CN107384921A - miR216a用于抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移 - Google Patents

Abstract

本发明公开了miR216a用于抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。本发明提供了miR216a及用于表达miR216a的物质在制备用于抑制骨肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移的产品中的应用。本发明证实了miR216a可以通过靶向调控CDK14的表达从而抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。此外，骨肉瘤患者中miR216a表达下调和CDK14表达呈负相关。因此，miR216a和CDK14有可能成为治疗骨肉瘤预后的新的生物标志物和共同的治疗靶标。本发明对于治疗骨肉瘤具有重要意义。

Description

miR216a用于抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及miR216a用于抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移，特别涉及miR216a在制备通过靶向调控CDK14从而抑制骨肉瘤细胞增殖，侵袭和迁移的产品中的应用。

背景技术

骨肉瘤作为目前最常见的骨恶性病变，发病机制复杂，且容易发生远处转移，最终导致世界范围内的青少年和成人死亡。目前，骨肉瘤尚未发生远处转移的患者5年生存率为60％-80％，而发生远处转以后，则降至15％-30％。当前，化疗联合手术治疗已广泛应用于治疗骨肉瘤患者。然而，虽然骨肉瘤生物学和遗传学研究已取得一定进展，但骨肉瘤患者的临床治疗效果却并未发生明显改善。因此，需找更好的骨肉瘤临床治疗方案并理解其中的作用机制至关重要。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类大小约19-25个核苷酸(nt)的内源性非蛋白编码调控单链小分子RNA，具有高度保守性，一般来源于染色体的非编码区域。miRNA由RNA聚合酶在基因组的不同区域转录形成较长的pri-miRNA。经过核酸内切酶Ⅲ-Drosha及其辅助因子DGCR8的识别和作用，形成60-75nt的miRNA前体(pre-miRNA)。pre-miRNA在RNA-GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin 5作用下，从细胞核进入细胞质。pre-miRNA在第二个核酸内切酶Ⅲ-Dicer的作用下被切割，形成21-25nt的双链miRNA。然后，双链体降解成为单链的成熟miRNA，继而通过基因沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，形成非对称RISC复合物，从而识别靶基因mRNA，阻断翻译过程。miRNA主要通过转录后基因表达调控发挥生物学效应，具有阶段性和组织特异性。miRNA与目标基因mRNA分子的3’端非编码区域(3’-untranslated region,3’UTR)互补匹配结合，导致靶基因mRNA分子翻译表达得到抑制或裂解，进而调节细胞早期发育，参与细胞分化，调控生物体内的基因表达。在各个生物物种之间，miRNA具有高度的进化保守性，在环部可以容许更多的突变位点存在，而在茎部的保守性较强。miRNA绝大部分定位于基因间隔区，并在基因组内以基因簇或单拷贝、多拷贝等多种形式存在。miRNA的转录与其他基因相互独立，可参与调控生物体内多种代谢过程，而其本身并不翻译蛋白质。DNA甲基化修饰、乙酰化修饰、DNA拷贝改变、特定翻译调节和基因位点突变等均可参与miRNA合成过程中蛋白功能，从而调控miRNA在体内的表达。系列改变导致miRNA功能发生变化，并可通过调控细胞信号通路、细胞因子和相关靶基因的表达，参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢与发育等，导致自身免疫性疾病、炎症、肿瘤等的发生发展。

细胞周期蛋白依赖激酶(CDK)作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是驱动细胞周期的过渡的关键调节酶，在细胞周期转换控制发挥关键作用。因此，CDK也长期被认为是有前途的癌症治疗靶标。人类基因组编码26个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶从而形成CDK和类CDK的激酶组分；其中的21种被划分为CDK。不同的激酶亚型在癌细胞增殖有关键作用。最近报告显示，CDK能够支持炎症介质的表达。CDK在各种人类癌症都高表达，如胃癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌和结直肠癌，并且与癌症预后密切相关。由此可见，对CDKs的生物学了解是评估与CDK抑制剂临床效果的关键，特别是确定其潜在的治疗和组合策略。CDK14又称作PFTK1(PFTAIRE蛋白激酶1)，虽然在乳腺癌、食管癌、肺癌、肝癌、胃癌、胰腺癌和卵巢癌中高表达；但是，其在骨肉瘤发生发展的重要作用仍然未知。

发明内容

本发明的目的是提供一种miR216a及其相关生物材料的新用途。

第一，本发明提供了如下(1)-(4)所示物质中的任一种在如下(a)-(e)至少一种中的应用：

(1)人源成熟miR216a；(2)人源前体miR216a；(3)编码(1)中所述人源成熟miR216a或(2)中所述人源前体miR216a的DNA分子；(4)含有(3)中所述DNA分子的表达盒、重组载体或转基因细胞。

(a)制备用于抑制骨肉瘤细胞增殖的产品；(b)制备用于抑制骨肉瘤细胞侵袭的产品；(c)制备用于抑制骨肉瘤细胞迁移的产品；(d)制备用于抑制骨肉瘤生长的产品；(e)制备用于抑制骨肉瘤转移的产品。

第二，本发明提供了如下(1)-(4)所示物质中的任一种在如下(f)-(g)至少一种中的应用：

(1)人源成熟miR216a；(2)人源前体miR216a；(3)编码(1)中所述人源成熟miR216a或(2)中所述人源前体miR216a的DNA分子；(4)含有(3)中所述DNA分子的表达盒、重组载体或转基因细胞。

(f)制备用于抑制骨肉瘤细胞内CDK14蛋白表达的产品；(g)制备用于抑制骨肉瘤细胞从G1期向S期过渡的产品。

第三，本发明提供了如下(1)-(4)所示物质中的任一种在如下(h)-(n)至少一种中的应用：

(1)人源成熟miR216a；(2)人源前体miR216a；(3)编码(1)中所述人源成熟miR216a或(2)中所述人源前体miR216a的DNA分子；(4)含有(3)中所述DNA分子的表达盒、重组载体或转基因细胞。

(h)制备用于抑制骨肉瘤细胞内LRP6蛋白磷酸化的产品；(i)制备用于抑制骨肉瘤细胞内CCND1蛋白表达的产品；(j)制备用于抑制骨肉瘤细胞内c-Myc蛋白表达的产品；(k)制备用于抑制骨肉瘤细胞内PI3K蛋白磷酸化的产品；(l)制备用于抑制骨肉瘤细胞内Akt蛋白磷酸化的产品；(m)制备用于抑制N-cadherin蛋白的表达的产品；(n)制备用于促进E-cadherin蛋白的表达的产品。

第四，本发明提供了能够抑制如下(1)或(2)表达的物质在如下(a’)-(d’)至少一种中的应用：

(1)人源成熟miR216a；(2)人源前体miR216a。

(a’)制备用于促进骨肉瘤细胞增殖的产品；(b’)制备用于促进骨肉瘤细胞侵袭的产品；(c’)制备用于促进骨肉瘤细胞迁移的产品；(d’)制备用于促进骨肉瘤生长的产品；(e’)制备用于促进骨肉瘤转移的产品。

第五，本发明提供了能够抑制如下(1)或(2)表达的物质在如下(f’)-(g’)至少一种中的应用：

(1)人源成熟miR216a；(2)人源前体miR216a。

(f’)制备用于促进骨肉瘤细胞内CDK14蛋白表达的产品；(g’)制备用于促进骨肉瘤细胞从G1期向S期过渡的产品。

第六，本发明提供了能够抑制如下(1)或(2)表达的物质在如下(h’)-(n’)至少一种中的应用：

(1)人源成熟miR216a；(2)人源前体miR216a。

(h’)制备用于促进骨肉瘤细胞内LRP6蛋白磷酸化的产品；(i’)制备用于促进骨肉瘤细胞内CCND1蛋白表达的产品；(j’)制备用于促进骨肉瘤细胞内c-Myc蛋白表达的产品；(k’)制备用于促进骨肉瘤细胞内PI3K蛋白磷酸化的产品；(l’)制备用于促进骨肉瘤细胞内Akt蛋白磷酸化的产品；(m’)制备用于促进N-cadherin蛋白的表达的产品；(n’)制备用于抑制E-cadherin蛋白的表达的产品。

其中，所述“能够抑制如下(1)或(2)表达的物质”为miR216a抑制剂。所述miR216a抑制剂具体为QIAGEN公司生产的货号为219300的Anti-hsa-miR-216a-5p。

在上述各应用中，所述人源成熟miR216a具体为序列表中序列1所示RNA分子。所述人源前体miR216a具体为序列表中序列2所示RNA分子。编码所述人源成熟miR216a或所述人源前体miR216a的DNA分子具体为序列表中序列3的第5447-5555位所示DNA分子。

在上述各应用中，所述CDK14蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列4所示；所述LRP6蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列5所示；所述CCND1蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列6所示；所述c-Myc蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列7所示；所述PI3K蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列8所示；所述Akt蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列9所示；所述N-cadherin蛋白的氨基酸序列如序列表中序列10所示；所述E-cadherin蛋白的氨基酸序列如序列表中序列11所示。

在上述各应用中，所述骨肉瘤细胞既可为来自于骨肉瘤患者病灶处的细胞，也可为商业化的人骨肉瘤细胞系，如143B细胞或者U2OS细胞。

本发明证实了miR216a可以通过靶向调控CDK14的表达从而抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移。此外，骨肉瘤患者中miR216a表达下调和CDK14表达呈负相关。因此，miR216a和CDK14有可能成为治疗骨肉瘤预后的新的生物标志物和共同的治疗靶标。本发明对于治疗骨肉瘤具有重要意义。

