CN113355323A - 人源化ace2基因改造小鼠模型的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种人源化ACE2基因改造小鼠模型的制备方法及应用。本发明提供了一种打靶载体，所述打靶载体包含5’同源臂序列、人源ACE2基因片段和SV40polyA序列。这种打靶载体，能够特异性的靶向ACE2基因，可用于制备人源化ACE2基因改造小鼠胚胎干细胞模型，再用所述的胚胎干细胞制备得到人源化ACE2基因改造小鼠。本发明得到的这种人源化ACE2基因改造小鼠在RNA水平以及蛋白水平上表达人ACE2。这种人源化ACE2基因改造小鼠对SARS‑CoV‑2易感。从而成功地获得了对2019‑nCoV易感的小鼠，从而能够很好地为2019‑nCoV的药物筛选或其他研究提供很好的动物模型，具有很好的现实意义。

Description

人源化ACE2基因改造小鼠模型的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，尤其涉及一种人源化ACE2基因改造小鼠模型的制备方法及应用。
背景技术
虽然现阶段已有在Vero E6 cells等细胞模型上感染2019-nCoV进行药物筛选，但细胞模型的单一性远不能比拟动物模型优势。
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和治疗药物是不可缺少的研究工具。常见的实验动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠(仓鼠)、兔、犬、猴、猪和鱼等。然而，人类和动物的基因和蛋白质序列还是存在不少差异，许多人类蛋白质不能与动物的同源蛋白质结合而产生生物活性，导致许多临床试验的结果也与动物实验的结果不相符。
随着基因工程技术的不断发展和成熟,用人类细胞或基因替代或置换动物的内源性同类细胞或基因，以建立更接近人类的生物体系或疾病模型，建立人源化实验动物模型(humanized animal model1)，已经为临床上新的治疗方法或手段提供了重要工具。其中基因人源化动物模型，即利用基因遗传操作技术，用人类正常或突变基因替换动物同类基因，可在动物体内建立更接近人类的正常或突变，体系的塞因大源化呦物模型。因大源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化还可改进和提升细胞人源化小鼠CN107815468 A2/28页模型，更重要的是，由于人类基因片段的存在，动物体内可表达或部分表达含有人类功能的蛋白质，从而大大减少人和动物的临床实验差异，为在动物水平进行药物筛选提供了可能。
2019-nCoV与SARS冠状病毒一样都以血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2, ACE2)作为感染人类的关键靶点，其中2019-nCoV除感染人类外还可感染多种哺乳动物如猴子、猪、兔子、白鼬、猩猩等，但小鼠和大鼠除外(Wan,Y.,et al.,Receptor recognition by novel coronavirus from Wuhan:An analysis based ondecade-long structural studies of SARS.J Virol,2020)。猴子、猪以及兔子等作为动物模型感染2019-nCoV用作药物筛选而言，其生长周期较长且体型较大难以大批量操作，而相对容易大批量操作的小鼠模型却对2019-nCoV不易感。
发明内容
由于人源ACE2和鼠源ACE2在基因序列上存在一定差异，有文献报道：病毒感染后，人源ACE2较鼠源ACE2对SARS-CoV的敏感性更强，病理症状更为明显。目前的临床研究急需更好的动物模型。
已有hACE2转基因小鼠被证实可感染2019-nCoV并出现肺部组织典型致病特征(https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2020.02.07.939389v3#disqus_thread)。但hACE2转基因小鼠为全身性过表达hACE2小鼠模型，并不能模拟ACE2时空组织表达特征，本发明人源化ACE2小鼠模型为原小鼠Ace2位点特异性表达hACE2小鼠模型，可模拟原mACE2表达特征，具有组织特异性，更为严谨的模拟人感染2019-nCoV发病过程。
所以本公开将通过在小鼠Ace2位点表达人源化ACE2的方法大批量制备2019-nCoV易感小鼠人源化 ACE2动物模型来对2019-nCoV进行药物筛选和疾病研究等应用。
本发明的目的之一在于提供一种特异性的RNA片段序列。
本发明另一个目的在于提供一种特异性的靶向ACE2基因的sgRNA序列。
本发明另一个目的在于提供一种特异性的靶向ACE2基因的靶向载体。
本发明另一个目的在于提供一种ACE2基因人源化细胞株。
本发明另一个目的在于提供一种ACE2基因人源化细胞株的构建方法。
本发明另一个目的在于提供一种ACE2基因人源化细胞株。本发明另一个目的在于提供一种基因人源化动物的构建方法。
本发明还有一个目的在于提供一种人源化ACE2基因改造小鼠胚胎干细胞模型。
一方面，本发明提供了一种引物组合，所述引物组合包括如SEQ ID NO:19所示的上游引物和SEQ ID NO:20所示的下游引物。
一些实施例中，所述引物组合还包括如SEQ ID NO:21所示的上游引物和如SEQ IDNO:22所示的下游引物。
一些实施例中，所述引物组合还包括如SEQ ID NO:23所示的上游引物和如SEQ IDNO:24所示的下游引物。
一些实施例中，所述引物组合还包含如SEQ ID NO:25所示的上游引物和如SEQ IDNO:26所示的下游引物。
另一方面，本发明提供了所述引物组合在构建人源化动物细胞模型或动物模型中的应用。
另一方面，本发明提供了所述引物组合在制备打靶载体中的应用。
另一方面，本发明提供了一种打靶载体，包含5’同源臂序列、人源ACE2基因片段和SV40 polyA序列。所述5’同源臂为与在所述目标基因组基因座处的5’靶序列同源的5’同源臂。
一些实施例中，所述打靶载体通过使用所述的引物组合连接5’同源臂序列、人源ACE2基因片段和 SV40 polyA序列。
一些实施例中，所述靶向载体用于将人源ACE2基因的CDS序列插入到动物基因的启动子和5’UTR 区域序列后，利用动物目的基因启动子启动人目的基因表达。
一些实施例中，所述5’同源臂序列如SEQ ID NO:15所示，所述ACE2基因的CDS序列如SEQ ID NO:12所示，所述SV40 polyA序列如SEQ ID NO:14所示，所述SV40 polyA序列位于所述的CDS序列之后。
一些实施例中，所述打靶载体还包含3’同源臂，所述3’同源臂为与在所述目标基因组基因座处的3’靶序列同源的3’同源臂。
一些实施例中，所述打靶载体还包含如SEQ ID NO:17所示的筛选标志PGK-Puro。
一些实施例中，所述打靶载体还包含如SEQ ID NO:18所示的Frt序列。
一些实施例中，所述打靶载体各个序列片段的连接顺序依次为5’同源臂序列、人源ACE2基因片段、SV40 polyA序列、frt序列、PGK-Puro序列、frt序列和3’同源臂序列。
一些实施例中，所述动物为哺乳动物。
一些实施例中，所述哺乳动物为啮齿类动物。
一些实施例中，所述动物为鼠。
另一方面，本发明提供了所述的打靶载体在制备基因人源化动物模型中的应用。
另一方面，本发明提供了一种制备所述打靶载体的方法，包括以下步骤：将PCR扩增得到的产物片段5’同源臂、人ACE2 CDS和SV40 polyA使用搭桥PCR法PCR成连续片段5arm-hACE-SV40。
一些实施例中，所述PCR反应体系为：2×Phanta Max Buffer 25μL；dNTP Mix 1μL；10μM上游引物2μL；10μM下游引物2μL；DNA Polymerase 1μL；模板链5’同源臂、人ACE2CDS、SV40 polyA 片段各50ng；H2O至50μL；PCR扩增反应条件65℃起始，每个循环降0.3℃。
一些实施例中，所述5’同源臂片段使用的引物包括如SEQ ID NO:19所示的上游引物和SEQ ID NO:20所示的下游引物；所述人源ACE2基因片段使用的引物包括如SEQ ID NO:21所示的上游引物和如 SEQ ID NO:22所示的下游引物；所述SV40 polyA序列使用的引物包括如SEQ ID NO:23所示的上游引物和如SEQ ID NO:24所示的下游引物。
一些实施例中，所述方法还包括以下步骤：将5arm-hACE-SV40片段进行AgeI+MluI双酶切；3’同源臂片段进行AscI+HindIII双酶切后分别通过酶切连接的方法连接上去，从而得打靶载体。
一些实施例中，所述3’同源臂片段使用的引物包括如SEQ ID NO:25所示的上游引物和如SEQ ID NO:26所示的下游引物。
另一方面，本发明提供了一种人源化动物细胞株的构建方法，所述方法中使用了所述的引物组合。
一些实施例中，所述方法包括将人源目的基因导入动物细胞中，使得目的基因在动物细胞内表达人源目的基因的CDS。
一些实施例中，所述目的基因为ACE2。
一些实施例中，所述动物为哺乳动物。
一些实施例中，所述动物为啮齿类动物。
一些实施例中，所述动物为鼠。
一些实施例中，所述细胞为胚胎干细胞。
一些实施例中，所述构建方法包括以下步骤：(1)构建权利要求1所述的打靶载体；(2)将构建的打靶载体和连接有sgRNA的载体导入动物来源的胚胎干细胞中；(3)将步骤(2)中的胚胎干细胞培养成克隆，即得。
一些实施例中，所述sgRNA包括如SEQ ID NO：1所示的序列。
一些实施例中，所述动物为哺乳动物。
一些实施例中，所述哺乳动物为啮齿类动物。
一些实施例中，所述啮齿类动物为鼠。
另一方面，本发明提供了所述的方法制备得到的ACE2基因人源化动物细胞株。
另一方面，本发明提供了一种基因人源化动物模型的构建方法，包括将所述的人源化动物细胞注入动物体内。
利用本发明的方法成功得到了人源化ACE2基因改造小鼠。
在一些实施方式中，所述人源化ACE2基因改造小鼠在RNA水平上表达人ACE2并具有组织特异性。
在一些实施方式中，所述人源化ACE2基因改造小鼠在蛋白水平上表达人ACE2并具有组织特异性。
在一些实施方式中，本发明研究显示利用本发明的方法获得的人源化ACE2基因改造小鼠对SARS- CoV-2易感。从而成功地获得了对2019-nCoV易感的小鼠，从而能够很好地为2019-nCoV的药物筛选或其他研究提供很好的动物模型。具有很好的现实意义。
另一方面，本发明提供了一种人源化鼠或其子孙的组织、体液、细胞、以及它们的破碎物或提取物，所述的人源化鼠是利用权利要求8所述的方法构建的。
还有一方面，本发明提供了来源于所述的构建方法得到的人源化动物模型或其后代在制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用，或在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用，或在筛选、验证、评价或研究ACE2基因功能、ACE2抗体、针对ACE2靶点的药物、药效研究方面的用途。
附图说明
图1为pX330质粒图谱。
图2为pX330-sgRNA1构建测序结果图。
图3为pX330-sgRNA2构建测序结果图。
图4为pX330-sgRNA1-3切割效率验证结果。
图5为pX330-sgRNA3构建测序结果图。
图6为人源化ACE2打靶策略示意图。
图7为人源化ACE2打靶载体测序结果信息。
图8为对比例1中的三片段连接的PCR鉴定图。
图9为人源化ACE2小鼠胚胎干细胞基因型的PCR鉴定结果图。
图10为删除PGK-Puro后人源化ACE2小鼠胚胎干细胞基因型的PCR鉴定结果图。
图11为人源化ACE2基因示意图。
图12为本发明获得的人源化ACE2基因改造小鼠。
图13显示人源化ACE2基因改造小鼠在RNA水平上表达人ACE2并具有组织特异性。
图14的组织免疫荧光结果显示人ACE2在蛋白在人源化ACE2基因改造小鼠组织上特异表达。
图15显示本发明人源化ACE2基因改造小鼠对SARS-CoV-2易感。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
除非另有定义,本文中所使用的所有技术与科学术语的定义与本领域技术人员所熟悉的定义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法和材料皆可应用于本发明方法中,具体实施方式中描述了优选的方法和材料。
文中所用的“一”和“一种”指语法上不定冠词的释义,表示“一个”、“一种”或“多个”、“多种"(即“至少一个”、“至少一种”)。例如“一要素”指一种或种要素。
“CDS”是编码序列(Coding sequence)的缩写，“编码序列”是指用于编码基因的多肽产物的任何核苷酸序列。相反，术语“非编码序列”是指不编码基因的多肽产物的任何核苷酸序列。
术语“片段”将被理解为指长度比参考核酸短并且在共同部分包含与参考核酸相同的核苷酸序列的核苷酸序列。如果合适的话，根据本发明的这样的核酸片段可以被包含在更大的多核苷酸中，该片段是该更大的多核苷酸的组成成分。这样的片段包括长度在本发明的核酸的至少6、8、9、10、12、15、18、20、 21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、 90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000或1500个连续核苷酸范围内的寡核苷酸，或可选地由这样的寡核苷酸组成。
在本说明中,除非上下文另有要求，词语"包含"、"包括"将被理解为是指包括所述的步骤或要素或步骤和要素的集合,但并不排除任何其它的步骤或要素或步骤和要素的集合；即开放式限定。
“相对应”是指:(a)一多核苷酸具有与参考核苷酸序列的全部或者部分基本上相同或互补的核苷酸序列, 或者一多核苷酸编码与肽或者蛋白质中的氨基酸序列完全相同的氨基酸序列；或(b)一肽或多肽具有一种氨基酸序列,该氨基酸序列基本上与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列相同。
术语“下游”是指位于参考核苷酸序列3’端的核苷酸序列。特别地，下游核苷酸序列通常涉及转录起始点之后的序列。例如，基因的翻译起始密码子位于转录起始位点的下游。
术语“上游”是指位于参考核苷酸序列5’端的核苷酸序列。特别地，上游核苷酸通常涉及位于编码序列或转录起始点的5’侧的序列。例如，大部分的启动子位于转录起始位点的上游。
“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的DNA序列。一般而言，编码序列位于启动子序列的3’端。启动子可以整体源自天然基因，或由源自天然发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包括合成的DNA片段。本领域技术人员应该理解的是，不同的启动子可以指导基因在不同的组织或细胞类型中，或在发育的不同阶段，或应答于不同的环境或生理条件进行表达。导致基因在大多数细胞类型中在大多数的时间被表达的启动子通常称为“组成型启动子”。导致基因在特定的细胞类型中被表达的启动子通常称为“细胞特异性启动子”或“组织特异性启动子”。导致基因在特定的发育或细胞分化阶段被表达的启动子通常称为“发育特异性启动子”或“细胞分化特异性启动子”。在将细胞暴露于诱导启动子的药剂、生物分子、化学品、配体、光或类似物，或用这些物质对细胞进行处理之后，被诱导并导致基因被表达的启动子通常被称为“诱导型启动子”或“调控型启动子”。还应该认识的是，因为在大多数情况下，调控序列的准确界限还没有完全限定，所以不同长度的DNA片段可能具有相同的启动子活性。
术语“5’UTR”或“5'非编码序列”或“5'非翻译区(UTR)”是指位于编码序列上游(5')的DNA序列。
术语“限制性核酸内切酶”和“限制性酶”是指结合并切割双链DNA内的特定核苷酸序列的酶。
术语“载体”意指核酸分子，其能转移它已连接的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，其指环状双链 DNA环，其他DNA区段可连接进去。另一类载体是病毒载体，其中其他DNA区段可连接到病毒基因组内。某些载体能在引入了这些载体的宿主细胞中自我复制(如具有细菌的复制起始点的细菌载体以及游离型哺乳动物载体)。其他载体(如非游离型哺乳动物载体)在引入到宿主细胞中后能够整合到宿主细胞的基因组中，因此随宿主基因组复制。此外，某些载体能够指导表达它们操作地连接的基因。
一些载体本发明称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)是指被设计成使得插入的核酸序列在转化入宿主后能够表达的载体、质粒或媒介。总的来说，重组DNA技术所使用的表达载体经常是质粒形式。本说明书的“质粒”和“载体”交换使用，因为质粒是载体最普遍使用的形式。但是，本发明意包括这种表达载体的其他形式，如病毒载体(如复制缺陷型反转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，其充当同等作用。
术语“质粒”是指染色体外元件，它们常常携带不是作为细胞的中心代谢的一部分的基因，并且常常是环状双链DNA分子的形式。这样的元件可以是来自任何来源的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，线性、环状或超螺旋的，单链或双链DNA或RNA，其中许多核苷酸序列已经被连接入或重组入独特的结构中，该结构能够将针对所选的基因产物的启动子片段和DNA序列以及合适的3’端非翻译序列导入细胞。
“靶向载体”或“打靶载体”是含有邻接所需遗传修饰的、与内源染色体核酸序列“同源的”序列的DNA 构建体。所述侧翼同源序列(称为“同源臂”)借助所述同源臂和相应的内源序列之间存在的同源性，指导所述打靶载体定位于所述基因组中的特定染色体位置，并且通过称为“同源重组”的过程引入所述所需的遗传修饰。“靶向载体”和“打靶载体”某些时候可以通用。采用靶向载体以将插入核酸引入大鼠、真核、非大鼠真核、哺乳动物、非人类哺乳动物、人类、啮齿动物、非大鼠啮齿动物、小鼠或仓鼠核酸的靶基因座中。所述靶向载体包含所述插入核酸且进一步包含5’同源臂和3’同源臂，其侧接所述插入核酸。侧接所述插入核酸的同源臂对应于在大鼠、真核、非大鼠真核、哺乳动物、非人类哺乳动物、人类、啮齿动物、非大鼠啮齿动物、小鼠或仓鼠核酸的靶基因座内的区域。为了便于提及，在靶基因组基因座内的相应同源基因组区在本文中称为“靶位点”。例如，靶向载体可包含由与第一靶位点和第二靶位点互补的第一同源臂和第二同源臂侧接的第一插入核酸。因而，所述靶向载体由此有助于经由在细胞的基因组内的同源臂和互补靶位点之间发生的同源重组事件将插入核酸整合到大鼠、真核、非大鼠真核、哺乳动物、非人类哺乳动物、人类、啮齿动物、非大鼠啮动物、小鼠或仓鼠核酸的靶基因座中。
在一个实施方案中，所述大鼠、真核、非大鼠真核、哺乳动物、非人类哺乳动物、人类、啮齿动物、非大鼠啮齿动物、小鼠或仓鼠核酸的靶基因座包含与5’同源臂互补的第一核酸序列和与3’同源臂互补的第二核酸序列。
载体可以通过本领域已知的方法导入期望的宿主细胞，例如转染、电穿孔、微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂转染(溶酶体融合)、使用基因枪或DNA载体转运蛋白(参见例如 Wu et al.,1992,J.Biol.Chem.267:963-967；Wu和Wu,1988,J.Biol.Chem.263:14621-14624；和Hartmut et al.,1990年3月15日提交的加拿大专利申请2,012,311)。
术语“转染”是指细胞摄取外源或异源RNA或DNA。当外源或异源RNA或DN已被引入细胞内时，该细胞便被这样的RNA或DNA“转染”。当转染的RNA或DNA影响表型变化时，该细胞便被外源或异源RNA或DNA“转化”。转化RNA或DNA可以被整合入(共价连接入)构成细胞基因组的染色体DNA。
术语“同源性”或“同源的”指序列例如核苷酸或氨基酸序列的两条序列经最佳比对和比较具有至少约 75％的核苷酸或氨基酸、至少约80％的核苷酸或氨基酸、至少约90-95％的核苷酸或氨基酸，例如超过 97％的核苷酸或氨基酸是相同的。本领域技术人员将理解，对于最佳基因靶向而言，靶向构建体应含有与内源性DNA序列同源的臂(即“同源臂”)；因此，能够在靶向构建体与被靶向的内源性序列之间发生同源重组。
如本文中所用，在两个区彼此共有足够水平的序列同一性时同源臂和靶位点(即同源基因组区)彼此互补，从而充当用于同源重组反应的底物。“同源性”是指DNA序列与相应或“互补”序列相同或共有序列同一性。在给定靶位点和在靶向载体上发现的相应同源臂之间的序列同一性可为允许同源重组发生的任何程度的序列同一性。例如，靶向载体的同源臂(或其片段)与靶位点(或其片段)共有的序列同一性的量可为至少51％、53％、57％、60％、65％、70％、75％、80％、83％、85％、87％、89％、91％、93％、95％、 97％、98％、99％或100％序列同一性，因此所述序列经历同源重组。此外，在同源臂和互补靶位点之间同源的互补区可具有足以促进在裂解的识别位点处同源重组的任何长度。因此同源臂与在细胞的基因组内的相应靶位点具有足以进行同源重组的同源性。为了便于提及，同源臂在本文中作为5’同源臂和3’同源臂提到。该术语涉及在靶向载体中同源臂与插入核酸的相对位置。
一些实施例中，所述靶向载体的同源臂可具有足以促进与相应靶位点的同源重组事件的任何长度，包括例如至少5-10kb、5-15kb、10-20kb、20-30kb、30-40kb、40-50kb、50-60kb、60-70kb、70-80kb、80- 90kb、90-100kb、100-110kb、110-120kb、120-130kb、130-140kb、140-150kb、150-160kb、160-170kb、 170-180kb、180-190kb、190-200kb长或更长。如下文进一步详细概述，靶向载体可采用更大长度的靶向臂。在一个特定的实施方案中5’同源臂和3’同源臂的总和为至少10kb或5’同源臂和3’同源臂的总和为至少约16kb-约100kb或约30kb-约100kb，在其它实施方案中，所述ACE2的5’同源臂和3’同源臂的总和的尺寸为约10kb-约150kb、约10kb-约100kb、约10kb-约75kb、约20kb-约150kb、约20kb-约100kb、约20kb-约75kb、约30kb-约150kb、约30kb-约100kb、约30kb-约75kb、约40kb-约150kb、约40kb-约 100kb、约40kb-约75kb、约50kb-约150kb、约50kb-约100kb、或约50kb-约75kb、约10kb-约30kb、约 20kb-约40kb、约40kb-约60kb、约60kb-约80kb、约80kb-约100kb、约100kb-约120kb或约120kb-约 150kb。
