CN110520535B

CN110520535B - 用于逆转录病毒产生的稳定细胞系

Info

Publication number: CN110520535B
Application number: CN201880025904.6A
Authority: CN
Inventors: C.文克
Original assignee: GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Current assignee: GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Ltd
Priority date: 2017-04-18
Filing date: 2018-04-18
Publication date: 2024-01-09
Anticipated expiration: 2038-04-18
Also published as: JP6878620B2; WO2018192981A1; CA3058972A1; BR112019020941A2; US11795474B2; GB201706121D0; CN110520535A; US20200095606A1; EP3612634A1; JP2020516307A

Abstract

本发明涉及逆转录病毒生产细胞，其包含编码以下的核酸序列：gag和pol蛋白；包膜蛋白或其功能性替代物；可扩增选择标记；和逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组；其中所述核酸序列全部整合于逆转录病毒生产细胞基因组内的单一基因座处。本发明还涉及包含非哺乳动物复制起点且能够容纳至少25千碱基(kb)的DNA的核酸载体，其特征在于所述核酸载体包含编码以下的逆转录病毒核酸序列：gag和pol蛋白，和env蛋白或其功能性替代物。所述核酸载体另外包含编码可扩增选择标记的核酸序列。本发明还涉及使用所述核酸载体以产生稳定的逆转录病毒包装和生产细胞系的用途和方法。

Description

用于逆转录病毒产生的稳定细胞系

发明领域

本发明涉及包含逆转录病毒载体产生所需的基因的核酸载体及其用途。还提供了制备包含本文所述的核酸载体的逆转录病毒包装/生产细胞系的方法。

发明背景

在基因疗法中，将遗传物质递送至需要治疗的主体中的内源性细胞。遗传物质可将新基因引入主体，引入预先存在的基因的额外拷贝，或引入存在于主体中的基因的不同等位基因或变体。已经提出病毒载体系统作为用于基因疗法的有效基因递送方法(Verma和Somia(1997)Nature 389:239-242)。

具体而言，这些病毒载体基于逆转录病毒家族成员，因为它们能够将其基因有效载荷整合至宿主的基因组中。逆转录病毒载体被设计用于保留包装和递送逆转录病毒基因组所需的必需蛋白，但除去任何非必需辅助蛋白，包括引起其疾病概况的那些。逆转录病毒载体的实例包括慢病毒载体，诸如基于人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的那些，由于它们能够整合至非增殖细胞中而被广泛使用。

目前，大多数病毒载体通过将病毒基因瞬时共转染至宿主细胞系中而产生。使用存在于宿主细胞中的细菌质粒仅在有限的时间段内引入病毒基因，因为病毒基因保留在质粒上并且不整合至基因组中。因此，瞬时转染的遗传物质在细胞分裂期间不会传递给后代。

存在与瞬时转染方法相关的几个缺点，诸如批次间差异性、转染试剂的高成本和难以维持质量控制(参见Segura等人(2013)Expert Opin.Biol.Ther.13(7):987-1011)。转染过程本身也是费力的并且难以扩大规模。除去载体制备期间遗留的质粒杂质也是困难的任务(参见Pichlmair等人(2007)J.Virol.81(2):539-47)。

为了解决与瞬时转染相关的问题，期望开发逆转录病毒包装和生产细胞系以简化逆转录病毒载体生产。

已经通过用质粒转染能够包装逆转录病毒载体的细胞系生成包装细胞系，其中个别质粒携带逆转录病毒包装基因和独特的真核选择标记。逆转录病毒包装基因被整合至包装细胞系的基因组中，并被描述为被稳定转染。在过去的20年中，已经做出各种尝试来生成用于逆转录病毒载体的稳定包装和生产细胞系。

经由将逆转录病毒载体组分整合至宿主细胞基因组中产生的包装和生产细胞系中存在许多报道的问题。首先，依次引入逆转录病毒载体组分可能是费力且不灵活的。当逆转录病毒载体组分被整合至宿主细胞基因组中时，也存在其遗传和/或转录不稳定性的问题，因为整合位点是不可预测的(Ni等，(2005)J.Gene Med.7:818–834.)。

在生产细胞系的悬浮适应和增大规模期间也报道了病毒载体生产力的显著下降(Farson等人(2001)Hum.Gene Ther.12:981–997；Guy等人(2013)Hum.GeneTher.Methods.24(2):125-39)。

生物制药工业内也已经作出尝试来生产提供可靠高滴度的重组蛋白的转染细胞系。此类过程通常涉及筛选转染的细胞以鉴定具有重组蛋白的最佳生长和产生的细胞系(例如，参见Wurm,2004,Nature Biotechnology 22,1393-1398)。

已知的方法涉及选择稳定转染的细胞系，其中目标重组基因已经整合至宿主细胞的基因组中并扩增，使得该细胞系包含增加拷贝数的目标重组基因。这通过用目标重组基因连同被已知毒性药物抑制的可扩增选择标记基因共转染宿主细胞来进行。然后，例如通过在含有毒性药物的培养基中培养转染的细胞，使稳定转染的细胞经受渐增浓度的已知毒性药物。以该方式，可以选择转染细胞群体，其通过基因扩增具有增加拷贝数的可扩增选择标记基因，导致可扩增选择标记的表达水平增加，且由此赋予对毒性药物的抗性。由于基因扩增过程导致可扩增选择标记和周围DNA序列的扩增，在目标重组基因在宿主细胞基因组内与编码可扩增选择标记的基因相邻整合的情况下，可能共同扩增编码目标重组基因的核酸序列连同编码可扩增选择标记的那些。该过程依赖于可扩增选择标记基因和目标重组基因体内连接和整合至宿主细胞基因组中(Kaufman,等人1985,Mol.Cell.Biol.5:1750-1759)。

鉴于目前可得的用于获得稳定转染的包装和生产细胞系用于产生逆转录病毒载体的的方法要求逆转录病毒基因依次整合至宿主细胞基因组中，并且每个整合事件的位点都是随机且不可预测的，所以极难获得这样的细胞系，其中所有逆转录病毒基因已经整合至可扩增选择标记基因附近，以获得其中逆转录病毒基因已经扩增的细胞系。因此，设想采用建立的选择程序使用可扩增选择标记来选择产生高滴度的病毒载体的细胞系是不切实际的。

因此，本发明的目的是提供制备稳定逆转录病毒包装和生产细胞系的方法，其克服了与现有方法相关的一个或多个缺点。

发明概述

本发明人已开发了制备逆转录病毒包装和生产细胞系的新方式，其涉及使用包含非哺乳动物复制起点且能够容纳至少25千碱基(kb)DNA的核酸载体，诸如包含逆转录病毒载体生产所必需的逆转录病毒基因和可扩增选择标记基因的细菌人工染色体。这允许表达产生复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒所需的逆转录病毒基因以改善与瞬时转染方法相关的问题。此外，由于必需的逆转录病毒基因和可扩增选择标记基因全部都在单一核酸载体中转染至宿主细胞中，所以该核酸载体整合至宿主基因组中的单一基因座中。这改善与依次转染、引起在宿主基因组内的不同基因座处整合逆转录病毒基因相关的问题，以及与使用可扩增选择标记以扩增所述细胞中的逆转录病毒基因相关的问题。

包含非哺乳动物复制起点且能够容纳至少25kb DNA(即，大型构建体DNA)的核酸载体的使用具有几个优点。首先，可以首先在非哺乳动物细胞(例如，微生物细胞，诸如细菌细胞)而不是哺乳动物宿主细胞中操作载体，这使得它们更易于使用(例如，细菌人工染色体可以首先在大肠杆菌中操作)。一旦已制备核酸载体，就可以将其引入哺乳动物宿主细胞中，并且可以选择核酸载体整合至内源染色体中的任何哺乳动物细胞以分离稳定的细胞系。

将逆转录病毒核酸引入哺乳动物宿主细胞也可以在单个步骤中发生，其有助于减少选择压力和沉默时间范围。这允许更快速筛选潜在的包装和生产细胞并降低材料成本，因为仅使用了单一载体，而不是像先前方法那样使用多个质粒载体。具体而言，通过节省质粒成本、所需的转染试剂(例如聚乙烯亚胺[PEI])、减少所需的Benzonase处理量(在慢病毒收获物中DNA的量减少，因此需要较少的Benzonase来除去下游处理中的过量)并降低测试成本(不需要测试慢病毒产物中的残留质粒)，目前系统的使用降低生产成本。

此外，逆转录病毒产生所必需的逆转录病毒基因(具有或不具有转移载体)和可扩增选择标记基因存在于核酸载体内，使得当载体被引入哺乳动物宿主细胞时，逆转录病毒基因和可扩增选择标记基因全部将整合至哺乳动物宿主细胞基因组内的一个基因座处。这可以克服诸如当逆转录病毒基因随机整合并在宿主细胞基因组内的不同基因座处整合时可能发生的基因沉默的问题。这还提供了用于产生具有高滴度的逆转录病毒载体颗粒的包装或生产细胞的程序，其中逆转录病毒基因的扩增不依赖于逆转录病毒基因在体内与可扩增选择标记的连接。

因此，根据本发明的第一个方面，提供了逆转录病毒包装细胞，其包含作为单独表达构建体的编码以下的核酸序列：

gag和pol蛋白；

env蛋白或其功能性替代物；和

可扩增选择标记；

其中所述表达构建体全部在逆转录病毒包装细胞基因组内的单个基因座处整合在一起作为单元；且

其中所述单元的拷贝数是2或更多。

在本发明的一个进一步方面，提供了逆转录病毒生产细胞，其包含作为单独表达构建体的编码以下的核酸序列：

gag和pol蛋白；

env蛋白或其功能性替代物；

可扩增选择标记；和

逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组；

其中所述表达构建体全部在逆转录病毒生产细胞基因组内的单个基因座处整合在一起作为单元；且

其中所述单元的拷贝数是2或更多。

在本发明的一个替代方面，提供了包含非哺乳动物复制起点且能够容纳至少25千碱基(kb)的DNA的核酸载体，其特征在于所述核酸载体包含编码以下的核酸序列：gag和pol蛋白，

env蛋白或其功能性替代物，和

可扩增选择标记，

其中每种核酸序列作为在核酸载体内的单独的表达构建体排列。

在本发明的又一个进一步方面，提供了产生稳定的逆转录病毒包装细胞系的方法，其包括以下步骤：

(a)将本文定义的核酸载体转染入哺乳动物宿主细胞的培养物中；

(b)使转染的哺乳动物宿主细胞在含有这样浓度的选择剂的培养基中生长，所述浓度的选择剂抑制表达不足水平的可扩增选择标记的转染的哺乳动物细胞的生长；和

(c)选择能够在所述培养基中生长的转染的哺乳动物宿主细胞，其中选择的转染的哺乳动物宿主细胞含有扩增拷贝数的整合至转染的哺乳动物宿主细胞基因组中的核酸载体。

在本发明的一个替代方面，提供了通过本文描述的方法获得的逆转录病毒包装细胞。

在本发明的一个进一步方面，提供了产生稳定的逆转录病毒生产细胞系的方法，其包括以下步骤：

(b)使转染的哺乳动物宿主细胞在含有这样浓度的选择剂的培养基中生长，所述浓度的选择剂抑制表达不足水平的可扩增选择标记的转染的哺乳动物宿主细胞的生长；和

在本发明的又一个进一步方面，提供了通过本文描述的方法获得的逆转录病毒生产细胞。

在本发明的一个替代方面，提供了产生复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒的方法，其包括以下步骤：

(b)使转染的哺乳动物宿主细胞在含有这样浓度的选择剂的培养基中生长，所述浓度的选择剂抑制表达不足水平的可扩增选择标记的转染的哺乳动物宿主细胞的生长；

(c)选择能够在所述培养基中生长的转染的哺乳动物宿主细胞，其中选择的转染的哺乳动物宿主细胞含有扩增拷贝数的整合至转染的哺乳动物宿主细胞基因组中的核酸载体；和

(d)在产生复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒的条件下进一步培养步骤(c)中选择的哺乳动物宿主细胞。

在本发明的一个进一步方面，提供了通过本文描述的方法获得的复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒。