附图说明

图1为骨肉瘤患者中CDK14表达情况及其与临床指征的相关性。其中，a为组织病理学检测患者骨肉瘤组织及癌旁组织中的CDK14表达情况；b为骨肉瘤组织与癌旁组织相比，CDK14表达显著上调；c为Kaplan Meier生存分析高水平表达的CDK14患者相对于低表达CDK14的患者具有较差的整体存活率；d为Kaplan Meier生存分析高水平表达的CDK14患者相对于低表达CDK14的患者具有较差的无病生存期。

图2为miR216a通过靶向CDK14的3’-UTR区抑制CDK14的表达。其中，a为miR216a显著抑制骨肉瘤细胞系中的表达(转入143B和U2OS细胞中的是序列3所示的含有miR216编码基因的载体)；b为抑制miR216a基因表达则能够促进骨肉瘤细胞CDK14的表达(所用的miR216a抑制剂具体为QIAGEN公司生产的货号为219300的Anti-hsa-miR-216a-5p)；c为miR216a过表达能够显著抑制CDK14的3’-UTR活性，但对突变的miR216a的结合位点的荧光素酶活性没有影响。

图3为miR216a通过抑制CDK14的表达抑制骨肉瘤增殖、迁移和侵袭。其中，a和c为miR216能够抑制骨肉瘤细胞增殖能力和集落形成，CDK14能逆转miR216a对细胞增殖的影响，a为细胞生长实验结果，c为克隆形成实验结果；b和d为添加miR216a抑制剂能够促进骨肉瘤细胞增殖和集落形成，b为细胞生长实验结果，d为克隆形成实验结果；e为miR216能够抑制骨肉瘤细胞迁移；f为miR216能够抑制骨肉瘤细胞侵袭；g为添加miR216a抑制剂能够促进骨肉瘤细胞的迁移；h为添加miR216a抑制剂能够促进骨肉瘤细胞的侵袭。

图4为miR-216a抑制骨肉瘤细胞的细胞周期。其中，a为在骨肉瘤143B细胞中转染含有miR216编码基因的载体会增加G0/G1期细胞比例(从52.09％到64.16％)，减少S期细胞比例(从32.14％到20.30％)；b为添加miR216a抑制剂后，G0/G1期细胞比例明显减少(从52.13％至40.41％)的阶段，而S期细胞比例却增加(31.89％到43.60％)；c为转染含有miR216编码基因的载体能够抑制LRP6磷酸化水平，以及Wnt信号通路的两个关键的下游靶基因CCND1和c-Myc；d为转染含有miR216编码基因的载体能够抑制骨肉瘤细胞PI3K和Akt的磷酸化，抑制N-cadherin的表达并促进E-cadherin的表达，而转染含有CDK14编码基因的载体(pcDNA3-FLAG-CDK14)则可增加PI3K和Akt的磷酸化水平，促进N-cadherin的表达并抑制E-cadherin的表达。

图5为miR-216a在动物体内抑制骨肉瘤的增殖和转移。其中，a和b为miR216a过表达能够明显抑制肿瘤的生长，而在小鼠体内联合表达miR216a和CDK14骨肉瘤143B细胞系则对肿瘤生长有逆转影响，a为肿瘤图片，b为体积统计结果；c为在小鼠接种mir216a过表达的骨肉瘤143B细胞系后，小鼠的CDK14和EMT标记物基因表达减少；d为miR216a组小鼠肺的活体成像实验显示相对于对照组，mir216a组小鼠的肺部转移灶更少，而miR216a和CDK14共表达组小鼠则显示较多转移灶；e为肺的解剖学和组织学分析显示相对于对照组，mir216a组小鼠的肺部转移灶更少，而miR216a和CDK14共表达组小鼠则显示较多转移灶。

图6为骨肉瘤患者中miR216a表达情况及其与临床指征的相关性。其中，a为实时荧光定量PCR结果显示骨肉瘤患者miR216a的表达明显降低；b为Kaplan Meier生存分析表明，体内miR216a高表达的患者具有更好的整体存活率(P＝0.020)；c为Kaplan Meier生存分析表明，体内miR216a高表达的患者具有更好的无病生存期(P＝0.017)；d为骨肉瘤样本中miR216a表达与CDK14蛋白表达呈负相关(P＝2.5×10-8，r＝-0.745)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、病人及标本

本发明研究是由中国人民解放军总医院的机构审查委员会批准(北京，中国)和并在患者知情同意下进行。共有91例骨肉瘤和癌旁组织，并在病理和影像学标准进行研究的基础上进行了评价。临床信息来自患者就诊记录。总的生存时间被定义为从手术到死亡的时间。患者的随访资料每月更新。标本分为两部分：一部分在液氮中立即冻结，保存在-80℃直到进行RNA提取，另一部分则用于组织病理学评估。

2、质粒构建

2.1含有CDK14编码基因的重组载体的构建

按常规PCR方法，以序列12所示的目的基因CDK14为模板，采用引物上游5’-GGATCCATGTGTGACCTCATTGAGCCGC-3’，下游5’-CTCGAGTCAGTGCTTGCTGTTTGATAGAC-3’进行PCR扩增，BamHI和XhoI双酶切PCR产物和相应载体(pcDNA3-FLAG，Invitrogen公司产品，货号为20011)，按正确相位将目的片断插入载体。经转化、筛选，得到阳性克隆酶切鉴定，分析各种重组蛋白的表达，所有重组质粒送北京博迈德生物技术有限公司测序。将测序后表明将pcDNA3-FLAG载体的酶切位点BamHI和XhoI之间的小片段替换为序列表中序列12所示DNA片段后的重组质粒命名为pcDNA3-FLAG-CDK14。

2.2含有野生型或突变的CDK14的3’UTR序列的报告基因载体的构建

按常规PCR方法，分别以序列13所示的含有目的基因CDK14的野生型3’UTR的序列和序列14所示的含有目的基因CDK14的突变型3’UTR的序列为模板，采用野生型引物(上游5’-CATGCCATGGCATATTCTCCCTCTGCTTCTTT-3’；下游5’-CCGCTCGAGGTGTCAAATCTCCTTTCAGAAT-3’)和突变型引物(上游5’-CATGCCATGGCACTGGAATGTTTTGGTCTCGGC-3’；下游5’-CCGCTCGAGGCCGAGACCAAAACATTCCAGTG-3’)分别进行PCR扩增，NcoI和XhoI双酶切PCR产物和相应载体(pmirGLO Dual-LuciferasemiRNA Target Expression Vector，Promega公司产品，货号为E1330，按正确相位将目的片断插入载体。经转化、筛选，得到阳性克隆酶切鉴定，分析各种重组蛋白的表达，所有重组质粒送北京博迈德生物技术有限公司测序。将测序后表明将载体的酶切位点NcoI和XhoI之间的小片段替换为序列表中序列13的第2345-2574位所示DNA片段后的重组质粒命名为CDK143’UTR野生型。将测序后表明将载体的酶切位点NcoI和XhoI之间的小片段替换为序列表中序列14的第2449-2471位所示DNA片段后的重组质粒命名为CDK14 3’UTR突变体。

2.3用于动物实验的PCDH-miR216a载体的构建

按常规PCR方法，以序列3的第5447-5555位所示的miR216a的编码基因为模板，采用上游引物和下游引物进行PCR扩增，其中PCR引物中上游引物：5’-GGATCCGATGGCTGTGAGTTGGCTTATCT-3’；下游引物：5’-CTCGAGTCGTGAGGGCTAGGAAATTGCTC-3’。BamHI和XhoI双酶切PCR产物和相应载体(PCDH，System Biosciences公司产品，货号为CD500B1)，按正确相位将目的片断插入载体。经转化、筛选，得到阳性克隆酶切鉴定，分析各种重组蛋白的表达，所有重组质粒送北京博迈德生物技术有限公司测序。将测序后表明将载体的酶切位点BamHI和XhoI之间的小片段替换为序列表中序列3的第5447-5555位所示DNA片段后的重组质粒命名为PCDH-miR216a。

3、RNA的提取和定量逆转录PCR(qRT-PCR)

采用RNeasy Mini Kit(Qiagen公司)试剂盒，提取总RNA，反转录成cDNA，RNA质量检查使用安捷伦2100生物分析仪根据RNA完整性评价(RIN)。RIN值的范围从1到10定义为RNA完全降解到结构完整，数值大于7被认为是可接受的完整性定量PCR基因表达检测。TaqMan miRNA qRT-PCR系统被用于检测和定量miRNA表达。用比较Ct法计算miRNA相对表达水平。通用核小RNA U6为内参。用于实时荧光定量PCR分析的引物序列列于表1。

表1引物序列

qRT-PCR具体步骤：

(1)真核细胞总RNA提取：取6cm²培养皿培养细胞，去除上清，并用1×PBS清洗一次。再添加1ml Trizol至细胞中，混合均匀，在室温下裂解5min。按照每ml Trizol液添加0.2ml三氯甲烷，然后剧烈振荡50次，静置2-3min，12000rpm离心15min。取上层清澈透明液体至新的EP管中，并添加等体积异丙醇，放置-80℃中15min，置于4℃离心机中高速离心15min；用75％乙醇洗涤RNA白色沉淀物，4℃高速离心5min；并添加无水乙醇1ml，4℃高速离心2min；至RNA自然干燥；最后，溶解RNA沉淀，采用100μl DEPC水溶解。

(2)反转录：总RNA 2μg，加入1μl 50μM的随机引物，72℃进行解链，5min后自然冷却到室温。然后加入dNTP、逆转录酶M-MLV、RNA酶抑制剂逆转录缓冲液，加水至最终体系体积，置于42℃恒温中，反应1h，95℃恒温环境，5min灭活处理，最终得到反转录完成的cDNA。