本文中的某些实施例涉及人源化基因编辑哺乳动物，所述人源化基因编辑哺乳动物的基因组包括编码人的全长ACE2蛋白的多聚核糖核酸。例如，所述多聚核糖核酸可操作地连接至启动子多聚核糖核酸。在一些实施例中，人源化基因编辑哺乳动物不表达全部的或部分的编码人源化基因编辑哺乳动物的内源性ACE2蛋白的多聚核糖核酸，并且所述编码人ACE2蛋白的多聚核糖核酸包括人ACE2蛋白基因的修饰。
一些实施例中，所述细胞为多潜能细胞、非多潜能细胞、哺乳动物细胞、人类细胞、非人类哺乳动物细胞、啮齿动物细胞、小鼠细胞、仓鼠细胞、非人类多潜能细胞、人类多潜能细胞、啮齿动物多潜能细胞或成纤维细胞或肺细胞。
在一些上述方法中，所述细胞为原代细胞或永生化细胞。在一些上述方法中,所述啮齿动物多潜能细胞为小鼠或大鼠胚胎干(ES)细胞。
在一些上述方法中，所述动物细胞或所述人类细胞为原代细胞或永生化细胞。在一些上述方法中，所述动物细胞或所述人类细胞为多潜能细胞。在一些上述方法中，所述动物多潜能细胞为小鼠胚胎干(ES) 细胞。在一些上述方法中，所述人类多潜能细胞为人类胚胎干(ES)细胞、人类成人干细胞、发育受限的人类祖细胞或人类诱导的多潜能干(iPS)细胞。
一些实施例中，本文中的某些实施例提供人源化基因编辑的细胞，尤其是还提供分离的人类和非人类全能或多潜能干细胞，尤其是小鼠胚胎干细胞，其能够在一种或多种体外连续基因修饰之后维持多潜能性且能够经由种系将所述靶向基因修饰传递到后代。
本文使用的术语“胚胎干细胞”或"ES细胞”包括在引入胚胎中后能够促进发育胚胎的任何组织的源自胚胎的全能或多潜能细胞。本文使用的术语“多潜能细胞”包括具有发育成多于一种类型的分化细胞的能力的未分化细胞。术语“非多潜能细胞”包括不是多潜能细胞的细胞。
在一些上述方法中，所述靶向基因编辑同时包括在所述目标基因组基因座处缺失内源核酸序列或在所述目标基因组基因座处插入所述核酸。
一些实施例中，所述基因修饰或基因编辑包括对细胞(例如，真核细胞、非大鼠真核细胞、哺乳动物细胞、类细胞、非人类哺乳动物细胞、多潜能细胞、非多潜能细胞、非人类多潜能细胞、人类多潜能细胞、人类ES细胞、人类成人干细胞、发育受限的人类祖细胞、人类iPS细胞、人类细胞、啮齿动物细胞、非大鼠啮齿动物细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、仓鼠细胞、成纤维细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)独立地实施的两种或多种修饰。第一修饰可通过电穿孔或本领域已知的任何其他方法实现。随后，采用合适的第二核酸构建体对同一细胞基因组进行第二修饰。所述第三修饰可通过第二电穿孔或本领域已知的任何其它方法实现。在各种实施方案中，在同一细胞的第一基因修饰和第二基因修饰之后,可使用例如连续电穿孔或本领域已知的任何其它合适方法(连续地)实现第三基因修饰、第四基因修饰、第五基因修饰、第六基因修饰等连修饰(一种基因修饰跟着另一基因修饰)。
一些实施例中，本发明是打靶载体同源重组方法进行基因的编辑，将外源核酸插入内源基因组中。
一些实施例中，所述插入核酸包含插入同源或直系同源人类核酸序列或用其替换真核、非大鼠真核、哺乳动物、人类或非人类哺乳动物核酸序列。
一些实施例中，所述给定插入的多核苷酸可来自任何生物体，包括例如啮齿动物、非大鼠啮齿动物、大鼠、小鼠、仓鼠、哺乳动物、非人类哺乳动物、真核生物、非大鼠真核生物、人类、农业动物或家养动物。
在特定的实施方案中，所述插入核酸可包含来自大鼠的核酸，其可包含基因组DNA的片段、 CDNA、调控区或其任何部分或组合。在其它实施方案中，所述插入核酸可包括来自真核生物、非大鼠真核生物、哺乳动物、人类、非人类哺乳动物、啮齿动物、非大鼠啮齿动物、人类、大鼠、小鼠、仓鼠、兔、猪、牛、鹿、绵羊、山羊、小鸡、猫、狗、白融、灵长类动物(例如，狨猴、恒河猴)、家养哺乳动物或农业哺乳动物或任何其它目标生物体的核酸。如在本文中更详细地概述，在各种方法和组合物中采用的插入核酸可引起目标靶基因座的“人源化”。
在一个实施方案中，所述基因修饰为添加核酸序列。在一个实施方案中，所述插入核酸包含在编码序列中的基因修饰。在一个实施方案中，所述基因修饰包括编码序列的缺失突变。在一个实施方案中，所述基因修饰包括两种内源编码序列的融合。在一个实施方案中，所述插入核酸包含插入同源或直系同源人类核酸序列或用其替换真核、非大鼠真核、哺乳动物、人类或非人类哺乳动物核酸序列。在一个实施方案中，所述插入核酸包含在包含相应小鼠DNA序列的内源小鼠基因编码区插入同源或直系同源人类核酸序列或用其替换小鼠DNA序列。在一个实施方案中，所述插入核酸包含在包含相应小鼠DNA序列的内源小鼠基因编码区插入同源或直系同源人类核酸序列或用其替换小鼠DNA序列。在一个实施方案中，利用打靶载体，针对小鼠Ace2位点，在紧接mAce2的EXON1 CDS起始ATG位点插入hACE2序列。
在一个实施方案中，所述靶向载体的核酸序列可包含在整合到基因组中时将生成哺乳动物、人类或非人类哺乳动物ACE2基因座的区域的基因修饰的多核苷酸，其中在ACE2基因座处的基因修饰引起 ACE2活性减小、ACE2活性增加或ACE2活性调整。在一个实施方案中，产生ACE2基因被完全替换。
在一个实施方案中，所述插入核酸可包含调控元件，包括例如启动子、增强子或转录。
一些实施例中，给定插入的多核苷酸和/或哺乳动物、人类细胞或非人类哺乳动物基因座的相应替换区可为编码区、内含子、外显子、未转译区、调控区、启动子或增强子或其任何组合。
本文提供允许将一种或多种目标多核苷酸靶向整合到靶基因座中的方法，如上概述，引入序列，由此产生的基因编辑细胞。“引入”以使得序列进入细胞内部的方式而将序列呈递到细胞中(多肽或多核苷酸)。
来自任何生物体的任何细胞都可用于本文提供的方法中。在特定的实施方案中，所述细胞来自真核生物、非大鼠真核生物、哺乳动物、非人类哺乳动物、人类、啮齿动物、非大鼠啮齿动物、大鼠、小鼠或仓鼠。在特定的实施方案中，所述细胞为真核细胞、非大鼠真核细胞、多潜能细胞、非多潜能细胞、非人类多潜能细胞、非人类哺乳动物细胞、人类多潜能细胞、人类ES细胞、人类成人干细胞、发育受限的人类祖细胞、人类诱导的多潜能细胞(iPS)细胞、哺乳动物细胞、人类细胞、成纤维细胞、啮齿动物细胞、非大鼠啮齿动物细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、小鼠ES细胞、仓鼠细胞或CHO细胞。
在一些实施方案中，在所述方法中采用的细胞具有稳定地并入其基因座中的DNA构建体。“稳定地并入”或“稳定地引入”是指将多核苷酸引入细胞中，因此核苷酸序列整合到细胞的基因组中且能够由其子代遗传。
在一个实施方案中，向细胞中引入一种或多种多核苷酸通过电穿孔、胞浆内注射、病毒感染、腺病毒、慢病毒、反转录病毒、转染、脂质介导的转染介导，或者经由NucleofectionTM介导。
在一个实施例中，所述表达构建体与所述被引入的核酸一起引入。
在一个实施方案中，向所述细胞中引入所述一种或多种多核苷酸可经一段时间执行多次。在一个实施方案中，向所述细胞中引入所述一种或多种多核苷酸可经一段时间执行至少两次，经一段时间执行至少三次，经一段时间执行至少四次，经一段时间执行至少五次，经一段时间执行至少六次，经一段时间执行至少七次，经一段时间执行至少八次，经一段时间执行至少九次，经一段时间执行至少十次，经一段时间执行至少十一次，经一段时间执行至少十二次，经一段时间执行至少十三次，经一段时间执行至少十四次，经一段时间执行至少十五次，经一段时间执行至少十六次，经一段时间执行至少十七次，经一段时间执行至少十八次，经一段时间执行至少十九次或经一段时间执行至少二十次。
在一个实施方案中，所述靶向载体(含有引入核酸)与表达载体(含有sgRNA)同时引入细胞中。
在一个实施例中，进一步提供用于制造人源化非人类动物的方法，其包括：(a)用包含插入核酸的靶向载体修饰多潜能细胞的基因组以形成供体细胞，所述插入核酸包含人类核酸序列；(b)将所述供体细胞引入宿主胚胎中；和(c)在代孕母体中孕育所述宿主胚胎，其中所述代孕母体生成包含所述人类核酸序列的子代。在一个实施方案中，所述供体细胞引入处于胚泡段或处于前桑椹胚阶段(即，4-细胞阶段或8-细胞阶段)的宿主胚胎中。在更进一步的实施方案中，所述基因修饰能够经由种系传递。
在一个特定实施例中，提供了用于制造人源化小鼠的方法，所述方法包括：(a)将包含ACE2基因片段的靶向载体与连接有sgRNA的表达载体引入小鼠胚胎细胞中，形成基因编辑的供体细胞；(b)将所述供体细胞引入小鼠胚胎中；和(c)在代孕母体中孕育所述小鼠胚胎，其中所述代孕母体生成包含所述人类 ACE2序列的子代。
实施例1Ace2基因sgRNA 1及pX330-sgRNA质粒构建
合成识别靶位点的sgRNA1序列。
sgRNA1序列(SEQ ID NO:1)：5’-tactgctcagtccctcaccgagg-3’
针对sgRNA位点引入BbsI酶切位点合成sgRNA的上下游退火引物进行后续退火实验。合成 sgRNA1的上下游单链引物序列如下：
上游：5’-caccgcttggcattttcctcggtga-3’(SEQ ID NO:4)
下游：5’-aaactcaccgaggaaaatgccaagc-3’(SEQ ID NO:5)
pX330质粒来源：pX330载体图谱，参见图1。该质粒骨架来源淼灵质粒平台，货号P0123。
将上述sgRNA退火引物经退火后分别连接至pX330质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体 pX330-sgRNA1。
具体的连接反应体系如表1所示。
表1连接反应体系
sgRNA退火产物 1μL(0.5μM)
pX330-sgRNA载体 1μL(20ng)
T4 DNA Ligase 1μL(5U)
10×T4 DNA Ligase buffer 1μL
H<sub>2</sub>O 补至10μL
反应条件为：16℃连接30min以上，转化至30μL TOP10感受态细胞中，然后取200μL涂布于Amp 抗性的平板，37℃培养至少12小时后挑选2个克隆接种含有Amp抗性的LB培养基(5mL)中，37℃，250rpm摇培至少12小时。
随机挑选的克隆送测序公司进行测序验证，测序结果如图2所示，选择连接正确的表达载体pX330- sgRNA1进行后续实验。
实施例2 Ace2基因sgRNA2及pX330-sgRNA2质粒构建
合成识别靶位点的sgRNA2序列。
sgRNA2-序列(SEQ ID NO:2)：5’-cttggcattttcctcggtgaggg-3’
针对sgRNA位点引入BbsI酶切位点合成sgRNA的上下游退火引物进行后续退火实验。合成 sgRNA2的上下游单链引物序列如下：
上游：5’-caccgtactgctcagtccctcaccg-3’(SEQ ID NO:6)
下游：5’-aaaccggtgagggactgagcagtac-3’(SEQ ID NO:7)
pX330质粒来源：pX330载体图谱，参见图1。该质粒骨架来源淼灵质粒平台，货号P0123。
将上述sgRNA退火引物经退火后分别连接至pX330质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体 pX330-sgRNA2。
具体的连接反应体系如表2所示。
表2连接反应体系
sgRNA退火产物 1μL(0.5μM)
pX330-sgRNA载体 1μL(20ng)
T4 DNA Ligase 1μL(5U)
10×T4 DNA Ligase buffer 1μL
H<sub>2</sub>O 补至10μL
反应条件为：16℃连接30min以上，转化至30μL TOP10感受态细胞中，然后取200μL涂布于Amp 抗性的平板，37℃培养至少12小时后挑选2个克隆接种含有Amp抗性的LB培养基(5mL)中， 37℃，250rpm摇培至少12小时。
随机挑选的克隆送测序公司进行测序验证，测序结果如图3所示，选择连接正确的表达载体pX330- sgRNA2进行后续实验。
实施例3 pX330-sgRNA切割效率鉴定
分别将2μg实施例1、实施例2制备的pX330-sgRNA质粒利用脂质体3000(Lipofectamine 3000，invitrogen，货号L3000001)方法转染进小鼠胚胎干细胞，具体转染操作参考Lipofectamine 3000试剂操作说明。收取转染两天后的小鼠胚胎干细胞，用细胞基因组提取试剂盒进行基因组提取(天根，DP304- 02)。随后在基因组切割位点两侧设计PCR上下游引物，上游引物(5arm-sgF：ggttttgatttggccataaaatgttagc (SEQ ID NO:10))和下游引物(3arm-sgR：attcccaggtccagtttcacctaag(SEQ ID NO:11))对提取所得基因组进行PCR反应(使用诺唯赞Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase)。然后利用T7核酸内切酶Ⅰ (T7EⅠ)(Biolabs，M0302L)进行pX330-sgRNA切割效率验证，原理T7核酸内切酶Ⅰ可识别并切割不完全配对DNA。
T7 EⅠ实验具体操作步骤：
将上述从各转染pX330-sgRNA1和pX330-sgRNA2的细胞提取基因组，通过5arm-sgF+3arm-sgR扩增得到的PCR产物进行回收(天根，DP214-02)，取1μg进行退火反应，体系如下所示：
表3
PCR产物 1μg
Buffer 2 2μL
H<sub>2</sub>O 补至20μL
反应条件 水浴锅煮沸10min后自然冷却
然后往退火产物中加入1μL T7核酸内切酶Ⅰ于37℃反应30min，后直接跑胶验证。跑胶结果如图4 所示。实施例1、实施例2的sgRNA1和sgRNA2其切割条带亮度较强(sgRNA1可切割成约376bp和 581bp两条带，sgRNA2可切割成约371bp和586bp两条带)，具有较高切割效率。
由于切割效率主要通过图显示，为了显现实施例1、2的方案的效果，图4中同时列举了另一sgRNA (指代为sgRNA3)的切割效率。
所列举的sgRNRA3序列(SEQ ID NO:3)：5’-caagtgaactttgataagacagg-3’
合成sgRNA3的上下游单链引物序列如下：
上游：5’-caccgcaagtgaactttgataagac-3’(SEQ ID NO:8)
下游：5’-aaacgtcttatcaaagttcacttgc-3’(SEQ ID NO:9)
其余步骤如同实施例1。随机挑选克隆送测序公司进行测序验证，测序结果如图5所示，选择连接正确的表达载体pX330-sgRNA3进行后续实验。
由于其他的sgRNA及pX330-sgRNA质粒构建非本发明实施例的重点，因此不作过多赘述和列举。
实施例4打靶载体的设计
将人ACE2基因(Gene ID：ID:59272)CDS蛋白编码序列(基于NCBI登录号为NM_001371415.1 →NP_001358344.1的转录本，其CDS序列如hACE2-CDS SEQ ID NO:12所示，蛋白序列如hACE2- protein SEQ ID NO:13所示)插入到鼠Ace2的启动子和5’UTR区域序列后，利用鼠Ace2启动子启动人 ACE2基因表达。同时，插入的人ACE2 CDS序列后加上SV40polyA序列信号(SV40-polyA序列如SEQ ID NO:14所示)终止信号加强人ACE2 mRNA转录停止。
hACE2-CDS序列如下(SEQ ID NO:12)：
atgtcaagctcttcctggctccttctcagccttgttgctgtaactgctgctcagtccaccattgaggaacaggccaagacatttttggacaagtttaaccacgaagc cgaagacctgttctatcaaagttcacttgcttcttggaattataacaccaatattactgaagagaatgtccaaaacatgaataatgctggggacaaatggtctgcctttttaaaggaacagtccacacttgcccaaatgtatccactacaagaaattcagaatctcacagtcaagcttcagctgcaggctcttcagcaaaatgggtcttcagtgctctcagaa gacaagagcaaacggttgaacacaattctaaatacaatgagcaccatctacagtactggaaaagtttgtaacccagataatccacaagaatgcttattacttgaaccag gtttgaatgaaataatggcaaacagtttagactacaatgagaggctctgggcttgggaaagctggagatctgaggtcggcaagcagctgaggccattatatgaagagt atgtggtcttgaaaaatgagatggcaagagcaaatcattatgaggactatggggattattggagaggagactatgaagtaaatggggtagatggctatgactacagcc gcggccagttgattgaagatgtggaacatacctttgaagagattaaaccattatatgaacatcttcatgcctatgtgagggcaaagttgatgaatgcctatccttcctatatc agtccaattggatgcctccctgctcatttgcttggtgatatgtggggtagattttggacaaatctgtactctttgacagttccctttggacagaaaccaaacatagatgttact gatgcaatggtggaccaggcctgggatgcacagagaatattcaaggaggccgagaagttctttgtatctgttggtcttcctaatatgactcaaggattctgggaaaattc catgctaacggacccaggaaatgttcagaaagcagtctgccatcccacagcttgggacctggggaagggcgacttcaggatccttatgtgcacaaaggtgacaatg gacgacttcctgacagctcatcatgagatggggcatatccagtatgatatggcatatgctgcacaaccttttctgctaagaaatggagctaatgaaggattccatgaagc tgttggggaaatcatgtcactttctgcagccacacctaagcatttaaaatccattggtcttctgtcacccgattttcaagaagacaatgaaacagaaataaacttcctgctca aacaagcactcacgattgttgggactctgccatttacttacatgttagagaagtggaggtggatggtctttaaaggggaaattcccaaagaccagtggatgaaaaagtg gtgggagatgaagcgagagatagttggggtggtggaacctgtgccccatgatgaaacatactgtgaccccgcatctctgttccatgtttctaatgattactcattcattcg atattacacaaggaccctttaccaattccagtttcaagaagcactttgtcaagcagctaaacatgaaggccctctgcacaaatgtgacatctcaaactctacagaagctggacagaaactgttcaatatgctgaggcttggaaaatcagaaccctggaccctagcattggaaaatgttgtaggagcaaagaacatgaatgtaaggccactgctcaact actttgagcccttatttacctggctgaaagaccagaacaagaattcttttgtgggatggagtaccgactggagtccatatgcagaccaaagcatcaaagtgaggataag cctaaaatcagctcttggagataaagcatatgaatggaacgacaatgaaatgtacctgttccgatcatctgttgcatatgctatgaggcagtactttttaaaagtaaaaaat cagatgattctttttggggaggaggatgtgcgagtggctaatttgaaaccaagaatctcctttaatttctttgtcactgcacctaaaaatgtgtctgatatcattcctagaact gaagttgaaaaggccatcaggatgtcccggagccgtatcaatgatgctttccgtctgaatgacaacagcctagagtttctggggatacagccaacacttggacctccta accagccccctgtttccatatggctgattgtttttggagttgtgatgggagtgatagtggttggcattgtcatcctgatcttcactgggatcagagatcggaagaagaaaaa taaagcaagaagtggagaaaatccttatgcctccatcgatattagcaaaggagaaaataatccaggattccaaaacactgatgatgttcagacctccttttag
hACE2-protein序列如下(SEQ ID NO:13)：
Figure RE-GDA0003169616320000111
Figure RE-GDA0003169616320000121
SV40 polyA序列(SEQ ID NO:14)：
aacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatca atgtatctta
根据序列设计，发明人进一步的设计了如图6所示的打靶方案和包含5’同源臂(5arm)、人ACE2基因片段、3’同源臂(3arm)的载体。其中5’同源臂为NCBI登录号为AC091606.8的第125683-126652位核苷酸(5’同源臂序列如SEQ ID NO:15所示)，3’同源臂为NCBI登录号为AC091606.8的第126796- 127766位核苷酸(3’同源臂序列如SEQ ID NO:16所示)。同时，PGK-嘌呤霉素异种基因包也被插入载体用做筛选需要，嘌呤霉素抗性基因(PGK-puro，SEQ ID NO:17)表达框两端设计有一对同向的frt位点 (SEQ ID NO:18)，因此可以利用FLP重组酶去除从而解决转基因引起的安全问题。构建的载体被进行完全序列验证。在靶向之前，通过AgeI，所述载体被线性化(打靶载体示意图和打靶策略示意图如图6所示)。
5’同源臂序列(SEQ ID NO:15)：