附图

图1：构建BACpack-WTGP-277delU5和BACpack-SYNGP-277delU5的逐步指南

图2：选择稳定的多克隆合并物。使用磷酸钙用BACpackWTGagPol-Transfer转染HEK293T贴壁细胞。博莱霉素(Zeocin)选择2周后生成稳定的合并物。为了观察稳定转染子是否能够生成病毒，用多西环素(Doxycycline)诱导稳定的多合并物48小时。诱导48小时后收获病毒上清液，通过0.22μm过滤器过滤并通过转导HEK293T细胞进行滴定。GFP阳性转导细胞用于计算转导单位/ml(TU/mL)。

图3：生成稳定的转染悬浮克隆。使用293fectin试剂用BACpackWTGagPol-Transfer转染HEK293 6E细胞。博莱霉素选择2周后生成稳定的合并物。通过有限稀释将稳定合并物克隆至96孔板中以获得单细胞克隆，随后将其扩增。GFP通过荧光显微法检测到最佳克隆1、14、15和16，其用贴壁培养基(DMEM+FBS)、随后悬浮适应(FreeStyle培养基)获得。

图4：在悬浮克隆中诱导慢病毒。为了观察稳定的HEK6E转染子是否能够生成病毒，用多西环素(2μg/ml)诱导20ml稳定悬浮克隆48小时。诱导48小时后收获病毒上清液，通过0.45μm过滤器过滤并通过转导HEK293T细胞进行滴定。使用GFP阳性转导细胞计算转导单位/ml(TU/mL)。

图5：根据实施例4产生的克隆的载体滴度。结果显示来自克隆1和16的载体滴度在第5代和第21代之间适度增加。

图6：构建BACpack-WTGP-DHFR-277delU5和BACpack-SYNGP-DHFR-277delU5的逐步指南。

图7：包含dhfr基因的表达构建体的核酸序列。

图8：构建BAC2.0 GS的逐步指南。

发明详述

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本文提及的所有专利和出版物都通过引用以其整体并入。

术语“包含(comprising)”涵盖“包括(including)”或“由…组成(consisting)”，例如,“包含(comprising)”X的组合物可以仅由X组成或可以包括额外的某物，例如X+Y。

术语“基本上由...组成”将特征的范围限制为具体的材料或步骤以及不会实质影响所请求保护的特征的基本特性的那些。

术语“由...组成”排除任何额外组分的存在。

关于数值x的术语“约”是指例如x±10％、5％、2％或1％。

术语“载体”或“核酸载体”是指能够将外来(即外源)遗传物质人工携带至另一个细胞中的媒介物，其可以在细胞中复制和/或表达。载体的实例包括非哺乳动物核酸载体，诸如细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1-衍生的人工染色体(PAC)、黏粒或F黏粒(fosmid)。如本文在整合至宿主细胞基因组中的上下文中所用的术语“核酸载体”是指源自已经整合至宿主细胞的基因组中的核酸载体的DNA。

载体的其他实例包括病毒载体，诸如逆转录病毒载体和慢病毒载体，其在本申请中特别感兴趣。慢病毒载体，诸如基于人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的那些被广泛使用，因为它们能够整合至非增殖细胞中。通过将病毒基因组分开成分离的部分，例如通过置于分开的质粒上，可以使病毒载体复制缺陷。例如，由Salk Institute for Biological Studies开发的所谓的第一代慢病毒载体被构建为由包装表达盒、包膜(envelope)表达盒和转移载体表达盒组成的三质粒表达系统。“包装质粒”含有完整的gag-pol序列，调节(tat和rev)和辅助(vif、vpr、vpu、nef)序列。“包膜质粒”在巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下保持用水疱性口炎病毒糖蛋白(VSVg)代替天然HIV-1包膜蛋白。第三质粒(“转移质粒”或“转移载体”)在长末端重复序列(LTR)之间携带转基因、包封序列(ψ)、Rev响应元件(RRE)序列和CMV启动子以在宿主细胞内表达转基因。

第二代慢病毒载体的特征在于缺失毒力序列vpr、vif、vpu和nef。包装载体被减少至gag、pol、tat和rev基因，因此增加系统的安全性。

为了改进慢病毒系统，第三代载体已通过如下设计：从包装构建体中除去tat基因并将来自载体盒的LTR失活，因此减少与插入诱变效应相关的问题。

各种慢病毒世代描述于以下参考文献中：第一代：Naldini等人，(1996)Science272(5259):263-7；第二代：Zufferey等人，(1997)Nat.Biotechnol.15(9):871-5；第三代：Dull等人，(1998)J.Virol.72(11):8463-7，其全部通过引用以其整体并入本文。关于慢病毒载体发展的综述可见于Sakuma等人(2012)Biochem.J.443(3):603-18和-Castro等人(2008)Exp.Opin.Therap.Patents 18(5):525–539。

术语“非哺乳动物复制起点”是指其中引发复制并源自非哺乳动物来源的核酸序列。这使得本发明的核酸载体能够在合适的宿主细胞(例如，微生物细胞，诸如细菌或酵母细胞)中与内源染色体一起稳定复制和分离，使得其可传递给宿主细胞后代(除了当宿主细胞是哺乳动物宿主细胞时)。在哺乳动物宿主细胞中，具有非哺乳动物复制起点的核酸载体将整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中或在哺乳动物宿主细胞复制后丢失。例如，具有非哺乳动物复制起点的核酸载体诸如细菌人工染色体(BAC)、P1-衍生的人工染色体(PAC)、黏粒或F黏粒能够在细菌细胞(诸如大肠杆菌)中与内源染色体一起稳定复制和分离，然而，如果将它们引入哺乳动物宿主细胞，BAC、PAC、黏粒或F黏粒将整合或在哺乳动物宿主细胞复制后丢失。酵母人工染色体(YAC)能够在酵母细胞中与内源染色体一起稳定复制和分离，然而，如果它们被引入哺乳动物宿主细胞，YAC将整合或在哺乳动物宿主细胞复制后丢失。因此，在本上下文中，本发明的核酸载体充当DNA的储库(即，对于产生逆转录病毒所必需的基因)，其可容易地转移至哺乳动物宿主细胞中以产生用于产生逆转录病毒的稳定细胞系。非哺乳动物复制起点的实例包括细菌的复制起点，诸如oriC、oriV或oriS，或酵母的复制起点，也称为自主复制序列(ARS元件)。

本发明的核酸载体包含非哺乳动物的复制起点并且能够容纳至少25千碱基(kb)的DNA。在一个实施方案中，核酸载体能够容纳至少30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340或350kb的DNA。应理解的是，提及“容纳能力”具有其通常的含义，并且暗示核酸载体的插入片段大小的上限不小于请求保护的大小(即不小于25kb的DNA)。

本发明的目的是在单一构建体(即核酸载体)中包括逆转录病毒包装所必需的基因和可扩增选择标记基因。因此，本发明的核酸载体必须能够容纳大的DNA插入片段。为避免疑义，应理解的是，提及“核酸载体”或“人工染色体”不是指天然细菌质粒(例如，诸如目前在瞬时转染方法中使用的质粒)，因为这些不能够容纳至少25kb的DNA。质粒可含有的最大大小插入片段为约15kb。此类核酸载体也不是指通常仅容纳5-11kb的最大插入片段的噬菌体。因此，在一个实施方案中，本发明的核酸载体不是质粒、噬菌体或附加体。

术语“内源染色体”(或宿主细胞基因组)是指在产生或引入外源核酸载体诸如细菌人工染色体之前在宿主细胞中发现的基因组染色体。

如本文所用的术语“转染(transfection)”、“转化(transformation)”和“转导(transduction)”可用于描述将非哺乳动物或病毒的载体插入靶细胞(即宿主细胞)。插入载体通常称为细菌细胞的转化和真核细胞的转染，尽管插入病毒载体也可称为转导。本领域技术人员将意识到通常使用的不同的非病毒转染方法，其包括但不限于使用物理方法(例如，电穿孔、细胞挤压(cell squeezing)、声致穿孔、光学转染、原生质体融合、穿刺转染(impalefection)、磁转染、基因枪或颗粒轰击)、化学试剂(例如，磷酸钙、高度支化的有机化合物或阳离子聚合物)或阳离子脂质(例如，脂质转染)。许多转染方法需要使质粒DNA溶液与细胞接触，然后使其生长并针对标记基因表达进行选择。

术语“启动子”是指驱动基因表达的序列。为了驱动高水平表达，使用高效启动子诸如非逆转录病毒高效启动子可以是有益的。合适的启动子的实例可以包括启动子诸如人巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、脾病灶形成病毒(SFFV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子或人延伸因子1-α(pEF)启动子。

Tet操纵子(四环素控制的转录活化)可用于可诱导基因表达的方法中，其中在抗生素四环素或其衍生物之一(例如多西环素)存在下可逆地启动或关闭转录。在自然界中，Ptet启动子表达TetR(阻遏蛋白)和TetA(将四环素抗生素泵出细胞的蛋白)。在本发明中，Tet操纵子可以存在或不存在，例如，在一个实施方案中，Tet操纵子可以存在于启动子中。

术语“polyA信号”是指聚腺苷酸化信号序列，例如置于转基因的3'，其使得宿主因子能够在转录期间将聚腺苷(polyA)尾部添加至新生mRNA的末端。polyA尾部是一段最多达300个腺苷核糖核苷酸的序列，其保护mRNA免于酶促降解并且还有助于翻译。因此，本发明的核酸载体可以包括polyA信号序列，诸如人β珠蛋白或兔β珠蛋白polyA信号、猿病毒40(SV40)早期或晚期polyA信号、人胰岛素polyA信号或牛生长激素polyA信号。在一个实施方案中，polyA信号序列是人β珠蛋白polyA信号。

术语“内含子序列”是指通过RNA剪接从最终基因产物除去的核苷酸序列。已经显示在增强子/启动子区域的下游和cDNA插入片段的上游使用内含子增加基因表达的水平。表达的增加取决于特定的cDNA插入片段。因此，本发明的核酸载体可以包括内含子，诸如人β珠蛋白内含子、兔β珠蛋白内含子II或嵌合人β珠蛋白-免疫球蛋白内含子。在一个实施方案中，内含子是人β珠蛋白内含子和/或兔β珠蛋白内含子II。

术语“包装细胞系”是指具有稳定插入的gag和pol蛋白以及包膜糖蛋白基因的细胞系。或者，术语“生产细胞系”是指具有在如上所述的LTR序列之间包含目标转基因的稳定插入的“转移载体”组分(如瞬时转染方法中所用)的包装细胞系。本领域技术人员应理解，本文所述的核酸载体可用于生成包装细胞系(即当至少gag、pol和env基因存在于核酸载体上且并入宿主细胞时)或生产细胞系(即当核酸载体另外包含将与gag、pol和env基因一起并入宿主细胞中的转移载体组分时)。

术语“稳定转染的”是指能够将引入的逆转录病毒基因传递给它们的后代(即子细胞)的细胞系，这是因为转染的DNA已经并入内源染色体或经由外源染色体的稳定遗传。

术语“表达构建体”和“表达盒”可互换使用，并且如本文所用，是指能够驱动一种或多种并入的多核苷酸的表达的功能性表达单元。此类盒通常包括该多核苷酸和该多核苷酸的转录和翻译所必需的组分。例如，所述盒可以包括包含启动子、翻译起始序列信号、转录终止子(例如polyA序列)和/或自切割肽序列(例如P2A序列)的核酸序列(即重组DNA)。在一个实施方案中，所述单独表达盒包含启动子和/或转录终止子。在一个实施方案中，所述单独表达盒包含被IRES分隔的两个基因，两者均从单一启动子转录。所述构建体还可以含有本领域已知的任何其他额外组分，其可以增强或提供对多核苷酸的转录和翻译的更大控制。在一个实施方案中，所述额外组分可以是来自SV40基因组的任何核酸序列。

核酸载体

根据本发明的一个方面，提供了包含非哺乳动物复制起点且能够容纳至少25千碱基(kb)的DNA的核酸载体，其特征在于所述核酸载体包含编码以下的核酸序列：

gag和pol蛋白，

env蛋白或其功能性替代物，和

可扩增选择标记，

目前生成逆转录病毒载体颗粒的方法涉及将逆转录病毒基因瞬时转染至宿主细胞中。然而，许多缺点与该方法相关，因为其成本高、费力且难以扩大规模。一种解决方案是工程改造稳定整合逆转录病毒包装基因的包装细胞系，以避免与瞬时转染相关的问题。