(3)RT-qPCR：PCR反应液(20μl体系)按下列组分配制：10μl SYBR Green Mix(2×)、2μl cDNA、0.4μl上下游引物(10μM)，余下用去离子水相应补齐；将样品加入到Real-time PCR专用PCR管中后，设置ABI Prism SDS 7000的PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，60℃30s，40cycles。完成Real-time PCR后对其熔解曲线进行分析并结合琼脂糖分析PCR产物是否特异。按2^-ΔΔCt公式基因表达值进行数据计算分析。

4、荧光素酶检测

60％的细胞种在24孔培养板上。将含有野生型或突变的CDK14的3’UTR序列的报告基因载体(见上述步骤2.2)与含有miR216编码基因的载体(全序列如序列3所示)分别共转染至细胞，采用的转染试剂是Lipofectamine 2000。48小时后，收集细胞，然后加入100μl裂解液，置于室温中，摇床上轻摇20min，刮下培养皿中细胞，收集至EP管中。震荡10min，低温高速离心5min，收集上层清澈液体。取10μl上清液加入到荧光素酶反应底物中，用荧光计测定荧光素酶活性。取含有β-巯基乙醇(2.7ml/L)的Z缓冲液90μl，然后向其中加入上述上清50μl，然后加入0.4％的ONPG溶液，20μl，置于37℃保温。等待溶液变为浅黄色，然后加入浓度为1mol/L Na₂CO₃溶液，50μl，然后终止颜色反应。并测定样品OD值。

5、Western blot

细胞转染后24h，去除DMEM，用PBS清洗1次，并用胰酶消化后吸除，加入1ml PBS，将细胞收集于EP管中，低速离心，4℃，10min，将上清液去除。取与细胞沉淀等体积的SDS，并使之混合均匀，置于沸水环境中，保持10-15min后，高速离心，并进行SDS-PAGE。电泳结束后，进行转膜；操作过程中要注意保持完整性，并驱除气泡，5％脱脂奶粉配成封闭液，室温封闭1h。室温孵育抗体1h，然后TBST洗膜5min，共3次。最后，采用DAB显色，按比例混合后，反应5min，进行X片压片显影。

6、细胞侵袭实验

取对数生长期的肿瘤细胞，以0.1％牛血清蛋白(BSA)DMEM培养液调整细胞数为1×10⁶cells/ml。取100μl细胞接种于transwell上室内，对照组加入等体积无血清DMEM培养液，每组设3个复室。下室加入含15％小牛血清的DMEM培养液500μl，37℃、5％CO₂培养24h后，将滤膜上层的细胞用棉签抹去，滤膜以甲醇固定5min。用Giemsa染料染色15min。100倍光镜下选择上下左右中5个不同视野的穿过膜的细胞数，求平均值，按下式计算药物对肿瘤细胞的迁移能力。迁移抑制率＝(1-实验组平均迁移细胞数/对照组平均迁移细胞数)×100％。

7、划痕实验

先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。其次在空中加入约5×10⁵个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。然后用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。放入37度5％CO₂培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。

8、细胞生长实验

将过表达miR216a的稳定克隆骨肉瘤143B细胞系(即向143B细胞中转入序列3所示含有miR216编码基因的载体后经压系所得的稳定转染细胞系)分别以2×10⁴个/mL密度分别接种于96孔板中，每个孔加入100μL细胞悬液各设3个复孔，常规培养。分别于24h、48h、72h、96h取一块96孔板，在接种孔中加入10μL CCK-8试剂，37℃、50mL/L CO₂常规培养2h，测定OD490nm值；以测量时间点为横坐标，OD值为纵坐标绘制生长曲线。

9、细胞周期实验

将细胞接种于六孔板，总细胞数为1×10⁶个，24h后收集细胞，1500转/分离心10分钟，弃上清，用PBS洗一次(含3％小牛血清)，然后用1ml含70％的乙醇，3％的小牛血清的PBS在-20℃固定过夜。然后3000转/分离心1min，弃上清，再用PBS(含3％小牛血清)以同样速度洗细胞两次，弃上清，加入0.2ml RNase A，37℃水浴30min，再加入0.3ml的PI置暗处染色。细胞周期采用流式细胞仪FACScan Becton-Dickinson BD系统检查。

10、动物实验

动物研究是按照中国人民解放军总医院机构动物护理和使用委员会批准的规程进行。将大约1×10⁷个143B细胞注射到6周龄BALB/c裸鼠。针对肿瘤生长模型，将过表达PCDH空载体、PCDH-miR216a或PCDH-miR216a和pcDNA3-FLAG-CDK14的稳定克隆骨肉瘤143B细胞系进行小鼠皮下注射。用卡尺测量肿瘤生长情况。根据下列公式计算肿瘤体积：体积＝(长径×短直径)/2。切除的肿瘤进行称重，并部分液氮冷冻或固定于4％多聚甲醛的进一步研究。在体内肺转移的研究中，1×10⁶ 143B细胞标记的荧光素酶载体与上述基因共同注入BALB/c雌性小鼠的尾静脉。动物的影像在28天使用IVIS200成像系统。小鼠的肺进行测量并用4％多聚甲醛固定以进一步研究。

11、统计分析

生存分析采用Kaplan Meier法，生存曲线的差异用对数秩检验进行评估。采用Cox回归模型进行单因素和多因素分析。定量资料采用单因素方差分析和并进行检验评估。采用GraphPad Prism 6软件通过Pearsonχ²进行相关性分析。统计计算采用SPSS 17.0软件进行。所有体外实验均均重复三次以上。数据以均值±标准差(SD)表示。P<0.05被认为具有统计学意义。

实施例1、miR216a通过靶向调控CDK14抑制骨肉瘤细胞生长，侵袭和迁移

本发明中出现的CDK14蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示；LRP6蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示；CCND1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列6所示；c-Myc蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示；所述PI3K蛋白的氨基酸序列如序列表中序列8所示；Akt蛋白的氨基酸序列如序列表中序列9所示；N-cadherin蛋白的氨基酸序列如序列表中序列10所示；E-cadherin蛋白的氨基酸序列如序列表中序列11所示。

一、骨肉瘤患者中的CDK14表达以及与患者临床参数的相关性研究

为探究CDK14在骨肉瘤中的作用，本发明采用组织病理学检测评估了91例患者骨肉瘤组织及癌旁组织中的CDK14表达情况(图1中a)。骨肉瘤组织与癌旁组织相比，CDK14表达显著上调(P＝7.4×10^-4)(图1中b)。为进一步探讨CDK14的临床意义，本发明研究CDK14的水平与临床病理特征之间的关系。结果表明：CDK14表达水平与肿瘤大小、组织学分级密切相关(表2)。此外，Kaplan Meier生存分析表明，高水平表达的CDK14患者相对于低表达CDK14的患者具有较差的整体存活率(P＝0.021)和无病生存期(P＝0.014)(图1中c和d)。这些结果表明CDK14在骨肉瘤的预后和转移发挥重要作用。

表2 CDK14表达与骨肉瘤患者临床信息

注：P-values采用Pearson卡方检验。*P<0.05,**P<0.01。

二、miR216a通过直接靶向CDK14的3’-UTR从而抑制CDK14的表达

为识别潜在的靶向CDK14miRNA的候选靶标，我们采用生物信息学，运用两个目标预测程序，miRanda和TargetScan，进行功能结合位点预测。对潜在的靶向CDK14miRNA的miRNA，包括miR216a、miR138、miR205、miR455进行筛选。接下来，我们在http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/rnawebsuite/rnacofold.cgi采用软件对miRNA及CDK14的3'UTR的结合自由能进行分析，并进行Western blot检测确认miRNA的表达上述CDK14有影响。结果表明miR455在骨肉瘤细胞系能够抑制CDK14表达。重要的是，miR216a具有最佳的自由能和最明显的抑制CDK14表达的作用。因此，我们推测miR216a能够在骨肉瘤中发挥重要作用。事实上，通过Western blot分析，miR216a显著抑制骨肉瘤细胞系中的表达(图2中a)。相反，抑制miR216a基因表达则能够促进骨肉瘤细胞CDK14的表达(图2中b)。值得注意的是，miR216a对CDK14的mRNA表达水平没有明显影响，从而表明miR216a对CDK14的调控是转录后调节。

我们接下来在骨肉瘤细胞系143B和U2OS中分别共转染含有野生型或突变的CDK14的3’UTR序列的报告基因载体(见实施例1前的步骤2.2)和含有miR216编码基因的荧光素酶报告基因载体(全序列如序列3所示)来评价CDK14是否是miR216a的直接靶基因。miR216a过表达能够显著抑制CDK14的3’-UTR活性，但对突变的miR216a的结合位点的荧光素酶活性没有影响(图2中c)。另一方面，抑制miR216a表达则会上调CDK14的3'UTR荧光素酶活性。这些结果综合表明miR216a能够通过在骨肉瘤细胞中靶向CDK14的3’-UTR活性抑制CDK14的表达。

人源成熟miR216a为序列表中序列1所示的RNA分子；所述人源前体miR216a为序列表中序列2所示的RNA分子；编码所述人源成熟miR216a或所述人源前体miR216a的DNA分子为序列表中序列3的第5447-5555位所示的DNA分子。

三、miR216a通过抑制CDK14的表达抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭

我们然后通过细胞生长和克隆形成试验评估了miR216a能否调节骨肉瘤细胞株的表型。转染miR216a的细胞用于分析生长情况。与上述结果一致，转染含有miR216编码基因的载体(全序列如序列表中序列3所示)能够抑制骨肉瘤细胞增殖能力和集落形成(图3中a和c)。此外，转染CDK14重组质粒pcDNA3-FLAG-CDK14(见实施例1前的步骤2.1)表明，CDK14能逆转miR216a对细胞增殖的影响(图3中a和c)。相反，添加miR216a抑制剂(QIAGEN公司生产的货号为219300的Anti-hsa-miR-216a-5p)则能够促进骨肉瘤细胞增殖和集落形成(图3中b和d)。上述结果表明，miR216a能够通过抑制CDK14表达抑制细胞增殖。