ccctatggagtggagaagagtcttataattttttaaatgggcagagaaatgaatttatttttaatttttagagacagggtttctttgtatagctctagctgtctttgattggtagac aaagctgtcctcaaactcagagatcttccttcctttgtctcctgagtgctgggattaaaggcatggaccaccactgccctgccccattctctccattaattttaagtgaatgc ttgcaaaagctcacttctttggtgaacagcttcctttacaaataagtacctttgccttcgtttttataggattcttaaaaagaaaaaaaagattcagccaggtggttgtggtgc acacctttaatcccagcagtcaggaggcagaggaaagcagatctcttgagtttgaggctagcctagtctacagagggagttccaggacagccaaggctacagagag gaactgtctaaaaacaccaagaaagagagaaaggagagagggagaggatggatagcttattgatagaattgtcagaaaaggctataagttccaatatgtgtcccatg atttctaagtctagccctttctgttatagtaaaatcatagtacaccctcctcctccagtgtatctttaacagcttttaaggaacatattaactaaatgtccaggttttgatttggcc ataaaatgttagcaaagctaaggttttctaggattaatgaataacatgtctttatttagtttacttaaaaaaatcattctaaaatatctgtttacatatctgtcctctccaggattaa cttcatattggtccagcagcttgtttactgttctcttctgtttcttcttctgctttttttttcttctcttctcagtgcccaacccaagttcaaaggctgatgagagagaaaaactcat gaagagattttactctagggaaagttgctcagtggatgggatcttggcgcacggggaaag
3’同源臂序列(SEQ ID NO:16)：
Gaattataatactaacattactgaagaaaatgcccaaaagatggtaagttcttgaggctacccagggggttattgattgcttcttaaagatcagaattactgcctataaaac tggataaggaaatcatagagatctctcaagtgtgaggatgagtgactgcctctgtagctctgatcctagtctcccagatggctaaattcaattgaccttagagttcatctgg aaaattgttatgaatgaattatttgcccagattccaaagatgagtgaaaatgtttaataaagttgccatcactattctcattatatttggtatgtaaagcattcatggaaatgttct aagtcgttattgagccaataattttctttagcttataatgccaacaggtctatccgagaactacaaatgacatattaactgaaaaatgcaactggggtttactgaaggcagc agcttagtaattaaggtaaccatggcttaggtgaaactggacctgggaattccttctttcattgacacagagctctgaggaatttccaaaggtcacagaagaaaagctata attaaactagtcccaaaaaatctcagcctactctgggaaagcagcatattttgtttgacaagtgcaaggacttagaacttttttttttctcactgatcctgaagtgccttttaag tatagttaagtggtggaaaattgagcaactatttaagaaaagactcttttttttcttcttccagcaatgctttccttcaaaacggtagcttcaaaacttcctgtcttttaaatgatc agggggctgtgtgtttaaattattgccattcatagaacagagtgggtctgaggatgcctgtttcctttgaaattctatgccccctcccagttttctaaaatttaagaaaccaca gagactttgacaatgtagttgccaaatgagttgcttttaactgctctaatagtttggtctt
PGK-puro序列(SEQ ID NO:17)：
Gggtaggggaggcgcttttcccaaggcagtctggagcatgcgctttagcagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacattccac atcccccggtaggcgccaaccggctccgttctttggtggccccttcgcgccaccttctactcctcccctagtcaggaagttcccccccgccccgcagctcgcgtcgtg caggacgtgacaaatggaagtagcacgtctcactagtctcgtgcagatggacagcaccgctgagcaatggaagcgggtaggcctttggggcagcggccaatagca gctttgctccttcgctttctgggctcagaggctgggaaggggtgggtccgggggcgggctcaggggcgggctcaggggcggggcgggcgcccgaaggtcctcc ggaggcccggcattctgcacgcttcaaaagcgcacgtctgccgcgctgttctcctcttcctcatctccgggcctttcgacctgcagcccaagctagcttaccatgaccg agtacaagcccacggtgcgcctcgccacccgcgacgacgtccccagggccgtacgcaccctcgccgccgcgttcgccgactaccccgccacgcgccacaccgt cgatccggaccgccacatcgagcgggtcaccgagctgcaagaactcttcctcacgcgcgtcgggctcgacatcggcaaggtgtgggtcgcggacgacggcgccg cggtggcggtctggaccacgccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgc agcaacagatggaaggcctcctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctggg cagcgccgtcgtgctccccggagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgacgtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctga
Frt序列(SEQ ID NO:18)：gaagttcctattctctagaaagtataggaacttc
载体构建过程如下：
设计扩增5’同源臂的搭桥片段的上游引物(5arm-pcrF： tcgcacacattccacatccaccggtccctatggagtggagaagagtctta(SEQ ID NO:19))和与其匹配的下游引物(5arm- pcrR：gaaggagccaggaagagcttgacatctttccccgtgcgccaagatcc(SEQ ID NO:20))；
设计扩增人ACE2 CDS的搭桥片段的上游引物(hACE2-F： ggatcttggcgcacggggaaagatgtcaagctcttcctggctccttc(SEQ ID NO:21))和与其匹配的下游引物(hACE2-R： cattataagctgcaataaacaagttctaaaaggaggtctgaacatcatc(SEQ ID NO:22))；
设计扩增SV40 polyA的搭桥片段的上游引物(SV40-F：gatgatgttcagacctccttttagaacttgtttattgcagcttataatg (SEQ ID NO:23))和与其匹配的下游引物(SV40-R： AGAGAATAGGAACTTCGCACGCGTtaagatacattgatgagtttggac(SEQ ID NO:24))；
设计扩增3’同源臂片段的上游引物(3arm-pcrF： tacgaagttatGtcgacgcGGCGCGCCgaattataatactaacattactg(SEQ ID NO:25))和与其匹配的下游引物(3arm- pcrR：tatgaccatgattacgccaagcttaagaccaaactattagagcagttaaaagc(SEQ ID NO:26))。5’同源臂与3’同源臂的扩增模板为C57BL6/J小鼠基因组，人ACE2的扩增模板为人肺细胞cDNA。PCR反应体系(使用诺唯赞 Phanta Max Super-FidelityDNA Polymerase)和条件见表4：
表4 PCR反应体系(50μL)
Figure RE-GDA0003169616320000131
Figure RE-GDA0003169616320000141
如是，将PCR扩增得到的产物片段5’同源臂、人ACE2 CDS、SV40 polyA使用搭桥PCR(overlap PCR)搭配Touch down PCR方法PCR成连续片段5arm-hACE-SV40；以及PCR扩增得到的3’同源臂回收后直接用于构建同源重组打靶载体，构建过程如下：
1.将5arm-hACE-SV40片段进行AgeI+MluI双酶切；3’同源臂片段进行AscI+HindIII双酶切后分别通过酶切连接的方法连接上去，从而得打靶载体。2.通过酶切鉴定后将获得的阳性打靶载体送去测序鉴定，经测序公司验证序列正确(如图7)，从而成功获得人源化ACE2打靶载体，序列如下：
整个打靶载体序列(SEQ ID NO:27)：
tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcaggg cgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgtaccgggtaggggaggcgcttttcc caaggcagtctggagcatgcgctttagcagccccgctgggcacttggcgctacacaagtggcctctggcctcgcacacattccacatccaccggtccctatggagtg gagaagagtcttataattttttaaatgggcagagaaatgaatttatttttaatttttagagacagggtttctttgtatagctctagctgtctttgattggtagacaaagctgtcctc aaactcagagatcttccttcctttgtctcctgagtgctgggattaaaggcatggaccaccactgccctgccccattctctccattaattttaagtgaatgcttgcaaaagctc acttctttggtgaacagcttcctttacaaataagtacctttgccttcgtttttataggattcttaaaaagaaaaaaaagattcagccaggtggttgtggtgcacacctttaatcc cagcagtcaggaggcagaggaaagcagatctcttgagtttgaggctagcctagtctacagagggagttccaggacagccaaggctacagagaggaactgtctaaa aacaccaagaaagagagaaaggagagagggagaggatggatagcttattgatagaattgtcagaaaaggctataagttccaatatgtgtcccatgatttctaagtctag ccctttctgttatagtaaaatcatagtacaccctcctcctccagtgtatctttaacagcttttaaggaacatattaactaaatgtccaggttttgatttggccataaaatgttagc aaagctaaggttttctaggattaatgaataacatgtctttatttagtttacttaaaaaaatcattctaaaatatctgtttacatatctgtcctctccaggattaacttcatattggtcc agcagcttgtttactgttctcttctgtttcttcttctgctttttttttcttctcttctcagtgcccaacccaagttcaaaggctgatgagagagaaaaactcatgaagagattttact ctagggaaagttgctcagtggatgggatcttggcgcacggggaaagatgtcaagctcttcctggctccttctcagccttgttgctgtaactgctgctcagtccaccattga ggaacaggccaagacatttttggacaagtttaaccacgaagccgaagacctgttctatcaaagttcacttgcttcttggaattataacaccaatattactgaagagaatgt ccaaaacatgaataatgctggggacaaatggtctgcctttttaaaggaacagtccacacttgcccaaatgtatccactacaagaaattcagaatctcacagtcaagcttc agctgcaggctcttcagcaaaatgggtcttcagtgctctcagaagacaagagcaaacggttgaacacaattctaaatacaatgagcaccatctacagtactggaaaagt ttgtaacccagataatccacaagaatgcttattacttgaaccaggtttgaatgaaataatggcaaacagtttagactacaatgagaggctctgggcttgggaaagctgga 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ccggagagcgtcgaagcgggggcggtgttcgccgagatcggcccgcgcatggccgagttgagcggttcccggctggccgcgcagcaacagatggaaggcctc ctggcgccgcaccggcccaaggagcccgcgtggttcctggccaccgtcggcgtctcgcccgaccaccagggcaagggtctgggcagcgccgtcgtgctccccg gagtggaggcggccgagcgcgccggggtgcccgccttcctggagacctccgcgccccgcaacctccccttctacgagcggctcggcttcaccgtcaccgccgac gtcgaggtgcccgaaggaccgcgcacctggtgcatgacccgcaagcccggtgcctgaggtacctctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagc ttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatcgatgaa gttcctattctctagaaagtataggaacttctaacctcccgggtgacagataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgtcgacgcggcgcgccgaattataatact aacattactgaagaaaatgcccaaaagatggtaagttcttgaggctacccagggggttattgattgcttcttaaagatcagaattactgcctataaaactggataaggaaa tcatagagatctctcaagtgtgaggatgagtgactgcctctgtagctctgatcctagtctcccagatggctaaattcaattgaccttagagttcatctggaaaattgttatga atgaattatttgcccagattccaaagatgagtgaaaatgtttaataaagttgccatcactattctcattatatttggtatgtaaagcattcatggaaatgttctaagtcgttattg 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actacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaa gggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgtt gttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaa aaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgt aagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccac atagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcaccc aactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaata ctcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacattt ccccgaaaagtgccacctgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtc
对比例1
将PCR扩增得到的产物片段5’同源臂、人ACE2 CDS、SV40 polyA使用搭桥PCR(overlap PCR)方法PCR成连续片段5arm-hACE-SV40，PCR反应条件如表5所示，其余条件同实施例4。
表5 PCR反应体系(50μL)
Figure RE-GDA0003169616320000161
结果如图8所示，并未能扩增出3片段连接片段。
实施例5人源化ACE2小鼠胚胎干细胞的获得
其中一个实施方式中，人源化ACE2小鼠胚胎干细胞的获得可按照如下方法进行：
C57BL6/J小鼠胚胎干细胞(所述的胚胎干细胞来源于已确立的胚胎干细胞系)从液氮冻存细胞库中复苏，特别使用代数为p10以内的小鼠胚胎干细胞，在6cm培养皿中培养生长3天。
通过配套使用NucleofectorTM IIs/2b电转仪以及Mouse ES Cell
Figure RE-GDA0003169616320000162
Kit(Lonza，VPH- 1001)小鼠胚胎干细胞电转试剂盒，使用A023程序，约2×106个细胞被电穿孔，并且所述电转过程含有3μg线性化打靶载体以及1μg pX330-sgRNA1的100μL电转缓冲液中进行。所述转染细胞被种到3个6 孔板的孔中，然后恢复36小时。恢复后，1μg/mL嘌呤霉素(默克公司)被加入到细胞培养基中。
经过3-4天的筛选后，通过使用玻璃拉针吸取单克隆的方式挑取并培养嘌呤霉素抗性小鼠胚胎干细胞克隆进96孔板中培养。第二天将单克隆通过胰酶消化并分成两份培养，其中一份细胞在10μL的NP 40 裂解缓冲液中于56℃下单独地裂解60分钟，随后在95℃下裂解10分钟。
其中，小鼠胚胎干细胞培养具体步骤：提前一天准备饲养层feeder细胞，按照需求铺在不同的孔板中，过夜培养形成单层。其中饲养层feeder细胞为经丝裂霉素C(MMC)法处理制备的小鼠胚胎成纤维细胞。使用含有LIF和2i(chir99021和pD0325901inhibitor)的mES培养基培养，每天更换新鲜培养基，可根据细胞的长势适当增加培养基，一般3天传一代，传代时用0.25％胰酶消化，按照6厘米盘30 万、6孔板10万每孔左右的密度种植。
mES+LIF+2i培养基组成为：Knockout DMEM(1×,gibco)+15％FBS(FRONTBIOMEDICAL,0.22μm Millipore滤器过滤)+GlutaMAX(100×,gibco)+NEAA(100×,gibco)+P/S(P:50units,S:50mg/ml, Hyclone)+β-mercaptoethanol(gibco，使用浓度0.1mM)+LIF(1000units/ml,Millipore)+CHIR99021 (GSK3β抑制剂，使用浓度3μM)+PD0325901(MEK抑制剂，使用浓度1μM)。
NP40裂解液的组成为：10mL TE(20mM Tris pH8.0，150mM NaCl，2mM EDTA)+0.5％NP40+10 μL蛋白酶K(10mg/mL)。
上述方法中的pX330-sgRNA1替换成pX330-sgRNA2或pX330-sgRNA3，其他步骤同pX330- sgRNA1。
pX330-sgRNA1、pX330-sgRNA2和pX330-sgRNA3搭配打靶载体打靶效果如表6所示。
表6.sgRNA1-3搭配打靶载体打靶效果(存活克隆数)
pX330-sgRNA1 pX330-sgRNA2 pX330-sgRNA3
231 187 43
实施例6人源化ACE2小鼠胚胎干细胞基因型鉴定
将实施例5最后得到的细胞裂解物用作基因型鉴定PCR筛选模板。通过使用PhantaMax Super- FidelityDNA Polymerase试剂(诺唯赞公司)，根据制造商的说明书实施PCR筛选。PCR分析用于定向插入小鼠Ace2位点的具有5’同源臂和3’同源臂的HDR。由于ACE2基因位于X染色体上，使用的小鼠胚胎干细胞为XY雄性，所以不存在双等位基因靶向发生。
鉴定定向插入引物的上游位于嘌呤霉素抗性内部(Puro-F：aacctccccttctacgagc(SEQ ID NO:28))，与其配对的引物下游位于3’同源臂的外侧(3arm-outR：tacagccaggatctggatgtcagc(SEQ ID NO:29))。如果重组载体插入位置正确，则应出现一条长度应为1504bp的条带。此时小鼠胚胎干细胞Ace2位点基因组序列替换为SEQ ID NO:30：
