CN106029891A - 病毒载体生产系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种核酸序列，其包含与目的核苷酸有效连接的结合位点，其中所述结合位点能够与RNA结合蛋白相互作用，从而在病毒载体生产细胞内抑制目的核苷酸的翻译。

Description

病毒载体生产系统
技术领域
本发明涉及病毒载体的生产。更具体而言，本发明涉及在病毒载体生产细胞中改变由病毒载体编码的目的核苷酸的翻译。
背景技术
基因治疗广泛涉及使用遗传物质来治疗疾病。它包括在具有缺陷基因(例如，包含突变的那些)的细胞内利用这些基因的功能性拷贝进行补充、使不正常工作的基因失活以及引入新的治疗基因。
治疗性遗传物质可利用载体引入到宿主靶细胞中，从而使得能够传递核酸。这样的载体一般可以分为病毒类和非病毒类。
作为病毒复制循环的一部分，病毒自发地将它们的遗传物质引入到宿主靶细胞中。经工程改造的病毒载体利用这种能力，从而能够向靶细胞递送目的核苷酸(NOI)。迄今为止，许多病毒已被工程改造为用于基因治疗的载体。这些病毒包括逆转录病毒、腺病毒(ADV)、腺相关病毒(AAV)、单纯疱疹病毒(HSV)和牛痘病毒。
除了改造为携带目的核苷酸，病毒载体通常还经工程改造为复制缺陷型。这样，重组载体可直接感染靶细胞，但不能产生下一代感染性病毒粒子。其他类型的病毒载体可以为仅在癌细胞内具有条件复制能力，并且还可以编码有毒转基因或酶原。
逆转录病毒载体已经被开发为用于治疗各种遗传紊乱，并且目前已经表明其在临床试验中具有与日俱增的前景(例如，文献“Galy,A.and A.J.Thrasher(2010)Curr OpinAllergy Clin Immunol 11(6):545-550”；“Porter,D.L.,B.L.Levine,M.Kalos,A.BaggandC.H.June(2011)N Engl J Med 365(8):725-733”；“Campochiaro,P.A.(2012)Gene Ther19(2):121-126”；“Cartier,N.,S.Hacein-Bey-Abina,C.C.Bartholomae,P.Bougneres,M.Schmidt,C.V.Kalle,A.Fischer,M.Cavazzana-Calvo and P.Aubourg(2012)MethodsEnzymol 507:187-198”；“Sadelain,M.,I.Riviere,X.Wang,F.Boulad,S.Prockop,P.Giardina,A.Maggio,R.Galanello,F.Locatelliand E.Yannaki(2010)Ann N Y AcadSci 1202:52-58”；“DiGiusto,D.L.,A.Krishnan,L.Li,H.Li,S.Li,A.Rao,S.Mi,P.Yam,S.Stinson,M.Kalos,J.Alvarnas,S.F.Lacey,J.K.Yee,M.Li,L.Couture,D.Hsu,S.J.Forman,J.J.Rossi and J.A.Zaia(2010)Sci Transl Med 2(36):36ra43and SeguraMM,M.M.,Gaillet B,Garnier A.(2013)Expert opinion in biological therapy”)。
这种载体的重要实例包括γ逆转录病毒载体系统(基于MMLV)、灵长类动物慢病毒载体系统(基于HIV-1)和非灵长类动物慢病毒载体系统(基于EIAV)。
反向遗传学已经使这些基于病毒的载体被大量工程改造，从而可以通过利用适当的DNA序列转染哺乳动物细胞来产生编码大的异源序列(大约10kb)的载体(参见综述“Bannert,K.(2010)Caister AcademicPress:347-370”)。
在研究阶段，逆转录病毒载体的工程改造和使用通常涉及生产报告基因载体，其编码(例如)GFP或lacZ。这些临床上不相关的载体的滴度通常在1×106至1×107转导单位每毫升(TU/mL)粗收集物的范围内。这种收集物的进一步浓缩和纯化可以获得超过1×1010TU/mL的工作储存液。然而，与这些报告载体相比，生产编码治疗相关NOI的载体经常导致滴度大幅下降。
以下几个因素是这种作用的潜在原因：
1.治疗性基因组的尺寸。非常大的基因组可以被逆转录病毒包装，但是认为随着尺寸增加，逆转录和/或整合步骤效率降低。
2.载体基因组RNA的稳定性。该稳定性可能由于NOI内存在不可预测的不稳定因素而降低。
3.在载体基因组RNA内使用次优核苷酸。野生型病毒基因组通常有一定的核苷酸偏好(例如，HIV-1富含AT)。载体基因组往往不太富含AT，这可能会影响包装和/或后成熟步骤。
4.在病毒载体生产细胞内的NOI的表达。(过)表达蛋白可能间接或直接影响载体病毒粒子组装和/或感染性。
我们已经凭经验证明了在病毒载体生产细胞内表达由NOI编码的蛋白质可以对治疗性载体滴度产生不利影响(参见图3i和3ii)。
将由目的核苷酸编码的蛋白(目的蛋白，POI)引入到载体病毒粒子中也可能会影响载体颗粒的下游加工；例如，编码跨膜POI的目的核苷酸可能会导致在病毒载体病毒粒子内跨膜蛋白的高表面表达，从而潜在地改变该病毒粒子的物理性质。此外，该引入可以在递送位点将POI呈递给患者的免疫系统，这可能在体内对治疗性基因的转导和/或长期表达产生负面影响。目的核苷酸还可以诱导产生不希望的、会影响生产、纯化、回收和免疫原性的二级蛋白或代谢物，因此希望将这些不利影响降至最低程度。
对于在病毒载体生产细胞内抑制目的核苷酸的表达，同时在靶细胞中保持目的核苷酸有效表达的能力存在明确的需求。无论采用任何机制，病毒载体颗粒组装的“自然”途径和所得功能必须不能受到阻碍。然而，这并不简单，因为将被包装到病毒粒子中的病毒载体基因组分子必然会编码目的核苷酸表达盒。换句话说，由于载体基因组分子和目的核苷酸表达盒有效连接，所述目的核苷酸表达盒的改变可能对在细胞内产生载体基因组分子的能力造成不良后果。例如，如果将物理转录阻碍(例如TetR阻遏系统)用于抑制目的核苷酸表达盒，则可能的情况是载体基因组分子的产生通过空间位阻也会被抑制。此外，在病毒粒子成熟和释放后，控制机制的改变还必须不对载体基因组分子的功能产生不利影响(即，关于指导对靶细胞的转导)。例如，逆转录病毒载体的基因组RNA分子必须能够进行逆转录和整合过程——对于目的核苷酸表达盒的任何改变必须不得妨碍转导过程中的这些步骤。
抑制病毒载体生产细胞内的目的核苷酸表达可能会具有进一步的优点。如果目的核苷酸的表达导致载体生产细胞的活力降低，则对其的抑制可有益于需要大量细胞数的大规模生产。在粗载体收集物内，由于细胞死亡导致的细胞碎片的减少也会使杂质降低。载体平台(即在相同的载体系统中编码不同的治疗性基因)的加工、纯化和浓缩可被标准化；如果在载体生产过程中，需要病毒载体生产细胞中仅表达异源基因，则对于治疗性载体的整个平台而言，更易于优化下游加工，从而导致载体制剂具有非常相似的物理参数。可以将获得的载体的体内免疫应答变化性和毒性降至最低，这可导致治疗性目的核苷酸在靶细胞内更持久的表达。
将目的核苷酸的表达限制在生产细胞中的组织特异性启动子是一种可能解决这个问题的方案，尽管这些启动子的渗漏可能导致转基因蛋白的不利水平。然而，可使用组成型启动子来实现目的核苷酸在靶细胞内更多、更强的表达。的确，这样的强表达可能是体内的有效性所需要的。此外，在临床前和临床开发期间，当通过动物模型跟踪治疗性载体产品并用于人体时，组织特异性启动子可能是更不可预测的。
发明简述
如上所述，在病毒载体生产细胞中，由病毒载体表达盒编码的目的蛋白(POI)的表达对于病毒载体治疗的开发来说可能具有许多问题。特别地，这样的表达可能导致病毒载体的滴度降低，以及不期望的将由目的核苷酸编码的蛋白引入到病毒载体颗粒中或与病毒载体颗粒结合。
我们证明，这个问题可以通过以下方式得到克服：在真核细胞培养物中利用异源翻译控制系统来抑制目的核苷酸的翻译，从而抑制或阻止由目的核苷酸编码的蛋白质的表达。我们惊奇地发现，使用这种系统不妨碍可包装的载体基因组分子的产生，也不影响载体病毒粒子的活性，并且不干扰靶细胞中目的核苷酸的长期表达。
在一个方面中，本发明提供了一种核酸序列，其包含与目的核苷酸有效连接的结合位点，其中所述结合位点能够与RNA结合蛋白相互作用，从而在病毒载体生产细胞内抑制或阻止目的核苷酸的翻译。
在优选的实施方案中，RNA结合蛋白为色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)，例如细菌色氨酸RNA结合衰减蛋白。
本发明的另一个方面涉及一种包括本发明核酸序列的病毒载体。
本发明的另一个方面涉及一种病毒载体生产系统，其包含一组编码生产病毒载体所需元件的核酸序列，其中载体基因组序列包含本发明的核酸序列。
本发明的另一个方面涉及一种用于本发明的病毒载体生产系统的DNA构建体，所述DNA构建体包含本发明的核酸序列。
本发明的另一个方面涉及一种用于本发明的病毒载体生产系统的DNA构建体，所述DNA构建体包含本发明的编码RNA结合蛋白的核酸序列。
本发明的另一个方面涉及一组用于本发明的病毒载体生产系统中的DNA构建体，所述一组DNA构建体包含本发明的一些或全部DNA构建体、编码Gag/Pol蛋白和Env蛋白的DNA构建体、或其功能性替代物。表达Rev的DNA构建体也可以用于所述病毒载体生产系统中。
本发明的另一个方面涉及一种病毒载体生产细胞，其包含本发明的核酸序列、病毒载体生产系统、或者一些或全部的DNA构建体。
本发明的另一个方面涉及一种生产病毒载体的方法，其包括将本发明的核酸序列、病毒载体生产系统、或者一些或全部的DNA构建体引入到病毒载体生产细胞中，并且在适合产生所述病毒载体的条件下培养所述生产细胞。
本发明的另一个方面涉及一种利用本发明的病毒载体生产细胞由本发明的病毒载体生产系统生产的病毒载体、或由本发明的方法生产的病毒载体。
本发明的另一个方面涉及一种由发明的病毒载体所转导的细胞。
本发明的另一个方面涉及本发明的核酸序列、病毒载体或转导的细胞用于药物。
本发明的另一个方面涉及本发明的核酸序列、病毒载体或转导的细胞在药物中的应用。
本发明的另一个方面涉及本发明的核酸序列、病毒载体或细胞在制备用于将目的核苷酸递送至有需要的靶位点的药物中的应用。
本发明的另一个方面涉及一种治疗方法，包括向有需要的对象施用本发明的核酸序列、病毒载体或转导的细胞。
本发明的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含本发明的核酸序列、病毒载体或转导的细胞、以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明的另一个方面涉及一种鉴定核酸结合位点和/或核酸结合蛋白的方法，当与所述核酸结合位点有效连接时，所述核酸结合蛋白能够与所述核酸结合位点相互作用，从而在病毒载体生产细胞内抑制或阻止目的核苷酸的翻译，其中所述方法包括分析细胞中的报告基因的表达，所述细胞包含与报告基因有效连接的核酸结合位点、以及核酸结合蛋白。
发明内容
在生产细胞中由转基因/NOI编码的蛋白的不利表达可以显著限制以高滴度或甚至中等滴度来生产治疗性逆转录病毒载体，特别是当转基因由有力的组成型启动子驱动时。某些转基因蛋白对细胞生产有活性的、感染性的载体颗粒的能力具有可变的、直接和间接的影响。细胞的新陈代谢、病毒载体颗粒组装和/或颗粒活性可能会受转基因产物特定(已知或未知的)作用的影响。使生产细胞内转基因表达沉默的组织特异性启动子已被用来解决这个问题，但这种方法的显著缺点是，由组织特异性启动子启动的基因表达往往不如由组成型启动子启动的基因表达强，并且在载体开发期间，在所利用的不同动物模型中更不可预测或者可变性更高。
我们惊奇地发现，RNA结合蛋白(如细菌的色氨酸操纵子调节蛋白，色氨酸RNA结合衰减蛋白，TRAP)和与其结合的RNA靶标的新用途会抑制或阻止RNA或DNA病毒载体生产细胞中的转基因翻译。在TRAP的情况中，转基因翻译的这种降低或阻止可导致编码某些目的核苷酸的载体的载体滴度提高100倍之多。这种系统被称为载体生产细胞内转基因抑制系统或TRIP系统。
我们首次证明了使用细菌翻译阻遏系统通过抑制目的核苷酸mRNA的翻译，增加了真核细胞生产系统中的RNA(逆转录病毒)载体滴度。在目的核苷酸翻译起始密码子上游设置RNA结合蛋白的结合位点(例如，TRAP结合序列，tbs)使得来自内部表达盒的mRNA的翻译受到特异性抑制，同时对载体RNA的生产或稳定性不存在不利的影响。我们还证明了，载体基因组中tbs的存在似乎最低限度地影响逆转录病毒载体的生产和功能。这意味着，在病毒粒子中包装长载体基因组RNA的情况中，逆转录酶(RT)可以从tbs处置换TRAP，或者TRAP并非有效地结合至tbs。我们还证明了，在DNA病毒载体(如AAV)的目的核苷酸表达盒内放置相似结构的tbs使得目的核苷酸翻译受到TRAP的抑制，同时保持活性病毒载体病毒粒子的生产。
tbs与目的核苷酸的翻译起始密码子之间的核苷酸的数目可以优选地为0至12个核苷酸，而不会影响对mRNA翻译的抑制程度。虽然不希望受任何理论的束缚，但是tbs-结合的TRAP可以通过在40S扫描核糖体复合物到达启示密码子之前，对其进行物理阻断，从而抑制翻译起始，否则将会形成更稳定且具有更高亲和性的翻译工具。
此外，我们发现，tbs可以放置在内部核糖体进入位点(IRES)的下游，以抑制位于多顺反mRNA中的目的核苷酸的翻译。事实上，这将提供进一步的证据表明tbs结合的TRAP可能会阻断40S核糖体的通过；IRES元件的作用是在完整的翻译复合体形成之前，以不依赖CAP的方式将核糖体40S亚基与mRNA隔离(参见文献“Thompson,S.(2012)Trends inMicrobiology 20(11):558-566”，其为关于IRES翻译起始的一篇综述)。置于IRES和目的核苷酸起始密码子之间的tbs序列略微影响非抑制性的翻译水平，但保持了受TRAP的功能性作用的能力。这一发现表明，TRIP系统可以抑制来自于病毒载体基因组所表达的单个mRNA的多个开放阅读框。当生产编码多个治疗基因的载体时，特别是当所有的转基因产物可能会对载滴度具有一定程度的负面影响时，TRIP系统的这一特征将会是有用的。
tbs序列的进一步表征显示，对于作为RNA结合蛋白的TRAP，优选的是，TRIP系统最多与包含至少8个RAGNN重复的tbs序列一起发挥作用，虽然在一个实施方案中，使用7个重复仍然可以获得强的转基因抑制，并且在另一个实施方案中，使用6个重复可以使转基因抑制到足以增加载体滴度的水平。同时RAGNN共有序列可以发生变化，以保持TRAP介导的抑制，优选的是，可以对所选择的精确序列进行优化，以确保在非抑制状态下高水平的翻译。例如，可以通过除去在没有TRAP(即，在靶细胞中)时会阻碍mRNA翻译效率的剪接位点、不稳定序列或茎环结构，从而优化tbs序列。关于给定tbs的RAGNN重复的结构，RAG重复之间的“间隔”核苷酸N的数目优选为两个。然而，在至少两个RAG重复之间包含超过两个N间隔子的tbs序列也是可以接受的(如体外结合研究判断的那样，多达50％的包含三个N的重复会产生功能性的tbs，参见文献“Babitzke P,Y.J.,Campanelli D.(1996)Journal ofBacteriology 178(17):5159-5163”)。事实上，我们已经表明，11x RAGNN tbs序列可以容忍最多三个RAGNNN重复的替代，并且在与TRAP-结合的共同作用中仍然保持一些潜在有用的翻译阻断活性。
为了在哺乳动物(例如，人)细胞中表达，可以对RNA结合蛋白(例如，TRAP)开放阅读框进行密码子优化，因为细菌的基因序列对于在哺乳动物细胞中的表达而言可能不是最佳的。所述序列也可以通过除去潜在不稳定的序列和剪接位点进行优化。使用在TRAP蛋白C-末端上表达的His标签似乎有益于翻译抑制，并且其可以任选地使用。该C末端His标签可改善真核细胞内TRAP的可溶性或稳定性，虽然不能排除改进的功能性益处。尽管如此，带有HIS标签和未带该标签的TRAP能够有力地抑制转基因表达。还可以对RNA结合蛋白(例如，TRAP)转录单元内的某些顺式作用序列进行优化；例如，在瞬时转染的情况下，相比于CMV启动子驱动的构建体，EF1a启动子驱动的构建体能够利用低输入的TRAP质粒进行更好的抑制。
TRAP系统内的RNA结合蛋白(如TRAP)的强表达是希望的，以便最大程度地抑制转基因的翻译。据预期，要求包含高水平的RNA结合蛋白质粒会对瞬时载体生产系统中的其他载体生产构建体的转染产生不利的影响。这是因为在没有其他质粒时，基因组构建体的量/比率通常是最优化的；要求共转染大量编码RNA结合蛋白的质粒可能会对这些最优比率产生不利影响，导致载体滴度降低。然而，结果表明，当使用瞬时转染方案时，TRAP与逆转录病毒载体基因组质粒之比低至1:10时能达到接近最大水平的转基因抑制。此外，当采用高达1:5的TRAP与逆转录病毒载体基因组质粒之比时，表达非问题(non-problematic)目的核苷酸的载体以接近最大的滴度产生。因此，在瞬时转染逆转录病毒载体生产构建体时，以这些较低的输出量添加TRAP表达质粒不太可能会对这些构建体的之前的最佳比率产生不利影响。也最优化了TRAP表达质粒与DNA病毒载体元件质粒(如AAV)之比。
这些重要的发现表明，TRIP系统可以在瞬时转染载体生产方案中使用。TRIP系统也可用于稳定生产系统，因此广泛适用于病毒载体的制造。
附图说明
图1示意性地示出了典型的逆转录病毒载体元件。目前使用的治疗性逆转录病毒载体系统已经由它们所来源的野生型病毒基因组经过高度工程改造。通常，使用3元件或4元件系统来生产γ逆转录病毒载体，所述系统需要载体基因组、Gag/Pol和包膜表达构建体，并且对于基于HIV的慢病毒载体而言，则还需要辅助基因Rev。如果开放阅读框(ORF)取代了RRE，则基于EIAV的慢病毒载体不需要Rev。载体基因组通常需要包装信号(ψ)、NOI、(任选的)转录后元件(PRE)、3’ppu和自失活(SIN)LTR。R-U5区域对于校正载体基因组RNA和转基因mRNA的聚腺苷酸化，以及逆转录加工来说都是需要的。通常，如驱动其他载体系统元件的启动子那样，基因组盒内编码的“外”启动子和“内”启动子(Pro)为强的真核或病毒启动子。
图2为描述载体基因组质粒混合实验的示意图，该实验确定了目的核苷酸转基因产物对生产细胞产生载体的能力的负面影响的程度。在载体基因组混合实验中，通过对细胞共转染载体包装组件和两种类型的载体基因组质粒来产生载体颗粒，所述两种载体基因组质粒为：报告基因载体基因组质粒和编码NOI转基因的载体，从而检测转基因产物对细胞的载体生产能力的影响。由于lacZ或GFP报告基因蛋白的表达不影响载体滴度，这些被用作对照载体。导入编码目的核苷酸转基因的第二载体基因组质粒可能对细胞的载体生产能力有负面影响，这对lacZ-载体的产生具有旁观者效应。目的核苷酸转基因的表达主要源自内部表达盒，其通常由强组成型启动子启动。由于每个病毒粒子可能包装两种拷贝的载体基因组RNA分子，并且只有一种载体RNA被逆转录并整合入靶细胞，因此混合第二基因组与lacZ-载体具有稀释效应；当按比例更多的第二基因组质粒与lacZ-载体基因组质粒混合时这种稀释效应会更明显。因此，需要“稀释”对照，其中第二载体基因组质粒是GFP；已知GFP对载体滴度无负面影响。因此，给定的NOI转基因产物对载体生产能力的影响可以针对LacZ:GFP载体基因组混合对照进行测量。由混合实验产生的载体通常通过lacZ-载体的读出(例如，载体-转导细胞的X-gal染色)来滴定。
图3i.在产生过程中载体基因组的混合证明了转基因蛋白表达对载体滴度的影响。
A.在瞬时载体产生过程中，lacZ-编码载体基因组成分以 1:1或1:5的比例与另一载体基因组混合，通过靶细胞的X-gal检验来测定对载体滴度的影响。GFP表达不影响载体滴度，因此不同比例下的滴度减少水平表明了稀释的lacZ基因组的基线效应。因此，其他载体转基因对lacZ滴度的影响可针对lacZ:GFP混合物进行测量。
B.该实验说明了来自StarGenTM、和基因组的转基因蛋白对载体滴度产生7至100倍的影响。外部和内部启动子元件均为CMV。
图3ii.在产生过程中混合COX-2和/或FPR基因组和lacZ基因组，证明了转基因蛋白表达对载体滴度的影响。在瞬时转染载体产生过程中，lacZ-编码载体基因组成分以1:1或1:5的比例与GFP或治疗性载体基因组混合，通过靶细胞的X-gal检验来测定对lacZ载体滴度的影响。GFP表达不影响载体滴度，因此lacZ滴度表明了稀释的lacZ基因组的基线效应。因此，其他载体转基因对lacZ滴度的影响可针对1:1和1:5比例下的lacZ/GFP混合物进行测量。所测定的治疗性载体是携带IRES元件的单转基因载体或双顺反子载体；COX-2和FPR对lacZ滴度的影响可以是加和的。
图4.在逆转录病毒载体生产细胞中抑制转基因表达的TRIP系统的实例。逆转录病毒载体生产细胞表达TRAP或密码子优化的TRAP(coTRAP)，其中在载体基因组表达盒的转基因的5’UTR中插入tbs。TRAP与tbs结合并阻碍转基因蛋白翻译。载体RNA分子也能够结合TRAP，但令人惊奇地是，这不阻碍载体病毒粒子的单轮生命周期，即通过载体颗粒正常进行逆转录和整合步骤。
图5.在GFP-质粒转染的细胞群的流式细胞分析中单独使用GFP-阳性细胞的数目限制或MFI限制。这些示意图示出了在比较具有基本上不同的GFP表达水平的群体的实验中的可能的结果。在实验A/B中，GFP-阳性群体具有相同的MFI，在实验C/D中，GFP-阳性群体包含相似数目的细胞，但10倍不同的MFI。情况A特别证明了当使用pEF1a-coTRAP[H6]时，当共转染pCMV-tbsGFP和pEF1a-coTRAP[H6]时，连续观察到非常少量(<1％)的超高表达GFP-阳性的HEK293T细胞，这表明EF1a启动子在这个小的亚群体中可能是无活性的。因此，当单独使用MFI作为群体表达的度量时，其歪曲了对GFP-抑制的分析。因此，表达评分(GFP-阳性％x MFI)更有效地描述了门控(gated)群体中GFP蛋白表达的总体水平。
图6.用于评估TRAP/tbs结构的荧光报告基因构建体。pCMV-tbsGFP最初是由用于样品评估的pONY8.4RC-GFP制备的。之后，制备非SIN EIAV载体基因组pONY8.4RC-tbsGFP以用于评估TRAP/tbs结构对载体活性的影响。最初用于评估的tbs序列[RAGNN]11两侧有位于翻译起始密码子前端的41nt近端序列和9nt远端序列。
图7.在瞬时转染评价研究中使用并产生稳定的HEK293T-TRAP[H6]细胞系的TRAP-表达质粒。最初的实验利用pCI-Neo构架以驱动带有/不带有C-末端HIS6-标签的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的密码子/序列优化TRAP的表达。然后用EF1a启动子序列代替CMV启动子以获得pEF1a-coTRAP[H6]。用寡聚接头代替pEF1a-coTRAP[H6]中的H6序列得到pEF1a-coTRAP质粒，从而使得EF1a启动子启动的构建体的3’UTRs相同，这与CMV启动子启动的构建体不同，其中3’UTRs不同。通过合成并表达编码TRAP[H6]和杀稻瘟菌素抗性标记的多顺反子mRNA，完全再衍生了pEF1a-coTRAP-iBsr；使用EMCV IRES驱动Bsr翻译。
图8.从HEK293T细胞的TRAP-介导的转基因表达抑制的第一瞬时转染评价研究中选择照片。照片证据示出了pCI-coTRAP[H6]特异性抑制含有tbs的pCMV-tbsGFP的5’UTR表达的能力。
图9.HEK293T细胞中TRAP-介导的转基因表达抑制的第一瞬时转染评价研究的流式细胞数据的总结
A.在分开的轴上绘制的阳性GFP群体百分比和中值荧光强度(ArbU)的直方图。TRAP和TRAP[H6]对pCMV-GFP的GFP表达都无任何影响。TRAP[H6]在1:1比例下显著地降低了pCMV-tbsGFP的GFP表达，并且是以剂量-依赖型的方式。TRAP表现出较低的抑制pCMV-tbsGFP的表达的能力。
B.表达评分来自各共转染细胞培养物，以更好地评估TRAP-介导的抑制的程度。阳性细胞百分比乘以MFI得到了每种培养物所产生的GFP总量的近似值。在这个实验中，通过表达评分评价的TRAP[H6]抑制GFP的最高水平为约25倍。
C.报告质粒与pCI-coTRAP或pCI-coTRAP[H6]以 1:1的比例共转染的代表性流式细胞点图。
D.相对于无TRAP表达的质粒(填充物)，用GFP-报告质粒和EF1a启动子或CMV启动子驱动的TRAP[H6]质粒共转染HEK293T细胞的GFP中值荧光强度。使用pEF1a-coTRAP[H6]在GFP:TRAP质粒为1:0.1摩尔比的条件下，可以实现由pCMV-tbsGFP近似最大程度地抑制GFP，而使用pCI-coTRAP[H6]则不可能。
图10.HIS6-标记的TRAP和未标记的TRAP的功能比较。
A.阳性GFP群体百分比和中值荧光强度(ArbU)的直方图绘制在分开的轴上。HIS6-标记的或未标记的TRAP表达质粒或填充(stuffer)质粒与GFP报告质粒以指定的比值(括号中)进行共转染，一式三份。用流式细胞术分析转染的细胞。
B.表达评分(MFI x GFP％)给出了群体中TRAP-介导的GFP抑制效果的总体评价。HIS6C-末端标签使TRAP通过pCMV-tbsGFP抑制GFP表达的能力增加最少2倍。
图11.不同TRAP同系物抑制转基因表达的能力，以及对HEK293T-TRAP细胞系的评价。
A.对来自热液口脱硫肠状菌(Desulfotomaculum hydrothermale)和寡食胺单胞菌(Aminomonas paucivorans)的TRAP ORF进行密码子/序列优化，并克隆到pEF1a-质粒骨架中。TRAP-表达或填充质粒与GFP报告质粒以指定的比值(括号中)进行共转染，一式三份。用流式细胞术分析转染的细胞。得到每种转染条件下的平均表达评分。
B.比较了四种HEK293T-TRAP[H6]细胞系的通过瞬时转染由pCMV-tbsGFP抑制转基因表达的能力，一式三份。pCMV-GFP或pCMV-tbsGFP与填充质粒或pEF1a-coTRAP[H6]共转染。通过流式细胞术分析细胞并得到每种条件下的平均表达评分。通过用pCMV-GFP/填充的表达评分除以其他条件下的表达评分，得到平均抑制倍数。
图12.评价TRAP-tbs系统对于逆转录病毒载体产生的流式细胞数据的总结。
A.在分开的轴上绘制阳性GFP群体百分比和中值荧光强度(ArbU)的直方图。用TRAP[H6]表达质粒和单个GFP报告质粒，或者用TRAP[H6]表达质粒和非-SIN EIAV载体基因组质粒(参见图6)在指定的比值下共转染HEK293T细胞。通过用Gag/Pol和VSVG表达质粒与非-SIN EIAV载体基因组质粒进行额外的共转染以实现载体的生产。在载体产生过程中，GFP抑制与单个GFP报告基因的情况相似，并且依赖于TRAP和tbs序列的存在。
B.表达评分(MFI x GFP％)给出了群体中TRAP-介导的GFP抑制效果的总体评价。
C.D17细胞的载体滴度。使用通过转染pONY8.4RC-(tbs)GFP载体产生的载体上清液转导D17细胞并在4天后进行流式细胞分析。TRAP/tbs结构令人惊讶地对载体滴度具有最小的影响，说明载体颗粒的单轮生命周期不受所推定的载体RNA基因组上的TRAP/tbs相互作用的影响。
图13.检测在TRAP/tbs结构中tbs和转基因AUG密码子之间的短间距要求的流式细胞数据的总结。
A.示意性示出了在基于pONY8.4RC-tbsGFP的载体基因组中检测的间隔变体。“无效”变体将AUG变为终止密码子以控制任何GFP表达，其可能源自全长载体基因组RNA，即由“外部”CMV启动子驱动(参见图6)。5’茎环(SL)序列源自枯草芽孢杆菌中的trp操纵子前导序列。下划线的核苷酸表示kozak序列。这些间隔子变体载体报告质粒与填充质粒或pEF1a-coTRAP[H6]以指定摩尔比(括号中)共转染入HEK293T细胞，一式三份。用流式细胞术对细胞进行分析。
B.通过生成平均表达评分来评价每种条件下的总体GFP表达。GFP抑制的效率对于间隔变体+11至+1基本相同。“0”变体似乎在无TRAP[H6]条件下略微有损GFP表达。意外地，5’SL变体对TRAP-介导的抑制完全无响应，说明5’SL干扰了该系统中的TRAP-tbs相互作用。
图14i.确定TRAP-结合序列中的对于TRAP/tbs结构功能所必需的RAGNN重复的最小数目
A.将tbs变体序列克隆到pCMV-tbsGFP中以用于评价。在该研究中所评价的初始tbs序列是在第10和11个RAGNN重复之间将TG间隔子改变为AA而得到优化的序列。因此设计了变体tbsx11M和tbsx10M以使潜在的隐藏SD位点被移除。从tbsx11M变体的3’末端连续地删除RAGNN重复(只是11至4重复)，但是保持GFP报告基因的良好翻译状态。在GFP:TRAP质粒为10:1的条件下，重复-变体tbs-GFP报告质粒与填充质粒或pEF1a-coTRAP[H6]共转染入HEK293T细胞，一式三份。用流式细胞术对细胞进行分析。
B.在分开的轴上绘制阳性GFP群体百分比和中值荧光强度(ArbU)的直方图。
C.计算每种条件下的平均表达评分并用作转染群体内总体GFP表达的度量。
D.用与填充质粒一起转染的每种tbs变体的表达评分除以转染pEF1a-coTRAP[H6]的表达评分，从而得到抑制倍数因子。8个RAGNN重复可能得到了最大抑制，7个RAGNN重复的tbs得到了近似最大抑制。6个RAGNN重复的tbs得到中等水平的转基因抑制，然而5个和4个RAGNN重复的tbs序列具有最低的功能性。
图14ii.在11个RAGNN重复tbs背景下，评估具有一个或多个RAGNNN重复的tbs序列的功能性。
A.在本实验中称为N2x11的tbsx11M tbs序列用作这样的改变的基础：用逐渐更多的RAGNNN替代tbs中心的RAGNN重复。因此，变体逐渐地含有1、3、5、7或10个RAGNNN重复(3’末端ct核苷酸不算作间隔子，所以N3x11包含10个NNN间隔核苷酸)。将这些tbs变体克隆到治疗性载体基因组质粒pONYK-tbsCOX2中(参见图18i)，替换现有的tbs。
B.通过以载体基因组:TRAP质粒为5:1的比例与EIAV载体包装组件和填充质粒或pEF1a-coTRAP[H6]一起共转染，这些含有tbs变体的载体基因组质粒用于制备载体。用来自最终(end-of)生产细胞的细胞裂解物对COX-2进行免疫印迹。
图14iii.在11个RAGNN重复tbs背景下评估具有一个或多个RAGNNN重复的tbs序列的功能性：转染后8小时载体生产细胞中COX2蛋白的水平。先前分析了最终生产细胞(转染后48小时)中的COX2水平(参见图14iiB)。为了检测在载体产生过程中TRAP-tbs介导的抑制是否随时间有差异，通过免疫印迹分析了转染后8小时的生产细胞的COX2水平。转染后8小时，编码N3N2tbs变体的不同构建体的COX2表达模式与约转染后48小时观察到的相同(图14iiB)。这说明在载体产生过程中给定tbs序列的TRAP的抑制程度变化不明显。
图14iv.在11个RAGNN重复tbs背景下评估具有一个或多个RAGNNN重复的tbs序列的功能性：载体滴度。图14ii和图14iii相关实验中的由EIAV-tbsCOX2生产细胞产生的原始载体上清液通过DNA整合分析进行滴定，以测定在生产过程中COX2抑制对载体活性的影响。数据表明，充分提高EIAV-COX2载体滴度只需要生产过程中适度的COX2抑制(参见图14iiB和图14iii中的N3N2x11[3])。
图14v.在7个和8个RAGNN重复tbs背景下评估具有一个或多个RAGNNN重复的tbs序列的功能性。
A.先前数据说明使用含有8个或7个RAGNN重复的tbs可以产生最大或接近最大水平的转基因抑制。将一个单独的RAGNNN重复插入到8xRAGNN和7xRAGNN tbs中，以评估对这些较短的tbs序列的功能的影响。在含有RAGNN的tbs(包含x11、x7、x6和x5重复)之间进行比较。将这些tbs变体克隆到治疗性载体基因组质粒pONYK-tbsCOX2(参见图18i)，替换现有的tbs。
B.通过以载体基因组:TRAP质粒为5:1的比例与EIAV载体包装组件和填充质粒或pEF1a-coTRAP[H6]一起共转染，这些含有tbs变体的载体基因组质粒用于制备载体。在载体产生过程中对早期(即转染后8小时)的细胞裂解物进行COX-2的免疫印迹。数据显示在含有7xRAGNN的tbs中，RAGNNN重复在8个重复以内是可以“被容许”的。
图15.构建IRES-tbs GFP报告质粒以检测基因表达的IRES-依赖型TRAP/tbs调控。
A.制造IRES-tbs GFP报告基因构建体，使得从远端顺反子(GFP)的表达能够报告TRAP的抑制程度。在pCMV-Vi-tbsx11G中IRES元件和tbs之间的距离是44nt(编码间隔核苷酸)，而在pCMV-Vi-tbsx4G中该距离被减少为4nt。pCMV-ViGFP被克隆为“无tbs”的对照。
B.IRES-tbs GFP报告质粒与填充质粒或pEF1a-coTRAP[H6]以GFP报告基因:TRAP质粒为10:1的比例被共转染入HEK293T细胞，一式三份。在平行实验中包括单独的ORF GFP报告质粒作为TRAP-介导的抑制的对照。通过流式细胞术对细胞进行分析。计算每种条件下的平均表达评分并用作转染群体内总体GFP表达的度量。TRAP能够以与5’CAP-介导的表达相似的程度来抑制IRES指导的GFP表达。
图16.使用TRIP系统生产含有WPRE的EIAV SIN-载体。检测载体基因组质粒pONY8.9RC-tbsGFP(+WPRE)以确定WPRE是否对TRAP/tbs结构有任何影响。通过流式细胞仪分析细胞。得到共转染有载体基因组pONY8.4RC-tbsGFP或pONY8.9RC-tbsGFP(+WPRE)和pEF1a-coTRAP[H6]或填充质粒的细胞群的表达评分。评分得自GFP％和中值荧光强度值的乘积，以提供总群体中GFP表达的度量。
图17i.将基于的治疗性载体基因组改造为包含tbs的示意图。用于治疗血友病A的载体编码人因子VIII基因。已知因子VIII阻碍VSV-G引入载体病毒粒子颗粒，大幅降低了载体活性。将tbs或错义tbs(scrambled tbs)克隆到载体基因组以分别产生ReQuinate–tbs和ReQuinate–con载体。
图17ii.使用TRIP系统改善滴度。在HEK293T细胞中使用TRIP系统按照标准载体方案产生基于的载体：以5:1的比例共转染载体基因组质粒和pEF1a-coTRAP[H6]，以及EIAV载体包装组件。收集载体上清液并用整合分析进行滴定，并且通过离心浓缩70倍，之后进行PERT检验，然后对VSV-G和p26(EIAV衣壳)进行免疫印迹。