本发明人已经发现，本文所述的核酸载体可用于生成逆转录病毒包装或生产细胞系，其改善先前与逆转录病毒载体生产方法相关的困难。例如，产生逆转录病毒包装细胞系的已知方法包括在引入每种逆转录病毒基因后进行多轮选择。该过程可花费最长达六个月，并且需要大量的劳力。甚至在漫长而费力的过程后获得包装细胞系后，也存在包装细胞系的悬浮适应和扩大规模期间病毒载体生产力的显著下降的报道。

通过将所有逆转录病毒基因包括在核酸载体中，则可以在单一步骤中将逆转录病毒基因插入哺乳动物宿主细胞的内源染色体中。因此，如本文所提出，使用核酸载体将减少选择压力，减少沉默时间范围并且允许更快速筛选潜在的包装细胞。

此外，核酸载体的逆转录病毒基因将全部在单一基因座处被整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中，其将降低单独逆转录病毒基因变得沉默的风险并允许均匀表达所有逆转录病毒基因。

在宿主细胞的基因组中的单一位点处的整合允许使用可扩增选择标记基因扩增逆转录病毒基因的程序，其中逆转录病毒基因的扩增不依赖于逆转录病毒基因与可扩增选择标记的体内连接，如果逆转录病毒基因未在单一基因座中整合在一起，则有必要。

因此，通过使用本文所述的核酸载体，可以选择具有扩增的逆转录病毒基因且导致逆转录病毒载体颗粒的滴度改进的包装或生产细胞。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含编码逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组的核酸序列。当转录该核酸序列时，其将被壳体化于细胞产生的逆转录病毒载体颗粒内，并且，因此，充当逆转录病毒载体颗粒的基因组。应理解的是，编码逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组的核酸序列通常被包括在用于瞬时转染方法的“转移载体”上。所述转移载体质粒通常在两个LTR序列(3’LTR(其可以是或可以不是自失活(即SIN)3’-LTR)和5’LTR(其可以包含或可以不包含U5区))之间含有与转基因(和任选地聚腺苷酸化信号，和进一步任选地，用于控制/增强转基因的转录和表达的核酸序列)可操作地连接的启动子(诸如SV40)和壳体化序列(ψ)。因此，在一个实施方案中，所述逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组包含在两个LTR之间编码的一个或多个转基因。

在一个实施方案中，在核酸载体中包括编码逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组的核酸序列(即转移载体的组分)的多个拷贝。预期转移载体的多个拷贝导致更高的病毒载体滴度。例如，核酸载体可以包括编码逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组的核酸序列(即转移载体)的两个或更多个，诸如三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个或更多个拷贝。

在一个实施方案中，核酸载体含有一个或多个重组位点。这允许靶序列在重组酶的存在下以位点特异性方式整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中。重组酶在两个重组位点之间催化重组反应。

许多类型的位点特异性重组系统是本领域已知的，并且可以在本发明中使用任何合适的重组系统。例如，在一个实施方案中，重组位点选自或源自λ噬菌体的int/att系统、噬菌体P1的Cre/lox系统、酵母的FLP/FRT系统、噬菌体Mu的Gin/gix重组酶系统、Cin重组酶系统、大肠杆菌的Pin重组酶系统和pSR1质粒的R/RS系统或其任何组合。在一个进一步实施方案中，重组位点是att位点(例如来自λ噬菌体)，其中att位点允许在λ整合酶存在下的定点整合。应理解的是，提及“λ整合酶”包括提及仍与int/att系统相容的突变体整合酶，例如在WO 2002/097059中描述的修饰的λ整合酶。

在一个实施方案中，核酸载体选自：细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、P1-衍生人工染色体(PAC)、F黏粒或黏粒。在另一个实施方案中，核酸载体是细菌人工染色体(BAC)。

细菌人工染色体

术语“细菌人工染色体”或“BAC”是指源自细菌质粒的DNA构建体，其能够容纳大型的外源DNA插入片段。它们通常可以容纳近似350kb的最大DNA插入片段。BAC开发自充分表征的细菌功能性育性质粒(F-质粒)，起含有促进质粒在细菌细胞分裂后均匀分布的分配基因。这允许BAC与内源细菌基因组(诸如大肠杆菌)一起被稳定复制和分离。BAC通常含有至少一个复制起点拷贝(诸如oriS或oriV基因)、repE基因(用于质粒复制和拷贝数调节)和分配基因(诸如sopA、sopB、parA、parB和/或parC)，其确保BAC在细菌细胞中的稳定维持。BAC是天然环状的和超螺旋的，其使得它们比线性人工染色体诸如YAC更容易恢复。它们也可以使用简单的方法诸如电穿孔相对容易地引入细菌宿主细胞。

在一个实施方案中，细菌人工染色体包含oriS基因。在一个实施方案中，细菌人工染色体包含repE基因。在一个实施方案中，细菌人工染色体包含分配基因。在一个进一步实施方案中，分配基因选自sopA、sopB、parA、parB和/或parC。在一个又进一步实施方案中，细菌人工染色体包含sopA和sopB基因。

用于本发明中的BAC可以从商业来源获得，例如来自LUCIGEN^TM的pSMART BAC(对于完整骨架序列，参见Genome登录号EU101022.1)。该BAC含有L-阿拉伯糖“拷贝”系统，其也含有oriV中等拷贝复制起点，其仅在TrfA复制蛋白存在下才有活性。TrfA的基因可以在L-阿拉伯糖诱导型启动子araC-P_BAD的控制下整合至细菌宿主细胞的基因组中(参见Wild等人，(2002)Genome Res.12(9):1434–1444)。L-阿拉伯糖的添加诱导TrfA的表达，TrfA活化oriV，引起质粒复制至最多达50个拷贝/细胞。

酵母人工染色体

术语“酵母人工染色体”或“YAC”是指其中酵母DNA整合至细菌质粒中的染色体。它们含有自主复制序列(ARS)(即复制起点)、着丝粒和端粒。与BAC不同，YAC是线性的，且因此在染色体的每个末端含有酵母端粒，以在其传递至宿主细胞后代上时保护末端免于降解。YAC可以容纳一定范围的DNA插入片段大小；从100-2000kb的任何大小。

P1-衍生的人工染色体

术语“P1-衍生的人工染色体”或“PAC”是指源自P1-噬菌体和细菌F-质粒的DNA的DNA构建体。它们通常可以容纳近似100-300kb的最大DNA插入片段，并用作大肠杆菌中的克隆载体。PAC具有与BAC类似的优点，例如易于纯化并引入细菌宿主细胞。

黏粒和F黏粒

术语“黏粒”是指源自细菌质粒的DNA构建体，其另外含有源自噬菌体λ的cos位点。黏粒通常含有细菌复制起点(诸如oriV)、选择标记、克隆位点和至少一个cos位点。黏粒通常可以接受40-45kb的最大DNA插入片段。已显示黏粒在感染大肠杆菌细胞方面比标准细菌质粒更有效。术语“F黏粒”是指与黏粒类似的非哺乳动物核酸载体，除了其基于细菌F-质粒。具体而言，它们使用F-质粒的复制起点和分配机制来允许克隆大的DNA片段。F黏粒通常可以接受40kb的最大DNA插入片段。

逆转录病毒

逆转录病毒是含有假二倍体单链RNA基因组的病毒家族。它们编码逆转录酶，其从RNA基因组产生DNA，其然后可插入宿主细胞DNA。本文所述的发明可用于产生复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒。本发明的逆转录病毒载体颗粒可以选自或源自任何合适的逆转录病毒。

在一个实施方案中，逆转录病毒载体颗粒源自或选自慢病毒、α-逆转录病毒、γ-逆转录病毒或泡沫逆转录病毒，诸如慢病毒或γ-逆转录病毒，尤其是慢病毒。在一个进一步实施方案中，逆转录病毒载体颗粒是选自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、EIAV和Visna的慢病毒。慢病毒能够感染非分裂中(即静止)的细胞，这使得它们成为用于基因疗法的有吸引力的逆转录病毒载体。在一个又进一步实施方案中，逆转录病毒载体颗粒是HIV-1或源自HIV-1。一些逆转录病毒的基因组结构可以在本领域中找到。例如，关于HIV-1的细节可以从NCBIGenbank(Genome登录号AF033819)找到。HIV-1是最好理解的逆转录病毒之一，且因此经常用作逆转录病毒载体。

逆转录病毒基因

所有逆转录病毒共有的核酸序列可以更详细地解释如下：

长末端重复序列(LTR)：逆转录病毒基因组的基本结构包含5'-LTR和3'-LTR，逆转录病毒产生所需的基因位于其间或其中。LTR是逆转录病毒整合和转录所需的。它们也可以充当启动子序列来控制逆转录病毒基因的表达(即，它们是顺式作用基因)。LTR由三个命名为U3、R、U5的亚区域组成：U3源自RNA的3'末端独特的序列；R源自在RNA两个末端重复的序列；且U5源自RNA的5'末端独特的序列。因此，在一个实施方案中，核酸载体另外包含5'-和3'-LTR。在一个进一步实施方案中，可以缺失5'LTR的U5区并用非HIV-1polyA尾部替换(参见Hanawa等人，(2002)Mol.Ther.5(3):242-51)。

为了解决与生成能够复制的病毒相关的安全性问题，已经通过缺失3'LTR的U3区中的区段来开发自失活的(SIN)载体，所述U3区包括TATA盒和转录因子Sp1和NF-κB的结合位点(参见Miyoshi等人，(1998)J.Virol.72(10):8150-7)。在逆转录并整合于受感染细胞中后，该缺失被转移至5'LTR中，这导致LTR的转录失活。这被称为基于自失活的慢病毒的载体系统，其可以包括在本发明中。

ψ：凭借位于逆转录病毒基因组5'末端的ψ(psi)序列发生逆转录病毒RNA的壳体化。本领域还众所周知的是，psi序列下游并延伸指gag编码区中的序列涉及有效的逆转录病毒载体产生(参见Cui等人，(1999)J.Virol.73(7):6171–6176)。在一个实施方案中，核酸载体另外包含Ψ(psi)序列。

引物结合位点(PBS)：逆转录病毒基因组含有在5'-LTR的U5区之后存在的PBS。该位点结合起始逆转录所需的tRNA引物。在一个实施方案中，核酸载体另外包含PBS序列。

PPT：逆转录病毒基因组在逆转录病毒基因组的3'末端附近含有称为多嘌呤区(PPT)的短延伸的嘌呤。这些PPT在逆转录期间作为用于正链DNA合成的RNA引物发挥功能。复杂的逆转录病毒(诸如HIV-1)含有第二个更位于中心的PPT(即，中央多嘌呤区(cPPT))，其提供用于起始DNA合成的第二个位点。已显示编码cPPT的逆转录病毒载体具有增强的转导和转基因表达(参见Barry等人，(2001)Hum.Gene Ther.12(9):1103-8)。在一个实施方案中，核酸载体另外包含3'-PPT序列和/或cPPT序列。

上述非编码区的基因组结构是本领域技术人员众所周知的。例如，关于HIV-1中非编码区的基因组结构的细节可以从NCBI Genbank的Genome登录号AF033819中找到，或对于HIV-1HXB2(常用的HIV-1参考毒株)为Genome登录号K03455。在一个实施方案中，非编码区源自Genome登录号K03455处的序列，例如来自碱基对454-1126(对于R-U5-PBS-Gag)，7622-8479(对于RRE)或7769-8146(对于RRE)，4781-4898(对于cPPT)，9015-9120和9521-9719(对于dNEF-PPT-sinU3-R-U5)。

Gag/pol：gag和pol基因的表达依赖于gag和gagpol之间的翻译移框。两者都是在成熟期间被切割的多蛋白。逆转录病毒载体的主要结构基质、衣壳和核衣壳蛋白由gag编码。pol基因编码逆转录病毒酶：i)逆转录酶，其对逆转录病毒RNA基因组向双链DNA的逆转录至关重要；ii)整合酶，其使得逆转录病毒DNA基因组能够整合至宿主细胞染色体中；以及iii)蛋白酶，其切割合成的多蛋白以产生逆转录病毒的成熟和功能性蛋白。在一个实施方案中，编码gag和pol蛋白的逆转录病毒核酸序列源自HIV-1HXB2序列，其可得自Genome登录号K03455，例如碱基对790-5105。