ccctatggagtggagaagagtcttataattttttaaatgggcagagaaatgaatttatttttaatttttagagacagggtttctttgtatagctctagctgtctttgattggtagac aaagctgtcctcaaactcagagatcttccttcctttgtctcctgagtgctgggattaaaggcatggaccaccactgccctgccccattctctccattaattttaagtgaatgc ttgcaaaagctcacttctttggtgaacagcttcctttacaaataagtacctttgccttcgtttttataggattcttaaaaagaaaaaaaagattcagccaggtggttgtggtgc acacctttaatcccagcagtcaggaggcagaggaaagcagatctcttgagtttgaggctagcctagtctacagagggagttccaggacagccaaggctacagagag gaactgtctaaaaacaccaagaaagagagaaaggagagagggagaggatggatagcttattgatagaattgtcagaaaaggctataagttccaatatgtgtcccatg atttctaagtctagccctttctgttatagtaaaatcatagtacaccctcctcctccagtgtatctttaacagcttttaaggaacatattaactaaatgtccaggttttgatttggcc ataaaatgttagcaaagctaaggttttctaggattaatgaataacatgtctttatttagtttacttaaaaaaatcattctaaaatatctgtttacatatctgtcctctccaggattaa cttcatattggtccagcagcttgtttactgttctcttctgtttcttcttctgctttttttttcttctcttctcagtgcccaacccaagttcaaaggctgatgagagagaaaaactcat gaagagattttactctagggaaagttgctcagtggatgggatcttggcgcacggggaaagatgtcaagctcttcctggctccttctcagccttgttgctgtaactgctgct cagtccaccattgaggaacaggccaagacatttttggacaagtttaaccacgaagccgaagacctgttctatcaaagttcacttgcttcttggaattataacaccaatatta ctgaagagaatgtccaaaacatgaataatgctggggacaaatggtctgcctttttaaaggaacagtccacacttgcccaaatgtatccactacaagaaattcagaatctc acagtcaagcttcagctgcaggctcttcagcaaaatgggtcttcagtgctctcagaagacaagagcaaacggttgaacacaattctaaatacaatgagcaccatctaca gtactggaaaagtttgtaacccagataatccacaagaatgcttattacttgaaccaggtttgaatgaaataatggcaaacagtttagactacaatgagaggctctgggctt gggaaagctggagatctgaggtcggcaagcagctgaggccattatatgaagagtatgtggtcttgaaaaatgagatggcaagagcaaatcattatgaggactatggg gattattggagaggagactatgaagtaaatggggtagatggctatgactacagccgcggccagttgattgaagatgtggaacatacctttgaagagattaaaccattat atgaacatcttcatgcctatgtgagggcaaagttgatgaatgcctatccttcctatatcagtccaattggatgcctccctgctcatttgcttggtgatatgtggggtagatttt ggacaaatctgtactctttgacagttccctttggacagaaaccaaacatagatgttactgatgcaatggtggaccaggcctgggatgcacagagaatattcaaggaggc 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cttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatc ttatcatcgatgaagttcctattctctagaaagtataggaacttctaacctcccgggtgacagataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgtcgacgcggcgcgc cgaattataatactaacattactgaagaaaatgcccaaaagatggtaagttcttgaggctacccagggggttattgattgcttcttaaagatcagaattactgcctataaaa ctggataaggaaatcatagagatctctcaagtgtgaggatgagtgactgcctctgtagctctgatcctagtctcccagatggctaaattcaattgaccttagagttcatctg gaaaattgttatgaatgaattatttgcccagattccaaagatgagtgaaaatgtttaataaagttgccatcactattctcattatatttggtatgtaaagcattcatggaaatgtt ctaagtcgttattgagccaataattttctttagcttataatgccaacaggtctatccgagaactacaaatgacatattaactgaaaaatgcaactggggtttactgaaggcag cagcttagtaattaaggtaaccatggcttaggtgaaactggacctgggaattccttctttcattgacacagagctctgaggaatttccaaaggtcacagaagaaaagctat aattaaactagtcccaaaaaatctcagcctactctgggaaagcagcatattttgtttgacaagtgcaaggacttagaacttttttttttctcactgatcctgaagtgccttttaa gtatagttaagtggtggaaaattgagcaactatttaagaaaagactcttttttttcttcttccagcaatgctttccttcaaaacggtagcttcaaaacttcctgtcttttaaatgat cagggggctgtgtgtttaaattattgccattcatagaacagagtgggtctgaggatgcctgtttcctttgaaattctatgccccctcccagttttctaaaatttaagaaaccac agagactttgacaatgtagttgccaaatgagttgcttttaactgctctaatagtttggtctt(seq id no:30)
PCR鉴定结果见图9，共鉴定了14株克隆，其中标注*号为阳性克隆，同时PCR产物经测序结果匹配一致。此PCR结果阳性的小鼠胚胎干细胞克隆为成功编辑的人源化小鼠胚胎干细胞模型，但其中还保留有PGK-Puro筛选标志，由于PGK-Puro两端具有一对同向的frt位点，因此可以利用FLP重组酶去除从而解决转基因引起的安全问题。
PGK-Puro筛选标志的删除方法如下：
将上述PCR结果阳性的小鼠胚胎干细胞继续培养至6cm盘，通过配套使用NucleofectorTM IIs/2b电转仪以及Mouse ES Cell
Figure RE-GDA0003169616320000181
Kit(Lonza，VPH-1001)小鼠胚胎干细胞电转试剂盒，使用A023 程序，约2×106个细胞被电穿孔，并且所述电转过程含有pPGK-FLPo质粒(Addgene，13793)的100μL 电转缓冲液中进行。所述转染细胞被种到6个12孔板的孔中，3天后，采取玻璃拉针吸取单克隆的方式挑取小鼠胚胎干细胞克隆进96孔板中培养，第二天将单克隆消化传代一分为二，一份进行嘌呤霉素筛选，一份正常培养。若成功删除PGK-Puro抗性筛选标志，则嘌呤霉素筛选后细胞不耐受死亡。嘌呤霉素不耐受相对应的克隆可使用上游引物(hACE2-F：tgatagtggttggcattgt(SEQ ID NO:31))和下游引物(3arm-outR：tacagccaggatctggatgtcagc(SEQ ID NO:29))进行基因组基因型PCR鉴定。若成功删除 PGK-Puro筛选标志，则PCR产物长度为1532bp，删除PGK-Puro前的PCR产物长度为2863bp。基因型鉴定结果如图9所示，跑胶条带在1500bp处的为成功删除PGK-puro后的克隆，条带在3000bp处的为删除前克隆。嘌呤霉素不耐受相对应的克隆则为最终成功编辑为人源化ACE2打靶的小鼠胚胎干细胞，也就是小鼠胚胎干细胞最终获得如图10所示的人源化ACE2基因。最终删除PGK-puro后小鼠胚胎干细胞 Ace2位点基因组序列替换为SEQ ID NO:32，如下所示：
ccctatggagtggagaagagtcttataattttttaaatgggcagagaaatgaatttatttttaatttttagagacagggtttctttgtatagctctagctgtctttgattggtagac aaagctgtcctcaaactcagagatcttccttcctttgtctcctgagtgctgggattaaaggcatggaccaccactgccctgccccattctctccattaattttaagtgaatgc ttgcaaaagctcacttctttggtgaacagcttcctttacaaataagtacctttgccttcgtttttataggattcttaaaaagaaaaaaaagattcagccaggtggttgtggtgc acacctttaatcccagcagtcaggaggcagaggaaagcagatctcttgagtttgaggctagcctagtctacagagggagttccaggacagccaaggctacagagag gaactgtctaaaaacaccaagaaagagagaaaggagagagggagaggatggatagcttattgatagaattgtcagaaaaggctataagttccaatatgtgtcccatg atttctaagtctagccctttctgttatagtaaaatcatagtacaccctcctcctccagtgtatctttaacagcttttaaggaacatattaactaaatgtccaggttttgatttggcc ataaaatgttagcaaagctaaggttttctaggattaatgaataacatgtctttatttagtttacttaaaaaaatcattctaaaatatctgtttacatatctgtcctctccaggattaa cttcatattggtccagcagcttgtttactgttctcttctgtttcttcttctgctttttttttcttctcttctcagtgcccaacccaagttcaaaggctgatgagagagaaaaactcat gaagagattttactctagggaaagttgctcagtggatgggatcttggcgcacggggaaagatgtcaagctcttcctggctccttctcagccttgttgctgtaactgctgct cagtccaccattgaggaacaggccaagacatttttggacaagtttaaccacgaagccgaagacctgttctatcaaagttcacttgcttcttggaattataacaccaatatta ctgaagagaatgtccaaaacatgaataatgctggggacaaatggtctgcctttttaaaggaacagtccacacttgcccaaatgtatccactacaagaaattcagaatctc acagtcaagcttcagctgcaggctcttcagcaaaatgggtcttcagtgctctcagaagacaagagcaaacggttgaacacaattctaaatacaatgagcaccatctaca gtactggaaaagtttgtaacccagataatccacaagaatgcttattacttgaaccaggtttgaatgaaataatggcaaacagtttagactacaatgagaggctctgggctt gggaaagctggagatctgaggtcggcaagcagctgaggccattatatgaagagtatgtggtcttgaaaaatgagatggcaagagcaaatcattatgaggactatggg gattattggagaggagactatgaagtaaatggggtagatggctatgactacagccgcggccagttgattgaagatgtggaacatacctttgaagagattaaaccattat atgaacatcttcatgcctatgtgagggcaaagttgatgaatgcctatccttcctatatcagtccaattggatgcctccctgctcatttgcttggtgatatgtggggtagatttt ggacaaatctgtactctttgacagttccctttggacagaaaccaaacatagatgttactgatgcaatggtggaccaggcctgggatgcacagagaatattcaaggaggc cgagaagttctttgtatctgttggtcttcctaatatgactcaaggattctgggaaaattccatgctaacggacccaggaaatgttcagaaagcagtctgccatcccacagc ttgggacctggggaagggcgacttcaggatccttatgtgcacaaaggtgacaatggacgacttcctgacagctcatcatgagatggggcatatccagtatgatatggc atatgctgcacaaccttttctgctaagaaatggagctaatgaaggattccatgaagctgttggggaaatcatgtcactttctgcagccacacctaagcatttaaaatccatt ggtcttctgtcacccgattttcaagaagacaatgaaacagaaataaacttcctgctcaaacaagcactcacgattgttgggactctgccatttacttacatgttagagaagt ggaggtggatggtctttaaaggggaaattcccaaagaccagtggatgaaaaagtggtgggagatgaagcgagagatagttggggtggtggaacctgtgccccatga tgaaacatactgtgaccccgcatctctgttccatgtttctaatgattactcattcattcgatattacacaaggaccctttaccaattccagtttcaagaagcactttgtcaagca gctaaacatgaaggccctctgcacaaatgtgacatctcaaactctacagaagctggacagaaactgttcaatatgctgaggcttggaaaatcagaaccctggacccta gcattggaaaatgttgtaggagcaaagaacatgaatgtaaggccactgctcaactactttgagcccttatttacctggctgaaagaccagaacaagaattcttttgtggg atggagtaccgactggagtccatatgcagaccaaagcatcaaagtgaggataagcctaaaatcagctcttggagataaagcatatgaatggaacgacaatgaaatgt acctgttccgatcatctgttgcatatgctatgaggcagtactttttaaaagtaaaaaatcagatgattctttttggggaggaggatgtgcgagtggctaatttgaaaccaag aatctcctttaatttctttgtcactgcacctaaaaatgtgtctgatatcattcctagaactgaagttgaaaaggccatcaggatgtcccggagccgtatcaatgatgctttccg tctgaatgacaacagcctagagtttctggggatacagccaacacttggacctcctaaccagccccctgtttccatatggctgattgtttttggagttgtgatgggagtgata gtggttggcattgtcatcctgatcttcactgggatcagagatcggaagaagaaaaataaagcaagaagtggagaaaatccttatgcctccatcgatattagcaaaggag aaaataatccaggattccaaaacactgatgatgttcagacctccttttagaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaata aagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttaacgcgtgcgaagttcctattctctagaaagtataggaacttctaacctcccgggtga cagataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatgtcgacgcggcgcgccgaattataatactaacattactgaagaaaatgcccaaaagatggtaagttcttgaggc tacccagggggttattgattgcttcttaaagatcagaattactgcctataaaactggataaggaaatcatagagatctctcaagtgtgaggatgagtgactgcctctgtag ctctgatcctagtctcccagatggctaaattcaattgaccttagagttcatctggaaaattgttatgaatgaattatttgcccagattccaaagatgagtgaaaatgtttaataa agttgccatcactattctcattatatttggtatgtaaagcattcatggaaatgttctaagtcgttattgagccaataattttctttagcttataatgccaacaggtctatccgagaa ctacaaatgacatattaactgaaaaatgcaactggggtttactgaaggcagcagcttagtaattaaggtaaccatggcttaggtgaaactggacctgggaattccttcttt cattgacacagagctctgaggaatttccaaaggtcacagaagaaaagctataattaaactagtcccaaaaaatctcagcctactctgggaaagcagcatattttgtttga caagtgcaaggacttagaacttttttttttctcactgatcctgaagtgccttttaagtatagttaagtggtggaaaattgagcaactatttaagaaaagactcttttttttcttcttc cagcaatgctttccttcaaaacggtagcttcaaaacttcctgtcttttaaatgatcagggggctgtgtgtttaaattattgccattcatagaacagagtgggtctgaggatgc ctgtttcctttgaaattctatgccccctcccagttttctaaaatttaagaaaccacagagactttgacaatgtagttgccaaatgagttgcttttaactgctctaatagtttggtct t(seq id no:32)
实施例7人源化ACE2基因改造小鼠的形成
1、腹腔注射7.5单位PMSG到4-10周龄B6C3F1雌鼠，48小时后注射hCG并与CD1种公鼠合笼，次日早上检查雌鼠阴栓并将有阴栓的雌鼠挑出，记录雌鼠相应的受精时间。
2、下一日将孕鼠进行颈椎脱臼法安乐死，70％酒精消毒小鼠腹部，用辅料镊子和眼科剪刀剪开腹部皮肤和肌肉层，打开腹腔。用镊子抓住一个子宫角的上部，用剪刀在靠近输卵管的膜上开一个小口，将输卵管和卵巢连接处剪断，将输卵管和附带的子宫移至35mm培养皿中，用镊子固定好输卵管伞口端，用装填好M2培养液(Hogan,B.(1994).Manipulating the mouse embryo:a laboratory manual,2nd edn(Cold SpringHarbor,NY,Cold Spring Harbor Laboratory Press).)的冲洗针轻轻插入伞口，用0.1mL的M2培养液冲洗输卵管，用移卵管收集冲出的胚胎并用M2清洗3次，收集E1.5的小鼠2-细胞胚胎。
3、对收集到的小鼠胚胎放入含0.1mM MgSO4,0.1mM CaCl2和0.3％牛血清白蛋白的0.3M甘露醇 (Sigma-Aldrich Inc.,St.Louis,MO)中，用Cellfusion CF-150/B电融合仪和250-um融合槽(BLS Ltd., Budapest,Hungary)进行60V 50微秒直流电融合，获得4倍体胚胎；放入KSOM培养基(Summers,M.C., McGinnis,L.K.,Lawitts,J.A.,Raffin,M.,andBiggers,J.D.(2000).IVF of mouse ova in a simplex optimized mediumsupplemented with amino acids.Hum Reprod 15,1791-1801.)，于CO2培养箱中培养24小时后用酸性台氏液(Sigma-Aldrich，T1788)去掉透明带，与胚胎干细胞(即本申请制备的人源化ACE2小鼠胚胎干细胞)聚集，形成嵌合体胚胎(Nagy,A.,Rossant,J.,Nagy,R.,Abramow-Newerly,W.,and Roder,J.C. (1993).Derivation of completely cellculture-derived mice from early-passage embryonic stem cells.Proc Natl AcadSci U S A 90,8424-8428.)。
4、于CO2培养箱中培养过夜，移植到E2.5天的假孕鼠子宫，17天后在将代孕鼠颈椎脱臼法安乐死后进行剖腹手术，存活和呼吸的新生鼠放入代乳鼠笼内，21天后断奶，获得完全来自胚胎干细胞的转基因小鼠，即得人源化ACE2基因改造小鼠(图12)。
相应的培养基配方如表7所示。
表7培养基配方
Figure RE-GDA0003169616320000201
Figure RE-GDA0003169616320000211
实施例8人源化ACE2基因改造小鼠的hACE2表达验证
取一只野生型小鼠以及一只人源化ACE2基因改造小鼠(实施例7制备得到的)的小肠、肺以及肾脏样品，用于RNA提取以及qPCR验证hACE2基因表达情况。组织样品加入Trizol试剂裂解。每毫升的Trizol裂解液中加入200μl氯仿，剧烈震荡后静置至分层，重复操作3次后，4℃，14000rpm离心15 min，取上清400μl至预冷的400μl异丙醇中，颠倒混匀，冰上静置5min，4℃，14000pm离心10 min，在EP管底部可见白色沉淀，为RNA。
弃上清，加入预冷的70％乙醇溶液，洗涤一次，离心，去掉乙醇，将RNA晾干至无色透明，按照沉淀多少，加入适量RNase-free H2O，60℃水浴至完全溶解。分别取1μl，用10mMTris-HCl(pH 7.5) 以及H2O稀释50倍测定纯度及浓度，OD260/280的值为2.0左右为宜。提完的RNA存放于-80℃，可长期保存。
