CN115161345A - 高表达FRα的重组载体、重组细胞及其构建方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药领域，具体而言，本发明涉及一种包含FRα编码基因的重组病毒载体、包含FRα编码基因的重组病毒颗粒、高表达FRα的重组细胞及其构建方法和用途。本发明通过选择特定的表达FRα的基因序列，构建含有FRα编码基因的重组病毒载体及重组病毒颗粒，然后将其稳转到MDA‑MB‑231细胞株中，通过在转染过程中降低培养基中的血清浓度，添加polybrene，以及调整MOI值提高病毒转染效率，最终获得高表达FRα的细胞模型，可用于以FRα为靶点的抗肿瘤药物的筛选评价。

Description

高表达FRα的重组载体、重组细胞及其构建方法和用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种高表达FRα的重组载体、重组细胞及其构建方法和用途。

背景技术

叶酸受体α(FRα)由FOLR1基因编码，是分子量为38-40kDa的细胞表面糖蛋白，最初发现是作为叶酸结合蛋白，能在牛奶中和叶酸结合，1991年作为肿瘤相关抗原被克隆。FRα是高亲和力FRs家族的一个成员，FRs家族还包括FRβ、FRγ和FRδ，它们分别由FOLR2、FOLR3和FOLR4基因编码。

FRα对还原叶酸(如5-甲基四氢叶酸和四氢叶酸)和叶酸有很高的亲和力，这些叶酸与FRα的结合促进了细胞膜上受体-配体复合物的聚集，然后经过胞吞作用内化、与溶酶体融合并酸化，最终释放出叶酸，参与之后的碳转移反应。FRα现已被证实在正常细胞中表达受限，而在绝大多数的卵巢癌以及在很多子宫癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肾癌、肺癌和乳腺癌中过度表达，FRα参与肿瘤的浸润、转移、进展，成为肿瘤治疗有吸引力的靶点。因此，目前FRα相关的靶向药物也在临床中有着广泛的应用，在临床诊断方面的应用有靶向FRα的叶酸基共轭放射性核素造影剂以及叶酸-FITC偶联探针进行荧光成像等；在治疗方面的应用更是百花齐放，从目前在研的产品药物类型去看，FRα在CAR-T、PROTAC、抗体、ADC、PDC药物等方面均有着应用。

发明内容

发明要解决的问题

目前，FRα缺乏体外高表达媒介。为此，本发明通过选择特定的表达FRα的FOLR1基因，构建含有FOLR1基因的报告系统载体，然后将其稳转到MDA-MB-231细胞株中，获得高表达FRα的抗肿瘤药物筛选细胞模型，可用于以FRα为靶点的抗肿瘤药物的靶向药效评价。

用于解决问题的方案

[1]、一种包含叶酸受体α的编码基因的重组病毒载体，其中，

所述叶酸受体α的编码基因包含如下(i)或(ii)所示的核苷酸序列：

(i)如SEQ ID NO.1所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO.1所示的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列；

所述病毒载体选自腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体；

优选地，所述重组病毒载体为重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体包含如下(iii)或(iv)所示的核苷酸序列：

(iii)如SEQ ID NO.2所示的序列；

(iv)与SEQ ID NO.2所示的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列。

[2]、一种包含叶酸受体α的编码基因的重组病毒颗粒，其中，所述重组病毒颗粒由如[1]所述的重组病毒载体经过病毒包装后得到。

[3]、一种表达叶酸受体α的重组细胞，其中，所述重组细胞包含如[2]所述的重组病毒颗粒；优选地，所述重组细胞来源于如下任一种细胞系：MDA-MB-231、HEC1B、PANC-1、TK10、A549。

[4]、一种表达叶酸受体α的重组细胞的构建方法，其中，所述构建方法包括如下步骤：

病毒感染步骤：将如[2]所述的重组病毒颗粒与癌细胞、细胞培养基和聚凝胺混合，进行共孵育；

筛选步骤：利用荧光筛选或抗生素筛选阳性克隆细胞。

[5]、根据[4]所述的构建方法，其中，在所述病毒感染步骤中，所述病毒感染的MOI值为20～50。

[6]、根据[4]或[5]所述的构建方法，其中，在所述病毒感染步骤中，所述癌细胞选自如下任一种细胞：MDA-MB-231、HEC1B、PANC-1、TK10、A549。

[7]、根据[4]～[6]中任一项所述的构建方法，其中，在所述病毒感染步骤中，所述聚凝胺的工作浓度为5～10μg/mL；所述细胞培养基为含有1％～7％(v/v)胎牛血清的IMDM培养基；

可选的，所述聚凝胺的工作浓度为5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL或10μg/mL；

可选的，所述细胞培养基中胎牛血清的含量为1％(v/v)、2％(v/v)、3％(v/v)、4％(v/v)、5％(v/v)、6％(v/v)或7％(v/v)。

[8]、根据[4]～[7]中任一项所述的构建方法，其中，在所述筛选步骤中，所述抗生素为嘌呤霉素；

可选的，所述嘌呤霉素的工作浓度为1～20μg/mL；

可选的，所述嘌呤霉素的工作浓度为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、18μg/mL、19μg/mL或20μg/mL。

[9]、根据[3]所述的表达叶酸受体α的重组细胞，和/或根据权利要求[4]～[8]中任一项所述的方法构建的重组细胞在如下(a)～(c)至少一种中的用途：

(a)靶向叶酸受体α的药物的筛选；

(b)靶向叶酸受体α的药物的药效评价；

(c)作为靶向叶酸受体α的药物筛选或药效评价的细胞模型；

优选地，所述靶向叶酸受体α的药物为抗肿瘤药物，更优选抗乳腺癌药物。

[10]、一种靶向叶酸受体α的药物的筛选方法，其中，所述方法包括将所述靶向叶酸受体α的药物与根据[3]所述的表达叶酸受体α的重组细胞，和/或根据[4]～[8]中任一项所述的方法构建的重组细胞共孵育的步骤。

发明的效果

通过上述技术方案的实施，本发明取得了以下有益效果：

在一些实施方案中，本发明提供了一种新的含有FOLR1基因的重组病毒载体，可用于构建含有FOLR1基因的重组病毒，并可用于药物的研究、评价。

在一些具体的实施方案中，本发明提供了含有FOLR1基因的重组慢病毒载体，能够用于高效、稳定表达FRα的细胞模型的构建，实现对乳腺癌药物的筛选、评价。

在一些实施方案中，本发明提供了一种新的含有FOLR1基因的重组病毒颗粒，可用于构建稳定表达FRα的重组细胞，并可用于FRα靶向药物的研发测试。

在一些具体的实施方案中，本发明提供了含有FOLR1基因的重组慢病毒颗粒，可用于感染宿主细胞，从而构建高效、稳定表达FRα的细胞模型，用于乳腺癌药物的筛选和评价。

在一些实施方案中，本发明通过在转染过程中降低培养基中的血清浓度，添加polybrene，以及调整MOI值以提高病毒转染效率。

在一些实施方案中，本发明通过转染、筛选获得了高表达FRα的抗肿瘤药物筛选细胞模型，可用于FRα靶向药物的筛选。

在一些实施方案中，本发明选择MDA-MB-231细胞株作为宿主细胞，构建高表达FRα的MDA-MB-231细胞模型，可用于针对高表达FRα的乳腺癌的候选药物的筛选。