A.通过DNA整合分析判断，载体滴度比提高30倍，这依赖于载体产生过程中TRAP的存在。载体的颗粒与感染力的比率也提高了(数据未显示)。
B.浓缩载体样品中的VSV-G的免疫印迹。载体滴度与VSV-G被引入载体病毒粒子的程度相关；已知h因子VIII显著抑制VSV-G被引入逆转录病毒载体病毒粒子的量。
C.载体核(p26-衣壳)的免疫印迹证明每个孔中负载有数目相同的载体病毒粒子。
图18i.编码COX2或FPR的载体基因组的示意图。将tbsx11M变体克隆到单基因表达载体。注意，与研究中使用的对照组的含有错义tbs的5’UTR相比，5’UTR序列+/-tbsx11M完全不同。
图18ii.使用TRIP系统改善单基因COX2载体滴度。使用TRIP系统在HEK293T细胞中产生基于单基因COX-2的载体：以5:1的比例共转染载体基因组质粒和pEF1a-coTRAP[H6]，以及EIAV载体包装组件。收集载体上清液，并且使用相同体积的原始收集的上清液通过整合分析进行滴定，通过免疫印迹用抗-COX-2抗体检测最终生产细胞的裂解液。还通过免疫印迹分析最终的整合分析细胞(即，用COX-2载体制备物转导的那些细胞)的COX-2表达。
A.通过DNA整合分析判断，COX2载体滴度提高了100倍，这依赖于载体产生过程中TRAP的存在。
B.最终生产细胞内的COX-2免疫印迹说明载体滴度与COX-2水平呈负相关。
C.每单位体积收集的上清液中活性载体颗粒的增加导致靶细胞中COX-2转导和表达的增加。
图18iii.使用TRIP系统改善单基因FPR载体滴度。使用TRIP系统在HEK293T细胞中生产基于单基因FPR的载体：以5:1的比例共转染载体基因组质粒和pEF1a-coTRAP[H6]，以及EIAV载体包装组件。收集载体上清液，并使用相同体积的原始收集的上清液通过整合分析进行滴定。通过DNA整合分析判断FPR载体滴度提高了24倍，这依赖于载体产生过程中TRAP和tbs的存在。
图19i.编码COX-2或FPR ORF的载体基因组示意图。如图所示将tbsx11M变体克隆到多顺反子载体基因组质粒中。将COX-2和FPR放置在上游或下游位置，且tbsx11M序列插入在这两个位置或不插入其他任何位置。
图19ii.使用TRIP系统改进多顺反子COX2/FPR载体滴度。使用TRIP系统在HEK293T细胞中生产图19i中的多顺反子载体：以5:1的比例共转染载体基因组质粒和pEF1a-coTRAP[H6]，以及EIAV载体包装组件。收集载体上清液并使用相同体积的原始收集的上清液通过整合分析进行滴定，并通过免疫印迹用抗-COX-2抗体探测最终生产细胞的裂解液。通过DNA整合分析，判断COX-2/FPR多顺反子载体滴度提高了约100倍，且FPR/COX-2多顺反子载体滴度提高了约50倍，这依赖于载体产生过程中TRAP和tbs的存在。最终生产细胞内的COX-2免疫印迹说明载体滴度与COX-2水平呈负相关，且TRAP/tbs结构能够在同一mRNA转录本的多个位点实现转基因抑制。
图20i.改造OXB-102载体基因组以用于TRIP系统的示意图。如图所示，将tbsx11M变体克隆到多顺反子载体基因组质粒。仅改造上游TH-CH1融合基因使其包括tbsx11M序列。
图20ii.在TRIP系统中在载体产生过程中抑制“非问题”转基因。使用TRIP系统在HEK293T细胞中生产图20i中的载体：以5:1的比例共转染载体基因组质粒和pEF1a-coTRAP[H6]，以及EIAV载体包装组件。收集载体上清液并使用抗-TH抗体通过免疫荧光分析进行滴定(A)，并通过免疫印迹用抗-TH和抗-CH1抗体探测最终生产细胞的裂解液(B)。TRAP/tbs系统对生产细胞中的转基因的抑制是明显的，但是对靶细胞中的转基因表达无影响，说明没有可检测到的TRAP相关活性转移到靶细胞中，并且与TRIP生产细胞的情况不同，在转基因盒5’UTR内编码的tbs允许融合转基因在细胞中稳定表达。
图21i.所检测的来自不同细菌物种的色氨酸RNA-结合蛋白同系物列表，其用于检测在HEK293T细胞中的TRAP-抑制功能性。列出了研究中所检测的TRAP同系物的名称、谱系和NCBI参考标号。(其他的信息参考图11A)。
图21ii.检测不同的TRAP同系物和S72N变体，以检测其对包含x11-和x12-RAGNN重复的tbs-GFP报告基因盒的抑制功能。将具有6个His标记的TRAP同系物克隆到pEF1a-表达质粒中，并将该表达质粒与pCMV-tbsx11-GFP或pCMV-tbsx12-GFP报告质粒一起以1:5(pTRAP:p报告质粒)的比例共转染到HEK293T细胞中。对于“无TRAP”的对照来说，使用pBluescript以产生GFP表达的“开启”水平，以比较TRAP变体。通过流式细胞术在转染后2天对细胞进行分析，并生成GFP表达评分(MFI x GFP％)示于[A]中。[B]以相对于各tbs-GFP报告基因的“无TRAP”对照的抑制倍数示出这些数据。(其他的信息参考图11A)。
图21iii.在新型抑制系统中不同TRAP同系物功能的总结。在HEK293T细胞中使用x11-或x12-RAGNN重复tbs-GFP报告基因盒的不同同系物和S72N变体的抑制倍数总结。同系物代表了相比于枯草芽孢杆菌TRAP(100％；包括His-标签的比对)的多样化的氨基序列改变(56-78％)。(其他的信息参考图11A)。
图22i.用于分离稳定细胞系的TRAP表达盒。对pEF1a-coTRAP[H6]进行改造，从而使IRES-Bsr序列插入到TRAP[H6]和聚腺苷酸化信号之间。在质粒线性化过程中，从DNA序列中去除细菌序列，并且将该编码枯草芽孢杆菌TRAP的盒稳定转染到低传代的HEK293T细胞中。(其他的信息参考图11B)。
图22ii.通过转染GFP报告质粒来筛选HEK293T.TRIP细胞克隆。
A.利用pCMV-GFP或pCMV-tbsx11GFP转染两板相同的亚克隆细胞，一式三份，并且2天后对细胞进行FACS。计算各亚克隆的表达评分(MFI x GFP％)，并通过用各亚克隆的pCMV-GFP(即，无tbs)的表达评分除以pCMV-tbsx11GFP的表达评分来计算抑制倍数(“抑制倍数”-标示的柱，右边的轴)。(其他的信息参考图11B)。
B.克隆细胞裂解物中的TRAP的免疫印迹。示出 11个表达TRAP[H6]的亚克隆的结果；用抗HIS6抗体检测单体TRAP。利用pEF1a-coTRAP[H6]瞬时转染HEK293T细胞，并且将裂解物用作免疫印迹的阳性对照。(其他的信息参考图11B)。
图22iii.使用稳定表达TRAP的生产细胞的EIAV载体滴度的改进；在生产过程中使用 50:50混合的EIAV-[tbs]GFP和EIAV-[tbs]huFVIII载体基因组的案例研究。
A.转染有混合载体基因组的载体生产细胞的GFP表达评分。利用EIAV-载体包装组件pGagPol、pVSVG、与50:50比例的载体基因组质粒EIAV-[tbs]GFP和EIAV-[tbs]huFVIII一起转染细胞。由此，在生产细胞中huFVIII的表达对混合载体颗粒(EIAV-[tbs]huFVIII与ReQuinate-tbs相同；参见图17i)的滴度产生了负面影响。基因组是标准的，或在转基因的上游包含tbs。还在指出的情况添加了pEF1a-coTRAP[H6](+TRAP TXN)pBluescript(-)。生产细胞为HEK293T细胞或稳定的TRAP细胞系 2F、10H、7E和3D。计算最终生产细胞的GFP表达评分(MFI xGFP％)。
B.混合的EIAV-[tbs]GFP/huFVIII载体粗收集物在HEK293T细胞中的载体滴度。将来自[A]中载体生产细胞的载体粗上清液在HEK293T细胞中进行滴定，并通过FACS测定滴度。已知的是huFactorVIII的表达对EIAV载体病毒粒子活性具有影响(参见图17ii)；因此，仅当生产细胞中的转基因表达受到抑制时(通过GFP测定示于[A]中)才能够提高载体滴度(通过GFP测定示于[B]中)。
图22iv.将VSVG引入到稳定或瞬时TRIP系统中所产生的混合EIAV-[tbs]GFP|EIAV-[tbs]huFVIII载体颗粒的改善。在EIAV-[tbs]GFP|EIAV-[tbs]huFVIII载体基因组混合实验中，来自生产细胞的载体上清液通过离心浓缩，并且使用抗-VSVG抗体通过免疫印迹对其进行分析。将等体积的浓缩制备物加样到每个孔中。
图22v.使用HEK293T.TRIP稳定细胞系改善编码治疗性转基因的慢病毒载体的生产。使用HEK293T.TRIP[3D]细胞系(稳定表达枯草芽孢杆菌TRAP[H6])以Cell FactoryTM等级生产EIAV-tbsCOX2，同时还使用了标准(无TRAP)的HEK293T细胞和瞬时转染有TRAP的HEK293T细胞。通过DNA整合分析滴定载体，并将TU/mL与EIAV-GFP载体滴度(设为100％)进行比较。对于EIAV-COX2载体来说，与在HEK293T细胞中瞬时转染TRAP相比，使用HEK293T.TRIP[3D]细胞能够进一步恢复载体滴度。
图23i.检测在不同长度的tbs序列中的RAGNN重复的“R”和“NN”位置处核苷酸选择的重要性。在位置R处是G的情况下，对11x RAGNN重复中NN序列是GG、AA、TT[UU]或CC的情况进行检测，显示出在NN位置对嘧啶的偏好性。通常的功能性顺序为T[U]>C>G>A。为了检测在第一(R)位置处最具有功能性的核苷酸，将各核苷酸G、A、T[U]或C插入到包含x11、x8或x6重复的tbs’内的xAGAA重复中。
图23ii.检测RAGTT重复的“R”位置处的G|T偏好性，并检测NN间隔子内与T成对出现的核苷酸。在高抑制性tbs(11xGAGTT)的情况中，将TAGTT重复逐渐替换入(swap)到该x11tbs序列中。增加TAGTT重复(替代GAGTT重复)适当地降低了tbs的抑制功能。对其中至少一个N＝T的GAGNN重复进行检测，表明当第一个N(RAGNN的位置4)优选为T[U]或嘧啶时能够实现最大抑制。这表明RAGNN的重要特征是在第一个N间隔子(位置4)处为嘧啶，并且在R位置处G>T。(没有对GAGAT进行测试，因为该RAGNN序列的串联重复导致在转基因ORF的上游具有多个ATG密码子，这可能使转基因的表达衰减)。
图24i.改变GFP转基因的5’UTR内的tbs位置以及拷贝数，从而检测TRAP的抑制活性。将tbsx11M序列克隆到pCMV-GFP的相对于CAP位点的不同位置处：0nt[1]、34nt[2]、54nt[3]、74nt[4]或114nt[5]；添加到包含34nt前导序列的构建体[2](有效的标准tbsx11M报告基因)上的其他序列衍生自CMVp 5’UTR。在构建体[6]中，tbs和AUG之间的序列也增至43nt。最后，将两拷贝的tbs置于5’UTR内，其中两者之间具有34nt的间隔子[7]。
图24ii.检测GFP转基因的5’UTR内tbs可变的位置对TRAP抑制活性的影响。检测图24i中的7个tbs变体GFP报告基因构建体以检测它们在以下三个条件下被TRAP抑制的能力：无TRAP(HEK293T)、瞬时共转染的TRAP(HEK293T+TRAP)、以及最大TRAP抑制条件(HEK293T.TRIP[内源性TRAP]+共转染的TRAP)。通过流式细胞术对培养物进行分析，以测定转染后2天的GFP表达，并生成GFP表达评分(MFI x GFP％)。
图25i.TRIP系统在基于HIV的GFP载体生产中的应用。[A]将tbs(x11M变体)插入到基于HIV-1的编码GFP的慢病毒载体骨架中，并用于在HEK293T细胞+/-pEF1a-coTRAP[H6]中制备粗载体制备物。[B]通过FACS对最终生产细胞进行分析，从而产生GFP表达评分(MFIxGFP％；“表达评分”-标示的柱)。对HEK293T细胞进行DNA整合分析从而对粗载体上清液进行滴定(“滴度”-标示的柱)。在TRAP存在下，在流出(shedding)HIV-tbsGFP载体的生产细胞中，GFP表达被抑制>100倍，但是载体滴度并未受到影响(因为GFP蛋白不是载体生产的决定因素)。CMV–CMV启动子，Ψ–包装信号，RRE–rev应答元件，wPRE–旱獭HBV转录后元件，ppu–聚嘌呤段，SIN–自失活U3/LTR。
图25ii.TRIP系统在基于HIV的治疗性载体生产中的应用。[A]将tbs(x11M变体)插入到基于HIV-1的编码5T4-CAR的慢病毒载体骨架中，并用于在HEK293T细胞+/-pEF1a-coTRAP[H6]中制备粗载体制备物。[B]通过对HEK293T细胞进行FACS(HIV-GFP；左手侧的2个柱)或进行DNA整合分析(HIV-5T4.CAR；右手侧的2个柱)从而对粗载体上清液进行滴定。相比于非共表达TRAP的生产，TRIP系统能够使HIV-5T4.CAR载体滴度提高10倍。CMV–CMV启动子，Ψ–包装信号，RRE–rev应答元件，wPRE–旱獭HBV转录后元件，ppu–聚嘌呤段，SIN–自失活U3/LTR。
图26.转染有标准或TRAP-tbs结构组件的HEK293T细胞内的转基因mRNA水平的分析。利用pCMV-GFP或pCMV-tbsGFP+/-pEF1a-coTRAP[H6]转染HEK293T细胞，并且在48小时后分析细胞，以分析GFP蛋白([A]；FACS)和细胞质中的GFP mRNA水平([B]；利用GFP-特异性引物/FAM-探针组对提取的经DNAse处理的细胞质RNA进行qRT-PCR)。这些数据证明当使用TRAP-tbs结构时，虽然细胞中出现>100倍的GFP蛋白的抑制，但是GFP mRNA的水平并未受到明显影响。[B]Ct反映了第一次检测到信号的PCR循环；Ct越低靶标丰度越多。因此，对于每个循环来说丰度增加约1.5倍，并且40是不可检测的信号。RT条件指示最小的质粒DNA污染。
图27i.编码TRAP-tbs调控的、由组成型或组织特异性启动子驱动的双顺反子转基因盒的基于HIV-1的载体。制备4种构件体，其中编码萤火虫荧光素酶(第一位置处)和GFP(第二位置处)的双顺反子转基因盒通过组成型CMV启动子转录，并通过TRAP-tbs在翻译水平进行差异性调控。将tbs序列插入到两个转基因ORF的上游，或仅插入到第一或第二转基因的上游，或者不含任何tbs序列。此外，制作了使用组织特异性启动子的2种构建体；限于光感受器细胞的VMD2启动子或者肝特异性mAlbAT启动子。制作对照构建体，其中不存在内部启动子，从而可以检测全长载体RNA转录本的任何低水平表达。
图27ii.编码TRAP-tbs调控的、由组成型或组织特异性启动子驱动的双顺反子转基因盒的基于HIV-1的载体在HEK293T生产细胞中的转基因表达评价。利用HIV-1双顺反子载体基因组(图27i)、pGagPol、pRev和pVSVG以及pEF1a-coTRAP[H6](+TRAP)或pBluescript(对照)共转染HEK293T细胞；基因组与TRAP质粒的比例为5:1。pGL3-对照(Renilla荧光素酶表达质粒)以与总DNA质量为1:40的比例存在于所有的转染混合物中。在两个相同的96孔板中进行转染，一式三份。一个96孔板用于在转染后2天通过流式细胞术对最终生产细胞进行分析，从而生成GFP表达评分(MFI x GFP％)。第二个板用于在转染后2天制备细胞裂解物以进行双重荧光素酶检验(Promega)。
图27iii.示意图，其总结了当TRIP系统应用到编码多顺反子转基因的逆转录病毒(慢病毒)载体的生产中时，TRIP系统的抑制能力。慢病毒载体生产细胞的一个实例利用TRIP系统采用内部核糖体进入位点[IRES]来抑制两个开放阅读框(ORF)的转基因表达。通过强启动子[Ext Pro]来驱动载体基因组表达盒，从而产生大量的载体基因组RNA。内部启动子[Int Pro]可以是强/组成型启动子，其导致出现充足水平的编码/表达转基因的mRNA，或者为会或不会被渗漏(leaky)的组织特异性启动子[Int Pro]，其导致编码/表达最少转基因或不编码/表达转基因的mRNA水平。TRAP-结合序列[tbs]能够被插入到一个或两个ORF位置的上游；由此在生产细胞中，TRAP的表达将抑制充足水平或低水平转基因mRNA产生蛋白质。另外，载体基因组RNA可以以依赖于帽的方式(通常以低水平)或者不依赖于帽的方式(由IRES；通常以中至高水平)来表达转基因蛋白。因此，内部启动子是否活化，在载体生产期间都可以表达转基因，因此，相比于使用组织特异性启动子，TRIP系统能够更好地抑制该表达。Ext Pro–外部启动子；Ψ–包装信号；RRE–rev应答元件；cppt/CTS–中部聚嘌呤段/中部终止子序列；Int Pro–内部启动子；tbs–TRAP结合序列；ORF–开放阅读框；IRES–内部核糖体进入位点；WPRE–旱獭肝炎转录调控元件；ppu–聚嘌呤段；Δ–部分缺失的U3。(注意，在示意图中未示出载体包装和TRAP表达盒，但是据推测，它们在该实例中是存在于TRIP系统载体生产细胞内的)。
图28i.TRIPAAV系统的开发。TRAP-tbs结构在基于AAV的载体生产中的应用。标准AAV载体系统利用三种DNA组件，以在腺病毒E1表达细胞(例如，基于HEK293的细胞)中生产载体：基因组(任选地缺失一个trs[Δtrs]，从而产生自补型[sc]AAV载体基因组)，RepCap和Helper功能体(在该非限制性实例中，由腺病毒E2A、E4orf6和VA提供Helper功能体)。TRIPAAV系统利用了TRAP-tbs结构：对AAV载体基因组进行改造，从而将tbs插入到转基因盒的5’UTR，并且在载体生产过程中，通过共转染TRAP表达质粒和/或通过使用稳定表达TRAP的细胞系共引入TRAP表达盒；TRAP可以任选的标记有His6。ITR–反向末端重复；Pro–真核启动子元件；tbs–TRAP-结合序列；pA–聚腺苷酸化信号；[ITN]–任选的内含子。示意性并非按比例尺。
图28ii.在HEK293T细胞中利用TRIPAAV系统抑制scAAV载体转基因表达。将编码血清型2scAAV-GFP载体基因组(+/-tbs)的质粒与各种组件一起共转染到HEK293T细胞中，以检测它们对TRAP-tbs介导的转基因抑制的影响。pscAAV-[tbs]GFP|pRepCap2|pHelper|pEF1a-coTRAP[H6]或pBlueScript(-)的质量比为2|2|2|2μg每10cm TC板，除了pEF1a-coTRAP[H6]的输入量按照本文所述改变。使pCMV-tbsGFP对照质粒(缺少两侧的AAV2ITR)经历相同的条件，从而对抑制水平进行比较。pscAAV2-[tbs]GFP质粒的GFP表达高于pCMV-tbsGFP，可能是因为mRNA转录本更稳定(构建体之间的3’UTR序列和polyA信号不同)。在pRepCap2和pHelper的存在下，即，在scAAV载体的生产过程中，TRAP能够抑制由pscAAV2-tbsGFP的GFP表达超过 300倍。在所采用的转染条件下，等质量比的pEF1a-coTRAP[H6]和pscAAV2-tbsGFP能够获得最大的抑制；将pEF1a-coTRAP[H6]的质量输入降低10倍仍能够获得1-Log等级的可测量的GFP抑制。没有观察到对于pscAAV-GFP的抑制。
图28iii.使用标准的和TRIPAAV系统比较scAAV-[tbs]GFP载体的生产。通过将等质量的基因组、pRepCap2、pHelper和pEF1a-coTRAP[H6]或pBluescript瞬时共转染到HEK293T细胞中，从而制备scAAV-(CMV)-GFP或scAAV-(CMV)-tbsGFP载体。大约在转染后53小时，收获细胞并对其进行冻融循环，从而释放AAV病毒粒子。使用VirabindTM试剂盒对AAV病毒粒子进行纯化，从每个10cm板获得100μL包含载体的PBS。通过流式细胞术对HEK293T细胞(“HEK293T”-标示的柱)或HEPG2细胞(“HEPG2”-标示的柱)进行载体制备物滴定。对各载体生产细胞的GFP表达评分进行共同绘图(“GFP Expr scr”-标示的柱)。数据表明虽然在AAV载体生产细胞中GFP表达的被抑制大于300倍，TRIPAAV系统的TRAP-tbs结构对AAV载体生产的基础生物学没有影响，这暗示在AAV载体生产过程中，能够关闭有问题的/有毒的转基因。
图28iv.使用芽胞杆菌RNA酶(Barnase)来模型化生产编码有问题的/有毒的转基因的AAV载体
A.载体基因组scAAV2-CMV-tbsBarnas编码细菌RNAse芽胞杆菌RNA酶，其ORF经过密码子优化以在人细胞中表达。将tbs插入到转基因盒的5’UTR。此外，Barstar(芽胞杆菌RNA酶的天然抑制剂)的细菌表达盒存在于质粒骨架中，从而帮助质粒在细菌中增殖(由于在大肠杆菌(E.coli)中CMV启动子的渗漏(leaky)表达)。Barstar ORF经过密码子优化以在大肠杆菌中表达。
B.在基因组混合转染中使用pscAAV-CMV-GFP质粒来监控芽胞杆菌RNA酶对于GFP表达的作用。
图 28v.用 50:50混合比的pscAAV-CMV-tbsBarnase和pscAAV-CMV-GFP载体基因组质粒，加上pRepCap2和pHelper转染HEK293T或HEK293T.TRiP[3D]细胞，从而进行基因组混合。基因组质粒分别以1μg/10cm板存在[i]，或者仅pscAAV-CMV-GFP以2μg/10cm板存在[ii]，而没有额外的TRAP-表达质粒。在转染后24小时，拍摄在这些培养物中GFP-表达的照片。
图29i TRIPAdeno系统的开发。TRAP-tbs结构在基于腺病毒的载体生产中的应用。将标准腺病毒载体分类为第一代(缺失E1/E3区)，第二代(缺失E1/E2/E3/E4)和Helper依赖型，“空壳”载体。另外，E1-活化的溶瘤载体可以包含在E3区域内编码的有毒的转基因：例如，有毒基因的表达可以受腺病毒主要晚期启动子或异源启动子以及腺病毒编码的或异源聚腺苷酸化信号的控制。这些类型的载体基因组的TRIPAdeno系统版本在编码转基因的转录本的5’UTR内具有tbs。在载体生产过程中，通过共转染TRAP表达质粒和/或通过使用稳定表达TRAP的细胞系共引入TRAP表达盒。TRAP可以任选的标记有His6。ITR–反向末端重复；Ψ–包装信号；Pro–真核启动子元件；tbs–TRAP-结合序列；pA–聚腺苷酸化信号；[ITN]–任选的内含子。示意性并非按照比例尺。
图29ii.在HEK293T细胞中利用TRAP-tbs结构对来自第一代腺病毒载体基因组组件的GFP转基因的抑制。利用pAd-CMV-GFP或pAd-CMV-tbsGFP穿梭质粒(包含左手侧的腺病毒载体基因组)与pEF1a-coTRAP[H6](+TRAP)或pBluescript(-)一起转染HEK293T细胞[A]，在48小时后进行流式细胞分析[B]。另外，进行平行转染-骨架(pacAd5 9.2-100；包含右手侧的腺病毒载体基因组)，利用试剂盒刺激第一代腺病毒载体的产生(其中在HEK293T细胞中出现载体基因组的重组)。在各条件下生成GFP表达评分(MFI xGFP％)。仅当tbs存在于穿梭质粒中并且当TRAP表达时，观察到超过100倍的GFP抑制。ITR–反向末端重复；CMV–CMV启动子；Ψ–包装信号；tbs–TRAP-结合序列；pA–聚腺苷酸化信号。示意性并非按照比例尺。
图29iii.在HEK293T.TRIP细胞中，在Adeno-tbsGFP(缺失E1/E3)载体扩增过程中，GFP转基因的抑制。将pAd-CMV-GFP或pAd-CMV-tbsGFP穿梭质粒与-骨架和pEF1a-coTRAP[H6]共转染，产生Adeno-CMV-GFP和Adeno-CMV-tbsGFP载体母液(参见图29ii)，将该母液以0.01的MOI用于转导HEK293T细胞或HEK293T.TRIP[3D]细胞(稳定表达TRAP[H6])。[A]通过流式细胞术在转导后的不同时间点对复制培养物进行分析，从而评估载体扩增期间的GFP表达。在各条件下生成GFP表达评分(MFI x GFP％)。[B]在最终时间期间对复制培养物进行冻融，以释放载体颗粒；通过离心去除细胞碎片，并将粗上清液滴定到HeLa细胞。
具体实施方式
现在通过非限制性的实例对本发明的各个优选特征和实施方案进行描述。
除非另有说明，本发明的实施将使用化学、分子生物学、微生物学免疫学的常规技术，这些技术在本领域技术人员的能力范围内。所述技术在文献中解释。参见，例如，“J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Maniatis(1989)Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版,1-3册,冷泉港实验室出版社”；“Ausubel,F.M.et al.(1995，定期增印)Current Protocols in Molecular Biology,Ch.9,13,and 16,John Wiley&Sons,NewYork,NY”；“B.Roe,J.Crabtree,and A.Kahn(1996)DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons”；“J.M.Polak and James O’D.McGee(1990)InSitu Hybridization:Principles and Practice；哈佛大学出版社”；“M.J.Gait(ed.)(1984)Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach,IRL出版社”；和“D.M.J.Lilley and J.E.Dahlberg(1992)Methods of Enzymology:DNA Structure PartA:Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology,Academic出版社”。这些文献的全部内容以引用方式并入本文。
在一个方面，本发明提供了一种核酸序列，其包含与目的核苷酸有效连接的结合位点，其中所述结合位点能够与RNA结合蛋白相互作用，从而抑制或阻止病毒载体生产细胞内的目的核苷酸的翻译。
术语“RNA结合蛋白”应被理解为是能够与核酸序列结合的蛋白质。在本发明的正文中，RNA结合蛋白与其结合位点序列的结合对病毒载体生产细胞中目的核苷酸的翻译具有抑制效果或阻止效果，所述结合位点与所述目的核苷酸有效连接。
在一个优选的实施方案中，RNA结合蛋白是色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)，例如细菌色氨酸RNA结合衰减蛋白。
在另一个实施方案中，RNA结合蛋白是细菌保守的碳存储调节系统蛋白A(CsrA)。
在另一个实施方案中，RNA结合蛋白是单纯疱疹病毒-1RNA结合蛋白US11。
色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)
色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)是一种在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中广泛表征的细菌蛋白。它通过参与转录衰减或翻译控制机制，由trpEDCFBA操纵子指导来调控色氨酸生物合成(参见综述“Gollnick,B.,Antson,and Yanofsky(2005)Annual Reviewof Genetics 39:47–68”)。
在自然情况下TRAP通过以下三个不同的机制调控色氨酸生物合成与运输：
1.trpEDCFBA操纵子的转录衰减(参见文献“Shimotsu H,K.M.,Yanofsky C,Henner DJ.(1986)Journal of Bacteriology 166:461–471”)。
2.促进形成trpE和trpD Shine-Dalgarno阻断发夹(参见文献“Yakhnin H,B.J.,Yakhnin AV,Babitzke P.(2001)Journal of Bacteriology 183(20):5918-5926”)。
3.阻断核糖体进入trpG和yhaG核糖体结合位点(参见文献“Yang M,d.S.A.,vanLoon APGM,Gollnick P.(1995)Journal of Bacteriology 177:4272-4278”)。
在枯草芽孢杆菌中，TRAP由单个基因(mtrB)编码，并且功能性蛋白由11个排列为螺旋形环(toroid ring)的相同的亚基构成(参见文献“Antson AA,D.E.,Dodson G,Greaves RB,Chen X,Gollnick P.(1999)Nature 401(6750):235-242”)。活化后，其通过与相邻亚基间的口袋内的多达11个色氨酸分子结合，从而与RNA相互作用。靶RNA缠绕在该四元环结构的外部(参见文献“Babitzke P,S.J.,Shire SJ,Yanofsky C.(1994)Journal ofBiological Chemistry 269:16597–16604”)。
不希望受理论的束缚，在感应和控制色氨酸合成的天然机制中，认为TRAP通过与新合成的RNA前导体中的结合位点结合，从而以转录终止水平发挥作用。这破坏了重叠的反终止子(anti-terminator)序列的稳定，使得下游的非Rho依赖型终止子被激活，导致仅产生短RNA。当色氨酸在细菌内受到限制时，TRAP环不能再结合其RNA结合位点。因此，反终止子被激活，转录继续进入色氨酸合成基因操纵子。TRAP也可以在翻译水平发挥作用：在RNA转录本的5’-UTR内，TRAP与其结合位点的色氨酸依赖性结合释放了反-Shine-Dalgarno序列，这形成了具有Shine-Dalgarno序列的稳定茎结构，从而抑制了核糖体开始翻译。最后，在其他情况中，当TRAP与其核酸结合位点结合时，其能够在40S扫描核糖体复合物达到起始密码子之前，对其进行物理阻断，从而抑制翻译起始，否则将会形成更稳定和更具有亲和性的翻译工具。
在本发明的一个实施方案中，TRAP衍生自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。例如，TRAP可以包含以下序列：
MNQKHSSDFVVIKAVEDGVNVIGLTRGTDTKFHHSEKLDKGEVIIAQFTEHTSAIKVRGEALIQTAYGEMKSEKK(SEQ ID NO:1)
在本发明优选的实施方案中，SEQ ID NO:1在C末端具有六个组氨酸标签(HISx6tag)。
在一个可选的实施方案中，TRAP衍生自寡食胺单胞菌(Aminomonaspaucivorans)。例如，TRAP可以包含以下序列：
MKEGEEAKTSVLSDYVVVKALENGVTVIGLTRGQETKFAHTEKLDDGEVWIAQFTEHTSAIKVRGASEIHTKHGMLFSGRGRNEKG(SEQ ID NO:2)
在一个可选的实施方案中，TRAP衍生自热液口脱硫肠杆菌(Desulfotomaculumhydrothermale)。例如，TRAP可以包含以下序列：
MNPMTDRSDITGDYVVVKALENGVTIIGLTRGGVTKFHHTEKLDKGEIMIAQFTEHTSAIKIRGRAELLTKHGKIRTEVDS(SEQ ID NO:3)
在一个可选的实施方案中，TRAP衍生自嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus).例如，TRAP可以包含以下序列：
MYTNSDFVVIKALEDGVNVIGLTRGADTRFHHSEKLDKGEVLIAQFTEHTSAIKVRGKAYIQTRHGVIESEGKK(SEQ ID NO:4)
在一个可选的实施方案中，TRAP衍生自嗜热脂肪芽胞杆菌(B.stearothermophilus)S72N。例如，TRAP可以包含以下序列：
MYTNSDFVVIKALEDGVNVIGLTRGADTRFHHSEKLDKGEVLIAQFTEHTSAIKVRGKAYIQTRHGVIENEGKK(SEQ ID NO:5)
在一个可选的实施方案中，TRAP衍生自耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)。例如，TRAP可以包含以下序列：
MNVGDNSNFFVIKAKENGVNVFGMTRGTDTRFHHSEKLDKGEVMIAQFTEHTSAVKIRGKAIIQTSYGTLDTEKDE(SEQ ID NO:6)
在一个可选的实施方案中，TRAP衍生自生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermushydrogenoformans)。例如，TRAP可以包含以下序列：
MVCDNFAFSSAINAEYIVVKALENGVTIMGLTRGKDTKFHHTEKLDKGEVMVAQFTEHTSAIKIRGKAEIYTKHGVIKNE(SEQ ID NO:7)
在一个实施方案中，TRAP由色氨酸RNA结合衰减蛋白基因家族mtrB编码(TrpBP超家族，例如，NCBI保藏域数据库#cl03437)。
在优选的实施方案中，TRAP在C末端具有6个组氨酸标签(HISx6tag)。
在优选的实施方案中，TRAP包含与SEQ ID NO:1至7中任一者具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且能够与RNA-结合位点相互作用，从而在病毒载体生产细胞中使有效连接的目的核苷酸的表达改变，例如抑制或阻止。
在优选的实施方案中，TRAP包含与SEQ ID NO:1至7中任一者至少具有50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性的氨基酸序列，并且能够与RNA-结合位点相互作用，从而在病毒载体生产细胞中使有效连接的目的核苷酸的表达改变，例如抑制或阻止。
在另一个实施方案中，RNA结合蛋白(例如，TRAP)可以由包含这样的核苷酸序列的多核苷酸编码，所述核苷酸序列编码能够与RNA结合位点相互作用的蛋白，从而在病毒载体生产细胞中使有效连接的目的核苷酸的表达改变，例如抑制或阻止。例如，TRAP可以由包含编码SEQ ID NO:1至7的蛋白的核苷酸序列的多核苷酸编码。
用于本发明的RNA结合蛋白(例如，TRAP)的所有变体、片段或同系物将保留结合本发明所述结合位点的能力，从而在病毒载体生产细胞中抑制或阻止目的核苷酸(其可以是标记基因)的翻译。
核酸结合位点