取2μg RNA进行反转，体系如表8所示。反转得到的cDNA样品稀释30倍后，进一步用来做荧光定量PCR检测基因表达情况，hACE2检测qPCR引物如下(hACE2-qF：GGTCTTCAGTGCTCTCAG (SEQ ID NO:33)；hACE2-qR：GCATTCTTGTGGATTATCTGG(SEQ ID NO:34))，并可见人源化 ACE2基因改造小鼠在RNA水平上表达人ACE2并具有组织特异性(图13)。
表8
Figure RE-GDA0003169616320000212
另外再取人源化ACE2基因改造小鼠的小肠、肺以及睾丸组织进行免疫荧光组织蛋白水平验证人 ACE2表达情况。将小鼠组织在4％PFA中于4℃固定过夜。第二天，将组织在PBS中漂洗3次，并在 4℃在PBS中的30％蔗糖中冷冻保护过夜。然后将组织在30％蔗糖/PBS和O.C.T.按1：1混合物中孵育 2-4小时。冷冻嵌入培养基(Sakura，目录号4583)。接下来，将组织从蔗糖/OCT混合物中转移到低温模具中，并用O.C.T.填充。将包埋的组织在干冰上冷冻，然后保存在-80℃直至低温恒温器切片。使用低温恒温器将冷冻的类器官组织切成20μm切片，并收集在superfrost Ultra Plus载玻片上。将切片干燥过夜，然后用于免疫荧光。在室温下，将4％PFA直接后固定在载玻片上10分钟，然后在PBS中洗涤3x10次。使用疏水性PAP笔勾勒出组织区域的轮廓。使用含0.05％叠氮化钠的5％BSA/0.3％TX100的PBS封闭，并在室温下孵育30分钟。然后将组织与抗ACE2抗体(ET1611-58，Huabio)在4℃孵育过夜。 PBS洗涤后，二抗(A11004，Invitrogen)孵育1小时，然后DAPI 2分钟。最后，将盖玻片安装在载玻片上进行观察，可从组织免疫荧光结果中看出人ACE2在蛋白表达水平上在人源化ACE2基因改造小鼠组织上特异表达(图14)。
实施例9SARS-CoV-2感染人源化ACE2基因改造小鼠
人源化ACE2基因改造小鼠通过滴鼻吸入30μl DMEM，内含2×106TCID50病毒载量的SARS-CoV- 2，对照组则滴入30μL DMEM。分别在D1、D3、D5、D6、D7以及D9取感染小鼠的肺、气道和小肠组织用Trizol裂解并进行RNA提取以及荧光定量PCR检测SARS-CoV-2病毒滴度，RNA提取方法同上述 hACE2表达检测实施例一致。提取得到的组织RNA将使用
Figure RE-GDA0003169616320000221
Probe One-step qRT-PCR Kit(Toyobo)试剂盒对SARS-CoV-2的核蛋白N基因进行检测。荧光定量PCR检测所用到的引物如下：正向引物：5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’(SEQ ID NO:35)；反向引物:5’- CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’(SEQ ID NO:36)，TaqMan探针序列为5’-FAM- TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3’(SEQ IDNO:37)，结果可见人源化ACE2基因改造小鼠经 SARS-CoV-2感染后肺、气道及小肠在D1、D3病毒载量达到顶峰，随之下降，表明本人源化ACE2基因改造小鼠对SARS-CoV-2易感(图15)。而对照组小鼠并未检测到病毒。图15中的折线表示平均值。
序列表
<110> 生物岛实验室
<120> 人源化ACE2基因改造小鼠模型的制备方法及应用
<150> 202010151592.2
<151> 2020-03-06
<160> 37
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> Natural sequence
<220>
<223> sgRNA1序列
<400> 1
tactgctcag tccctcaccg agg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Natural sequence
<220>
<223> sgRNA2序列
<400> 2
cttggcattt tcctcggtga ggg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Natural sequence
<220>
<223> sgRNRA3序列
<400> 3
caagtgaact ttgataagac agg 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成sgRNA1的上游单链引物序列
<400> 4
caccgcttgg cattttcctc ggtga 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成sgRNA1的下游单链引物序列
<400> 5
aaactcaccg aggaaaatgc caagc 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成sgRNA2的上游单链引物序列
<400> 6
caccgtactg ctcagtccct caccg 25
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成sgRNA2的下游单链引物序列
<400> 7
aaaccggtga gggactgagc agtac 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成sgRNA3的上游单链引物序列
<400> 8
caccgcaagt gaactttgat aagac 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成sgRNA3的下游单链引物序列
<400> 9
aaacgtctta tcaaagttca cttgc 25
<210> 10
<211> 28
<212> DNA
<213> Natural sequence
<220>
<223> 5arm-sgF
<400> 10
ggttttgatt tggccataaa atgttagc 28
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> Natural sequence
<220>
<223> 3arm-sgR
<400> 11
attcccaggt ccagtttcac ctaag 25
<210> 12
<211> 2418
<212> DNA
<213> Natural sequence
<220>
<223> hACE2-CDS序列
<400> 12
atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc tcagtccacc 60
attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga agacctgttc 120
tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga gaatgtccaa 180
aacatgaata atgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc cacacttgcc 240
caaatgtatc cactacaaga aattcagaat ctcacagtca agcttcagct gcaggctctt 300
cagcaaaatg ggtcttcagt gctctcagaa gacaagagca aacggttgaa cacaattcta 360
aatacaatga gcaccatcta cagtactgga aaagtttgta acccagataa tccacaagaa 420
tgcttattac ttgaaccagg tttgaatgaa ataatggcaa acagtttaga ctacaatgag 480
aggctctggg cttgggaaag ctggagatct gaggtcggca agcagctgag gccattatat 540
gaagagtatg tggtcttgaa aaatgagatg gcaagagcaa atcattatga ggactatggg 600
gattattgga gaggagacta tgaagtaaat ggggtagatg gctatgacta cagccgcggc 660
cagttgattg aagatgtgga acataccttt gaagagatta aaccattata tgaacatctt 720
catgcctatg tgagggcaaa gttgatgaat gcctatcctt cctatatcag tccaattgga 780
tgcctccctg ctcatttgct tggtgatatg tggggtagat tttggacaaa tctgtactct 840
ttgacagttc cctttggaca gaaaccaaac atagatgtta ctgatgcaat ggtggaccag 900
gcctgggatg cacagagaat attcaaggag gccgagaagt tctttgtatc tgttggtctt 960
cctaatatga ctcaaggatt ctgggaaaat tccatgctaa cggacccagg aaatgttcag 1020
aaagcagtct gccatcccac agcttgggac ctggggaagg gcgacttcag gatccttatg 1080
tgcacaaagg tgacaatgga cgacttcctg acagctcatc atgagatggg gcatatccag 1140
tatgatatgg catatgctgc acaacctttt ctgctaagaa atggagctaa tgaaggattc 1200
catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca tttaaaatcc 1260
attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa cttcctgctc 1320
aaacaagcac tcacgattgt tgggactctg ccatttactt acatgttaga gaagtggagg 1380
tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg gtgggagatg 1440
aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata ctgtgacccc 1500
gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac aaggaccctt 1560
taccaattcc agtttcaaga agcactttgt caagcagcta aacatgaagg ccctctgcac 1620
aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat gctgaggctt 1680
ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa gaacatgaat 1740
gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga ccagaacaag 1800
aattcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagaccaaag catcaaagtg 1860
aggataagcc taaaatcagc tcttggagat aaagcatatg aatggaacga caatgaaatg 1920
tacctgttcc gatcatctgt tgcatatgct atgaggcagt actttttaaa agtaaaaaat 1980
cagatgattc tttttgggga ggaggatgtg cgagtggcta atttgaaacc aagaatctcc 2040
tttaatttct ttgtcactgc acctaaaaat gtgtctgata tcattcctag aactgaagtt 2100
gaaaaggcca tcaggatgtc ccggagccgt atcaatgatg ctttccgtct gaatgacaac 2160
agcctagagt ttctggggat acagccaaca cttggacctc ctaaccagcc ccctgtttcc 2220
atatggctga ttgtttttgg agttgtgatg ggagtgatag tggttggcat tgtcatcctg 2280
atcttcactg ggatcagaga tcggaagaag aaaaataaag caagaagtgg agaaaatcct 2340
tatgcctcca tcgatattag caaaggagaa aataatccag gattccaaaa cactgatgat 2400
gttcagacct ccttttag 2418
<210> 13
<211> 805
<212> PRT
<213> Natural sequence
<220>
<223> hACE2-protein序列
<400> 13
Met Ser Ser Ser Ser Trp Leu Leu Leu Ser Leu Val Ala Val Thr Ala
1 5 10 15
Ala Gln Ser Thr Ile Glu Glu Gln Ala Lys Thr Phe Leu Asp Lys Phe
20 25 30
Asn His Glu Ala Glu Asp Leu Phe Tyr Gln Ser Ser Leu Ala Ser Trp
35 40 45
Asn Tyr Asn Thr Asn Ile Thr Glu Glu Asn Val Gln Asn Met Asn Asn
50 55 60
Ala Gly Asp Lys Trp Ser Ala Phe Leu Lys Glu Gln Ser Thr Leu Ala
65 70 75 80
Gln Met Tyr Pro Leu Gln Glu Ile Gln Asn Leu Thr Val Lys Leu Gln
85 90 95
Leu Gln Ala Leu Gln Gln Asn Gly Ser Ser Val Leu Ser Glu Asp Lys
100 105 110
Ser Lys Arg Leu Asn Thr Ile Leu Asn Thr Met Ser Thr Ile Tyr Ser
115 120 125
Thr Gly Lys Val Cys Asn Pro Asp Asn Pro Gln Glu Cys Leu Leu Leu
130 135 140
Glu Pro Gly Leu Asn Glu Ile Met Ala Asn Ser Leu Asp Tyr Asn Glu
145 150 155 160
Arg Leu Trp Ala Trp Glu Ser Trp Arg Ser Glu Val Gly Lys Gln Leu
165 170 175
Arg Pro Leu Tyr Glu Glu Tyr Val Val Leu Lys Asn Glu Met Ala Arg
180 185 190
Ala Asn His Tyr Glu Asp Tyr Gly Asp Tyr Trp Arg Gly Asp Tyr Glu
195 200 205
Val Asn Gly Val Asp Gly Tyr Asp Tyr Ser Arg Gly Gln Leu Ile Glu
210 215 220
Asp Val Glu His Thr Phe Glu Glu Ile Lys Pro Leu Tyr Glu His Leu
225 230 235 240
His Ala Tyr Val Arg Ala Lys Leu Met Asn Ala Tyr Pro Ser Tyr Ile
245 250 255
Ser Pro Ile Gly Cys Leu Pro Ala His Leu Leu Gly Asp Met Trp Gly
260 265 270
Arg Phe Trp Thr Asn Leu Tyr Ser Leu Thr Val Pro Phe Gly Gln Lys
275 280 285
Pro Asn Ile Asp Val Thr Asp Ala Met Val Asp Gln Ala Trp Asp Ala
290 295 300
Gln Arg Ile Phe Lys Glu Ala Glu Lys Phe Phe Val Ser Val Gly Leu
305 310 315 320
Pro Asn Met Thr Gln Gly Phe Trp Glu Asn Ser Met Leu Thr Asp Pro
325 330 335
Gly Asn Val Gln Lys Ala Val Cys His Pro Thr Ala Trp Asp Leu Gly
340 345 350
Lys Gly Asp Phe Arg Ile Leu Met Cys Thr Lys Val Thr Met Asp Asp
355 360 365
Phe Leu Thr Ala His His Glu Met Gly His Ile Gln Tyr Asp Met Ala
370 375 380
Tyr Ala Ala Gln Pro Phe Leu Leu Arg Asn Gly Ala Asn Glu Gly Phe
385 390 395 400
His Glu Ala Val Gly Glu Ile Met Ser Leu Ser Ala Ala Thr Pro Lys
405 410 415
His Leu Lys Ser Ile Gly Leu Leu Ser Pro Asp Phe Gln Glu Asp Asn
420 425 430
Glu Thr Glu Ile Asn Phe Leu Leu Lys Gln Ala Leu Thr Ile Val Gly
435 440 445
Thr Leu Pro Phe Thr Tyr Met Leu Glu Lys Trp Arg Trp Met Val Phe
450 455 460
Lys Gly Glu Ile Pro Lys Asp Gln Trp Met Lys Lys Trp Trp Glu Met
465 470 475 480
Lys Arg Glu Ile Val Gly Val Val Glu Pro Val Pro His Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Cys Asp Pro Ala Ser Leu Phe His Val Ser Asn Asp Tyr Ser Phe
500 505 510
Ile Arg Tyr Tyr Thr Arg Thr Leu Tyr Gln Phe Gln Phe Gln Glu Ala
515 520 525
Leu Cys Gln Ala Ala Lys His Glu Gly Pro Leu His Lys Cys Asp Ile
530 535 540
Ser Asn Ser Thr Glu Ala Gly Gln Lys Leu Phe Asn Met Leu Arg Leu
545 550 555 560
Gly Lys Ser Glu Pro Trp Thr Leu Ala Leu Glu Asn Val Val Gly Ala
565 570 575
Lys Asn Met Asn Val Arg Pro Leu Leu Asn Tyr Phe Glu Pro Leu Phe
580 585 590
Thr Trp Leu Lys Asp Gln Asn Lys Asn Ser Phe Val Gly Trp Ser Thr
595 600 605
Asp Trp Ser Pro Tyr Ala Asp Gln Ser Ile Lys Val Arg Ile Ser Leu
610 615 620
Lys Ser Ala Leu Gly Asp Lys Ala Tyr Glu Trp Asn Asp Asn Glu Met
625 630 635 640
Tyr Leu Phe Arg Ser Ser Val Ala Tyr Ala Met Arg Gln Tyr Phe Leu
645 650 655
Lys Val Lys Asn Gln Met Ile Leu Phe Gly Glu Glu Asp Val Arg Val
660 665 670
Ala Asn Leu Lys Pro Arg Ile Ser Phe Asn Phe Phe Val Thr Ala Pro
675 680 685
Lys Asn Val Ser Asp Ile Ile Pro Arg Thr Glu Val Glu Lys Ala Ile
690 695 700
Arg Met Ser Arg Ser Arg Ile Asn Asp Ala Phe Arg Leu Asn Asp Asn
705 710 715 720
Ser Leu Glu Phe Leu Gly Ile Gln Pro Thr Leu Gly Pro Pro Asn Gln
725 730 735
Pro Pro Val Ser Ile Trp Leu Ile Val Phe Gly Val Val Met Gly Val
740 745 750
Ile Val Val Gly Ile Val Ile Leu Ile Phe Thr Gly Ile Arg Asp Arg
755 760 765
Lys Lys Lys Asn Lys Ala Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr Ala Ser Ile
770 775 780
Asp Ile Ser Lys Gly Glu Asn Asn Pro Gly Phe Gln Asn Thr Asp Asp
785 790 795 800
Val Gln Thr Ser Phe
805
<210> 14
<211> 122
<212> DNA
<213> Natural sequence
<220>
<223> SV40 polyA序列