接下来，我们研究了miR216a对骨肉瘤细胞迁移和侵袭能力的影响。事实上，转染含有miR216编码基因的载体(全序列如序列表中序列3所示)能够抑制骨肉瘤细胞迁移(图3中e)。Matrigel侵袭实验也得到了类似的结果。简言之，上述结果表明miR216a表达能够明显抑制骨肉瘤细胞系的侵袭(图3中f)。此外，添加miR216a抑制剂(QIAGEN公司生产的货号为219300的Anti-hsa-miR-216a-5p)，则能够促进骨肉瘤细胞的侵袭和迁移能力(图3中g和h)。综上结果也表明CDK14是miR216a调控骨肉瘤转移的重要调节因子。

四、miR216a/CDK14轴能调节细胞周期进程

由于miR216a靶向细胞周期蛋白依赖性激酶CDK14，为更好地阐明miR216a调控骨肉瘤细胞生长抑制的机制，我们通过采用流式细胞仪分析miR216a对细胞周期的影。在骨肉瘤143B细胞中转染含有miR216编码基因的载体(全序列如序列表中序列3所示)会增加G0/G1期细胞比例(从52.09％到64.16％)，但减少了S期细胞比例(从32.14％到20.30％)(图4中a)。相反，添加miR216a抑制剂(QIAGEN公司生产的货号为219300的Anti-hsa-miR-216a-5p)后，G0/G1期细胞比例明显减少(从52.13％至40.41％)的阶段，而S期细胞比例却增加(31.89％到43.60％)(图4中b)。这些数据表明，miR216a抑制骨肉瘤细胞的G1/S过渡。

五、miR216a/CDK14轴通过控制LRP6介导的Wnt信号通路和PI3K/Akt通路调节细胞迁移和侵袭进程

CDK14能介导脂蛋白受体相关蛋白6(LRP6)磷酸化从而促进Wnt信号转导。此外，敲低CDK14表达能抑制胰腺癌细胞p-PI3K和p-Akt表达。因此，我们探究Wnt和PI3K/Akt信号通路是否参与调控miR216a/CDK14对细胞侵袭和迁移的进程。我们的数据表明，转染含有miR216编码基因的载体(全序列如序列表中序列3所示)能够抑制LRP6磷酸化水平，以及Wnt信号通路的两个关键的下游靶基因CCND1和c-Myc(图4中c)。此外，转染含有miR216编码基因的载体(全序列如序列表中序列3所示)能够抑制骨肉瘤细胞PI3K和Akt的磷酸化，而转染含有CDK14编码基因的载体(pcDNA3-FLAG-CDK14，见实施例1前的步骤2.1)则可增加PI3K和Akt的磷酸化水平(图4中d)。上述数据共同表明miR216a/CDK14轴能通过控制LRP6介导的Wnt信号通路和PI3K/Akt通路调节细胞迁移和侵袭进程。

E-cadherin、N-cadherin是肿瘤上皮细胞-间充质转化(Epithelial-MesenchymalTransition，EMT)的重要标志。E-cadherin和N-cadherin的表达与肿瘤侵袭和转移密切相关。在肿瘤中，E-cadherin的突变促进细胞的侵袭、运动和转移。在肿瘤细胞中敲低CDK14能够促进E-cadherin的表达从而抑制肿瘤EMT。然而，N-cadherin和CDK14之间的关系尚未完全阐明。由于miR-216a/CDK14轴可调控骨肉瘤的侵袭，因此我们尝试探讨miR-216a/CDK14轴对小鼠E-cadherin和N-cadherin生产的影响。正如预期的那样，miR-216a抑制N-cadherin的表达并促进E-cadherin的表达，添加CDK14后可促进N-cadherin的表达并抑制E-cadherin的表达。提示miR-216a/CDK14有轴与骨肉瘤的EMT相关。

六、miR216a抑制肿瘤发生和转移的骨肉瘤

我们进一步通过对裸鼠瘤细胞生长影响评价在miR216a在体内的表型表达。的确，miR216a过表达能够明显抑制肿瘤的生长(图5中a、b)。此外，在小鼠接种mir216a过表达的骨肉瘤143B细胞系(即向143B细胞中转入序列3所示含有miR216编码基因的载体后经压系所得的稳定转染细胞系)后，小鼠的CDK14和EMT标记物基因表达减少(图5中c)。而在小鼠体内联合表达miR216a和CDK14骨肉瘤143B细胞系则对肿瘤生长有逆转影响(图5中a、b)。

接下来，我们研究了miR216a对转移的影响。结果表明，相对于对照组，mir216a组小鼠的肺部转移灶更少。此外，miR216a组小鼠肺的活体成像实验也显示出类似的结果(图5中d)。相反，miR216a和CDK14共表达组小鼠则显示较多转移灶(图5中d)。肺的解剖学和组织学分析也同样得以证实(图5中e)。此外，Kaplan Meier生存分析也表明，miR216a组小鼠比对照组有更好的生存概率(P＝0.002)。综上，这些数据都表明miR216a可作为抑制肿瘤扩散的作用。

七、miR216a和CDK14的表达以及在骨肉瘤样本中的相关性

为评估miR216a的临床意义，我们用实时荧光定量PCR在91例患者骨肉瘤和癌旁组织中进行了miR216a表达水平检测。实时荧光定量PCR结果显示，骨肉瘤患者miR216a的表达明显降低(P＝3.2×10-4)(图6中a)。为进一步探讨CDK14的临床意义，我们对miR216a与临床病理特征的关系进行了分析。结果表明：miR216a表达水平与肿瘤大小、组织学分级密切相关。此外，Kaplan Meier生存分析表明，体内miR216a高表达的患者具有更好的整体存活率(P＝0.020)和无病生存期(P＝0.017)；从而表明miR216a可用于更好的临床效果预测(图6中b和c)。此外，骨肉瘤样本中miR216a表达与CDK14蛋白表达呈负相关(P＝2.5×10-8，r＝-0.745)(图6中d)。综上，这些研究结果表明miR216a和CDK14对指导骨肉瘤预后的重要作用。

<110> 中国人民解放军总医院

<120> miR216a用于抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和迁移

<130> GNCLN171468

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

uaaucucagc uggcaacugu ga 22

<210> 2

<211> 110

<212> RNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

gauggcugug aguuggcuua aucucagcug gcaacuguga gauguucaua caaucccuca 60

caguggucuc ugggauuaug cuaaacagag caauuuccua gcccucacga 110

<210> 3

<211> 5555

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gcttggtacc 900

gagctcggat ccactagtaa cggccgccag tgtgctggaa ttctgcagat atccatcaca 960

ctggcggccg ctcgagcatg catctagagg gccctattct atagtgtcac ctaaatgcta 1020

gagctcgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct 1080

cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg 1140

aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt ggggtggggc 1200

aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct 1260

ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc cacgcgccct 1320

gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 1380

ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 1440

gctttccccg tcaagctcta aatcggggca tccctttagg gttccgattt agtgctttac 1500

ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 1560

gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 1620

tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt 1680

tggggatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt 1740

aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc caggcaggca 1800

gaagtatgca aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct 1860

ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc 1920

ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg 1980

gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctctgcctct gagctattcc 2040

agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctc ccgggagctt 2100

gtatatccat tttcggatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac 2160

aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact 2220

gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc 2280

gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg 2340

cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg 2400

tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt 2460

catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc 2520

atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag 2580

cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg 2640

ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgaggatc 2700

tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt 2760

ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg 2820

ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt 2880

acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct 2940

tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg 3000

agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga 3060

cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccccaa 3120

cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa 3180

taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta 3240

tcatgtctgt ataccgtcga cctctagcta gagcttggcg taatcatggt catagctgtt 3300

tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 3360

gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 3420

gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 3480

ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 3540

ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 3600

cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 3660

gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 3720

tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 3780

ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 3840

atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcaatgct cacgctgtag 3900

gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 3960

tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 4020

cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 4080

cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa ggacagtatt 4140

tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc 4200

cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 4260

cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg 4320

gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta 4380

gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg 4440

gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg 4500

ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 4560

atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc 4620

agcaataaac cagccagccg gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc 4680

ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag 4740

tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat 4800

ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 4860

caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt 4920

gttatcactc atggttatgg cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 4980

atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 5040

accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 5100

aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 5160

gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 5220

tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 5280

aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 5340

ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 5400

aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gacgtcgatg gctgtgagtt 5460

ggcttatctc agctggcaac tgtgagatgt tcatacaatc cctcacagtg gtctctggga 5520

ttatgctaaa cagagcaatt tcctagccct cacga 5555

<210> 4

<211> 469

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

Met Cys Asp Leu Ile Glu Pro Gln Pro Ala Glu Lys Ile Gly Lys Met

1 5 10 15

Lys Lys Leu Arg Arg Thr Leu Ser Glu Ser Phe Ser Arg Ile Ala Leu

20 25 30

Lys Lys Asp Asp Thr Thr Phe Asp Glu Ile Cys Val Thr Lys Met Ser

35 40 45

Thr Arg Asn Cys Gln Gly Met Asp Ser Val Ile Lys Pro Leu Asp Thr

50 55 60

Ile Pro Glu Asp Lys Lys Val Arg Val Gln Arg Thr Gln Ser Thr Phe

65 70 75 80

Asp Pro Phe Glu Lys Pro Ala Asn Gln Val Lys Arg Val His Ser Glu

85 90 95

Asn Asn Ala Cys Ile Asn Phe Lys Thr Ser Ser Thr Gly Lys Glu Ser

100 105 110

Pro Lys Val Arg Arg His Ser Ser Pro Ser Ser Pro Thr Ser Pro Lys

115 120 125

Phe Gly Lys Ala Asp Ser Tyr Glu Lys Leu Glu Lys Leu Gly Glu Gly

130 135 140

Ser Tyr Ala Thr Val Tyr Lys Gly Lys Ser Lys Val Asn Gly Lys Leu

145 150 155 160

Val Ala Leu Lys Val Ile Arg Leu Gln Glu Glu Glu Gly Thr Pro Phe

165 170 175

Thr Ala Ile Arg Glu Ala Ser Leu Leu Lys Gly Leu Lys His Ala Asn

180 185 190

Ile Val Leu Leu His Asp Ile Ile His Thr Lys Glu Thr Leu Thr Leu

195 200 205

Val Phe Glu Tyr Val His Thr Asp Leu Cys Gln Tyr Met Asp Lys His

210 215 220

Pro Gly Gly Leu His Pro Asp Asn Val Lys Leu Phe Leu Phe Gln Leu

225 230 235 240

Leu Arg Gly Leu Ser Tyr Ile His Gln Arg Tyr Ile Leu His Arg Asp

245 250 255

Leu Lys Pro Gln Asn Leu Leu Ile Ser Asp Thr Gly Glu Leu Lys Leu

260 265 270

Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Ala Lys Ser Val Pro Ser His Thr Tyr