术语“结合位点”应被理解为能够与特定蛋白质相互作用的核酸序列。本发明的核酸结合位点可以是能够与本发明的RNA结合蛋白(例如，色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP))相互作用的位点。
在TRAP的情况中，能够结合TRAP的共同核酸结合位点序列为[RAGNN]，其重复多次，例如6、7、8、9、10、11、12或更多次；在天然的trp操纵子中找到了这样的序列。在天然环境中，偶尔的AAGNN是能够被容许的，并且偶尔的额外“间隔”N核苷酸导致功能序列的产生。体外实验表明，对于TRAP-RNA结合而言，需要至少6个以上的共同重复序列(参见文献“Babitzke P,Y.J.,Campanelli D.(1996)Journal of Bacteriology 178(17):5159-5163”)。因此，在一个实施方案中，优选的是在tbs内存在6个以上连续的[RAGN≥2]序列，其中在DNA中R可以为T或G，在RNA中R可以为U或G。
在本发明的一个实施方案中，TRAP结合位点包含序列RAGN≥2(例如，RAGN2-3)。因此，为了避免产生疑问，该核酸结合位点包含(例如)序列UAGNN、GAGNN、TAGNN、UAGNNN、GAGNNN或TAGNNN中的任一者。
“N”应理解为序列中位于该位置的任何核苷酸。例如，其可以是G、A、T、C或U。此类核苷酸的数目优选为2，但最多为3，例如为1、2或3，11次重复tbs的RAG重复序列可以被3个间隔核苷酸隔开，并且仍然保留了一些导致翻译抑制的TRAP-结合活性。优选地，在11次重复tbs中使用的N3间隔子不超过一个，从而保留导致翻译抑制的最大TRAP-结合活性。
在另一个实施方案中，核酸结合位点包含多个RAGN≥2重复序列(例如，多个RAGN2-3重复序列)。
在另一个实施方案中，核酸结合位点包含多个RAGN2重复序列。
在另一个实施方案中，核酸结合位点至少包含6个RAGN≥2重复序列(例如，至少6个RAGN2-3重复序列)。
在另一个实施方案中，核酸结合位点至少包含6个RAGN2重复序列。例如，核酸结合位点可包含6、7、8、9、10、11、12或更多个RAGN2重复序列。
在另一个实施方案中，核酸结合位点至少包含8个RAGN≥2重复序列(例如，至少8个RAGN2-3重复序列)。
优选地，在核酸结合位点中的RAGNNN重复序列的数目为1以下。
在另一个实施方案中，核酸结合位点包含11个RAGN≥2重复序列(例如，11个RAGN2-3重复序列)。优选地，在该核酸结合位点中的RAGNNN重复序列的数目为3以下。
在另一个实施方案中，核酸结合位点包含12个RAGN≥2重复序列(例如，12个RAGN2-3重复序列)。
在一个优选的实施方案中，核酸结合位点包含8至11个RAGN2重复序列(例如，8、9、10或11个RAGN2重复序列)。
例如，TRAP结合位点可以包含以下任一序列：
GAGUUUAGCGGAGUGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCUAGCAGAGACGAGUGGAGCU(SEQ ID NO:8)；或
GAGUUUAGCGGAGUGGAGAAGAGCGGAGCCGAGCCUAGCAGAGACGAGAAGAGCU(SEQ ID NO:9)
术语“RAGN≥2重复序列”可以理解为，一般的RAGN≥2(例如，RAGN2-3)基序被重复。满足该基序标准的不同RAGN≥2序列可以连接以组成核酸结合位点。并非旨在将所得到的核酸结合位点限制为只有一个满足该基序要求的序列的重复序列，虽然这种可能性包括在该定义中。例如，“6个RAGN≥2重复序列”包括但不限于以下序列：
UAGUU-UAGUU-UAGUU-UAGUU-UAGUU-UAGUU(SEQ ID NO:10)；
UAGUU-UAGUU-GAGUU-UAGUU-GAGUU-UAGUU(SEQ ID NO:11)；
GAGUUU-GAGUU-GAGUU-GAGUUU-GAGUU-GAGUU(SEQ ID NO:12)
以及
UAGUUU-GAGUU-UAGUU-GAGUUU-UAGUU-GAGUU(SEQ ID NO:13)
(仅为了清楚起见，在重复序列之间包含了破折号)。
包含一个RAGNNN重复序列和七个RAGNN重复序列的8次重复tbs保留了TRAP介导的抑制活性。含有一个或多个RAGNNN重复序列的小于8次重复的tbs序列(例如，7次重复或6次重复tbs序列)可能具有降低的TRAP-介导的抑制活性。因此，当存在少于8次重复时，优选tbs仅包含RAGNN重复。
用于RAGNN共有重复的优选核苷酸如下所示：
·位于NN间隔位置中至少一个的嘧啶；
·位于NN间隔位置中第一个的嘧啶；
·位于两个NN间隔位置的嘧啶；
·位于R位置的G。
还优选的是，当NN间隔位置为AA时，在R位置使用G(即，优选地，在共有序列中不使用TAGAA作为重复序列)。
术语“能够相互作用”应理解为，在细胞(例如，真核病毒载体生产细胞)中相遇的条件下，核酸结合位点能够与蛋白(例如TRAP)结合。与RNA结合蛋白(例如TRAP)的这种相互作用导致目的核苷酸的翻译受到抑制或阻止，该目的核苷酸与核酸结合位点有效连接。
术语“有效连接”应理解为，所描述的元件处于允许它们以其预期方式发挥功能的关系。因此有效连接到目的核苷酸的本发明的RNA结合位点的位置被设置为，当RNA结合蛋白(如TRAP)结合到该RNA结合位点时，改变了目的核苷酸的翻译。
在给定开放阅读框(ORF)的目的核苷酸翻译起始密码子的上游放置能够与RNA结合蛋白相互作用的核酸结合位点(例如，TRAP结合序列；tbs)使来自该ORF的mRNA的翻译受到特定抑制。将TRAP-结合位点和翻译起始密码子隔开的核苷酸数目可以变化(例如0至12个核苷酸)，而不影响抑制程度。作为进一步的例子，可以用0至43个核苷酸将TRAP-结合位点和翻译起始密码子隔开。
抑制或阻止目的核苷酸的翻译应理解为，在相同的时间点，与不存在本发明的核酸结合位点的表达量相比，在病毒载体生产过程中所翻译的目的核苷酸的产物(例如，蛋白质)的量发生改变。这种翻译的改变导致的结果是，抑制或阻止由目的核苷酸所编码的蛋白的表达。
在本发明的一个实施方案中，核酸结合位点能够与RNA结合蛋白(如色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP))相互作用，从而在病毒载体生产细胞中抑制或阻止目的核苷酸的翻译。
在载体生产过程中的任意给定时间点，目的核苷酸的翻译可以降低至在不存在本发明的核酸序列的情况下，载体生产过程中相同时间点翻译量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。
在载体生产过程中的任意给定时间点，目的核苷酸的翻译可以降低至低于在不存在本发明的核酸序列的情况下，载体生产过程中相同时间点翻译量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。
阻止目的核苷酸的翻译应理解为将翻译量基本上降为零。
在载体生产过程中的任意给定时间点，由目的核苷酸的蛋白质表达可以降低至在不存在本发明的核酸序列的情况下，载体生产过程中相同时间点表达量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。
在载体生产过程中的任意给定时间点，由目的核苷酸的蛋白质表达可以降低至低于在不存在本发明的核酸序列的情况下，载体生产过程中相同时间点表达量的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。
阻止由目的核苷酸的蛋白质表达应理解为将蛋白质的表达量基本上降为零。
目的核苷酸翻译的分析和/或定量方法在本领域中是公知的。
来自裂解细胞的蛋白质产物可使用如SDS-PAGE分析并通过考马斯或银染色可视化等方法来进行分析。可选地，蛋白质产物可利用与蛋白质产物结合的抗体探针用免疫印迹或酶联免疫吸附测定(ELISA)进行分析。在完整细胞中的蛋白质产物可通过免疫荧光进行分析。
目的核苷酸
在本发明的一个实施方案中，目的核苷酸在缺少RNA结合蛋白的靶细胞中进行翻译，该RNA结合蛋白例如为色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)。
“靶细胞”应理解为是这样的细胞，期望的是其能表达目的核苷酸。利用本发明的病毒载体将目的核苷酸引入到靶细胞中。递送至靶细胞可以在体内、离体(ex vivo)或体外进行。
在优选的实施方案中，目的核苷酸产生治疗效果。
目的核苷酸可具有治疗或诊断应用。合适的目的核苷酸包括但不限于编码以下物质的序列：酶、辅因子、细胞因子、趋化因子、激素、抗体、抗氧化剂分子、工程改造的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、免疫共刺激分子、免疫调节分子、嵌合抗原受体、靶标蛋白的跨结构域负突变体、毒素、条件毒素、抗原、肿瘤抑制蛋白、生长因子、膜蛋白、受体、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白和核酶，以及它们的衍生物(如带有结合的报告基团的衍生物)。目的核苷酸还可以编码micro-RNA。不愿受到理论的束缚，认为micro-RNA的加工受到TRAP的抑制。
在一个实施方案中，目的核苷酸可用于治疗神经退化性疾病。
在另一个实施方案中，目的核苷酸可用于治疗帕金森病。
在另一个实施方案中，目的核苷酸可编码一种或多种参与多巴胺合成的酶。例如，该酶可以是以下之一者或多者：酪氨酸羟化酶、GTP环式水解酶I和/或芳族氨基酸多巴脱羧酶。所有这三个基因的序列是可得的(登录号分别是X05290、U19523和M76180)。
在另一个实施方案中，目的核苷酸可编码囊泡单胺转运体2(VMAT2)。在一个可选的实施方案中，病毒基因组可以包含编码芳族氨基酸多巴脱羧酶的目的核苷酸和编码VMAT2的目的核苷酸。这种基因组可用于治疗帕金森病，特别是联合外周施用L-DOPA。
在另一个实施方案中，目的核苷酸可编码治疗性蛋白或治疗性蛋白的组合。
在另一个实施方案中，目的核苷酸可编码选自由以下物质构成的组中的一种或多种蛋白：神经胶质细胞衍生的神经营养因子(GDNF)、大脑衍生的神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、胰岛素生长因子-2、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C/VEGF-2、VEGF-D、VEGF-E、PDGF-A、PDGF-B、PDFG-A和PDFG-B的异源二聚体和同源二聚体。
在另一个实施方案中，目的核苷酸可编码选自由以下构成的组中的一种或多种抗血管生成蛋白：血管生成抑制素、内皮抑素、血小板因子4、色素上皮衍生因子(PEDF)、列斯蛋白(restin)、干扰素-α、干扰素诱导蛋白、gro-β和tubedown-1、白细胞介素(IL)-1、IL-12、视黄酸、抗VEGF抗体或其片段/变体、凝血栓蛋白、VEGF受体蛋白(如US5,952,199和US6,100,071中描述的那些)和抗VEGF受体抗体。
在另一个实施方案中，目的核苷酸可编码囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)。
在另一个实施方案中，目的核苷酸可编码通常在视觉细胞中表达的蛋白。
在另一个实施方案中，目的核苷酸可编码通常在光感受器细胞和/或视网膜色素上皮细胞中表达的蛋白。
在另一个实施方案中，目的核苷酸可编码选自包含以下物质的组中的蛋白质：RPE65、芳基烃相互作用受体蛋白样1(AIPL1)、CRB1、卵磷脂视网膜乙酰转移酶(LRAT)、光受体特异性同源盒(CRX)、视网膜鸟苷酸环化酶(GUCY2D)、RPGR相互作用蛋白1(RPGRIP1)、LCA2、LCA3、LCA5、抗肌萎缩蛋白、PRPH2、CNTF、ABCR/ABCA4、EMP1、TIMP3、MERTK、ELOVL4、MYO7A、USH2A、VMD2、RLBP1、COX-2、FPR、harmonin、Rab护卫蛋白1、CNGB2、CNGA3、CEP 290、RPGR、RS1、RP1、PRELP、谷胱甘肽途径酶和opticin。
在其他实施方案中，目的核苷酸可编码人类因子VIII或因子IX。
在其他实施方案中，目的核苷酸可编码嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
在进一步的实施方案中，目的核苷酸可编码SGSH、SUMF1、GAA、常见的γ链(CD132)、腺苷脱氨酶、WAS蛋白、球蛋白、α半乳糖苷酶A，δ-氨基乙酰丙酸(ALA)合酶、δ-氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD)，羟甲基胆色烷(HMB)合酶、尿卟啉原(URO)合酶、尿卟啉原(URO)脱羧酶、粪卟啉原(COPRO)氧化酶、原卟啉原(PROTO)氧化酶、亚铁螯合酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸硫酸酯酶、乙酰肝素磺酰胺酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、乙酰肝素-α-氨基葡糖苷N-乙酰转移酶、3N-乙酰基葡萄糖胺-6-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸酯硫酸酯酶、β-半乳糖苷酶、N-乙酰基半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β-葡糖醛酸酶和透明质酸酶。
除了目的核苷酸以外，载体还可包含或编码siRNA、shRNA或者经调节的shRNA(参见“Dickins et al，(2005)Nature Genetics 37:1289-1295”,“Silva et al，(2005)Nature Genetics 37:1281-1288”)。
指征
根据本发明的载体(包括逆转录病毒和AAV载体)可用于递送一种或多种可用于治疗WO 1998/05635、WO 1998/07859、WO1998/09985中列举的疾病的目的核苷酸。目的核苷酸可以是DNA或RNA。这类疾病的例子给出如下：
能对以下作出响应的疾病：细胞因子和细胞增殖/分化活性；免疫抑制或免疫刺激活性(例如用于治疗免疫缺陷(包括感染人免疫缺陷病毒)；调节淋巴细胞生长；治疗癌症和许多自身免疫疾病，和预防移植排斥或诱导肿瘤免疫性)；造血作用的调节(例如骨髓或淋巴疾病的治疗)；促进骨、软骨、腱、韧带和神经组织的生长(例如用于愈合伤口，治疗烧伤、溃疡和牙周疾病和神经退化)；卵泡刺激激素的抑制或激活(生育力的调节)；趋化性/化学促进活性(例如用于将特定细胞类型动员到损伤或感染部位)；止血和溶栓活性(例如用于治疗血友病和中风)；抗炎活性(用于治疗例如脓毒性休克或克罗恩病)；巨噬细胞抑制活性和/或T细胞抑制活性，因而抗炎活性；抗免疫活性，即对细胞和/或体液免疫应答(包括与炎症不相关的应答)的抑制作用；抑制巨噬细胞和T细胞粘附于胞外基质成分和纤连蛋白的能力，以及T细胞中的上调的fas受体表达。
恶性疾病，包括癌症；白血病；良性和恶性肿瘤生长、侵入和扩散；血管生成；转移；腹水和恶性胸腔积液。
自身免疫性疾病，包括关节炎(包括类风湿性关节炎)、过敏性、变态反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原疾病和其他疾病。
血管疾病，包括动脉硬化症、动脉硬化性心脏病、再灌注损伤、心动停止、心肌梗塞、血管炎性疾病、呼吸窘迫综合征、心血管效应、外周血管病、偏头痛和阿斯匹林依赖性抗血栓形成症、中风、大脑局部缺血、缺血性心脏病或其他疾病。
胃肠道的疾病，包括消化性溃疡、溃疡性结肠炎、克罗恩病和其他疾病。
肝病，包括肝纤维化、肝硬化或其他疾病。
肾病和泌尿疾病，包括甲状腺炎或其他腺体疾病、血管球性肾炎或其他疾病。
耳、鼻和喉疾病，包括耳炎或其他耳鼻喉疾病、皮炎或其他皮肤疾病。
牙齿和口腔疾病，包括牙周病、牙周炎、齿龈炎或其他牙齿/口腔疾病。
睾丸疾病，包括睾丸炎或附睾-睾丸炎、不育症、睾丸创伤或其他睾丸疾病。
妇科疾病，包括胎盘功能异常、胎盘功能不全、习惯性流产、子痫、子痫前期、子宫内膜异位和其他妇科疾病。
眼科疾病，例如后葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、前葡萄膜炎、结膜炎、脉络视网膜炎、葡萄膜视网膜炎、视神经炎、青光眼(包括开角型青光眼和青少年先天性青光眼)、眼内炎症(例如视网膜炎或囊样黄斑水肿)、交感性眼炎、巩膜炎、色素性视网膜炎、黄斑变性(包括年龄相关性黄斑变性(AMD)和青少年黄斑变性，包括Best病、Best卵黄样黄斑变性、斯特格(Stargardt)病、Usher综合征、Doyne蜂窝状视网膜营养失调、Sorby黄斑营养失调、青年性视网膜劈裂症、视锥-视杆营养失调、角膜营养失调、Fuch营养失调、Leber先天性黑内障、Leber遗传性视神经病变(LHON)、Adie综合征、Oguchi病、退行性眼底病、视觉损伤、由感染引起的眼睛炎症、增殖性玻璃体-视网膜病变、急性局部缺血性视神经病变、过度疤痕(例如在青光眼滤过手术后，对眼睛植入物的反应、角膜移植物移植排斥)和其他眼科疾病，例如糖尿病黄斑性水肿、视网膜静脉阻塞、RLBP1相关的视网膜营养失调、无脉络膜和色盲。
神经疾病和神经退化性疾病，包括帕金森病、治疗帕金森病引起的并发症和/或副作用、AIDS相关痴呆综合症、HIV相关脑病、Devic病、西德纳姆舞蹈病、阿尔兹海默病和其他退行性疾病、CNS的病症或紊乱、中风、脊髓灰质炎后综合征、精神疾病、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经病、亚急性神经病、慢性神经病、庞贝氏病、Guillaim-Barre综合征、西德纳姆舞蹈病、重症肌无力、大脑假性肿瘤、唐氏综合征、亨廷顿舞蹈病、CNS压缩或CNS创伤或CNS的感染、肌肉萎缩和营养失调、中枢神经系统和外周神经系统的疾病、病症或紊乱、运动神经元疾病(包括肌萎缩性侧索硬化、脊髓性肌萎缩症、脊髓和撕裂损伤)。
其他的疾病和病症，例如囊性纤维化、粘多糖贮积症(包括Sanfilipo综合征A)、ADA-SCID、X相关的SCID、卟啉症、血友病A、血友病B、外伤后炎症、出血、血凝固和急性期应答、恶病质、厌食症、急性感染、脓毒性休克、传染性疾病、手术的并发症或副作用、骨髓移植或其他移植并发症和/或副作用、基因治疗的并发症和副作用(例如由于感染病毒载体、或者AIDS)，以压制或抑制体液和/或细胞免疫应答，从而在天然或人工细胞、组织和器官(如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然或人工皮肤组织)的移植的情况中用于预防和/或治疗移植排斥。
siRNA、micro-RNA和shRNA
在某些其他的实施方案中，目的核苷酸包含micro-RNA。micro-RNA是生物体中天然产生的非常大的一组小RNA，其中至少一些能调节靶基因的表达。micro-RNA家族的基础成员是let-7和lin-4。let-7基因编码小的、高度保守的RNA种类，该RNA种类在蠕虫发育过程中调节内源蛋白编码基因的表达。该活性RNA种类最初被转录为70nt的前体，该前体在转录后被加工成成熟的21nt的形式。let-7和lin-4两者都被转录成发夹RNA前体，所述前体由Dicer酶加工成它们的成熟形式。
除了目的核苷酸，所述载体还可包含或编码siRNA、shRNA或者经调节的shRNA(参见文献“Dickins et al，(2005)Nature Genetics37:1289-1295”,“Silva et al，(2005)Nature Genetics 37:1281-1288”)。
由双链RNA(dsRNA)介导的转录后基因沉默(PTGS)是控制外来基因表达的保守的细胞防御机制。据认为，元件(例如转座子)或病毒的随机整合会引起dsRNA的表达，该dsRNA能激活同源单链mRNA或病毒基因组RNA的序列特异性降解。这种沉默作用称为RNA干扰(RNAi)(参见文献“Ralph et al，(2005)Nature Medicine 11：429-433”)。RNAi的机制涉及将长的dsRNA加工成大约21-25个核苷酸(nt)的RNA的双链体。这些产物称为小干扰RNA或沉默RNA(siRNA)，它们是mRNA降解的序列特异性媒介物。在分化的哺乳动物细胞中，已发现＞30bp的dsRNA能激活干扰素应答，从而导致蛋白质合成的停止和非特异性的mRNA降解(参见“Stark et al.,Annu Rev Biochem 67:227-64(1998)”)。但是，可用21nt siRNA双链体来绕过该应答(参见“Elbashir et al.,EMBO J.Dec 3；20(23):6877-88(2001)”,“Hutvagneret al.,Science.Aug 3,293(5531):834-8.Eupub Jul12(2001)”)，使得可以在培养的哺乳动物细胞中分析基因功能。
载体
本发明的另一个方面涉及一种包含本发明的核酸序列的病毒载体。
载体是一种工具，其允许或促进物质从一种环境转移到另一种环境。按照本发明，并以举例的方式，在重组核酸技术中使用的一些载体使得物质，如核酸片段(例如，异源DNA片段，如异源cDNA片段)，转移到靶细胞中。载体可以用于维持细胞内的异源核酸(DNA或RNA)，或促进包含DNA或RNA片段的载体复制，或促进核酸片段编码的蛋白质的表达。
本发明的载体可以(例如)为这样的病毒载体：具有复制起点、任选具有用于所述多核苷酸表达的启动子和任选具有的启动子的调节子。所述载体可含有一个或多个选择性标记基因(例如，新霉素抗性基因)和/或可追踪性标记基因(例如，编码GFP的基因)。载体可用于(例如)感染和/或转导靶细胞。
本发明的载体可用于在体外在相容的靶细胞内复制目的核苷酸。因此，本发明提供了体外制备蛋白质的方法：在体外将本发明的载体引入相容的靶细胞内，并使靶细胞在使目的核苷酸表达的条件下生长。蛋白质可以从靶细胞中通过本领域中公知的方法进行回收。合适的靶细胞包括哺乳动物细胞系和其它真核细胞系。
载体可以是表达载体。如本文描述的表达载体包含核酸区域，该区域包含能够被转录的序列。因此，编码mRNA、tRNA和rRNA的序列都包括在本定义内。优选地，表达载体包含有效连接至控制序列的本发明的多核苷酸，所述控制序列能够通过靶细胞使编码序列表达。
病毒载体
在本发明的一个实施方案中，载体是病毒载体。病毒载体可以被称作为载体、载体病毒粒子或载体颗粒。
在另一个实施方案中，病毒载体衍生自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒或杆状病毒。
据估计，本发明的抑制系统有益于任意的病毒载体系统。该系统对于以下情况是特别有用的，目的核苷酸在(例如)病毒载体生产细胞上或病毒粒子组装期间产生副作用。
在另一个实施方案中，所述逆转录病毒衍生自泡沫病毒。
在另一个实施方案中，所述逆转录病毒载体衍生自慢病毒。
在另一个实施方案中，所述慢病毒载体衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或绵羊脱髓鞘性脑白质炎慢病毒。
载体滴度
本领域技术人员将会理解本领域有大量不同的用于测定病毒载体滴度的方法。通常将滴度描述为转导单位/mL(TU/mL)。可以通过增加感染性颗粒的数目和增加载体制备的特异性活性从而增加滴度。
逆转录病毒和慢病毒载体
本发明的逆转录病毒载体可衍生自任何合适的逆转录病毒，或者是由任何合适的逆转录病毒可衍生得到的。已经鉴定了大量不同的逆转录病毒。其实例包括：鼠白血病病毒(MLV)、人类T细胞白血病病毒(HTLV)、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、Fujinami肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、禽类成髓细胞瘤病毒-29(MC29)和禽类成红细胞增多症病毒(AEV)。逆转录病毒的详细列表可以参见“Coffin et al，(1997)“retroviruses”,Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds:JM Coffin,SMHughes,HE Varmus pp 758-763”。
逆转录病毒可以广泛地分为两大类：即，“简单的”和“复杂的”。逆转录病毒甚至可以进一步分为7小类。其中的5小类代表具有致癌可能的逆转录病毒。其余的两小类是慢病毒属和泡沫病毒属。这些逆转录病毒的综述见Coffin等，1997(出处同上文)。
逆转录病毒和慢病毒基因组的基本结构具有许多共同特征，如5’LTR和3’LTR，在它们之间或内部具有使基因组能够被包装的包装信号、引物结合位点、使得能够整合到靶细胞基因组中的整合位点、和编码包装组件的gag/pol和env基因-所述包装组件是病毒颗粒组装所需的多肽。慢病毒具有其它的特征，如HIV中的rev基因和RRE序列，它们使得整合的原病毒的RNA转录物能够有效地从受感染靶细胞的细胞核输出到细胞质。
在原病毒中，这些基因的两端的侧翼是称作长末端重复(LTRs)的区域。LTR负责原病毒整合和转录。LTR也作为增强子-启动子序列，并且能够控制病毒基因的表达。
LTR自身是可以被分为三种元件的相同的序列，称作U3、R和U5。U3衍生自RNA的3’末端特有的序列。R衍生自在RNA的两端重复的序列，U5衍生自RNA的5’末端特有的序列。在不同的逆转录病毒中，三种元件的大小可以显著不同。
在本发明的典型逆转录病毒载体中，可以从病毒中除去一种或多种编码复制所必须的区域的蛋白的至少一部分；例如，可以不存在gag/pol和env基因或者这些基因是功能丧失的。这使病毒载体成为复制缺陷型病毒。
也可以用与载体基因组中的调控区和报告基因有效连接的编码本发明的候选核酸结合序列的文库来代替病毒基因组的部分，以便制备包含本发明的候选核酸结合序列的载体，该载体能够将非分裂的靶宿主细胞转导到宿主基因组中和/或将其基因组整合到宿主基因组中。
慢病毒是较大一类的逆转录病毒的一部分。慢病毒的详细列表可以参见Coffin等(1997)(“Retroviruses”，冷泉港实验室出版社，编辑：JM Coffin，SM Hughes，HE Varmuspp 758-763)。简言之，慢病毒可以分为灵长类动物类和非灵长类动物类。灵长类动物慢病毒的实例包括，但不限于：人类免疫缺陷病毒(HIV)，即人类自身免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体，和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类动物慢病毒类包括原型“慢病毒”绵羊脱髓鞘性脑白质炎/羊慢性进行性肺炎病毒(VMV)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血症病毒(EIAV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
慢病毒科和逆转录病毒之间的区别是慢病毒具有感染分裂和非分裂细胞这两者的能力(参见文献“Lewis et al(1992)EMBO J11(8):3053-3058”和“Lewis and Emerman(1994)J Virol 68(1):510-516”)。相反，其它逆转录病毒(如MLV)不能感染非分裂的或缓慢分裂的细胞，例如组成诸如肌肉、脑、肺和肝组织的那些细胞。
此处使用的慢病毒载体是包含至少一种可衍生自慢病毒的组成部分的载体。优选地，该组成部分参与载体感染细胞、表达基因或复制的生物学机制。
慢病毒载体可以衍生自灵长类慢病毒(例如，HIV-1)或非灵长类慢病毒。
非灵长类动物慢病毒的例子可以是慢病毒科的任何成员，其在自然状态下不感染灵长类动物，其实例可以包括猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、羊慢性进行性肺炎绵羊脱髓鞘性脑白质炎病毒(MVV)或马传染性贫血症病毒(EIAV)。
一般地，典型的逆转录病毒载体生产系统涉及从必要的病毒包装功能体中分离病毒基因组。如图1所示，这些元件以单独的DNA表达盒(或者被称为质粒、表达质粒、DNA构建体或表达构建体)的方式被提供给生产细胞。
载体基因组包含目的核苷酸。载体基因组通常需要包装信号(ψ)、含有目的核苷酸的内部表达盒、(任选的)后转录元件(PRE)、3’-ppu和自失活(SIN)LTR。R-U5区是载体基因组RNA和目的核苷酸mRNA进行正确多腺苷酸化、以及逆转录加工所必须的。载体基因组可选的包括开放阅读框，如在WO 2003/064665中有所描述。
包装功能包括gag/pol和env基因。这些基因是生产细胞产生载体颗粒所必须的。将这些功能基因反式赋予基因组有利于产生复制缺陷型病毒。
γ逆转录病毒载体的生产系统通常是需要基因组、gag/pol和env表达构建体的3组分系统。基于HIV-1的慢病毒载体的生产系统还需要以反式提供辅助基因rev，并且对于载体基因组而言，要包括rev-应答元件(RRE)。基于EIAV的慢病毒载体如果存在开放阅读框(ORF)的话，则不需要rev(参见WO 2003/064665)。
通常来说，在载体基因组盒内编码的“外部”启动子(其驱动载体基因组盒)和“内部”启动子(其驱动目的核苷酸盒)是强的真核或病毒启动子，就像驱动其他载体系统元件的那些启动子一样。这类启动子的实例包括CMV、EF1a、PGK、CAG、TK、SV40和泛素启动子。强“合成”启动子，如由DNA文库产生的那些启动子(例如，JeT启动子)，还可以用于驱动转录。或者，可以使用组织特异性启动子来驱动转录，这些启动子例如视紫红质(Rho)、视紫红质激酶(RhoK)、含视锥-视杆同源框基因(CRX)、神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白(NRL)、卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)、酪氨酸羟化酶、神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子、星形细胞特异性神经胶质纤维性酸性蛋白(GFAP)启动子、人α1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、肝脏脂肪酸结合蛋白启动子、Flt-1启动子、INF-β启动子、Mb启动子、SP-B启动子、SYN1启动子、WASP启动子、SV40/hAlb启动子、SV40/CD43、SV40/CD45、NSE/RU5′启动子、ICAM-2启动子、GPIIb启动子、GFAP启动子,纤连蛋白启动子、Endoglin启动子、弹性蛋白酶-1启动子、结蛋白启动子、CD68启动子、CD14启动子和B29启动子。
逆转录病毒载体的生产涉及利用这些DNA元件来瞬时转染生产细胞，或者使用稳定的生产细胞系(PCL)，其中这些元件整合到了生产细胞基因组内(例如，参加文献“Stewart,H.J.,M.A.Leroux-Carlucci,C.J.Sion,K.A.Mitrophanous and P.A.Radcliffe(2009)Gene Ther.16(6):805-814Epub 2009Mar 2005”)。可替代的途径是用稳定的包装细胞(其中已经稳定的整合有包装元件)，然后根据需要在载体基因组质粒中进行瞬时转染。为了生产本发明的病毒载体，生产细胞必须能够表达RNA结合蛋白(例如，TRAP蛋白)。因此，在本发明的一个实施方案中，生产细胞将稳定表达RNA结合蛋白(例如，TRAP)构建体。在本发明的另一个实施方案中，生产细胞将瞬时表达RNA结合蛋白(例如，TRAP)构建体。在本发明的另一个实施方案中，生产细胞将稳定表达RNA结合蛋白(例如，TRAP)构建体，并且还瞬时表达RNA结合蛋白(例如，TRAP)构建体。
应当注意，尽管TRIP系统主要描述为用于生产逆转录病毒载体，但是类似的策略也可以用于其他病毒载体。
在本发明的一个实施方案中，病毒载体衍生自EIAV。EIAV具有慢病毒的最简单的基因组结构，特别优选用于本发明。除了gag/pol和env基因之外，EIAV还编码其他三种基因：tat、rev和S2。Tat充当病毒LTR的转录激活物(参见文献“Derse and Newbold(1993)Virology194(2):530-536”；“Maury et al，(1994)Virology 200(2):632-642”)，rev通过rev-应答元件(RRE)调节和协调病毒基因的表达(参见文献“Martarano et al，(1994)JVirol 68(5):3102-3111”)。这两种蛋白质的作用机制据认为大体上相似于灵长类动物病毒中的类似机制(参见文献“Martarano et al，(1994)J Virol 68(5):3102-3111”)。S2的功能未知。另外，已鉴定了称为Ttm的EIAV蛋白，它由在跨膜蛋白起始处被剪接到env编码序列的tat的第一个外显子编码。在本发明一个可选的实施方案中，病毒载体衍生自HIV，HIV与EIAV的差异在于它不编码S2，但是与EIAV不同，它编码vif、vpr、vpu和nef。
术语“重组逆转录病毒或慢病毒载体”(RRV)指这样的载体，其具有足够的逆转录病毒遗传信息，以让RNA基因组在包装组件存在下得以包装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中。靶细胞的感染可包括逆转录、以及整合到靶细胞基因组中。RRV携带着要通过载体递送到靶细胞的非病毒编码序列。RRV不能够进行独立复制以在靶细胞中产生感染性慢病毒颗粒。通常，RRV缺乏复制所必需的功能性gag/pol基因和/或env基因和/或其他基因。
优选地，本发明的RRV载体具有最低限度的病毒基因组。
本文所用的术语“最低限度的病毒基因组”意指病毒载体已经过操作，从而去除非必需元件而保留必需元件，以提供感染、转导和递送目的核苷酸序列到靶细胞所需的功能性。这个策略的更多细节可见WO 1998/17815和WO 99/32646。最低限度EIAV载体缺少tat、rev和S2基因，并且这些基因也都没有反式出现在生产系统中。最低限度HIV载体缺少vif、vpr、vpu、tat和nef。