Env：env(“包膜”)基因编码逆转录病毒包膜的表面和跨膜组分(例如HIV-1的糖蛋白gp120和gp41)并参与逆转录病毒-细胞膜融合。为了拓宽逆转录病毒载体的组织嗜性，本文所述的逆转录病毒载体可以用来自另一种病毒的包膜蛋白假型化。假型化是指通过改变逆转录病毒载体颗粒上的糖蛋白(GP)(例如，通过使用从其他包膜病毒获得或源自其他包膜病毒的GP或使用合成/人工GP)，逆转录病毒载体(包括慢病毒载体)的宿主细胞范围可以被扩展或改变的过程。由于其广泛的嗜性和高载体颗粒稳定性，用于假型化逆转录病毒载体的最常用的糖蛋白是水疱性口炎病毒GP(VSVg)。然而，技术人员应理解，其他糖蛋白可以用于假型化(参见Cronin等，(2005)Curr.Gene Ther.5(4):387–398，其通过引用以其整体并入本文)。用于假型化的病毒的选择还可取决于待靶向的细胞和/或器官的类型，因为已经显示一些假型具有组织类型偏好。在一个实施方案中，env蛋白的功能替代物是水疱性口炎病毒糖蛋白。

在一个实施方案中，env蛋白或其功能替代物从选自以下的病毒获得或来源：水疱病毒属(例如水疱性口炎病毒)，狂犬病病毒属(例如，狂犬病病毒、莫科拉病毒(Mokolavirus))，沙粒病毒(例如，淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV))，甲病毒属(例如，罗斯河病毒(RRV)、辛德毕斯病毒、塞姆利基森林病毒(SFV)、委内瑞拉马脑炎病毒)，线状病毒(例如，埃博拉病毒雷斯顿株、埃博拉病毒扎伊尔株、拉沙病毒)，α逆转录病毒属(例如，禽白血病病毒(ALV))，β逆转录病毒属(例如，绵羊肺腺瘤病毒(JSRV))，γ逆转录病毒属(例如，莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)，长臂猿白血病病毒(GALV)、猫内源性逆转录病毒(RD114))，δ-逆转录病毒属(例如人嗜T淋巴细胞病毒1型(HTLV-1))，泡沫病毒属(例如人泡沫病毒)，慢病毒属(例如梅迪-维斯纳病毒(MVV))，冠状病毒属(例如SARS-CoV)，呼吸道病毒属(例如，仙台病毒、呼吸道合胞体病毒(RSV))，丙型肝炎病毒属(例如丙型肝炎病毒(HCV))，流感病毒(例如A型流感病毒)和核型多角体病毒(例如苜蓿银纹夜蛾多核多角体病毒(AcMNPV))。在一个进一步实施方案中，env蛋白或其功能性替代物获得自或源自水疱性口炎病毒。在该实施方案中，可以使用水疱性口炎病毒糖蛋白(VSVg)的蛋白，其使得逆转录病毒颗粒能够感染更广泛的宿主细胞范围并消除重组产生野生型包膜蛋白的机会。在一个进一步实施方案中，编码env蛋白或其功能性替代物的逆转录病毒核酸序列源自可得自Genome登录号J02428.1处的序列，例如碱基对3071至4720。

本文所述的结构基因对于所有逆转录病毒都是共同的。另外的辅助基因可见于不同类型的逆转录病毒中。例如，慢病毒，诸如HIV-1，含有另外六种称为rev、vif、vpu、vpr、nef和tat的辅助基因。其他逆转录病毒可具有与本文描述的基因类似的辅助基因，然而它们可能并不总是被给予与文献中相同的名称。参考文献诸如Tomonaga和Mikami(1996)J.Gen.Virol.77(Pt 8):1611–1621描述了各种逆转录病毒辅助基因。

Rev：辅助基因rev(“病毒粒子的调节子”)编码结合Rev应答元件(RRE)并促进逆转录病毒转录物输出的辅助蛋白。该基因的蛋白产物允许含有Rev应答元件(RRE)的逆转录病毒mRNA片段从细胞核输出至细胞质中。预测RRE序列以形成复杂的折叠结构。rev的该特殊作用反映剪接和核输出步骤的紧密偶联。在一个实施方案中，核酸载体包含RRE序列。在一个进一步实施方案中，RRE序列源自HIV-1HXB2序列，其可得自Genome登录号K03455，例如碱基对7622至8479或7769至8146，尤其是碱基对7622至8479。

Rev结合RRE并促进单一剪接(env、vif、vpr和vpu)或非剪接(gag、pol和基因组RNA)病毒转录物的输出，因此导致下游事件如基因翻译和包装(参见Suhasini和Reddy(2009)Curr.HIV Res.7(1):91-100)。在一个实施方案中，核酸载体另外包含辅助基因rev或其类似基因(即，来自其他逆转录病毒或功能类似系统)。包括rev基因确保逆转录病毒载体基因组的RNA转录物从细胞核有效地输出至细胞质，特别是如果RRE元件也包括在待转运的转录物上。在一个进一步实施方案中，rev基因与Genome登录号M11840(即HIV-1克隆12cDNA，HIVPCV12基因座)的碱基对970至1320具有至少60％序列同一性，诸如至少70％序列同一性。在一个替代实施方案中，rev基因与Genome登录号K03455.1(即人免疫缺陷病毒1型，HXB2)的碱基对5970至6040和8379至8653具有至少60％序列同一性，诸如至少70％、80％、90％或100％序列同一性。

辅助基因被认为在逆转录病毒复制和发病机制中起作用，因此许多目前的病毒载体生产系统不包括这些基因中的一些。通常存在的rev是一个例外，或者可使用类似于rev/RRE系统的系统。因此，在一个实施方案中，破坏编码辅助基因vpr、vif、vpu、tat和nef或类似辅助基因中的一种或多种的核酸序列，使得所述辅助基因从逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组中除去或不能编码功能辅助蛋白。在一个进一步实施方案中，破坏辅助基因vpr、vif、vpu、tat和nef或类似辅助基因中的至少两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或全部，使得所述辅助基因从逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组中除去或不能编码功能辅助蛋白。除去功能辅助基因可不需要除去整个基因；除去部分基因或破坏基因就足够。

应理解的是，编码复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒的核酸序列可以与逆转录病毒载体颗粒所基于的逆转录病毒的野生型基因相同或源自该逆转录病毒的野生型基因，即，序列可以是包含在野生型病毒中的遗传上或其他方式改变版本的序列。因此，引入核酸载体或宿主细胞基因组中的逆转录病毒基因也可以指野生型基因的密码子优化版本。

基因扩增

在自然界中，基因扩增是表征一些正常发育状态的过程，诸如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中的卵子发生，尤其是在卵巢中绒毛膜基因的扩增中(Spralding等人(1980)PNAS,77:1096-1100)。基因扩增也是肿瘤细胞中的频繁事件，其中它通过引起癌基因表达的增强而在癌基因活化中起主要作用(Albertson D.G.(2006)Trends Genet.22:447-455)。

“基因扩增”是指这样的过程，通过该过程，基因组的特定DNA序列(即基因)相对于基因组中的其他序列不成比例地复制，使得扩增的DNA序列变得以比这种不成比例的复制前基因组中最初存在的拷贝数更高的拷贝数存在。如本文关于基因或核酸序列所用的“扩增的”或“扩增”是指凭借基因扩增以两个或更多个拷贝存在于宿主细胞系中的基因或核酸序列。

基因扩增的自然现象已经在生物制药工业中被开发为增加细胞系产生的重组基因产物的滴度的方式。在重组基因已整合至宿主细胞的基因组中的情况下，则可以通过选择其中整合至宿主细胞基因组中后已扩增重组基因的细胞系来增加重组基因的拷贝数和伴随表达的重组蛋白的量。

如本文所用的“可扩增选择标记基因”是指允许在适当的生长条件下扩增该基因的基因。相反，如本文所用且如以下更详细描述的术语“可选择标记基因”是指不允许扩增的可选择标记基因。所述可扩增选择标记基因能够通过扩增以增加表达产物(即，由可扩增选择标记基因编码的蛋白的表达)而对抑制剂或必需代谢产物的缺乏响应。当使用抑制剂、诸如毒性药物时，所述可扩增选择标记的表达增加赋予针对该抑制剂的抗性。在一个实施方案中，所述可扩增选择标记基因可以被表征为能够与营养缺陷型宿主互补。在一个实施方案中，所述可扩增选择标记在启动子的控制下。在一个实施方案中，所述启动子是SV40启动子。

如本文所用的术语“选择标记基因”是指将有助于选择活跃地表达插入基因(例如核酸载体)的细胞、但不允许扩增的基因。合适的选择标记的实例包括编码对抗生素的抗性的酶(即抗生素抗性基因)，例如卡那霉素、新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、杀稻瘟菌素或博莱霉素。合适的选择标记的另一个实例是荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、红色荧光蛋白(RFP)或蓝色荧光蛋白(BFP)。

如本文所用的“可扩增选择标记”和“可选择标记”分别是指由可扩增选择标记基因和可选择标记基因编码的产物(即，酶蛋白)。

可以通过用可扩增选择标记基因稳定转染宿主细胞来诱导基因扩增。稳定转染的宿主细胞经受渐增浓度的毒性药物，已知所述毒性药物抑制可扩增选择标记。例如，可以在含有毒性药物的培养基中培养转染的细胞，所述毒性药物的浓度实现在将亲本细胞(即未转染的细胞)铺板于含有毒性药物的培养基中后的3-5天内的大于98％的细胞的杀死。或者，可以将转染的细胞在含有毒性药物(例如MTX或MSX)的培养基中在空气中在37℃下在于空气中8％ CO的湿润气氛中在摇动下培养14至21天，或者直至活力>90％。通过这种抑制，可以选择细胞群体，其具有增加的可扩增选择标记的表达水平，和因此对所用浓度的药物的抗性。用于诱导基因扩增的另外的方法是本领域技术人员已知的，诸如OptiCHO^TMExpress试剂盒手册(Life Technologies^TM)中描述的方法。

本发明的核酸载体允许其中含有的所有表达构建体在宿主细胞基因组内的单一基因座处整合。可扩增选择标记基因的扩增也引起周围DNA序列的扩增。作为结果，一起整合至宿主细胞基因组中的核酸载体的剩余DNA序列也将被扩增。以此方式，通过使用本文所述的核酸载体，可以提供用于扩增稳定整合至宿主细胞基因组中的逆转录病毒载体基因的方法，其不依赖于通过宿主细胞的多种逆转录病毒载体基因与可扩增选择标记基因的体内连接整合。

每种可扩增选择标记具有相关的选择剂(即毒性药物)，其在扩增和选择方案期间被添加至细胞培养基中。不同的可扩增选择标记/选择剂组合是本领域已知的，并且在本发明中可以使用任何合适的扩增和选择方案。合适的可扩增选择标记/选择剂组合包括腺苷脱氨酶/脱氧助间型霉素、天冬氨酸转氨甲酰酶/N(磷酸乙酰基)-L-天冬氨酸、二氢叶酸还原酶/甲氨蝶呤、谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸亚砜亚胺和金属硫蛋白-l/重金属。

在一个实施方案中，所述可扩增选择标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)。DHFR选择方法涉及将包含dhfr基因(即，可扩增选择标记基因)的表达构建体并入核酸载体，由此诱导对核酸载体的其他表达构建体的DHFR选择压力。宿主细胞用核酸载体转染，并在渐增浓度的DHFR抑制剂甲氨蝶呤(MTX)的存在下生长，以选择已扩增整合至宿主基因组中的外源dhfr基因和伴随剩余的整合核酸载体的细胞。

用于基因扩增的包含dhfr基因的表达构建体是本领域众所周知的，并且例如描述于Subramani等人(1981)Mol.Cell.Bio.2:854-864和Walls等人(1989)Gene 81:139-149。

在一个实施方案中，所述dhfr基因与基因组登录号NM_010049.3具有至少60％序列同一性，诸如至少70％、80％、90％或100％序列同一性。在一个实施方案中，DHFR与基因组登录号NP_034179具有至少60％序列同一性，诸如至少70％、80％、90％或100％序列同一性。

在一个实施方案中，包含编码DHFR的核酸序列的表达构建体可以进一步包含从猿猴病毒40基因组转录和翻译多核苷酸所必需的组分。

在一个实施方案中，包含编码可扩增选择标记的核酸序列的表达构建体源自pSV2-dhfr，如Subramani等人(1981)Mol.Cell.Bio.2:854-864中所公开。