275 280 285

Ser Asn Glu Val Val Thr Leu Trp Tyr Arg Pro Pro Asp Val Leu Leu

290 295 300

Gly Ser Thr Glu Tyr Ser Thr Cys Leu Asp Met Trp Gly Val Gly Cys

305 310 315 320

Ile Phe Val Glu Met Ile Gln Gly Val Ala Ala Phe Pro Gly Met Lys

325 330 335

Asp Ile Gln Asp Gln Leu Glu Arg Ile Phe Leu Val Leu Gly Thr Pro

340 345 350

Asn Glu Asp Thr Trp Pro Gly Val His Ser Leu Pro His Phe Lys Pro

355 360 365

Glu Arg Phe Thr Leu Tyr Ser Ser Lys Asn Leu Arg Gln Ala Trp Asn

370 375 380

Lys Leu Ser Tyr Val Asn His Ala Glu Asp Leu Ala Ser Lys Leu Leu

385 390 395 400

Gln Cys Ser Pro Lys Asn Arg Leu Ser Ala Gln Ala Ala Leu Ser His

405 410 415

Glu Tyr Phe Ser Asp Leu Pro Pro Arg Leu Trp Glu Leu Thr Asp Met

420 425 430

Ser Ser Ile Phe Thr Val Pro Asn Val Arg Leu Gln Pro Glu Ala Gly

435 440 445

Glu Ser Met Arg Ala Phe Gly Lys Asn Asn Ser Tyr Gly Lys Ser Leu

450 455 460

Ser Asn Ser Lys His

465

<210> 5

<211> 1613

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

Met Gly Ala Val Leu Arg Ser Leu Leu Ala Cys Ser Phe Cys Val Leu

1 5 10 15

Leu Arg Ala Ala Pro Leu Leu Leu Tyr Ala Asn Arg Arg Asp Leu Arg

20 25 30

Leu Val Asp Ala Thr Asn Gly Lys Glu Asn Ala Thr Ile Val Val Gly

35 40 45

Gly Leu Glu Asp Ala Ala Ala Val Asp Phe Val Phe Ser His Gly Leu

50 55 60

Ile Tyr Trp Ser Asp Val Ser Glu Glu Ala Ile Lys Arg Thr Glu Phe

65 70 75 80

Asn Lys Thr Glu Ser Val Gln Asn Val Val Val Ser Gly Leu Leu Ser

85 90 95

Pro Asp Gly Leu Ala Cys Asp Trp Leu Gly Glu Lys Leu Tyr Trp Thr

100 105 110

Asp Ser Glu Thr Asn Arg Ile Glu Val Ser Asn Leu Asp Gly Ser Leu

115 120 125

Arg Lys Val Leu Phe Trp Gln Glu Leu Asp Gln Pro Arg Ala Ile Ala

130 135 140

Leu Asp Pro Ser Ser Gly Phe Met Tyr Trp Thr Asp Trp Gly Glu Val

145 150 155 160

Pro Lys Ile Glu Arg Ala Gly Met Asp Gly Ser Ser Arg Phe Ile Ile

165 170 175

Ile Asn Ser Glu Ile Tyr Trp Pro Asn Gly Leu Thr Leu Asp Tyr Glu

180 185 190

Glu Gln Lys Leu Tyr Trp Ala Asp Ala Lys Leu Asn Phe Ile His Lys

195 200 205

Ser Asn Leu Asp Gly Thr Asn Arg Gln Ala Val Val Lys Gly Ser Leu

210 215 220

Pro His Pro Phe Ala Leu Thr Leu Phe Glu Asp Ile Leu Tyr Trp Thr

225 230 235 240

Asp Trp Ser Thr His Ser Ile Leu Ala Cys Asn Lys Tyr Thr Gly Glu

245 250 255

Gly Leu Arg Glu Ile His Ser Asp Ile Phe Ser Pro Met Asp Ile His

260 265 270

Ala Phe Ser Gln Gln Arg Gln Pro Asn Ala Thr Asn Pro Cys Gly Ile

275 280 285

Asp Asn Gly Gly Cys Ser His Leu Cys Leu Met Ser Pro Val Lys Pro

290 295 300

Phe Tyr Gln Cys Ala Cys Pro Thr Gly Val Lys Leu Leu Glu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Thr Cys Lys Asp Gly Ala Thr Glu Leu Leu Leu Leu Ala Arg Arg

325 330 335

Thr Asp Leu Arg Arg Ile Ser Leu Asp Thr Pro Asp Phe Thr Asp Ile

340 345 350

Val Leu Gln Leu Glu Asp Ile Arg His Ala Ile Ala Ile Asp Tyr Asp

355 360 365

Pro Val Glu Gly Tyr Ile Tyr Trp Thr Asp Asp Glu Val Arg Ala Ile

370 375 380

Arg Arg Ser Phe Ile Asp Gly Ser Gly Ser Gln Phe Val Val Thr Ala

385 390 395 400

Gln Ile Ala His Pro Asp Gly Ile Ala Val Asp Trp Val Ala Arg Asn

405 410 415

Leu Tyr Trp Thr Asp Thr Gly Thr Asp Arg Ile Glu Val Thr Arg Leu

420 425 430

Asn Gly Thr Met Arg Lys Ile Leu Ile Ser Glu Asp Leu Glu Glu Pro

435 440 445

Arg Ala Ile Val Leu Asp Pro Met Val Gly Tyr Met Tyr Trp Thr Asp

450 455 460

Trp Gly Glu Ile Pro Lys Ile Glu Arg Ala Ala Leu Asp Gly Ser Asp

465 470 475 480

Arg Val Val Leu Val Asn Thr Ser Leu Gly Trp Pro Asn Gly Leu Ala

485 490 495

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Lys Ile Glu Val Met Asn Thr Asp Gly Thr Gly Arg Arg Val Leu Val

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Arg Ser Ala Glu Arg Glu Val Ile Ile Asp Gln Leu Pro Asp Leu Met

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Gly Leu Lys Ala Thr Asn Val His Arg Val Ile Gly Ser Asn Pro Cys

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Val Ile Thr Val Thr Asp Val Asn Asp Asn Pro Pro Glu Phe Thr Ala

370 375 380

Met Thr Phe Tyr Gly Glu Val Pro Glu Asn Arg Val Asp Ile Ile Val

385 390 395 400

Ala Asn Leu Thr Val Thr Asp Lys Asp Gln Pro His Thr Pro Ala Trp

405 410 415

Asn Ala Val Tyr Arg Ile Ser Gly Gly Asp Pro Thr Gly Arg Phe Ala

420 425 430

Ile Gln Thr Asp Pro Asn Ser Asn Asp Gly Leu Val Thr Val Val Lys

435 440 445

Pro Ile Asp Phe Glu Thr Asn Arg Met Phe Val Leu Thr Val Ala Ala

450 455 460

Glu Asn Gln Val Pro Leu Ala Lys Gly Ile Gln His Pro Pro Gln Ser

465 470 475 480

Thr Ala Thr Val Ser Val Thr Val Ile Asp Val Asn Glu Asn Pro Tyr

485 490 495

Phe Ala Pro Asn Pro Lys Ile Ile Arg Gln Glu Glu Gly Leu His Ala

500 505 510

Gly Thr Met Leu Thr Thr Phe Thr Ala Gln Asp Pro Asp Arg Tyr Met

515 520 525

Gln Gln Asn Ile Arg Tyr Thr Lys Leu Ser Asp Pro Ala Asn Trp Leu

530 535 540

Lys Ile Asp Pro Val Asn Gly Gln Ile Thr Thr Ile Ala Val Leu Asp

545 550 555 560

Arg Glu Ser Pro Asn Val Lys Asn Asn Ile Tyr Asn Ala Thr Phe Leu

565 570 575

Ala Ser Asp Asn Gly Ile Pro Pro Met Ser Gly Thr Gly Thr Leu Gln

580 585 590

Ile Tyr Leu Leu Asp Ile Asn Asp Asn Ala Pro Gln Val Leu Pro Gln

595 600 605

Glu Ala Glu Thr Cys Glu Thr Pro Asp Pro Asn Ser Ile Asn Ile Thr

610 615 620

Ala Leu Asp Tyr Asp Ile Asp Pro Asn Ala Gly Pro Phe Ala Phe Asp

625 630 635 640

Leu Pro Leu Ser Pro Val Thr Ile Lys Arg Asn Trp Thr Ile Thr Arg

645 650 655

Leu Asn Gly Asp Phe Ala Gln Leu Asn Leu Lys Ile Lys Phe Leu Glu

660 665 670

Ala Gly Ile Tyr Glu Val Pro Ile Ile Ile Thr Asp Ser Gly Asn Pro

675 680 685

Pro Lys Ser Asn Ile Ser Ile Leu Arg Val Lys Val Cys Gln Cys Asp

690 695 700

Ser Asn Gly Asp Cys Thr Asp Val Asp Arg Ile Val Gly Ala Gly Leu

705 710 715 720

Gly Thr Gly Ala Ile Ile Ala Ile Leu Leu Cys Ile Ile Ile Leu Leu

725 730 735

Ile Leu Val Leu Met Phe Val Val Trp Met Lys Arg Arg Asp Lys Glu

740 745 750

Arg Gln Ala Lys Gln Leu Leu Ile Asp Pro Glu Asp Asp Val Arg Asp

755 760 765

Asn Ile Leu Lys Tyr Asp Glu Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Gln Asp