然而，用于在生产细胞内生产载体基因组的表达质粒将包括有效连接于逆转录病毒基因组的转录调控序列，从而在生产细胞/包装细胞内直接转录基因组。这些调控序列可以是与所转录的逆转录病毒序列相关联的天然序列，即5’U3区域，或它们可以是异源启动子，如其他病毒启动子，例如CMV启动子，如下所述。一些慢病毒载体基因组为了有效的产生病毒，因此需要额外的序列。例如，特别在HIV的情况中，可以包括RRE序列。然而，可以通过密码子优化减少或消除对于RRE的需求(以及对反式提供的rev的依赖性)。这一策略的进一步细节可以参见WO2001/79518。与rev/RRE系统执行相同功能的可替代的序列也是已知的。例如，在Mason Pfizer猴病毒中发现了rev/RRE系统的功能性类似物，其被称为组成型转运元件(CTE)，并且在基因组内包括据信与被感染的细胞中的因子相互作用的RRE型序列。细胞因子可以被认为是rev类似物。因此，CTE可被用作rev/RRE系统的替代。任何已知的或者可获得的其他功能等价物都可以与本发明相关。例如，还已知，HTLV-I的Rex蛋白能够功能性地代替HIV-1的Rev蛋白。在本发明方法中使用的载体中，Rev和RRE可以不存在或者是无功能的；在可替代的方案中，可以存在rev和RRE或功能等价系统。
SIN载体
本发明的方法中使用的载体优选用于自失活(SIN)结构中，其中已经删除了病毒增强子和启动子序列。SIN载体可以在体内、离体或体外以类似于野生型载体的效率产生并转导非分裂靶细胞。SIN原病毒的长末端重复(LTR)的转录失活将会抑制由具有复制能力的病毒的活化。这通过消除LTR的任意顺式作用效果，还能够调控由内部启动子启动的基因表达。
举例来说，自失活的逆转录病毒载体系统已经被构建为删除了转录增强子或3’LTR的U3区内的增强子或启动子。在载体逆转录和整合一轮之后，这些变化将被拷贝到产生无转录活性的原病毒的5'和3'LTR中。然而，在这种载体中的LTR的任意内部启动子将仍然保持转录活性。这一策略已被用来消除病毒LTR内的增强子和启动对由内部放置的基因的转录的影响。这些影响包括增加转录或抑制转录。这种策略也可用于消除从3'端LTR下游转录成基因组DNA。在人类基因治疗中，这是受到特别关注的，在该治疗中，重要的是防止任何内源致癌基因的外来激活。参见文献“Yu et al.，(1986)PNAS 83:3194-98”；“Marty etal.，(1990)Biochimie 72:885-7”；“Naviaux et al.，(1996)J.Virol.70:5701-5”；“Iwakuma et al.，(1999)Virol.261:120-32”；“Deglon et al.，(2000)Human GeneTherapy 11:179-90”。SIN慢病毒载体在US6,924,123和US 7,056,699中有所描述。
非复制型慢病毒载体
在复制缺陷型慢病毒载体的基因组中，gag/pol和/或env的序列可以突变、缺失和/或没有功能。
在本发明的典型慢病毒载体中，可以从载体中除去为病毒复制所必需的蛋白质的一个或多个编码区的至少一部分。这制造了复制缺陷型病毒载体。病毒基因组的部分也可以由目的核苷酸(NOI)替换，以产生包含目的核苷酸的载体，该目的核苷酸能够转导非分裂靶细胞和/或将它的基因组整合到靶细胞基因组中。
在一个实施方案中，如WO 2006/010834和WO 2007/071994中所描述的那样，慢病毒载体是非整合型载体。
在进一步的实施方案中，载体具有递送没有或缺少病毒RNA序列的能力。在进一步的实施方案中，位于待递送的RNA上的异源结合域(与gag异源)和位于Gag或GagPol上的同源结合域可以被用来确保待递送RNA的包装。这些载体在WO 2007/072056中有所描述。
腺病毒载体
在本发明的另一个实施方案中，载体可以是腺病毒载体。腺病毒是双链、线性DNA病毒，其不通过RNA中间体来复制。腺病毒有超过50种不同的人类血清型，基于其遗传序列分为了6个亚类。
腺病毒是双链DNA无包膜病毒，其能够在体内、离体和体外转导广泛的人类和非人类来源的细胞类型。这些细胞包括呼吸气道上皮细胞、肝细胞、肌肉细胞、心肌细胞、滑膜细胞、原发性乳腺上皮细胞和后有丝分裂终末分化细胞(如神经元)。
腺病毒载体也能够转导非分裂细胞。这对于疾病来说非常重要，例如囊性纤维化，其中在肺上皮中受影响的细胞具有缓慢的更换率。事实上，一些试验正在利用腺病毒介导，将囊性纤维化转运蛋白
(CFTR)转移进遭受痛苦的成年囊性纤维化患者的肺中。
腺病毒已被用作基因治疗载体和异源基因的表达载体。大的(36kb)基因组可容纳多达8kb的外源插入DNA，并且能够在补体细胞系中有效复制，从而产生高达每毫升1012转导单位的非常高的滴度。因此，腺病毒是用于在初期非复制性细胞中研究基因表达的最佳系统。
由腺病毒基因组表达病毒基因或外源基因不需要正在复制的细胞。腺病毒载体由受体介导的内吞作用进入细胞。一旦进入细胞，腺病毒载体很少整合到宿主染色体中。相反，它们附加地(episomally)(独立于宿主基因组)作为宿主细胞核内的线性基因组。
腺相关病毒载体
腺相关病毒(AAV)是本发明中使用的有吸引力的载体系统，因为它具有高频率的整合能力，并且它可以感染非分裂细胞。这对于将基因递送到哺乳动物细胞中是有用的。AAV的感染性具有广泛的宿主范围。关于rAAV载体的产生和使用的细节在US专利No.5,139,941和US专利No.4,797,368中有所描述，它们通过引用并入本文。
重组AAV载体已被成功地用于标记基因和涉及人类疾病的基因的体外、离体和体内转导。
某些AAV载体已被开发成可有效地容纳大的有效载荷(高达8-9kb)。一种此类载体具有AAV5衣壳和AAV2ITR(参见文献“Allocca M,et al，J.Clin Invest(2008)118:1955-1964”)。
单纯疱疹病毒载体
单纯疱疹病毒(HSV)是一种天然感染神经元的有包膜双链DNA病毒。它可以容纳大片段的外源DNA，这使得它作为载体系统非常有吸引力，并已被用作用于将基因递送至神经元的载体(参见文献“Manservigiet et al，Open Virol J.(2010)4:123-156”)。
在治疗过程中使用的单纯疱疹病毒需要减毒株，以便它们不能建立裂解周期。特别地，如果单纯疱疹病毒载体用于人类基因疗法，那么多核苷酸应优选被插入到必需基因中。这是因为，如果病毒载体遇到野生型病毒，将会出现通过重组而使异源基因转移到野生型病毒的情况。然而，只要该多核苷酸被插入到必需基因中，那么在受体病毒中该重组转移还会删除必需基因并阻止异源基因“逃逸”到有复制能力的野生型病毒群体中。
牛痘病毒载体
本发明的载体可以是牛痘病毒载体，例如MVA或NYVAC。牛痘病毒载体的可替代物包括禽痘载体，如鸟痘或称为ALVAC的金丝雀痘以及衍生自它们的毒株，其可以在人细胞中感染并表达重组蛋白，但无法复制。
杆状病毒载体
本发明的载体也可以是杆状病毒载体。使编码的目的核苷酸能够在哺乳动物细胞中表达的杆状病毒的修饰在本领域中是众所周知的。例如，这可以通过使用目的核苷酸上游的哺乳动物启动子来实现。
编码多个目的核苷酸的载体
在一个实施方案中，载体包括超过一个目的核苷酸，其中一个以上的目的核苷酸有效连接到本发明的核酸结合位点。
内部核糖体进入位点(IRES)
如上所述，本发明的载体可包括多于一个目的核苷酸。为了使这些目的核苷酸表达，在载体基因组中可以有两个或更多个转录单位，各转录单位对应各目的核苷酸。然而，文献中明确指出如果逆转录病毒载体在基因上保持简单，那么它们将达到最高滴度并且具有最有效的基因表达性质(WO 96/37623；Bowtell等，1988J.Virol.62,2464；Correll等，1994Blood 84,1812；Emerman and Temin 1984Cell 39,459；Ghattas等，1991Mol.Cell.Biol.11,5848；Hantzopoulos等，1989PNAS86,3519；Hatzoglou等，1991J.Biol.Chem 266,8416；Hatzoglou等，1988J.Biol.Chem 263,17798；Li等，1992Hum.Gen.Ther.3,381；McLachlin等，1993Virol.195,1；Overell等，1988Mol.CellBiol.8,1803；Scharfman等，1991PNAS 88,4626；Vile等，1994Gene Ther 1,307；Xu等，1989Virol.171,331；Yee等，1987PNAS 84,5197)，因此优选的是使用内部核糖体进入位点(IRES)以启动在多顺反子信息内的第二(和随后的)编码序列的翻译(Adam等，1991J.Virol.65,4985)。
IRES元件插入到逆转录病毒载体是与逆转录病毒复制周期兼容的，并允许由单一启动子启动多个编码区的表达(Adam等，(同上)；Koo等，(1992)Virology 186:669-675；Chen等，1993J.Virol67:2142-2148)。IRES元件首次发现于小RNA病毒的非翻译5'末端，在此它们促进病毒蛋白的不依赖于帽的翻译(Jang等，(1990)Enzyme44:292-309)。当在RNA中位于开放阅读框之间时，IRES元件通过促进在IRES元件处的核糖体进入，随后启动下游翻译，从而允许下游开放阅读框的有效翻译。
Mountford和Smith介绍了关于IRES的综述(TIG May 1995vol 11,No 5:179-184)。许多不同的IRES序列是已知的，包括来自脑心肌炎病毒(EMCV)(Ghattas,I.R.,等，Mol.Cell.Biol.,11:5848-5859(1991))、BiP蛋白[Macejak和Sarnow,Nature 353:91(1991)]、果蝇触角足基因(外显子d和e)[Oh等，Genes&Development,6:1643-1653(1992)]的那些，以及在脊髓灰质炎病毒(PV)[Pelletier和Sonenberg,Nature 334:320-325(1988)；还参见Mountford和Smith,TIG 11,179-184(1985)]中的那些序列。
来自PV、EMCV和猪水疱病病毒的IRES元件之前被用于逆转录病毒载体中(Coffin等，如上述)。
术语“IRES”包括发挥IRES功能或改善IRES功能的任何序列或序列的组合。
IRES可以是病毒来源的(如EMCV IRES、PV IRES或FMDV 2A样序列)或细胞来源的(如FGF2IRES、NRF IRES、Notch 2IRES或EIF4IRES)。
为了使IRES能够启动各多核苷酸的翻译，它应位于载体基因组中的多核苷酸之间或在多核苷酸之前。
启动子
目的核苷酸的表达可用控制序列进行控制，这些控制序列包括启动子/增强子和其他表达调节信号。可以使用原核生物启动子和在真核细胞中发挥功能的启动子。可以使用组织特异性启动子或刺激特异性启动子。还可使用包含来自两种或更多种不同启动子的序列元件的嵌合启动子。
合适的启动序列是强启动子，包括那些衍生自病毒(如多瘤病毒、腺病毒、禽痘病毒、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒(CMV)、逆转录病毒和猿猴病毒40(SV40))的基因组的启动子，或者衍生自异源哺乳动物启动子(如肌动蛋白启动子、EF1a、CAG、TK、SV40、泛素、PGK或核糖体蛋白启动子)的启动子。可供选择地，可以使用组织特异性启动子来驱动转录，如视紫红质(Rho)、视紫红质激酶(RhoK)、含视锥-视杆同源框基因(CRX)、神经视网膜特异性亮氨酸拉链蛋白(NRL)、卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)、酪氨酸羟化酶、神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子、星形细胞特异性神经胶质纤维性酸性蛋白(GFAP)启动子、人α1抗胰蛋白酶(hAAT)启动子、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)、肝脏脂肪酸结合蛋白启动子、Flt-1启动子、INF-β启动子、Mb启动子、SP-B启动子、SYN1启动子、WASP启动子、SV40/hAlb启动子、SV40/CD43、SV40/CD45、NSE/RU5′启动子、ICAM-2启动子、GPIIb启动子、GFAP启动子,纤连蛋白启动子、Endoglin启动子、弹性蛋白酶-1启动子、结蛋白启动子、CD68启动子、CD14启动子和B29启动子。
可通过将增强序列插入到载体中，来进一步提高基因的转录。增强子相对不依赖于取向和位置；但是，可以采用来自真核细胞病毒的增强子，如在复制起点的后侧(lateside)上的SV40增强子(bp 100-270)和CMV早期启动子增强子。增强子可在相对于启动子的5’或3’的位置剪接到载体中，但优选位于相对于启动子的5’位点。
启动子可另外包括用以确保或提高在合适的靶细胞中表达的特征。例如，所述特征可以是保守区域，例如Pribnow框或TATA框。启动子可含有用以影响(如维持、增强或降低)核苷酸序列的表达水平的其他序列。合适的其他序列包括Sh1内含子或ADH内含子。其他序列包括可诱导元件，如温度、化学、光和应激可诱导元件。还可存在用以增强转录或翻译的合适元件。
当驱动转基因的组成型和/或强启动子(包括组织特异性启动子)是可期望的时，特别是当在生产细胞中转基因蛋白的表达导致载体滴度下降和/或由于病毒载体递送来自转基因的蛋白而引发体内免疫应答时，RNA结合蛋白-结合位点(例如，TRAP-tbs)的相互作用对于形成转基因蛋白抑制系统的基础来说可以是有用的，该系统用于产生逆转录病毒载体。图4示出了如何以优选的形式应用的实例。
包装序列
在本发明的背景下所使用的术语“包装信号”可与“包装序列”或“psi”互换使用，其用来指在病毒颗粒形成期间逆转录病毒RNA链的衣壳化作用所需的非编码、顺式作用序列。在HIV-1中，该序列已被定位于从主要剪接供体位点(SD)上游至少延伸到gag起始密码子的基因座。在EIAV中，包装信号包括R区域到Gag的5’编码区。
本文所使用的术语“延伸的包装信号”或“延伸的包装序列”指在psi序列的周围使用进一步延伸到gag基因中的序列。包含这些额外的包装序列可提高载体RNA插入到病毒颗粒中的效率。
已经证明猫免疫缺陷病毒(FIV)RNA的衣壳化作用决定簇是离散的、非连续的，其包括位于基因组mRNA的5'末端的一个区域(R-U5)和定位在gag的大约311nt中的另一个区域(Kaye等，J Virol.Oct；69(10):6588-92(1995))。
病毒载体生产系统和细胞
本发明的另一个方面涉及一种病毒载体生产系统，包括一组编码生产病毒载体所需元件的核酸序列，其中所述载体基因组序列包含本发明的核酸序列。
“病毒载体生产系统”或“载体生产系统”或“生产系统”应被理解为包括生产病毒载体所需元件的系统。
因此，该载体生产系统包括一组编码产生病毒载体颗粒所需的元件的核酸序列。一条这样的核酸序列可包含编码RNA结合蛋白的基因。在一个优选的实施方案中，RNA结合蛋白是细菌的TRAP。
在本发明的一个实施方案中，病毒载体是逆转录病毒载体，并且病毒载体生产系统还包括编码Gag和Gag/Pol蛋白、以及Env蛋白的核酸序列、或其功能性替代物、以及包含本发明结合位点的载体基因组序列。生产系统可以任选包含编码Rev蛋白的核酸序列。
在本发明的病毒载体生产系统另一个实施方案中，病毒载体衍生自逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒。
在另一个实施方案中，病毒载体衍生自慢病毒。在另一个实施方案中，病毒载体衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或绵羊脱髓鞘性脑白质炎慢病毒。。
本发明的另一个方面涉及一种DNA构建体，其用于本发明的病毒载体生产系统。这种DNA构建体(例如质粒)可以包括包含本发明的核酸序列的载体基因组构建体。
本发明的再一个方面涉及一种DNA构建体，其用于本发明的病毒载体生产系统中，所述构建体包含编码本发明的RNA结合蛋白(例如TRAP)的核酸序列。
本发明的另一个方面涉及一组DNA构建体，其用于本发明的病毒载体生产系统中，所述一组DNA构建体包含本发明的DNA构建体、编码Gag和Gag/Pol蛋白以及Env蛋白的DNA构建体、或其功能性替代物。
在本发明的一个实施方案中，所述一组DNA构建体还包含编码RNA结合蛋白(例如TRAP)的DNA构建体。
在本发明的一个实施方案中，所述一组DNA构建体还包含编码Rev蛋白的DNA构建体或其功能性替代物。
本发明的另一个方面涉及一种病毒载体生产细胞，其包含本发明的核酸序列、病毒载体生产系统、或一些或全部的所述DNA构建体。
“病毒载体生产细胞”应理解为能够产生病毒载体或病毒载体颗粒的细胞。病毒载体生产细胞可以是“生产细胞”或“包装细胞”。病毒载体系统的一种或多种DNA构建体可稳定地整合入或附加地保持在病毒载体生产细胞内。可供选择地，病毒载体系统的所有的DNA元件可瞬时转染到病毒载体生产细胞中。在另一种可供选择的实施方案中，稳定表达元件中的一些的生产细胞可以利用其余的元件进行瞬时转染。
编码RNA结合蛋白(例如，TRAP)的DNA表达盒可以稳定地整合入或附加地保持在病毒载体生产细胞内。可供选择地，编码RNA结合蛋白(例如，TRAP)的DNA表达盒可被瞬时转染到病毒载体生产细胞中。
因此，在本发明的一个实施方案中，生产细胞将稳定表达RNA结合蛋白(例如，TRAP)构建体。在本发明的另一个实施方案中，生产细胞将瞬时表达RNA结合蛋白(例如，TRAP)构建体。
所需的抑制水平可以根据目的核苷酸而改变，因此在生产细胞内所需的RNA结合蛋白(例如，TRAP)的水平也可以取决于目的核苷酸。因此，在一些情况下，稳定和瞬时表达RNA结合蛋白(例如，TRAP)的组合是期望的。稳定表达可以在生产细胞内提供连续水平的RNA结合蛋白表达，而瞬时表达可提供短期的增加水平的RNA结合蛋白表达。例如，更有问题/有毒的转基因的抑制可受益于载体生产过程中的预存在水平(例如，通过稳定表达提供)的和高水平的RNA结合蛋白。
因此，在本发明的另一个实施方案中，生产细胞将稳定表达RNA结合蛋白(例如，TRAP)构建体，并且也瞬时表达RNA结合蛋白(例如，TRAP)构建体。相比于稳定表达，瞬时表达可提供短期更高水平的RNA结合蛋白表达。
术语“稳定表达”应当理解为来自构建体的RNA结合蛋白的表达提供了基本上不随时间延长而变化的稳定表达。
术语“瞬时表达”应当理解为来自构建体的RNA结合蛋白的表达提供了随着时间的延长并不稳定的瞬时表达。优选地，编码用于瞬时表达的RNA结合蛋白的多核苷酸不整合到生产细胞基因组中，并且不附加地保持在生产细胞内。
本文所用的术语“包装细胞”指这样的细胞，其含有为产生感染性载体颗粒所需的元件，但是其缺乏载体基因组。通常，这种包装细胞含有一种或多种能够表达病毒结构蛋白(如gag、gag/pol和env)的表达盒。
生产细胞/包装细胞可以是任何合适的细胞类型。生产细胞通常是哺乳动物细胞，但也可以是(例如)昆虫细胞。
如本文所用，术语“生产者/生产细胞”或“载体生产/产生细胞”是指这样的细胞，其包含产生逆转录病毒载体颗粒和表达RNA结合蛋白(例如，TRAP)所需的所有元件。
生产细胞可以是稳定的生产细胞系或瞬时衍生的生产细胞系。
在一个本发明的实施方案中，包膜和核壳、RNA结合蛋白(例如TRAP)以及rev核苷酸序列(如果存在的话)都稳定地整合入生产细胞和/或包装细胞。然而，这些序列中的任何一种或多种也可以以附加体的形式存在并且可以发生来自附加体的基因表达，或者它们可以被瞬时转染到生产细胞中。
载体生产细胞可以是诸如组织培养细胞系等在体外培养的细胞。合适的细胞系包括但不限于，哺乳动物细胞(如衍生自鼠成纤维细胞的细胞系或人细胞系)。优选的载体生产细胞衍生自人细胞系。
在一个实施方案中，本发明的载体用作其生产系统，表达载体基因组的四个转录单元包括有效连接到目的核苷酸的本发明的结合位点、gag-pol元件、包膜以及RNA结合蛋白(例如，TRAP)。包膜表达盒可以包括多个异源包膜之一，如VSV-G。任选地，还可以包括rev元件。
病毒载体生产方法
本发明的另一个方面涉及一种病毒载体的生产方法，包括将本发明的核酸序列、病毒载体生产系统、或一些或全部DNA构建体引入到病毒载体生产细胞中，并且在适合所述病毒载体产生的条件下培养所述生产细胞。
合适的“生产细胞”是那些在适当条件下培养能够生产病毒载体或病毒载体颗粒的细胞。它们通常是哺乳动物细胞或人细胞，例如HEK293T、HEK293、CAP、CAP-T或CHO细胞，但也可以是，例如，昆虫细胞，如SF9细胞。
生产细胞也可以是禽类细胞，例如(Sigma)细胞。禽类细胞特别可以用于生产基于病毒的人用和兽用疫苗，例如流感和鸡新城疫病毒疫苗。
用于将核酸引入生产细胞的方法在本领域中是众所周知的，并且先前已被描述。
在一个实施方案中，生产细胞包含RNA结合蛋白(例如，色氨酸RNA结合衰减蛋白，TRAP)。
本发明的另一个方面涉及一种利用本发明的病毒载体生产细胞由本发明的病毒载体生产系统生产的病毒载体，或由本发明的方法生产的病毒载体。
在一个实施方案中，病毒载体颗粒包含核酸结合位点。病毒载体颗粒可衍生自逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒。逆转录病毒载体颗粒可衍生自慢病毒。慢病毒载体颗粒可衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或绵羊脱髓鞘性脑白质炎慢病毒。
用于生产慢病毒载体的方法，特别是用于慢病毒载体加工的方法在WO 2009/153563中有所描述。
本发明的另一个方面涉及一种由本发明的病毒载体转导的细胞。
“由病毒载体颗粒转导的细胞”应理解为是一种已经转入了由病毒载体颗粒携带的核酸的细胞，特别是靶细胞。
假毒粒化
在一个优选方面，本发明的逆转录病毒载体已经被假毒粒化。在这一点上，假毒粒化可以赋予一个或多个优点。例如，基于HIV的载体的env基因产物将限制这些载体，使其仅仅感染表达称作CD4的蛋白的细胞。但如果这些载体中的env基因被来自其它有包膜病毒的env序列替代，那么它们可能具有更宽的感染谱(Verma和Somia(1997)Nature 389(6648):239-242)。例如，工作者已经用来自VSV的糖蛋白对基于HIV的载体进行了假毒粒化(Verma和Somia(1997)Nature 389(6648):239-242)。
在另一种可选的方案中，Env蛋白可以是修饰的Env蛋白，如突变的或工程化的Env蛋白。可以进行修饰或对修饰进行选择，以导入靶定能力或减少毒性或用于其它目的(Valsesia-Wittman等，1996J Virol 70：2056-64；Nilson等，(1996)Gene Ther 3(4):280-286；Fielding等，(1998)Blood 91(5):1802-1809；及其中引用的参考文献)。
可以用任何选择的分子使载体假毒粒化。
VSV-G
水疱性口腔炎病毒(VSV，一种棒状病毒)的包膜糖蛋白(G)是已被证实能够对某些包膜病毒和病毒载体病毒粒子进行假毒粒化的包膜蛋白。
Emi等(参见“(1991)Journal of Virology 65:1202-1207”)首先证明了在不存在任何逆转录病毒包膜蛋白的情况下，它对基于MoMLV的逆转录病毒载体进行假毒粒化的能力。WO 1994/294440教导了逆转录病毒载体可成功地用VSV-G进行假毒粒化。这些经假毒粒化的VSV-G载体可用于转导广范围的哺乳动物细胞。最近，文献“Abe et al.(1998)J Virol72(8)6356-6361”教导了可通过加入VSV-G使非感染性逆转录病毒颗粒变成感染性。
Burns等((1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-7)成功地用VSV-G对逆转录病毒MLV进行假毒粒化，这导致产生与天然形式的MLV相比改变了宿主范围的载体。已经证实VSV-G假毒粒化的载体不仅感染哺乳动物细胞，而且还感染衍生自鱼类、爬行动物和昆虫的细胞系(Burns等(1993)，出处同上)。还证实了它们对于多种细胞系而言比传统的兼嗜性包膜更有效(Yee等，(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:9564-9568、Emi等，(1991)Journal of Virology65:1202-1207)。VSV-G蛋白可用于对某些逆转录病毒进行假毒粒化，因为它的胞质尾巴能够与逆转录病毒核心发生相互作用。
提供非逆转录病毒假毒粒化包膜(如VSV-G蛋白)可得到这样的优点，即载体颗粒能被浓缩至高滴度而不损失感染性(Akkina等，(1996)J.Virol.70:2581-5)。逆转录病毒包膜蛋白显然不能够承受超离心过程中的剪切力，这很可能是因为它们由两个非共价连接的亚单位组成。离心可破坏亚单位之间的相互作用。相比之下，VSV糖蛋白由单一单位组成。因此VSV-G蛋白假毒粒化可提供潜在的优点。
WO 2000/52188描述了由具有水疱性口腔炎病毒G蛋白(VSV-G)作为膜结合性病毒包膜蛋白的稳定生产细胞系产生假毒粒化的逆转录病毒载体，并提供了VSV-G蛋白的基因序列。
罗斯河病毒
用罗斯河病毒包膜对非灵长类动物慢病毒载体(FIV)进行假毒粒化，并且按照系统给药主要转导肝(Kang等，(2002)J Virol76(18):9378-9388)。据报道，效率比用VSV-G假毒粒化载体获得的效率高20倍，并且通过测量提示肝中毒的肝酶血清水平得知，导致的毒性更低。
杆状病毒GP64
已经证明了杆状病毒GP64蛋白是VSV-G的替代方案，其用于在临床和商业应用所需的高滴度病毒的大规模生产中使用的病毒载体(Kumar M,Bradow BP,Zimmerberg J(2003)Hum Gene Ther.14(1):67-77)。与VSV-G假毒粒化载体相比，GP64假毒粒化载体具有相似的广泛嗜性和相似的天然滴度。由于GP64的表达不杀死细胞，因此可以制备组成型表达GP64的基于293T的细胞系。
可供选择的包膜
当用于假毒粒化EIAV时提供适当的滴度的其他包膜包括Mokola、Rabies、Ebola和LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)。向小鼠体内静脉输注利用4070A进行假毒粒化的慢病毒导致在肝脏内具有最大的基因表达。
多核苷酸
本发明的多核苷酸可包含DNA或RNA。它们可以是单链的或双链的。技术人员会理解，由于遗传密码的简并性，有许多不同的多核苷酸可编码同一多肽。另外，应理解，技术人员可使用常规技术进行不会影响由本发明的多核苷酸所编码的多肽序列的核苷酸替代，以反映在其中表达本发明多肽的任何具体宿主生物体的密码子使用。
多核苷酸可通过本领域可获得的任何方法进行修饰。可进行这种修饰以提高本发明的多核苷酸的体内活性或寿命。
多核苷酸如DNA多核苷酸可用重组法产生、合成法产生或本领域技术人员可获得的任何方法产生。它们还可通过标准的技术进行克隆。
通常使用重组方法来产生较长的多核苷酸，例如使用PCR(聚合酶链反应)克隆技术。这涉及到制备一对能侧接于需要克隆的靶序列的引物(例如约15至30个核苷酸)，使引物与从动物细胞或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在能引起所需区域扩增的条件下进行聚合酶链反应，分离扩增的片段(例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)和回收扩增的DNA。可将引物设计成含有合适的限制性内切酶识别位点，使得扩增的DNA可被克隆到合适的载体中。
蛋白质
本文所用的术语“蛋白质”包括单链多肽分子以及多个多肽的复合物，在所述复合物中各个组成多肽通过共价方式或非共价方式连接。本文所用的术语“多肽”和“肽”指其中单体为氨基酸并通过肽键或二硫键连接在一起的聚合物。
变体、衍生物、类似物、同源物和片段
除了本文提到的具体蛋白质和核苷酸之外，本发明还涵盖使用它们的变体、衍生物、类似物、同源物和片段。
在本发明的情况中，任何给定序列的变体是这样的序列，其中残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的特定序列以这样的方式进行了改变：所涉及的多肽或多核苷酸保持了其内源功能中的至少一种。可通过对天然蛋白质中存在的至少一个残基进行添加、缺失、替代、修饰、替换和/或改变，来获得变体序列。
与本发明的蛋白质或多肽相关的本文所用术语“衍生物”包括对序列的一个(或多个)氨基酸残基进行的任何替代、改变、修饰、替换、缺失和/或添加，只要所产生的蛋白质或多肽能保持其内源功能中的至少一种即可。
与多肽或多核苷酸相关的本文所用术语“类似物”包括任何模仿物，即这样的化合物，它具有其所模仿的多肽或多核苷酸的内源功能中的至少一种。
通常，可进行(例如)1、2或3至10或20个替换以进行氨基酸替换，只要被改变的序列能保持所需的活性或能力即可。氨基酸替换可包括非天然类似物的使用。
用于本发明的蛋白质还可具有这样的氨基酸残基缺失、插入或替代，即缺失、插入或替代能产生沉默的变化并导致功能上等同的蛋白质。还可在残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性的基础上作出谨慎的氨基酸替代，只要内源性功能得以保持即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；含有具有相似亲水性值的无电荷极性头部基团的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
保守替代可例如按下表作出。第二列同一格中的氨基酸、优选第三列同一行中的氨基酸可互相替代：
术语“同系物”意指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有特定同源性的实体。术语“同源性”可以与“同一性”互换。
在本发明的正文中，同源序列包括可与题述序列至少具有50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性的氨基酸序列，优选与题述序列至少具有95％或97％或99％的同一性。通常，同源性包括与题述氨基酸序列相同的活性位点等。虽然还可根据相似性(即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基)来考虑同源性，但在本发明的正文中，优选根据序列同一性来表示同源性。
在本发明的正文中，同源序列包括可与题述序列至少具有50％、55％、65％、75％、85％或90％同一性的核苷酸序列，优选与题述序列至少具有95％或97％或99％的同一性。虽然还可根据相似性来考虑同源性，但在本发明的正文中，优选根据序列同一性来表示同源性。
同源性比较可以借助眼睛来进行，或更通常借助于容易获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可以计算出两个或更多个序列之间的同源性或同一性百分率。
同源性百分率可以对连续的序列进行计算，即将一个序列与另一序列比对，并且将一个序列中的每个氨基酸直接与另一序列中的相应氨基酸进行比较，每次比较一个残基。这称为“没有空位的(ungapped)”比对。通常，这种没有空位的比对仅对相对短数目的残基进行。
虽然这是一种非常简单而相容的方法，但它不能考虑例如在其它情况下相同的一对序列中，一个核苷酸的插入或缺失将引起随后的密码子不能对齐，从而当进行全序列比对时，潜在地导致同源性百分率大大降低。因此，大多数的序列比较方法被设计为产生最佳比对，最佳比对考虑到可能的插入和缺失，而对整体同源性分值不会处以过高的罚分。通过在序列比对中插入“空位”以尝试使局部同源性最大化，来实现这一点。
然而，这些更为复杂的方法为在比对中发生的每个空位指定“空位处罚”，使得对于相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少的空位并反映出两个比较序列之间较高相关性的序列比对将获得比具有许多空位的序列比对更高的分值。“Affine空位罚分”通常用来对存在空位处以相对高的罚分，而对该空位的每种后来残基的罚分较低。这是最常用的空位打分系统。当然，高的空位处罚会产生具有较少空位的最佳比对。大多数的序列比对程序允许对空位处罚进行修改。然而，当使用这类软件进行序列比较时，最好使用默认值。例如，当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位处罚为：一个空位为-12，每个延长为-4。
因此，最大同源性百分率的计算首先需要考虑空位处罚，产生最佳比对。用于进行这种序列比对的合适计算机程序是GCG WisconsinBestfit软件包(Wisconsin大学，U.S.A.；Devereux等，(1984)核酸研究12:387)。可以进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等，1999，出处同上-第18章)、FASTA(Atschul等，(1990)J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具程序组。BLAST和FASTA都可用于线下和在线搜索(参见Ausubel等，(1999)，出处同上，第7-58页至第7-60页)。然而，对于一些应用而言，优选使用GCG Bestfit程序。另一种称为BLAST 2Sequences的工具也可用来比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol Lett(1999)174(2):247-50；FEMS Microbiol Lett(1999)177(1):187-8)。
虽然可以根据同一性测量最终的同源性百分率，但序列比对过程本身通常不基于全或无的成对比较。而是，通常用绘制的相似性分值矩阵，该分值矩阵根据化学相似性或进化距离，为每个成对比较指定分值。常用的这种矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序组的默认矩阵。GCG Wisconsin程序一般或者使用公共默认值，或者使用用户符号比较表(如果供应的话)(有关进一步的细节，参见用户手册)。对于一些应用，优选使用GCG软件包的公共默认值，或在其它软件的情况中，使用默认矩阵，例如BLOSUM62。
一旦软件产生了最佳比对，则可以计算出同源性百分率，优选序列同一性百分率。软件通常将此作为序列比较的一部分来进行，并且产生数值结果。
“片段”也是变体，这个术语通常指多肽或多核苷酸中的在功能上或者在例如检验上所感兴趣的选定区域。因此“片段”指属于全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。