在一个进一步实施方案中，包含编码可扩增选择标记的核酸序列的表达构建体的核酸序列包含SEQ ID NO:1的核酸序列。SEQ ID NO:1的核酸序列如图2中所示。

在另一个实施方案中，所述可扩增选择标记是谷氨酰胺合成酶(GS)。GS选择方法涉及将gs基因并入核酸载体，由此对核酸载体的其他表达构建体诱导GS选择压力。宿主细胞用核酸载体转染，并在渐增浓度的GS抑制剂甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)的存在下生长，以选择已扩增整合至宿主基因组中的gs基因和伴随剩余的整合核酸载体的细胞。

用于基因扩增的包含gs基因的表达构建体是本领域众所周知的，并且例如描述于WO874462和Bebbington等人(1992)Nature 10:169-175)。

通过以该方式使用可扩增选择标记和相关选择剂，可以扩增宿主细胞基因组中具有选择压力的区域，由此增加可扩增选择标记和核酸载体的拷贝数。然后，针对逆转录病毒载体生产的滴度，筛选通过此类轮次的扩增和选择而生长的细胞系，并选择最佳克隆用于大规模生产。

通常，扩增轮数和采用的相关试剂的浓度两者均未设定或固定。反而，扩增和选择方案通常变得逐渐严格，直至达到生产阈值的点。已经观察到直到接近蛋白生产的“平稳期”，观察到的蛋白生产的水平通常与基因拷贝数的增加成正比(Bebbington和Hentschel,DNA Cloning Volume III,IRL press,1987)。

在一个优选实施方案中，所述宿主细胞对于可扩增选择标记是阴性的。也就是说，所述宿主细胞不包含内源的可扩增选择标记基因。例如，当使用DHFR作为可扩增选择标记时，优选采用DHFR阴性的宿主株，诸如CHO DG44或CHO DUX-B11。在一个实施方案中，所述宿主细胞是GS阴性的宿主株。在一个实施方案中，修饰所述宿主细胞以敲除内源gs基因。敲除细胞的特定基因的方法是本领域众所周知的，例如，使用锌指核酸酶。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是GS阴性HEK293T细胞。然而，本发明不受限于特定宿主细胞系的选择。可以在本发明的方法中使用任何细胞系，其具有快速生长速率(例如，倍增时间为12小时或更短)并且能够以合理的速率扩增外源可扩增选择标记基因而不以相似或更高的速率扩增内源可扩增选择标记基因，使得所述外源可扩增选择标记可以用作显性标记。

通过确定细胞在渐增浓度的选择剂中生长的能力与可扩增选择标记的拷贝数增加相关，鉴定用显性标记(即外源可扩增选择标记)转导的细胞系(这可以通过经由Southern印迹证明可扩增标记的拷贝数的增加直接测量或通过经由Northern印迹或qPCR证明由可扩增标记产生的mRNA的量的增加间接测量)。

在宿主细胞包含内源可扩增选择标记基因的情况下，除了可扩增选择标记以外，核酸载体可以进一步包含编码选择性标记的核酸序列。所述宿主细胞用包含可扩增选择标记以及可选择标记的核酸载体转染。在可选择标记赋予抗生素抗性的情况下，首先针对在相应的抗生素诸如博莱霉素或潮霉素的存在下生长的能力选择转染的宿主细胞。以该方式，有可能在诱导基因扩增之前选择已经用核酸载体成功转染的宿主细胞。然后针对在渐增浓度的选择剂诸如MTX或MSX中生长的能力选择细胞。

因此，在一个实施方案中，所述核酸载体另外包含可选择标记基因。在一个进一步实施方案中，可选择标记是抗生素抗性基因，诸如博莱霉素、卡那霉素或嘌呤霉素抗性基因，特别是博莱霉素(ZeoR)抗性基因。在又一个进一步实施方案中，所述博莱霉素抗性基因源自Streptoalloteichus hindustans ble基因，例如参见GenBank登录号X52869.1，从碱基对3至377。在另一个实施方案中，所述可选择标记是潮霉素磷酸转移酶。

额外组分

本发明的核酸载体可以包含另外的额外组分。例如，可以使用这些额外特征例如来帮助稳定转录物用于翻译，增加基因表达水平并打开/关闭基因转录。

本发明产生的逆转录病毒载体颗粒可用于基因疗法的方法中。因此，在一个实施方案中，核酸载体另外包含一种或多种转基因。例如，当靶基因在哺乳动物宿主细胞中没有正确表达时，因此引入靶基因的修正版本作为转基因。换言之，该转基因可以是治疗活性基因，其编码可用于治疗或改善靶疾病的基因产物。转基因可编码例如反义RNA、核酶、蛋白(例如肿瘤抑制蛋白)、毒素、抗原(其可用于诱导抗体或辅助性T细胞或细胞毒性T细胞)或抗体(诸如单链抗体)。所述转基因可以编码期望在体外、离体或体内在细胞中产生的任何多肽或RNA。在一个实施方案中，所述转基因编码β珠蛋白。转基因可已经从另一种细胞类型或另一种物种获得，或合成制备。或者，转基因可已从宿主细胞获得，但可操作地连接至与天然基因中存在的那些不同的调节区。或者，转基因可以是存在于宿主细胞中的基因的不同等位基因或变体。

预期含有转基因的转移载体的多个拷贝导致更高的逆转录病毒载体滴度，因此在一个实施方案中，核酸载体包含转基因的多个拷贝，诸如转基因的两个或更多个，特别是三个或更多个拷贝。在一些情况下，需要多于一种的基因产物来治疗疾病，因此在一个进一步实施方案中，核酸载体另外包含两种或更多种，诸如三种或更多种或四种或更多种不同的转基因。

基因疗法的目的是为了治疗目的而修饰活细胞的遗传物质，并且其涉及将功能基因插入细胞中以实现治疗效果。使用本文所述的核酸载体和宿主细胞产生的逆转录病毒载体可以用于转染靶细胞并诱导具有潜在治疗意义的基因的表达。因此逆转录病毒载体可用于治疗患有病况(包括但不限于遗传性疾病、癌症和某些病毒感染)的哺乳动物主体，诸如人主体。

本领域技术人员应理解，核酸序列可以与适当的控制序列可操作地结合。例如，所述核酸序列可以与表达控制元件、诸如转录/翻译控制信号、复制起点、聚腺苷酸化信号、内部核糖体进入位点(IRES)、启动子和/或增强子等可操作地结合。

在一个实施方案中，核酸载体额外包含转录调节元件。例如，本文描述的任何元件可以可操作地连接至启动子，使得可以控制表达。本文提及的启动子可以包括已知的启动子(完整的或一部分)，其可以是连续起作用的或可诱导的，例如，在调节蛋白存在的情况下。在一个实施方案中，所述启动子是病毒启动子。在一个实施方案中，核酸载体另外包含高效启动子，诸如CMV启动子。该启动子具有促进在非哺乳动物核酸载体上编码的元件的高水平表达的优点。在另一个实施方案中，CMV启动子包含源自人巨细胞病毒毒株AD169的序列。该序列可得自Genome登录号X17403，例如碱基对173731至174404。在一个替代实施方案中，所述启动子是来自猿猴病毒40的SV40晚期启动子。本文提及的启动子可以包括已知的启动子(完整的或一部分)，其可以是连续起作用的或可诱导的，例如，在调节蛋白存在的情况下。

在一个实施方案中，启动子(诸如CMV启动子)另外包含至少一个Tet操纵子。Tet操纵子系统可用于控制核酸载体内所含逆转录病毒序列的表达。简言之，Tet阻遏蛋白通过结合引入启动子的Tet操纵子位点来阻断表达。因此，当Tet阻遏蛋白与Tet操纵子结合时，没有基因表达。在添加四环素或多西环素后，Tet阻遏蛋白被隔绝以允许启动子活性，因此开启基因表达。Tet操纵子系统是广泛可用的，诸如可得自Invitrogen的pcDNA^TM4/TO哺乳动物表达载体中使用的Tet操纵子。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含四环素抗性操纵子阻遏蛋白(“Tet阻遏蛋白”或“TetR”)。在一个进一步实施方案中，Tet阻遏蛋白是密码子优化的。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含绝缘子，诸如染色质绝缘子。术语“绝缘子”是指阻断启动子和增强子之间相互作用的基因序列。在一个进一步实施方案中，绝缘子(诸如染色质绝缘子)存在于每个逆转录病毒核酸序列之间(即，单独的表达构建体之间)。这有助于防止相邻逆转录病毒核酸序列之间的启动子干扰(即，来自一个转录单元的启动子损害相邻转录单元的表达)。不受理论的束缚，这也被认为有助于使逆转录病毒序列之间重组以生成能够复制的病毒的风险最小化。

应理解的是，如果绝缘子存在于每个逆转录病毒核酸序列之间的核酸载体中，则它们可以作为核酸载体内的单独表达构建体排列。例如，编码逆转录病毒核酸序列的每个序列都具有其自身的启动子和/或内含子和/或polyA信号。

在一个实施方案中，染色质绝缘子与原鸡(Gallus gallus)HS4绝缘子序列(例如参见Genome登录号U78775.2，碱基对1至1205)具有至少90％的序列同一性，例如至少95％的序列同一性。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含polyA信号。polyA信号的使用具有保护mRNA免于酶促降解并帮助翻译的优点。在一个进一步实施方案中，polyA信号获得自或源自SV40、牛生长激素和/或人β珠蛋白。在一个实施方案中，polyA信号源自SV40早期polyA信号(例如参见Genome登录号EF579804.1，来自负链的碱基对2668至2538)。在一个实施方案中，polyA信号源自人β珠蛋白polyA信号(例如，参见Genome登录号GU324922.1，碱基对3394至4162)。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含内含子序列。已知在增强子/启动子区下游和cDNA插入片段(即转基因)上游使用内含子增加插入片段的表达水平。在一个进一步实施方案中，内含子序列是人β珠蛋白内含子或兔β珠蛋白内含子II序列。在一个实施方案中，人β珠蛋白内含子源自得自Genome登录号KM504957.1的序列(例如来自碱基对476至1393)。在一个实施方案中，兔β珠蛋白内含子II源自得自Genome登录号V00882.1的序列(例如，碱基对718至1290)。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。WPRE的存在已经显示增强表达，且因此可能有利于获得高水平的表达。在一个进一步实施方案中，WPRE源自得自Genome登录号J04514.1的序列(例如，碱基对1093至1684)。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含内部核糖体进入位点(IRES)。IRES是结构化的RNA元件，其通常存在于5'-帽下游的5'-非翻译区(其是装配起始复合物所需的)。IRES被翻译起始因子所识别，并允许不依赖于帽的翻译。在一个进一步实施方案中，IRES源自脑心肌炎病毒(EMCV)基因组(例如，参见Genome登录号KF836387.1，碱基对151至724)。

在一个实施方案中，核酸载体另外包含多克隆位点(MCS)。MCS是含有多个限制性位点(例如10、15或20个位点)的核酸载体内的DNA短片段。这些位点通常在核酸载体内仅出现一次，以确保核酸内切酶仅在一个位点处切割。这允许使用合适的核酸内切酶(即限制酶)容易地插入逆转录病毒基因。

本领域技术人员应理解，构建体可以在核酸载体内以任何顺序排列。在一个示例性实施方案中，核酸载体包含以下插入片段：编码可扩增选择标记的核酸序列，编码gag和pol蛋白的逆转录病毒核酸序列，编码env蛋白或其功能性替代物(诸如VSVg)的逆转录病毒核酸序列，编码辅助基因rev(例如密码子优化的rev序列)或其类似基因或功能类似系统的逆转录病毒核酸序列，四环素抗性操纵子阻遏蛋白(TetR)，内部核糖体进入位点和选择标记(诸如博莱霉素抗性选择标记)(即，可扩增选择标记-GagPol-Env-Rev-Tet阻遏蛋白-IRES-抗生素抗性标记-剩余的BAC序列(“BAC骨架”)；或可扩增选择标记GagPol-(野生型)VSVg-(密码子优化的)Rev–Tet阻遏蛋白-IRES-博莱霉素抗性-pSMARTBAC)。在一个进一步实施方案中，绝缘子(诸例如染色质绝缘子)存在于可扩增选择标记、gagpol、env和rev序列各自之间。在一个进一步的实施方案中，启动子存在于可扩增选择标记、gagpol、env和rev序列各自之前。在一个又进一步实施方案中，转移载体序列的至少一个拷贝(即，包含编码逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组的核酸序列)存在于可扩增选择标记序列之前。