附图说明

图1为pLVX-EF1a-hFOLR1-IRES-Puro质粒图谱。

图2为未与FRα流式抗体孵育和与FRα流式抗体孵育的MDA-MB-231细胞的流式检测结果。

图3为未与FRα流式抗体孵育和与FRα流式抗体孵育的MDA-MB-231-hFOLR1细胞的流式检测结果。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。

在本发明中，使用“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

在本发明中，“任选的”或“任选地”是指接下来描述的事件或情况可发生或可不发生，并且该描述包括该事件发生的情况和该事件不发生的情况。

在本发明中，术语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”可以指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在本发明中，所提及的“一些具体/优选的实施方式”、“另一些具体/优选的实施方式”、“实施方式”等是指所描述的与该实施方式有关的特定要素(例如，特征、结构、性质和/或特性)包括在此处所述的至少一种实施方式中，并且可存在于其它实施方式中或者可不存在于其它实施方式中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方式中。

在本发明中，使用“数值A～数值B”或“数值A-数值B”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

在本发明中，术语“一(a)”或“一(an)”或“一(the)”可以指“一个”，也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。

在本发明中，使用“v/v”表示体积百分比含量。

在本发明中，术语“工作浓度”是指某物质在工作体系中的终浓度。

在本发明中，“载体”或“表达载体”是复制子，诸如质粒、噬菌体、病毒、人工染色体或粘粒，另一DNA区段(即“插入物”)可附接至所述复制子以便引起所附接区段在细胞中的复制。进一步的，所述载体可包括，例如包含①对基因表达具有调控作用的遗传元素的集合，例如启动子和增强子；②转录成mRNA并翻译成蛋白质的结构或编码序列；以及③适当的转录和翻译起始和终止序列的转录亚单位。在一些实施方案中，本发明中的载体是指质粒。

在本发明中，术语“病毒载体”指含有主要衍生自病毒的结构和/或功能遗传元件或其部分(包括LTR等)的核酸分子。在一些实施方案中，病毒载体用于携带外源基因，促进外源基因转移到细胞内或整合到细胞的基因组中。

在本发明中，“病毒载体”的来源包括但不限于腺病毒(Adenovirus)、慢病毒(Lentivirus)、逆转录病毒(Retrovirus)等。

在本发明中，“重组病毒载体”涵盖已导入外源基因的病毒载体。

进一步地，术语“病毒包装系统”包含携带外源基因的重组质粒。除此之外，病毒包装系统还可以包含辅助成分，即辅助质粒和用于包装产生病毒颗粒的细胞系。针对不同的病毒，病毒包装系统中的辅助质粒功能不同，例如，腺病毒包装系统中的辅助质粒负责携带腺病毒主要功能基因，即提供腺病毒基因组的骨架，其可在细胞中与重组腺病毒载体发生同源重组；慢病毒包装系统及逆转录病毒包装系统中的辅助质粒负责提供转录并包装RNA到重组的病毒颗粒所需要的辅助蛋白。

在本发明中，“病毒”、“病毒颗粒”通用，是指一类可以将外源基因带入至宿主中，并达到持久性表达目的序列的病毒颗粒。相应的，在本发明中，“重组病毒”、“重组病毒颗粒”通用，涵盖利用所述重组病毒载体包装合成的已导入外源基因的病毒颗粒。

在本发明中，术语“重组细胞”涵盖导入重组核酸分子或重组载体后不同于亲本细胞的宿主细胞，重组宿主细胞具体通过转化来实现。术语“宿主细胞”包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从其衍生的子代。宿主细胞是可以用来产生本发明目标蛋白(例如，叶酸受体α)的任何类型的细胞系统，包括真核细胞，例如，哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞；和原核细胞，例如，大肠杆菌细胞。宿主细胞包括培养的细胞，也包括转基因动物、转基因植物或培养的植物组织或动物组织内部的细胞。

在本发明中，术语“转化、转染、转导”具有本领域技术人员普遍理解的意思，即将外源性的DNA导入宿主的过程。所述转化的方法包括任何将核酸导入细胞的方法，这些方法包括但不限于电穿孔法、磷酸钙沉淀法、氯化钙(CaCl₂)沉淀法、微注射法、聚乙二醇(PEG)法、DEAE-葡聚糖法、阳离子脂质体法以及乙酸锂-DMSO法。

如无特殊说明，本说明书中所使用的单位均为国际标准单位，并且本发明中出现的数值和数值范围，均应当理解为包含了不可避免的系统性误差。

除非另有定义，否则本文中使用的其他技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。

包含叶酸受体α的编码基因的重组病毒载体

本发明提供了一种包含叶酸受体α的编码基因的重组病毒载体。其中，病毒载体选自腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体构建重组病毒载体。

在一些实施方案中，本发明以腺病毒载体构建重组病毒载体。可选地，腺病毒载体来源于人腺病毒。例如，人腺病毒2型(Ad2)、人腺病毒5型(Ad5)、人腺病毒55型(Ad55)等。作为示例，腺病毒载体包括但不限于如下任一种：pHBAd-CMV-IRES-GFP、pHBAd-CMV-IRES-RFP、pHBAd-U6-GFP、pHBAd-U6-RFP。

在一些实施方案中，本发明以慢病毒载体构建重组病毒载体。可选地，慢病毒载体来源于人免疫缺陷病毒，例如，人I型免疫缺陷病毒(HIV-I)、人II型免疫缺陷病毒(HIV-II)等。作为示例，慢病毒载体包括但不限于如下任一种：pLVX-EF1a-IRES-Puro、pLVX-IRES-Puro、pLVX-Puro。

在一些实施方案中，本发明以逆转录病毒载体构建重组病毒载体。可选地，逆转录病毒载体的来源于鼠逆转录病毒。例如，鼠白血病病毒(MuLV)、莫洛尼(氏)鼠白血病逆转录病毒(MMLV)等。作为示例，逆转录病毒载体包括但不限于如下任一种：pMYs-IRES-Puro、pMXs-IRES-Puro。

在一些优选的实施方案中，本发明使用的病毒载体为慢病毒载体。在一些更优选的实施方案中，本发明使用的慢病毒载体为pLVX-EF1a-IRES-Puro。

本发明扩增了叶酸受体α的编码基因并进行人工优化，例如在终止密码子后额外添加一个腺嘌呤核苷酸用于提高终止效率，随后将该编码基因(例如以SEQ ID NO.1所示的序列)克隆至病毒载体(例如慢病毒载体pLVX-EF1a-IRES-Puro)中，例如克隆至载体的BamHI和EcoRI酶切位点之间，从而获得了包含叶酸受体α的编码基因的重组病毒载体(例如重组慢病毒载体pLVX-EF1a-hFOLR1-IRES-Puro)。