这类变体可用标准的重组DNA技术如定点诱变来制备。在要进行插入的情况中，可以制备合成DNA，其编码该插入以及对应于该插入位点任一侧的天然序列的5′和3’侧翼区。所述侧翼区含有对应于天然序列中的位点的便利的限制位点，使得该序列可用适当的酶进行切割，并且所述合成DNA可连接到该切口中。然后按照本发明表达DNA以制备所编码的蛋白质。这些方法仅仅是举例说明许多本领域已知的用于操作DNA序列的标准技术，其他已知的技术也可使用。
本发明的RNA结合蛋白的全部变体、片段或同源物将保留结合本发明的同源结合位点的能力，从而在病毒载体生产细胞中抑制或阻止目的核苷酸的翻译。
本发明的结合位点的全部变体、片段或同源物将保留结合同源RNA结合蛋白的能力，从而在病毒载体生产细胞中抑制或阻止目的核苷酸的翻译。
密码子优化
本发明中所用的多核苷酸(包括目的核苷酸和/或载体生产系统的成分)可经过密码子优化。之前，密码子优化在WO 1999/41397和WO 2001/79518中已有描述。不同的细胞在它们对具体密码子的使用上存在差异。这种密码子偏好对应于特定tRNA在该细胞类型中的相对丰度的偏好。通过改变序列中的密码子，将它们定制成匹配相应的tRNA的相对丰度，可以提高表达。同样地，通过有意选择相应的tRNA已知在特定细胞类型中稀有的密码子，可以降低表达。因此，可以更大程度地进行翻译控制。
许多病毒(包括HIV和其他慢病毒)使用大量的稀有密码子，通过将这些密码子改变以对应于常用的哺乳动物密码子，可实现目的基因(例如目的核苷酸或包装组件)在哺乳动物生产细胞中的表达增加。本领域已知哺乳动物细胞以及多种其他生物的密码子用法表。
病毒载体成分的密码子优化具有许多其他优点。对于编码在生产细胞/包装细胞中病毒颗粒的装配所必需的病毒颗粒包装组件的核苷酸序列，由于它们的序列的改变，可使RNA不稳定性序列(INS)从中去除。同时，保留了包装组件的氨基酸序列编码序列，从而使得由所述序列编码的病毒成分保持相同或至少充分相似，从而包装组件的功能不受损害。在慢病毒载体中，密码子优化还能克服输出对Rev/RRE的需要，从而使得经优化的序列不依赖于Rev。密码子优化还能减少载体系统中的不同构建体之间(例如gag-pol开放阅读框和env开放阅读框的重叠区域之间)的同源重组。因此，密码子优化的总体效果是病毒滴度明显提高和安全性改善。
在一个实施方案中，仅对与INS相关的密码子进行密码子优化。但是，在更为优选和实用的实施方案中，对序列全部都进行密码子优化，但有一些例外，例如包含gag-pol的移码位点的序列(参见下文)。
gag-pol基因包含编码gag-pol蛋白的两个重叠阅读框。两种蛋白质的表达都依赖于翻译过程中的移码。该移码是因为核糖体在翻译过程中“滑动”而产生的。这个滑动据认为至少部分地由核糖体停靠(ribosome-stalling)RNA二级结构造成。这种二级结构存在于gag-pol基因中的移码位点的下游。对于HIV，重叠区域从gag起始端下游的核苷酸1222(其中核苷酸1为gag ATG的A)延伸至gag的末端(nt 1503)。因此，横跨两个阅读框的移码位点和重叠区域的281bp片段优选不进行密码子优化。保留此片段将使得能够更有效地表达Gag-Pol蛋白。
对于EIAV，据认为重叠的起始端是nt 1262(其中核苷酸1为gag ATG的A)。重叠的末端在1461bp。为了确保保留移码位点和gag-pol重叠，已保留了野生型序列的nt 1156至1465。
可作出与最佳密码子用法的偏差以(例如)适应便利的限制位点，并且可将保守氨基酸变化引入到Gag-Pol蛋白中。
在一个实施方案中，密码子优化基于轻表达的(lightly expressed)哺乳动物基因。可改变第三个碱基，有时可改变第二和第三个碱基。
由于遗传密码的简并性，应理解，技术人员可获得许多种gag-pol序列。另外，有许多所描述的逆转录病毒变体可用作用于产生经密码子优化的gag-pol序列的起始点。慢病毒基因组可以是十分可变的。例如，存在着许多仍能发挥功能的HIV-1类似物质。对于EIAV情况也是一样。这些变体可用于增强转导过程的特定部分。HIV-1变体的例子可在LosAlamos National Security公司运营的HIV数据库(http://hiv-web.lanl.gov)中找到。有关EIAV克隆的细节可在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中找到。
用于经密码子优化的gag-pol序列的策略可针对任意逆转录病毒使用。这将适用于所有的慢病毒，包括EIAV、FIV、BIV、CAEV、VMR、SIV、HIV-1和HIV-2。另外，这个方法可用于提高来自HTLV-1、HTLV-2、HFV、HSRV和人内源逆转录病毒(HERV)、MLV及其他逆转录病毒的基因的表达。
密码子优化可使gag-pol表达不依赖于Rev。但是，为了使得能够在慢病毒载体中使用抗rev或RRE因子，有必要使病毒载体生产系统完全不依赖于Rev/RRE。因此，基因组还需要加以修饰。这通过优化载体基因组成分来实现。有利地，这些修饰还导致在生产细胞和被转导的细胞中产生了不存在所有额外蛋白的更安全的系统。
应用
本发明的另一个方面涉及本发明的病毒载体或者转导有本发明病毒载体的细胞或组织用于药物。
本发明的另一个方面涉及本发明的病毒载体或者转导有本发明病毒载体的细胞或组织在药物中的应用。
本发明的另一个方面涉及本发明的病毒载体、本发明的生产细胞、或者转导有本发明病毒载体的细胞或组织用于制备将目的核苷酸递送至有需要的靶位点的药物中的应用。
如上所述，本发明的病毒载体或转导细胞的所述应用可以用于治疗目的或诊断目的。
治疗性载体
逆转录病毒治疗性载体
在一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于引入三个编码多巴胺合成途径的三个酶的基因以治疗帕金森病。该逆转录病毒载体是非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血症病毒(EIAV)，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。逆转录病毒载体所携带的基因可包含截短形式的人酪氨酸羟化酶(TH*)基因(其缺乏参与TH的反馈调节的N末端160个氨基酸)、人芳族L-氨基酸脱羧酶(AADC)和人GTP-环化水解酶1(CH1)基因。这三种酶可以由逆转录病毒载体在三个单独的开放阅读框中编码。可供选择地，逆转录病毒载体可以在第一开放阅读框内编码TH和CH1酶的融合蛋白，在第二开放阅读框内编码AADC酶。可以通过CMV启动子驱动基因表达，并且表达盒可包括一个或多个IRES元件。逆转录病毒载体可通过直接注射至大脑的纹状体内来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能将矫正性MYO7A基因引入到光感受器和支持性的视网膜色素上皮(RPE)细胞，从而减弱或逆转与Usher1B综合征相关的视力退化。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血症病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因是编码MYO7A蛋白的MYO7A cDNA(长度超过100mb的大基因)。可以通过CMV启动子、CMV/MYO7A嵌合启动子或另选的启动子来驱动大的MYO7A基因的表达。该逆转录病毒载体可在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于将矫正性ATP结合盒基因ABCA4(也称为ABCR)引入到光感受器，从而减弱或逆转会导致斯特格(Stargardt)病的病理生理学。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血症病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因是编码ABCA4蛋白的ABCA4cDNA。可通过CMV启动子、光感受器特异性启动子(如视紫红质激酶)或另选的启动子来驱动ABCA4的表达。该逆转录病毒载体可在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能防止湿型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者、糖尿病黄斑水肿患者、视网膜静脉阻塞患者眼睛中的异常血管生长和/或血管渗漏的复发，和/或防止干型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者眼睛中的异常血管生长。该逆转录病毒载体递送一个或多个编码(一种或多种)抗血管发生蛋白(如血管生长抑素和/或内皮生长抑素)的基因。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血症病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。在一个实施方案中，该逆转录病毒载体以双顺反子构型利用内部核糖体进入位点(IRES)表达人内皮生长抑素基因和血管生长抑素基因，以递送到视网膜色素上皮细胞。可通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白(bestrophin)启动子)、或另选的启动子来驱动抗血管发生基因的表达。该逆转录病毒载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能防止湿型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者眼睛中的水肿中的异常血管生长的复发。该逆转录病毒载体可递送编码(一种或多种)抗血管发生蛋白如血管生长抑素和/或内皮生长抑素的一个或多个基因。该逆转录病毒载体是衍生自马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。在一个实施方案中，逆转录病毒载体以双顺反子构型利用内部核糖体进入位点(IRES)表达人内皮生长抑素基因和血管生长抑素基因，以递送到视网膜色素上皮细胞。可通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子)、或另选的启动子来驱动抗血管发生基因的表达。该逆转录病毒载体可在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成通过在移植前向供体角膜递送抗血管发生基因，从而防止由新血管生成导致的角膜移植排斥。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。在一个实施方案中，逆转录病毒载体以双顺反子构型利用内部核糖体进入位点(IRES)表达抗血管发生基因如人内皮生长抑素基因和血管生长抑素基因，以离体递送到角膜移植物。该逆转录病毒载体可离体应用于角膜移植组织，并且被转导的供体组织在移植之前还可保存。可由组成型启动子如CMV启动子驱动抗血管发生基因的表达，但是还可以使用另选的启动子。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能防止湿型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者、糖尿病黄斑水肿患者、视网膜血管阻塞患者眼睛中的异常血管生长和/或血管渗漏的复发，和/或防止干型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者眼睛中的异常血管生长。该逆转录病毒载体递送编码可溶形式的fms-样酪氨酸激酶(可溶性Flt-1)的基因。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子)、或另选的启动子来驱动可溶性Flt-1基因的表达。该逆转录病毒载体可在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能防止湿型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者、糖尿病黄斑水肿患者、视网膜血管阻塞患者眼睛中的异常血管生长和/或血管渗漏的复发，和/或防止干型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者眼睛中的异常血管生长。该逆转录病毒载体递送编码色素上皮衍生因子蛋白(PEDF)的一个或多个基因。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子)、或另选的启动子来驱动PEDF基因的表达。该逆转录病毒载体可在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能防止湿型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者、糖尿病黄斑水肿患者、视网膜血管阻塞患者眼睛中的异常血管生长和/或血管渗漏的复发，和/或防止干型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者眼睛中的异常血管生长。该逆转录病毒载体递送编码血管上皮生长因子(VEGF)抑制剂(如抗-VEGF抗体或其结合片段，VEGF的特异性适体或VEGF阻断肽或多肽，包括但不限于，可溶形式的VEGF受体和/或血小板衍生生长因子(PDGF)的抑制剂，如抗PDGF抗体或其结合片段，PDGF的特异性适体或PDGF阻断肽或多肽，包括但不限于，可溶形式的PDGF受体)的一个或多个基因。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。在一个实施方案中，该逆转录病毒载体以双顺反子构型利用内部核糖体进入位点(IRES)表达VEGF抑制剂和PDGF抑制剂，递送到视网膜色素上皮细胞。可通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子)、或另选的启动子来驱动基因的表达。该逆转录病毒载体可在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于将矫正性基因卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)和编码对疾病相关形式的VMD 2特异的micro-RNA(miRNA)的盒、或者编码RDS基因的矫正性外周蛋白2和编码对疾病相关形式的RDS特异的miRNA的盒引入到视网膜色素上皮细胞，从而减轻或逆转导致Best病或Best卵黄样黄斑营养不良(BVMD)的病理生理。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子)、或另选的启动子来驱动基因的表达。该逆转录病毒载体可在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于将矫正性视黄醛结合蛋白1基因(RLBP1)引入到视网膜色素上皮细胞中，从而减轻或逆转导致RLBP1-相关视网膜营养不良的病理生理。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因是编码RLBP1蛋白的RLBP1cDNA。可以通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子)、或另选的启动子来驱动RLBP1基因的表达。逆转录病毒载体可在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能够治疗青光眼。该逆转录病毒载体递送编码用于降低眼内压的COX-2和/或前列腺素F2α受体(FPR)的一个或多个基因。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。在一个实施方案中，该逆转录病毒载体以双顺反子构型利用内部核糖体进入位点(IRES)表达COX-2和前列腺素F2α受体(FPR)基因，以递送到眼前房。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。该逆转录病毒载体可以通过角膜注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于引入矫正性harmonin基因，从而减轻或逆转导致Usher综合征1c的病理生理。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因是编码harmonin蛋白的harmonin cDNA。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动harmonin基因的表达。该逆转录病毒载体可在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于引入矫正性Rab护卫蛋白1(REP1)基因，从而减轻或逆转导致无脉络膜的病理生理。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因是编码REP1蛋白的REP1cDNA。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动REP1基因的表达。该逆转录病毒载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于将矫正性环式核苷酸门控通道β2(CNGB2)和/或环式核苷酸门控通道α3(CNGA3)基因引入到眼中，从而减轻或逆转导致全色盲的病理生理。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因是编码CNGB2和/或CNGA3蛋白的CNGB2和/或CNGA3基因。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。该逆转录病毒载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于将矫正性CEP290基因引入到眼中，从而减轻或逆转导致Leber先天性黑内障(LCA)的病理生理。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因是编码290kDa的中心体蛋白的CEP290基因。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动CEP290基因的表达。该逆转录病毒载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于将矫正性色素性视网膜炎GTP酶调节子(RPGR)基因引入到眼中，从而减轻或逆转导致伴x色素性视网膜炎的病理生理。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因是编码RPGR蛋白的RPGR cDNA。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动RPGR基因的表达。该逆转录病毒载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于将矫正性retinoschisin1(RS1)基因引入到眼中，从而减轻或逆转导致伴x视网膜劈裂症炎的病理生理。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因是编码RS1蛋白的RS1cDNA。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动RS1基因的表达。该逆转录病毒载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于将矫正性色素性视网膜炎1(RP1)基因引入到眼中，从而减轻或逆转导致色素性视网膜炎的病理生理。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因是编码RP1蛋白的RP1cDNA。可以通过CMV启动子、光感受器特异性启动子(如视紫红质激酶)或另选的启动子来驱动RP1基因的表达。该逆转录病毒载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于引入矫正性视网膜色素上皮特异性的65kDa蛋白(RPE65)基因，从而减轻或逆转导致2型Leber先天性黑内障(LCA)的病理生理。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因是编码RPE65蛋白的RPE65cDNA。可以通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子)、或另选的启动子来驱动RPE65基因的表达。该逆转录病毒载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于引入矫正性人富含脯氨酸/精氨酸端部富含亮氨酸的重复蛋白(PRELP)基因，从而减轻或逆转导致湿型年龄相关性黄斑变性(AMD)、干型AMD、糖尿病黄斑水肿或视网膜血管阻塞的病理生理。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因是编码PRELP蛋白的PRELP cDNA。可以通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子)、或另选的启动子来驱动PRELP基因的表达。该逆转录病毒载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于将编码合成肌纤蛋白特异性miRNA的核酸序列引入到眼中，从而通过肌纤蛋白的表达敲减(knock down)，来减轻或逆转导致青少年开角型青光眼的病理生理。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动合成肌纤蛋白特异性miRNA的表达。该逆转录病毒载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于将来自谷胱甘肽生物合成途径的限速酶、谷氨酸半胱氨酸连接酶(GCL)和/或谷胱甘肽合成酶(GSS)，和/或编码合成的γ-谷酰基转移酶(GGT)特异性miRNA的核酸序列引入到眼中，通过基因扩增或敲减，从而减轻或逆转导致色素性视网膜炎的病理生理。该逆转录病毒载体是(例如)衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动GCL和/或GSS基因和/或合成的GGT特异性miRNA的表达。在一个实施方案中，该逆转录病毒载体可利用一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)以双顺反子构型表达基因和/或合成的miRNA。该逆转录病毒载体可以通过直接递送到眼前房来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能够治疗神经变性疾病，如额颞叶痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病和运动神经元失调，例如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)。该逆转录病毒载体递送编码VEGF蛋白的基因，其可以为VEGF-A同工型，如VEGF145、VEGF165或VEGF189；或者可以为VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D，此类基因具有神经保护作用。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用狂犬病G或VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。该逆转录病毒载体可通过直接注射到大肌肉群来施用，或通过鞘内或心室内注射直接注射入脑脊液来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能够治疗囊性纤维化。该逆转录病毒载体递送编码囊性纤维化跨膜传导调节子(CFTR)的基因。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用Flu-HA、Sendai病毒包膜F或HN、埃博拉病毒、杆状病毒GP64或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。该逆转录病毒载体可以利用喷雾器经鼻内施用，或者通过支气管肺泡灌洗直接递送至肺部来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于将矫正性N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)和/或硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)基因引入到脑中，从而减轻或逆转导致Sanfilipo综合征A的病理生理。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因是编码SGSH蛋白的SGSHcDNA，和/或编码SUMF1蛋白的SUMF1基因。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。在一个实施方案中，该逆转录病毒载体可利用内部核糖体进入位点(IRES)以双顺反子构型表达SGSH和SUMF1基因。该逆转录病毒载体可以通过直接脑内注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于将矫正性酸性-α糖苷酶(GAA)引入到大肌肉群和/或肺部，从而减轻或逆转导致庞贝氏病的病理生理。该逆转录病毒载体递送编码GAA蛋白的基因。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用Flu-HA、Sendai病毒包膜F或HN、埃博拉病毒、杆状病毒GP64、狂犬病G、VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。该逆转录病毒载体可以通过(i)直接注射入大肌肉群施用和/或(ii)利用喷雾器经鼻内施用或者通过支气管肺泡灌洗直接递送至肺部来施用。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可以用于利用编码CD19-特异性嵌合抗原受体(CAR19)的核酸序列来离体转导自体或异体T细胞。然后将这些转导的T细胞注入到受试者体内，从而治疗表达CD19的癌症和白血病。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可以通过EF1α、CMV或另选的启动子来驱动CAR编码核酸序列的表达。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可以用于利用编码5T4-特异性嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列来离体转导自体或异体T细胞。然后将这些转导的T细胞注入到受试者体内，从而治疗表达5T4的癌症和白血病。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可以通过EF1α、CMV或另选的启动子来驱动5T4CAR编码核酸序列的表达。
如本领域技术人员已知的那样，嵌合抗原受体(CAR)可以制备成对一系列癌症或白血病相关多肽特异。本发明的逆转录病毒载体可用于利用编码对任意癌症或白血病相关多肽特异的嵌合抗原受体(CAR)的核酸序列来离体转导自体或异体T细胞。然后将这些转导的T细胞注入到受试者体内，以治疗表达CAR结合的癌症或白血病相关多肽的癌症和白血病。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可以通过EF1α启动子、CMV或另选的启动子来驱动编码CAR的核酸序列的表达。可被所述CAR靶定的合适的癌症或白血病相关多肽包括但不限于以下所列物质：间皮素、叶酸受体α、免疫球蛋白的κ轻链、CD30、癌胚抗原(CEA)、CD138、神经节苷脂G2(GD2)、CD33、CD22、表皮生长因子受体(EGFRs)(如EGFR VIII)、IL-13Rα2、CD20、ErbBs(如Her2)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、Lewis Y抗原和成纤维细胞活化蛋白(FAB)。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于利用编码对在患病细胞、白血病细胞或癌细胞中表达的肽-MHC特异的T细胞受体(TCR)的核酸序列来离体转导自体或异体T细胞。然后将这些转导的T细胞注入到受试者体内，以治疗与肽-MHC(TCR与其结合)的表达相关的疾病、癌症和白血病。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可以通过EF1α启动子、CMV或另选的启动子来驱动编码TCR的核酸序列的表达。由本发明的载体编码的的TCR可以是单链TCR(scTCR)或二聚体TCR(dTCR)。如本领域技术人员已知的那样，合适的dTCR包括在WO2003/020763中描述的那些，合适的scTCR包括在WO1999/018129中描述的那些。在该实施方案的具体方面中，用TCR转导的T细胞可用于治疗艾滋病、白血病和癌症(包括骨髓瘤和肉瘤)。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于引入编码常见γ链(CD132)的基因，以治疗伴x重症联合免疫缺陷(SCID)。该逆转录病毒载体是衍生自马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。本发明的逆转录病毒载体可用于离体转导骨髓干细胞。然后，可以将这些转导的骨髓干细胞注入受试者体内以治疗疾病。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可以用于引入编码腺苷脱氨酶的基因，以治疗ADA重症联合免疫缺陷(SCID)。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。本发明的逆转录病毒载体可用于离体转导骨髓干细胞。然后，可以将这些转导的骨髓干细胞注入受试者体内以治疗疾病。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可以用于引入编码WAS蛋白的基因，以治疗Wiskott-Aldrich综合征(WAS)。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。本发明的逆转录病毒载体可用于离体转导骨髓干细胞。然后，可以将这些转导的骨髓干细胞注入受试者体内以治疗疾病。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可以用于引入编码几种球蛋白(包括野生型β球蛋白、野生型胎儿球蛋白和突变的“抗镰状”球蛋白)之一的基因，以治疗镰状细胞病或地中海贫血。如本领域技术人员所已知的那样，抗镰状球蛋白的例子包括但不限于在WO 2014/043131和WO 1996/009385中所描述的那些球蛋白。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。本发明的逆转录病毒载体可用于离体转导骨髓干细胞。然后，可以将这些转导的骨髓干细胞注入受试者体内以治疗疾病。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于将矫正性基因(因子VIII)引入到肝细胞、肌肉细胞或脂肪细胞中，以治疗血友病A。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因为因子VIII。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动因子VIII基因的表达。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于将矫正性基因(因子IX)引入到肝细胞、肌肉细胞或脂肪细胞中，以治疗血友病B。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因为因子IX。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动因子IX基因的表达。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于引入编码α半乳糖苷酶A(α-GAL A)的基因，以治疗法布瑞士症。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因为编码α-GAL A蛋白的GLA cDNA。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。本发明的逆转录病毒载体可用于离体转导CD34+造血干细胞。然后，可以将这些转导的CD34+造血干细胞注入到受试者体内，以治疗疾病。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于引入编码缺陷酶的基因，以治疗卟啉症。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因为编码选自下表中与待治疗的卟啉症种类相关的的缺陷酶的基因。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。
在另一个实施方案中，本发明的逆转录病毒载体可用于引入编码缺陷酶的基因，以治疗一种形式的粘多糖贮积症。该逆转录病毒载体是衍生自人免疫缺陷病毒(HIV)或马传染性贫血病毒(EIAV)的非复制型、自身失活型最小的慢病毒载体，其可用VSV-G或另选的病毒包膜蛋白进行假毒粒化。该逆转录病毒载体所携带的基因为编码选自下表中与待治疗的粘多糖贮积症类型相关的缺陷酶的基因。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。