在一个实施方案中，核酸载体包含以下插入片段：启动子(诸如任选包含Tet操纵子序列的CMV启动子)，内含子(诸如人β珠蛋白内含子)，编码可扩增选择标记的核酸序列，polyA信号(例如人β珠蛋白polyA信号)，绝缘体(诸如染色质绝缘子)，启动子(例如任选地包含Tet操纵子的CMV启动子)，内含子(例如人β珠蛋白内含子)，编码gag和pol蛋白的逆转录病毒核酸序列，编码RRE的逆转录病毒核酸，polyA信号(例如人β珠蛋白polyA信号)，绝缘子(诸如染色质绝缘子)，启动子(诸如任选地包含Tet操纵子序列的CMV启动子)，内含子(诸如人β珠蛋白内含子)，编码env蛋白或其功能性替代物的逆转录病毒核酸序列(诸如VSVg)，polyA信号(诸如人β珠蛋白polyA信号)，绝缘子(诸如染色质绝缘子)，启动子(诸如任选包含Tet操纵子序列的CMV启动子)，编码辅助基因rev或其类似基因或功能性相似系统的逆转录病毒核酸序列，polyA信号(诸如人β珠蛋白polyA信号)，绝缘体(诸如染色质绝缘子)，启动子(诸如CMV启动子)，内含子(诸如兔β珠蛋白内含子)，四环素抗性操纵子阻遏蛋白(TetR)，内部核糖体进入位点，选择标记(诸如博莱霉素抗性选择标记)，polyA信号和多克隆位点。

可以将核酸序列依次引入核酸载体中。这允许在每次整合后进行选择，以确保所有需要的核酸序列均成功整合至核酸载体中。或者，将至少两个或更多个核酸序列同时引入核酸载体中。

应理解的是，可以通过本领域已知的标准分子克隆技术，例如使用限制性核酸内切酶和连接技术，将本文所述的额外基因引入核酸载体中。此外，可以通过标准技术(诸如，电穿孔)将核酸载体，尤其是BAC、PAC、F黏粒和/或黏粒引入细菌宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞，特别是大肠杆菌菌株DH10B)。

用途

根据本发明的一个进一步方面，提供了用于产生逆转录病毒包装或生产细胞系的如本文所定义的核酸载体。

本文描述的核酸载体可用于产生逆转录病毒包装细胞系，其将大大简化逆转录病毒载体的生产。应理解的是，如果编码逆转录病毒载体的RNA基因组(包含转基因)的核酸序列被包含在核酸载体上，则这将用于产生生产细胞系。

如本文所述，开发稳定的逆转录病毒包装或生产细胞系以克服与瞬时转染和减少的逆转录病毒载体颗粒滴度相关的困难将是有用的。本文所述的核酸载体可以用于制备所述包装或生产细胞系，因为它们能够容纳含有逆转录病毒包装所需的必需基因的大的DNA插入片段，然后可以在一个步骤中将该基因整合至哺乳动物宿主细胞的内源基因组中和作为单元扩增，使得必需逆转录病毒基因的扩增和随后表达相对于彼此成正比。

宿主细胞

根据本发明的一个进一步方面，提供了逆转录病毒包装细胞，其包含作为单独表达构建体的编码以下的核酸序列：

gag和pol蛋白；

env蛋白或其功能性替代物；和

可扩增选择标记；

其中所述单元的拷贝数是2或更多。

将所有逆转录病毒基因和可扩增选择标记包括在大型核酸载体上的优点在于，它们可以首先在微生物细胞(诸如细菌或酵母细胞)中制备，其更易于操作和操纵，然后在单一步骤中整合至哺乳动物细胞中。一旦逆转录病毒基因被整合至哺乳动物宿主细胞中，这就减轻选择压力并减少沉默时间段。该方法的特征性特征在于，创建包装细胞系所需的所有逆转录病毒基因都作为单元存在于内源基因组的单一基因座中，而不是随机分散在整个内源基因组中。这具有产生以同一水平表达所有逆转录病毒基因的逆转录病毒包装细胞的优点，因为它们都整合于同一基因座，相比之下，在先前已知的方法中逆转录病毒基因分别且随机整合至整个宿主细胞的基因组中，这可导致不均匀的水平的表达。

此外，通过在与包含编码必需逆转录病毒蛋白(gag、pol、env或其功能性替代物)的核酸序列的所有表达构建体相同的核酸载体上具有可扩增选择标记，一起扩增表达构建体。

应理解的是，该单元可以在宿主细胞基因组中在不同染色体上的多个不同位置处整合多于一次(尽管所有编码的核酸序列都存在于单一基因座中)。因此，提及“单一基因座”不排除核酸序列在逆转录病毒包装/生产细胞基因组内的多个基因座处全部整合在一起的可能性。这对于增加转基因的表达水平可能是有益的，并且可能潜在地提高逆转录病毒滴度。可以通过qPCR比较源自单独克隆的细胞群体之间的构建体插入的拷贝数。

在一个实施方案中，逆转录病毒包装细胞另外包含编码逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组的核酸序列。此类核酸序列也可以与编码gag和pol蛋白、env蛋白或其功能性替代物的核酸序列和可扩增选择标记整合于单一基因座中。

因此，根据本发明的一个进一步方面，提供了逆转录病毒生产细胞，其包含作为单独表达构建体的编码以下的核酸序列：

gag和pol蛋白；

env蛋白或其功能性替代物；

可扩增选择标记；和

逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组；

其中所述单元的拷贝数是2或更多。

在一个实施方案中，所述逆转录病毒包装细胞是哺乳动物细胞。在一个进一步实施方案中，所述哺乳动物细胞选自HEK 293细胞、CHO细胞、Jurkat细胞、KS62细胞、PerC6细胞、HeLa细胞或其衍生物或功能等同物。在一个实施方案中，所述哺乳动物细胞是CHO-K1或CHO-K1SV。在又一个进一步实施方案中，所述哺乳动物宿主细胞是HEK 293细胞，或源自HEK293细胞。此类细胞可以是贴壁细胞系(即它们以附着于表面的单层生长)或悬浮适应/非贴壁细胞系(即它们在培养基中悬浮生长)。悬浮生长的细胞在工业中被广泛用于生产生物产品，因为它们生长至高密度并且与贴壁细胞相比，生产容易扩大规模。在又一个进一步实施方案中，所述HEK 293细胞是HEK 293T细胞。术语“HEK 293细胞”是指通常用于生物技术中的人胚肾293细胞系。具体而言，HEK 293T细胞通常用于生产各种逆转录病毒载体。合适的市售细胞系的其他实例包括T-REX^TM(Life Technologies)细胞系。优选地，所述哺乳动物细胞不内源表达可扩增选择标记。例如，在可扩增选择标记是DHFR的情况下，优选采用dhfr^-(dhfr阴性)细胞系，诸如dhfr^-CHO细胞系，或者在可扩增选择标记是GS的情况下，优选采用gs^-(gs阴性)细胞系，例如，经修饰以用gs基因敲除以产生GS阴性HEK293T的HEK293细胞系。敲除细胞的特定基因的方法是本领域众所周知的，例如，使用锌指核酸酶。

在一个优选实施方案中，所述宿主细胞对于可扩增选择标记是阴性的。也就是说，所述宿主细胞基因组不包含内源的可扩增选择标记基因。例如，当使用DHFR作为可扩增选择标记时，优选采用DHFR阴性的宿主株，诸如CHO DG44或CHO DUX-B11。在一个实施方案中，所述宿主细胞是GS阴性的宿主株。在一个实施方案中，修饰所述宿主细胞以敲除内源gs基因。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是GS阴性HEK293T细胞。然而，本发明不受限于特定宿主细胞系的选择。可以在本发明的方法中使用任何细胞系，其具有快速生长速率(即，倍增时间为12小时或更短)并且能够以合理的速率扩增可扩增选择标记基因而不以相似或更高的速率扩增内源可扩增选择标记基因。通过发现细胞在渐增浓度的选择剂(即需要细胞表达可扩增选择标记以存活的化合物)中生长的能力与可扩增选择标记的拷贝数增加相关，鉴定具有以比扩增内源选择标记基因的速率更大的速率扩增可扩增选择标记基因的能力的细胞系(这可以通过经由Southern印迹证明可扩增标记的拷贝数的增加直接测量或通过经由Northern印迹证明由可扩增标记产生的mRNA的量的增加间接测量)。

应理解的是，上文针对核酸载体描述的所有实施方案也可以应用于本发明的逆转录病毒包装/生产细胞。

方法

根据本发明的一个进一步方面，提供了产生稳定的逆转录病毒包装或生产细胞系的方法，其包括以下步骤：

(a)将本文所述的核酸载体转染入哺乳动物宿主细胞的培养物中；

是否产生生产或包装细胞系分别取决于核酸载体是否分别包含或不包含编码逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组的核酸序列。

如果靶基因被整合至具有选择标记(诸如抗生素抗性基因)的内源染色体中，则该方法可以还包括选择其中逆转录病毒核酸已成功整合的哺乳动物宿主细胞。因此，在一个实施方案中，所述方法在步骤a)之后包括在培养物内选择具有在整合至哺乳动物宿主细胞的内源染色体中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞。

稳定转染的宿主细胞经受渐增浓度的选择剂(例如毒性药物)，已知所述选择剂抑制可扩增选择标记。例如，可以在含有毒性药物的培养基中培养转染的细胞，所述毒性药物的浓度实现在将亲本细胞(即未转染的细胞)铺板于含有毒性药物的培养基中后的3-5天内的大于98％的细胞的杀死。或者，可以将转染的细胞在含有毒性药物(例如MTX或MSX)的培养基中在37℃下在空气中的8％ CO的湿润气氛中在摇动下培养14至21天，或者直至活力>90％。通过这种抑制，可以选择细胞群体，其具有增加的可扩增选择标记的表达水平，和因此对所用浓度的药物的抗性。步骤b)和c)可以用逐渐增加浓度的选择剂重复。在一个实施方案中，外源基因的扩增通过经由重复步骤b)和c)选择对逐渐增加水平的选择剂的抗性来实现。

用于诱导基因扩增的方法是本领域技术人员已知的，诸如OptiCHO^TMExpress试剂盒手册(Life Technologies^TM)中描述的方法。

在一个实施方案中，所述哺乳动物宿主细胞选自HEK 293细胞、HEK 6E细胞、CHO细胞、Jurkat细胞、KS62细胞、PerC6细胞、HeLa细胞或其衍生物或功能等同物。在一个进一步实施方案中，所述哺乳动物宿主细胞是HEK 293细胞，或源自HEK 293细胞。此类细胞可以是贴壁细胞系(即它们以附着于表面的单层生长)或悬浮适应/非贴壁细胞系(即它们在培养基中悬浮生长)。在又一个进一步实施方案中，所述HEK 293细胞是HEK 293T细胞或HEK 6E细胞。合适的市售细胞系的其他实例包括T-REX^TM(Life Technologies)细胞系。

在一个优选实施方案中，所述宿主细胞对于可扩增选择标记是阴性的。也就是说，所述宿主细胞基因组不包含内源的可扩增选择标记基因。例如，当使用DHFR作为可扩增选择标记时，优选采用DHFR阴性的宿主株，诸如CHO DG44或CHO DUX-B11。在一个实施方案中，所述宿主细胞是GS阴性的宿主株。在一个实施方案中，修饰所述宿主细胞以敲除内源gs基因。敲除细胞的特定基因的方法是本领域众所周知的，例如，使用锌指核酸酶。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是GS阴性HEK293T细胞。

然而，本发明不受限于特定宿主细胞系的选择。可以在本发明的方法中使用任何细胞系，其具有快速生长速率(即，倍增时间为12小时或更短)并且能够以合理的速率扩增可扩增选择标记基因而不以相似或更高的速率扩增内源可扩增选择标记基因。通过发现细胞在渐增浓度的选择剂(即需要细胞表达可扩增选择标记以存活的化合物)中生长的能力与可扩增选择标记的拷贝数增加相关，鉴定具有以比扩增内源选择标记基因的速率更大的速率扩增可扩增选择标记基因的能力的细胞系(这可以通过经由Southern印迹证明可扩增标记的拷贝数的增加直接测量或通过经由Northern印迹证明由可扩增标记产生的mRNA的量的增加间接测量)。

