucleicos compreender sequências de ácidos nucleicos retrovirais que codificam: proteínas gag e pol, e uma proteína env ou um substituto funcional da mesma. o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente sequências de ácido nucleico que codificam um marcador de seleção amplificável. a invenção também se refere a usos e métodos usando o referido vetor de ácido nucleico, a fim de produzir empacotamento retroviral estável e linhagens de células produtoras.
Description
CÉLULA DE EMPACOTAMENTO RETROVIRAL E PRODUTORA DE RETROVIRAIS, VETOR DE ÁCIDO NUCLEICO, MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA LINHAGEM CELULAR DE EMPACOTAMENTO RETROVIRAL ESTÁVEL, UMA LINHAGEM DE CÉLULAS PRODUTORAS DE RETROVIRAIS ESTÁVEIS E UMA PARTÍCULA DE VETOR RETROVIRAL COM DEFEITO DE REPLICAÇÃO, E, PARTÍCULA DE VETOR RETROVIRAL COM DEFEITO DE REPLICAÇÃO
CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção se refere a vetores de ácidos nucleicos compreendendo genes necessários para a produção de vetores retrovirais e seus usos. Também são providos métodos para fazer linhagens celulares de empacotamento/produção retroviral compreendendo os vetores de ácido nucleico aqui descritos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002] Na terapia gênica, o material genético é entregue às células endógenas em um indivíduo que necessita de tratamento. O material genético pode introduzir novos genes no indivíduo, introduzir cópias adicionais de genes pré-existentes ou introduzir diferentes alelos ou variantes de genes que estão presentes no indivíduo. Os sistemas de vetores virais foram propostos como um método eficaz de entrega de genes para uso em terapia gênica (Verma e Somia (1997) Nature 389: 239 a 242).
[003] Em particular, esses vetores virais são baseados em membros da família de retrovirus devido à sua capacidade de integrar sua carga genética no genoma do hospedeiro. Os vetores retrovirais são projetados para manter as proteínas essenciais necessárias para o empacotamento e a entrega do genoma retroviral, mas quaisquer proteínas acessórias não essenciais, incluindo as responsáveis pelo seu perfil de doença, são removidas. Exemplos de vetores retrovirais incluem vetores lentivirais, como os baseados no Vírus
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2/65 da Imunodeficiência Humana Tipo 1 (HIV-1), que são amplamente utilizados porque são capazes de integrar células não proliferativas.
[004] Atualmente, a maioria dos vetores virais é produzida por cotransfecção transitória de genes virais em uma linhagem celular hospedeira. Os genes virais são introduzidos usando plasmídeos bacterianos que existem na célula hospedeira por apenas um período de tempo limitado, porque os genes virais permanecem nos plasmídeos e não estão integrados ao genoma. Como tal, o material genético transientemente transfectado não é passado para as gerações subsequentes durante a divisão celular.
[005] Existem várias desvantagens associadas à transfecção transitória, como a variabilidade lote a lote, o alto custo dos reagentes de transfecção e a dificuldade em manter o controle de qualidade (ver Segura et al. (2013) Expert Opinion. Biol. Ther. 13 (7) : 987 a 1011). O processo de transfecção em si também é trabalhoso e desafiador para se ampliar. Existe também a difícil tarefa de remover as impurezas plasmáticas que são transportadas durante a preparação do vetor (ver Pichlmair et al. (2007) J. Virol. 81 (2): 539 a 547).
[006] A fim de abordar problemas associados à transfecção transitória, houve um desejo de desenvolver linhagens celulares de empacotamento e produção retrovirais e, a fim de simplificar a produção de vetores retrovirais.
[007] As linhagens celulares de empacotamento foram geradas transfectando uma linhagem celular capaz de empacotar vetores retrovirais com plasmídeos, onde plasmídeos individuais carregam os genes de empacotamento retroviral e marcadores de seleção eucarióticos exclusivos. Os genes de empacotamento retroviral são integrados ao genoma da linhagem celular de empacotamento e são descritos como sendo estavelmente transfectados. Nos últimos 20 anos, foram feitas várias tentativas para gerar linhagens celulares de empacotamento e produção de vetores retrovirais
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3/65 estáveis.
[008] Houve muitos problemas relatados nas linhagens celulares de empacotamento e produção produzidas através da integração de componentes de vetores retrovirais no genoma da célula hospedeira. Em um primeiro momento, a introdução sequencial de componentes do vetor retroviral pode ser trabalhosa e inflexível. Também houve problemas com a instabilidade genética e/ou transcricional dos componentes do vetor retroviral quando eles são integrados ao genoma da célula hospedeira porque o local da integração é imprevisível (Ni et al. (2005) J. Gene Med. 7:818 a 834).
[009] Também foi relatada uma queda significativa na produtividade do vetor viral durante a adaptação da suspensão e o aumento de escala das linhagens celulares de produção (Farson et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12: 981 a 997; Guy et al. (2013) Hum Gene Ther. Methods 24 (2): 125 a 139).
[0010] Também foram feitas tentativas, dentro da indústria biofarmacêutica, de produzir linhagens celulares transfectadas, proporcionando títulos altos e confiáveis de proteínas recombinantes. Tais processos envolvem tipicamente a triagem de células transfectadas para identificar linhagens celulares com crescimento e produção ideais da proteína recombinante (por exemplo, ver Wurm, 2004, Nature Biotechnology 22, 1393 a 1398).
[0011] Um método conhecido envolve a seleção de uma linhagem celular estavelmente transfectada na qual o gene recombinante de interesse foi integrado ao genoma da célula hospedeira e amplificado, de modo que a linhagem celular compreenda um número aumentado de cópias do gene recombinante de interesse. Isto é feito co-transfectando a célula hospedeira com um gene recombinante de interesse juntamente com um gene marcador de seleção amplificável que é inibido por um fármaco tóxico conhecido. As células estavelmente transfectadas são então submetidas a concentrações crescentes do fármaco tóxico conhecido, por exemplo, cultivando as células
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4/65 transfectadas em um meio contendo o fármaco tóxico. Deste modo, podem ser selecionadas populações de células transfectadas que têm um número de cópias aumentado do gene marcador de seleção amplificável através da amplificação gênica, resultando em níveis de expressão aumentados do marcador de seleção amplificável e, desse modo, conferindo resistência ao fármaco tóxico. Como o processo de amplificação do gene resulta na amplificação do marcador de seleção amplificável e nas sequências de DNA circundantes, no caso de um gene recombinante de interesse ser integrado adjacente ao gene que codifica o marcador de seleção amplificável no genoma da célula hospedeira, é possível co-amplificar sequências de ácidos nucleicos que codificam o gene recombinante de interesse, juntamente com as que codificam o marcador de seleção amplificável. Este processo se baseia na ligação e integração in vivo no genoma da célula hospedeira do gene marcador de seleção amplificável e do gene recombinante de interesse (Kaufman, et al. 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1750 a 1759).
[0012] Dado que os métodos atualmente disponíveis para obter linhagens celulares de empacotamento e produção transfectadas estáveis para produção de vetores retrovirais requerem integração sequencial dos genes retrovirais no genoma da célula hospedeira e que o local de cada evento de integração é aleatório e imprevisível, seria extremamente difícil obter uma linhagem celular em que todos os genes retrovirais fossem integrados nas proximidades do gene marcador de seleção amplificável para obter uma linhagem celular em que os genes retrovirais foram amplificados. Portanto, prevê-se que não será praticável empregar procedimentos de seleção estabelecidos usando marcadores de seleção amplificáveis para selecionar linhagens celulares que produzem altos títulos de vetores virais.
[0013] E, portanto, um objetivo da presente invenção prover um método para fazer linhagens celulares estáveis de empacotamento e produção retroviral que superem uma ou mais das desvantagens associadas aos métodos
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5/65 existentes.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0014] Os presentes inventores desenvolveram uma nova maneira de fazer linhagens celulares de empacotamento e produção retrovirais que envolvem o uso de vetores de ácidos nucleicos compreendendo uma origem de replicação não mamífera e a capacidade de reter pelo menos 25 kilobases (kb) de DNA, tais como cromossomos artificiais de bactérias, compreendendo os genes retrovirais essenciais para a produção do vetor retroviral e um gene marcador de seleção amplificável. Isto permite a expressão dos genes retrovirais necessários para a produção de partículas de vetores retrovirais defeituosos na replicação para melhorar os problemas associados aos métodos de transfecção transitória. Além disso, como todos os genes retrovirais essenciais e o gene marcador de seleção amplificável são transfectados para uma célula hospedeira em um único vetor de ácido nucleico, o vetor de ácido nucleico é integrado ao genoma do hospedeiro em um único locus. Isso melhora os problemas associados à transfecção sequencial, causando a integração dos genes retrovirais em diferentes loci no genoma do hospedeiro, bem como os problemas associados ao uso de marcadores de seleção amplificáveis para amplificar os genes retrovirais nas referidas células.
[0015] A utilização de um vetor de ácido nucleico compreendendo uma origem de replicação não mamífera e que tem a capacidade de reter pelo menos 25 kb de DNA (isto é, DNA de construção grande) tem várias vantagens. Em primeiro lugar, os vetores podem ser manipulados primeiro em células não mamíferas (por exemplo, células microbianas, tais como células bacterianas) em vez de células hospedeiras de mamíferos, o que as toma muito mais fáceis de usar (por exemplo, cromossomos bacterianos artificiais podem ser manipulados em E. coli). Uma vez que o vetor de ácido nucleico tenha sido preparado, ele pode ser introduzido em uma célula hospedeira de mamífero e quaisquer células de mamífero que possuam o vetor de ácido
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6/65 nucleico integrado nos cromossomos endógenos podem ser selecionadas para isolar uma linhagem celular estável.
[0016] A introdução dos ácidos nucleicos retrovirais na célula hospedeira dos mamíferos também ocorre em uma única etapa, o que ajuda a reduzir a pressão de seleção e o período de silenciamento. Isso permite uma triagem mais rápida de potenciais células de empacotamento e produção e reduz o custo dos materiais, porque apenas um único vetor é usado, em vez de métodos anteriores que usam vários vetores de plasmídeo. Em particular, o uso do sistema atual reduz o custo de fabricação, economizando nos custos dos plasmídeos, nos reagentes de transfecção necessários (por exemplo, polietilenimina [PEI]), reduzindo a quantidade de tratamento com benzonase necessária (há uma quantidade reduzida de DNA na coleta de lentivírus, portanto, menos benzonase é necessária para remover o excesso no processamento a jusante) e custo reduzido dos testes (não há necessidade de testar o plasmídeo residual no produto lentiviral).
[0017] Além disso, os genes retrovirais essenciais para a produção retroviral (com ou sem o vetor de transferência) e o gene marcador de seleção amplificável estão presentes no vetor de ácido nucleico, de modo que, quando o vetor é introduzido nas células hospedeiras dos mamíferos, todos os genes retrovirais e os genes marcadores de seleção amplificáveis se integrarão em um locus no genoma da célula hospedeira de mamífero. Isso pode superar problemas, como o silenciamento de genes, que podem ocorrer quando os genes retrovirais são integrados aleatoriamente e em diferentes locais no genoma da célula hospedeira. Isso também provê um procedimento para produzir uma célula de empacotamento ou produção com um alto título de partícula de vetor retroviral, em que a amplificação dos genes retrovirais não depende da ligação in vivo dos genes retrovirais ao marcador de seleção amplificável.
[0018] Portanto, de acordo com um primeiro aspecto da invenção, é
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7/65 provida uma célula de empacotamento retroviral compreendendo sequências de ácidos nucleicos que codificam:
proteínas gag e pol;
proteína env ou um substituto funcional da mesma; e um marcador de seleção amplificável;
como construtos de expressão individuais, em que os referidos construtos de expressão são todos integrados juntas em um único local no genoma da célula de empacotamento retroviral como uma unidade; e em que o número de cópias da unidade é dois ou mais.
[0019] Em um aspecto adicional da invenção, é provida uma célula produtora de retroviral compreendendo sequências de ácidos nucleicos que codificam:
proteínas gag e pol;
proteína env ou um substituto funcional da mesma;
um marcador de seleção amplificável; e um genoma de RNA de uma partícula de vetor retroviral, como construtos de expressão individuais, em que os referidos construtos de expressão são todos integrados em um único local no genoma da célula de produção retroviral como uma unidade; e em que o número de cópias da unidade é dois ou mais.
[0020] Em um aspecto alternativo da invenção, é provido um vetor de ácido nucleico compreendendo uma origem de replicação não mamífera e a capacidade de reter pelo menos 25 kilobases (kb) de DNA, caracterizado por o referido vetor de ácido nucleico compreender sequências de ácido nucleico que codificam:
proteínas gag e pol, uma proteína env ou um substituto funcional da mesma, e um marcador de seleção amplificável, em que cada uma das sequências de ácidos nucleicos é
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8/65 disposta como construtos de expressão individuais dentro do vetor de ácido nucleico.
[0021] Em ainda outro aspecto da invenção, é provido um método para produzir uma linhagem celular de empacotamento retroviral estável, compreendendo as etapas de:
(a) transfectar o vetor de ácido nucleico aqui definido em uma cultura de células hospedeiras de mamíferos;
(b) cultivar as células hospedeiras de mamíferos transfectadas em um meio que contém uma concentração de um agente de seleção que inibe o crescimento das células de mamíferos transfectadas que expressam níveis insuficientes do marcador de seleção amplificável; e (c) selecionar células hospedeiras de mamífero transfectadas capazes de crescer no referido meio, em que as células hospedeiras de mamífero transfectadas selecionadas contêm um número amplificado de cópias do vetor de ácido nucleico integrado no genoma da célula hospedeira de mamífero transfectada.
[0022] Em um aspecto alternativo da invenção, é provida uma célula de empacotamento retroviral obtida pelo método aqui descrito.
[0023] Em um aspecto adicional da invenção, é provido um método para a produção de uma linhagem de células de produção retrovirais estáveis, compreendendo as etapas de:
(a) transfectar o vetor de ácido nucleico aqui definido em uma cultura de células hospedeiras de mamíferos;
(b) cultivar as células hospedeiras de mamíferos transfectadas em um meio que contém uma concentração de um agente de seleção que inibe o crescimento das células hospedeiras de mamíferos transfectadas que expressam níveis insuficientes do marcador de seleção amplificável; e (c) selecionar células hospedeiras de mamífero transfectadas capazes de crescer no referido meio, em que as células hospedeiras de
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9/65 mamífero transfectadas selecionadas contêm um número amplificado de cópias do vetor de ácido nucleico integrado no genoma da célula hospedeira de mamífero transfectada.
[0024] Ainda em um aspecto adicional da invenção, é provida uma célula de produção retroviral obtida pelo método aqui descrito.
[0025] Em um aspecto alternativo da invenção, é provido um método para produzir uma partícula de vetor retroviral com defeito de replicação, compreendendo as etapas de:
(a) transfectar o vetor de ácido nucleico aqui definido em uma cultura de células hospedeiras de mamíferos;
(b) cultivar as células hospedeiras de mamíferos transfectadas em um meio que contém uma concentração de um agente de seleção que inibe o crescimento das células hospedeiras de mamíferos transfectadas que expressam níveis insuficientes do marcador de seleção amplificável;
(c) selecionar células hospedeiras de mamífero transfectadas capazes de crescer no referido meio, em que as células hospedeiras de mamífero transfectadas selecionadas contêm um número amplificado de cópias do vetor de ácido nucleico integrado no genoma da célula hospedeira de mamífero transfectada; e (d) cultivar adicionalmente as células hospedeiras de mamífero selecionadas na etapa (c) sob condições nas quais a partícula do vetor retroviral com defeito de replicação é produzida.
[0026] Em um aspecto adicional da invenção, é provida uma partícula de vetor retroviral com defeito de replicação obtida pelo método aqui descrito.
FIGURAS [0027] FIGURA 1: Um guia passo a passo para a construção de BACpack-WTGP-277delU5 e BACpack-SYNGP-277delU5.
[0028] FIGURA 2: Seleção de um agrupamento policlonal estável.