逆转录病毒治疗性载体的制备
本发明的逆转录病毒载体可以通过用以下四种质粒瞬时转染HEK293T细胞来制备：
(1)重组的逆转录病毒载体基因组质粒，其编码所需的(一个或多个)转基因和能够与RNA结合蛋白相互作用的结合位点，
(2)合成的逆转录病毒gag/pol表达质粒，
(3)包膜(env)表达质粒，其(例如)可以表达VSV-G，
(4)RNA结合蛋白表达质粒。
可供选择地，本发明的逆转录病毒载体(如HIV)可以通过用以下五种质粒瞬时转染HEK293T细胞来制备：
(1)重组的HIV载体基因组质粒，其编码所需的(一个或多个)转基因、能够与RNA结合蛋白相互作用的结合位点以及RRE序列，
(2)合成的gag/pol表达质粒，
(3)包膜(env)表达质粒，其(例如)可以表达VSV-G
(4)RNA结合蛋白表达质粒，
(5)REV表达质粒。
可供选择地，瞬时转染系统可利用稳定表达本发明的RNA结合蛋白(例如，TRAP)的细胞系。
可供选择地，本发明的逆转录病毒载体可通过使用包装细胞来制备，该包装细胞稳定表达(1)gag/pol、(2)env和(3)RNA结合蛋白，对于HIV载体而言，还有Rev，并且其中编码重组逆转录病毒载体基因组的质粒通过瞬时转染被引入到这样的细胞中，所述重组逆转录病毒载体基因组编码所需的(一个或多个)转基因和能够与RNA结合蛋白相互作用的结合位点，对于HIV载体而言，还包括RRE序列。
可供选择地，本发明的逆转录病毒载体可以在生产细胞中制备，所述细胞稳定表达(1)gag/pol、(2)env、(3)RNA结合蛋白和(4)编码所需的(一个或多个)转基因和能够与RNA结合蛋白相互作用的结合位点的重组EIAV载体基因组。
可供选择地，本发明的HIV载体可以在生产细胞中制备，所述细胞稳定表达(1)gag/pol、(2)env、(3)RNA结合蛋白、(4)编码所需的(一个或多个)转基因、能够与RNA结合蛋白相互作用的结合位点以及RRE序列的重组HIV载体基因组和(5)REV。
AAV治疗性载体
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于引入三个编码多巴胺合成途径的三种酶的基因以治疗帕金森病。该AAV载体所携带的基因可包含截短形式的人酪氨酸羟化酶(TH*)基因(其缺乏参与TH反馈调节的N末端160个氨基酸)、人芳族L-氨基酸脱羧酶(AADC)和人GTP-环式水解酶1(CH1)基因。这三种酶可以由AAV载体在三个单独的开放阅读框中编码。可供选择地，AAV载体可以在第一开放阅读框内编码TH和CH1酶的融合蛋白，在第二开放阅读框内编码AADC酶。可以通过CMV启动子驱动基因表达，并且表达盒可包括一个或多个IRES元件。AAV载体可通过直接注射至大脑的纹状体内来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用作这样的基因治疗产品，其被设计成能将矫正性MYO7A基因引入到光感受器和支持性视网膜色素上皮(RPE)细胞，从而减弱或逆转与Usher 1B综合征相关的视力退化。AAV载体所携带的基因是编码MYO7A蛋白的MYO7AcDNA(长度超过100mb的大基因)。可以通过CMV启动子、CMV/MYO7A嵌合启动子或另选的启动子来驱动大的MYO7A基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于将矫正性ATP结合框基因ABCA4(也称为ABCR)引入到光感受器，从而减弱或逆转会导致斯特格(Stargardt)病的病理生理。AAV载体所携带的基因是编码ABCA4蛋白的ABCA4cDNA。可通过CMV启动子、光感受器特异性启动子(如视紫红质激酶)或另选的启动子来驱动ABCA4基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用作这样的基因治疗产品，该产品被设计成能防止湿型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者、糖尿病黄斑水肿患者、视网膜血管阻塞患者眼睛中的异常血管生长和/或血管渗漏的复发，和/或防止干型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者眼睛中的异常血管生长。该AAV载体递送一个或多个编码一种或多种抗血管发生蛋白(如血管生长抑素和/或内皮生长抑素)的基因。在一个实施方案中，AAV载体以双顺反子构型利用内部核糖体进入位点(IRES)表达人内皮生长抑素基因和血管生长抑素基因，以递送到视网膜色素上皮细胞。可通过CMV启动子、RPE特异性启动子(如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子))、或另选的启动子来驱动抗血管发生基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成通过在移植前向供体角膜递送抗血管发生基因来防止由生成新血管导致的角膜移植排斥。在一个实施方案中，AAV载体以双顺反子构型利用内部核糖体进入位点(IRES)表达抗血管发生基因如人内皮生长抑素基因和血管生长抑素基因，以离体递送到角膜移植物。AAV载体可离体应用于角膜移植组织，并且被转导的供体组织在移植之前还可保存。可由组成型启动子如CMV启动子驱动抗血管发生基因的表达，但是还可以使用另选的启动子。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能防止湿型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者、糖尿病黄斑水肿患者、视网膜血管阻塞患者眼睛中的异常血管生长和/或血管渗漏的复发，和/或防止干型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者眼睛中的异常血管生长。该AAV载体递送编码可溶形式的fms-样酪氨酸激酶(可溶性Flt-1)的基因。可通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子)、或另选的启动子来驱动可溶性Flt-1基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能防止湿型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者、糖尿病黄斑水肿患者、视网膜血管阻塞患者眼睛中的异常血管生长和/或血管渗漏的复发，和/或防止干型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者眼睛中的异常血管生长。该AAV载体递送一个或多个编码色素上皮衍生因子蛋白(PEDF)的基因。可通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子)、或另选的启动子来驱动PEDF基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能防止湿型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者、糖尿病黄斑水肿患者、视网膜血管阻塞患者眼睛中的异常血管生长和/或血管渗漏的复发，和/或防止干型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者眼睛中的异常血管生长。该AAV载体递送一个或多个编码血管上皮生长因子(VEGF)抑制剂(如抗VEGF抗体或其结合片段，VEGF的特异性适体或VEGF阻断肽或多肽，包括但不限于，可溶形式的VEGF受体和/或血小板衍生生长因子(PDGF)的抑制剂，如抗PDGF抗体或其结合片段，PDGF特异性适体或PDGF阻断肽或多肽，包括但不限于，可溶形式的PDGF受体)的基因。在一个实施方案中，AAV载体以双顺反子构型利用内部核糖体进入位点(IRES)表达VEGF抑制剂和PDGF抑制剂，以递送到视网膜色素上皮细胞。可通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子)、或另选的启动子来驱动基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于将矫正性基因卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)和编码对疾病相关形式的VMD2特异的micro-RNA(miRNA)的盒、或者编码RDS基因的矫正性外周蛋白2和编码对疾病相关形式的RDS特异的miRNA的盒引入到视网膜色素上皮细胞，从而减轻或逆转导致Best病或Best卵黄样黄斑营养不良(BVMD)的病理生理。可通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子)、或另选的启动子来驱动基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于将矫正性视黄醛结合蛋白1基因(RLBP1)引入到视网膜色素上皮细胞中，从而减轻或逆转导致RLBP1-相关的视网膜营养不良的病理生理。AAV载体所携带的基因是编码RLBP1蛋白的RLBP1cDNA。可以通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子)、或另选的启动子来驱动RLBP1基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能够治疗青光眼。该AAV载体递送编码COX-2和/或前列腺素F2α受体(FPR)的一个或多个基因。在一个实施方案中，AAV载体以双顺反子构型利用内部核糖体进入位点(IRES)表达COX-2和前列腺素F2α受体(FPR)基因，以递送到眼前房。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。AAV载体可以通过角膜注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于引入矫正性harmonin基因，从而减轻或逆转导致Usher综合征1c的病理生理。AAV载体所携带的基因是编码harmonin蛋白的harmonin cDNA。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动harmonin基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于引入矫正性Rab护卫蛋白1(REP1)基因，从而减轻或逆转导致无脉络膜的病理生理。AAV载体所携带的基因是编码REP1蛋白的REP1cDNA。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动REP1基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于将矫正性环式核苷酸门控通道β2(CNGB2)和/或环式核苷酸门控通道α3(CNGA3)基因引入到眼中，从而减轻或逆转导致全色盲的病理生理。AAV载体所携带的基因是编码CNGB2和/或CNGA3蛋白的CNGB2和/或CNGA3基因。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于将矫正性CEP290基因引入到眼中，从而减轻或逆转导致Leber先天性黑内障(LCA)的病理生理。AAV载体所携带的基因是编码290kDa的中心体蛋白的CEP290基因。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动CEP290基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于将矫正性色素性视网膜炎GTP酶调节子(RPGR)基因引入到眼中，从而减轻或逆转导致伴x色素性视网膜炎的病理生理。AAV载体所携带的基因是编码RPGR蛋白的RPGR cDNA。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动RPGR基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于将矫正性retinoschisin 1(RS1)基因引入到眼中，从而减轻或逆转导致伴x视网膜劈裂症炎的病理生理。AAV载体所携带的基因是编码RS1蛋白的RS1cDNA。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动RS1基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于将矫正性色素性视网膜炎1(RP1)基因引入到眼中，从而减轻或逆转导致色素性视网膜炎的病理生理。AAV载体所携带的基因是编码RP1蛋白的RP1cDNA。可以通过CMV启动子、光感受器特异性启动子(如视紫红质激酶)或另选的启动子来驱动RP1基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于引入矫正性视网膜色素上皮特异性的65kDa蛋白(RPE65)基因，从而减轻或逆转导致2型Leber先天性黑内障(LCA)的病理生理。AAV载体所携带的基因是编码RPE65蛋白的RPE65cDNA。可以通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子)、或另选的启动子来驱动RPE65基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于引入矫正性人富含脯氨酸/精氨酸端部富含亮氨酸重复蛋白(PRELP)基因，从而减轻或逆转导致湿型年龄相关性黄斑变性(AMD)、干型AMD、糖尿病黄斑水肿或视网膜血管阻塞的病理生理。AAV载体所携带的基因是编码PRELP蛋白的PRELP cDNA。可以通过CMV启动子、RPE特异性启动子，如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子)、或另选的启动子来驱动PRELP基因的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于将编码合成肌纤蛋白特异性miRNA的核酸序列引入到眼中，从而通过敲减肌纤蛋白的表达来减轻或逆转导致青少年开角型青光眼的病理生理。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动合成肌纤蛋白特异性miRNA的表达。AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于将来自谷胱甘肽生物合成途径的限速酶、谷氨酸-半胱氨酸连接酶(GCL)和/或谷胱甘肽合成酶(GSS)，和/或编码合成的γ-谷酰基转移酶(GGT)特异性miRNA的核酸序列引入到眼中，从而通过基因扩增和/或敲减，减轻或逆转导致色素性视网膜炎的病理生理。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动GCL和/或GSS基因和/或合成的GGT特异性miRNA的表达。在一个实施方案中，AAV载体可以利用一个或多个内部核糖体进入位点(IRES)以双顺反子构型表达基因和/或合成的miRNA。AAV载体可以通过直接递送到眼前房来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能够治疗神经变性疾病，如额颞叶性痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病和运动神经元疾病，例如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)。该AAV载体递送编码VEGF蛋白的基因，其可以为VEGF-A同工型，如VEGF145、VEGF165或VEGF189；或者可以为VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D，此类基因具有神经保护作用。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。该AAV载体可通过直接注射到大肌肉群来施用，或通过鞘内或心室内注射来直接注射入脑脊液来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能够治疗囊性纤维化。该AAV载体递送编码囊性纤维化跨膜传导调节子(CFTR)的基因。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。AAV载体可以利用喷雾器经由鼻内施用，或者经由支气管肺泡灌洗直接递送至肺部。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于将矫正性N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶(SGSH)和/或硫酸酯酶修饰因子1(SUMF1)基因引入到脑中，从而减轻或逆转导致Sanfilipo综合征A的病理生理。AAV载体所携带的基因是编码SGSH蛋白的SGSH cDNA，和/或编码SUMF1蛋白的SUMF1基因。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。在一个实施方案中，AAV载体利用内部核糖体进入位点(IRES)以双顺反子构型表达SGSH和SUMF1基因。AAV载体可以通过直接在大脑内注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于将矫正性酸性-α糖苷酶(GAA)基因引入到大肌肉群和/或肺部，从而减轻或逆转导致庞贝氏病的病理生理。该AAV载体递送编码GAA蛋白的基因。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。AAV载体可以通过(i)直接注射入大肌肉群来施用，和/或(ii)利用喷雾器经由鼻内施用或者经由支气管肺泡灌洗直接递送至肺部来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于将矫正性基因(因子VIII)引入到肝细胞、肌肉细胞或脂肪细胞中，以治疗血友病A。AAV载体所携带的基因为因子VIII。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动因子VIII基因的表达。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于将矫正性基因(因子IX)引入到肝细胞、肌肉细胞或脂肪细胞中，以治疗血友病B。AAV载体所携带的基因为因子IX。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动因子IX基因的表达。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于引入编码缺陷酶的基因，以治疗某种形式的卟啉症。AAV载体所携带的基因为编码选自下表中与待治疗的卟啉症种类相关的缺陷酶的基因。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。
卟啉症类型 缺陷酶
伴x铁粒幼细胞贫血(XLSA) δ-氨基乙酰丙酸(ALA)合酶
Doss卟啉症/ALA脱水酶缺陷 δ-氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD)
急性间歇性卟啉症(AIP) 羟甲基胆色烷(HMB)合酶
先天性红细胞生成性卟啉症(CEP) 尿卟啉原(URO)合酶
迟发性皮肤卟啉症(PCT) 尿卟啉原(URO)脱羧酶
遗传性粪卟啉症(HCP) 粪卟啉原(COPRO)氧化酶
混合型卟啉症(VP) 原卟啉原(PROTO)氧化酶
红细胞生成性原卟啉症(EPP) 铁螯合酶
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用于引入编码缺陷酶的基因，以治疗某种形式的粘多糖贮积症。AAV载体所携带的基因为编码选自下表中与待治疗类型的粘多糖贮积症相关的缺陷酶的基因。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能防止湿型年龄相关性黄斑变性(AMD)患者眼睛水肿中的异常血管生长的复发。该AAV载体递送一个或多个编码一种或多种抗血管发生蛋白(如血管生长抑素和/或内皮生长抑素)的基因。在一个实施方案中，AAV载体以双顺反子构型利用内部核糖体进入位点(IRES)表达人内皮生长抑素基因和血管生长抑素基因，以递送到视网膜色素上皮细胞。可通过CMV启动子、RPE特异性启动子(如卵黄样黄斑营养不良2(VMD2)启动子(近来称为斑萎蛋白启动子))、或另选的启动子来驱动抗血管发生基因的表达。该AAV载体可通过在眼睛的玻璃体切除术后进行直接视网膜下注射来施用。
在另一个实施方案中，本发明的AAV载体可用作这样的基因治疗产品，该产品设计成能够治疗神经变性疾病，如额颞叶性痴呆、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病和运动神经元疾病，例如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)。该AAV载体递送编码VEGF蛋白的基因，其可以为VEGF-A同工型，如VEGF145、VEGF165或VEGF189；或者可以为VEGF-B、VEGF-C或VEGF-D，此类基因具有神经保护作用。可以通过CMV启动子或另选的启动子来驱动基因的表达。该AAV载体可通过心室内或鞘内注射来直接注射入浸在脊髓中的脑脊液来施用。
治疗方法
本发明的另一个方面涉及一种治疗方法，包括向有此需要的对象施用本发明的病毒载体或转导有本发明的病毒载体的细胞。
应当理解，本文中提及的治疗包括治愈、缓解和预防性治疗；尽管在本发明的正文中所提及的预防通常与预防性治疗更加相关。治疗还包括阻止或减缓疾病进展。哺乳动物的治疗是特别优选的。人类和兽医治疗在本发明的范围之内。
在一个实施方案中，本发明的病毒载体或病毒载体颗粒可以用作疫苗。该疫苗例如可以是基于病毒的人用或兽用疫苗(例如流感和新城疫病毒疫苗)。
本发明也可以是特定用途的，其中疫苗基于携带有转基因的具有改造能力的病毒。
如上所讨论的，禽类生产细胞可以用于用作疫苗的病毒载体和病毒载体颗粒的生产。
药物组合物
本发明的另一个方面涉及一种药物组合物，其包括本发明的病毒载体或者转导有本发明的病毒载体的细胞或组织，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
本发明提供了用于通过基因疗法治疗个体的药物组合物，其中所述组合物包含治疗有效量的载体。该药物组合物可用于人体或动物用途。
所述组合物可以包含药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。药用载体、赋形剂或稀释剂的选择可以根据预定的给药途径和标准的药物实践来进行。所述药用组合物可以包含载体、赋形剂或稀释剂，或除此之外还包含任何合适的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、包衣剂、增溶剂和可以辅助或促进载体进入靶位点的其它载体试剂(诸如脂质递送系统)。
在适当的情况下，所述药用组合物可以通过以下任何一种或多种方式施用：吸入；栓剂或阴道栓剂形式；以洗剂、溶液剂、乳膏、软膏或撒布粉剂(dusting powder)形式局部施用；通过使用皮肤贴剂；口服，为含赋形剂(诸如淀粉或乳糖)的片剂形式、或单独的或与赋形剂混合的胶囊或原卵(ovule)形式、或含调味剂或着色剂的酏剂、溶液剂或悬浮剂形式；或它们可以胃肠外注射，例如经阴茎海绵体内、静脉内、肌内、颅内、眼内或皮下注射。对于胃肠外施用，所述组合物最好以无菌水溶液形式使用，所述无菌水溶液可以含有其它物质，例如足够的盐或单糖，使得溶液与血液等渗。对于口腔或舌下给药，所述组合物可以用常规方法配制的片剂或锭剂形式施用。
本发明的载体可用于离体转导靶细胞或靶组织，然后将所述靶细胞或靶组织转移到需要治疗的患者体内。这种细胞的实例可以为自体T细胞，这种组织的实例可以是供体角膜。
筛选方法
本发明的另一个方面涉及一种识别核酸结合位点和/或相应的核酸结合蛋白的方法，当与核酸结合位点有效连接时，所述核酸结合位点能够与所述核酸结合蛋白相互作用，从而在病毒载体生产细胞内抑制或阻止目的核苷酸的翻译，其中所述方法包括分析细胞中的报告基因的表达，所述细胞包含与报告基因有效连接的核酸结合位点以及核酸结合蛋白。
该方法使得可以识别新的RNA结合蛋白和它们相应的结合位点，这对于本发明而言是有用的。该方法还可以识别已知RNA结合蛋白或结合位点的变体。
在一个实施方案中，所述方法能够识别与TRAP相互作用的结合位点。
在另一个实施方案中，所述方法能够识别与结合位点相互作用的核酸结合蛋白，所述结合位点能够结合TRAP。
在一个实施方案中，报告基因编码荧光蛋白。
在另一个实施方案中，报告基因编码阳性细胞生长选择标记，例如能够使细胞抗ZeocinTM的sh ble基因产物。
在另一个实施方案中，报告基因编码负细胞生长选择标记，例如，单纯疱疹病毒胸苷激酶基因产物，其在更昔洛韦(Ganciclovir)的存在下导致细胞死亡。
筛选用于改善功能性的TRAP-结合位点(tbs)的实例如下所述：
-合成简并DNA文库，其包含8个RAGNN序列重复或总共8个的RAGNN和RAGNNN重复。
-在报告基因盒(如GFP)的5’UTR内(优选在ORF的12个核苷酸内)克隆文库。连接文库的报告基因可选择地克隆到逆转录病毒载体基因组中和产生的逆转录病毒载体文库中。
-将连接文库的报告基因盒稳定地引入到细胞系中(这可以通过转染或逆转录病毒载体递送得以实现)，并分离单个克隆。
-使用对照DNA(例如，pBlueScript)或TRAP表达质粒DNA，通过平行转染筛选克隆。在这两种情况下测量报告基因的表达，并鉴定具有高的、无抑制的报告基因水平的克隆(对照)和具有低的、抑制的报告基因水平的克隆(TRAP)。
-通过PCR扩增识别tbs序列，并对来自候选克隆的靶细胞基因组DNA的tbs序列进行测序。
实施例
方案、数据分析和报告的说明
(tbs)GFP报告基因和TRAP-表达质粒的瞬时共转染
使用Lipofectamine 2000CD，用pCMV-GFP或pCMV-tbsGFP(或其变体)与TRAP-表达质粒质粒一起共转染HEK293T细胞，从而进行对TRAP-tbs结构的检测。使用填充DNA(pBlueScript)将DNA的量标准化为每10cm板中总DNA的量为6.1μg(在转染前24小时，利用3.5x106个细胞进行预接种)。当使用多孔板时，根据组织培养皿的面积将这些参数按比例下调(scaleddown)。进行转染，一式三份。在各实验中示出GFP-报告质粒与TRAP-表达质粒的摩尔比。转染18小时后更换培养基，并且在转染后48小时对活细胞进行GFP分析。
典型的逆转录(慢)-病毒载体生产方案
利用Lipofectamine 2000CD，使用3种载体元件，通过瞬时转染HEK293T细胞来生产载体；pDNA的比例为：每10cm板(该板在转染前24小时，利用3.5x106个细胞进行预接种)，4μg载体基因组、2μg GagPol、0.1μg VSVG质粒——根据皿面积将这些参数按比例下调。TRAP质粒或填充质粒(pBlueScript)与载体基因组之间以所述的摩尔比进行共转染，例如，载体基因组质粒与TRAP质粒的摩尔比为10:1，质量比为4μg载体基因组：0.28μg TRAP质粒。转染后第2天，以10mM的终浓度添加丁酸钠，6小时后更换新鲜的培养基；20-24小时之后取含有载体的收获上清液。为了生产编码GFP的载体，转染后48小时对活细胞进行GFP分析。用于免疫印迹的最终载体(End-of-vector)生产细胞样品通常由分级缓冲液(130mM NaCl，20mM Tris-HCl[pH7.4]，2mM EDTA，0.2％IEGPAL)制成，并且通过离心除去细胞核。通过0.45μm的过滤器过滤载体收获上清液，并将其储存在-80℃，之后进行载体滴定试验。通过靶细胞的转导对编码GFP的载体进行滴定，并且3天后通过流式细胞术进行分析(参见下文)。在转导后10天，通过宿主细胞DNA的qPCR(DNA整合分析；参见下文)对治疗性载体进行滴定，或者在转导后3天，通过对转基因产物的免疫荧光法对治疗性载体进行滴定。
转染的细胞群内总GFP蛋白的评估
主要用流式细胞术进行GFP阳性细胞的分析，流式细胞术能够灵敏的量化群体中GFP阳性细胞的百分比以及每个细胞中GFP表达的程度，其以中值荧光强度进行测定。应当注意的是，通过GFP阳性细胞数目的百分比乘以中值荧光强度(MFI；任意单位)来产生“表达评分”，从而报告转染的细胞群中总体GFP表达的量。我们相信该测量很好的代表了转染的细胞群内GFP蛋白表达的总水平——基本上假定转染的细胞群内GFP表达水平是正态分布的，因此近似于“曲线下面积”。这样做是因为仅基于阳性百分比或MFI来报告GFP表达受限于所分析的群体的“描述”(参见图5的解释)。因此“抑制倍数”是TRAP对GFP翻译影响的一种度量，并且其通过用“填充”对照的表达评分除以相关TRAP-表达质粒检测样品的表达评分来计算。
SDS-PAGE和免疫印迹
收获载体之后，主要对最终载体生产细胞进行标准SDS-PAGE和免疫印迹实验。为了进行载体颗粒的免疫印迹分析，将～2mL过滤的载体上清液在小型离心机(microfuge)中，在4C下以21,000rpm离心1-2小时，之后将“小团”重新悬浮于20-30μL的PBS中。通过PERT检验(下述)对这些浓缩的载体制备物进行定量，每个SDS-PAGE凝胶孔中装载通过PERT预测为7x104TU的载体。在200μL的分级缓冲液中将大约1x106个最终载体生产细胞裂解，并且通过离心除去细胞核。通过BioRa测定对蛋白样品进行定量，通常将5μg的蛋白加载于预制的12-15孔的4-20％丙烯酰胺凝胶中。在冰上以45V将蛋白转移到硝酸纤维素上，进行3小时。在4℃下，在5％牛奶PBS/吐温20中封闭印迹过夜。利用初级抗体和HRP二极抗体对印迹进行检测，这些抗体通常以封闭缓冲液进行1:100稀释。通过ECL检测对免疫印迹进行分析，接着进行X射线膜曝光。
逆转录病毒载体滴定
-整合检验
将收获的、过滤后的载体上清液在培养基中以1:5稀释，之后在存在8μg/mL聚凝胺(polybrene)的情况下，使用0.5mL体积转导1x105HEK293T细胞，规模为12个孔。将培养物传代10天(每2-3天以1:5分裂)，之后由1x106个细胞的小团中提取宿主DNA。使用FAM引物/探针进行定量PCR，得到EIAV包装信号(ψ)，并使用以下因素计算载体滴度(TU/mL)：转导体积、载体稀释度、每个细胞检测到的ψ拷贝和所表征的“单拷贝ψ”对照细胞系的每个细胞所检测到的ψ拷贝。
-GFP-报告基因检验
将收获的、过滤后的编码GFP的载体上清液在培养基中以1:10至1:160进行稀释，之后在存在8μg/mL聚凝胺的情况下，使用0.25mL体积转导5x104HEK293T细胞或3.74x104D17细胞，规模为24孔。在转导后3天，使用FACS Verse或FACS Calibur在制造商建议的设置下通过流式细胞术对培养物进行分析：捕获10,000个结果，并且使用DEAD/LIVE混合对照，基于SSC/FSC 2D绘图和/或ToPro3染色去除(out-gate)死亡细胞。
-免疫荧光(IF)检验(生物学滴定)
将收获的、过滤后的编码OXB-102的载体上清液在培养基中以1:2至1:8进行稀释，之后在存在8μg/mL聚凝胺的情况下，使用0.5mL体积转导1x105HEK293T细胞，规模为12孔。培养物培养3天，随后对固定的穿透化(permeablised)的细胞进行IF。使用在穿透化缓冲液中以1:500的稀释度稀释的酪氨酸羟化酶(TH)初级抗体和Alexa-488二级抗体。
-LacZ-报告基因检验
为了进行LacZ-载体混合实验，对收获的、过滤后的载体上清液进行10倍连续稀释至因数为10-5，之后在12孔板中，使用0.5mL体积的10-2、10-3、10-4和10-5稀释的载体转导D17细胞，在转导前24小时，所述12孔板已经预接种了7.5x104个细胞。在转导后3天，通过固定和添加X-Gal对培养物进行分析，接着计数蓝色菌落，从而得到滴度(LFU TU/mL)。
-PERT检验
在其他地方已经对PERT检验进行了描述(参见“Arnold BA,等，1998,Biotechniques 25:98-106”)。PERT预测的滴度(PERT-TU/mL)是基于RT活性的任意物理颗粒滴度，该RT活性与在PERT检验中用作qRT-PCR标准曲线的编码GFP的EIAV载体制备物的生物学滴度相关。
通过载体基因组混合实验评估在生产细胞内表达转基因产物对逆转录病毒/慢病毒载体生产的影响。
为了评估目的核苷酸转基因产物对细胞生产逆转录病毒载体的负面影响程度，如图2所示，可以进行简单的载体基因组混合实验。可以利用报告基因载体基因组质粒(如lacZ或GFP转基因)与表达目的核苷酸的载体基因组质粒的混合物，连同图1所描述的载体包装元件一起来进行上述“逆(慢)病毒载体生产方案”。通常接受的是，载体生产细胞(例如HEK293T)中报告蛋白lacZ或GFP的表达不会不利地影响所产生的载体颗粒的滴度或特定活性；因此，能够以高滴度制造编码这些报告基因的载体。因此，将编码具有这种报告基因的载体基因组的质粒与编码确实影响载体滴度的转基因的载体基因组的质粒混合，使得能够在靶细胞中利用报告基因活性作为读出数据在一定程度上测定载体滴度的影响。这是因为来自“有问题”转基因蛋白的影响将对报告基因载体滴度具有“旁观者”效应，因为所有的载体颗粒会利用相同的用于病毒粒子组装的细胞机制/通路在相同的细胞中制成。在转染中使用的报告基因与目的核苷酸载体基因组质粒的比率通常在1:1和1:5之间。注意，由于逆转录病毒载体颗粒为每个病毒粒子包装两个拷贝的基因组RNA，因此即使在生产细胞内由两种不同的载体基因组质粒表达两种没有问题的蛋白(例如，Lac Z和GFP)，也会对报告基因特定的载体滴度产生“稀释”效果。例如，当使用的lacZ和GFP载体基因组质粒的比例为1:1时，概率定律指出25％的病毒粒子将包含两个拷贝的lacZ载体RNA，25％将包含两个拷贝的GFP载体RNA，剩余的50％的病毒粒子将包含每种载体RNA中的一个。在后一种情况下，两种基因组RNA分子仅有一种将被逆转录成DNA，所以有50:50的机会报告基因载体基因组将被整合到靶细胞中，从而表达所述报告基因。合起来看，这意味着当两种载体基因组质粒以1:1的比例混合时，相比于单一载体基因组制备物的产量而言，特定的报告基因载体滴度将降低2倍。当使用更高的混合比(例如1:5)时，稀释效果将更显著。为此，混合两种报告基因载体基因组质粒作为稀释效果的“混合”对照，并列评估任意混合的报告基因载体基因组质粒与表达目的核苷酸转基因的载体基因组质粒。