在一些具体实施方案中，本发明所述的叶酸受体α的编码基因包含如下(i)或(ii)所示的核苷酸序列：

(i)如SEQ ID NO.1所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO.1所示的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列。

在一些优选的实施方案中，本发明所述的重组病毒载体为重组慢病毒载体。在一些更优选的实施方案中，本发明所述的重组慢病毒载体包含如下(iii)或(iv)所示的核苷酸序列：

(iii)如SEQ ID NO.2所示的序列；

(iv)与SEQ ID NO.2所示的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列。

包含叶酸受体α的编码基因的重组病毒颗粒

本发明提供了一种包含叶酸受体α的编码基因的重组病毒颗粒。

在一些实施方案中，本发明利用病毒包装系统包装重组病毒颗粒。进一步地，本发明中用于包装重组病毒颗粒的病毒包装系统为慢病毒包装系统。

示例性的，慢病毒包装系统包括转移质粒(transfer plasmid)、包装质粒(packing plasmid)、包膜质粒(envelope plasmid)，以及用于包装病毒颗粒的细胞。其中，转移质粒携带外源基因，形成本发明中的重组慢病毒载体；包装质粒及包膜质粒作为辅助质粒，用于提供转录并包装RNA到重组病毒颗粒所需要的辅助蛋白。

在一些实施方案中，慢病毒包装系统中的辅助质粒选自如下任一种或多种：psPAX2、pMD2.G、pMDlg/pRRE、pRSV-Rev。在一些优选的实施方案中，慢病毒包装系统中的辅助质粒为psPAX2和pMD2.G。

在一些实施方案中，慢病毒包装系统中用于包装病毒颗粒的细胞来源于人胚胎肾细胞，示例性的，用于包装病毒颗粒的细胞为293细胞系、293T细胞系等。

在一些具体的实施方案中，本发明将所述重组慢病毒载体pLVX-EF1a-hFOLR1-IRES-Puro与慢病毒包装辅助质粒psPAX2和pMD2.G共同转染至293T细胞，从而获得含叶酸受体α的编码基因的重组慢病毒颗粒。

表达叶酸受体α的重组细胞

本发明提供了一种表达叶酸受体α的重组细胞，其包含上述重组病毒颗粒。在一些实施方案中，重组细胞中包含重组慢病毒颗粒。

示例性的，所述重组慢病毒颗粒感染宿主细胞，其基因在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到宿主细胞基因组中，整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，使宿主细胞表达目的蛋白(例如叶酸受体α)，从而获得能够表达目的蛋白的重组细胞。

在一些实施方案中，本发明使用的宿主细胞为癌细胞，例如可以选自乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫内膜癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞、肺癌细胞等。在一些具体的实施方案中，本发明使用的宿主细胞选自如下任一种细胞系：MDA-MB-231、HEC1B、PANC-1、TK10、A549。

在一些优选的实施方案中，本发明所述的重组细胞来源于MDA-MB-231细胞系。进一步的，通过利用所述重组病毒颗粒感染MDA-MB-231细胞，经筛选后获得阳性表达叶酸受体α的重组细胞MDA-MB-231-hFOLR1。

表达叶酸受体α的重组细胞的构建方法

本发明提供了一种表达叶酸受体α的重组细胞的构建方法，其包括如下步骤：

病毒感染步骤：将上述重组病毒颗粒与癌细胞、细胞培养基和聚凝胺混合，进行共孵育；

筛选步骤：利用荧光筛选或抗生素筛选阳性克隆细胞。

在一些实施方案中，本发明使用的所述癌细胞可以选自乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、子宫内膜癌细胞、胰腺癌细胞、肾癌细胞、肺癌细胞等。在一些具体实施方案中，本发明使用的癌细胞选自如下任一种细胞系：MDA-MB-231、HEC1B、PANC-1、TK10、A549；优选为MDA-MB-231。

为了针对特定宿主细胞提高病毒转染效率，可以控制病毒感染步骤中的各条件，例如细胞培养基中的血清浓度、是否添加聚凝胺(polybrene)及其添加浓度、调整病毒感染的MOI值等。

在一些实施方案中，本发明在所述病毒感染步骤中，控制病毒感染的MOI值为20～50。上述条件为经过实验摸索后得出的最适MOI值范围，能够有效提高病毒感染效率。

在一些实施方案中，本发明在所述病毒感染步骤中，添加聚凝胺，并控制聚凝胺的工作浓度为5～10μg/mL。在一些具体的实施方案中，本发明在所述病毒感染步骤中，控制聚凝胺的工作浓度为5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL或10μg/mL；优选聚凝胺的工作浓度为8μg/mL。在添加聚凝胺并控制其工作浓度后，有效提高了病毒的感染效率。

在一些实施方案中，本发明在所述病毒感染步骤中，适当降低了细胞培养基中的血清浓度，所述细胞培养基为含有1％～7％(v/v)胎牛血清的IMDM培养基。在一些具体的实施方案中，本发明在所述病毒感染步骤中，所述细胞培养基中胎牛血清的含量为1％(v/v)、2％(v/v)、3％(v/v)、4％(v/v)、5％(v/v)、6％(v/v)或7％(v/v)；优选血清含量为5％(v/v)。

由于重组病毒载体带有标记基因(例如荧光蛋白基因和特有的抗性基因)，利用其包装而成的病毒感染细胞后，阳性克隆细胞会表达相应的标记基因，因此可以利用相关检测手段进行阳性筛选。示例性的，由于在所述重组慢病毒载体中含有嘌呤霉素抗性基因，而在所述重组慢病毒颗粒感染细胞后，病毒基因组将整合至宿主细胞基因组中，因此可以利用嘌呤霉素筛选成功感染病毒的细胞，即阳性克隆细胞。

在一些实施方案中，本发明在所述筛选步骤中使用的抗生素为嘌呤霉素。

为了确保筛选结果的准确性，在一些实施方案中，本发明在所述筛选步骤中，控制嘌呤霉素的工作浓度为1～20μg/mL。在一些具体的实施方案中，在所述筛选步骤中，所述嘌呤霉素的工作浓度为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、18μg/mL、19μg/mL或20μg/mL。在一些优选的实施方案中，在所述筛选步骤中，所述嘌呤霉素的工作浓度为1μg/mL；该浓度为能够杀死全部未感染重组慢病毒颗粒的阴性克隆细胞的最低浓度。