As células aderentes HEK293T foram transfectadas com
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BACpackWTGagPol-Transfer usando fosfato de cálcio. Agrupamentos estáveis foram gerados após duas semanas de seleção de Zeocin. Para verificar se os transfectantes estáveis eram capazes de gerar vírus, os poliagrupamentos estáveis foram induzidos com doxiciclina por 48 horas. O sobrenadante viral foi coletado 48 horas após a indução, filtrado através de um filtro de 0,22 pm e titulado pela transdução de células HEK293T. As células transduzidas positivas para GFP foram usadas para calcular as Unidades Transdutoras/ml (TU/mL).
[0029] FIGURA 3: Gerando clones de suspensão de transfecção estáveis. As células HEK293 6E foram transfectadas com BACpackWTGagPol-Transfer usando reagente 293fectina. Agrupamentos estáveis foram gerados após duas semanas de seleção de Zeocina. Os agrupamentos estáveis foram clonados por limitação da diluição em placas de 96 poços para obter clones de célula única, que foram posteriormente expandidos. GFP detectado por microscopia de fluorescência dos melhores clones 1, 14, 15 e 16, obtidos com meio aderente (DMEM + FBS) seguido de adaptação da suspensão (meio FreeStyle).
[0030] FIGURA 4: Indução de lentivírus nos clones de suspensão. Para verificar se os transfectantes HEK6E estáveis eram capazes de gerar vírus, 20 ml dos clones de suspensão estáveis foram induzidos com Doxiciclina (2 pg/ml) por 48 horas. O sobrenadante viral foi coletado 48 horas após a indução, filtrado através de um filtro de 0,45 pm e titulado por transdução de células HEK293T. As células transduzidas positivas para GFP foram usadas para calcular as Unidades Transdutoras/ml (TU/mL).
[0031] FIGURA 5: Títulos de vetor de clones produzidos de acordo com o Exemplo 4. Os resultados mostram títulos de vetor dos clones 1 e 16 aumentados modestamente entre a passagem 5 e a passagem 21.
[0032] FIGURA 6: Um guia passo a passo para a construção de BACpack-WTGP-DHFR-277delU5 e BACpack-SYNGP-DHFRPetição 870190099643, de 04/10/2019, pág. 19/95
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277delU5.
[0033] FIGURA 7: Sequência de ácido nucleico de um construto de expressão compreendendo um gene dhfr.
[0034] FIGURA 8: Um guia passo a passo para a construção de BAC2.0 GS.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
DEFINIÇÕES [0035] A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é comumente entendido por uma pessoa versada na técnica à qual esta invenção pertence. Todas as patentes e publicações aqui referidas são incorporadas por referência na sua totalidade.
[0036] O termo “compreendendo” abrange “incluindo” ou “consistindo”, por exemplo, uma composição “compreendendo” X pode consistir exclusivamente em X ou pode incluir algo adicional, por exemplo, X + Y.
[0037] O termo “consistindo essencialmente em” limita o escopo do recurso aos materiais ou etapas especificados e àqueles que não afetam materialmente as características básicas do recurso reivindicado.
[0038] O termo “consistindo em” exclui a presença de qualquer componente adicional.
[0039] O termo “cerca de” em relação a um valor numérico x significa, por exemplo, x ± 10%, 5%, 2% ou 1%.
[0040] O termo “vetor” ou “vetor de ácido nucleico” se refere a um veículo capaz de transportar artificialmente material genético estranho (isto é, exógeno) para outra célula, onde pode ser replicado e/ou expresso. Exemplos de vetores incluem vetores de ácido nucleico não mamíferos, como cromossomos artificiais bacterianos (BACs), cromossomos artificiais de levedura (YACs), cromossomos artificiais derivados de PI (PACs),
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12/65 cosmídeos ou fosmídeos. O termo “vetor de ácido nucleico”, conforme usado aqui no contexto da integração em um genoma da célula hospedeira, refere-se ao DNA originário do vetor de ácido nucleico que foi integrado ao genoma da célula hospedeira.
[0041] Outros exemplos de vetores incluem vetores virais, como vetores retrovirais e lentivirais, que são de particular interesse no presente pedido. Os vetores lentivirais, como os baseados no Vírus da Imunodeficiência Humana Tipo 1 (HIV-1), são amplamente utilizados, pois são capazes de integrar células não proliferativas. Os vetores virais podem tomar a replicação defeituosa dividindo o genoma viral em partes separadas, por exemplo, colocando plasmídeos separados. Por exemplo, a chamada primeira geração de vetores lentivirais, desenvolvida pelo Instituto Salk de Estudos Biológicos, foi construída como um sistema de expressão de três plasmídeos que consiste em um cassete de expressão de embalagem, o cassete de expressão de envelope e o cassete de expressão de vetor de transferência. O “plasmídeo de embalagem” contém todas as sequências gag-pol, as sequências reguladora (tat e rev) e acessória (vif, vpr, vpu, nef). O “plasmídeo envelope” mantém a glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSVg) em substituição à proteína envelope de HIV-1 nativa, sob o controle de um promotor de citomegalovírus (CMV). O terceiro plasmídeo (o “plasmídeo de transferência” ou “vetor de transferência”) transporta entre as Repetições Longas de Terminal (LTRs), o transgene, a sequência de encapsulamento (ψ), a sequência do Elemento de Resposta de Rev (RRE) e o promotor do CMV para expressar o transgene dentro da célula hospedeira.
[0042] A segunda geração do vetor lentiviral foi caracterizada pela exclusão das sequências de virulência vpr, vif, vpu e nef. O vetor de empacotamento foi reduzido aos genes gag, pol, tat e rev, aumentando assim a segurança do sistema.
[0043] Para melhorar o sistema lentiviral, os vetores de terceira
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13/65 geração foram projetados removendo o gene tat do construto de empacotamento e inativando o LTR do cassete de vetor, reduzindo assim os problemas relacionados aos efeitos da mutagênese insercional.
[0044] As várias gerações de lentivírus são descritas nas seguintes referências: Primeira geração: Naldini et al. (1996) Science 272 (5259): 263 a 267; Segunda geração: Zufferey et al. (1997) Nat. Biotechnol. 15 (9): 871 a 875; Terceira geração: Dull et al. (1998) J. Virol. 72 (11): 8463 a 8467, todos os quais são incorporados aqui por referência na sua totalidade. Uma revisão sobre o desenvolvimento de vetores lentivirais pode ser encontrada em Sakuma et al. (2012) Biochem. J. 443 (3): 603 a 618 e Picanço-Castro et al. (2008) Exp. Opin. Therap. Patentes 18 (5): 525 a 539.
[0045] O termo “origem de replicação não mamífera” se refere a uma sequência de ácido nucleico em que a replicação é iniciada e que é derivada de uma fonte não mamífera. Isso permite que os vetores de ácidos nucleicos da invenção se repliquem e segregem de forma estável ao longo dos cromossomos endógenos em uma célula hospedeira adequada (por exemplo, uma célula microbiana, como uma célula bacteriana ou de levedura), de modo que seja transmissível para a progênie da célula hospedeira, exceto quando a célula hospedeira é uma célula hospedeira de mamífero. Nas células hospedeiras de mamíferos, os vetores de ácidos nucléicos com origens de replicação não mamíferas se integrarão nos cromossomos endógenos da célula hospedeira de mamíferos ou serão perdidos com a replicação de células hospedeiras de mamíferos. Por exemplo, vetores de ácidos nucléicos com origens de replicação não mamíferas, como cromossomos artificiais bacterianos (BAC), cromossomo artificial derivado de Pl (PAC), cosmídeos ou fosmídeos, são capazes de replicar e segregar de maneira estável e segregar ao lado de cromossomos endógenos em células bacterianas (como E. coli), no entanto, se forem introduzidas nas células hospedeiras dos mamíferos, BAC, PAC, cosmídeo ou fosmídeo se integrarão ou serão
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14/65 perdidos com a replicação das células hospedeiras de mamíferos. Os cromossomos artificiais de levedura (YAC) são capazes de se replicar e segregar de forma estável ao lado dos cromossomos endógenos nas células de levedura; no entanto, se forem introduzidos nas células hospedeiras de mamíferos, o YAC se integrará ou será perdido na replicação de células hospedeiras de mamíferos. Portanto, neste contexto, os vetores de ácidos nucleicos da invenção atuam como reservatórios de DNA (isto é, para os genes essenciais para a produção retroviral) que podem ser facilmente transferidos para células hospedeiras de mamíferos para gerar linhagens celulares estáveis para produção retroviral. Exemplos de origens de replicação não mamíferas incluem origens de replicação bacterianas, como oriC, oriV ou oriS ou origens de replicação de leveduras, também conhecidas como Sequências de Replicação Autônoma (elementos ARS).
[0046] Os vetores de ácido nucleico da presente invenção compreendem uma origem de replicação não mamífera e são capazes de reter pelo menos 25 kilobases (kb) de DNA. Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico tem a capacidade de reter pelo menos 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340 ou 350 kb de DNA. Será entendido que as referências à “capacidade de retenção” têm seu significado usual e implica que o limite superior para o tamanho da inserção do vetor de ácido nucleico não seja menor que o tamanho reivindicado (isto é, não menos que 25 kb de DNA).
[0047] O objetivo da presente invenção é incluir os genes essenciais para o empacotamento retroviral e um gene marcador de seleção amplificável em um único construto (isto é, o vetor de ácido nucleico). Portanto, o vetor de ácido nucleico da invenção deve ser capaz de reter grandes inserções de DNA. Para evitar dúvidas, entender-se-á que as referências a “vetores de ácidos nucléicos” ou “cromossomos artificiais” não se referem a plasmídeos
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15/65 bacterianos naturais (por exemplo, como os plasmídeos atualmente usados em métodos de transfecção transitória) porque eles não são capazes de reter pelo menos 25 kb de DNA. A inserção de tamanho máximo que um plasmídeo pode conter é de cerca de 15 kb. Tais vetores de ácido nucleico também não se referem a bacteriófagos que geralmente contêm apenas inserções máximas de 5 a 11 kb. Portanto, em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico da invenção não é um plasmídeo, bacteriófago ou epissoma.
[0048] O termo “cromossomos endógenos” (ou genoma da célula hospedeira) refere-se a cromossomos genômicos encontrados na célula hospedeira antes da geração ou introdução de um vetor de ácido nucleico exógeno, como um cromossomo artificial bacteriano.
[0049] Os termos “transfecção”, “transformação” e “transdução”, conforme usados aqui, podem ser usados para descrever a inserção do vetor não mamífero ou viral em uma célula alvo (isto é, célula hospedeira). A inserção de um vetor é geralmente chamada de transformação para células bacterianas e transfecção para células eucarióticas, embora a inserção de um vetor viral também possa ser chamada de transdução. O especialista estará ciente dos diferentes métodos de transfecção não viral comumente usados, que incluem, entre outros, o uso de métodos físicos (por exemplo, eletroporação, compressão de células, sonoporação, transfecção óptica, fusão de protoplastos, impalefecção, magnetofecção, pistola de genes ou bombardeio de partículas), reagentes químicos (por exemplo, fosfato de cálcio, compostos orgânicos altamente ramificados ou polímeros catiônicos) ou lipídios catiônicos (por exemplo, lipofecção). Muitos métodos de transfecção requerem o contato de soluções de DNA plasmídico com as células, que são então cultivadas e selecionadas para uma expressão do gene marcador.
[0050] O termo “promotor” se refere a uma sequência que impulsiona a expressão do gene. Para gerar um alto nível de expressão, pode ser benéfico
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16/65 usar um promotor de alta eficiência, como um promotor não retroviral de alta eficiência. Exemplos de promotores adequados podem incluir um promotor, como o promotor imediato de citomegalovírus humano (CMV), promotor de vírus formador de foco no baço (SFFV), promotor vírus do sarcoma de Rous (RSV) ou promotor de fator de alongamento humano 1-alfa (pEF).
[0051] Um operon Tet (ativação transcricional controlada por tetraciclina) pode ser usado em um método de expressão genética induzível, em que a transcrição é ativada ou desativada reversivelmente na presença do antibiótico tetraciclina ou de um de seus derivados (por exemplo, doxiciclina). Na natureza, o promotor Ptet expressa TetR, o repressor e TetA, a proteína que bombeia o antibiótico da tetraciclina para fora da célula. Na presente invenção, o operon Tet pode estar presente ou ausente, por exemplo, em uma modalidade, o operon Tet pode estar presente no promotor.
[0052] O termo “sinal de poliA” se refere a uma sequência de sinal de poliadenilação, por exemplo, colocada a 3’ de um transgene, que permite que os fatores hospedeiros adicionem uma cauda de poliadenosina (poliA) ao final do mRNA nascente durante a transcrição. A cauda poliA é um trecho de até 300 ribonucleotídeos de adenosina que protege o mRNA da degradação enzimática e também ajuda na tradução. Por conseguinte, os vetores de ácido nucleico da presente invenção podem incluir uma sequência de sinais poliA, como os sinais poliA beta globina humana ou beta globina de coelho, os sinais poliA iniciais ou tardios do vírus simiano 40 (SV40), o sinal insulina humana poliA ou o sinal poliA do hormônio de crescimento bovino. Em uma modalidade, a sequência do sinal poliA é o sinal poliA da beta globina humana.
[0053] O termo “sequência de introns” se refere a uma sequência de nucleotídeos que é removida do produto genético final por união de RNA. Foi demonstrado que a utilização de um intron a jusante da região potenciadora/promotora e a montante da inserção de cDNA aumenta o nível
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17/65 de expressão gênica. O aumento na expressão depende da inserção particular de cDNA. Por conseguinte, o vetor de ácido nucleico da presente invenção pode incluir introns como o intron beta globina humano, intron beta globina de coelho II ou um íntron quimérico beta globina-imunoglobulina humano. Em uma modalidade, o íntron é um íntron beta globina humano e/ou íntron beta globina de coelho II.
[0054] O termo “linhagem celular de empacotamento” se refere a uma linhagem celular com genes de proteína gag e pol inseridos de maneira estável e glicoproteína envelope. Alternativamente, o termo “linhagem celular produtora” se refere a uma linhagem celular de empacotamento com componentes de “vetor de transferência” inseridos de forma estável (como usados em métodos de transfecção transitórios) contendo um transgene de interesse entre as sequências de LTR, como descrito acima. Será entendido por uma pessoa versada na técnica que os vetores de ácido nucleico aqui descritos podem ser usados para gerar linhagens celulares de empacotamento (isto é, quando pelo menos os genes gag, pol e env estão presentes no vetor de ácido nucleico e incorporados a uma célula hospedeira) ou linhagens celulares produtoras (isto é, quando o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente os componentes do vetor de transferência a serem incorporados em uma célula hospedeira juntamente com os genes gag, pol e env).
[0055] O termo “transfectada de forma estável” se refere a linhagens celulares que são capazes de transmitir genes retrovirais introduzidos para sua progênie (isto é, células filhas), seja porque o DNA transfectado foi incorporado nos cromossomos endógenos ou por herança estável de cromossomos exógenos.
[0056] Os termos “construto de expressão” e “cassete de expressão” são usados de forma intercambiável e, como aqui utilizado, referem-se a uma unidade de expressão funcional, capaz de conduzir a expressão de um ou mais
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18/65 polinucleotídeos incorporados. Tais cassetes geralmente incluem o polinucleotídeo e os componentes necessários para a transcrição e tradução do polinucleotídeo. Por exemplo, a cassete pode incluir uma sequência de ácido nucleico (isto é, DNA recombinante) incluindo um promotor, um sinal de sequência de iniciação da tradução, um terminador de transcrição (por exemplo, uma sequência poliA) e/ou uma sequência peptídica de autoclivagem (por exemplo, sequência P2A). Em uma modalidade, o cassete de expressão individual compreende um promotor e/ou um terminador de transcrição. Em uma modalidade, o cassete de expressão individual compreende dois genes separados por um IRES que são ambos transcritos a partir de um único promotor. O construto também pode conter quaisquer outros componentes adicionais conhecidos na técnica que podem melhorar ou prover maior controle da transcrição e tradução do polinucleotídeo. Em uma modalidade, os componentes adicionais podem ser quaisquer sequências de ácidos nucleicos do genoma SV40.