770 775 780

Tyr Asp Leu Ser Gln Leu Gln Gln Pro Asp Thr Val Glu Pro Asp Ala

785 790 795 800

Ile Lys Pro Val Gly Ile Arg Arg Met Asp Glu Arg Pro Ile His Ala

805 810 815

Glu Pro Gln Tyr Pro Val Arg Ser Ala Ala Pro His Pro Gly Asp Ile

820 825 830

Gly Asp Phe Ile Asn Glu Gly Leu Lys Ala Ala Asp Asn Asp Pro Thr

835 840 845

Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu Leu Val Phe Asp Tyr Glu Gly Ser Gly

850 855 860

Ser Thr Ala Gly Ser Leu Ser Ser Leu Asn Ser Ser Ser Ser Gly Gly

865 870 875 880

Glu Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu Asn Asp Trp Gly Pro Arg Phe Lys Lys

885 890 895

Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly Gly Asp Asp

900 905

<210> 11

<211> 882

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

Met Gly Pro Trp Ser Arg Ser Leu Ser Ala Leu Leu Leu Leu Leu Gln

1 5 10 15

Val Ser Ser Trp Leu Cys Gln Glu Pro Glu Pro Cys His Pro Gly Phe

20 25 30

Asp Ala Glu Ser Tyr Thr Phe Thr Val Pro Arg Arg His Leu Glu Arg

35 40 45

Gly Arg Val Leu Gly Arg Val Asn Phe Glu Asp Cys Thr Gly Arg Gln

50 55 60

Arg Thr Ala Tyr Phe Ser Leu Asp Thr Arg Phe Lys Val Gly Thr Asp

65 70 75 80

Gly Val Ile Thr Val Lys Arg Pro Leu Arg Phe His Asn Pro Gln Ile

85 90 95

His Phe Leu Val Tyr Ala Trp Asp Ser Thr Tyr Arg Lys Phe Ser Thr

100 105 110

Lys Val Thr Leu Asn Thr Val Gly His His His Arg Pro Pro Pro His

115 120 125

Gln Ala Ser Val Ser Gly Ile Gln Ala Glu Leu Leu Thr Phe Pro Asn

130 135 140

Ser Ser Pro Gly Leu Arg Arg Gln Lys Arg Asp Trp Val Ile Pro Pro

145 150 155 160

Ile Ser Cys Pro Glu Asn Glu Lys Gly Pro Phe Pro Lys Asn Leu Val

165 170 175

Gln Ile Lys Ser Asn Lys Asp Lys Glu Gly Lys Val Phe Tyr Ser Ile

180 185 190

Thr Gly Gln Gly Ala Asp Thr Pro Pro Val Gly Val Phe Ile Ile Glu

195 200 205

Arg Glu Thr Gly Trp Leu Lys Val Thr Glu Pro Leu Asp Arg Glu Arg

210 215 220

Ile Ala Thr Tyr Thr Leu Phe Ser His Ala Val Ser Ser Asn Gly Asn

225 230 235 240

Ala Val Glu Asp Pro Met Glu Ile Leu Ile Thr Val Thr Asp Gln Asn

245 250 255

Asp Asn Lys Pro Glu Phe Thr Gln Glu Val Phe Lys Gly Ser Val Met

260 265 270

Glu Gly Ala Leu Pro Gly Thr Ser Val Met Glu Val Thr Ala Thr Asp

275 280 285

Ala Asp Asp Asp Val Asn Thr Tyr Asn Ala Ala Ile Ala Tyr Thr Ile

290 295 300

Leu Ser Gln Asp Pro Glu Leu Pro Asp Lys Asn Met Phe Thr Ile Asn

305 310 315 320

Arg Asn Thr Gly Val Ile Ser Val Val Thr Thr Gly Leu Asp Arg Glu

325 330 335

Ser Phe Pro Thr Tyr Thr Leu Val Val Gln Ala Ala Asp Leu Gln Gly

340 345 350

Glu Gly Leu Ser Thr Thr Ala Thr Ala Val Ile Thr Val Thr Asp Thr

355 360 365

Asn Asp Asn Pro Pro Ile Phe Asn Pro Thr Thr Tyr Lys Gly Gln Val

370 375 380

Pro Glu Asn Glu Ala Asn Val Val Ile Thr Thr Leu Lys Val Thr Asp

385 390 395 400

Ala Asp Ala Pro Asn Thr Pro Ala Trp Glu Ala Val Tyr Thr Ile Leu

405 410 415

Asn Asp Asp Gly Gly Gln Phe Val Val Thr Thr Asn Pro Val Asn Asn

420 425 430

Asp Gly Ile Leu Lys Thr Ala Lys Gly Leu Asp Phe Glu Ala Lys Gln

435 440 445

Gln Tyr Ile Leu His Val Ala Val Thr Asn Val Val Pro Phe Glu Val

450 455 460

Ser Leu Thr Thr Ser Thr Ala Thr Val Thr Val Asp Val Leu Asp Val

465 470 475 480

Asn Glu Ala Pro Ile Phe Val Pro Pro Glu Lys Arg Val Glu Val Ser

485 490 495

Glu Asp Phe Gly Val Gly Gln Glu Ile Thr Ser Tyr Thr Ala Gln Glu

500 505 510

Pro Asp Thr Phe Met Glu Gln Lys Ile Thr Tyr Arg Ile Trp Arg Asp

515 520 525

Thr Ala Asn Trp Leu Glu Ile Asn Pro Asp Thr Gly Ala Ile Ser Thr

530 535 540

Arg Ala Glu Leu Asp Arg Glu Asp Phe Glu His Val Lys Asn Ser Thr

545 550 555 560

Tyr Thr Ala Leu Ile Ile Ala Thr Asp Asn Gly Ser Pro Val Ala Thr

565 570 575

Gly Thr Gly Thr Leu Leu Leu Ile Leu Ser Asp Val Asn Asp Asn Ala

580 585 590

Pro Ile Pro Glu Pro Arg Thr Ile Phe Phe Cys Glu Arg Asn Pro Lys

595 600 605

Pro Gln Val Ile Asn Ile Ile Asp Ala Asp Leu Pro Pro Asn Thr Ser

610 615 620

Pro Phe Thr Ala Glu Leu Thr His Gly Ala Ser Ala Asn Trp Thr Ile

625 630 635 640

Gln Tyr Asn Asp Pro Thr Gln Glu Ser Ile Ile Leu Lys Pro Lys Met

645 650 655

Ala Leu Glu Val Gly Asp Tyr Lys Ile Asn Leu Lys Leu Met Asp Asn

660 665 670

Gln Asn Lys Asp Gln Val Thr Thr Leu Glu Val Ser Val Cys Asp Cys

675 680 685

Glu Gly Ala Ala Gly Val Cys Arg Lys Ala Gln Pro Val Glu Ala Gly

690 695 700

Leu Gln Ile Pro Ala Ile Leu Gly Ile Leu Gly Gly Ile Leu Ala Leu

705 710 715 720

Leu Ile Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Arg Arg Arg Ala Val

725 730 735

Val Lys Glu Pro Leu Leu Pro Pro Glu Asp Asp Thr Arg Asp Asn Val

740 745 750

Tyr Tyr Tyr Asp Glu Glu Gly Gly Gly Glu Glu Asp Gln Asp Phe Asp

755 760 765

Leu Ser Gln Leu His Arg Gly Leu Asp Ala Arg Pro Glu Val Thr Arg

770 775 780

Asn Asp Val Ala Pro Thr Leu Met Ser Val Pro Arg Tyr Leu Pro Arg

785 790 795 800

Pro Ala Asn Pro Asp Glu Ile Gly Asn Phe Ile Asp Glu Asn Leu Lys

805 810 815

Ala Ala Asp Thr Asp Pro Thr Ala Pro Pro Tyr Asp Ser Leu Leu Val

820 825 830

Phe Asp Tyr Glu Gly Ser Gly Ser Glu Ala Ala Ser Leu Ser Ser Leu

835 840 845

Asn Ser Ser Glu Ser Asp Lys Asp Gln Asp Tyr Asp Tyr Leu Asn Glu

850 855 860

Trp Gly Asn Arg Phe Lys Lys Leu Ala Asp Met Tyr Gly Gly Gly Glu

865 870 875 880

Asp Asp

<210> 12

<211> 1410

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

atgtgtgacc tcattgagcc gcagccggcc gagaagatcg gcaagatgaa gaagttgcgg 60

agaactttgt cggagagttt cagtcgcatt gctttgaaga aagatgacac cacctttgat 120

gagatatgtg tcacaaagat gtctacacgg aactgccagg gaatggactc agtgatcaaa 180

cccctggaca caattcctga ggataaaaaa gtcagagttc agaggacaca gagcactttt 240

gacccatttg agaaaccagc taatcaagta aagagggtgc attctgagaa caatgcttgc 300

attaacttta agacctcctc cactggcaaa gagtcaccta aagttaggcg gcactccagc 360

cccagctcgc caacaagtcc caaatttgga aaagctgact catatgaaaa gctggaaaaa 420

ctaggggaag gatcttatgc tacagtatac aaagggaaaa gcaaggtaaa tgggaagttg 480

gtagctctga aggtgatcag gctgcaggaa gaagaaggga cacctttcac agctatcagg 540