在一些实施方案中，本发明提供的一种表达叶酸受体α的重组细胞的构建方法，在所述筛选步骤后还可以包括针对阳性克隆细胞的扩增步骤，其具体程序为：消化重悬经过筛选的阳性克隆细胞，取10μL细胞悬液至含1μg/mL嘌呤霉素的培养基中，100μL/孔铺96孔板中培养；挑取只生长一团细胞的96孔，消化重悬其细胞，取10μL细胞重悬液到10mL培养基中，100μL/孔铺96孔板中培养；挑取只生长一团细胞的96孔，挑出来转移至6孔板扩大培养。

医药用途

本发明提供的上述表达叶酸受体α的重组细胞和/或根据上述表达叶酸受体α的重组细胞的构建方法构建的重组细胞可以用于靶向叶酸受体α的药物的筛选。

本发明提供的上述表达叶酸受体α的重组细胞和/或根据上述表达叶酸受体α的重组细胞的构建方法构建的重组细胞可以用于靶向叶酸受体α的药物的药效评价。

本发明提供的上述表达叶酸受体α的重组细胞和/或根据上述表达叶酸受体α的重组细胞的构建方法构建的重组细胞可以作为靶向叶酸受体α的药物筛选或药效评价的细胞模型。

在一些实施方案中，上述靶向叶酸受体α的药物为抗肿瘤药物；

可选的，所述抗肿瘤药物为针对过表达叶酸受体α的肿瘤细胞的药物；

可选的，所述抗肿瘤药物选自如下药物中的任一种：抗乳腺癌药物，抗卵巢癌药物、抗子宫内膜癌药物、抗胰腺癌药物、抗肾癌药物和抗肺癌药物；

优选的，所述抗肿瘤药物为抗乳腺癌药物。

本发明提供了一种靶向叶酸受体α的药物的筛选方法，其中，所述方法包括将所述靶向叶酸受体α的药物与上述表达叶酸受体α的重组细胞，和/或根据上述表达叶酸受体α的重组细胞的构建方法构建的重组细胞共孵育的步骤。

本申请中涉及的核苷酸序列

FOLR1 CDS序列：ATGGCTCAGCGGATGACAACACAGCTGCTGCTCCTTCTAGTGTGGGTGGCTGTAGTAGGGGAGGCTCAGACAAGGATTGCATGGGCCAGGACTGAGCTTCTCAATGTCTGCATGAACGCCAAGCACCACAAGGAAAAGCCAGGCCCCGAGGACAAGTTGCATGAGCAGTGTCGACCCTGGAGGAAGAATGCCTGCTGTTCTACCAACACCAGCCAGGAAGCCCATAAGGATGTTTCCTACCTATATAGATTCAACTGGAACCACTGTGGAGAGATGGCACCTGCCTGCAAACGGCATTTCATCCAGGACACCTGCCTCTACGAGTGCTCCCCCAACTTGGGGCCCTGGATCCAGCAGGTGGATCAGAGCTGGCGCAAAGAGCGGGTACTGAACGTGCCCCTGTGCAAAGAGGACTGTGAGCAATGGTGGGAAGATTGTCGCACCTCCTACACCTGCAAGAGCAACTGGCACAAGGGCTGGAACTGGACTTCAGGGTTTAACAAGTGCGCAGTGGGAGCTGCCTGCCAACCTTTCCATTTCTACTTCCCCACACCCACTGTTCTGTGCAATGAAATCTGGACTCACTCCTACAAGGTCAGCAACTACAGCCGAGGGAGTGGCCGCTGCATCCAGATGTGGTTCGACCCAGCCCAGGGCAACCCCAATGAGGAGGTGGCGAGGTTCTATGCTGCAGCCATGAGTGGGGCTGGGCCCTGGGCAGCCTGGCCTTTCCTGCTTAGCCTGGCCCTAATGCTGCTGTGGCTGCTCAGCTAAA(SEQ ID NO.1)。

pLVX-EF1a-hFOLR1-IRES-Puro质粒序列：GTGCTACAAGCTAGTACCAGTTGAGCCAGATAAGGTAGAAGAGGCCAATAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTGAGCCTGCATGGGATGGATGACCCGGAGAGAGAAGTGTTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATCACGTGGCCCGAGAGCTGCATCCGGAGTACTTCAAGAACTGCTGATATCGAGCTTGCTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTAGTAGTTCATGTCATCTTATTATTCAGTATTTATAACTTGCAAAGAAATGAATATCAGAGAGTGAGAGGCCTTGACATTGCTAGCGTTTACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGGATCAACTGGATAACTCAAGCTAACCAAAATCATCCCAAACTTCCCACCCCATACCCTATTACCACTGCCAATTACCTGTGGTTTCATTTACTCTAAACCTGTGATTCCTCTGAATTATTTTCATTTTAAAGAAATTGTATTTGTTAAATATGTACTACAAACTTAGTAGTTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAAAGAAGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTAGCAGAACTACACACCAGGGCCAGGGGTCAGATATCCACTGACCTTTGGATGGTGCTACAAGCTAGTACCAGTTGAGCCAGATAAGGTAGAAGAGGCCAATAAAGGAGAGAACACCAGCTTGTTACACCCTGTGAGCCTGCATGGGATGGATGACCCGGAGAGAGAAGTGTTAGAGTGGAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATCACGTGGCCCGAGAGCTGCATCCGGAGTACTTCAAGAACTGCTGATATCGAGCTTGCTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGGCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATCCTGCATATAAGCAGCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACTTGAAAGCGAAAGGGAAACCAGAGGAGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTCAGTATTAAGCGGGGGAGAATTAGATCGCGATGGGAAAAAATTCGGTTAAGGCCAGGGGGAAAGAAAAAATATAAATTAAAACATATAGTATGGGCAAGCAGGGAGCTAGAACGATTCGCAGTTAATCCTGGCCTGTTAGAAACATCAGAAGGCTGTAGACAAATACTGGGACAGCTACAACCATCCCTTCAGACAGGATCAGAAGAACTTAGATCATTATATAATACAGTAGCAACCCTCTATTGTGTGCATCAAAGGATAGAGATAAAAGACACCAAGGAAGCTTTAGACAAGATAGAGGAAGAGCAAAACAAAAGTAAGACCACCGCACAGCAAGCGGCCGGCCGCTGATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATCTCGACGGTATCGCCTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTCGGGTTTATTACAGGGACAGCAGAGATCCAGTTTATCGATGAGGCCCTTTCGTCTTCACTCGAGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGATCCGCCACCATGGCTCAGCGGATGACAACACAGCTGCTGCTCCTTCTAGTGTGGGTGGCTGTAGTAGGGGAGGCTCAGACAAGGATTGCATGGGCCAGGACTGAGCTTCTCAATGTCTGCATGAACGCCAAGCACCACAAGGAAAAGCCAGGCCCCGAGGACAAGTTGCATGAGCAGTGTCGACCCTGGAGGAAGAATGCCTGCTGTTCTACCAACACCAGCCAGGAAGCCCATAAGGATGTTTCCTACCTATATAGATTCAACTGGAACCACTGTGGAGAGATGGCACCTGCCTGCAAACGGCATTTCATCCAGGACACCTGCCTCTACGAGTGCTCCCCCAACTTGGGGCCCTGGATCCAGCAGGTGGATCAGAGCTGGCGCAAAGAGCGGGTACTGAACGTGCCCCTGTGCAAAGAGGACTGTGAGCAATGGTGGGAAGATTGTCGCACCTCCTACACCTGCAAGAGCAACTGGCACAAGGGCTGGAACTGGACTTCAGGGTTTAACAAGTGCGCAGTGGGAGCTGCCTGCCAACCTTTCCATTTCTACTTCCCCACACCCACTGTTCTGTGCAATGAAATCTGGACTCACTCCTACAAGGTCAGCAACTACAGCCGAGGGAGTGGCCGCTGCATCCAGATGTGGTTCGACCCAGCCCAGGGCAACCCCAATGAGGAGGTGGCGAGGTTCTATGCTGCAGCCATGAGTGGGGCTGGGCCCTGGGCAGCCTGGCCTTTCCTGCTTAGCCTGGCCCTAATGCTGCTGTGGCTGCTCAGCTAAAGAATTCCTCGAGGGCGGCCGCTCTAGAGTCGACGGGCCGCGGTAACAATTGTTAACTAACTTAAGCTAGCAACGGTTTCCCTCTAGCGGGATCAATTCCGCCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATAATACCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCAGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGATCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGACCCGGGCGGGGCGCGTCTGGAACAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGCTGACGTCCTTTCCATGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTGGAATTAATTCTGCAGTCGAGACCTAGAAAAACATGGAGCAATCACAAGTAGCAATACAGCAGCTACCAATGCTGATTGTGCCTGGCTAGAAGCACAAGAGGAGGAGGAGGTGGGTTTTCCAGTCACACCTCAGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGAGGGGACTGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATATCCTTGATCTGTGGATCTACCACACACAAGGCTACTTCCCTGATTAGCAGAACTACACACCAGGGCCAGGGGTCAGATATCCACTGACCTTTGGATG(SEQ ID NO.2)。