VETORES DE ÁCIDO NUCLEICO [0057] De acordo com um aspecto da invenção, é provido um vetor de ácido nucleico compreendendo uma origem de replicação não mamífera e a capacidade de reter pelo menos 25 kilobases (kb) de DNA, caracterizado por o referido vetor de ácido nucleico compreender sequências de ácido nucleico que codificam:
proteínas gag e pol, uma proteína env ou um substituto funcional da mesma, e um marcador de seleção amplificável, em que cada uma das sequências de ácidos nucleicos é disposta como construtos de expressão individuais dentro do vetor de ácido nucleico.
[0058] Os métodos atuais para gerar partículas de vetores retrovirais envolvem transfecção transitória dos genes retrovirais em uma célula
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19/65 hospedeira. No entanto, muitas desvantagens foram associadas a esse método, pois é caro, trabalhoso e difícil de expandir. Uma solução seria projetar uma linhagem celular de empacotamento que incorpore estavelmente os genes de empacotamento retroviral para evitar os problemas associados à transfecção transitória.
[0059] Os presentes inventores constataram que os vetores de ácido nucleico aqui descritos podem ser utilizados para gerar uma linhagem celular de empacotamento ou produção retroviral que melhora as dificuldades anteriores associadas aos métodos de produção de vetores retrovirais. Por exemplo, métodos conhecidos de produção de linhagens celulares de empacotamento retroviral envolvem múltiplas rodadas de seleção após a introdução de cada gene retroviral. Esse processo pode levar até seis meses e exige muito trabalho. Mesmo após a obtenção de uma linhagem celular de empacotamento após o longo e trabalhoso processo, houve relatos de uma queda significativa na produtividade do vetor viral durante a adaptação da suspensão e a ampliação das linhagens celulares de empacotamento.
[0060] Ao incluir todos os genes retrovirais no vetor de ácido nucleico, os genes retrovirais podem então ser inseridos no cromossomo endógeno de uma célula hospedeira de mamífero em uma única etapa. Portanto, o uso de um vetor de ácido nucleico, como proposto aqui, reduziría a pressão de seleção, reduziría o período de silenciamento e permitiría uma triagem mais rápida de possíveis células de empacotamento.
[0061] Além disso, os genes retrovirais do vetor de ácido nucleico seriam todos integrados no cromossomo endógeno da célula hospedeira de mamífero em um único local, o que reduziría o risco de genes retrovirais individuais serem silenciados e permitiría a expressão uniforme de todos os genes retrovirais.
[0062] A integração em um único local no genoma da célula hospedeira permite um procedimento para amplificar os genes retrovirais
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20/65 usando um gene marcador de seleção amplificável, em que a amplificação dos genes retrovirais não depende da ligação in vivo dos genes retrovirais ao marcador de seleção amplificável, como seria necessário se os genes retrovirais não fossem integrados juntos em um único local.
[0063] Portanto, usando o vetor de ácido nucleico aqui descrito, é possível selecionar uma célula de empacotamento ou produção com genes retrovirais amplificados, resultando em um título melhorado de partículas de vetores retrovirais.
[0064] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente sequências de ácido nucleico que codificam o genoma de RNA da partícula de vetor retroviral. Quando essa sequência de ácido nucleico é transcrita, ela fica encapsidada dentro da partícula de vetor retroviral produzida pela célula e, portanto, atua como o genoma da partícula de vetor retroviral. Será entendido que as sequências de ácidos nucleicos que codificam o genoma do RNA da partícula do vetor retroviral geralmente são incluídas no “vetor de transferência” usado nos métodos de transfecção transitória. O plasmídeo do vetor de transferência geralmente contém um promotor (como SV40) operacionalmente ligado a um transgene (e opcionalmente um sinal de poliadenilação e, opcionalmente, sequências de ácidos nucleicos para controle/aprimoramento da transcrição e expressão do transgene) e uma sequência de encapsidação (ψ) entre duas sequências LTR; o 3’LTR (que pode ou não ser uma inativação automática (ou seja, SIN) 3’LTR) e o 5’LTR (que pode ou não conter a região U5). Portanto, em uma modalidade, o genoma de RNA da partícula de vetor retroviral compreende um ou mais transgenes codificados entre duas LTRs.
[0065] Em uma modalidade, várias cópias das sequências de ácidos nucleicos que codificam o genoma de RNA da partícula do vetor retroviral (isto é, componentes do “vetor de transferência”) são incluídas no vetor de ácidos nucleicos. Espera-se que várias cópias do vetor de transferência
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21/65 resultem em um título de vetor viral mais alto. Por exemplo, o vetor de ácido nucleico pode incluir duas ou mais, como três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez ou mais cópias das sequências de ácidos nucleicos que codificam o genoma de RNA da partícula do vetor retroviral (ou seja, o vetor de transferência).
[0066] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico contém um ou vários locais de recombinação. Isto permite que as sequências alvo sejam integradas nos cromossomos endógenos da célula hospedeira de mamífero de uma maneira específica do local na presença de uma enzima recombinase. A enzima recombinase catalisa a reação de recombinação entre dois locais de recombinação.
[0067] Muitos tipos de sistemas de recombinação específicos do local são conhecidos na técnica, e qualquer sistema de recombinação adequado pode ser utilizado na presente invenção. Por exemplo, em uma modalidade, os locais de recombinação são selecionados ou derivados do sistema int/att do fago lambda, do sistema Cre/lox do bacteriófago Pl, do sistema de levedura FLP/FRT, do sistema de recombinase Gin/gix de fago Mu, o sistema de recombinase Cin, o sistema de recombinase Pin de E. coli e o sistema R/RS do plasmídeo pSRl, ou qualquer combinação dos mesmos. Em uma modalidade adicional, o local de recombinação é um local att (por exemplo, a partir de fago lambda), em que o local att permite a integração direcionada ao local na presença de uma integrase lambda. Será entendido que a referência a “integrase lambda” inclui referências a integrase mutante que ainda são compatíveis com o sistema int/att, por exemplo, as integrase lambda modificadas descritas em WO 2002/097059.
[0068] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico é selecionado dentre: um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um cromossomo artificial de levedura (YAC), um cromossomo artificial derivado de Pl (PAC), fosmídeo ou cosmídeo. Em uma modalidade adicional, o vetor de
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22/65 ácido nucleico é um cromossomo artificial bacteriano (BAC).
Cromossomos artificiais bacterianos [0069] O termo “cromossomo artificial bacteriano” ou “BAC” se refere a um construto de DNA derivado de plasmídeos bacterianos que é capaz de reter uma grande inserção de DNA exógeno. Eles geralmente podem conter uma inserção máxima de DNA de aproximadamente 350 kb. Os BACs foram desenvolvidos a partir do bem caracterizado plasmídeo de fertilidade funcional bacteriana (plasmídeo F) que contém genes de partição que promovem a distribuição uniforme dos plasmídeos após a divisão celular bacteriana. Isso permite que os BACs sejam replicados e segregados de maneira estável ao lado de genomas bacterianos endógenos (como E. colí). O BAC geralmente contém pelo menos uma cópia de uma origem de replicação (como o gene oriS ou oriV), o gene repE (para replicação de plasmídeos e regulação do número de cópias) e genes de partição (como sopA, sopB, parA, parB e/ou parC) que garante a manutenção estável do BAC nas células bacterianas. Os BACs são naturalmente circulares e superenrolados, o que os toma mais fáceis de recuperar do que os cromossomos artificiais lineares, como os YACs. Eles também podem ser introduzidos nas células hospedeiras bacterianas com relativa facilidade, usando métodos simples, como eletroporação.
[0070] Em uma modalidade, o cromossomo artificial bacteriano compreende um gene oriS. Em uma modalidade, o cromossomo artificial bacteriano compreende um gene repE. Em uma modalidade, o cromossomo artificial bacteriano compreende genes de partição. Em uma modalidade adicional, os genes de partição são selecionados a partir de sopA, sopB, par A, parB e/ou parC. Ainda em uma modalidade adicional, o cromossomo artificial bacteriano compreende um gene sopA e sopB.
[0071] O BAC para uso na presente invenção pode ser obtido de fontes comerciais, por exemplo, o pSMART BAC da LUCIGEN™ (consulte
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23/65 o No. de Acesso ao Genoma EU101022.1 para a sequência completa dos ossos das costas). Esse BAC contém o sistema de “cópia” de L-arabinose, que também contém a origem da replicação oriV da cópia média, que é ativa apenas na presença da proteína de replicação TrfA. O gene para TrfA pode ser incorporado no genoma de células hospedeiras bacterianas sob controle do promotor induzível por L arabinose araC-PBAD (consulte Wild et al. (2002) Genome Res. 12 (9): 1434 a 1444). A adição de L-arabinose induz a expressão de TrfA, que ativa o oriV, fazendo com que o plasmideo se replique em até 50 cópias por célula.
Cromossomos artificiais de levedura [0072] O termo “cromossomo artificial de levedura” ou “YAC” se refere a cromossomos nos quais o DNA de levedura é incorporado em plasmídeos bacterianos. Eles contêm uma sequência de replicação autônoma (ARS) (isto é, uma origem de replicação), um centrômero e telômeros. Ao contrário dos BACs, o YAC é linear e, portanto, contém telômeros de levedura em cada extremidade do cromossomo para proteger as extremidades da degradação à medida que são transmitidas à progênie da célula hospedeira. Os YACs podem conter uma variedade de tamanhos de inserções de DNA; qualquer coisa entre 100 a 2.000 kb.
Cromossomos artificiais derivados de PI [0073] O termo “cromossomo artificial derivado de Pl” ou “PAC” se refere a construtos de DNA derivados do DNA do bacteriófago Pl e do plasmideo F bacteriano. Eles geralmente podem conter uma inserção máxima de DNA de aproximadamente 100 a 300 kb e são usados como vetores de clonagem em E. coli. Os PACs têm vantagens semelhantes às dos BACs, por serem fáceis de purificar e introduzir nas células hospedeiras bacterianas.
Cosmídeos efosmídeos [0074] O termo “cosmídeo” se refere a construtos de DNA derivados de plasmídeos bacterianos que contêm adicionalmente locais cos derivados de
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24/65 bacteriófagos lambda. Os cosmídeos geralmente contêm uma origem bacteriana de replicação (como oriV), um marcador de seleção, um local de clonagem e pelo menos um local cos. Os cosmídeos geralmente podem aceitar uma inserção máxima de DNA de 40 a 45 kb. Demonstrou-se que os cosmídeos são mais eficientes na infecção de células de E. coli do que os plasmídeos bacterianos padrão. O termo “fosmídeos” se refere a vetores de ácidos nucleicos não mamíferos que são semelhantes aos cosmídeos, exceto que eles são baseados no plasmídeo F bacteriano. Em particular, eles usam a origem do plasmídeo F de mecanismos de replicação e particionamento para permitir a clonagem de grandes fragmentos de DNA. Os fosmídeos geralmente podem aceitar uma inserção máxima de DNA de 40 kb.
RETROVÍRUS [0075] Os retrovirus são uma família de vírus que contêm um genoma de RNA de cadeia simples pseudo-diplóide. Eles codificam uma transcriptase reversa que produz DNA a partir do genoma do RNA que pode ser inserido no DNA da célula hospedeira. A invenção aqui descrita pode ser usada para produzir partículas de vetores retrovirais com defeito de replicação. A partícula de vetor retroviral da presente invenção pode ser selecionada ou derivada de qualquer retrovirus adequado.
[0076] Em uma modalidade, a partícula de vetor retroviral é derivada de, ou selecionada de, um lentivírus, alfa-retrovírus, gama-retrovírus ou retrovirus espumoso, como um lentivírus ou gama-retrovírus, em particular um lentivírus. Em uma modalidade adicional, a partícula de vetor retroviral é um lentivírus selecionado do grupo que consiste em HIV-1, HIV-2, SIV, FIV, EIAV e Visna. Os lentivírus são capazes de infectar células não divididas (isto é, inativas), o que os toma vetores retrovirais atraentes para terapia genética. Ainda em uma modalidade adicional, a partícula de vetor retroviral é HIV-1 ou é derivada do HIV 1. A estrutura genômica de alguns retrovirus pode ser encontrada na técnica. Por exemplo, detalhes sobre o HIV-1 podem
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25/65 ser encontrados no NCBI Genbank (No. de Acesso ao Genoma AF033819). O HIV-1 é um dos retrovirus mais bem compreendidos e, portanto, é frequentemente usado como um vetor retroviral.
Genes Retrovirais [0077] As sequências de ácidos nucleicos comuns a todos os retrovirus podem ser explicadas em mais detalhes, como segue.
[0078] Repetições terminais longas (LTRs): a estrutura básica de um genoma de retrovirus compreende uma 5’-LTR e uma 3’-LTR, entre ou dentro da qual estão localizados os genes necessários para a produção de retrovirus. As LTRs são necessárias para integração e transcrição retroviral. Elas também podem atuar como sequências promotoras para controlar a expressão dos genes retrovirais (isto é, são genes de ação eis). As LTRs são compostas de três sub-regiões designadas U3, R, U5: U3 é derivada da sequência exclusiva da extremidade 3’ do RNA; R é derivada de uma sequência repetida em ambas as extremidades do RNA; e U5 é derivada da sequência exclusiva da extremidade 5’ do RNA. Portanto, em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente uma LTR 5’ e 3’. Em uma modalidade adicional, a região U5 da 5 ‘LTR pode ser excluída e substituída por uma cauda poliA não-HIV-1 (ver Hanawa et al. (2002) Mol. Ther. 5 (3): 242 a 251).
[0079] Para tratar de questões de segurança relacionadas à geração de vírus competentes para replicação, um vetor autoinativador (SIN) foi desenvolvido pela exclusão de uma seção na região U3 da 3' LTR, que inclui a caixa TATA e locais de ligação para fatores de transcrição Spl e NF-kB (ver Miyoshi et al. (1998) J. Virol. 72 (10): 8150 a 8157). A deleção é transferida para a 5’ LTR após transcrição reversa e integração em células infectadas, o que resulta na inativação transcricional da LTR. Isto é conhecido como um sistema de vetor baseado em lentivírus auto-inativador que pode ser incluído na presente invenção.
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26/65 [0080] ψ: a encapsidação dos RNAs retrovirais ocorre em virtude de uma sequência ‘(psi) localizada na extremidade 5’ do genoma retroviral. Também é bem conhecido na técnica que sequências a jusante da sequência psi e que se estendem para a região de codificação de gag estão envolvidas na produção eficiente de vetores retrovirais (ver Cui et al. (1999) J. Virol. 73 (7): 6171 a 6176). Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente uma sequência ψ (psi).
[0081] Local de ligação do primer (PBS): o genoma retroviral contém um PBS que está presente após a região U5 da 5’-LTR. Este local se liga ao iniciador de tRNA necessário para o início da transcrição reversa. Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente uma sequência de PBS.
[0082] PPT: os genomas retrovirais contêm trechos curtos de purinas, chamadas tratos polipurínicos (PPTs), próximos à extremidade 3’ do genoma retroviral. Esses PPTs funcionam como primers de RNA para a síntese de DNA de cadeia positiva durante a transcrição reversa. Retrovirus complexos (como o HIV-1) contêm um segundo PPT mais centralmente localizado (isto é, um trato polipurina central (cPPT)) que provê um segundo local para o início da síntese de DNA. Demonstrou-se que os vetores retrovirais que codificam um cPPT apresentam uma transdução e expressão de transgene melhoradas (ver Barry et al. (2001) Hum. Gene Ther. 12 (9): 1103 a 1108). Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente uma sequência de 3’-PPT e/ou uma sequência de cPPT.