技术人员将意识到，可以使用本领域已知的合适方法，例如脂质介导的转染、显微注射、细胞(诸如微细胞)融合、电穿孔或微粒轰击，以将核酸载体引入宿主细胞。在一个实施方案中，通过电穿孔将核酸载体引入宿主细胞。应理解的是，用于引入核酸载体的方法的选择可以根据使用的哺乳动物宿主细胞的类型来选择。

一旦在哺乳动物宿主细胞内，核酸载体将被随机整合至哺乳动物宿主细胞的内源基因组中。因此，该方法还包括选择其中已经整合在核酸载体上编码的核酸的哺乳动物宿主细胞(例如，使用抗生素抗性选择标记，诸如博莱霉素抗性标记)。

本领域技术人员将意识到促进核酸载体整合的方法，例如，如果核酸载体是天然环状的(例如，BAC、PAC、黏粒或F黏粒)，则将其线性化。核酸载体可以另外包含与哺乳动物宿主细胞的内源染色体共有同源性的区域，以引导整合至内源基因组内的选定位点。此外，如果重组位点存在于核酸载体上，则这些可用于靶向重组。例如，核酸载体可含有loxP位点，其与Cre重组酶(即使用来源自P1噬菌体的Cre/lox系统)组合时允许靶向整合。或者(或另外)，重组位点是att位点(例如来自λ噬菌体)，其中att位点允许在λ整合酶存在下进行定点整合。这将允许逆转录病毒基因靶向至内源基因组中的基因座，其允许高表达和/或稳定表达。

其他靶向整合方法是本领域众所周知的。例如，可以使用诱导基因组DNA的靶向切割的方法来促进选择的染色体基因座处的靶向重组。这些方法通常涉及使用工程改造的切割系统来诱导内源基因组中的双链断裂(DSB)或切口以通过天然过程(诸如非同源性末端接合(NHEJ))修复断裂或使用修复模板修复(即，同源性定向修复或HDR)。

通过使用特定的核酸酶诸如工程改造的锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子如效应物核酸酶(TALEN)、使用CRISPR/Cas9系统与工程改造的crRNA/tracr RNA('单引导RNA')指导特异性切割和/或使用基于Argonaute系统的核酸酶(例如来自嗜热栖热菌(T.thermophilus)，称为'TtAgo'，参见Swarts等人，(2014)Nature 507(7491):258-261)，可发生切割。使用这些核酸酶系统之一的靶向切割可以用于使用HDR或NHEJ介导的过程将核酸插入特定的靶位置。因此，在一个实施方案中，该方法另外包括使用至少一种核酸酶将在核酸载体上编码的核酸序列整合至哺乳动物宿主细胞的基因组(即内源染色体)中，其中所述至少一种核酸酶切割哺乳动物宿主细胞的基因组，使得核酸序列整合至细胞的基因组中。在一个进一步实施方案中，所述至少一种核酸酶选自锌指核酸酶(ZFN)，TALE核酸酶(TALEN)，CRISPR/Cas核酸酶系统及其组合。

根据本发明的一个进一步方面，提供了通过本文定义的方法获得的逆转录病毒包装或生产细胞。

使用本文定义的方法获得的细胞系可用于产生具有提高滴度的逆转录病毒载体颗粒的细胞系。

本文中提及术语“滴度”是指能够转导靶细胞诸如患者细胞的有效量的逆转录病毒载体或颗粒。在一个实施方案中，高滴度为，超过10⁶TU/ml而没有浓缩(TU＝转导单位)。

根据本发明的一个进一步方面，提供了产生复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒的方法，其包括以下步骤：

步骤b)和c)可以用逐渐增加浓度的选择剂重复。因此，在一个实施方案中，外源基因的扩增通过经由重复步骤b)和c)选择对逐渐增加水平的选择剂的抗性来实现。

如前文所述，在一个实施方案中，所述哺乳动物宿主细胞选自HEK 293细胞、CHO细胞、Jurkat细胞、KS62细胞、PerC6细胞、HeLa细胞或其衍生物或功能等同物。在一个进一步实施方案中，所述哺乳动物宿主细胞是HEK 293细胞，或源自HEK 293细胞。此类细胞可以是贴壁细胞系(即它们以附着于表面的单层生长)或悬浮适应/非贴壁细胞系(即它们在培养基中悬浮生长)。在又一个进一步实施方案中，所述HEK 293细胞是HEK 293T细胞。合适的市售细胞系的其他实例包括T-REX^TM(Life Technologies)细胞系。

在一个优选实施方案中，所述宿主细胞对于可扩增选择标记是阴性的。也就是说，所述宿主细胞基因组不包含内源的可扩增选择标记基因。例如，当使用DHFR作为可扩增选择标记时，优选采用DHFR阴性的宿主株，诸如CHO DG44或CHO DUX-B11。在一个实施方案中，所述宿主细胞是GS阴性的宿主株。在一个实施方案中，修饰所述宿主细胞以敲除内源gs基因。敲除细胞的特定基因的方法是本领域众所周知的，例如，使用锌指核酸酶。在一个优选实施方案中，所述宿主细胞是GS阴性HEK293T细胞。然而，本发明不受限于特定宿主细胞系的选择。

本领域技术人员应理解，本文描述的方法中使用的条件将取决于所使用的宿主细胞。典型的条件，例如待使用的培养基或温度，是本领域众所周知的。在一个实施方案中，培养通过在湿润条件下孵育哺乳动物宿主细胞来进行。在一个进一步实施方案中，湿润条件包括在37℃、5％ CO₂下孵育转染的细胞。在一个实施方案中，使用选自以下的培养基进行培养：含有10％(vol/vol)胎牛血清(FBS)的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM)，无血清UltraCULTURE^TM培养基(Lonza，目录号12-725F)，BalanCD培养基(IrvineScientific，目录号911615)或FreeStyle^TM表达培养基(Thermo fisher，目录号12338-018)。

适当的培养方法是本领域技术人员众所周知的。例如，可以在悬浮液和/或无动物组分的条件下培养细胞。在一个实施方案中，所述细胞适合于在任何体积的培养基、从10ml(例如在摇瓶中)至10L、50L、100L或更多(例如在生物反应器中)中培养。

在一个实施方案中，该方法另外包括分离复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒。例如，在一个实施方案中，通过使用过滤器来进行分离。在一个进一步实施方案中，过滤器是低蛋白结合膜(例如，0.22μm低蛋白结合膜或0.45μm低蛋白结合膜)，诸如聚偏氟乙烯(PVDF)或聚醚砜(PES)人工膜。

一旦在哺乳动物宿主细胞内，存在于核酸载体上的逆转录病毒核酸可被整合至内源基因组内的随机、单一基因座中。整合步骤可以如上文所述促进，例如使用线性化和/或共享同源性的区域。重组位点也可用于靶向重组。

一旦分离，逆转录病毒载体颗粒可以浓缩用于体内应用。浓缩方法包括例如超速离心、沉淀或阴离子交换色谱。超速离心作为小规模逆转录病毒载体浓缩的快速方法是有用的。或者，阴离子交换色谱(例如使用Mustang Q阴离子交换膜盒)或沉淀(例如使用PEG6000)对于处理大体积的慢病毒载体上清液特别有用。

根据本发明的一个进一步方面，提供了通过本文定义的方法获得的复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒。

现在将参考以下非限制性实施例更详细地描述本发明。

实施例

实施例1：构建指南(BAC)

图1显示构建BACpack-WTGP-277delU5和BACpack-SYNGP-277delU5的逐步指南。由于XbaI和NheI消化物的相容末端，慢病毒包装基因逐渐被装载至pSmart BAC载体中。在添加GagPol时，制备了2种构建体，其含有野生型GagPol(WTGP)或密码子优化的GagPol，SYNGP。这些被分别命名为BACpack-WTGP和BACpack-SYNGP。然后将转移盒装载至这两种构建体上，且因此生成BACpackWTGP-277delU5和BACpackSYNGP-277delU5。

实施例2：选择稳定的多克隆合并物

通过用BACpackSYNGP-277delU5或BACpackWTGP-277delU5转染贴壁细胞系HEK293T生成多克隆稳定转染子合并物。然后用博莱霉素选择成功的整合事件。

为了评价这些多克隆合并物生成慢病毒载体的能力，将细胞用多西环素诱导(I)或保持未诱导(UI)并与未转染的HEK293T细胞进行比较。

结果显示从每种转染条件收获的慢病毒载体上清液的滴度，以转导单位(TU)/mL计。从图2的滴定结果可以看出，用BACpackSYNGP-277delU5或BACpackWTGP-277delU5生成的稳定多克隆合并物能够产生大约10e7 TU/mL浓度的慢病毒载体，其与目前的瞬时转染系统相当。

结果证实含有慢病毒生产所必需的所有包装基因的单一BAC载体可以生成能够产生合适滴度的慢病毒载体的细胞系。

实施例3：生成稳定的转染悬浮克隆

使用BAC技术生成慢病毒载体产生细胞系的主要目的是迅速将新的进展应用于平台。这些进展可能包括修饰特定细胞系。例如，通过在悬浮细胞中产生生物产品来增加产量是行业标准，因为它们生长至高于贴壁细胞的密度。然而，目前的慢病毒载体生产系统依赖于高转染率，其在悬浮细胞中比贴壁HEK293T细胞更难以实现。由于选择成功的整合体，当生成稳定的细胞系时转染效率不太受关注，BAC构建体是生成产生慢病毒载体的悬浮细胞系的理想解决方案。

如前所表明，BAC构建体能够从贴壁HEK293T细胞生成慢病毒载体生产细胞系。为了证明BAC构建体的灵活性，从悬浮细胞系HEK293 6E生成稳定的转染细胞系。用BAC构建体BACpackWTGP-277delU5转染HEK293 6E细胞，然后用博莱霉素选择。这随后为克隆以生成克隆细胞系。图3中的结果显示稳定细胞系生成的GFP信号。这表明在转移载体区段中存在博莱霉素抗性和功能性GFP表达盒两者。

该结果表明BAC构建体能够从多种细胞系生成稳定的克隆。

实施例4：在悬浮克隆中诱导慢病毒

为了证实稳定悬浮克隆产生慢病毒载体的能力，用2μg/ml多西环素诱导克隆1、14、15和16，并且通过转导HEK293T细胞测量上清液的病毒滴度。

图4中的结果显示从每个克隆收获的慢病毒载体上清液的滴度，以转导单位(TU)/mL计。结果清楚地显示通过用BACpackWTGP-277delU5稳定转染悬浮细胞系HEK293 6E生成的细胞系能够产生与现有的瞬时转染系统相当的产量的慢病毒载体。

实施例5：克隆的载体滴度

将如图4所述的克隆1和16在培养物中传代并在稍后的时间点诱导和滴定，以确定从这些高产克隆的载体生产是否稳定。如图5A和5B中所示，来自这些克隆的载体滴度实际上在第5代和第21代之间适度增加，可能是由于引入诱导方法中的丁酸钠浓度的增加。

实施例6：构建指南(BAC+DHFR)

图6显示构建BACpackWTGP-DHFR-277delU5和BACpackSYNGP-DHFR-277delU5的逐步指南。由于XbaI和NheI消化物的相容末端，慢病毒包装基因逐渐被装载至pSmart BAC载体中。在添加GagPol时，制备2种构建体，其含有野生型GagPol(WTGP)或密码子优化的GagPol，SYNGP。这些被分别命名为BACpack-WTGP和BACpack-SYNGP。然后将DHFR盒和随后转移盒装载至这两种构建体上，并因此生成BACpackWTGP-DHFR-277delU5和BACpackSYNGP-DHFR-277delU5。

实施例7：选择稳定的多克隆合并物和通过MTX方案的基因组扩增通过用BACpackWTGP-DHFR-277delU5或BACpackSYNGP-DHFR-277delU5转染贴壁细胞系HEK293T来生成多克隆稳定转染子合并物。然后用博莱霉素选择成功的整合事件，并且在用多西环素诱导后评价这些多克隆合并物生成慢病毒载体的能力，并与未转染的HEK293T细胞进行比较。将转染的贴壁细胞转移至无血清培养基中，在摇动条件下在锥形烧瓶中生长，以使细胞适应于悬浮生长。