引物1序列：ACCTTAACTAGGTCTCGGATCCGCCACCATGGCTCAGCGGATGACAAC(SEQ IDNO.3)。

引物2序列：CGCAACGTTCCGGGGTCTCGAATTCTTTAGCTGAGCAGCCACA(SEQ ID NO.4)。

实施例

本发明通过下述实施例进一步阐明，但任何实施例或其组合不应当理解为对本发明的范围或实施方式的限制。本发明的范围由所附权利要求书限定，结合本说明书和本领域一般常识，本领域普通技术人员可以清楚地明白权利要求书所限定的范围。在不偏离本发明的精神和范围的前提下，本领域技术人员可以对本发明的技术方案进行任何修改或改变，这种修改和改变也包含在本发明的范围内。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所有试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购的常规产品。为了更好地说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段、器材和步骤未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。

实施例1：含有FOLR1基因的表达载体的构建

由引物1(ACCTTAACTAGGTCTCGGATCCGCCACCATGGCTCAGCGGATGACAAC)及引物2(CGCAACGTTCCGGGGTCTCGAATTCTTTAGCTGAGCAGCCACA)，以

High-Fidelity DNAPolymerases(NEB,M0491)扩增hFOLR1CDS序列(SEQ ID NO.1)。

PCR扩增条件：

表1

PCR扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳确认约800bp产物扩增成功。PCR扩增产物以necleospin Gel&PCR purification KIT(MN,740609.50)纯化至去离子水中。纯化产物以BsaI-HF(NEB,R3535)酶切后进行1％琼脂糖凝胶电泳，以necleospin Gel&PCRpurification KIT(MN,740609.50)回收790bp。酶切回收片段以T4连接酶连入含有BamHI-HF(NEB,R3136)及EcoRI-HF(NEB,R3101)酶切位点的的pLVX-EF1a-IRES-Puro(载体信息参考https://www.addgene.org/85132/)载体中构建成pLVX-EF1a-hFOLR1-IRES-Puro质粒(质粒图谱见图1)。连接产物转化至Stbl3感受态细胞(康体生命，KTSM110L)中，挑取单克隆以引物1及引物2PCR鉴定正确后，将阳性克隆菌液送至金唯智进行测序。测序比对正确的阳性克隆以EndoFree Plasmid Kit(Qiagen,12362)提取质粒备用。

实施例2：含有FOLR1基因的慢病毒的包装

(1)将293T细胞接种于6孔板中，待细胞密度达到70％～80％时，将培养基更换为无血清培养基。

(2)配制DNA稀释液：取无内毒素的psPAX2(2μg)、pMD2.G(1μg)及实施例1中构建得到的表达质粒pLVX-EF1a-hFOLR1-IRES-Puro(2μg)加入到250μL Opti-MEM培养基中，混匀。

(3)配制脂质体稀释液：取50μL Lipofectamine 2000转染试剂加入到250μLOpti-MEM培养基中，混匀。

(4)将DNA稀释液与脂质体稀释液按照体积比1:1混匀，室温孵育15～30min，得到DNA-脂质体复合物。

(5)将DNA-脂质体复合物加入到(1)中的293T细胞中，放入细胞培养箱培养6h后，将培养基更换为DMEM完全培养基。

(6)收集转染后24h、48h和72h的培养基上清，中间补加新鲜的培养基。

(7)将收集到的培养基上清于4℃、2000g离心10min，取上清。使用无菌0.45μm滤膜将上清过滤至50mL离心管内。

(8)加入适量5×PEG8000溶液，充分混匀，4℃放置过夜。

(9)2200g离心90min，离心管底部出现白色沉淀，即为含有FOLR1基因的慢病毒颗粒，弃尽上清，用适量无菌HBSS缓冲液重悬病毒沉淀，分装于1.5ml EP管中，-80℃保存备用。

实施例3：高表达FRα的MDA-MB-231-hFOLR1细胞模型的构建

(1)细胞培养：用含10％胎牛血清和1％双抗的IMDM培养基将MDA-MB-231细胞于10cm²细胞培养皿中培养，待细胞汇合度至50～90％时，将细胞接种于24孔板中，培养24h。

(2)病毒转染：从-80℃冰箱取出实施例2收集的病毒，冰浴融化，根据预实验得到的感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)，用新鲜培养基(IMDM+5％FBS+1％双抗)将病毒稀释至所需浓度，MOI值为20～50。吸去细胞原有培养基，按照MOI，将稀释好的病毒液+培养基+Polybrene(终浓度为8μg/mL)加入细胞中，轻轻摇匀，37℃培养过夜。