[0083] A estrutura genômica das regiões não codificantes descritas acima é bem conhecida de uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, detalhes sobre a estrutura genômica das regiões não codificantes do HIV-1 podem ser encontrados no NCBI Genbank com o número de acesso ao genoma AF033819 ou no HIV-1 HXB2 (uma cepa de referência comumente usada para o HIV-1) com o Número de acesso ao Genoma K03455. Em uma
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27/65 modalidade, as regiões não codificantes são derivadas das sequências disponíveis no número de acesso ao genoma K03455, por exemplo, dos pares de bases 454-1126 (para R-U5-PBS-Gag), 7622-8479 (para RRE) ou 77698146 (para RRE), 4781-4898 (para cPPT), 9015-9120 e 9521-9719 (para dNEF-PPT-sinU3-R-U5).
[0084] Gag/pol: A expressão dos genes gag e pol se baseia em um deslocamento de quadros de tradução entre gag e gagpol. Ambas são poliproteínas que são clivadas durante a maturação. As principais proteínas estruturais da matriz, capsídeo e nucleocapsídeo do vetor retroviral são codificadas por gag. O gene pol codifica as enzimas retrovirais: i) transcriptase reversa, essencial para a transcrição reversa do genoma do RNA retroviral em DNA de fita dupla; ii) integrase, que permite a integração do genoma do DNA retroviral em um cromossomo da célula hospedeira; e iii) protease, que cliva a poliproteína sintetizada para produzir as proteínas maduras e funcionais do retrovirus. Em uma modalidade, a sequência de ácido nucleico retroviral que codifica as proteínas gag e pol é derivada da sequência HIV-1 HXB2, que está disponível no número de acesso ao genoma K03455, por exemplo, dos pares de bases 790-5105.
[0085] Env: o gene env (“envelope”) codifica os componentes da superfície e transmembrana do envelope retroviral (por exemplo, glicoproteínas gpl20 e gp41 do HIV-1) e está envolvido na fusão da membrana das células retrovirais. A fim de ampliar o tropismo de tecido do vetor retroviral, os vetores retrovirais aqui descritos podem ser pseudotipados com uma proteína envelope de outro vírus. Pseudotipagem se refere ao processo pelo qual a faixa de células hospedeiras de vetores retrovirais, incluindo vetores lentivirais, pode ser expandida ou alterada alterando as glicoproteínas (GPs) nas partículas de vetores retrovirais (por exemplo, usando GPs obtidos ou derivados de outros vírus envelopados ou usando GP sintéticos/artificiais). A glicoproteína mais comumente usada para
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28/65 pseudotipagem de vetores retrovirais é o vírus da estomatite vesicular GP (VSVg), devido ao seu amplo tropismo e alta estabilidade de partículas vetoriais. No entanto, será entendido pelo especialista que outras glicoproteínas podem ser usadas para pseudotipagem (ver Cronin et al. (2005) Curr. Gene Ther. 5 (4): 387 a 398, aqui incorporado por referência em sua totalidade). A escolha do vírus usado para a pseudotipagem também pode depender do tipo de célula e/ou órgão a ser alvejado, porque alguns pseudotipos demonstraram ter preferências de tipo de tecido. Em uma modalidade, o substituto funcional da proteína env é uma glicoproteína do vírus da estomatite vesicular.
[0086] Em uma modalidade, a proteína env ou um substituto funcional da mesma é obtida ou derivada de um vírus selecionado de um Vesiculovirus (por exemplo, vírus da estomatite vesicular), Lyssavírus (por exemplo, vírus da Raiva, vírus de Mokola), Arenavirus (por exemplo, vírus da coromenomeningite linfocítica (LCMV) ), Alphavirus (por exemplo, vírus do rio Ross (RRV), vírus Sindbis, vírus da floresta Semliki (SFV), vírus da encefalite equina venezuelana), filovírus (por exemplo, vírus Ebola Reston, vírus Ebola Zaire, vírus Lassa), alpharetrovirus (vírus da leucose aviária (ALV)), Betaretrovírus (por exemplo, retrovirus Jaagsiekte ovinos (JSRV)), Gammaretrovirus (por exemplo, vírus da leucemia murina Moloney (MLV), vírus da leucemia por macaco Gibbon (GALV), retrovirus endógeno felino (RD 114)), Deltaretrovirus (por exemplo, vírus linfotrópico humano 1 (HTLV1)), Spumavírus (por exemplo, vírus espumoso humano), Lentivírus (por exemplo, vírus Maedi-visna (MW)), Coronavirus (por exemplo, SARSCoV), Respirovírus (por exemplo, vírus Sendai, vírus sincicial respiratório (RSV)), Hepacivírus (por exemplo, vírus da hepatite C (HCV)), Influenzavirus (por exemplo, Vírus da gripe A) e Nucleopoli-hedrovirus (por exemplo, nucleopolyhedrovirus múltiplo de Autopolpha califomica (AcMNPV)). Em outra modalidade, a proteína env ou um substituto funcional
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29/65 da mesma é obtida ou derivada do vírus da estomatite vesicular. Nesta modalidade, a glicoproteína do vírus da estomatite vesicular (VSVg) pode ser usada o que permite que as partículas retrovirais infectem uma faixa mais ampla de células hospedeiras e elimina as chances de recombinação para produzir proteínas envelope do tipo selvagem. Em uma modalidade adicional, a sequência de ácido nucleico retroviral que codifica a proteína env ou um substituto funcional da mesma é derivada da sequência disponível no número de acesso ao genoma J02428.1, por exemplo, dos pares de bases 3071 a 4720. [0087] Os genes estruturais aqui descritos são comuns a todos os retrovirus. Outros genes auxiliares podem ser encontrados em diferentes tipos de retrovirus. Por exemplo, os lentivírus, como o HIV-1, contêm seis outros genes auxiliares conhecidos como rev, vif, vpu, vpr, nef e tat. Outros retrovirus podem ter genes auxiliares que são análogos aos genes aqui descritos, no entanto, eles nem sempre receberam o mesmo nome que na literatura. Referências como Tomonaga e Mikami (1996) J. Gen. Virol. 77 (Pt 8): 1611 a 1621 descrevem vários genes auxiliares de retrovirus.
[0088] Rev: O gene auxiliar rev (“regulador do virion”) codifica uma proteína acessória que se liga ao elemento Rev Response (RRE) e facilita a exportação de transcritos retrovirais. O produto proteico do gene permite que fragmentos de mRNA retroviral que contêm o elemento Rev Responsive (RRE) sejam exportados do núcleo para o citoplasma. A sequência RRE é prevista para formar uma estrutura dobrada complexa. Esse papel específico de rev reflete um forte acoplamento das etapas de emenda e exportação nuclear. Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende uma sequência RRE. Em uma modalidade adicional, a sequência RRE é derivada da sequência HIV-1 HXB2, que está disponível no No. de Acesso ao Genoma K03455, por exemplo, dos pares de bases 7622 a 8479 ou 7769 a 8146, em particular os pares de bases 7622 a 8479.
[0089] Rev se liga ao RRE e facilita a exportação de transcritos virais
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30/65 unidos emendados (env, vif, vpr e vpu) ou não emendados (gag, pol e RNA genômico), levando a eventos a jusante, como tradução e empacotamento de genes (ver Suhasini e Reddy (2009) Curr. HIV Res. 7 (1): 91 a 100). Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente o gene auxiliar rev ou um gene análogo ao mesmo (isto é, de outros retrovirus ou de um sistema funcionalmente análogo). A inclusão do gene rev garante a exportação eficiente de transcritos de RNA do genoma do vetor retroviral do núcleo para o citoplasma, especialmente se um elemento RRE também estiver incluído no transcrito a ser transportado. Em uma modalidade adicional, o gene rev compreende pelo menos 60% de identidade de sequência, como pelo menos 70% de identidade de sequência para os pares de bases 970 a 1320 do N° de Acesso ao Genoma Ml 1840 (isto é, cDNA do clone 12 do HIV-1 12, o locus HIVPCV12). Em uma modalidade alternativa, o gene rev compreende pelo menos 60% de identidade de sequência, como pelo menos 70%, 80%, 90% ou 100% de identidade de sequência para os pares de bases 5970 a 6040 e 8379 a 8653 do número de acesso ao genoma K03455.1 (isto é, vírus da imunodeficiência humana tipo 1, HXB2).
[0090] Acredita-se que os genes auxiliares desempenham um papel na replicação retroviral e na patogênese; portanto, muitos sistemas atuais de produção de vetores virais não incluem alguns desses genes. A exceção é rev, que geralmente está presente, ou um sistema análogo ao sistema rev/RRE é potencialmente usado. Portanto, em uma modalidade, as sequências de ácidos nucleicos que codificam um ou mais dos genes auxiliares vpr, vif, vpu, tat e nef, ou genes auxiliares análogos, são interrompidas de modo que os referidos genes auxiliares sejam removidos do genoma de RNA da partícula do vetor retroviral ou são incapazes de codificar proteínas auxiliares funcionais. Em uma modalidade adicional, pelo menos dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, ou todos os genes auxiliares vpr, vif, vpu, tat e nef, ou genes auxiliares análogos, são interrompidos de modo que os referidos genes auxiliares sejam
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31/65 removidos do genoma de RNA da partícula do vetor retroviral ou é incapaz de codificar proteínas auxiliares funcionais. A remoção do gene auxiliar funcional pode não exigir a remoção de todo o gene; a remoção de uma parte do gene ou a interrupção do gene será suficiente.
[0091] Será entendido que as sequências de ácido nucleico que codificam a partícula do vetor retroviral com defeito de replicação podem ser as mesmas ou derivadas dos genes de tipo selvagem do retrovirus nos quais a partícula do vetor retroviral se baseia, ou seja, as sequências podem ser geneticamente ou versões alteradas de sequências contidas no vírus do tipo selvagem. Portanto, os genes retrovirais incorporados nos vetores de ácidos nucleicos ou nos genomas das células hospedeiras também podem se referir a versões otimizadas por códon dos genes do tipo selvagem.
AMPLIFICAÇÃO GÊNICA [0092] Na natureza, a amplificação de genes é um processo que caracteriza alguns estados normais de desenvolvimento, como a oogênese em Drosophila melanogaster, particularmente na amplificação de genes de córion em seus ovários (Spralding et al. (1980) PNAS, 77: 1096 a 1100). A amplificação de genes também é um evento frequente nas células tumorais, em que desempenha um papel importante na ativação do oncogene, causando um aprimoramento de sua expressão (Albertson D.G. (2006) Trends Genet. 22: 447 a 455).
[0093] “Amplificação de gene” se refere a um processo pelo qual sequências específicas de DNA do genoma (ou seja, genes) são replicadas desproporcionalmente em relação a outras sequências no genoma, de modo que as sequências de DNA amplificadas se tomem presentes em um número de cópias mais alto do que o inicialmente presente no genoma antes dessa replicação desproporcional. “Amplificado” ou “amplificação”, como aqui utilizado, com referência a uma sequência de gene ou ácido nucleico, referese a uma sequência de gene ou ácido nucleico presente em duas ou mais
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32/65 cópias em uma linhagem celular hospedeira em virtude da amplificação do gene.
[0094] O fenômeno natural da amplificação de genes tem sido explorado na indústria biofarmacêutica como uma maneira de aumentar o título de um produto genético recombinante produzido por uma linhagem celular. Onde um gene recombinante foi integrado ao genoma da célula hospedeira, o número de cópias do gene recombinante e, concomitantemente, a quantidade de proteína recombinante expressa, podem ser aumentados selecionando-se linhagens celulares nas quais o gene recombinante foi amplificado após a integração no genoma da célula hospedeira.
[0095] Um “gene marcador de seleção amplificável”, conforme usado aqui, refere-se a um gene que permite a amplificação desse gene sob condições de crescimento apropriadas. Em contraste, o termo “gene marcador selecionável”, conforme usado aqui e como descrito em mais detalhes abaixo, refere-se a um gene marcador selecionável que não permite a amplificação. O gene marcador de seleção amplificável é capaz de responder a um inibidor ou a falta de um metabólito essencial por amplificação para aumentar o produto de expressão (isto é, a expressão da proteína codificada pelo gene marcador de seleção amplificável). Quando um inibidor, como um fármaco tóxico, é usado, o aumento da expressão do marcador de seleção amplificável confere resistência contra o inibidor. Em uma modalidade, o gene marcador de seleção amplificável pode ser caracterizado como capaz de complementar um hospedeiro auxotrófico. Em uma modalidade, o marcador de seleção amplificável está sob o controle de um promotor. Em uma modalidade, o promotor é um promotor SV40.
[0096] O termo “gene marcador selecionável”, conforme usado aqui, refere-se a um gene que ajudará a selecionar células que expressam ativamente um gene inserido (por exemplo, vetor de ácido nucleico), mas que não permite amplificação. Exemplos de marcadores de seleção adequados
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33/65 incluem enzimas que codificam resistência a um antibiótico (isto é, um gene de resistência a antibióticos), por exemplo, canamicina, neomicina, puromicina, higromicina, blasticidina ou zeocina. Outro exemplo de marcadores de seleção adequados são proteínas fluorescentes, por exemplo, proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente vermelha (RFP) ou proteína fluorescente azul (BFP).
[0097] Um “marcador de seleção amplificável” e um “marcador selecionável”, conforme usado aqui, refere-se ao produto (ou seja, proteínas enzimáticas) codificado pelo gene marcador de seleção amplificável e pelo gene marcador selecionável, respectivamente.
[0098] A amplificação de genes pode ser induzida por transfecção estável de uma célula hospedeira com um gene marcador de seleção amplificável. As células hospedeiras estavelmente transfectadas são sujeitas a concentrações crescentes de um fármaco tóxico, que é conhecido por inibir o marcador de seleção amplificável. Por exemplo, as células transfectadas podem ser cultivadas em um meio que contém o fármaco tóxico em uma concentração para atingir a morte de mais de 98% das células dentro de 3 a 5 dias após o plaqueamento das células-mãe (ou seja, células não transfectadas) em meio contendo o medicamento tóxico. Altemativamente, as células transfectadas podem ser cultivadas em um meio que contém o fármaco tóxico (por exemplo, MTX ou MSX) a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 8% de CO no ar com agitação por 14 a 21 dias ou até viabilidade de > 90%. Através dessa inibição, podem ser selecionadas populações de células que têm níveis aumentados de expressão do marcador de seleção amplificável e, consequentemente, resistência ao fármaco na concentração empregada. Outros métodos para induzir a amplificação de genes serão conhecidos por uma pessoa versada na técnica, como o descrito no manual OptiCHO™ Express Kit (Life Technologies™).
[0099] O vetor de ácido nucleico da presente invenção permite que
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34/65 todos os construtos de expressão nele contidos sejam integrados em um único local no genoma da célula hospedeira. A amplificação do gene marcador de seleção amplificável também causa amplificação das sequências de DNA circundantes. Como resultado, as demais sequências de DNA do vetor de ácido nucleico que foram integradas no genoma da célula hospedeira também serão amplificadas. Dessa maneira, usando o vetor de ácido nucleico aqui descrito, é possível prover um processo para amplificar os genes do vetor retroviral integrados de maneira estável no genoma da célula hospedeira, o que não depende da integração da ligação in vivo pela célula hospedeira dos genes do vetor retroviral ao gene marcador de seleção amplificável.
[00100] Cada marcador de seleção amplificável possui um agente de seleção associado (isto é, um fármaco tóxico), que é adicionado ao meio de cultura de células durante os regimes de amplificação e seleção. Diferentes combinações de marcadores de seleção/agente de seleção amplificáveis são conhecidas na técnica, e quaisquer regimes de amplificação e seleção adequados podem ser utilizados na presente invenção. As combinações de marcadores de seleção/agente de seleção amplificáveis adequadas incluem adenosina desaminase/desoxicoformicina, aspartato transcarbamilase/N (fosfoacetil)-L-aspartato, di-hidrofolato redutase/metotrexato, glutamina sintetase/metionina sulfoximina e metaltionioneina-l/metal pesado.