<400> 14
aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60
aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120
ta 122
<210> 15
<211> 970
<212> DNA
<213> Natural sequence
<220>
<223> 5’同源臂序列
<400> 15
ccctatggag tggagaagag tcttataatt ttttaaatgg gcagagaaat gaatttattt 60
ttaattttta gagacagggt ttctttgtat agctctagct gtctttgatt ggtagacaaa 120
gctgtcctca aactcagaga tcttccttcc tttgtctcct gagtgctggg attaaaggca 180
tggaccacca ctgccctgcc ccattctctc cattaatttt aagtgaatgc ttgcaaaagc 240
tcacttcttt ggtgaacagc ttcctttaca aataagtacc tttgccttcg tttttatagg 300
attcttaaaa agaaaaaaaa gattcagcca ggtggttgtg gtgcacacct ttaatcccag 360
cagtcaggag gcagaggaaa gcagatctct tgagtttgag gctagcctag tctacagagg 420
gagttccagg acagccaagg ctacagagag gaactgtcta aaaacaccaa gaaagagaga 480
aaggagagag ggagaggatg gatagcttat tgatagaatt gtcagaaaag gctataagtt 540
ccaatatgtg tcccatgatt tctaagtcta gccctttctg ttatagtaaa atcatagtac 600
accctcctcc tccagtgtat ctttaacagc ttttaaggaa catattaact aaatgtccag 660
gttttgattt ggccataaaa tgttagcaaa gctaaggttt tctaggatta atgaataaca 720
tgtctttatt tagtttactt aaaaaaatca ttctaaaata tctgtttaca tatctgtcct 780
ctccaggatt aacttcatat tggtccagca gcttgtttac tgttctcttc tgtttcttct 840
tctgcttttt ttttcttctc ttctcagtgc ccaacccaag ttcaaaggct gatgagagag 900
aaaaactcat gaagagattt tactctaggg aaagttgctc agtggatggg atcttggcgc 960
acggggaaag 970
<210> 16
<211> 971
<212> DNA
<213> Natural sequence
<220>
<223> 3’同源臂序列
<400> 16
gaattataat actaacatta ctgaagaaaa tgcccaaaag atggtaagtt cttgaggcta 60
cccagggggt tattgattgc ttcttaaaga tcagaattac tgcctataaa actggataag 120
gaaatcatag agatctctca agtgtgagga tgagtgactg cctctgtagc tctgatccta 180
gtctcccaga tggctaaatt caattgacct tagagttcat ctggaaaatt gttatgaatg 240
aattatttgc ccagattcca aagatgagtg aaaatgttta ataaagttgc catcactatt 300
ctcattatat ttggtatgta aagcattcat ggaaatgttc taagtcgtta ttgagccaat 360
aattttcttt agcttataat gccaacaggt ctatccgaga actacaaatg acatattaac 420
tgaaaaatgc aactggggtt tactgaaggc agcagcttag taattaaggt aaccatggct 480
taggtgaaac tggacctggg aattccttct ttcattgaca cagagctctg aggaatttcc 540
aaaggtcaca gaagaaaagc tataattaaa ctagtcccaa aaaatctcag cctactctgg 600
gaaagcagca tattttgttt gacaagtgca aggacttaga actttttttt ttctcactga 660
tcctgaagtg ccttttaagt atagttaagt ggtggaaaat tgagcaacta tttaagaaaa 720
gactcttttt tttcttcttc cagcaatgct ttccttcaaa acggtagctt caaaacttcc 780
tgtcttttaa atgatcaggg ggctgtgtgt ttaaattatt gccattcata gaacagagtg 840
ggtctgagga tgcctgtttc ctttgaaatt ctatgccccc tcccagtttt ctaaaattta 900
agaaaccaca gagactttga caatgtagtt gccaaatgag ttgcttttaa ctgctctaat 960
agtttggtct t 971
<210> 17
<211> 1124
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> PGK-puro序列
<400> 17
gggtagggga ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg 60
gcacttggcg ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca ttccacatcc cccggtaggc 120
gccaaccggc tccgttcttt ggtggcccct tcgcgccacc ttctactcct cccctagtca 180
ggaagttccc ccccgccccg cagctcgcgt cgtgcaggac gtgacaaatg gaagtagcac 240
gtctcactag tctcgtgcag atggacagca ccgctgagca atggaagcgg gtaggccttt 300
ggggcagcgg ccaatagcag ctttgctcct tcgctttctg ggctcagagg ctgggaaggg 360
gtgggtccgg gggcgggctc aggggcgggc tcaggggcgg ggcgggcgcc cgaaggtcct 420
ccggaggccc ggcattctgc acgcttcaaa agcgcacgtc tgccgcgctg ttctcctctt 480
cctcatctcc gggcctttcg acctgcagcc caagctagct taccatgacc gagtacaagc 540
ccacggtgcg cctcgccacc cgcgacgacg tccccagggc cgtacgcacc ctcgccgccg 600
cgttcgccga ctaccccgcc acgcgccaca ccgtcgatcc ggaccgccac atcgagcggg 660
tcaccgagct gcaagaactc ttcctcacgc gcgtcgggct cgacatcggc aaggtgtggg 720
tcgcggacga cggcgccgcg gtggcggtct ggaccacgcc ggagagcgtc gaagcggggg 780
cggtgttcgc cgagatcggc ccgcgcatgg ccgagttgag cggttcccgg ctggccgcgc 840
agcaacagat ggaaggcctc ctggcgccgc accggcccaa ggagcccgcg tggttcctgg 900
ccaccgtcgg cgtctcgccc gaccaccagg gcaagggtct gggcagcgcc gtcgtgctcc 960
ccggagtgga ggcggccgag cgcgccgggg tgcccgcctt cctggagacc tccgcgcccc 1020
gcaacctccc cttctacgag cggctcggct tcaccgtcac cgccgacgtc gaggtgcccg 1080
aaggaccgcg cacctggtgc atgacccgca agcccggtgc ctga 1124
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> Natural sequence
<220>
<223> Frt序列
<400> 18
gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc 34
<210> 19
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 5arm-pcrF
<400> 19
tcgcacacat tccacatcca ccggtcccta tggagtggag aagagtctta 50
<210> 20
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 5arm-pcrR
<400> 20
gaaggagcca ggaagagctt gacatctttc cccgtgcgcc aagatcc 47
<210> 21
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hACE2-F
<400> 21
ggatcttggc gcacggggaa agatgtcaag ctcttcctgg ctccttc 47
<210> 22
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hACE2-R
<400> 22
cattataagc tgcaataaac aagttctaaa aggaggtctg aacatcatc 49
<210> 23
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SV40-F
<400> 23
gatgatgttc agacctcctt ttagaacttg tttattgcag cttataatg 49
<210> 24
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SV40-R
<400> 24
agagaatagg aacttcgcac gcgttaagat acattgatga gtttggac 48
<210> 25
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3arm-pcrF
<400> 25
tacgaagtta tgtcgacgcg gcgcgccgaa ttataatact aacattactg 50
<210> 26
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 3arm-pcrR
<400> 26
tatgaccatg attacgccaa gcttaagacc aaactattag agcagttaaa agc 53
<210> 27
<211> 8470
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 打靶载体序列
<400> 27
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgta ccgggtaggg gaggcgcttt tcccaaggca gtctggagca tgcgctttag 240
cagccccgct gggcacttgg cgctacacaa gtggcctctg gcctcgcaca cattccacat 300
ccaccggtcc ctatggagtg gagaagagtc ttataatttt ttaaatgggc agagaaatga 360
atttattttt aatttttaga gacagggttt ctttgtatag ctctagctgt ctttgattgg 420
tagacaaagc tgtcctcaaa ctcagagatc ttccttcctt tgtctcctga gtgctgggat 480
taaaggcatg gaccaccact gccctgcccc attctctcca ttaattttaa gtgaatgctt 540
gcaaaagctc acttctttgg tgaacagctt cctttacaaa taagtacctt tgccttcgtt 600
tttataggat tcttaaaaag aaaaaaaaga ttcagccagg tggttgtggt gcacaccttt 660
aatcccagca gtcaggaggc agaggaaagc agatctcttg agtttgaggc tagcctagtc 720
tacagaggga gttccaggac agccaaggct acagagagga actgtctaaa aacaccaaga 780
aagagagaaa ggagagaggg agaggatgga tagcttattg atagaattgt cagaaaaggc 840
tataagttcc aatatgtgtc ccatgatttc taagtctagc cctttctgtt atagtaaaat 900
catagtacac cctcctcctc cagtgtatct ttaacagctt ttaaggaaca tattaactaa 960
atgtccaggt tttgatttgg ccataaaatg ttagcaaagc taaggttttc taggattaat 1020
gaataacatg tctttattta gtttacttaa aaaaatcatt ctaaaatatc tgtttacata 1080
tctgtcctct ccaggattaa cttcatattg gtccagcagc ttgtttactg ttctcttctg 1140
tttcttcttc tgcttttttt ttcttctctt ctcagtgccc aacccaagtt caaaggctga 1200
tgagagagaa aaactcatga agagatttta ctctagggaa agttgctcag tggatgggat 1260
cttggcgcac ggggaaagat gtcaagctct tcctggctcc ttctcagcct tgttgctgta 1320
actgctgctc agtccaccat tgaggaacag gccaagacat ttttggacaa gtttaaccac 1380
gaagccgaag acctgttcta tcaaagttca cttgcttctt ggaattataa caccaatatt 1440
actgaagaga atgtccaaaa catgaataat gctggggaca aatggtctgc ctttttaaag 1500
gaacagtcca cacttgccca aatgtatcca ctacaagaaa ttcagaatct cacagtcaag 1560
cttcagctgc aggctcttca gcaaaatggg tcttcagtgc tctcagaaga caagagcaaa 1620
cggttgaaca caattctaaa tacaatgagc accatctaca gtactggaaa agtttgtaac 1680
ccagataatc cacaagaatg cttattactt gaaccaggtt tgaatgaaat aatggcaaac 1740
agtttagact acaatgagag gctctgggct tgggaaagct ggagatctga ggtcggcaag 1800
cagctgaggc cattatatga agagtatgtg gtcttgaaaa atgagatggc aagagcaaat 1860
cattatgagg actatgggga ttattggaga ggagactatg aagtaaatgg ggtagatggc 1920
tatgactaca gccgcggcca gttgattgaa gatgtggaac atacctttga agagattaaa 1980
ccattatatg aacatcttca tgcctatgtg agggcaaagt tgatgaatgc ctatccttcc 2040
tatatcagtc caattggatg cctccctgct catttgcttg gtgatatgtg gggtagattt 2100
tggacaaatc tgtactcttt gacagttccc tttggacaga aaccaaacat agatgttact 2160
gatgcaatgg tggaccaggc ctgggatgca cagagaatat tcaaggaggc cgagaagttc 2220
tttgtatctg ttggtcttcc taatatgact caaggattct gggaaaattc catgctaacg 2280
gacccaggaa atgttcagaa agcagtctgc catcccacag cttgggacct ggggaagggc 2340
gacttcagga tccttatgtg cacaaaggtg acaatggacg acttcctgac agctcatcat 2400
gagatggggc atatccagta tgatatggca tatgctgcac aaccttttct gctaagaaat 2460
ggagctaatg aaggattcca tgaagctgtt ggggaaatca tgtcactttc tgcagccaca 2520
cctaagcatt taaaatccat tggtcttctg tcacccgatt ttcaagaaga caatgaaaca 2580
gaaataaact tcctgctcaa acaagcactc acgattgttg ggactctgcc atttacttac 2640
atgttagaga agtggaggtg gatggtcttt aaaggggaaa ttcccaaaga ccagtggatg 2700
aaaaagtggt gggagatgaa gcgagagata gttggggtgg tggaacctgt gccccatgat 2760
gaaacatact gtgaccccgc atctctgttc catgtttcta atgattactc attcattcga 2820
tattacacaa ggacccttta ccaattccag tttcaagaag cactttgtca agcagctaaa 2880
catgaaggcc ctctgcacaa atgtgacatc tcaaactcta cagaagctgg acagaaactg 2940
ttcaatatgc tgaggcttgg aaaatcagaa ccctggaccc tagcattgga aaatgttgta 3000
ggagcaaaga acatgaatgt aaggccactg ctcaactact ttgagccctt atttacctgg 3060
ctgaaagacc agaacaagaa ttcttttgtg ggatggagta ccgactggag tccatatgca 3120
gaccaaagca tcaaagtgag gataagccta aaatcagctc ttggagataa agcatatgaa 3180
tggaacgaca atgaaatgta cctgttccga tcatctgttg catatgctat gaggcagtac 3240
tttttaaaag taaaaaatca gatgattctt tttggggagg aggatgtgcg agtggctaat 3300
ttgaaaccaa gaatctcctt taatttcttt gtcactgcac ctaaaaatgt gtctgatatc 3360
attcctagaa ctgaagttga aaaggccatc aggatgtccc ggagccgtat caatgatgct 3420
ttccgtctga atgacaacag cctagagttt ctggggatac agccaacact tggacctcct 3480
aaccagcccc ctgtttccat atggctgatt gtttttggag ttgtgatggg agtgatagtg 3540
gttggcattg tcatcctgat cttcactggg atcagagatc ggaagaagaa aaataaagca 3600
agaagtggag aaaatcctta tgcctccatc gatattagca aaggagaaaa taatccagga 3660
ttccaaaaca ctgatgatgt tcagacctcc ttttagaact tgtttattgc agcttataat 3720
ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat 3780
tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttaac gcgtgcgaag ttcctattct 3840
ctagaaagta taggaacttc atcgataccg ggtaggggag gcgcttttcc caaggcagtc 3900
tggagcatgc gctttagcag ccccgctggg cacttggcgc tacacaagtg gcctctggcc 3960
tcgcacacat tccacatccc ccggtaggcg ccaaccggct ccgttctttg gtggcccctt 4020
cgcgccacct tctactcctc ccctagtcag gaagttcccc cccgccccgc agctcgcgtc 4080