gaagcttctc ttttaaaagg actaaaacat gctaacatag tgctacttca tgacatcatc 600

cataccaagg agacgctgac acttgtgttt gaatatgtgc acactgattt atgtcagtac 660

atggacaagc accctggggg gctgcatcca gataatgtga agttgttttt atttcagttg 720

ctgcgaggtc tgtcttacat ccaccagcgt tatattttgc acagagacct gaaaccacag 780

aaccttctga tcagtgacac gggggagtta aagctggcag atttcggtct tgcaagagca 840

aaatccgtcc ctagccacac atactccaac gaagtggtta ccttgtggta cagacctcca 900

gatgtccttc taggctcaac agaatattcc acctgccttg acatgtgggg agtaggttgc 960

atctttgttg aaatgatcca aggagttgct gcttttccag gaatgaaaga cattcaggat 1020

caacttgaac gaatatttct ggttcttgga acaccaaatg aggacacatg gcctggagtt 1080

cattctttac cacattttaa gccagaacgc tttaccctgt acagctctaa aaaccttaga 1140

caagcatgga ataagctcag ctatgtgaac catgcagagg acctggcctc caagctccta 1200

caatgttccc caaagaacag actgtcggca caggctgcct tgagccacga gtattttagt 1260

gacctgccgc cacggctatg ggaactcacc gacatgtctt ctatttttac tgtcccaaat 1320

gtgagattgc aaccagaagc tggagaaagc atgcgggcct ttgggaaaaa caatagttat 1380

ggcaaaagtc tatcaaacag caagcactga 1410

<210> 13

<211> 3470

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

caagcagcac attctcaaga gcacacagga ttaagttgtc atcattctgg gaagaaaaaa 60

aaaacattaa tgaagaggcc aataatatga agggaatcat ggatcagttt tctttcgctc 120

cctgtggtgg atttcactta caagaaaatt gaagctggca agaccctgtt ttctctgcaa 180

tttatttaaa accttgcacg catttggata ccttgtgatt tccaagaact acgtgaagat 240

taagctttgc ttactgatac atggcatgta ttcttttcag tcttttgtgt ttgattttgt 300

ttgatttccc tctgcagcac agcgtctctg taaaggtttt tatgctttca ccagccatgt 360

cttaaataca ttaagacaac acatttggtg ttcacacttc ttcagtaatg tctgaacttg 420

aaagccacag agtggcataa aacaatgtgt gttttctttg agagcagtgc acattttgca 480

accactagga aggaaatttt ctgctaaagc aaacccctgt tctctgactt gacaacttgg 540

ccccggactg tggggcccca cctgttgctt accttttgag gtaattttgc aaatgtggtt 600

tttttacttg gaaataactg cacatttata tataggatat tggactctgc ttagcatttt 660

caagccacat agcatgactg ttttttgaat aggttggaat tgaaaaaaca attatcaaac 720

gttaagaaca aagacaggga taaattgctt acatttcaac ctctggagat tgaggtaact 780

ttttgtgtct gggtcttgtc aacatctaat ttttttccat ccattctgtt acactttgta 840

ttttctaact ggagaaaaga gtgaggaaca gaatgtttta aatctggtgc aaaagaacta 900

tatctgctgg atgagccttg aaagcagtct tggcctgtta gggcttacaa agtaaattac 960

aaagtgatcc agttcaaagt ttgcttagtt acaacaaagc acctttaaaa aaaatacatt 1020

ttaaaaaaac attccaagcc aattggaaga catcattggg ttcttacttt aagacatctc 1080

ctggaataac tgttcaaatg caggttttag aaacaatgca ggaatcttgc tttaaagatg 1140

aaaaagggaa tgggccagct tcccttactc aaggagttga gggaccttgg aggatgaagg 1200

cgagtatgtg acactggaga aaagtggacc aggcatgtct tttgctttga tctggaggga 1260

gggctgcctg atgcaggccg gctcccagtg gggcaggcct cgctgcagaa tgcccagtag 1320

tactgcggcc aaggggacag ttaggagact tcatctaaag catgaaacct agctcctcta 1380

cacacaaatt cctatggaaa tacctttgtg tacagtgtct tacattttcc tattagtcag 1440

aaagaaggag agaatgagtg agtgcttgaa atgtgtcata ctgttttagg atcaagacta 1500

ggaattagga gccaggttga caaggacttt ttctgagagt tgggtgaggg taaagctttt 1560

ctataatcaa gctcaataca ccaaggaaac tggatccaga attcctaaac tttaaaatgg 1620

tactgtctgc ggagtggagt atggatggtt atgtcaaagt catagttcat cctatccaga 1680

tgtagcattc atggtaaact tttaagtgct aagcaaggaa ttatttactg attggtttta 1740

aagagagcag aaaacaccca agtgtagaat gtctactgtt tgctacctag aaatcttttc 1800

cattcctctt tcatacattc caacccactg gaagtcttta gaggtatttt gatttaaagt 1860

atacttaaat taggatttct taaagaaaac atagggagaa aactttacat gcaattaaaa 1920

atggactttc ctgtgatttg tttttaatca ttcatttgga gaagaggcat gacctttgta 1980

tttcactaag tttaaagcaa gagcaactga tgattaaatg ttgcttttta ataaggtttt 2040

taacttgaaa atttgaaaat atttaatgtt gaaagacttc aattagggct attagagtta 2100

tatctccctg tcgtaggcag cttcttcgga gaagtgaaat ataacattac tcagtggacg 2160

gagaaatctg ttttgttaca gagacatgcc tctcagaagg tcaggaggtt ttgagtacct 2220

atccttgcca cccatacagg aaatccaaag tttggtgtct ctctctctct gtctctttct 2280

ttctctttct ccccccaaac ccctctcact ccctccctcc ctctctcctt cccctatttg 2340

caatcatatt ctccctctgc ttcttttctc ttctgccctc cttgtgggca gtcatgaaaa 2400

tcaattcaga ctgtgttgat tagcagattt attattctat tgagaaagca ctggaatgtt 2460

ttgtgagatt atttttatat gaaggaatag cctgaactca aacagatggt aagaatagta 2520

caaacacctt agcacatcac tgcacacaca gtattctgaa aggagatttg acacttaatt 2580

cccattttct taaaataaca gttttgttga cttaaaaata tgagatacat aggatgtgaa 2640

aaaaaatgtt tgcagtactc agcaaaaaat agggtacata aagcagggtg gctgtccatc 2700

cactgattct ggggtgagaa gcgatttcta cctcgcaaga gtgactagaa agtttctagg 2760

agcacctcca ggcttgcaaa gaaagtgagg cctcttggta tcctttcctc agtgtgtata 2820

tgacagccag tataatcaat accctaggtt atgcgtctat atgatactca tctgtgaata 2880

ttattggttt tgtaatcttt gttatataag aggatgttta ggctgtatat actggggtag 2940

attattgcct gccccttata cataggaata tgctgcataa ttgcgcataa cttccatctc 3000

ccttactggc ttgtaggcag aggaaactgt atatgttact gccttgtact tttctcatac 3060

accaaaaaca caccaaaaaa atcaataaaa taagcaatct tctattctca ttccttttcc 3120

cacagcagca tattttagag gcacatacaa aacctacatt ctctagttgg gagtggattt 3180

ttaaagtttt ccttttatct tttatttttt tttgtatgat gcactgagat gtgtactttc 3240

taacagggga ttggtaccta agaaatgtgg tagcattatt cagaaaacta ttatactttc 3300

aaatgacaca tagtaaggag aatggaataa tacatgttgc atatttgtta ccagttgtaa 3360

tttgtctgta ttatgaaaga tgtaatggtt tgtcagctgt cactgttgtt ttcttgtaac 3420

atgatatgga ataaagtata gcagaatctc cgtaaaaaaa aaaaaaaaaa 3470

<210> 14

<211> 3470

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

caagcagcac attctcaaga gcacacagga ttaagttgtc atcattctgg gaagaaaaaa 60

aaaacattaa tgaagaggcc aataatatga agggaatcat ggatcagttt tctttcgctc 120

cctgtggtgg atttcactta caagaaaatt gaagctggca agaccctgtt ttctctgcaa 180

tttatttaaa accttgcacg catttggata ccttgtgatt tccaagaact acgtgaagat 240

taagctttgc ttactgatac atggcatgta ttcttttcag tcttttgtgt ttgattttgt 300

ttgatttccc tctgcagcac agcgtctctg taaaggtttt tatgctttca ccagccatgt 360