[00101] Em uma modalidade, o marcador de seleção amplificável é a di-hidrofolato redutase (DHFR). O método de seleção de DHFR envolve a incorporação de um construto de expressão compreendendo o gene dhfr (isto é, gene marcador de seleção amplificável) ao vetor de ácido nucleico, induzindo assim uma pressão de seleção de DHFR para outros construtos de expressão do vetor de ácido nucleico. A célula hospedeira é transfectada com o vetor de ácido nucleico e cresce na presença de concentrações crescentes de metotrexato inibidor de DHFR (MTX) para selecionar células que amplificaram o gene dhfr exógeno integrado ao genoma do hospedeiro e,
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35/65 concomitantemente, o restante vetor de ácido nucleico integrado.
[00102] Os construtos de expressão compreendendo o gene dhfr para uso na amplificação de genes são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, em Subramani et al. (1981) Mol. Célula. Bio. 2: 854 a 864 e Walls etal. (1989) Gene 81: 139 a 149.
[00103] Em uma modalidade, o gene dhfr compreende pelo menos 60% de identidade de sequência, como pelo menos 70%, 80%, 90% ou 100% de identidade de sequência do No. de Acesso ao Genoma NM_010049.3 Em uma modalidade, DHFR compreende pelo menos 60% de sequência identidade, como pelo menos 70%, 80%, 90% ou 100% de identidade de sequência do No. de acesso ao Genoma NP_034179.
[00104] Em uma modalidade, o construto de expressão compreendendo sequências de ácidos nucleicos que codificam DHFR pode ainda compreender os componentes necessários para a transcrição e tradução do polinucleotídeo do genoma do vírus símio 40.
[00105] Em uma modalidade, o construto de expressão compreendendo as sequências de ácidos nucleicos que codificam um marcador de seleção amplificável é derivado de pSV2-dhfr como divulgado em Subramani et al. (1981) Mol. Cell. Bio. 2: 854 a 864.
[00106] Em uma modalidade adicional, a sequência de ácido nucleico do construto de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica o marcador de seleção amplificável compreende a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1. A sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 é como estabelecido na Figura 2.
[00107] Em outra modalidade, o marcador de seleção amplificável é a glutamina sintetase (GS). O método de seleção GS envolve a incorporação do gene gs ao vetor de ácido nucleico, induzindo assim uma pressão de seleção GS aos outros construtos de expressão do vetor de ácido nucleico. A célula hospedeira é transfectada com o vetor de ácido nucleico e cultivada na
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36/65 presença de concentrações crescentes de inibidor de GS metionina sulfoximina (MSX) para selecionar células que amplificaram o gene gs integrado no genoma do hospedeiro e, concomitantemente, o restante vetor de ácido nucleico integrado.
[00108] Os construtos de expressão compreendendo o gene gs para uso na amplificação de genes são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, no documento WO 874462 e em Bebbington et al. (1992) Nature 10: 169 a 175).
[00109] Ao usar o marcador de seleção amplificável e o agente de seleção associado dessa maneira, a área do genoma da célula hospedeira que abriga a pressão de seleção pode amplificar, aumentando assim o número de cópias do marcador de seleção amplificável e o vetor de ácido nucleico. As linhagens celulares que crescem através de tais ciclos de amplificação e seleção são então pesquisadas quanto ao título da produção do vetor retroviral e o melhor clone é selecionado para uso na produção em massa.
[00110] Tipicamente, o número de ciclos de amplificação e a concentração do agente associado empregado não são definidos ou fixos. Em vez disso, é típico que os regimes de amplificação e seleção se tomem progressivamente rigorosos até o ponto em que um limite de produção é atingido. Observou-se que até que um “patamar” de produção de proteínas seja atingido, os níveis de produção de proteínas observados são tipicamente proporcionais ao aumento no número de cópias de genes (Bebbington e Hentschel, DNA Cloning Volume III, IRL press, 1987).
[00111] Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é negativa para o marcador de seleção amplificável. Isto é, que a célula hospedeira não compreende um gene marcador de seleção amplificável endógena. Por exemplo, ao usar DHFR como marcador de seleção amplificável, é preferível empregar cepas hospedeiras negativas para DHFR, como CHO DG44 ou CHO DUX-B11. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma cepa
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37/65 hospedeira GS negativa. Em uma modalidade, a célula hospedeira é modificada para eliminar o gene gs endógeno. Os métodos para eliminar genes específicos de uma célula são bem conhecidos na técnica, por exemplo, usando nucleases de dedo de zinco. Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é uma célula HEK293T GS negativa. No entanto, a invenção não é limitada pela escolha de uma linhagem de célula hospedeira específica. Qualquer linhagem celular que tenha uma taxa de crescimento rápida (por exemplo, um tempo de duplicação de 12 horas ou menos) e que seja capaz de amplificar o gene marcador de seleção amplificável exógena a uma taxa razoável sem amplificação do gene marcador de seleção amplificável endógena a um similar ou uma taxa mais alta, de modo que o marcador de seleção amplificável exógena possa ser usado como um marcador dominante, pode ser usado nos métodos da presente invenção.
[00112] As linhagens celulares transduzidas com o marcador dominante (isto é, marcador de seleção amplificável exógena) são identificadas determinando que a capacidade da célula de crescer em concentrações crescentes do agente de seleção se correlaciona com um aumento no número de cópias do marcador de seleção amplificável (isso pode ser medido diretamente demonstrando um aumento no número de cópias do marcador amplificável por Southern blotting ou indiretamente demonstrando um aumento na quantidade de mRNA produzido a partir do marcador amplificável por Northern blotting, ou qPCR).
[00113] Quando uma célula hospedeira compreende um gene marcador de seleção amplificável endógena, o vetor de ácido nucleico pode ainda compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica um marcador selecionável além do marcador de seleção amplificável. As células hospedeiras são transfectadas com um vetor de ácido nucleico compreendendo um marcador de seleção amplificável, bem como um marcador selecionável. Onde o marcador selecionável confere resistência a
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38/65 antibióticos, as células hospedeiras transfectadas são primeiro selecionadas para a capacidade de crescer na presença do respectivo antibiótico, como zeocina ou higromicina. Deste modo, é possível selecionar células hospedeiras que foram transfectadas com sucesso com o vetor de ácido nucleico, antes de induzir a amplificação do gene. As células são então selecionadas pela capacidade de crescer em concentrações crescentes do agente de seleção, como MTX ou MSX.
[00114] Portanto, em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente um gene marcador selecionável. Em uma modalidade adicional, o gene marcador selecionável é um gene de resistência a antibióticos, como um gene de resistência a zeocina, canamicina ou puromicina, em particular um gene de resistência a zeocina (ZeoR). Ainda em uma modalidade adicional, o gene de resistência à zeocina é derivado do gene Streptoalloteichus hindustans ble, por exemplo, ver o número de acesso do genoma X52869.1 dos pares de bases 3 a 377. Em outra modalidade, o marcador selecionável é a higromicina fosfotransferase.
COMPONENTES ADICIONAIS [00115] Os vetores de ácido nucleico da invenção podem compreender outros componentes adicionais. Esses recursos adicionais podem ser usados, por exemplo, para ajudar a estabilizar os transcritos para tradução, aumentar o nível de expressão gênica e ativar/desativar a transcrição gênica.
[00116] As partículas de vetores retrovirais produzidas pela invenção podem ser usadas em métodos de terapia gênica. Portanto, em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente um ou mais transgenes. Por exemplo, quando um gene alvo não é expresso corretamente na célula hospedeira de mamífero, portanto, uma versão corrigida do gene alvo é introduzida como o transgene. Em outras palavras, o transgene é um gene terapeuticamente ativo que codifica um produto genético que pode ser utilizado para tratar ou melhorar uma doença alvo. O transgene
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39/65 pode codificar, por exemplo, um RNA anti-sentido, uma ribozima, uma proteína (por exemplo, uma proteína supressora de tumor), uma toxina, um antígeno (que pode ser usado para induzir anticorpos ou células T auxiliares ou células T citotóxicas) ou um anticorpo (como um anticorpo de cadeia única). O transgene pode codificar qualquer polipeptídeo ou RNA que seja desejavelmente produzido em uma célula in vitro, ex vivo ou in vivo. Em uma modalidade, o transgene codifica beta globina. O transgene pode ter sido obtido de outro tipo de célula, ou de outra espécie, ou preparado sinteticamente. Altemativamente, o transgene pode ter sido obtido a partir da célula hospedeira, mas operativamente ligado a regiões reguladoras que são diferentes daquelas presentes no gene nativo. Alternativamente, o transgene pode ser um alelo ou variante diferente de um gene presente na célula hospedeira.
[00117] Espera-se que várias cópias do vetor de transferência contendo o transgene resultem em um título de vetor retroviral mais alto; portanto, em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende várias cópias do transgene, como duas ou mais, em particular três ou mais cópias do transgene. Em alguns casos, é necessário mais de um produto genético para tratar uma doença; portanto, em uma modalidade adicional, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente dois ou mais, como três ou mais, ou quatro ou mais transgenes diferentes.
[00118] O objetivo da terapia gênica é modificar o material genético das células vivas para fins terapêuticos, e envolve a inserção de um gene funcional na célula para obter um efeito terapêutico. O vetor retroviral produzido utilizando os vetores de ácido nucleico e as células hospedeiras aqui descritas pode ser usado para transfectar células alvo e induzir a expressão do gene de potencial interesse terapêutico. O vetor retroviral pode, portanto, ser utilizado para o tratamento de um indivíduo mamífero, como um indivíduo humano, sofrendo de uma condição incluindo, mas não se limitando
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40/65 a, distúrbios herdados, câncer e certas infecções virais.
[00119] Será entendido pelos especialistas na matéria que as sequências de ácidos nucleicos podem ser associadas operacionalmente com sequências de controle apropriadas. Por exemplo, as sequências de ácidos nucleicos podem ser associadas operacionalmente a elementos de controle de expressão, como sinais de controle de transcrição/tradução, origens de replicação, sinais de poliadenilação, locais de entrada interna de ribossomo (IRES), promotores e/ou potenciadores e similares.
[00120] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente um elemento de regulação de transcrição. Por exemplo, qualquer um dos elementos aqui descritos pode ser operacionalmente ligado a um promotor, para que a expressão possa ser controlada. Os promotores aqui referidos podem incluir promotores conhecidos, no todo ou em parte, que podem ser constitutivamente atuantes ou induzíveis, por exemplo, na presença de uma proteína reguladora. Em uma modalidade, o promotor é um promotor viral. Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente um promotor de alta eficiência, como um promotor de CMV. Este promotor tem a vantagem de promover um alto nível de expressão dos elementos codificados no vetor de ácido nucleico não mamífero. Em outra modalidade, o promotor de CMV compreende uma sequência derivada da cepa de citomegalovírus humano ADI69. Esta sequência está disponível no No. de Acesso ao Genoma X17403, por exemplo, dos pares de bases 173731 a 174404. Em uma modalidade alternativa, o promotor é um promotor tardio SV40 do vírus símio 40. Os promotores aqui mencionados podem incluir promotores conhecidos, no todo ou em parte, que podem ser constitutivamente atuantes ou induzíveis, por exemplo, na presença de uma proteína reguladora.
[00121] Em uma modalidade, o promotor (como um promotor de CMV) compreende adicionalmente pelo menos um operon Tet. O sistema
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41/65 operon Tet pode ser utilizado para controlar a expressão das sequências retrovirais contidas no vetor de ácido nucleico. Resumidamente, a proteína repressora Tet bloqueia a expressão por ligação ao local do operon Tet que é introduzido no promotor. Portanto, quando o repressor Tet está ligado ao operon Tet, não há expressão gênica. Por adição de tetraciclina ou doxiciclina, o repressor Tet é sequestrado, permitindo a atividade do promotor, portanto a expressão gênica é ativada. Os sistemas operon Tet estão amplamente disponíveis, como o Operon Tet usado no vetor de expressão em mamífero pcDNA™ 4/TO, disponível na Invitrogen.
[00122] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente uma proteína repressora de operon de resistência à tetraciclina (“repressor Tet” ou “TetR”). Em outra modalidade, o repressor Tet é otimizado por códon.
[00123] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente um isolador, tal como um isolador de cromatina. O termo “isolador” se refere a uma sequência genética que bloqueia a interação entre promotores e potenciadores. Em outra modalidade, o isolador (tal como um isolador de cromatina) está presente entre cada uma das sequências de ácido nucleico retroviral (isto é, entre construtos de expressão individuais). Isto ajuda a impedir a interferência do promotor (isto é, quando o promotor de uma unidade de transcrição prejudica a expressão de uma unidade de transcrição adjacente) entre sequências de ácidos nucleicos retrovirais adjacentes. Sem estar limitado pela teoria, isso também ajuda a minimizar o risco de recombinação entre sequências retrovirais para gerar vírus competentes para replicação.
[00124] Será entendido que, se os isoladores estiverem presentes no vetor de ácido nucleico entre cada uma das sequências retrovirais de ácido nucleico, então eles podem ser dispostos como construtos de expressão individuais dentro do vetor de ácido nucleico. Por exemplo, cada sequência
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42/65 que codifica as sequências de ácido nucleico retroviral possui seu próprio promotor e/ou um sinal de íntron e/ou poliA.
[00125] Em uma modalidade, o isolador de cromatina possui pelo menos 90% de identidade de sequência, por exemplo, pelo menos 95% de identidade de sequência, para a sequência de isolador HS4 de galinha (Gallus gallus) (por exemplo, ver No. de acesso ao genoma U78775.2, pares de bases 1 a 1205).
[00126] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente um sinal poliA. O uso de um sinal poliA tem a vantagem de proteger o mRNA da degradação enzimática e auxiliar na tradução. Em outra modalidade, o sinal poliA é obtido ou derivado de SV40, Hormônio do Crescimento Bovino e/ou Beta Globina Humana. Em uma modalidade, o sinal poliA é derivado do sinal poliA inicial do SV40 (por exemplo, ver No. de Acesso ao Genoma EF579804.1, pares de bases 2668 a 2538 da cadeia negativa). Em uma modalidade, o sinal poliA é derivado do sinal poliA da Beta Globina Humana (por exemplo, ver No. de Acesso ao Genoma GU324922.1, pares de bases 3394 a 4162).
[00127] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente uma sequência de íntron. Sabe-se que a utilização de um íntron a jusante da região promotora/melhoradora e a montante da inserção de cDNA (isto é, o transgene) aumenta o nível de expressão da inserção. Em uma modalidade adicional, a sequência de íntron é uma sequência de íntron de beta globina humana ou a sequência de Beta Globina de íntron II de coelho. Em uma modalidade, a íntron de beta globina humana é derivada da sequência disponível no número de acesso ao genoma KM504957.1 (por exemplo, dos pares de bases 476 a 1393). Em uma modalidade, a Beta Globina de íntron II de coelho é derivada da sequência disponível no número de acesso do genoma V00882.1 (por exemplo, dos pares de bases 718 a 1290).
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43/65 [00128] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente um elemento regulador pós-transcricional do vírus da hepatite por marmota (WPRE). Foi demonstrado que a presença de WPRE melhora a expressão e, como tal, é provável que seja benéfica na obtenção de altos níveis de expressão. Em outra modalidade, o WPRE é derivado da sequência disponível no número de acesso ao genoma J04514.1 (por exemplo, dos pares debases 1093 a 1684).
[00129] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente um local de entrada interno do ribossomo (IRES). Um IRES é um elemento de RNA estruturado que geralmente é encontrado na região não traduzida em 5’ a jusante da tampa 5’ (o que é necessário para a montagem do complexo de iniciação). O IRES é reconhecido por fatores de iniciação da tradução e permite a tradução independente de limite. Em uma modalidade adicional, o IRES é derivado do genoma do vírus da encefalomiocardite (EMCV) (por exemplo, ver número de acesso ao genoma KF836387.1, pares de bases 151 a 724).
[00130] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende adicionalmente um Sítio de Clonagem Múltipla (MCS). Um MCS é um segmento curto de DNA dentro do vetor de ácido nucleico que contém vários locais de restrição (por exemplo, 10, 15 ou 20 locais). Esses locais geralmente ocorrem apenas uma vez dentro do vetor de ácido nucleico para garantir que a endonuclease corta apenas em um local. Isto permite que os genes retrovirais sejam facilmente inseridos utilizando as endonucleases apropriadas (isto é, enzimas de restrição).