举例来说，图3i和3ii示出了各种载体基因组质粒混合实验的数据，所述实验利用lacZ报告基因载体基因组质粒，并且根据靶细胞中的X-gal染色读出载体滴度。所测试的大多数载体基因组质粒(包括StarGenTM、和的质粒以及表达COX-2和/或FPR的载体)对载体滴度产生7至100倍的影响，这取决于所采用的lacZ载体质粒对测试载体质粒的比例。这些数据清楚的表明与报告基因载体相比，用临床相关的载体观察到在载体生产细胞内转基因蛋白的表达显著降低载体滴度。
本发明的逆转录病毒载体生产；载体生产细胞中的翻译抑制[TRIP]系统的说明
图4展示了将载体生产细胞中的翻译抑制[TRIP]系统应用到逆转录/慢病毒载体生产中的简化示意图。描述在其他病毒载体系统(例如，基于腺病毒和AAV载体的载体)中抑制转基因翻译所必须的元件的TRIP系统可以被描述为包括病毒特异性包装元件。除了必需的载体元件之外，所有这样的TRIP系统必须包含以下两种元件：TRAP表达盒和插入在目的核苷酸转基因的5'UTR内的TRAP-结合位点(tbs)，从而在TRAP存在时，抑制目的蛋白质的产生。TRAP可以调节载体基因组分子中的多个目的核苷酸ORF，即，载体基因组可以是多顺式的(例如含有IRES元件)，并且不止一个ORF可具有插入在其翻译起始密码子上游(例如在IRES和下游的OFR之间)的TRAP-结合位点。
关键实验的描述
使用GFP质粒和表达GFP的慢病毒载体基因组质粒对TRAP/tbs的结构进行的最初检测
实施例1.检测与TRAP-表达质粒瞬时共转染中的GFP表达调控
如图6所示，构建了GFP报告基因构建体pCMV-tbsGFP。将TRAP结合序列(tbs)插入到该构建体中，从而5’UTR编码(从5'至3')41nt的前导序列、55nt tbs和紧挨GFP ATG密码子上游的编码Kozak共有序列的9nt的区域。这些GFP报告基因构建体衍生自实验用EIAV载体基因组pONY8.4RC-GFP，并且删除两个CMV启动子之间的区域而得(参见图6)。
更具体而言，关于荧光基因表达报告基因的细节，选择GFP报告基因用于初期评价实验，从而能够通过流式细胞术进行较快速的基因调控评估。对于载体生产而言，GFP不已知是有毒的或有害的，而是将其用作通过TRAP/tbs的基因表达调控的敏感模型。此外，现有的载体基因组pONY8.4RC-GFP可用于操作；如图6所示，该载体利用了位于3'LTR中的野生型EIAV U3和位于内部转基因盒上游的DsRED-表达ORF。因此，该载体基因组质粒能够在载体生产细胞内进行GFP和DsRed-表达的表达。
所有这些报告基因构建体含有野生型EIAV LTR，其允许由强CMV启动子转录而来的mRNA进行多聚腺苷酸化。因此，在HEK293T细胞中由pCMV-tbsGFP和对照质粒pCMV-GFP两者的GFP表达都是强表达(参见图8和9)。
利用来自枯草芽孢杆菌的经密码子/序列优化以在人细胞中高表达的TRAP ORF构建TRAP表达构建体。在更详细而言，图7示出了最初在瞬时转染实验中评价的TRAP表达质粒的种类。由于TRAP蛋白是细菌来源的，因此公众可得的核苷酸序列是在mtrB/TrpBP“转录衰减蛋白基因家族”操纵子中编码的细菌序列。然而，为了潜在地增加在哺乳动物细胞中的表达，并且为了消除任何次优序列(例如拼接-供体/受体位点)，对TRAP核苷酸序列进行密码子/序列优化以在人中表达。设计合成序列以克隆到pCI-NEO中，以产生pCI-coTRAP。设置SapI位点，从而通过消化和再环化使HIS6标签融合到TRAP蛋白的C-末端。这最终产生了pCI-coTRAP[H6]。以前使用非密码子优化的TRAP表达质粒的报道也使用了C末端HIS6标记的TRAP，并且没有损害TRAP的功能。由于目前还没有可商购的TRAP抗体，所以在实验过程中，用HIS6标记的TRAP确定TRAP的表达水平。
第一组实验利用了不带标签的TRAP和C末端HIS6标记的TRAP。利用TRAP+/-His6-标签质粒和tbs-GFP报告基因构建体共转染的实验表明，两个版本的TRAP都能够在HEK293T细胞中抑制由pCMV-tbsGFP的GFP表达(图8和图9)。当TRAP质粒和报告基因以1:1的比例进行共转染时(图9B)，TRAP和TRAP[H6]分别以3倍和27倍抑制GFP的表达。即使当TRAP质粒以这一剂量10倍(即10:1的摩尔比(报告基因:TRAP))进行共转染时也观察到了一些最低抑制。两个版本的TRAP都没有对pCMV-GFP的GFP表达产生影响，表明tbs对于TRAP介导的抑制来说是必不可少的。
实施例2.TRAP-表达质粒表达的优化
由基于pCI-Neo的质粒的表达可能主动或被动地与其他的CMV驱动的DNA盒竞争。由于此原因，认为pCI-coTRAP[H6]与pCMV-tbsGFP以1/10的剂量进行共转染将会进行这种类型的竞争，因为pCI-Neo也用作使DNA负载标准化的填充DNA(该实验后，将pBlueScript用作用于其他所有实验的标准填充DNA)。因此，如上所述制备了EF1a驱动的构建体pEF1a-coTRAP[H6]，并且与pCMV-tbsGFP以不同的比例在共转染中进行了检测。图9D总结了在利用pCI-coTRAP[H6]或pEF1a-coTRAP[H6]和GFP报告基因构建体共转染的细胞中GFP的抑制情况。这些数据表明，与pCI-coTRAP[H6]形成对比，pEF1a-coTRAP[H6]能够以1/10的剂量与tbs-GFP报告基因DNA一起进行共转染，并且保持以1:1的比例共转染时所观察到的GFP抑制水平(在此情况中，比较了MFI数据)。因此，EF1a-启动子在驱动TRAP表达方面可能是更优选的。
由于克隆pCI-coTRAP和pCI-coTRAP[H6]的方法，这些构建体的3’UTR不是相同的(图7)，所以所观察到的两种构建体在功能上的差异的潜在原因可能是由于TRAP mRNA/蛋白水平不同，而不是由于任何氨基酸的不同。为了评估TRAP上的C-末端HIS6标签是否对功能性而言是重要的，从pEF1a-coTRAP[H6]中除去该序列构建了pEF1a-coTRAP(图7)；除了HIS6标签序列之外，这些构建体是相同的。通过与tbs-GFP报告质粒以不同的比例共转染HEK293T细胞，将pEF1a-coTRAP[H6]和pEF1a-coTRAP直接进行比较(图10)。
这些数据表明，当与含tbs的GFP报告质粒以1:1或1:0.1的摩尔比一起应用时，HIS6-标记的和未标记的TRAP蛋白能够将GFP表达抑制到几乎不可检测的水平。在所有表达的测定中，未标记的TRAP版本的抑制效果比TRAP[H6]低2倍。因此，与未标记的TRAP相比，HIS6标签可以提供一些微小的优势；这可能是由于蛋白质稳定性、和/或溶解度/折叠和/或功能性(例如，RNA结合)的增强。
实施例3.不同TRAP同系物的评价
除了枯草芽孢杆菌的TRAP，已经示出两种其他TRAP同系物对于用pCMV-tbsGFP和TRAP-表达质粒共转染的细胞，能够介导GFP表达的抑制(图11A)。对来自热液口脱硫肠状菌(Desulfotomaculum hydrothermale)和寡食胺单胞菌(Aminomonas paucivorans)的TRAP基因进行密码子/序列优化，并克隆到基于pEF1a的表达质粒中；这些变体都包括C末端HIS6标签。这些TRAP变体与枯草芽孢杆菌的TRAP分别共享75％和55％的氨基酸同源性。所有这三个变体都能够以大约2Log来抑制HEK293T细胞中GFP的表达，这表明仅具有55％序列同源性的TRAP同系物能够在TRIP系统中发挥作用。所有这三个同系物在涉及RNA和色氨酸结合位点的序列中都是保守的(数据未显示)。
实施例3b.不同TRAP同系物及变体的评价
为了检测来自除了枯草芽孢杆菌之外的菌株的TRAP的同系物是否能够在抑制系统中发挥作用，从NCBI数据库中鉴定了5种TRAP变体，这些变体与枯草芽孢杆菌TRAP具有不同的序列同一性(图21i)。这些变体代表了跨细菌谱系的广泛的不同的TRAP变体。为了在人类细胞中高度表达，对这些TRAP变体的基因序列进行了密码子优化，并使其包括C末端HIS6(类似于之前的显示出TRAP介导的抑制增强的枯草芽孢杆菌TRAP[H6]；图10)，并将其克隆到pEF1a-启动子质粒中(图7)。耐盐芽孢杆菌(B.Halodurans)TRAP变体形成天然的12-mer(参见“Bayfield,O.W等，(2012)PLoS ONE 7：e44309.doi:10.1371/journal.pone.0044309”)，这潜在地表明，tbs内的12个RAGNN重复可以被该TRAP所结合。还表明，可以通过在蛋白质的C末端进行修饰从而对天然11-mer TRAP变体的人工12-mer的版本进行改造。通过X射线结晶学判断，显示嗜热脂肪地芽孢杆菌(BacillusStearothermophilus)TRAP的S72N修饰产生了12-mer蛋白(参见文献“ayfield,O.W.et al，(2012)PLoS ONE 7:e44309.doi:10.1371/journal.pone.0044309”)，尽管在细胞环境中是否形成了11-mer或12-mer的这些变体还尚未已知。还构建了嗜热脂肪地芽孢杆菌TRAP-S72N变体，并且与其他TRAP同系物一起在TRAP抑制系统中对它们的潜在功能进行了检测。使用了包含11x RAGNN或12xRAGNN重复tbs的两种GFP报告质粒；据假设，与11-mer对于pCMV-tbsx11GFP报告基因的抑制相比，12-mer的TRAP可能会在更大程度上抑制来自pCMV-tbsx12GFP报告基因的转基因表达。
在图21iiA-B中示出了来自不同的TRAP同系物和嗜热脂肪地芽孢杆菌TRAP-S72N变体的比较数据。所有的同系物和嗜热脂肪地芽孢杆菌TRAP-S72N变体都能够至少10倍抑制GFP。鉴于这些TRAP同系物之间的较低的氨基酸序列同源性(与枯草芽孢杆菌TRAP具有56-78％的同源性；见图21iii)，这表明来自多种细菌菌种的TRAP蛋白形成相似的四级结构，该结构是在哺乳动物细胞中与tbs RNA序列相互作用所需的。所有同系物含有已知对于与RNA和L-色氨酸结合进行接触而言重要的氨基酸残基；然而，预计L-色氨酸结合突变体也将在TRAP介导的抑制结构中发挥作用，该突变体组成性地结合tbs-RNA(甚至在没有L-色氨酸的情况下)，如枯草芽孢杆菌TRAP T30V(参见“Yakhnin et al，(2000)J.Biol.Chem.275:4519-4524”)。
实施例4.稳定HEK293T-TRAP细胞系中转基因抑制的评价
为了在TRAP稳定表达细胞系的情况中评价TRAP介导的转基因表达抑制，制备了构建体pEF1a-coTRAP[H6]-iBsr，并将其用于稳定转染HEK293T细胞，通过杀稻瘟菌素进行选择(图11B)。从约100个稳定的克隆中，分离4种亚克隆HEK293T-TRAP[H6]细胞系2F、10H、7E和3D，并检测它们抑制由转染的pCMV-tbsGFP表达GFP的能力。培养物与填充质粒或pEF1a-coTRAP[H6]质粒共转染，以评估TRAP[H6]的内源性水平是否能够实现与瞬时转染TRAP表达质粒所观察到水平的相同的GFP抑制水平。这些数据表明，相比于用TRAP-表达质粒瞬时转染的HEK293T细胞，TRAP稳定表达细胞系由内源性的TRAP能够实现相似水平的转基因抑制(大约2Log)。然而，当瞬时转染额外的TRAP表达质粒时，在HEK293T-TRAP[H6]克隆中能够观察到甚至更高水平的转基因抑制(大约4Log)。该效果的原因可能是由于在HEK293T-TRAP[H6]克隆细胞中预先存在的TRAP池。为了进一步地解释，在瞬时转染的情况下，会出现pCMV-tbsGFP和pEF1a-coTRAP[H6]共转染后的早期，积累了不充足的TRAP[H6]蛋白，这导致在TRAP介导的pCMV-tbsGFP-衍生的mRNA抑制之前，产生了少但可测量的量的GFP表达。在HEK293T-TRAP[H6]细胞中没有观察到这种少量的GFP表达，因为预先存在的TRAP[H6]池可以从出现tbsGFP mRNA开始立即对其发挥作用。这种作用与额外的TRAP表达质粒一起使得在稳定TRAP细胞系中对GFP表达具有更大的“抑制倍数”。这表明，在稳定细胞系中，TRAP[H6]的最大表达量没有像在瞬时转染的HEK293T细胞中所观察到的那样高(这一点已经通过对TRAP[H6]的免疫印迹进行了证实，数据没有示出)。然而，可能的是，TRAP[H6]稳定细胞系以超过2Log来抑制转基因表达的能力将足以提高载体滴度。
实施例4b.稳定表达TRAP[H6]的HEK293T细胞系的开发以及其在载体生产中的用途
该实施例建立在实施例4的基础上，并提供了关于如何开发TRAP[H6]稳定细胞系的更多的信息。利用EF1a-coTRAP[H6]-iBsr表达盒稳定转染HEK293T细胞(图22i)并通过杀稻瘟素筛选分离克隆。这些稳定表达TRAP[H6](枯草芽孢杆菌)的克隆被亚克隆两次，然后通过转染pCMV-GFP(无抑制)或pCMV-tbsGFP来筛选抑制功能性。通过产生的表达评分(图22iiA；MFI x GFP％)来估计细胞群中的总GFP表达。在抑制条件下(即，存在TRAP)，四种克隆(2F、10H、7E和3D)被鉴定为具有高达2-Log的抑制活性以及低的、绝对的GFP表达评分。稳定克隆内的GFP转基因抑制水平与在细胞中检测到的TRAP[H6]水平之间具有相当好的相关性(图22iiB)。这些数据表明，TRAP的表达对HEK293T细胞没有毒性，并且表明“HEK293T.TRIP”细胞(稳定表达TRAP；也称为“HEK293T.TRAP')能够以之前在TRAP质粒的瞬时转染中所观察到的类似的方式抑制转基因的表达。
我们在另一个实施例中表明，与标准载体生产系统相比，该TRIP系统可以提高ReQuinate(一种表达huFactorVIII的EIAV载体)的载体滴度(图17)。HuFactorVIII阻碍VSVG掺入EIAV载体病毒粒子。理论上认为，与瞬时TRIP系统(即，“pTRAP”质粒和载体组件共转染)相比，稳定的TRIP系统(即整合的TRAP盒)可以改善转基因抑制的时间。这是因为在稳定细胞中预先存在的TRAP蛋白池会立即实现对转基因的抑制，而在瞬时系统“pTRAP”中则需要表达，直到出现足以抑制转基因mRNA的TRAP蛋白水平；因此，在该早期，可能会发生转基因的一些“渗漏”表达，并可能对活性载体产生负面影响。为了检测这一点，进行了载体混合实验，其中在利用载体组件+/-pEF1a-coTRAP[H6]对细胞进行转染的过程中，EIAV-[tbs]GFP和EIAV-[tbs]FVIII(也称为ReQuinate-tbs)基因组以50:50进行混合。因此，huFVIII的表达对EIAV载体病毒粒子总体活性的任何负面影响将可以在EIAV-GFP载体滴度上进行衡量。对HEK293T细胞和稳定HEK293T.TRIP细胞系2F、10H、7E和3D进行了检测。通过流式细胞术对形成GFP表达的最终生产细胞进行分析(图22iiiA)，并且对新鲜的HEK293T细胞滴定所产生的粗载体，也通过流式细胞术进行分析(图22iiiB)。
图22iiiA的数据表明，相比于瞬时TRIP系统，稳定表达TRAP的细胞能够更大程度地抑制转基因；在HEK293T.TRIP-10H中GFP的表达降低1000倍(图22iiiA；比较EIAV-GFP与EIAV-tbsGFP基因组)。生产细胞中GFP(通过扩展，huFVIII)的抑制程度与产生的载体滴度相关(参见图22iiiB)。总体上，与瞬时TRIP系统相比，HEK293T.TRIP稳定细胞系产生约3倍的更高的滴度。虽然在HEK293T.TRIP稳定细胞系(+TRAP TXN)中，额外的TRAP表达能够进一步抑制转基因表达，但是这并没有转化为该特定转基因编码载体的进一步提高的滴度。因此，可能的是，在该实施例中相比于瞬时系统(即，表达huFVIII的载体)，预先存在的TRAP池(而不是最大的TRAP蛋白本身)提高了载体滴度。可能的是，对更有问题/有毒的转基因的抑制将受益于载体生产期间预先存在的和高水平的TRAP。
通过免疫印迹法对从EIAV-[tbs]GFP|EIAV-[tbs]huFVIII生产细胞中收获的包含载体颗粒的上清液进行VSVG含量分析(图22iv)。这些数据表明，只有当将tbs用于载体基因组并且在载体生产过程中供应TRAP(反式-HEK293T+pEF1a-coTRAP[H6]或通过稳定的TRAP表达)时才能够使VSVG掺入到载体颗粒中。
实施例5.检测TRIP系统对编码GFP的慢病毒载体的生产的影响
该实验的目的是评价在载体基因组内存在tbs的潜在影响。展开来说，由于TRAP能够结合载体基因组RNA分子(以及转基因的mRNA)内的tbs，并因此被包装入新(de novo)载体病毒粒子，因此合理预期的是逆转录的过程将受到不利影响。该TRAP-tbs的相互作用具有特别高的亲和力(nM范围)，并且逆转录酶是否能够在RT步骤扰乱这种相互作用是未知的。为了将TRAP/tbs结构应用到生产细胞中的载体转基因的抑制中，由pCMV-tbsGFP构建了EIAV载体基因组pONY8.4RC-tbsGFP(参见图6)。在使用基因组pONY8.4RC-tbsGFP或pONY8.4RC-GFP、包装组件(GagPol和VSVG)，用或不用pCI-coTRAP[H6]进行共转染的HEK293T细胞中生产载体(在pEF1a-coTRAP[H6]构建之前进行该实验)。通过流式细胞术对最终生产细胞中的GFP表达进行分析(图12A和B)，并且将载体的上清液用于转导D17细胞(图12C)。
与不含tbs的载体基因组形成对比，TRAP/tbs结构能够将来自含tbs的载体基因组的内部转基因盒的GFP抑制到与pCMV-tbsGFP中相似的水平(图12A)。DsRed-X的表达不受TRAP影响，这表明形成了全长载体基因组RNA并且其是可翻译的(数据未示出)。由TRAP导致的来自载体基因组质粒的GFP的抑制倍数为50至100倍(图12B)。但是该抑制倍数低于在pCMV-tbsGFP观察到的情况，这可能是因为观察到载体基因组具有较低水平的未抑制的GFP，该现象可能是与外部CMVp驱动的载体基因组RNA竞争的结果。这些数据还表明，在载体生产过程中添加丁酸钠(其是已知的CMV启动子的活化剂)似乎没有影响TRIP系统(在该实验中，也将丁酸钠添加到pCMV-tbsGFP转染中)。
图12C表明，含有tbs的GFP载体可以以与标准GFP载体非常相似的滴度产生；在TRAP蛋白的存在下产生的pONY8.4RC-tbsGFP的滴度为1.4x106TU/ml，而不存在TRAP蛋白时，产生的pONY8.4RC-GFP的滴度为1.8x106TU/ml。这些数据首次表明可以利用TRIP系统产生其中转基因在翻译水平上沉默的逆转录病毒载体。
TRAP介导的抑制所需的tbs序列的基本表征
实施例6.检测tbs和翻译起始密码子之间所需的短间隔
表征在TRAP-结合位点(tbs)中重要的序列的第一个实验提出的问题是，tbs和AUG翻译起始密码子之间的短间距对于翻译抑制是否是重要的。pCMV-tbsGFP和pONY8.4RC-tbsGFP中的tbs被构造为使得tbs距离GFP AUG翻译起始密码子9个核苷酸。在其他人工基因调控系统(如Tet-ON/OFF)中，间距参数已被证明对功能性是有贡献的。为了评估短间隔的重要性，构建了一系列变体，其中逐渐删除了1至9个这些间隔核苷酸。另外，在另外两个变体中，间隔增加至10和11个核苷酸。最后，标准的tbs-9nt-AUG结构添加了来自枯草芽孢杆菌trpEDCFBA操纵子的5'近端茎环(SL)序列，该序列已经被证明对用于体内转录衰减机制的TRAP-tbs结合来说是重要的(参见“McGraw AP,M.A.,Major F,Bevilacqua PC,BabitzkeP.(2009)RNA 15(1):55-66”)。实验包括了SL突变体，从而检测是否能增强TRAP介导的抑制。将这些变体克隆到载体基因组pONY8.4RC-tbsGFP中，并用限制数量的pEF1a-coTRAP[H6](比率为1:0.05)共转染，以便更容易地对翻译抑制中的细微差别进行量化。
在图13B中描绘了该实验的结果。与9nt间隔子的情况相比，间隔子删除的变体或间隔子增加的变体都没有显示任何改变的TRAP介导的抑制。相比于其他+11至+1的变体，“0”变体显示出GFP的表达大约降低2倍，但是这种情况发生在存在或不存在TRAP的情况下，这表明该变体mRNA翻译GFP的总体能力是低效的(可能是由于缺失了最佳的Kozak共有序列)。有趣的是，来自天然trp操纵子的5'茎环的存在与TRAP一致，完全消除了tbs抑制翻译的功能性。这个出乎意料的结果暗示，无论使SL-tbs结构具有体内功能性的其他特征的情况如何，该人工结构中缺少了这些其他特征，或者这些其他特征未处于正确的序列间隔/环境，或者该结果暗示，与不依赖于SL的翻译衰减相比，在枯草芽孢杆菌中TRAP与SL-tbs的结合遵循了一种不同的转录衰减机制。所有的这些数据暗示在该人工系统中由TRAP与tbs的结合所指导的翻译抑制没有由于tbs和翻译起始密码子之间的短间距而改变。
实施例6b.检测转基因盒的5’UTR内的tbs的位置对TRAP介导的抑制的影响
为了进一步表征转基因的5’UTR内的tbs位置对于TRAP介导的抑制活性的重要性，构建了一系列的pCMV-tbsGFP的5’UTR变体，其中tbs与Cap位点和AUG起始密码子的相对距离是变化的(图24i)。另外，制备了另一种构建体，其中在5’UTR内插入了2拷贝的tbs，同时在两个tbs序列之间存在34nt的插入序列。构建该构建体是为了检测与单拷贝tbs结构相比，TRAP-tbs介导的抑制是否能够增强。
在以下三个条件下检测图24i中的7种tbs变体GFP报告基因构建体能够被TRAP抑制的能力：没有TRAP(HEK293T)、瞬时共转染pEF1a-coTRAP[H6](HEK293T+TRAP)、以及最大TRAP抑制条件(HEK293T.TRIP[内源性TRAP]+共转染的TRAP)。所有5'UTR tbs变体都能够被TRAP[H6]抑制10至100倍。将上游UTR区的长度降为零(即，全部UTR仅由单一的tbs构成)似乎并未影响TRAP介导的抑制；构建体#[1]通过TRAP能够对GFP具有大约2-Log的抑制，尽管未抑制的GFP水平低于其他构建体。
将tbs和AUG起始密码子之间的间距由9nt增加至43nt仍然可以通过tbs实现10倍的TRAP介导的抑制。相比于包含单tbs的载体，编码双tbs的5'UTR变体(图24ii，构建体#[7])未提高TRAP介导的抑制。
这些数据表明：[1]单一的tbs可以被插入到5’UTR内的任意位置处，其允许一定程度的TRAP介导的转基因抑制，[2]优选将tbs插入到靠近AUG起始密码子的位置，从而促进最大的TRAP介导的抑制，以及[3]tbs上游的5’UTR序列长度能够降为0，而不会影响抑制的量。
实施例7.确定对于TRAP介导的翻译抑制所需tbs内的[RAGNN]重复的最小数目
进行接下来的实验是为了确定实现TRAP介导的抑制所需的[RAGNN]重复的最小数目。一篇文献报道采用了体外结合以确定5个重复就足以实现TRAP结合(参见“Babitzke P,Y.J.,Campanelli D.(1996)Journal of Bacteriology 178(17):5159-5163”)。产生一系列的tbs删除变体，其中逐渐删除1至7个重复(图14iA)。在所有的变体中保留最佳Kozak序列。此外，在tbs中在第10和第11个重复之间进行TG>AA的变化；在表明该区域可能包含非典型剪接供体位点(此后证明这是不正确的)的其他工作之后，进行这项工作，数据并未示出。将变体tbs GFP报告基因构建体与pEF1a-coTRAP[H6](前者以10:1的摩尔比超过后者)或pBlueScript一起共转染到HEK293T细胞中，并且通过流式细胞术测定GFP的表达(图14iB)。tbs的TG>AA改变对TRAP介导的抑制没有可以检测的效果，而tbsx11M变体使得GFP的表达抑制1000倍。变体tbsx10M、tbsx9和tbsx8也使得GFP的表达抑制1000倍，而tbsx7使得抑制500倍(图14i C和D)。进一步删除RAGNN重复得到tbsx6，这导致功能性进一步降低，因为该变体能够以30倍抑制GFP的表达。相比于没有tbs序列的变体，变体tbsx5和tbsx4显示出可以忽略不计的抑制效果。这些数据清楚地表明，由TRAP/tbs结构得到的最强抑制水平需要至少7个(优选至少8个)RAGNN重复，而6个重复对转基因表达会有一定程度上有效的敲减作用。
实施例8.确定tbs中容许的[RAGNNN]重复的数目
虽然普遍的共识是TRAP与在RAG重复之间包含N2间隔子的tbs结合是最优的，但是体外的tbs-TRAP结合研究也表明tbs的RAG重复之间具有三个核苷酸的核苷酸间隔子也是可以容许的(参见“Babitzke P,Y.J.,Campanelli D.(1996)Journal of Bacteriology178(17):5159-5163”)。事实上，在体内发现的天然tbs序列具有比两个核苷酸长的偶然间隔子，尽管这可能是因为在特定的细胞条件下，体内的TRAP/tbs相互作用已经进化为其中其他蛋白质的相互作用和/或选择压力可能发挥了作用。可能的是，天然TRAP/tbs相互作用并不需要处于最大的效率以实现生物学功能。然而，在人工TRIP系统中，期望的是TRAP/tbs相互作用具有最大效率。为了检测11xRAGNN tbs序列的功能性能够容许用多少RAGNNN重复进行替换，设计了一系列变体tbs序列(图14iiA)，并将它们克隆到表达COX2转基因的EIAV载体基因组中(参见图18i)。这些是基于在图14iA中首先检测的tbsx11M序列。在tbsx11M中，RAGNNN重复从中心部分向外取代了RAGNN重复，产生具有1x、3x、5x、7x以及最终11xRAGNNN重复的tbs序列(注意，对于N3x11M tbs序列，只有10个NNN间隔子是有效存在的，因为3'最远端的重复间隔子不能算作为间隔子)。将这些载体基因组质粒与EIAV载体包装组件+/pEF1a-coTRAP[H6]一起瞬时共转染到HEK293T细胞中，并收集载体上清液(在下文中描述了这些COX2载体的载体滴度)。通过对COX2进行免疫印迹从而对最终生产细胞的裂解物进行分析，以测定与填充质粒(未抑制)相比，细胞中的转基因抑制(图14iiB)。
数据表明，在11x重复tbs中多达三个RAGNNN重复会使得在载体生产细胞中具有一定可检测的转基因表达抑制；这在一些情况中足以提高载体滴度，这取决于转基因蛋白对载体滴度的影响程度，而不是TRIP系统。在tbs中单一的RAGNNN重复似乎与N2x11重复tbs具有相同的功能。
实施例8b.确定tbs内所容许的[RAGNNN]重复的数目
关于包含间隔子的Ns的数目，进行了进一步的工作，该Ns位于实现TRAP介导的抑制的共有重复RAGN2-3中的RAG重复之间。图14iB示出了大约在转染后2天的在最终生产细胞中的COX2表达分析。为了检测在N3N2tbs变体的情况中转基因(COX2)表达是否在转录后早期发生变化(相比于后期)，通过对COX2的免疫印迹分析转染后8小时的生产细胞裂解物(图14iii)。这些数据表明，在载体生产过程中，来自N3N2tbs变体的COX2表达在早期和晚期具有相似的模式，即，对于给定的tbs变体，在载体生产过程中，TRAP-tbs介导的抑制程度似乎是相似的。
为了测定包含N3N2tbs载体的载体基因组的不同COX2抑制水平对载体滴度的影响，对粗上清液收集物进行DNA整合检验。图14iv示出了这些数据并显示对于在生产细胞中具有明显的COX2抑制的N3N2tbs变体，载体滴度增加；即‘N3N2x11[3]’、‘N3N2x11[1]’和‘N2x11[0]’。这证明，在由RAGNN组成的x11tbs中多达三个重复可被RAGNNN重复替代，同时保留一些TRAP介导的抑制活性，从而提高载体滴度。然而，应该指出的是，除了增加载体产量，出于一些原因，RAGNN x8-11tbs结构保持了偏好性，即，显著降低了与载体生产相关的转基因蛋白，否则会导致在载体施用过程中对转基因产生免疫应答。
之前已表明RAGNN x7-8tbs变体保留了接近最大的TRAP介导的抑制活性(图14i)。为了检测在这些较短的tbs变体内用RAGNNN取代单个RAGNN重复的影响，构建了第二系列的N3N2tbs变体，并将它们插入到COX2载体基因组(图14vA)。将这些载体基因组质粒与EIAV载体包装组件+/pEF1a-coTRAP[H6]一起瞬时共转染到HEK293T细胞中，并且转染后8小时，通过对COX2的免疫印迹来分析细胞裂解物，从而与填充质粒(未抑制)进行比较，测定细胞中的转基因抑制(图14vB)。这些数据表明，含有一个RAGNNN重复和七个RAGNN重复的8重复tbs保留了TRAP介导的抑制活性。含有一个或多个RAGNNN重复的小于8重复的tbs序列可能具有较低的TRAP介导的抑制活性。
实施例8c.确定在RAGNN重复共有序列的5个位置处的优选核苷酸
为了进一步表征tbs的RAGNN共有序列重复，在全部由GAGxx重复构成的x11重复tbs中，利用各种核苷酸(G|A|T[U]|C)对NN间隔子进行检测。将这些tbs变体克隆到pCMV-[tbs]GFP中，取代x11M tbs，并通过瞬时共转染HEK293T细胞+/-pEF1a-coTRAP[H6]来进行检测。48小时后，通过流式细胞术对细胞进行分析，并计算GFP表达评分(图23i)。这揭示了在NN位置处对于嘧啶的偏好性。功能性的一般顺序为T[U]>C>G/A。为了检测在第一(R)位置处最具有功能性的核苷酸，将各核苷酸G、A、T[U]或C插入到包含x11、x8或x6重复的tbs’中的xAGAA重复中。这表明在最弱间隔子重复(NN＝AA)的情况中，G在第一位置处是最具有功能的。在[TAGAA]x11中的第一位置处T[U]仅是具有最小功能的，A和C在任何这些xAGAA重复中都没有功能。因此，在包含串联xAGAA重复的tbs’的情况中，x必须为G而不是T。
接着，对RAGNN重复共有序列第一位置处的G或T的相对偏好性进行了检测。在具有高功能的tbs(11xGAGTT)的情况中，逐渐用TAGTT重复替代GAGTT重复。增加TAGTT重复(替代GAGTT重复)仅适当地降低了tbs的抑制功能。鉴于图23i的结果，这表明在RAGNN重复共有序列中，对于功能性而言最重要的可变核苷酸的位置为NN间隔子，接着是R。数据表明在NN位置处的嘧啶是最优选的。
为了进一步表征RAGNN重复共有序列的该特征，构建了另外一系列的tbs变体，其中在GAGxx的条件下，至少一个N＝T(图23ii)。这表明当第一个N(RAGNN的位置4)优选为嘧啶，甚至更优选为T[U]时能够实现最大抑制。注意，没有对GAGAT进行检测，因为该RAGNN序列的串联重复导致在转基因ORF的上游具有多个ATG密码子，这可能使下游转基因的表达衰减。
这些发现中的众多发现与关于在体外或体内检测的TRAP-tbs相互作用的公开报道相一致(Babitzke P,Y.J.,Campanelli D.(1996)Journal of Bacteriology 178(17):5159-5163)，尽管其中也观察到了些许不同。例如，在本研究中，证明了RAGCC重复是TRAP抑制的高度有效的调节剂，而其他文献表明该间隔子由于其二级结构因此具有降低的活性((Xirasagar等，J.Biol.Chem.,Vol 273(42):27146-27153,Oct1998)。这表明，包含RAGNN重复的特定tbs序列需要凭借经验在用于生产载体的细胞(通常是但不限于基于HEK293的细胞)中在TRAP-tbs抑制系统内进行检测，从而检测在存在TRAP的情况下，可能由特定tbs导致的抑制程度。总之，此研究的数据已经表明RAGNN重复共有序列的优选核苷酸为：
-在至少一个NN间隔子位置处为嘧啶；
-在NN间隔子的第一位置处为嘧啶；
-在两个NN间隔子位置处为嘧啶；
-在R位置处优选为G。
实施例9.对其中翻译依赖IRES的转基因盒中的TRAP/tbs结构进行检测
多顺反子载体是将超过一个的基因递送到患者靶细胞中的有用的工具。因此有利的是，能够利用TRIP系统抑制载体基因组中的多个转基因，包括依赖IRES元件的那些。为了检测TRIP系统是否能够应用于远端ORF依赖于内部核糖体进入位点(IRES)的转基因表达盒中，构建了如图15A所示的双顺反子载体。简言之，将编码血管内皮细胞生长因子(VEGF)和EMCV IRES元件的序列插入到pCMV-tbsGFP中，从而得到在pCMV-Vi-tbsx11GFP内编码的双顺反子基因盒VEGF-IRES-tbsGFP。制作了两个另外的对照构建体，其仅包含4[RAGNN]重复或无重复；预计它们将不会被TRAP抑制。将构建体与填充质粒或pEF1a-coTRAP[H6]一起共转染到HEK293T细胞中，通过流式细胞术对GFP表达进行分析。在图15B中示出了这些数据。来自双顺反子盒远端位置的GFP表达水平相比于单顺反子结构降低了约7倍，单顺反子结构不是非典型的双顺反子基因结构。在pCMV-Vi-tbsx11GFP-转染的细胞中，GFP表达水平进一步降低2倍，表明tbs序列的替换对IRES依赖型翻译效率具有小的降低效果。在pCMV-Vitbsx11G+pEF1a-coTRAP[H6]-转染的细胞中，GFP表达水平比填充质粒降低17倍，表明TRAP/tbs结构可以在内部核糖体进入的情况下发挥功能。此外，该功能依赖于tbs的存在，也依赖于TRAP蛋白的存在，因为对照和4x重复构建体对TRAP没有显著的响应。这些数据首次证明了TRAP/tbs通过控制IRES依赖型翻译从而在调控基因表达方面的新用途。(图19i和19ii中的数据进一步证明了使用TRIP系统可以同时抑制多顺反子mRNA内的多个ORF)。
通过TRAP/tbs结构对生产细胞中包含WPRE的SIN载体的GFP转基因的抑制
实施例10.利用TRIP系统生产包含WPRE的SIN-慢病毒载体