cttaaataca ttaagacaac acatttggtg ttcacacttc ttcagtaatg tctgaacttg 420

aaagccacag agtggcataa aacaatgtgt gttttctttg agagcagtgc acattttgca 480

accactagga aggaaatttt ctgctaaagc aaacccctgt tctctgactt gacaacttgg 540

ccccggactg tggggcccca cctgttgctt accttttgag gtaattttgc aaatgtggtt 600

tttttacttg gaaataactg cacatttata tataggatat tggactctgc ttagcatttt 660

caagccacat agcatgactg ttttttgaat aggttggaat tgaaaaaaca attatcaaac 720

gttaagaaca aagacaggga taaattgctt acatttcaac ctctggagat tgaggtaact 780

ttttgtgtct gggtcttgtc aacatctaat ttttttccat ccattctgtt acactttgta 840

ttttctaact ggagaaaaga gtgaggaaca gaatgtttta aatctggtgc aaaagaacta 900

tatctgctgg atgagccttg aaagcagtct tggcctgtta gggcttacaa agtaaattac 960

aaagtgatcc agttcaaagt ttgcttagtt acaacaaagc acctttaaaa aaaatacatt 1020

ttaaaaaaac attccaagcc aattggaaga catcattggg ttcttacttt aagacatctc 1080

ctggaataac tgttcaaatg caggttttag aaacaatgca ggaatcttgc tttaaagatg 1140

aaaaagggaa tgggccagct tcccttactc aaggagttga gggaccttgg aggatgaagg 1200

cgagtatgtg acactggaga aaagtggacc aggcatgtct tttgctttga tctggaggga 1260

gggctgcctg atgcaggccg gctcccagtg gggcaggcct cgctgcagaa tgcccagtag 1320

tactgcggcc aaggggacag ttaggagact tcatctaaag catgaaacct agctcctcta 1380

cacacaaatt cctatggaaa tacctttgtg tacagtgtct tacattttcc tattagtcag 1440

aaagaaggag agaatgagtg agtgcttgaa atgtgtcata ctgttttagg atcaagacta 1500

ggaattagga gccaggttga caaggacttt ttctgagagt tgggtgaggg taaagctttt 1560

ctataatcaa gctcaataca ccaaggaaac tggatccaga attcctaaac tttaaaatgg 1620

tactgtctgc ggagtggagt atggatggtt atgtcaaagt catagttcat cctatccaga 1680

tgtagcattc atggtaaact tttaagtgct aagcaaggaa ttatttactg attggtttta 1740

aagagagcag aaaacaccca agtgtagaat gtctactgtt tgctacctag aaatcttttc 1800

cattcctctt tcatacattc caacccactg gaagtcttta gaggtatttt gatttaaagt 1860

atacttaaat taggatttct taaagaaaac atagggagaa aactttacat gcaattaaaa 1920

atggactttc ctgtgatttg tttttaatca ttcatttgga gaagaggcat gacctttgta 1980

tttcactaag tttaaagcaa gagcaactga tgattaaatg ttgcttttta ataaggtttt 2040

taacttgaaa atttgaaaat atttaatgtt gaaagacttc aattagggct attagagtta 2100

tatctccctg tcgtaggcag cttcttcgga gaagtgaaat ataacattac tcagtggacg 2160

gagaaatctg ttttgttaca gagacatgcc tctcagaagg tcaggaggtt ttgagtacct 2220

atccttgcca cccatacagg aaatccaaag tttggtgtct ctctctctct gtctctttct 2280

ttctctttct ccccccaaac ccctctcact ccctccctcc ctctctcctt cccctatttg 2340

caatcatatt ctccctctgc ttcttttctc ttctgccctc cttgtgggca gtcatgaaaa 2400

tcaattcaga ctgtgttgat tagcagattt attattctat tgagaaagca ctggaatgtt 2460

ttggtctcgg ctttttatat gaaggaatag cctgaactca aacagatggt aagaatagta 2520

caaacacctt agcacatcac tgcacacaca gtattctgaa aggagatttg acacttaatt 2580

cccattttct taaaataaca gttttgttga cttaaaaata tgagatacat aggatgtgaa 2640

aaaaaatgtt tgcagtactc agcaaaaaat agggtacata aagcagggtg gctgtccatc 2700

cactgattct ggggtgagaa gcgatttcta cctcgcaaga gtgactagaa agtttctagg 2760

agcacctcca ggcttgcaaa gaaagtgagg cctcttggta tcctttcctc agtgtgtata 2820

tgacagccag tataatcaat accctaggtt atgcgtctat atgatactca tctgtgaata 2880

ttattggttt tgtaatcttt gttatataag aggatgttta ggctgtatat actggggtag 2940

attattgcct gccccttata cataggaata tgctgcataa ttgcgcataa cttccatctc 3000

ccttactggc ttgtaggcag aggaaactgt atatgttact gccttgtact tttctcatac 3060

accaaaaaca caccaaaaaa atcaataaaa taagcaatct tctattctca ttccttttcc 3120

cacagcagca tattttagag gcacatacaa aacctacatt ctctagttgg gagtggattt 3180

ttaaagtttt ccttttatct tttatttttt tttgtatgat gcactgagat gtgtactttc 3240

taacagggga ttggtaccta agaaatgtgg tagcattatt cagaaaacta ttatactttc 3300

aaatgacaca tagtaaggag aatggaataa tacatgttgc atatttgtta ccagttgtaa 3360

tttgtctgta ttatgaaaga tgtaatggtt tgtcagctgt cactgttgtt ttcttgtaac 3420

atgatatgga ataaagtata gcagaatctc cgtaaaaaaa aaaaaaaaaa 3470

Claims (10)

1.如下(1)-(4)所示物质中的任一种在如下(a)-(e)至少一种中的应用：

(1)人源成熟miR216a；

(2)人源前体miR216a；

(3)编码(1)中所述人源成熟miR216a或(2)中所述人源前体miR216a的DNA分子；

(4)含有(3)中所述DNA分子的表达盒、重组载体或转基因细胞；

(a)制备用于抑制骨肉瘤细胞增殖的产品；

(b)制备用于抑制骨肉瘤细胞侵袭的产品；

(c)制备用于抑制骨肉瘤细胞迁移的产品；

(d)制备用于抑制骨肉瘤生长的产品；

(e)制备用于抑制骨肉瘤转移的产品。

2.如下(1)-(4)所示物质中的任一种在如下(f)-(g)至少一种中的应用：

(1)人源成熟miR216a；

(2)人源前体miR216a；

(3)编码(1)中所述人源成熟miR216a或(2)中所述人源前体miR216a的DNA分子；

(4)含有(3)中所述DNA分子的表达盒、重组载体或转基因细胞；

(f)制备用于抑制骨肉瘤细胞内CDK14蛋白表达的产品；

(g)制备用于抑制骨肉瘤细胞从G1期向S期过渡的产品。

3.如下(1)-(4)所示物质中的任一种在如下(h)-(n)至少一种中的应用：

(1)人源成熟miR216a；

(2)人源前体miR216a；

(3)编码(1)中所述人源成熟miR216a或(2)中所述人源前体miR216a的DNA分子；

(4)含有(3)中所述DNA分子的表达盒、重组载体或转基因细胞；

(h)制备用于抑制骨肉瘤细胞内LRP6蛋白磷酸化的产品；

(i)制备用于抑制骨肉瘤细胞内CCND1蛋白表达的产品；

(j)制备用于抑制骨肉瘤细胞内c-Myc蛋白表达的产品；

(k)制备用于抑制骨肉瘤细胞内PI3K蛋白磷酸化的产品；

(l)制备用于抑制骨肉瘤细胞内Akt蛋白磷酸化的产品；

(m)制备用于抑制N-cadherin蛋白的表达的产品；

(n)制备用于促进E-cadherin蛋白的表达的产品。

4.能够抑制如下(1)或(2)表达的物质在如下(a’)-(d’)至少一种中的应用：

(1)人源成熟miR216a；

(2)人源前体miR216a；

(a’)制备用于促进骨肉瘤细胞增殖的产品；

(b’)制备用于促进骨肉瘤细胞侵袭的产品；

(c’)制备用于促进骨肉瘤细胞迁移的产品；

(d’)制备用于促进骨肉瘤生长的产品；

(e’)制备用于促进骨肉瘤转移的产品。

5.能够抑制如下(1)或(2)表达的物质在如下(f’)-(g’)至少一种中的应用：

(1)人源成熟miR216a；

(2)人源前体miR216a；

(f’)制备用于促进骨肉瘤细胞内CDK14蛋白表达的产品；

(g’)制备用于促进骨肉瘤细胞从G1期向S期过渡的产品。

6.能够抑制如下(1)或(2)表达的物质在如下(h’)-(n’)至少一种中的应用：

(1)人源成熟miR216a；

(2)人源前体miR216a；

(h’)制备用于促进骨肉瘤细胞内LRP6蛋白磷酸化的产品；

(i’)制备用于促进骨肉瘤细胞内CCND1蛋白表达的产品；

(j’)制备用于促进骨肉瘤细胞内c-Myc蛋白表达的产品；

(k’)制备用于促进骨肉瘤细胞内PI3K蛋白磷酸化的产品；

(l’)制备用于促进骨肉瘤细胞内Akt蛋白磷酸化的产品；

(m’)制备用于促进N-cadherin蛋白的表达的产品；

(n’)制备用于抑制E-cadherin蛋白的表达的产品。

7.根据权利要求3-6中任一所述的应用，其特征在于：所述“能够抑制如下(1)或(2)表达的物质”为miR216a抑制剂。

8.根据权利要求1-7中任一所述的应用，其特征在于：

所述人源成熟miR216a为序列表中序列1所示的RNA分子；

所述人源前体miR216a为序列表中序列2所示的RNA分子；

编码所述人源成熟miR216a或所述人源前体miR216a的DNA分子为序列表中序列3所示的DNA分子。

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用，其特征在于：所述CDK14蛋白的氨基酸序列如序列表中序列4所示；所述LRP6蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示；所述CCND1蛋白的氨基酸序列如序列表中序列6所示；所述c-Myc蛋白的氨基酸序列如序列表中序列7所示；所述PI3K蛋白的氨基酸序列如序列表中序列8所示；所述Akt蛋白的氨基酸序列如序列表中序列9所示；所述N-cadherin蛋白的氨基酸序列如序列表中序列10所示；所述E-cadherin蛋白的氨基酸序列如序列表中序列11所示。

10.根据权利要求1-8中任一所述的应用，其特征在于：所述骨肉瘤细胞为骨肉瘤患者病灶处的细胞或者人骨肉瘤细胞系；

具体的，所述人骨肉瘤细胞系为143B细胞或者U2OS细胞。