[00131] Será entendido por uma pessoa versada na técnica que os construtos podem ser dispostos em qualquer ordem dentro do vetor de ácido nucleico. Em uma modalidade exemplar, o vetor de ácido nucleico compreende a seguinte inserção: uma sequência de ácido nucleico que codifica um marcador de seleção amplificável, uma sequência de ácido
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44/65 nucleico retroviral que codifica as proteínas gag e pol, uma sequência de ácido nucleico retroviral que codifica a proteína env ou um substituto funcional do mesmo (como VSVg), uma sequência de ácido nucleico retroviral que codifica o gene auxiliar rev (como uma sequência rev otimizada por códon) ou um gene análogo ao mesmo ou um sistema funcionalmente análogo, uma proteína repressora do operon de resistência à tetraciclina (TetR), uma entrada interna de ribossomo local e um marcador selecionável (como um marcador de seleção de resistência à zeocina) (ou seja, marcador de seleção amplificável-GagPol-Env-Rev-TetRepressor-IRES-marcador de resistência a antibióticos-sequência BAC restante do marcador (“osso BAC”); ou marcador de seleção amplificável-GagPol-(tipo selvagem) VSVg(otimizado por códon)-Rev-TetRepressor-IRES-Resistência à zeocinapSMARTBAC). Em uma modalidade adicional, um isolador (como um isolador de cromatina) está presente entre cada uma das sequências de marcadores de seleção amplificáveis, gagpol, env e rev. Em uma modalidade adicional, um promotor está presente antes de cada uma das sequências de marcadores de seleção amplificáveis, gagpol, env e rev. Ainda em uma modalidade adicional, pelo menos uma cópia da sequência do vetor de transferência (isto é, compreendendo sequências de ácidos nucleicos que codificam o genoma do RNA de uma partícula do vetor retroviral) está presente antes da sequência do marcador de seleção amplificável.
[00132] Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico compreende a seguinte inserção: um promotor (como um promotor de CMV opcionalmente compreendendo uma sequência de operon Tet), um intron (como um íntron de beta globina humana), sequência de ácido nucleico que codifica um marcador de seleção amplificável, um sinal de poliA (como um sinal poliA de beta globina humana), um isolador (como um isolador de cromatina), um promotor (como um promotor de CMV que compreende opcionalmente uma sequência de operon Tet), um íntron (como um íntron de globina humana), uma
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45/65 sequência de ácido nucleico retroviral que codifica as proteínas gag e pol, um ácido nucleico retroviral que codifica RRE, um sinal poliA (como um sinal poliA da beta globina humana), um isolador (como um isolador de cromatina), um promotor (como um promotor de CMV opcionalmente compreendendo uma sequência de operon Tet), um íntron (como um íntron beta globina humana), uma sequência de ácido nucleico retroviral que codifica a proteína env ou um substituto funcional da mesma (como VSVg), um sinal poliA (como um sinal poliA de beta globina humana), um isolador (como um isolador de cromatina), um promotor (como um promotor de CMV opcionalmente compreendendo uma sequência de operon Tet), uma sequência de ácido nucleico retroviral que codifica o gene auxiliar rev ou um gene análogo ao mesmo ou um sistema funcionalmente análogo , um sinal de poliA (como um sinal poliA de beta globina humana), um isolador (como um isolador de cromatina), um promotor (como um promotor de CMV), um íntron (como um íntron de beta globina de coelho), uma proteína repressora de operon de resistência à tetraciclina (TetR), um local interno de entrada de ribossomo, um marcador selecionável (como um marcador de seleção de resistência à zeocina), um sinal poliA e um local de clonagem múltipla.
[00133] As sequências de ácido nucleico podem ser introduzidas no vetor de ácido nucleico sequencialmente. Isso permite a seleção após cada integração para garantir que todas as sequências de ácido nucleico necessárias sejam integradas com sucesso no vetor de ácido nucleico. Alternativamente, pelo menos duas ou mais das sequências de ácidos nucleicos são introduzidas no vetor de ácido nucleico simultaneamente.
[00134] Será entendido que os genes adicionais aqui descritos podem ser introduzidos no vetor de ácido nucleico por técnicas convencionais de clonagem molecular conhecidas na técnica, por exemplo, usando endonucleases de restrição e técnicas de ligação. Além disso, o vetor de ácido nucleico, em particular BACs, PACs, fosmídeos e/ou cosmídeos, pode ser
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46/65 introduzido em células hospedeiras bacterianas (como células de E. coli, em particular a cepa DH10B de E. coli) por técnicas padrão, como eletroporação. USOS [00135] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provido o vetor de ácido nucleico aqui definido para uso na produção de uma linhagem celular de empacotamento ou produção retroviral.
[00136] Os vetores de ácido nucleico aqui descritos podem ser usados para criar uma linhagem celular de empacotamento retroviral que simplificaria bastante a produção de vetores retrovirais. Será entendido que, se as sequências de ácido nucleico que codificam o genoma de RNA do vetor retroviral (compreendendo o transgene) forem incluídas no vetor de ácido nucleico, isso será usado para criar uma linhagem celular de produção.
[00137] Como aqui descrito, seria útil desenvolver uma linhagem celular de empacotamento ou produção retroviral estável, a fim de superar as dificuldades associadas à transfecção transitória e títulos reduzidos de partículas de vetores retrovirais. Os vetores de ácido nucleico aqui descritos podem ser utilizados para preparar as referidas linhagens celulares de empacotamento ou produção, porque são capazes de conter grandes inserções de DNA contendo os genes essenciais necessários para o empacotamento retroviral que podem ser integrados ao genoma endógeno das células hospedeiras de mamíferos em uma única etapa, por exemplo, amplificado como uma unidade tal que a amplificação e expressão subsequente dos genes retrovirais essenciais sejam proporcionais entre si.
CÉLULAS HOSPEDEIRAS [00138] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provida uma célula de empacotamento retroviral que compreende sequências de ácidos nucleicos que codificam:
proteínas gag e pol;
proteína env ou um substituto funcional da mesma; e
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47/65 um marcador de seleção amplificável;
como construtos de expressão individuais, em que os referidos construtos de expressão são todos integrados juntos em um único local no genoma da célula de empacotamento retroviral como uma unidade; e em que o número de cópias da unidade é dois ou mais.
[00139] A vantagem de incluir todos os genes retrovirais e o marcador de seleção amplificável em um vetor grande de ácido nucleico é que eles podem ser preparados primeiro em células microbianas (como células bacterianas ou de levedura), que são muito mais fáceis de manusear e manipular antes de serem integrados em células de mamíferos em uma única etapa. Isso alivia a pressão de seleção e reduz o período de silenciamento depois que os genes retrovirais são integrados a uma célula hospedeira de mamífero. A característica deste método é que todos os genes retrovirais necessários para criar uma linhagem celular de empacotamento estão presentes em um único locus no genoma endógeno como uma unidade, em vez de espalhados aleatoriamente pelo genoma endógeno. Isso tem a vantagem de produzir uma célula de empacotamento retroviral que expressa todos os genes retrovirais no mesmo nível porque eles estão integrados no mesmo local, em comparação com os métodos anteriormente conhecidos nos quais os genes retrovirais são integrados separadamente e aleatoriamente em todo o genoma da célula hospedeira que pode causar níveis desiguais de expressão.
[00140] Além disso, por ter o marcador de seleção amplificável no mesmo vetor de ácido nucleico que todos os construtos de expressão compreendendo sequências de ácidos nucleicos que codificam a proteína retroviral essencial (gag, pol, env ou um substituto funcional da mesma), os construtos de expressão são amplificados juntos.
[00141] Será entendido que a unidade pode integrar mais de uma vez no genoma da célula hospedeira em vários locais diferentes em cromossomos
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48/65 diferentes (embora com todas as sequências de ácidos nucleicos codificadas presentes em um único locus'). Portanto, a referência a um ‘locus único” não exclui a possibilidade de que as sequências de ácidos nucleicos sejam todas integradas em vários loci no genoma da célula de produção/empacotamento retroviral. Isso pode ser benéfico para aumentar os níveis de expressão dos transgenes e potencialmente melhorar os títulos retrovirais. E possível comparar o número de cópias de inserções de construção entre populações de células derivadas de clones individuais por qPCR.
[00142] Em uma modalidade, a célula de empacotamento retroviral compreende adicionalmente sequências de ácido nucleico que codificam o genoma de RNA da partícula de vetor retroviral. Tais sequências de ácidos nucleicos também podem ser integradas no local único com as sequências de ácidos nucleicos que codificam as proteínas gag e pol, a proteína env ou um substituto funcional da mesma e o marcador de seleção amplificável.
[00143] Portanto, de acordo com um aspecto adicional da invenção, é provida uma célula de produção retroviral compreendendo sequências de ácidos nucleicos que codificam:
proteínas gag e pol;
proteína env ou um substituto funcional da mesma;
um marcador de seleção amplificável; e um genoma de RNA de uma partícula de vetor retroviral, como construtos de expressão individuais, em que os referidos construtos de expressão são todos integrados em um único local no genoma da célula de produção retroviral como uma unidade; e em que o número de cópias da unidade é dois ou mais.
[00144] Em uma modalidade, a célula de empacotamento retroviral é uma célula de mamífero. Em outra modalidade, a célula de mamífero é selecionada a partir de uma célula HEK 293, célula CHO, célula Jurkat, célula KS62, célula PerC6, célula HeLa ou um derivado ou equivalente funcional
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49/65 das mesmas. Em uma modalidade, a célula de mamífero é CHO-K1 ou CHOK1SV. Ainda em uma modalidade adicional, a célula hospedeira de mamífero é uma célula HEK 293 ou derivada de uma célula HEK 293. Tais células podem ser linhagens celulares aderentes (isto é, crescem em uma única camada ligada a uma superfície) ou linhagens celulares adaptadas/não aderentes à suspensão (isto é, crescem em suspensão em um meio de cultura). As células que crescem em suspensão são amplamente utilizadas na indústria para a produção de produtos biológicos à medida que crescem em grandes densidades, e a produção é fácil de expandir em comparação às células aderentes. Ainda em uma modalidade adicional, a célula HEK 293 é uma célula HEK 293T. O termo “célula HEK 293” se refere à linhagem celular Rim Embrionário Humano 293, que é comumente usada em biotecnologia. Em particular, as células HEK 293T são comumente usadas para a produção de vários vetores retrovirais. Outros exemplos de linhagens celulares adequadas comercialmente disponíveis incluem linhagens celulares T REX™ (Life Technologies). De preferência, a célula de mamífero não expressa endogenamente o marcador de seleção amplificável. Por exemplo, onde o marcador de seleção amplificável é DHFR, é preferível empregar uma linhagem celular dhfr- (dhfr negativa), como uma linhagem celular dhfrCHO, ou onde o marcador de seleção amplificável é GS, é preferível empregar um linhagem celular gs- (gs negativa), por exemplo, uma linhagem celular HEK293 modificada para eliminar o gene gs e produzir HEK293T GS negativa. Os métodos para eliminar genes específicos de uma célula são bem conhecidos na técnica, por exemplo, usando nucleases de dedo de zinco.
[00145] Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é negativa para o marcador de seleção amplificável. Isto é, que o genoma da célula hospedeira não compreende um gene marcador de seleção amplificável endógena. Por exemplo, ao usar DHFR como marcador de seleção amplificável, é preferível empregar cepas hospedeiras negativas para DHFR,
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50/65 como CHO DG44 ou CHO DUX-B11. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma cepa hospedeira GS negativa. Em uma modalidade, a célula hospedeira é modificada para eliminar o gene gs endógeno. Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é uma célula HEK293T GS negativa. No entanto, a invenção não é limitada pela escolha de uma linhagem de célula hospedeira específica. Qualquer linhagem celular que tenha uma taxa de crescimento rápida (ou seja, um tempo de duplicação de 12 horas ou menos) e que seja capaz de amplificar o gene marcador de seleção amplificável a uma taxa razoável sem amplificação do gene marcador de seleção amplificável endógena a uma taxa similar ou superior pode ser usada nos métodos da presente invenção. As linhagens celulares que têm a capacidade de amplificar o gene marcador de seleção amplificável a uma taxa maior que a taxa na qual o gene marcador de seleção endógena é amplificada são identificadas por descobrir que a capacidade da célula crescer em concentrações crescentes do agente de seleção (ou seja, o composto que requer que a célula expresse o marcador de seleção amplificável para sobreviver) correlaciona-se com um aumento no número de cópias do marcador de seleção amplificável (isso pode ser medido diretamente demonstrando um aumento no número de cópias do marcador amplificável por Southern blotting ou indiretamente, demonstrando um aumento na quantidade de mRNA produzido a partir do marcador amplificável por Northern blotting).
[00146] Deve ser entendido que todas as modalidades descritas anteriormente para o vetor de ácido nucleico, também podem ser aplicadas às células retrovirais de empacotamento/produção da invenção.
MÉTODOS [00147] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provido um método para produzir uma linhagem celular de empacotamento ou produção retroviral estável, compreendendo as etapas de:
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51/65 (a) transfectar o vetor de ácido nucleico aqui descrito em uma cultura de células hospedeiras de mamíferos;
(b) cultivar as células hospedeiras de mamíferos transfectadas em um meio que contém uma concentração de um agente de seleção que inibe o crescimento das células de mamíferos transfectadas que expressam níveis insuficientes do marcador de seleção amplificável; e (c) selecionar células hospedeiras de mamífero transfectadas capazes de crescer no referido meio, em que as células hospedeiras de mamífero transfectadas selecionadas contêm um número amplificado de cópias do vetor de ácido nucleico integrado no genoma da célula hospedeira de mamífero transfectada.
[00148] A produção de uma linhagem celular de empacotamento ou produção depende de o vetor de ácido nucleico compreender ou não a sequência de ácido nucleico que codifica o genoma de RNA da partícula do vetor retroviral, respectivamente.
[00149] Se os genes alvo forem integrados nos cromossomos endógenos com um marcador selecionável, como um gene de resistência a antibióticos, o método poderá compreender adicionalmente a seleção das células hospedeiras de mamíferos nas quais os ácidos nucleicos retrovirais foram integrados com sucesso. Portanto, em uma modalidade, o método compreende uma etapa adicional, após a etapa (a), de selecionar dentro da cultura uma célula hospedeira de mamífero que possui as sequências de ácido nucleico codificadas no vetor integradas a um cromossomo endógeno da célula hospedeira de mamífero.
[00150] As células hospedeiras estavelmente transfectadas são sujeitas a concentrações crescentes de um agente de seleção (por exemplo, droga tóxica), que é conhecido por inibir o marcador de seleção amplificável. Por exemplo, as células transfectadas podem ser cultivadas em um meio que contém o fármaco tóxico em uma concentração para atingir a morte de mais
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52/65 de 98% das células dentro de 3 a 5 dias após o plaqueamento das células-mãe (ou seja, células não transfectadas) em meio contendo o medicamento tóxico. Altemativamente, as células transfectadas podem ser cultivadas em um meio que contém o fármaco tóxico (por exemplo, MTX ou MSX) a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 8% de CO no ar com agitação por 14 a 21 dias ou até viabilidade de > 90%. Através dessa inibição, podem ser selecionadas populações de células que têm níveis aumentados de expressão do marcador de seleção amplificável e, consequentemente, resistência ao fármaco na concentração empregada. As etapas (b) e (c) podem ser repetidas com concentrações progressivamente crescentes do agente de seleção. Em uma modalidade, a amplificação dos genes exógenos é alcançada por seleção para resistência a níveis progressivamente aumentados de um agente de seleção, repetindo as etapas (b) e (c).
[00151] Os métodos para induzir a amplificação de genes serão conhecidos por uma pessoa versada na técnica, como o descrito no manual do OptiCHO™ Express Kit (Life Technologies™).