将TRIP系统用于生产SIN-载体，该载体还包含旱獭HBV转录后元件(WPER)。用于举例说明利用TRAP/tbs结构实现转基因翻译抑制的最初的载体基因组(pONY8.4RC-tbsGFP)不是SIN载体，并且不包含转录后调控元件(PRE)，该元件是当代逆转录病毒载体和其他病毒载体系统的典型特征。已经证明WPRE通过在聚腺苷酸化位点降低通读性(read-through)从而发挥功能(Higashimoto T,U.F.,Perumbeti A,Jiang G,Zarzuela A,Chang LJ,KohnDB,Malik P.(2007)Gene Therapy 14(17):1298-1304)。然而，早期的报告表明WPRE可能在RNA水平以其他方式发挥作用。为了检测TRAP/tbs结构是否能够用于抑制由包含WPRE的SIN-载体基因组的转基因表达，构建了载体基因组pONY8.9RCTG(+WPRE)，并检测了其在HEK293T细胞中对GFP表达的抑制作用。图16证明了在SIN-载体基因组上包含WPRE对于TRIP系统没有负面影响：由pONY8.4RC-tbsGFP和pONY8.9RCTG(+WPRE)的GFP抑制是相等的。
TRIP系统增加表达治疗性转基因的载体的生产滴度的用途
实施例11.使用TRIP系统生产表达huFactor VIII的载体。
所开发的用于治疗血友病A的难以在HEK293T细胞中产生，因为转基因huFactorVIII显示出对VSVG包膜并入载体病毒粒子的严格抑制作用。载体滴度低(参见图3i中的混合实验数据)，除非使用在HEK293T细胞中没有活性的组织特异性启动子来驱动huFactorVIII的表达(参见“Radcliffe PA,S.C.,Wilkes FJ,Custard EJ,Beard GL,Kingsman SM,Mitrophanous KA(2008)GeneTherapy 15(4):289-297”)。将TRIP系统用于以检测是否能够通过抑制HEK293T生产细胞中huFactorVIII的表达来提高载体滴度。构建了载体基因组ReQuniate-tbs和ReQuniate-con(图17i)，其中原始基因组内的5’UTR被来自tbs-GFP报告基因载体的相同的5’UTR替换(如图6所示)。ReQuinate-con载体基因组包含与ReQuinate-tbs相同的5’UTR，不同之处在于tbs是混杂的(scramble)；完成上述构建，从而使得与包含tbs的mRNA相比，由tbs-阴性mRNA的huFactorVIII的翻译在在序列长度和核苷酸含量方面相似的5’UTR背景下进行。使用载体基因组质粒DNA，以超过pEF1a-coTRAP[H6]5倍的摩尔量在HEK293T细胞中制备这些载体。对过滤的载体上清液进行DNA整合检验以确定滴度。还将载体上清液浓缩100倍，对其进行PERT测定，从而定量颗粒数目，并且通过免疫印迹分析相同数目的载体颗粒以确定VSVG含量。来自这些分析的数据在图17ii中列出。与在TRAP[H6]和的存在下生产的ReQuinate-tbs相比，TRIP系统将表达huFactorVIII的载体基因组的DNA整合滴度提高了30倍。利用TRAP/tbs结构大幅度提高了VSVG并入载体颗粒中的程度，并且这与载体滴度密切相关。有趣的是，利用ReQuniate-con将VSVG并入载体颗粒的程度也略微有所增加，并且+/-pEF1a-coTRAP[H6]观察到载体滴度也伴随小幅度增加；这可能是因为由该构建体的huFactorVIII的亚优化表达。
实施例12利用TRIP系统生产表达COX2和/或FRP的载体
关于开发逆转录病毒载体来治疗青光眼，对大量用于降低眼内压的转基因进行了评价，包括前列腺素F受体(FPR)，其是由PTGFR基因编码的前列腺素F2α的受体)；和环加氧酶-2(COX-2)，其是前列腺素生物合成中的限速酶。希望将这些基因同时递送(通过分别的单基因载体或通过双顺反子基因载体)会有益于青光眼患者。然而，已发现，编码这些转基因的载体的滴度相比标记基因载体滴度显著降低。这种效应的至少一部分已被证明是由于转基因产物，因为在载体生产过程中，混合这些载体基因组与lacZ-载体基因组导致了lacZ-载体滴度的下降(参见图3ii)。
为了检测TRIP系统是否能够增加青光眼载体滴度，将tbsx11m变体序列(参见图14iA)克隆到图18i中所示的单一转基因载体基因组内。在HEK293T中生产病毒载体制备物(preps)，同时以载体基因组:TRAP质粒的摩尔比为1:0.2共转染pEF1a-coTRAP[H6]或填充质粒。通过标准DNA整合检验来滴定载体制备物(图18iiA)，并且由COX-2载体生产细胞和COX-2载体-转导的细胞获取细胞裂解物，从而对在靶细胞中由包含tbs的转录单位的COX-2表达进行评估。在图18iiB和18iiC分别示出了这些分析的数据。tbs-COX-2载体的滴度比未修饰的COX-2载体的滴度高100倍(图18iiA)，并且生产细胞内COX-2的水平与滴度呈负相关(图18iiB)。仅在转导有利用TRIP系统产生的载体的靶细胞内能够稳定地检测到COX-2表达，这证明tbs序列对靶细胞内的转基因表达没有影响(图18iiC)。使用TRIP系统产生的FPR-载体的滴度相比于标准载体增加了24倍(图18iii)；这再一次证明这依赖于该系统中的TRAP和tbs。
为了对表达COX-2和FPR两者的多顺反子载体进行检测，将tbsx11M序列克隆到如图19i所示的载体基因组质粒中；构建了在位置+/-tbs处编码COX-2和FRP的双顺反子载体基因组质粒。在标准条件下，在HEK293T中制备病毒载体制备物，同时以载体基因组:TRAP质粒的摩尔比为1:0.2共转染pEF1a-coTRAP[H6]或填充质粒。通过标准DNA整合检验滴定载体制备物，并且由载体生产细胞获取细胞裂解物(图19ii)。仅在FPR的抗体非市售可得时，使用COX-2的抗体对细胞裂解物进行免疫印迹。这些数据表明利用TRIP系统，多顺反子mRNA能够同时在超过1个OFR位置处被抑制。该抑制的结果使载体滴度提高100倍(将pKCMV-COX2-i-FPR[+填充]与pKCMV-tbsCOX2-i-tbsFPR[+pEF1a-coTRAP[H6]进行比较)。
实施例13.利用TRIP系统生产OXB-102载体
OXB-102是开发用于治疗帕金森病的EIAV载体，并且其表达参与多巴胺生物合成的3种蛋白：酪氨酸羟化酶、GTP-环式水解酶和芳族L-氨基酸脱羧酶(在WO 2013/061076中有所描述)。同时如上所述，已知这些酶对于载体滴度没有负面影响，从载体加工/浓缩以及将低免疫原性的载体制剂递送到患者体内的观点来看，这将有益于在载体生产细胞内抑制转基因表达。因此，将tbsx11M序列克隆到如图20i所示的多顺反子OXB-102载体基因组质粒的5’近端ORF内。在得到的载体中，据预测酪氨酸羟化酶:GTP-环式水解酶1(TH-CH1)融合基因的翻译只会在载体生产细胞中受到TRAP的抑制。在HEK293T中制备病毒载体制备物，同时以载体基因组:TRAP质粒的摩尔比为1:0.2共转染pEF1a-coTRAP[H6]或填充质粒。通过标准DNA整合检验来滴定载体制备物，并且由载体生产细胞获取细胞裂解物。图20iiA和20iiB明确地示出了，通过使用TH和CH1两者的抗体进行免疫印迹来判断，在载体生产细胞中TH-CH1融合蛋白受到抑制(图20iiB)，但是其在转导细胞中是易于检测的，这通过使用抗TH抗体进行免疫印迹来判断。
实施例14.利用TRIP系统生产基于HIV-1的慢病毒载体
我们尝试证明TRIP系统在生产基于HIV-1的慢病毒载体中的有效性。将tbsx11M序列克隆到在CMV启动子的控制下编码GFP的标准HIV-1载体基因组中(图25iA)。利用每10cm板25μL的Lipofectamine 2000CD(转染前24小时，以3.5x106细胞/板的密度接种)，用包装组件质粒按照以下质量比瞬时共转染HEK293T细胞从而生产编码GFP的载体：4.5μg载体基因组、1.5μg gagpol、1.1μg rev、0.7μg vsvg以及0.56μg的pEF1a-coTRAP[H6](+TRAP)或0.56μg pBlueScript(-)。将培养物过夜培育，之后添加丁酸钠直至终浓度为10mM，持续5小时。然后更换培养基，并培育培养物直至转染后2天，此时收获粗载体上清液，过滤(0.2μm)并储存于-80℃。通过流式细胞术对最终生产细胞进行分析，并计算GFP表达评分。通过转导HEK293T细胞来滴定载体上清液，接着通过流式细胞术进行分析。图25iiB示出了最终生产细胞的GFP表达评分(MFI x GFP％)以及产生的载体滴度。仅当如所述的HIV-1载体基因组包含tbs序列并且TRAP是共引入的情况下，GFP表达受到2-Log抑制。然而，载体滴度未受到这些修饰的影响。这些数据证明了，原则上，利用TRIPLenti系统，在基于HIV-1的载体生产细胞内可以抑制任何转基因。
为了评估使用TRIPLenti系统，编码治疗性基因的基于HIV-1的载体的滴度是否能够提高，将tbsx11M tbs插入到编码5T4-CAR的HIV-1载体基因组的转基因盒的5’UTR中(图25iiA)；该治疗性载体用于对编码它们的T细胞进行遗传修饰，从而靶向并杀死表达抗原5T4的肿瘤细胞。在上述相同(用于GFP载体)的条件下制备得到的载体HIV-tbs-h5T4.CAR，即，利用载体组件+/-pEF1a-coTRAP[H6]共转染HEK293T细胞。在HEK293T细胞中，通过DNA整合检验来滴定载体上清液。图25iiB示出了该实验的结果：在生产细胞中当TRAP[H6]共表达时，HIV-tbs-h5T4.CAR的滴度高于对照(pBlueScript)30倍。这些数据证明了在生产细胞中5T4.CAR的表达对活性载体的产生是不利的，还证明了TRIP系统通过抑制转基因表达从而克服了这个问题。
实施例15.TRAP-tbs结构不影响细胞质中的转基因mRNA水平
TRAP-tbs结构具有极有效的转基因抑制能力，并且认为它仅在翻译水平发挥作用。为了检测编码tbs的mRNA的稳态池在TRAP存在下是否受影响(例如，可能的去稳态作用)(这也会有助于转基因表达的抑制)，在转染有pCMV-[tbs]GFP+/-pEF1a-coTRAP[H6]的HEK293T细胞中对转基因细胞质RNA的相对水平进行测定。对细胞进行转染，并在转染后2天通过流式细胞术对GFP的表达进行测定(图26A)。将一式两份培养物分级，去除细胞核并利用QIAGEN RNAeasy试剂盒纯化总细胞质RNA。对RNA进行DNAse-处理，之后使用GFP靶序列的FAM-探针/引物组进行qRT-PCR(图26B)。与之前的数据一致，TRAP-tbs结构能够在HEK293T细胞中抑制GFP表达2-Log。然而，在所有情况下，细胞质中GFP mRNA的检测水平的变化不超过约2倍(所有的Ct值的变化小于1.5循环)。这些数据证实了TRAP-介导的转基因抑制的最可能的机制是翻译水平上的抑制。
实施例16.比较编码组成型启动子和编码组织特异性启动子的基于HIV-1的载体在载体生产细胞中的TRAP/tbs-介导的双顺反子转基因抑制
为了将TRAP-介导的抑制(翻译水平)与在转录水平的转基因抑制进行比较，构建了基于HIV-1的载体基因组，其中，由组织特异性启动子(VMD2，光感受器细胞表达(Esumi,N.等，(2004)J.Biol.Chem.279:19064-73)；mAlbAT，肝细胞表达(Kramer,M.G.et al.(2003)Mol.Ther.7:375-385))或者组成型CMV启动子来驱动转基因转录。转基因盒是双顺反子，其编码位于第一个ORF位置处的萤火虫(Photinus pyralis)荧光素酶和位于第二个ORF位置处的GFP，并且EMCV IRES元件插入在两个ORF之间。将单一的tbs(x11M)序列插入到两个报告基因的上游。构建可供选择的CMV-启动子构建体，其中仅第一个ORF或第二个ORF受TRAP-tbs调控，并且对照不含任何tbs序列或者没有启动子(图27i)。
在HEK293T细胞中使用7个载体基因组以制备载体颗粒。利用载体基因组质粒加包装组件以及pEF1a-coTRAP[H6]或pBluescript(对照)共转染细胞。另外，添加pGL3-对照(SV40-启动子驱动的海肾(Renilla reniformis)荧光素酶)(其与总DNA的比例为1:40)以提供转染有效对照。质粒的比例为：基因组(4.5)|GagPol(1.5)|Rev(1.1)|VSVG(0.7)|TRAP/Bluescript(0.56)|pGL3对照(0.23)。在一式两份的96孔板中进行转染，各条件下一式三份。转染后1天，用10mM的丁酸钠诱导培养物5至6小时(通常的载体生产方法)，之后培养基用新鲜的培养基更换。通过流式细胞术对最终生产细胞进行分析，从而生成GFP表达评分(MFI x GFP％)，以测定在第2位置处的表达，或者根据Dual报告基因检测方案(Promega)在被动裂解缓冲液中裂解所述最终生产细胞，以测定在第1位置处的表达。使用Dynex MLX平板读出器根据上述方案，利用制造商的方法对裂解物的萤火虫荧光素酶表达进行分析。
在图27ii中示出了载体生产细胞内双顺反子盒的表达数据。正如所预期的那样，当应用TRAP时，由于缺少tbs’，所以没有观察到对来自pHIV-CMV-Luc-iGFP的荧光素酶和GFP的抑制。观察到了由pHIV-CMV-tbsLuc-itbsGFP和pHIV-CMV-tbsLuc-iGFP的荧光素酶表达的抑制，但对于pHIV-CMV-Luc-itbsGFP没有观察到。观察到了由pHIV-CMV-tbsLuc-itbsGFP和pHIV-CMV-Luc-itbsGFP的GFP表达的抑制，但对于pHIV-CMV-tbsLuc-iGFP没有观察到。
有趣的是，由启动子弱的载体基因组pHIV-Null-tbsLuc-itbsGFP表达的荧光素酶的水平比CMVp变体的低100倍，该表达水平可被TRAP抑制。可能的是，该较低的荧光素酶表达水平(在缺少TRAP的情况下)来自于帽依赖方式的全长载体基因组RNA，即，核糖体从全长载体RNA的5’端开始扫描。因此，TRAP能够与该全长载体基因组RNA上的tbs结合，并阻遏由该较长的RNA的转基因表达，以及内部转录。这还通过pHIV-Null-tbsLuc-itbsGFP高水平表达GFP得以证实，推测可能是由于IRES元件仅驱动GFP翻译。TRAP能够抑制由衍生自pHIV-Null-tbsLuc-itbsGFP的全长载体基因组RNA的GFP表达。这一点也得到了以下事实的支持：与pHIV-Null-tbsLuc-itbsGFP(缺少TRAP)相比，组织特异性构建体pHIV-VMD2-tbsLuc-itbsGFP和pHIV-mAlb-hAAT-tbsLuc-itbsGFP产生了相似水平的GFP，尽管荧光素酶表达较低(与CMVp构建体相比)，这表明大部分的GFP表达并非来自于内部启动子驱动的盒。该GFP的表达水平(来自全长载体基因组RNA)也会受到TRAP的有效抑制。最后，来自pHIV-VMD2-tbsLuc-itbsGFP和pHIV-mAlb-hAAT-tbsLuc-itbsGFP的荧光素酶表达水平比pHIV-Null-tbsLuc-itbsGFP的表达水平高大约2倍，表明这些组织特异性启动子在HEK293T细胞中是轻微渗漏的。甚至这样低的荧光素酶表达水平也受到TRAP的抑制。
在图27iii的示意图中总结了这些观察结果。这些数据表明TRIP系统能够同时抑制多顺反子转基因，并且与使用组织特异性启动子相比具有优势。对于逆转录病毒载体的生产而言，在细胞内大量的全长载体基因组RNA必须被转录，但在此，我们证明了由该全长的分子可以实现转基因蛋白的翻译，特别是如果采用了IRES元件的情况下。由于TRIP系统介导了在翻译水平的抑制，所以它能够抑制来自全长载体基因组RNA的转基因表达以及来自内部衍生的转基因盒mRNA的转基因表达。
实施例17.证明在基于DNA的病毒载体生产中，TRAP/tbs介导的转基因抑制的有效性；案例研究1-基于AAV的载体
以下的工作描述了TRiPAAV载体生产系统，其以与基于RNA的病毒载体系统(例如逆转录病毒/慢病毒)相似的方式采用了TRAP-tbs结构。图28i展示了TRiPAAV系统的非限制性实例，该系统包括生产细胞(例如，表达腺病毒E1的细胞；基于HEK293的细胞，基于PER.C6的细胞)，该生产细胞含有以下表达盒：[1]AAV载体基因组，其经过改造以将tbs插入到转基因的5’UTR中(和/或在IRES和下游转基因之间)，[2]repcap表达质粒，[3]Helper功能体(例如，腺病毒E2A、E4orf6、VA)，和[4]TRAP表达盒(瞬时转染的或稳定的TRAP细胞系)。
为了检测在AAV载体生产细胞中，是否能够抑制转基因表达，将TRiPAAV系统应用到HEK293T细胞中的自补型(sc)AAV-(CMV)-tbsGFP载体(血清型2)的生产中。首先，检测repcap和腺病毒Helper功能体的共表达对TRAP介导的抑制的影响，并将其与pCMV-tbsGFP报告质粒进行比较(图28ii)。利用pscAAV-GFP或pscAAV-tbsGFP或pCMV-tbsGFP，并与pEF1a-coTRAP[H6]、pRepCap2和pHelper进行不同的组合转染HEK293T细胞(除了对pEF1a-coTRAP[H6]另有说明以外，所有的转染都以每10cm板2μg的等质量比进行，参见图28ii)，一式三份。正如所预期的那样，TRAP的表达对由pscAAV-GFP(缺少tbs)的GFP表达没有影响。在TRAP的存在下，来自pscAAV-tbsGFP的GFP表达几乎被抑制了3-Log(TRAP和scAAV载体基因组质粒的比例为1:1)。pHelper或pRepCap2的共表达对该TRAP介导的抑制水平没有影响。当pscAAV-tbsGFP、pRepCap2、pHelper和pEF1a-coTRAP[H6]全部一起转染时(即，在产生scAAV-tbsGFP载体颗粒的条件下)，TRAP导致的GFP抑制的水平超过300倍。在生产scAAV-tbsGFP的条件下，pEF1a-coTRAP[H6]的10倍滴度(与基因组的比例为1:1[2μg]至10:1[0.2μg])表明在更多的TRAP质粒输入时，可能会出现3-Log抑制。这些数据证明利用TRiPAAV系统，AAV载体基因组中的转基因盒的表达会被抑制至少300倍，并且表明包装/Helper功能体本身不会抑制TRAP介导的抑制。
为了证明利用TRiPAAV系统能够产生功能性AAV载体颗粒，利用pscAAV2-GFP基因组(+/-tbs)、pRepCap2、pHelper和pEF1a-coTRAP[H6](TRAP)或pBluescript(-)(所有DNA 2μg)转染细胞，从而以10cm板的规模生产scAAV2-[tbs]GFP载体颗粒。53小时之后，将细胞冻融，并使用VirabindTM试剂盒纯化载体颗粒，浓缩至100μL PBS的终体积，然后转导HEK293T和HEPG2细胞以进行滴定(图28iii)。这些数据表明在标准方法下，TRiPAAV系统能够以相等的滴度产生AAV-GFP载体，这表明tbs修饰和TRAP的共转染从本质上来说没有阻碍AAV载体生物学。因此，这项工作证明了利用TRiPAAV系统可在AAV载体生产细胞内有效抑制转基因表达，并且如果转基因产物的活性损害AAV载体颗粒滴度或效力，那么该活性将被显著降低。
为了证明TRiPAAV载体系统能够在生产细胞中抑制由AAV载体基因组编码的高度有毒性/有问题的转基因，构建了scAAV2-tbsBarnase(图28ivA)。芽胞杆菌RNA酶(Barnase)是一种有效的细菌RNA酶，当表达时它对真核细胞是具有毒性的，并且已经证明除非沉默，否则其损害AAV载体生产(Chen H.,Mol Ther Nuc Acids.,1,e57；doi:10.1038/mtna.2012.48,Nov 2012)。除了将等质量的pscAAV2-GFP(图28ivB)和pscAAV2-tbsBarnase基因组质粒混合，以观察Barnase对GFP表达的影响，或者仅用pscAAV-(CMV)-GFP转染，利用pRepCap2和pHelper包装组件(没有pEF1a-coTRAP[H6])转染HEK293T和HEK293T.TRiP[3D]细胞培养物。这些培养物的照片是在转染后24小时拍摄的，它们在图28v:i-ii中示出。仅用pscAAV-(CMV)-GFP转染的HEK293T和HEK293T.TRiP[3D]培养物产生了高水平的GFP表达(图28v:ii)。然而，用pscAAV-(CMV)-GFP基因组和pscAAV-(CMV)-tbsBarnase共转染的HEK293T培养物表达出可忽略不计的GFP水平(图28v:i)，这证明了Barnase表达导致降低的蛋白表达的总体效果，推测这可能是由于转基因mRNA和核糖体RNA的降解。相反，利用相同的DNA混合物转染的HEK293T.TRiP培养物允许一些基本的GFP表达，这表明在这些细胞中TRAP[H6]的内源水平已经抑制了Barnase的表达。通过分离稳定细胞系，可能可以将Barnase的抑制提高到甚至高于内源TRAP的水平。作为在病毒载体生产过程中表达的毒性转基因蛋白的Barnase的模型代表了最坏的情况，其中从头开始的蛋白合成(包括病毒载体组件)被有效关闭。鉴于所观察到的在HEK293T.TRiP细胞中GFP表达的适度恢复，表明了也出现了AAV载体组件蛋白的表达，并且表明在稳定TRAP细胞系中能够生产编码Barnase的AAV载体颗粒。
实施例18.证明在基于DNA的病毒载体生产中，TRAP/tbs介导的转基因抑制的有效性：案例研究2-基于腺病毒的载体
以下的工作描述了TRIPAdeno载体生产系统，其以与所述的基于RNA的病毒载体系统(例如逆转录病毒/慢病毒)和基于DNA的AAV载体(实施例17)相似的方式采用了TRAP-tbs结构。图29i展示了TRIPAdeno系统的非限制性实例，该系统包括生产细胞(例如，表达腺病毒E1的细胞；基于HEK293的细胞，基于PER.C6的细胞)，该生产细胞含有以下表达盒：[1]基于腺病毒的载体基因组，其经过改造从而将tbs插入到转基因的5’UTR中(和/或在IRES和下游转基因之间)，[2]TRAP表达盒(瞬时转染的或稳定的TRAP细胞系)。任选地，可以共引入E1缺失型辅助病毒以生产依赖Helper的载体。
为了证明在哺乳细胞中，在载体DNA重组期间，在TRIPAdeno系统中转基因表达能够被抑制，从而产生全长Adeno-tbs转基因载体基因组，构建了pAdeno-CMV-GFP和pAdeno-tbsGFP穿梭质粒(试剂盒，Cell BioLabs)(图29iiA)。这些质粒包含编码转基因盒的腺病毒基因组(缺失E1)的左手侧。将这些穿梭质粒与pEF1a-coTRAP[H6](TRAP)或pBlueScript(-)一起共转染到HEK293T细胞中，并且在平行进行的转染中与pacAd5 9.2-100一起(试剂盒，Cell BioLabs)，其包含与穿梭质粒中的Ad5序列的重叠同源区，以及Ad5基因组(缺失E3)到右手侧ITR的剩余部分(图29iiB)。穿梭质粒与TRAP质粒的质量比为5:1。一式两份培养物培养48小时，然后通过流式细胞术对GFP表达进行分析(生产GFP表达评分：MFI x GFP％)，或者培养直到观察到细胞病变效应(大约14天)。冻融细胞并除去细胞碎片，从而制备粗Adeno-CMV-GFP和Adeno CMV-tbsGFP载体原液，接着在HeLa细胞上进行滴定。
图29iiB中的数据显示了在转录后48小时细胞培养物内的总GFP表达，并且示出了仅当tbs存在于转基因5’UTR内并且存在TRAP时，Ad穿梭质粒能够抑制转基因表达2-Log。与pacAd5 9.2-100的共转染对抑制水平没影响，由此证明了在哺乳动物细胞内在载体DNA重组过程中转基因表达可以受到抑制。这展示了哺乳动物细胞中腺病毒载体生产中的主要步骤，因为毒性转基因表达可能会损害恢复载体重组的能力。
为了检测TRIPAdeno系统是否能够在Ad载体扩增期间抑制转基因表达，利用Adeno-CMV-GFP和Adeno-CMV-tbsGFP，以0.01的MOI转导HEK293T细胞或HEK293T.TRIP[3D]细胞(稳定表达TRAP[H6])。在培养后不同的时间点，对一式两份培养物的载体扩增期间的GFP表达进行分析，并生成GFP表达评分(MFI x GFP％)。该实验的结果在图29iii中示出，并且表明仅在HEK293T.TRIP[3D]细胞系中，在Adeno-CMV-tbsGFP扩增期间，GFP的表达受到大于400倍的抑制(图29iiiA)。正如所预期的那样，在两种细胞系中，Adeno-CMV-GFP扩增期间的GFP表达是相似的(即，未受到抑制)。
在培养后48小时，从细胞中收集在TRAP存在情况下生产的Adeno-CMV-GFP和Adeno-CMV-tbsGFP载体原液；除去碎片，并在HeLa细胞上滴定(图29iiiB)。在HEK293T或HEK293T.TRIP[3D]细胞中生产的载体滴度是相等的，表明tbs修饰和TRAP的共转染从本质上来说没有阻碍腺病毒载体生物学。因此，这项工作证明了利用TRIPAdeno系统可在腺病毒载体生产细胞内有效抑制转基因表达，并且如果转基因产物的活性损害腺病毒载体颗粒滴度或效力，那么该活性将被显著降低。
上文说明书中提到的所有公开文献以引用方式并入本文。在不偏离本发明的范围和精神的前提下，对本发明所描述的方面的各种改变和变化对本领域技术人员是显而易见的。尽管参照特定的优选实施方案对本发明进行描述，应该理解，所要求保护的发明不应该不适当地限制于所述特定实施方案。实际上，所附权利要求的范围旨在包括对所描述的实施本发明的方式进行的各种修改，这些修改对生物化学和生物技术或相关领域的技术人员来说是显而易见的。

Claims (52)

1.一种核酸序列，其包含与目的核苷酸有效连接的结合位点，其中所述结合位点能够与RNA结合蛋白相互作用，从而在病毒载体生产细胞内抑制目的核苷酸的翻译。
2.根据权利要求1所述的核酸序列，其中所述RNA结合蛋白为色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)。
3.根据权利要求1或2所述的核酸序列，其中所述目的核苷酸在缺乏RNA结合蛋白的靶细胞中进行翻译。
4.根据前述任一项权利要求所述的核酸序列，其中所述TRAP结合位点包含多个RAGN2-3重复序列。
5.根据前述任一项权利要求所述的核酸序列，其中所述TRAP结合位点包含多个RAGN2重复序列。
6.根据前述任一项权利要求所述的核酸序列，其中所述TRAP结合位点至少包含6个RAGN2重复序列。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸序列，其中所述TRAP结合位点至少包含8个RAGN2-3重复序列。
8.根据权利要求7所述的核酸序列，其中RAGNNN重复的数目为1以下。
9.根据前述任一项权利要求所述的核酸序列，其中所述TRAP结合位点包含8-11个RAGN2重复序列。
10.根据前述任一项权利要求所述的核酸序列，其中所述TRAP结合位点包含11个RAGN2-3重复序列，其中RAGNNN重复的数目为3以下。
11.根据前述任一项权利要求所述的核酸序列，其中所述目的核苷酸产生治疗效果。
12.根据前述任一项权利要求所述的核酸序列，其中所述核酸序列进一步包含RRE序列或其功能性替代物。
13.一种病毒载体，包含根据前述任一项权利要求所述的核酸序列。
14.根据权利要求13所述的病毒载体，其包含多于一个目的核苷酸，并且其中至少一个目的核苷酸有效连接至权利要求1至12中任一项所限定的结合位点。
15.根据权利要求13或14所述的病毒载体，其衍生自逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒、牛痘病毒或杆状病毒。
16.根据权利要求15所述的病毒载体，其衍生自慢病毒.
17.根据权利要求16所述的慢病毒载体，其衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或绵羊脱髓鞘性脑白质炎慢病毒。
18.一种病毒载体生产系统，其包含一组编码生产病毒载体所需元件的核酸序列，其中载体基因组包含根据权利要求1至12中任一项所述的核酸序列。
19.根据权利要求18所述的病毒载体生产系统，其中所述病毒载体衍生自逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒。
20.根据权利要求19所述的病毒载体生产系统，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体，并且所述病毒载体生产系统进一步包含编码Gag和Pol蛋白、RNA结合蛋白、和Env蛋白的核酸序列，或其功能性替代物。
21.根据权利要求20所述的病毒载体生产系统，其中所述病毒载体生产系统进一步包含编码rev的核酸序列或其功能性替代物。
22.根据权利要求19至21中任一项所述的病毒载体生产系统，其中所述病毒载体衍生自慢病毒。
23.根据权利要求22所述的病毒载体生产系统，其中所述病毒载体衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或绵羊脱髓鞘性脑白质炎慢病毒。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的病毒载体生产系统，其中所述RNA结合蛋白为色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)。
25.一种DNA构建体，其用于根据权利要求18至24中任一项所述的病毒载体生产系统，所述DNA构建体包含根据权利要求1至12中任一项所述的核酸序列。
26.一种DNA构建体，其用于根据权利要求18至24中任一项所述的病毒载体生产系统，所述DNA构建体包含编码RNA结合蛋白的核酸序列。
27.根据权利要求26所述的DNA构建体，其中所述构建体包含编码色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)的核酸序列。
28.一组DNA构建体，其用于根据权利要求18至24中任一项所述的病毒载体生产系统，所述一组DNA构建体包含根据权利要求25所述的DNA构建体、编码Gag和Pol蛋白的DNA构建体、和编码Env蛋白的DNA构建体、或其功能性替代物。
29.根据权利要求28所述的一组DNA构建体，其进一步包含根据权利要求26或27所述的DNA构建体。
30.根据权利要求28或29所述的一组DNA构建体，其进一步包含编码rev序列的DNA构建体或其功能性替代物。
31.一种病毒载体生产细胞，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的核酸序列、根据权利要求18至24中任一项所述的病毒载体生产系统、或根据权利要求25至30中任一项所述的DNA构建体。
32.根据权利要求31所述的病毒载体生产细胞，其中利用编码能够与权利要求1至12中任一项所限定的结合位点相互作用的RNA结合蛋白的载体来瞬时转染所述细胞。
33.根据权利要求31所述的病毒载体生产细胞，其中所述细胞稳定表达能够与权利要求1至12中任一项所限定的结合位点相互作用的RNA结合蛋白。
34.根据权利要求31所述的病毒载体生产细胞，其中所述细胞稳定表达能够与权利要求1至12中任一项所限定的结合位点相互作用的RNA结合蛋白，并且瞬时表达来自独立的构建体的RNA结合蛋白。
35.根据权利要求31至34中任一项所述的病毒载体生产细胞，其中所述RNA结合蛋白为色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)。
36.一种生产病毒载体的方法，包括将根据权利要求1至12中任一项所述的核酸序列、根据权利要求18至24中任一项所述的病毒载体生产系统、或根据权利要求25至30中任一项所述的DNA构建体引入到病毒载体生产细胞中，并且在适合生产所述病毒载体的条件下培养所述生产细胞。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述病毒载体生产细胞包含能够与权利要求1至12中任一项所限定的结合位点相互作用的RNA结合蛋白。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述RNA结合蛋白为色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)。
39.一种病毒载体，其利用根据权利要求31至35中任一项所述的病毒载体生产细胞，由根据权利要求18至24中任一项所述的病毒载体生产系统产生，或由根据权利要求36至38中任一项所述的方法产生。
40.根据权利要求39所述的病毒载体，其包含根据权利要求1至12中任一项所述的核酸序列。
41.根据权利要求39或40所述的病毒载体，其衍生自逆转录病毒、腺病毒或腺相关病毒。
42.根据权利要求41所述的逆转录病毒载体，其衍生自慢病毒。
43.根据权利要求42所述的慢病毒载体，其衍生自HIV-1、HIV-2、SIV、FIV、BIV、EIAV、CAEV或绵羊脱髓鞘性脑白质炎慢病毒。
44.一种由根据权利要求13至17或39至43中任一项所述的病毒载体转导的细胞。
45.根据权利要求13至17或39至43中任一项所述的病毒载体或根据权利要求44所述的细胞在药物中的应用。
46.根据权利要求13至17或39至43中任一项所述的病毒载体或根据权利要求44所述的细胞在制备用于向有需要的靶位点递送目的核苷酸的药物中的应用。
47.一种治疗方法，包括向有需要的对象施用根据权利要求13至17或39至43中任一项所述的病毒载体或根据权利要求44所述的细胞。
48.一种药物组合物，包含根据权利要求13至17或39至43中任一项所述的病毒载体或根据权利要求44所述的细胞、以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
49.一种鉴定核酸结合位点和/或核酸结合蛋白的方法，其中当与所述核酸结合位点有效连接时，所述核酸结合蛋白能够与所述核酸结合位点相互作用，从而在病毒载体生产细胞内抑制目的核苷酸的翻译，其中所述方法包括分析细胞中的报告基因的表达，所述细胞包含与所述报告基因有效连接的核酸结合位点以及核酸结合蛋白。
50.根据权利要求49所述的鉴定核酸结合位点的方法，其中所述核酸结合蛋白为色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)。
51.根据权利要求49所述的鉴定核酸结合蛋白的方法，其中所述核酸结合位点能够结合色氨酸RNA结合衰减蛋白(TRAP)。
52.根据权利要求49至51中任一项所述的方法，其中所述报告基因编码荧光蛋白。
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