gtgcaggacg tgacaaatgg aagtagcacg tctcactagt ctcgtgcaga tggacagcac 4140
cgctgagcaa tggaagcggg taggcctttg gggcagcggc caatagcagc tttgctcctt 4200
cgctttctgg gctcagaggc tgggaagggg tgggtccggg ggcgggctca ggggcgggct 4260
caggggcggg gcgggcgccc gaaggtcctc cggaggcccg gcattctgca cgcttcaaaa 4320
gcgcacgtct gccgcgctgt tctcctcttc ctcatctccg ggcctttcga cctgcagccc 4380
aagctagctt accatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc ctcgccaccc gcgacgacgt 4440
ccccagggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac taccccgcca cgcgccacac 4500
cgtcgatccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg caagaactct tcctcacgcg 4560
cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac ggcgccgcgg tggcggtctg 4620
gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc gagatcggcc cgcgcatggc 4680
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ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc gtctcgcccg accaccaggg 4800
caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag gcggccgagc gcgccggggt 4860
gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc ttctacgagc ggctcggctt 4920
caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc acctggtgca tgacccgcaa 4980
gcccggtgcc tgaggtacct ctcatgctgg agttcttcgc ccaccccaac ttgtttattg 5040
cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt 5100
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gttcctattc tctagaaagt ataggaactt ctaacctccc gggtgacaga taacttcgta 5220
taatgtatgc tatacgaagt tatgtcgacg cggcgcgccg aattataata ctaacattac 5280
tgaagaaaat gcccaaaaga tggtaagttc ttgaggctac ccagggggtt attgattgct 5340
tcttaaagat cagaattact gcctataaaa ctggataagg aaatcataga gatctctcaa 5400
gtgtgaggat gagtgactgc ctctgtagct ctgatcctag tctcccagat ggctaaattc 5460
aattgacctt agagttcatc tggaaaattg ttatgaatga attatttgcc cagattccaa 5520
agatgagtga aaatgtttaa taaagttgcc atcactattc tcattatatt tggtatgtaa 5580
agcattcatg gaaatgttct aagtcgttat tgagccaata attttcttta gcttataatg 5640
ccaacaggtc tatccgagaa ctacaaatga catattaact gaaaaatgca actggggttt 5700
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attccttctt tcattgacac agagctctga ggaatttcca aaggtcacag aagaaaagct 5820
ataattaaac tagtcccaaa aaatctcagc ctactctggg aaagcagcat attttgtttg 5880
acaagtgcaa ggacttagaa cttttttttt tctcactgat cctgaagtgc cttttaagta 5940
tagttaagtg gtggaaaatt gagcaactat ttaagaaaag actctttttt ttcttcttcc 6000
agcaatgctt tccttcaaaa cggtagcttc aaaacttcct gtcttttaaa tgatcagggg 6060
gctgtgtgtt taaattattg ccattcatag aacagagtgg gtctgaggat gcctgtttcc 6120
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taatcatggt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac 6300
atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca 6360
ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat 6420
taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 6480
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 6540
aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca 6600
aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg 6660
ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg 6720
acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 6780
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 6840
tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc 6900
tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt 6960
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agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 7080
tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 7140
agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt 7200
tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct 7260
acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta 7320
tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 7380
agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 7440
tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact 7500
acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc 7560
tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt 7620
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agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 7740
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acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc 7860
agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt 7920
actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 7980
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gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa 8100
ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac 8160
tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa 8220
aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 8280
tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 8340
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct 8400
gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg 8460
ccctttcgtc 8470
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> Natural sequence
<220>
<223> Puro-F
<400> 28
aacctcccct tctacgagc 19
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> Natural sequence
<220>
<223> 3arm-outR
<400> 29
tacagccagg atctggatgt cagc 24
<210> 30
<211> 5922
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 鼠胚胎干细胞Ace2位点基因组替换序列
<400> 30
ccctatggag tggagaagag tcttataatt ttttaaatgg gcagagaaat gaatttattt 60
ttaattttta gagacagggt ttctttgtat agctctagct gtctttgatt ggtagacaaa 120
gctgtcctca aactcagaga tcttccttcc tttgtctcct gagtgctggg attaaaggca 180
tggaccacca ctgccctgcc ccattctctc cattaatttt aagtgaatgc ttgcaaaagc 240
tcacttcttt ggtgaacagc ttcctttaca aataagtacc tttgccttcg tttttatagg 300
attcttaaaa agaaaaaaaa gattcagcca ggtggttgtg gtgcacacct ttaatcccag 360
cagtcaggag gcagaggaaa gcagatctct tgagtttgag gctagcctag tctacagagg 420
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aaggagagag ggagaggatg gatagcttat tgatagaatt gtcagaaaag gctataagtt 540
ccaatatgtg tcccatgatt tctaagtcta gccctttctg ttatagtaaa atcatagtac 600
accctcctcc tccagtgtat ctttaacagc ttttaaggaa catattaact aaatgtccag 660
gttttgattt ggccataaaa tgttagcaaa gctaaggttt tctaggatta atgaataaca 720
tgtctttatt tagtttactt aaaaaaatca ttctaaaata tctgtttaca tatctgtcct 780
ctccaggatt aacttcatat tggtccagca gcttgtttac tgttctcttc tgtttcttct 840
tctgcttttt ttttcttctc ttctcagtgc ccaacccaag ttcaaaggct gatgagagag 900
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acggggaaag atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc 1020
tcagtccacc attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga 1080
agacctgttc tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga 1140
gaatgtccaa aacatgaata atgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc 1200
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gcaggctctt cagcaaaatg ggtcttcagt gctctcagaa gacaagagca aacggttgaa 1320
cacaattcta aatacaatga gcaccatcta cagtactgga aaagtttgta acccagataa 1380
tccacaagaa tgcttattac ttgaaccagg tttgaatgaa ataatggcaa acagtttaga 1440
ctacaatgag aggctctggg cttgggaaag ctggagatct gaggtcggca agcagctgag 1500
gccattatat gaagagtatg tggtcttgaa aaatgagatg gcaagagcaa atcattatga 1560
ggactatggg gattattgga gaggagacta tgaagtaaat ggggtagatg gctatgacta 1620
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tgaacatctt catgcctatg tgagggcaaa gttgatgaat gcctatcctt cctatatcag 1740
tccaattgga tgcctccctg ctcatttgct tggtgatatg tggggtagat tttggacaaa 1800
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ggtggaccag gcctgggatg cacagagaat attcaaggag gccgagaagt tctttgtatc 1920
tgttggtctt cctaatatga ctcaaggatt ctgggaaaat tccatgctaa cggacccagg 1980
aaatgttcag aaagcagtct gccatcccac agcttgggac ctggggaagg gcgacttcag 2040
gatccttatg tgcacaaagg tgacaatgga cgacttcctg acagctcatc atgagatggg 2100
gcatatccag tatgatatgg catatgctgc acaacctttt ctgctaagaa atggagctaa 2160
tgaaggattc catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca 2220
tttaaaatcc attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa 2280
cttcctgctc aaacaagcac tcacgattgt tgggactctg ccatttactt acatgttaga 2340
gaagtggagg tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg 2400
gtgggagatg aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata 2460
ctgtgacccc gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac 2520
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ccctctgcac aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat 2640
gctgaggctt ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa 2700
gaacatgaat gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga 2760
ccagaacaag aattcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagaccaaag 2820
catcaaagtg aggataagcc taaaatcagc tcttggagat aaagcatatg aatggaacga 2880
caatgaaatg tacctgttcc gatcatctgt tgcatatgct atgaggcagt actttttaaa 2940
agtaaaaaat cagatgattc tttttgggga ggaggatgtg cgagtggcta atttgaaacc 3000
aagaatctcc tttaatttct ttgtcactgc acctaaaaat gtgtctgata tcattcctag 3060
aactgaagtt gaaaaggcca tcaggatgtc ccggagccgt atcaatgatg ctttccgtct 3120
gaatgacaac agcctagagt ttctggggat acagccaaca cttggacctc ctaaccagcc 3180
ccctgtttcc atatggctga ttgtttttgg agttgtgatg ggagtgatag tggttggcat 3240
tgtcatcctg atcttcactg ggatcagaga tcggaagaag aaaaataaag caagaagtgg 3300
agaaaatcct tatgcctcca tcgatattag caaaggagaa aataatccag gattccaaaa 3360
cactgatgat gttcagacct ccttttagaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 3420
ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 3480
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta acgcgtgcga agttcctatt ctctagaaag 3540
tataggaact tcatcgatac cgggtagggg aggcgctttt cccaaggcag tctggagcat 3600
gcgctttagc agccccgctg ggcacttggc gctacacaag tggcctctgg cctcgcacac 3660
attccacatc ccccggtagg cgccaaccgg ctccgttctt tggtggcccc ttcgcgccac 3720
cttctactcc tcccctagtc aggaagttcc cccccgcccc gcagctcgcg tcgtgcagga 3780
cgtgacaaat ggaagtagca cgtctcacta gtctcgtgca gatggacagc accgctgagc 3840
aatggaagcg ggtaggcctt tggggcagcg gccaatagca gctttgctcc ttcgctttct 3900
gggctcagag gctgggaagg ggtgggtccg ggggcgggct caggggcggg ctcaggggcg 3960
gggcgggcgc ccgaaggtcc tccggaggcc cggcattctg cacgcttcaa aagcgcacgt 4020
ctgccgcgct gttctcctct tcctcatctc cgggcctttc gacctgcagc ccaagctagc 4080