[00152] Em uma modalidade, a célula hospedeira de mamífero é selecionada a partir de uma célula HEK 293, célula HEK 6E, célula CHO, célula Jurkat, célula KS62, célula PerC6, célula HeLa ou um derivado ou equivalente funcional das mesmas. Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira de mamífero é uma célula HEK 293 ou derivada de uma célula HEK 293. Tais células podem ser linhagens celulares aderentes (isto é, crescem em uma única camada ligada a uma superfície) ou linhagens celulares adaptadas/não aderentes à suspensão (isto é, crescem em suspensão em um meio de cultura). Ainda em outra modalidade, a célula HEK 293 é uma célula HEK 293T ou HEK 6E. Outros exemplos de linhagens celulares adequadas comercialmente disponíveis incluem linhagens celulares T REX™ (Life Technologies).
[00153] Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é negativa
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53/65 para o marcador de seleção amplificável. Isto é, que o genoma da célula hospedeira não compreende um gene marcador de seleção amplificável endógena. Por exemplo, ao usar DHFR como marcador de seleção amplificável, é preferível empregar cepas hospedeiras negativas para DHFR, como CHO DG44 ou CHO DUX-B11. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma cepa hospedeira GS negativa. Em uma modalidade, a célula hospedeira é modificada para eliminar o gene gs endógeno. Os métodos para eliminar genes específicos de uma célula são bem conhecidos na técnica, por exemplo, usando nucleases de dedo de zinco. Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é uma célula HEK293T negativa para GS.
[00154] No entanto, a invenção não é limitada pela escolha de uma linhagem de células hospedeiras específica. Qualquer linhagem celular que tenha uma taxa de crescimento rápida (ou seja, um tempo de duplicação de 12 horas ou menos) e que seja capaz de amplificar o gene marcador de seleção amplificável a uma taxa razoável sem amplificação do gene marcador de seleção amplificável endógena a uma taxa similar ou mais alta pode ser usada nos métodos da presente invenção. As linhagens celulares que têm a capacidade de amplificar o gene marcador de seleção amplificável a uma taxa maior que a taxa na qual o gene marcador de seleção endógena é amplificada são identificadas por descobrir que a capacidade da célula crescer em concentrações crescentes do agente de seleção (ou seja, o composto que requer que a célula expresse o marcador de seleção amplificável para sobreviver) correlaciona-se com um aumento no número de cópias do marcador de seleção amplificável (isso pode ser medido diretamente demonstrando um aumento no número de cópias do marcador amplificável por Southern blotting ou indiretamente, demonstrando um aumento na quantidade de mRNA produzido a partir do marcador amplificável por Northern blotting).
[00155] O especialista estará ciente de que a introdução do vetor de
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54/65 ácido nucleico na célula hospedeira pode ser realizada usando métodos adequados conhecidos na técnica, por exemplo, transfecção mediada por lipídios, microinjeção, fusão celular (como microcélula), eletroporação ou bombardeio de microprojetos. Em uma modalidade, o vetor de ácido nucleico é introduzido na célula hospedeira por eletroporação. Será entendido que a escolha do método a ser usado para a introdução do vetor de ácido nucleico pode ser escolhida dependendo do tipo de célula hospedeira de mamífero utilizada.
[00156] Uma vez dentro da célula hospedeira de mamífero, o vetor de ácido nucleico se integra aleatoriamente no genoma endógeno da célula hospedeira de mamífero. Portanto, o método compreende adicionalmente a seleção da célula hospedeira de mamífero na qual os ácidos nucleicos codificados no vetor de ácido nucleico foram integrados (por exemplo, usando um marcador de seleção de resistência a antibióticos, como um marcador de resistência a zeocina).
[00157] O especialista terá conhecimento de métodos para incentivar a integração do vetor de ácido nucleico, por exemplo, linearizando o vetor de ácido nucleico se ele for naturalmente circular (por exemplo, BACs, PACs, cosmídeos ou fosmídeos). O vetor de ácido nucleico pode adicionalmente compreender áreas de homologia compartilhada com os cromossomos endógenos da célula hospedeira de mamífero para orientar a integração a um local selecionado dentro do genoma endógeno. Além disso, se locais de recombinação estiverem presentes no vetor de ácido nucleico, eles poderão ser usados para recombinação direcionada. Por exemplo, o vetor de ácido nucleico pode conter um local loxP que permite a integração direcionada quando combinado com a recombinase Cre (isto é, usando o sistema Cre/lox derivado do bacteriófago Pl). Alternativamente (ou adicionalmente), o local de recombinação é um local att (por exemplo, a partir de fago lambda), em que o local att permite a integração direcionada ao local na presença de uma
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55/65 lambda integrase. Isso permitiría que os genes retrovirais fossem direcionados para um locus dentro do genoma endógeno que permite a expressão alta e/ou estável.
[00158] Outros métodos de integração direcionada são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, métodos para induzir a clivagem direcionada do DNA genômico podem ser usados para incentivar a recombinação direcionada em um locus cromossômico selecionado. Esses métodos geralmente envolvem o uso de sistemas de clivagem projetados para induzir uma quebra de fita dupla (DSB) ou um corte no genoma endógeno para induzir o reparo da quebra por processos naturais, como junção de extremidade não homóloga (NHEJ) ou reparo usando um reparo modelo (ou seja, reparo direcionado à homologia ou HDR).
[00159] A clivagem pode ocorrer através do uso de nucleases específicas, como nucleases de dedo de zinco manipuladas (ZFN), nucleases efetoras do tipo ativador de transcrição (TALENs), usando o sistema CRISPR/Cas9 com um RNA crRNA/tracr manipulado (‘RNA guia único’) para orienta a clivagem específica e/ou o uso de nucleases baseadas no sistema Argonaute (por exemplo, de T. thermophilus, conhecido como ‘TtAgo’, ver Swarts et al. (2014) Nature 507 (7491): 258 a 261). A clivagem direcionada usando um desses sistemas de nuclease pode ser explorada para inserir um ácido nucleico em um local alvo específico usando processos mediados por HDR ou NHEJ. Portanto, em uma modalidade, o método compreende adicionalmente integrar as sequências de ácido nucleico codificadas no vetor de ácido nucleico no genoma (isto é, um cromossomo endógeno) da célula hospedeira do mamífero usando pelo menos uma nuclease, em que a pelo menos uma nuclease cliva o genoma da célula hospedeira de mamífero, de modo que as sequências de ácidos nucleicos sejam integradas no genoma da célula. Em uma modalidade adicional, a pelo menos uma nuclease é selecionada do grupo que consiste em uma nuclease de
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56/65 dedo de zinco (ZFN), uma nuclease TALE (TALEN), um sistema de nuclease CRISPR/Cas e combinações dos mesmos.
[00160] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provida uma célula retroviral de empacotamento ou produção obtida pelo método aqui definido.
[00161] A linhagem celular obtida utilizando os métodos aqui definidos pode ser usada para produzir uma linhagem celular com título melhorado de partícula de vetor retroviral.
[00162] As referências aqui feitas ao termo “título” se referem a uma quantidade eficaz de vetor ou partícula retroviral que é capaz de transduzir uma célula alvo, como uma célula do paciente. Em uma modalidade, um título alto excede 106 TU/ml sem concentração (TU = unidades de transdução).
[00163] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provido um método para produzir uma partícula de vetor retroviral com defeito de replicação, compreendendo as etapas de:
(a) transfectar o vetor de ácido nucleico aqui descrito em uma cultura de células hospedeiras de mamíferos;
(b) cultivar as células hospedeiras de mamíferos transfectadas em um meio que contém uma concentração de um agente de seleção que inibe o crescimento das células hospedeiras de mamíferos transfectadas que expressam níveis insuficientes do marcador de seleção amplificável;
(c) selecionar células hospedeiras de mamífero transfectadas capazes de crescer no referido meio, em que as células hospedeiras de mamífero transfectadas selecionadas contêm um número amplificado de cópias do vetor de ácido nucleico integrado no genoma da célula hospedeira de mamífero transfectada; e (d) cultivar adicionalmente as células hospedeiras de mamífero selecionadas na etapa (c) sob condições nas quais a partícula do vetor
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57/65 retroviral com defeito de replicação é produzida.
[00164] As etapas (b) e (c) podem ser repetidas com concentrações progressivamente crescentes do agente de seleção. Portanto, em uma modalidade, a amplificação dos genes exógenos é alcançada por seleção para resistência a níveis progressivamente aumentados de um agente de seleção, repetindo as etapas (b) e (c).
[00165] Se os genes alvo forem integrados nos cromossomos endógenos com um marcador selecionável, como um gene de resistência a antibióticos, o método poderá compreender adicionalmente a seleção das células hospedeiras de mamíferos nas quais os ácidos nucleicos retrovirais foram integrados com sucesso. Portanto, em uma modalidade, o método compreende uma etapa adicional, após a etapa (a), de selecionar dentro da cultura uma célula hospedeira de mamífero que possui as sequências de ácido nucleico codificadas no vetor integradas a um cromossomo endógeno da célula hospedeira de mamífero.
[00166] Como descrito anteriormente, em uma modalidade, a célula hospedeira de mamífero é selecionada a partir de uma célula HEK 293, célula CHO, célula Jurkat, célula KS62, célula PerC6, célula HeLa ou um derivado ou equivalente funcional das mesmas. Em uma modalidade adicional, a célula hospedeira de mamífero é uma célula HEK 293 ou derivada de uma célula HEK 293. Tais células podem ser linhagens celulares aderentes (isto é, crescem em uma única camada ligada a uma superfície) ou linhagens celulares adaptadas/não aderentes à suspensão (isto é, crescem em suspensão em um meio de cultura). Ainda em uma modalidade adicional, a célula HEK 293 é uma célula HEK 293T. Outros exemplos de linhagens celulares adequadas comercialmente disponíveis incluem linhagens celulares T REX™ (Life Technologies).
[00167] Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é negativa para o marcador de seleção amplificável. Isto é, que o genoma da célula
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58/65 hospedeira não compreende um gene marcador de seleção amplificável endógena. Por exemplo, ao usar DHFR como marcador de seleção amplificável, é preferível empregar cepas hospedeiras negativas para DHFR, como CHO DG44 ou CHO DUX-B11. Em uma modalidade, a célula hospedeira é uma cepa hospedeira GS negativa. Em uma modalidade, a célula hospedeira é modificada para eliminar o gene gs endógeno. Os métodos para eliminar genes específicos de uma célula são bem conhecidos na técnica, por exemplo, usando nucleases de dedo de zinco. Em uma modalidade preferida, a célula hospedeira é uma célula HEK293T negativa para GS. No entanto, a invenção não é limitada pela escolha de uma linhagem de células hospedeiras específica.
[00168] Será entendido pelo especialista que as condições utilizadas no método aqui descrito dependerão da célula hospedeira utilizada. As condições típicas, por exemplo, o meio de cultura ou a temperatura a ser usada, são bem conhecidas na técnica. Em uma modalidade, a cultura é realizada incubando a célula hospedeira do mamífero em condições umidificadas. Em outra modalidade, as condições umidificadas compreendem a incubação das células transfectadas a 37 °C a 5% de CO2. Em uma modalidade, a cultura é realizada usando um meio de cultura selecionado a partir de: Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo 10% (vol/vol) de soro bovino fetal (FBS), meio UltraCULTURE™ sem soro (Lonza, No. de Cat. 12-725F), meio BalanCD HEK293® (Irvine Scientific No. de Cat. 911615) ou meio FreeStyle™ Expression (Thermo fisher, No. de Cat. 12338 018).
[00169] Os métodos de cultura apropriados são bem conhecidos das pessoas versadas na técnica. Por exemplo, a célula pode ser cultivada em suspensão e/ou em condições livres de componentes animais. Em uma modalidade, a célula é adequada para cultura em qualquer volume de meio de cultura, de 10 ml (por exemplo, em frascos agitadores) a 10 L, 50 L, 100 L ou mais (por exemplo, em biorreatores).
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59/65 [00170] Em uma modalidade, o método compreende adicionalmente isolar a partícula de vetor retroviral com defeito de replicação. Por exemplo, em uma modalidade, o isolamento é realizado usando um filtro. Em uma modalidade adicional, o filtro é uma membrana de ligação de baixa proteína (por exemplo, uma membrana de ligação de 0,22 pm de baixa proteína ou uma membrana de ligação de 0,45 pm), como membranas artificiais de fluoreto de polivinilideno (PVDF) ou polietersulfona (PES).
[00171] Uma vez dentro da célula hospedeira de mamífero, os ácidos nucleicos retrovirais presentes no vetor de ácido nucleico podem se integrar em um locus único e aleatório dentro do genoma endógeno. A etapa de integração pode ser incentivada como descrito anteriormente, por exemplo, usando linearização e/ou áreas de homologia compartilhada. Os locais de recombinação também podem ser usados para recombinação direcionada.
[00172] Uma vez isoladas, as partículas do vetor retroviral podem ser concentradas para aplicações in vivo. Os métodos de concentração incluem, por exemplo, ultracentrifugação, precipitação ou cromatografia de troca aniônica. A ultracentrifugação é útil como um método rápido para a concentração de vetores retrovirais em pequena escala. Alternativamente, a cromatografia de troca aniônica (por exemplo, usando cartuchos de membrana de troca aniônica Mustang Q) ou precipitação (por exemplo, usando PEG 6000) são particularmente úteis para o processamento de grandes volumes de sobrenadantes de vetores lentivirais.
[00173] De acordo com um aspecto adicional da invenção, é provida uma partícula de vetor retroviral com defeito de replicação obtida pelo método aqui definido.
[00174] A invenção será agora descrita em mais detalhes com referência aos seguintes Exemplos não limitativos.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Guia de Construção (BAC)
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60/65 [00175] A Figura 1 mostra um guia passo a passo para a construção de BACpack-WTGP-277delU5 e BACpack-SYNGP-277delU5. Devido às extremidades compatíveis de um digestão Xbal e Nhel, os genes de empacotamento lentiviral foram progressivamente carregados no vetor pSmart BAC. No ponto da adição de GagPol, foram feitos 2 construtos contendo GagPol do tipo selvagem (WTGP) ou GagPol otimizado para códons, SYNGP. Estes receberam a nomenclatura de BACpack-WTGP e BACpack-SYNGP, respectivamente. O cassete de transferência foi então carregado em ambas os construtos gerando BACpackWTGP-277delU5 e BACpackSYNGP-277delU5.
Exemplo 2: Seleção de um agrupamento policlonal estável [00176] Os agrupamentos de transfectantes estáveis policlonais foram gerados por transfecção da linhagem celular aderente, HEK293T, com BACpackSYNGP-277delU5 ou BACpackWTGP-277delU5. Eventos de integração bem-sucedidos foram selecionados para Zeocina.
[00177] Para avaliar a capacidade desses agrupamentos policlonais de gerar vetor lentiviral, as células foram induzidas com doxiciclina (I) ou deixadas não induzidas (UI) e comparadas com células HEK293T não transfectadas.
[00178] Os resultados mostram o título em unidades de transdução (TU)/mL do sobrenadante do vetor lentiviral coletado de cada condição de transfecção. Pode ser visto pelos resultados da titulação na Figura 2 que os agrupamentos policlonais estáveis, gerados com BACpackSYNGP-277delU5 ou BACpackWTGP-277delU5, são capazes de produzir vetor lentiviral em concentrações na região de 10e7 TU/mL, comparável ao atual sistema de transfecção transitória.
[00179] Os resultados confirmam que o vetor BAC único contendo todos os genes de empacotamento necessários para a produção de lentivírus pode gerar linhagens celulares capazes de produzir vetor de lentivírus com um
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61/65 título adequado.
Exemplo 3: Gerando clones de suspensão de transfecção estáveis [00180] O objetivo principal de gerar linhagens celulares produtoras de vetores lentivirais usando a tecnologia BAC é aplicar rapidamente novos avanços à plataforma. Esses avanços provavelmente incluirão a modificação de linhagens celulares especializadas. Por exemplo, é um padrão da indústria aumentar o rendimento produzindo produtos biológicos em células em suspensão à medida que crescem em densidades maiores que as células aderentes. No entanto, o atual sistema de produção de vetores lentivirais conta com altas taxas de transfecção que são mais difíceis de obter em células em suspensão do que as células HEK293T aderentes. Como a eficiência da transfecção é menos preocupante ao gerar uma linhagem celular estável devido à seleção de inteiros bem-sucedidos, o construto BAC é uma solução ideal para gerar linhagens celulares de suspensão produtoras de vetores lentivirais.