为了生成产生慢病毒载体的悬浮细胞系，使多克隆稳定合并物适应于悬浮生长。这随后为通过使细胞逐步经受渐增浓度的MTX的逆转录病毒基因和转基因的基因组扩增。将细胞接种于含有100μg/ml MTX的培养基中，并生长14-21天，或直至活力大于90％，然后经受下一最高浓度的MTX。为了观察是否已经发生逆转录病毒基因的扩增，在每轮扩增之后，通过液滴数字PCR评价核酸载体拷贝数；并将生成慢病毒载体的能力与前一步的能力进行比较。

实施例8：构建指南(BAC+GS)

图8显示通过用GS表达盒替换DHFR表达盒来构建含有gs选择标记基因的LV-BAC构建体的逐步指南。通过使用LV-BAC和pTAR-GS-RFP载体分别作为BAC和gs序列的模板的重叠PCR生成MauBI-MreI片段(图8A和8B)。由于聚合酶产物的平末端，将扩增子亚克隆至pCR^TM-Blunt II-TOPO^TM载体中(图8C)，然后装载至MauBI-MreI消化的LV-BAC中(图8D)。该构建体给予BAC2.0_GS的命名。

实施例9：修饰哺乳动物细胞以敲除GS基因

HEK293T细胞用靶向gs基因的锌指核酸酶(ZFNs)转染，并且通过CELL-1或T7测定法证实并测量转染合并物中的ZFN活性。从转染合并物生成细胞克隆，并筛选最多达500个克隆，以鉴定在gs基因的所有拷贝中具有移框插入缺失(插入或缺失)的那些。将阳性克隆扩增，建库，并通过PCR扩增修饰序列、随后测序来证实基因型。

实施例10：转染GS阴性HEK293T细胞并使用MSX选择稳定的多克隆合并物用LV-BAC构建体转染最多达三个GS敲除细胞和亲本HEK293T细胞的克隆。最初用博莱霉素选择成功的整合事件，并在多西环素诱导后评价GS敲除HEK293T克隆生成慢病毒载体的能力，并与转染的亲本HEK293T细胞系进行比较。然后选择GS阴性克隆中最佳的慢病毒载体生产者，用于用BAC2.0_GS转染。转染后，用单一轮不同的MSX浓度(0、5、10、25、50μM)选择BAC整合至转录活性区域中，持续3-4周。博莱霉素还用于选择BAC2.0_GS的整合事件，并且博莱霉素多克隆合并物充当MSX稳定多克隆合并物生成慢病毒载体的能力的对照。可以通过基因扩增进一步实现更高的慢病毒生产力。用MSX选择的多克隆稳定合并物在含有增加浓度的MSX(100-500μM)的培养基中生长3-4周，其后扩增细胞并评价慢病毒生产力。为了生成产生慢病毒载体的悬浮细胞系，使多克隆稳定合并物适应于悬浮生长，并评价在MSX的存在和不存在下慢病毒生产的稳定性。

应理解的是，本文描述的实施方案可以应用于本发明的所有方面。此外，在本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请，通过引用并入本文，如同完全阐述一样。

序列表

<110> GlaxoSmithKline Intellectual Property Development Limited

<120> 用于逆转录病毒产生的稳定细胞系

<130> PB66336

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2621

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 包含dhfr基因的构建体

<400> 1

cagctgtgga atgtgtgtca gttagggtgt ggaaagtccc caggctcccc agcaggcaga 60

agtatgcaaa gcatgcatct caattagtca gcaaccaggt gtggaaagtc cccaggctcc 120

ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccat agtcccgccc 180

ctaactccgc ccatcccgcc cctaactccg cccagttccg cccattctcc gccccatggc 240

tgactaattt tttttattta tgcagaggcc gaggccgcct cggcctctga gctattccag 300

aagtagtgag gaggcttttt tggaggccta ggcttttgca aaaagctttc ttggatagct 360

tggggggggg acagctcagg gctgcgattt cgcgccaaac ttgacggcaa tcctagcgtg 420

aaggctggta ggattttatc cccgctgcca tcatggttcg accattgaac tgcatcgtcg 480

ccgtgtccca agatatgggg attggcaaga acggagacct accctggcct ccgctcagga 540

acgagttcaa gtacttccaa agaatgacca caacctcttc agtggaaggt aaacagaatc 600

tggtgattat gggtaggaaa acctggttct ccattcctga gaagaatcga cctttaaagg 660

acagaattaa tatagttctc agtagagaac tcaaagaacc accacgagga gctcattttc 720

ttgccaaaag tttggatgat gccttaagac ttattgaaca accggaattg gcaagtaaag 780

tagacatggt ttggatagtc ggaggcagtt ctgtttacca ggaagccatg aatcaaccag 840

gccacctcag actctttgtg acaaggatca tgcaggaatt tgaaagtgac acgtttttcc 900

cagaaattga tttggggaaa tataaacttc tcccagaata cccaggcgtc ctctctgagg 960

tccaggagga aaaaggcatc aagtataagt ttgaagtcta cgagaagaaa gactaagatc 1020

tttgtgaagg aaccttactt ctgtggtgtg acataattgg acaaactacc tacagagatt 1080

taaagctcta aggtaaatat aaaattttta agtgtataat gtgttaaact actgattcta 1140

attgtttgtg tattttagat tccaacctat ggaactgatg aatgggagca gtggtggaat 1200

gcctttaatg aggaaaacct gttttgctca gaagaaatgc catctagtga tgatgaggct 1260

actgctgact ctcaacattc tactcctcca aaaaagaaga gaaaggtaga agaccccaag 1320

gactttcctt cagaattgct aagttttttg agtcatgctg tgtttagtaa tagaactctt 1380

gcttgctttg ctatttacac cacaaaggaa aaagctgcac tgctatacaa gaaaattatg 1440

gaaaaatatt ctgtaacctt tataagtagg cataacagtt ataatcataa catactgttt 1500

tttcttactc cacacaggca tagagtgtct gctattaata actatgctca aaaattgtgt 1560

acctttagct ttttaatttg taaaggggtt aataaggaat atttgatgta tagtgccttg 1620

actagagatc ataatcagcc ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct 1680

cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt 1740

tattgcagct tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc 1800

atttttttca ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt 1860

ctggatcccc aggaagctcc tctgtgtcct cataaaccct aacctcctct acttgagagg 1920

acattccaat cataggctgc ccatccaccc tctgtgtcct cctgttaatt aggtcactta 1980

acaaaaagga aattgggtag gggtttttca cagaccgctt tctaagggta attttaaaat 2040

atctgggaag tcccttccac tgctgtgttc cagaagtgtt ggtaaacagc ccacaaatgt 2100

caacagcaga aacatacaag ctgtcagctt tgcacaaggg cccaacaccc tgctcatcaa 2160

gaagcactgt ggttgctgtg ttagtaatgt gcaaaacagg aggcacattt tccccacctg 2220

tgtaggttcc aaaatatcta gtgttttcat ttttacttgg atcaggaacc cagcactcca 2280

ctggataagc attatcctta tccaaaacag ccttgtggtc agtgttcatc tgctgactgt 2340

caactgtagc attttttggg gttacagttt gagcaggata tttggtcctg tagtttgcta 2400

acacaccctg cagctccaaa ggttccccac caacagcaaa aaaatgaaaa tttgaccctt 2460

gaatgggttt tccagcacca ttttcatgag ttttttgtgt ccctgaatgc aagtttaaca 2520

tagcagttac cccaataacc tcagttttaa cagtaacagc ttcccacatc aaaatatttc 2580

cacaggttaa gtcctcattt aaattaggca aaggaattct t 2621

Claims

1.逆转录病毒包装细胞，其包含作为单独表达构建体的编码以下的核酸序列：

gag和pol蛋白；

env蛋白；和

可扩增选择标记；

其中所述表达构建体通过单一核酸载体全部在逆转录病毒包装细胞基因组内的单个基因座处整合在一起作为单元；且

其中所述单元的拷贝数是2或更多。

2.权利要求1的逆转录病毒包装细胞，其中所述可扩增选择标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)或谷氨酰胺合成酶(GS)。

3.权利要求2的逆转录病毒包装细胞，此时所述可扩增选择标记是DHFR，其中包含编码DHFR的核酸序列的表达构建体包含SEQ ID NO:1的核酸序列。

4.权利要求1至3中任一项的逆转录病毒包装细胞，其中所述单元进一步包含表达构建体，所述表达构建体包含编码可选择标记的核酸序列。

5.权利要求1至3中任一项的逆转录病毒包装细胞，其中所述单元进一步包含表达构建体，所述表达构建体包含编码辅助基因rev的核酸序列。

6.权利要求1至3中任一项的逆转录病毒包装细胞，其中编码gag和pol蛋白、env蛋白的核酸序列或辅助基因rev的核酸序列源自选自慢病毒、α-逆转录病毒、γ-逆转录病毒或泡沫逆转录病毒的逆转录病毒。

7.权利要求1至3中任一项的逆转录病毒包装细胞，其中所述表达构建体中的一种或多种包含CMV启动子。

8.权利要求7的逆转录病毒包装细胞，其中所述CMV启动子另外包含至少一个Tet操纵子。

9.权利要求1至3中任一项的逆转录病毒包装细胞，其另外包含绝缘子。

10.权利要求9的逆转录病毒包装细胞，其中每个表达构建体之间存在绝缘子。

11.权利要求1至3中任一项的逆转录病毒包装细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

12.权利要求11的逆转录病毒包装细胞，其中所述哺乳动物细胞是HEK 293T。

13.权利要求1至3中任一项的逆转录病毒包装细胞，其中所述单元进一步包含表达构建体，所述表达构建体包含编码逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组的核酸序列。

14.逆转录病毒生产细胞，其包含作为单独表达构建体的编码以下的核酸序列：

gag和pol蛋白；

env蛋白；

可扩增选择标记；和

逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组；

其中所述表达构建体通过单一核酸载体全部在逆转录病毒生产细胞基因组内的单个基因座处整合在一起作为单元；且

其中所述单元的拷贝数是2或更多。

15.包含非哺乳动物复制起点且能够容纳至少25千碱基(kb)的DNA的核酸载体，其特征在于所述核酸载体包含编码以下的核酸序列：

gag和pol蛋白，

env蛋白，和

可扩增选择标记，

16.权利要求15的核酸载体，其中所述可扩增选择标记是DHFR或GS。

17.权利要求16的核酸载体，此时所述可扩增选择标记是DHFR，其中包含编码DHFR的核酸序列的表达构建体包含SEQ ID NO:1的核酸序列。

18.权利要求15至17中任一项的核酸载体，其进一步包含表达构建体，所述表达构建体包含编码可选择标记的核酸序列。

19.权利要求15至17中任一项的核酸载体，其进一步包含表达构建体，所述表达构建体包含辅助基因rev的核酸序列。

20.权利要求15至17中任一项的核酸载体，其中所述核酸载体选自：细菌人工染色体、酵母人工染色体、P1-衍生的人工染色体、F黏粒或黏粒。

21.权利要求20的核酸载体，其中所述核酸载体为细菌人工染色体。

22.权利要求15至17中任一项的核酸载体，其另外包含编码逆转录病毒载体颗粒的RNA基因组的核酸序列。

23.产生稳定的逆转录病毒包装细胞系的方法，其包括以下步骤：

(a)将权利要求15至22中任一项的核酸载体转染入哺乳动物宿主细胞的培养物中；

24.产生稳定的逆转录病毒生产细胞系的方法，其包括以下步骤：

(a)将权利要求22的核酸载体转染入哺乳动物宿主细胞的培养物中；

25.权利要求23或24的方法，其中将步骤(b)和(c)重复两次或更多次。

26.权利要求23或24的方法，其在步骤a)之后进一步包括在培养物内选择具有在整合至哺乳动物宿主细胞基因组中的载体上编码的核酸序列的哺乳动物宿主细胞的步骤。

27.权利要求23或24的方法，其中所述选择剂是DHFR抑制剂或者GS抑制剂。

28.权利要求23或24的方法，其中所述选择剂是甲氨蝶呤(MTX)或者甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)。

29.通过权利要求23中任一项或当从属于权利要求23时的权利要求25至27中任一项的方法获得的逆转录病毒包装细胞。

30.通过权利要求24或当从属于权利要求24时的权利要求25至27中任一项的方法获得的逆转录病毒生产细胞。

31.产生复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒的方法，其包括以下步骤：

32.权利要求31的方法，其另外包括分离复制缺陷型逆转录病毒载体颗粒的步骤。