ttaccatgac cgagtacaag cccacggtgc gcctcgccac ccgcgacgac gtccccaggg 4140
ccgtacgcac cctcgccgcc gcgttcgccg actaccccgc cacgcgccac accgtcgatc 4200
cggaccgcca catcgagcgg gtcaccgagc tgcaagaact cttcctcacg cgcgtcgggc 4260
tcgacatcgg caaggtgtgg gtcgcggacg acggcgccgc ggtggcggtc tggaccacgc 4320
cggagagcgt cgaagcgggg gcggtgttcg ccgagatcgg cccgcgcatg gccgagttga 4380
gcggttcccg gctggccgcg cagcaacaga tggaaggcct cctggcgccg caccggccca 4440
aggagcccgc gtggttcctg gccaccgtcg gcgtctcgcc cgaccaccag ggcaagggtc 4500
tgggcagcgc cgtcgtgctc cccggagtgg aggcggccga gcgcgccggg gtgcccgcct 4560
tcctggagac ctccgcgccc cgcaacctcc ccttctacga gcggctcggc ttcaccgtca 4620
ccgccgacgt cgaggtgccc gaaggaccgc gcacctggtg catgacccgc aagcccggtg 4680
cctgaggtac ctctcatgct ggagttcttc gcccacccca acttgtttat tgcagcttat 4740
aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt tttttcactg 4800
cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatcgatg aagttcctat 4860
tctctagaaa gtataggaac ttctaacctc ccgggtgaca gataacttcg tataatgtat 4920
gctatacgaa gttatgtcga cgcggcgcgc cgaattataa tactaacatt actgaagaaa 4980
atgcccaaaa gatggtaagt tcttgaggct acccaggggg ttattgattg cttcttaaag 5040
atcagaatta ctgcctataa aactggataa ggaaatcata gagatctctc aagtgtgagg 5100
atgagtgact gcctctgtag ctctgatcct agtctcccag atggctaaat tcaattgacc 5160
ttagagttca tctggaaaat tgttatgaat gaattatttg cccagattcc aaagatgagt 5220
gaaaatgttt aataaagttg ccatcactat tctcattata tttggtatgt aaagcattca 5280
tggaaatgtt ctaagtcgtt attgagccaa taattttctt tagcttataa tgccaacagg 5340
tctatccgag aactacaaat gacatattaa ctgaaaaatg caactggggt ttactgaagg 5400
cagcagctta gtaattaagg taaccatggc ttaggtgaaa ctggacctgg gaattccttc 5460
tttcattgac acagagctct gaggaatttc caaaggtcac agaagaaaag ctataattaa 5520
actagtccca aaaaatctca gcctactctg ggaaagcagc atattttgtt tgacaagtgc 5580
aaggacttag aacttttttt tttctcactg atcctgaagt gccttttaag tatagttaag 5640
tggtggaaaa ttgagcaact atttaagaaa agactctttt ttttcttctt ccagcaatgc 5700
tttccttcaa aacggtagct tcaaaacttc ctgtctttta aatgatcagg gggctgtgtg 5760
tttaaattat tgccattcat agaacagagt gggtctgagg atgcctgttt cctttgaaat 5820
tctatgcccc ctcccagttt tctaaaattt aagaaaccac agagactttg acaatgtagt 5880
tgccaaatga gttgctttta actgctctaa tagtttggtc tt 5922
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> Natural sequence
<220>
<223> hACE2-F
<400> 31
tgatagtggt tggcattgt 19
<210> 32
<211> 4591
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 最终删除PGK-puro后小鼠胚胎干细胞Ace2位点基因组替换序列
<400> 32
ccctatggag tggagaagag tcttataatt ttttaaatgg gcagagaaat gaatttattt 60
ttaattttta gagacagggt ttctttgtat agctctagct gtctttgatt ggtagacaaa 120
gctgtcctca aactcagaga tcttccttcc tttgtctcct gagtgctggg attaaaggca 180
tggaccacca ctgccctgcc ccattctctc cattaatttt aagtgaatgc ttgcaaaagc 240
tcacttcttt ggtgaacagc ttcctttaca aataagtacc tttgccttcg tttttatagg 300
attcttaaaa agaaaaaaaa gattcagcca ggtggttgtg gtgcacacct ttaatcccag 360
cagtcaggag gcagaggaaa gcagatctct tgagtttgag gctagcctag tctacagagg 420
gagttccagg acagccaagg ctacagagag gaactgtcta aaaacaccaa gaaagagaga 480
aaggagagag ggagaggatg gatagcttat tgatagaatt gtcagaaaag gctataagtt 540
ccaatatgtg tcccatgatt tctaagtcta gccctttctg ttatagtaaa atcatagtac 600
accctcctcc tccagtgtat ctttaacagc ttttaaggaa catattaact aaatgtccag 660
gttttgattt ggccataaaa tgttagcaaa gctaaggttt tctaggatta atgaataaca 720
tgtctttatt tagtttactt aaaaaaatca ttctaaaata tctgtttaca tatctgtcct 780
ctccaggatt aacttcatat tggtccagca gcttgtttac tgttctcttc tgtttcttct 840
tctgcttttt ttttcttctc ttctcagtgc ccaacccaag ttcaaaggct gatgagagag 900
aaaaactcat gaagagattt tactctaggg aaagttgctc agtggatggg atcttggcgc 960
acggggaaag atgtcaagct cttcctggct ccttctcagc cttgttgctg taactgctgc 1020
tcagtccacc attgaggaac aggccaagac atttttggac aagtttaacc acgaagccga 1080
agacctgttc tatcaaagtt cacttgcttc ttggaattat aacaccaata ttactgaaga 1140
gaatgtccaa aacatgaata atgctgggga caaatggtct gcctttttaa aggaacagtc 1200
cacacttgcc caaatgtatc cactacaaga aattcagaat ctcacagtca agcttcagct 1260
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gcatatccag tatgatatgg catatgctgc acaacctttt ctgctaagaa atggagctaa 2160
tgaaggattc catgaagctg ttggggaaat catgtcactt tctgcagcca cacctaagca 2220
tttaaaatcc attggtcttc tgtcacccga ttttcaagaa gacaatgaaa cagaaataaa 2280
cttcctgctc aaacaagcac tcacgattgt tgggactctg ccatttactt acatgttaga 2340
gaagtggagg tggatggtct ttaaagggga aattcccaaa gaccagtgga tgaaaaagtg 2400
gtgggagatg aagcgagaga tagttggggt ggtggaacct gtgccccatg atgaaacata 2460
ctgtgacccc gcatctctgt tccatgtttc taatgattac tcattcattc gatattacac 2520
aaggaccctt taccaattcc agtttcaaga agcactttgt caagcagcta aacatgaagg 2580
ccctctgcac aaatgtgaca tctcaaactc tacagaagct ggacagaaac tgttcaatat 2640
gctgaggctt ggaaaatcag aaccctggac cctagcattg gaaaatgttg taggagcaaa 2700
gaacatgaat gtaaggccac tgctcaacta ctttgagccc ttatttacct ggctgaaaga 2760
ccagaacaag aattcttttg tgggatggag taccgactgg agtccatatg cagaccaaag 2820
catcaaagtg aggataagcc taaaatcagc tcttggagat aaagcatatg aatggaacga 2880
caatgaaatg tacctgttcc gatcatctgt tgcatatgct atgaggcagt actttttaaa 2940
agtaaaaaat cagatgattc tttttgggga ggaggatgtg cgagtggcta atttgaaacc 3000
aagaatctcc tttaatttct ttgtcactgc acctaaaaat gtgtctgata tcattcctag 3060
aactgaagtt gaaaaggcca tcaggatgtc ccggagccgt atcaatgatg ctttccgtct 3120
gaatgacaac agcctagagt ttctggggat acagccaaca cttggacctc ctaaccagcc 3180
ccctgtttcc atatggctga ttgtttttgg agttgtgatg ggagtgatag tggttggcat 3240
tgtcatcctg atcttcactg ggatcagaga tcggaagaag aaaaataaag caagaagtgg 3300
agaaaatcct tatgcctcca tcgatattag caaaggagaa aataatccag gattccaaaa 3360
cactgatgat gttcagacct ccttttagaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 3420
ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 3480
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta acgcgtgcga agttcctatt ctctagaaag 3540
tataggaact tctaacctcc cgggtgacag ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag 3600
ttatgtcgac gcggcgcgcc gaattataat actaacatta ctgaagaaaa tgcccaaaag 3660
atggtaagtt cttgaggcta cccagggggt tattgattgc ttcttaaaga tcagaattac 3720
tgcctataaa actggataag gaaatcatag agatctctca agtgtgagga tgagtgactg 3780
cctctgtagc tctgatccta gtctcccaga tggctaaatt caattgacct tagagttcat 3840
ctggaaaatt gttatgaatg aattatttgc ccagattcca aagatgagtg aaaatgttta 3900
ataaagttgc catcactatt ctcattatat ttggtatgta aagcattcat ggaaatgttc 3960
taagtcgtta ttgagccaat aattttcttt agcttataat gccaacaggt ctatccgaga 4020
actacaaatg acatattaac tgaaaaatgc aactggggtt tactgaaggc agcagcttag 4080
taattaaggt aaccatggct taggtgaaac tggacctggg aattccttct ttcattgaca 4140
cagagctctg aggaatttcc aaaggtcaca gaagaaaagc tataattaaa ctagtcccaa 4200
aaaatctcag cctactctgg gaaagcagca tattttgttt gacaagtgca aggacttaga 4260
actttttttt ttctcactga tcctgaagtg ccttttaagt atagttaagt ggtggaaaat 4320
tgagcaacta tttaagaaaa gactcttttt tttcttcttc cagcaatgct ttccttcaaa 4380
acggtagctt caaaacttcc tgtcttttaa atgatcaggg ggctgtgtgt ttaaattatt 4440
gccattcata gaacagagtg ggtctgagga tgcctgtttc ctttgaaatt ctatgccccc 4500
tcccagtttt ctaaaattta agaaaccaca gagactttga caatgtagtt gccaaatgag 4560
ttgcttttaa ctgctctaat agtttggtct t 4591
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hACE2-qF
<400> 33
ggtcttcagt gctctcag 18
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> hACE2-qR
<400> 34
gcattcttgt ggattatctg g 21
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 正向引物
<400> 35
ggggaacttc tcctgctaga at 22
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 反向引物
<400> 37
cagacatttt gctctcaagc tg 22
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> TaqMan 探针
<400> 37
ttgctgctgc ttgacagatt 20

Claims (11)

1.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合包括如SEQ ID NO:19所示的上游引物和SEQ ID NO:20所示的下游引物。
2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合还包括如SEQ ID NO:21所示的上游引物和如SEQ ID NO:22所示的下游引物；
优选地，所述引物组合还包括如SEQ ID NO:23所示的上游引物和如SEQ ID NO:24所示的下游引物；
更为优选地，所述引物组合还包含如SEQ ID NO:25所示的上游引物和如SEQ ID NO:26所示的下游引物。
3.权利要求1或2所述引物组合在构建人源化动物细胞模型或动物模型中的应用。
4.一种打靶载体，其特征在于，包含5’同源臂序列、人源ACE2基因片段和SV40 polyA序列；
优选地，所述5’同源臂为与在所述目标基因组基因座处的5’靶序列同源的5’同源臂；
更为优选地，所述打靶载体通过权利要求1或2所述的引物组合连接5’同源臂序列、人源ACE2基因片段和SV40 polyA序列；
优选地，所述靶向载体用于将人源ACE2基因的CDS序列插入到动物基因的启动子和5’UTR区域序列后，利用动物目的基因启动子启动人目的基因表达；
优选地，所述5’同源臂序列如SEQ ID NO:15所示，所述ACE2基因的CDS序列如SEQ IDNO:12所示，所述SV40 polyA序列如SEQ ID NO:14所示，所述SV40 polyA序列位于所述的CDS序列之后；进一步优选地，所述打靶载体还包含3’同源臂，所述3’同源臂为与在所述目标基因组基因座处的3’靶序列同源的3’同源臂；
进一步优选地，所述3’同源臂的序列如SEQ ID NO:16所示；
优选地，所述打靶载体还包含如SEQ ID NO:17所示的筛选标志PGK-Puro；
进一步优选地，所述打靶载体还包含如SEQ ID NO:18所示的Frt序列；
更为优选地，所述打靶载体各个序列片段的连接顺序依次为5’同源臂序列、人源ACE2基因片段、SV40 polyA序列、frt序列、PGK-Puro序列、frt序列和3’同源臂序列；
或优选地，所述动物为哺乳动物；
更为优选地，所述哺乳动物为啮齿类动物；
更为优选地，所述动物为鼠。
5.权利要求4所述的打靶载体在制备基因人源化动物模型中的应用。
6.一种制备权利要求4所述的打靶载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将PCR扩增得到的产物片段5’同源臂、人ACE2 CDS和SV40 polyA使用搭桥PCR法PCR成连续片段5arm-hACE-SV40；
优选地，所述PCR反应体系为：
2×Phanta Max Buffer 25μL；
dNTP Mix 1μL；
10μM上游引物2μL；
10μM下游引物2μL；
DNA Polymerase 1μL；
模板链5’同源臂、人ACE2 CDS、SV40 polyA片段各50ng；
H2O至50μL；
PCR扩增反应条件65℃起始，每个循环降0.3℃；
优选地，所述5’同源臂片段使用的引物包括如SEQ ID NO:19所示的上游引物和SEQ IDNO:20所示的下游引物；所述人源ACE2基因片段使用的引物包括如SEQ ID NO:21所示的上游引物和如SEQ ID NO:22所示的下游引物；所述SV40 polyA序列使用的引物包括如SEQ IDNO:23所示的上游引物和如SEQ ID NO:24所示的下游引物；
更为优选地，所述方法还包括以下步骤：
将5arm-hACE-SV40片段进行AgeI+MluI双酶切；3’同源臂片段进行AscI+HindIII双酶切后分别通过酶切连接的方法连接上去，从而得打靶载体；
更进一步优选地，所述3’同源臂片段使用的引物包括如SEQ ID NO:25所示的上游引物和如SEQ ID NO:26所示的下游引物。
7.一种人源化动物细胞株的构建方法，其特征在于，所述方法中使用了权利要求1所述的引物组合；
优选地，所述方法包括将人源目的基因导入动物细胞中，使得目的基因在动物细胞内表达人源目的基因的CDS；
优选地，所述目的基因为ACE2；
更为优选地，所述动物为哺乳动物；
更为优选地，所述动物为啮齿类动物；
更为优选地，所述动物为鼠；
或优选地，所述细胞为胚胎干细胞。
或更为优选地，所述构建方法包括以下步骤：
(1)构建权利要求4所述的打靶载体；
(2)将构建的打靶载体和连接有sgRNA的载体导入动物来源的胚胎干细胞中；
(3)将步骤(2)中的胚胎干细胞培养成克隆，即得；
优选地，所述sgRNA包括如SEQ ID NO：1所示的序列；
或优选地，所述动物为哺乳动物；
进一步优选地，所述哺乳动物为啮齿类动物；
进一步优选地，所述啮齿类动物为鼠。
8.权利要求7所述的方法制备得到的ACE2基因人源化动物细胞株。
9.一种基因人源化动物模型的构建方法，其特征在于，包括将权利要求8所述的人源化动物细胞注入动物体内。
10.一种人源化鼠或其子孙的组织、体液、细胞、以及它们的破碎物或提取物，其特征在于，所述的人源化鼠是利用权利要求9所述的方法构建的。
11.来源于权利要求9所述的构建方法得到的人源化动物模型或其后代在制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用，或在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用，或在筛选、验证、评价或研究ACE2基因功能、ACE2抗体、针对ACE2靶点的药物、药效研究方面的用途。
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