[00181] Como demonstrado anteriormente, o construto BAC é capaz de gerar linhagens celulares produtoras de vetores lentivirais a partir de células HEK293T aderentes. Para provar a flexibilidade dos construtos BAC, linhagens celulares transfectantes estáveis foram geradas a partir da linhagem celular de suspensão HEK293 6E. As células HEK293 6E foram transfectadas com o construto BAC BACpackWTGP-277delU5 e depois selecionadas com Zeocina. Isto foi seguido por clonagem para gerar linhagens celulares clonais. Os resultados na Figura 3 mostram o sinal GFP gerado pelas linhagens celulares estáveis. Isso indica a presença de resistência à Zeocina e um cassete de expressão GFP funcional no segmento de vetor de transferência.
[00182] Este resultado sugere que o construto BAC é capaz de gerar clones estáveis a partir de várias linhagens celulares.
Exemplo 4: Indução de lentivírus nos clones de suspensão [00183] A fim de confirmar a capacidade dos clones de suspensão
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62/65 estável para produzir o vetor lentiviral, os clones 1, 14, 15 e 16 foram induzidos com 2 μg/ml de doxiciclina e o sobrenadante medido quanto ao título viral por transdução de células HEK293T.
[00184] Os resultados na Figura 4 mostram o título em unidades de transdução (TU)/mL do sobrenadante do vetor lentiviral coletado em cada clone. Os resultados mostram claramente que as linhagens celulares geradas por transfecção estável da linhagem celular de suspensão HEK293 6E com BACpackWTGP-277delU5 são capazes de produzir vetor lentiviral com rendimentos comparáveis ao sistema de transfecção transiente atual.
Exemplo 5: Título de vetor de clones [00185] Os clones 1 e 16, como descrito na Figura 4, foram passados em cultura e induzidos e titulados em momentos posteriores para determinar se a produção de vetores era estável a partir desses clones altamente produtivos. Como mostrado nas Figuras 5A e 5B, os títulos de vetores desses clones realmente aumentaram modestamente entre a passagem 5 e a passagem 21, possivelmente devido a um aumento na concentração de butirato de sódio introduzido no método de indução.
Exemplo 6: Guia de construção (BAC + DHFR) [00186] A Figura 6 mostra um guia passo a passo para a construção de BACpackWTGP-DHFR-277delU5 e BACpackSYNGP-DHFR-277delU5. Devido às extremidades compatíveis de um digestão Xbal e Nhel, os genes de empacotamento lentiviral são progressivamente carregados no vetor pSmart BAC. No ponto da adição de GagPol, são feitos 2 construtos contendo GagPol do tipo selvagem (WTGP) ou GagPol otimizado para códons, SYNGP. Eles recebem a nomenclatura de BACpack-WTGP e de BACpack-SYNGP, respectivamente. O cassete DHFR e subsequentemente o cassete de transferência são então carregados em ambos os construtos gerando BACpackWTGP-DHFR-277delU5 e BACpackSYNGP-DHFR-277delU5.
Exemplo 7: Seleção de um agrupamento policlonal estável e amplificação
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63/65 genômica por solução MTX [00187] Os conjuntos de transfectantes estáveis policlonais são gerados através da transfecção da linhagem celular aderente, HEK293T, com BACpackWTGP-DHFR-277delU5 ou BACpackSYNGP-DHFR-277delU5. Eventos de integração bem-sucedidos são então selecionados com Zeocina, e a capacidade desses agrupamentos policlonais de gerar o vetor lentiviral é avaliada após a indução com Doxiciclina e comparada com células HEK293T não transfectadas. As células aderentes transfectadas são transferidas para um meio isento de soro e crescidas em frascos de Erlenmeyer sob condições de agitação para adaptar as células para crescer em suspensão.
[00188] Para gerar linhagens celulares de suspensão produtoras de vetores lentivirais, o agrupamento estável policlonal é adaptado para crescer em suspensão. Isto é seguido pela amplificação genômica dos genes retrovirais e do transgene, submetendo as células a concentrações crescentes de MTX, passo a passo. As células são semeadas em meio contendo 100 pg/ml de MTX e cultivadas por 14 a 21 dias, ou até a viabilidade ser superior a 90%, antes de serem submetidas à próxima concentração mais alta de MTX. Para verificar se ocorreu a amplificação dos genes retrovirais, após cada rodada de amplificação, o número de cópias do vetor de ácido nucleico é avaliado por PCR digital de gotículas; e a capacidade de gerar vetores lentivirais é comparada com a da etapa anterior.
Exemplo 8: Guia de construção (BAC + GS) [00189] A Figura 8 mostra um guia passo a passo para a construção de um construto de LV-BAC contendo o gene marcador de seleção gs por substituição do cassete de expressão DHFR por um cassete de expressão GS. Um fragmento MauBI-Mrel é gerado pela sobreposição de PCR usando os vetores LV-BAC e pTAR-GS-RFP como modelos para as sequências BAC e gs, respectivamente (Figura 3A e 3B). Devido às extremidades cegas do produto da polimerase, o amplicon é subclonado no vetor pCR™ -Blunt II
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TOPO™ (Figura 3C) antes de carregar no LV-BAC digerido com MauBIMrel (Figura 3D). Esse construto recebe a nomenclatura de BAC2.0_GS.
Exemplo 9: Modificação de células de mamíferos no gene GS inativado [00190] As células HEK293T são transfectadas com nucleases de dedos de zinco (ZFNs) direcionadas ao gene gs e a atividade de ZFN no agrupamento transfectado é confirmada e medida pelo ensaio CELL-I ou T7. Os clones celulares são gerados a partir do agrupamento transfectado, e até 500 clones são rastreados para identificar aqueles com indels de deslocamento de quadros (inserções ou deleções) em todas as cópias do gene gs. Os clones positivos são expandidos, depositados e o genótipo é confirmado por amplificação por PCR das sequências modificadas, seguidas pelo sequenciamento.
Exemplo 10: Transfecção de células HEK293T GS negativas e seleção de um agrupamento policlonal estável usando MSX [00191] Até três clones de células GS inativadas e células HEK293T parentais são transfectadas com um construto de LV-BAC. Eventos de integração bem-sucedidos são selecionados inicialmente com Zeocina, e a capacidade dos clones inativados para GS HEK293T de gerar vetor lentiviral é avaliada após a indução com doxiciclina e comparada com a linhagem celular parental transfectada HEK293T. O melhor produtor de vetor lentiviral entre clones negativos para GS é então escolhido para transfecção com BAC2.0_GS. Após a transfecção, a integração do BAC nas regiões ativas da transcrição é selecionada para um único ciclo de diferentes concentrações de MSX (0, 5, 10, 25, 50 μΜ) por 3 a 4 semanas. A Zeocina também é usado para selecionar eventos de integração do BAC2.0_GS e o agrupamento policlonal de zeocina serve como controle para a capacidade dos agrupamentos policlonais estáveis do MSX em gerar vetor lentiviral. Maior produtividade lentiviral pode ser alcançada ainda mais por amplificação de genes. Os pools estáveis policlonais selecionados com MSX são cultivados
Petição 870190099643, de 04/10/2019, pág. 73/95
65/65 em meios contendo uma concentração aumentada de MSX (100 a 500 μΜ) por 3 a 4 semanas após as quais as células são expandidas e a produtividade lentiviral é avaliada. Para gerar linhagens celulares de suspensão produtoras de vetores lentivirais, os agrupamentos estáveis policlonais são adaptados para crescer em suspensão e a estabilidade da produção de lentivirais na presença e ausência de MSX é avaliada.
[00192] Será entendido que as modalidades descritas neste documento podem ser aplicadas a todos os aspectos da invenção. Além disso, todas as publicações, incluindo, sem limitação, patentes e pedidos de patentes, citadas neste relatório descritivo, são aqui incorporadas por referência como se fossem totalmente estabelecidas.
Claims (28)
- REIVINDICAÇÕES1. Célula de empacotamento retroviral, caracterizada pelo fato de que compreende sequências de ácidos nucleicos que codificam:proteínas gag e pol;proteína env ou um substituto funcional da mesma; e um marcador de seleção amplificável;como construtos de expressão individuais, em que os referidos construtos de expressão são todos integrados juntos em um único local no genoma da célula de empacotamento retroviral como uma unidade; e em que o número de cópias da unidade é dois ou mais.
- 2. Célula de empacotamento retroviral de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o marcador de seleção amplificável é di-hidrofolato redutase (DHFR) ou glutamina sintetase (GS).
- 3. Célula de empacotamento retroviral de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que quando o marcador de seleção amplificável é DHFR, o construto de expressão compreendendo a sequência de ácido nucleico que codifica DHFR compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1.
- 4. Célula de empacotamento retroviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a unidade compreende adicionalmente um construto de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um marcador selecionável.
- 5. Célula de empacotamento retroviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a unidade compreende adicionalmente um construto de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um gene auxiliar rev ou um gene funcionalmente análogo ou um sistema funcionalmente análogo.
- 6. Célula de empacotamento retroviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que as sequências dePetição 870190099643, de 04/10/2019, pág. 75/952/6 ácido nucleico que codificam as proteínas gag e pol, a proteína env ou um substituto funcional da mesma, ou a sequência de ácido nucleico de um gene auxiliar rev ou um gene funcionalmente análogo ou um sistema funcionalmente análogo são derivados de um retrovirus selecionado entre lentivírus, alfaretrovírus, gama-retrovírus ou retrovirus espumoso.
- 7. Célula de empacotamento retroviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que um ou mais dos construtos de expressão compreendem um promotor de CMV, de preferência em que o promotor de CMV compreende adicionalmente pelo menos um operon Tet.
- 8. Célula de empacotamento retroviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente um isolador, de preferência em que um isolador está presente entre cada um dos construtos de expressão.
- 9. Célula de empacotamento retroviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de mamífero, de preferência em que a célula de mamífero é HEK 293T.
- 10. Célula de empacotamento retroviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a unidade compreende adicionalmente um construto de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um genoma de RNA de uma partícula de vetor retroviral.
- 11. Célula produtora de retrovirais, caracterizada pelo fato de que compreende sequências de ácidos nucleicos que codificam:proteínas gag e pol;proteína env ou um substituto funcional da mesma;um marcador de seleção amplificável; e um genoma de RNA de uma partícula de vetor retroviral como construtos de expressão individuais, em que os referidosPetição 870190099643, de 04/10/2019, pág. 76/953/6 construtos de expressão são todos integrados em um único local no genoma da célula de produção retroviral como uma unidade; e em que o número de cópias da unidade é dois ou mais.
- 12. Vetor de ácido nucleico compreendendo uma origem de replicação não mamífera e a capacidade de reter pelo menos 25 kilobases (kb) de DNA, caracterizado pelo fato de que o referido vetor de ácido nucleico compreender sequências de ácidos nucleicos que codificam:proteínas gag e pol, uma proteína env ou um substituto funcional da mesma, e um marcador de seleção amplificável, em que cada uma das sequências de ácidos nucleicos é disposta como construtos de expressão individuais dentro do vetor de ácido nucleico.
- 13. Vetor de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o marcador de seleção amplificável é DHFR ou GS.
- 14. Vetor de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que quando o marcador de seleção amplificável é DHFR, o construto de expressão compreendendo a sequência de ácido nucleico que codifica DHFR compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1.
- 15. Vetor de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um construto de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um marcador selecionável.
- 16. Vetor de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um construto de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico de um gene auxiliar rev ou um gene análogo ao mesmo ou um sistema funcionalmente análogo.Petição 870190099643, de 04/10/2019, pág. 77/95
- 17. Vetor de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 16, caracterizado pelo fato de que o vetor de ácido nucleico é selecionado dentre: um cromossomo artificial bacteriano, um cromossomo artificial de levedura, um cromossomo artificial derivado de Pl, um fosmídeo ou um cosmídeo, de um modo preferido um cromossomo bacteriano artificial.
- 18. Vetor de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente sequências de ácido nucleico que codificam um genoma de RNA de uma partícula de vetor retroviral.
- 19. Método para produzir uma linhagem celular de empacotamento retroviral estável, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) transfectar o vetor de ácido nucleico como definido em qualquer uma das reivindicações 12 a 18 em uma cultura de células hospedeiras de mamíferos;(b) cultivar as células hospedeiras de mamíferos transfectadas em um meio que contém uma concentração de um agente de seleção que inibe o crescimento das células de mamíferos transfectadas que expressam níveis insuficientes do marcador de seleção amplificável; e (c) selecionar células hospedeiras de mamífero transfectadas capazes de crescer no referido meio, em que as células hospedeiras de mamífero transfectadas selecionadas contêm um número amplificado de cópias do vetor de ácido nucleico integrado no genoma da célula hospedeira de mamífero transfectada.
- 20. Método para produzir uma linhagem de células produtoras de retrovirais estáveis, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) transfectar o vetor de ácido nucleico como definido na reivindicação 18 em uma cultura de células hospedeiras de mamíferos;(b) cultivar as células hospedeiras de mamíferos transfectadasPetição 870190099643, de 04/10/2019, pág. 78/955/6 em um meio que contém uma concentração de um agente de seleção que inibe o crescimento das células hospedeiras de mamíferos transfectadas que expressam níveis insuficientes do marcador de seleção amplificável; e (c) selecionar células hospedeiras de mamífero transfectadas capazes de crescer no referido meio, em que as células hospedeiras de mamífero transfectadas selecionadas contêm um número amplificado de cópias do vetor de ácido nucleico integrado no genoma da célula hospedeira de mamífero transfectada.
- 21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 ou 20, caracterizado pelo fato de que as etapas (b) e (c) são repetidas duas ou mais vezes.
- 22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 21, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma etapa, após a etapa (a), de selecionar dentro da cultura uma célula hospedeira de mamífero que possui as sequências de ácido nucleico codificadas no vetor integradas ao genoma da célula hospedeira de mamífero.
- 23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato de que o agente de seleção é um inibidor de DHFR, de um modo preferido metotrexato (MTX), ou um inibidor de GS, de um modo preferido metionina sulfoximina (MSX).
- 24. Célula de empacotamento retroviral, caracterizada pelo fato de ser obtida pelo método como definido na reivindicação 19, ou em qualquer uma das reivindicações 21 a 23, quando dependente da reivindicação 19.
- 25. Célula produtora de retrovirais, caracterizada pelo fato de ser obtida pelo método como definido na reivindicação 20, ou em qualquer uma das reivindicações 21 a 23, quando dependente da reivindicação 20.
- 26. Método para produzir uma partícula de vetor retroviral com defeito de replicação, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:(a) transfectar o vetor de ácido nucleico como definido emPetição 870190099643, de 04/10/2019, pág. 79/956/6 qualquer uma das reivindicações 12 a 18 em uma cultura de células hospedeiras de mamíferos;(b) cultivar as células hospedeiras de mamíferos transfectadas em um meio que contém uma concentração de um agente de seleção que inibe o crescimento das células hospedeiras de mamíferos transfectadas que expressam níveis insuficientes do marcador de seleção amplificável;(c) selecionar células hospedeiras de mamífero transfectadas capazes de crescer no referido meio, em que as células hospedeiras de mamífero transfectadas selecionadas contêm um número amplificado de cópias do vetor de ácido nucleico integrado no genoma da célula hospedeira de mamífero transfectada; e (d) cultivar adicionalmente as células hospedeiras de mamífero selecionadas na etapa (c) sob condições nas quais a partícula do vetor retroviral com defeito de replicação é produzida.
- 27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a etapa de isolar a partícula de vetor retroviral com defeito na replicação.
- 28. Partícula de vetor retroviral com defeito de replicação caracterizada pelo fato de ser obtida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 26 ou 27.
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