(3)换液：在转染16～24h后，弃去病毒转染液，换成新鲜完全培养基。

(4)扩大培养：病毒转染后待细胞融合率达到90％后，将细胞转移至10cm²的细胞培养皿中。

(5)筛选感染细胞：因病毒载体上带有puromycin抗性基因，细胞感染上病毒后则会获得puromycin抗性，根据这一特性，利用puromycin处理病毒感染后的细胞可从中筛选出成功感染病毒的细胞，即阳性克隆细胞，并将其命名为MDA-MB-231-hFOLR1细胞。筛选之前，需探索能够杀死空细胞的最佳puromycin浓度：细胞铺六孔板使第二天融合率约为30％～40％，24h换含不同浓度puromycin的新鲜培养基，梯度设置为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、16、17、18、19、20μg/mL，puro处理10天，观察细胞的死亡情况，选取能够杀死全部细胞的最低浓度。结果显示puro的浓度选择为1μg/mL。

(6)阳性克隆扩增：消化重悬步骤(5)筛选的阳性克隆细胞，取10μL细胞悬液至含1μg/mL puromycin培养基中，100μL/孔铺96孔板中培养；挑取只生长一团细胞的96孔，消化重悬，取10μL细胞重悬液到10mL培养基中，100μL/孔铺96孔板中培养；挑取只生长一团细胞的96孔，挑出来转移至6孔板扩大培养。

(7)流式细胞仪检测结果：胰酶消化后收集细胞并计数，将细胞悬液稀释成1×10⁶cell/mL，每孔加入100μL细胞悬液于圆底96孔板中，离心后甩去上清，用含1％BSA的PBS按照1:500的比例稀释FRα流式抗体，将稀释后的抗体按照每孔100μL加入对应的96孔板中，4℃孵育30min，用含0.2％BSA的PBS洗涤两次后，PBS重悬上机检测。

未与FRα流式抗体孵育和与FRα流式抗体孵育的MDA-MB-231细胞的流式检测结果见图2，未与FRα流式抗体孵育和与FRα流式抗体孵育的MDA-MB-231-hFOLR1细胞的流式检测结果见图3。对比图2和图3可以看出，MDA-MB-231-hFOLR1相较于MDA-MB-231细胞，可高效表达FRα。

实施例3：MDA-MB-231-hFOLR1用于评价叶酸靶向药的应用

(1)使用含2％FBS的PBS稀释FA-CY5，配制终浓度为8μM的样品；

(2)分别消化MDA-MB-231及MDA-MB-231-hFOLR1细胞，1000rpm离心5min，用IMDM完整培养基重悬细胞后进行细胞计数；

(3)取圆底96孔板，按照100000cell/well铺板，铺完后置于培养箱稳定10min；

(4)上述96孔板离心5min，弃去培养基，每孔加入200μL用PBS稀释好的FA-CY5，吹打混匀；

(5)37℃孵育30min；

(6)用预冷的PBS洗去未结合样品，洗两遍；

(7)每孔加入200μL PBS吹打混匀，通过流式细胞仪在APC通道内读取10000个细胞的荧光数值。

结果显示MDA-MB-231-hFOLR1荧光强度明显高于MDA-MB-231，表明FA-CY5在MDA-MB-231-hFOLR1细胞上更容易结合并内吞，这也侧面说明了MDA-MB-231-hFOLR1由于稳定表达FRα，介导FA-CY5更容易与细胞膜上的FRα结合并内吞。

表2

样品	Median APC-H	APC-H比值
			MDA-MB-231-hFOLR1(FA-CY5)	31153	12.06
MDA-MB-231(FA-CY5)	2584	1

本说明书公开的所有技术特征都可以任何组合方式进行组合。本说明所公开的每个特征也可以被其它具有相同、相等或相似作用的特征所替换。因此，除非特殊说明，所公开的每一特征仅仅是一系列相等或相似特征的实例。

此外，从上述描述中，本领域技术人员可从本公开中很容易清楚本公开的关键特征，在不脱离本公开的精神及范围的情况下，可对发明进行很多修改以适应各种不同的使用目的及条件，因此这类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。

序列表

<110> 同宜医药（苏州）有限公司

<120> 高表达FRα的重组载体、重组细胞及其构建方法和用途

<130> 6C32-2243016IP-SU

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 775

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FOLR1 CDS序列

<400> 1

atggctcagc ggatgacaac acagctgctg ctccttctag tgtgggtggc tgtagtaggg 60

gaggctcaga caaggattgc atgggccagg actgagcttc tcaatgtctg catgaacgcc 120

aagcaccaca aggaaaagcc aggccccgag gacaagttgc atgagcagtg tcgaccctgg 180

aggaagaatg cctgctgttc taccaacacc agccaggaag cccataagga tgtttcctac 240

ctatatagat tcaactggaa ccactgtgga gagatggcac ctgcctgcaa acggcatttc 300

atccaggaca cctgcctcta cgagtgctcc cccaacttgg ggccctggat ccagcaggtg 360

gatcagagct ggcgcaaaga gcgggtactg aacgtgcccc tgtgcaaaga ggactgtgag 420

caatggtggg aagattgtcg cacctcctac acctgcaaga gcaactggca caagggctgg 480

aactggactt cagggtttaa caagtgcgca gtgggagctg cctgccaacc tttccatttc 540

tacttcccca cacccactgt tctgtgcaat gaaatctgga ctcactccta caaggtcagc 600

aactacagcc gagggagtgg ccgctgcatc cagatgtggt tcgacccagc ccagggcaac 660

cccaatgagg aggtggcgag gttctatgct gcagccatga gtggggctgg gccctgggca 720

gcctggcctt tcctgcttag cctggcccta atgctgctgt ggctgctcag ctaaa 775

<210> 2

<211> 9487

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> pLVX-EF1a-hFOLR1-IRES-Puro质粒序列

<400> 2

gtgctacaag ctagtaccag ttgagccaga taaggtagaa gaggccaata aaggagagaa 60

caccagcttg ttacaccctg tgagcctgca tgggatggat gacccggaga gagaagtgtt 120

agagtggagg tttgacagcc gcctagcatt tcatcacgtg gcccgagagc tgcatccgga 180

gtacttcaag aactgctgat atcgagcttg ctacaaggga ctttccgctg gggactttcc 240

agggaggcgt ggcctgggcg ggactgggga gtggcgagcc ctcagatcct gcatataagc 300

agctgctttt tgcctgtact gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 360

ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag 420

tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 480

cagtgtggaa aatctctagc agtagtagtt catgtcatct tattattcag tatttataac 540

ttgcaaagaa atgaatatca gagagtgaga ggccttgaca ttgctagcgt ttaccgtcga 600

cctctagcta gagcttggcg taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc 660

cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct 720

aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 780

acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta 840

ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc 900

gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg 960

caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt 1020

tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 1080

gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct 1140

ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc 1200

cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg 1260

tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct 1320

tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 1380

cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga 1440

agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga 1500

agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg 1560

gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag 1620

aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 1680

ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat 1740

gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct 1800

taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 1860

tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 1920

tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 1980

gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 2040

gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 2100

ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 2160

cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 2220

tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 2280

cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 2340

agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 2400

cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 2460

aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 2520

aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 2580

gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 2640

gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca 2700

tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat 2760

ttccccgaaa agtgccacct gacgtcgacg gatcgggaga tcaacttgtt tattgcagct 2820

tataatggtt acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca 2880

ctgcattcta gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttatcatgt ctggatcaac 2940

tggataactc aagctaacca aaatcatccc aaacttccca ccccataccc tattaccact 3000

gccaattacc tgtggtttca tttactctaa acctgtgatt cctctgaatt attttcattt 3060

taaagaaatt gtatttgtta aatatgtact acaaacttag tagttggaag ggctaattca 3120

ctcccaaaga agacaagata tccttgatct gtggatctac cacacacaag gctacttccc 3180

tgattagcag aactacacac cagggccagg ggtcagatat ccactgacct ttggatggtg 3240

ctacaagcta gtaccagttg agccagataa ggtagaagag gccaataaag gagagaacac 3300

cagcttgtta caccctgtga gcctgcatgg gatggatgac ccggagagag aagtgttaga 3360

gtggaggttt gacagccgcc tagcatttca tcacgtggcc cgagagctgc atccggagta 3420

cttcaagaac tgctgatatc gagcttgcta caagggactt tccgctgggg actttccagg 3480

gaggcgtggc ctgggcggga ctggggagtg gcgagccctc agatcctgca tataagcagc 3540

tgctttttgc ctgtactggg tctctctggt tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg 3600

gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag 3660

tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc cctcagaccc ttttagtcag 3720

tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa cagggacttg aaagcgaaag ggaaaccaga 3780

ggagctctct cgacgcagga ctcggcttgc tgaagcgcgc acggcaagag gcgaggggcg 3840

gcgactggtg agtacgccaa aaattttgac tagcggaggc tagaaggaga gagatgggtg 3900

cgagagcgtc agtattaagc gggggagaat tagatcgcga tgggaaaaaa ttcggttaag 3960

gccaggggga aagaaaaaat ataaattaaa acatatagta tgggcaagca gggagctaga 4020

acgattcgca gttaatcctg gcctgttaga aacatcagaa ggctgtagac aaatactggg 4080

acagctacaa ccatcccttc agacaggatc agaagaactt agatcattat ataatacagt 4140

agcaaccctc tattgtgtgc atcaaaggat agagataaaa gacaccaagg aagctttaga 4200

caagatagag gaagagcaaa acaaaagtaa gaccaccgca cagcaagcgg ccggccgctg 4260

atcttcagac ctggaggagg agatatgagg gacaattgga gaagtgaatt atataaatat 4320

aaagtagtaa aaattgaacc attaggagta gcacccacca aggcaaagag aagagtggtg 4380

cagagagaaa aaagagcagt gggaatagga gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca 4440

ggaagcacta tgggcgcagc gtcaatgacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct 4500

ggtatagtgc agcagcagaa caatttgctg agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg 4560

caactcacag tctggggcat caagcagctc caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac 4620

ctaaaggatc aacagctcct ggggatttgg ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact 4680

gctgtgcctt ggaatgctag ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg 4740

acctggatgg agtgggacag agaaattaac aattacacaa gcttaataca ctccttaatt 4800

gaagaatcgc aaaaccagca agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg 4860

gcaagtttgt ggaattggtt taacataaca aattggctgt ggtatataaa attattcata 4920

atgatagtag gaggcttggt aggtttaaga atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat 4980

agagttaggc agggatattc accattatcg tttcagaccc acctcccaac cccgagggga 5040

cccgacaggc ccgaaggaat agaagaagaa ggtggagaga gagacagaga cagatccatt 5100

cgattagtga acggatctcg acggtatcgc ctttaaaaga aaagggggga ttggggggta 5160

cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat agcaacagac atacaaacta aagaattaca 5220

aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttcg ggtttattac agggacagca gagatccagt 5280

ttatcgatga ggccctttcg tcttcactcg aggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc 5340

gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag 5400

gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg 5460

tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt 5520

tgccgccaga acacaggtaa gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg 5580

ttatggccct tgcgtgcctt gaattacttc cacctggctg cagtacgtga ttcttgatcc 5640

cgagcttcgg gttggaagtg ggtgggagag ttcgaggcct tgcgcttaag gagccccttc 5700

gcctcgtgct tgagttgagg cctggcctgg gcgctggggc cgccgcgtgc gaatctggtg 5760

gcaccttcgc gcctgtctcg ctgctttcga taagtctcta gccatttaaa atttttgatg 5820

acctgctgcg acgctttttt tctggcaaga tagtcttgta aatgcgggcc aagatctgca 5880

cactggtatt tcggtttttg gggccgcggg cggcgacggg gcccgtgcgt cccagcgcac 5940

atgttcggcg aggcggggcc tgcgagcgcg gccaccgaga atcggacggg ggtagtctca 6000

agctggccgg cctgctctgg tgcctggcct cgcgccgccg tgtatcgccc cgccctgggc 6060

ggcaaggctg gcccggtcgg caccagttgc gtgagcggaa agatggccgc ttcccggccc 6120

tgctgcaggg agctcaaaat ggaggacgcg gcgctcggga gagcgggcgg gtgagtcacc 6180

cacacaaagg aaaagggcct ttccgtcctc agccgtcgct tcatgtgact ccacggagta 6240

ccgggcgccg tccaggcacc tcgattagtt ctcgagcttt tggagtacgt cgtctttagg 6300

ttggggggag gggttttatg cgatggagtt tccccacact gagtgggtgg agactgaagt 6360

taggccagct tggcacttga tgtaattctc cttggaattt gccctttttg agtttggatc 6420

ttggttcatt ctcaagcctc agacagtggt tcaaagtttt tttcttccat ttcaggtgtc 6480

gtgaggatcc gccaccatgg ctcagcggat gacaacacag ctgctgctcc ttctagtgtg 6540

ggtggctgta gtaggggagg ctcagacaag gattgcatgg gccaggactg agcttctcaa 6600

tgtctgcatg aacgccaagc accacaagga aaagccaggc cccgaggaca agttgcatga 6660

gcagtgtcga ccctggagga agaatgcctg ctgttctacc aacaccagcc aggaagccca 6720

taaggatgtt tcctacctat atagattcaa ctggaaccac tgtggagaga tggcacctgc 6780

ctgcaaacgg catttcatcc aggacacctg cctctacgag tgctccccca acttggggcc 6840

ctggatccag caggtggatc agagctggcg caaagagcgg gtactgaacg tgcccctgtg 6900

caaagaggac tgtgagcaat ggtgggaaga ttgtcgcacc tcctacacct gcaagagcaa 6960

ctggcacaag ggctggaact ggacttcagg gtttaacaag tgcgcagtgg gagctgcctg 7020

ccaacctttc catttctact tccccacacc cactgttctg tgcaatgaaa tctggactca 7080

ctcctacaag gtcagcaact acagccgagg gagtggccgc tgcatccaga tgtggttcga 7140

cccagcccag ggcaacccca atgaggaggt ggcgaggttc tatgctgcag ccatgagtgg 7200

ggctgggccc tgggcagcct ggcctttcct gcttagcctg gccctaatgc tgctgtggct 7260

gctcagctaa agaattcctc gagggcggcc gctctagagt cgacgggccg cggtaacaat 7320

tgttaactaa cttaagctag caacggtttc cctctagcgg gatcaattcc gccccccccc 7380

cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt gtgcgtttgt ctatatgtta 7440

ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc ggaaacctgg ccctgtcttc 7500

ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag gaatgcaagg tctgttgaat 7560

gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac aaacaacgtc tgtagcgacc 7620

ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc gacaggtgcc tctgcggcca aaagccacgt 7680

gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc acgttgtgag ttggatagtt 7740

gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca aggggctgaa ggatgcccag 7800

aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt gcacatgctt tacatgtgtt 7860

tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga 7920

aaaacacgat aataccatga ccgagtacaa gcccacggtg cgcctcgcca cccgcgacga 7980

cgtccccagg gccgtacgca ccctcgccgc cgcgttcgcc gactaccccg ccacgcgcca 8040

caccgtcgat ccggaccgcc acatcgagcg ggtcaccgag ctgcaagaac tcttcctcac 8100

gcgcgtcggg ctcgacatcg gcaaggtgtg ggtcgcggac gacggcgccg cggtggcggt 8160

ctggaccacg ccggagagcg tcgaagcggg ggcggtgttc gccgagatcg gcccgcgcat 8220

ggccgagttg agcggttccc ggctggccgc gcagcaacag atggaaggcc tcctggcgcc 8280

gcaccggccc aaggagcccg cgtggttcct ggccaccgtc ggcgtctcgc ccgaccacca 8340

gggcaagggt ctgggcagcg ccgtcgtgct ccccggagtg gaggcggccg agcgcgccgg 8400

ggtgcccgcc ttcctggaga cctccgcgcc ccgcaacctc cccttctacg agcggctcgg 8460

cttcaccgtc accgccgacg tcgaggtgcc cgaaggaccg cgcacctggt gcatgacccg 8520

caagcccggt gcctgacccg ggcggggcgc gtctggaaca atcaacctct ggattacaaa 8580

atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac 8640

gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc 8700

ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt 8760

ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc 8820

tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc 8880

gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg 8940

gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt 9000

ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc 9060

cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt 9120

cggatctccc tttgggccgc ctccccgcct ggaattaatt ctgcagtcga gacctagaaa 9180

aacatggagc aatcacaagt agcaatacag cagctaccaa tgctgattgt gcctggctag 9240

aagcacaaga ggaggaggag gtgggttttc cagtcacacc tcaggtacct ttaagaccaa 9300

tgacttacaa ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagagg ggactggaag 9360

ggctaattca ctcccaacga agacaagata tccttgatct gtggatctac cacacacaag 9420

gctacttccc tgattagcag aactacacac cagggccagg ggtcagatat ccactgacct 9480

ttggatg 9487

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物1序列

<400> 3

accttaacta ggtctcggat ccgccaccat ggctcagcgg atgacaac 48

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物2序列

<400> 4

cgcaacgttc cggggtctcg aattctttag ctgagcagcc aca 43

Claims (10)

1.一种包含叶酸受体α的编码基因的重组病毒载体，其中，

所述叶酸受体α的编码基因包含如下(i)或(ii)所示的核苷酸序列：

(i)如SEQ ID NO.1所示的序列；

(ii)与SEQ ID NO.1所示的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列；

所述病毒载体选自腺病毒载体、慢病毒载体或逆转录病毒载体；

优选地，所述重组病毒载体为重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体包含如下(iii)或(iv)所示的核苷酸序列：

(iii)如SEQ ID NO.2所示的序列；

(iv)与SEQ ID NO.2所示的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列。

2.一种包含叶酸受体α的编码基因的重组病毒颗粒，其中，所述重组病毒颗粒由如权利要求1所述的重组病毒载体经过病毒包装后得到。

3.一种表达叶酸受体α的重组细胞，其中，所述重组细胞包含如权利要求2所述的重组病毒颗粒；优选地，所述重组细胞来源于如下任一种细胞系：MDA-MB-231、HEC1B、PANC-1、TK10、A549。

4.一种表达叶酸受体α的重组细胞的构建方法，其中，所述构建方法包括如下步骤：

病毒感染步骤：将如权利要求2所述的重组病毒颗粒与癌细胞、细胞培养基和聚凝胺混合，进行共孵育；

筛选步骤：利用荧光筛选或抗生素筛选阳性克隆细胞。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其中，在所述病毒感染步骤中，所述病毒感染的MOI值为20～50。

6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其中，在所述病毒感染步骤中，所述癌细胞选自如下任一种细胞：MDA-MB-231、HEC1B、PANC-1、TK10、A549。

7.根据权利要求4～6中任一项所述的构建方法，其中，在所述病毒感染步骤中，所述聚凝胺的工作浓度为5～10μg/mL；所述细胞培养基为含有1％～7％(v/v)胎牛血清的IMDM培养基；

可选的，所述聚凝胺的工作浓度为5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL或10μg/mL；

可选的，所述细胞培养基中胎牛血清的含量为1％(v/v)、2％(v/v)、3％(v/v)、4％(v/v)、5％(v/v)、6％(v/v)或7％(v/v)。

8.根据权利要求4～7中任一项所述的构建方法，其中，在所述筛选步骤中，所述抗生素为嘌呤霉素；

可选的，所述嘌呤霉素的工作浓度为1～20μg/mL；

可选的，所述嘌呤霉素的工作浓度为1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、18μg/mL、19μg/mL或20μg/mL。

9.根据权利要求3所述的表达叶酸受体α的重组细胞，和/或根据权利要求4～8中任一项所述的方法构建的重组细胞在如下(a)～(c)至少一种中的用途：

(a)靶向叶酸受体α的药物的筛选；

(b)靶向叶酸受体α的药物的药效评价；

(c)作为靶向叶酸受体α的药物筛选或药效评价的细胞模型；

优选地，所述靶向叶酸受体α的药物为抗肿瘤药物，更优选抗乳腺癌药物。

10.一种靶向叶酸受体α的药物的筛选方法，其中，所述方法包括将所述靶向叶酸受体α的药物与根据权利要求3所述的表达叶酸受体α的重组细胞，和/或根据权利要求4～8中任一项所述的方法构建的重组细胞共孵育的步骤。

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