CN106755092A - GLCCI1基因基于Cre‑LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒及构建方法 - Google Patents
GLCCI1基因基于Cre‑LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒及构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106755092A CN106755092A CN201611070834.5A CN201611070834A CN106755092A CN 106755092 A CN106755092 A CN 106755092A CN 201611070834 A CN201611070834 A CN 201611070834A CN 106755092 A CN106755092 A CN 106755092A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glcci1
- mouse
- cre
- gene
- genes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 title claims abstract description 26
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 238000010276 construction Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 101100282784 Homo sapiens GLCCI1 gene Proteins 0.000 title abstract description 9
- 101001058426 Homo sapiens Glucocorticoid-induced transcript 1 protein Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 36
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims abstract description 26
- 102100028689 Glucocorticoid-induced transcript 1 protein Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 22
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 16
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 14
- 238000011814 C57BL/6N mouse Methods 0.000 claims description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 11
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 claims description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 9
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 claims description 9
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 claims description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 claims description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 5
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000013011 mating Effects 0.000 claims description 3
- 208000033040 Somatoform disorder pregnancy Diseases 0.000 claims description 2
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000009399 inbreeding Methods 0.000 claims 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims 1
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 6
- 230000004853 protein function Effects 0.000 abstract description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 abstract 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 7
- 108091006044 chimera Proteins 0.000 description 6
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 5
- 101100282785 Mus musculus Glcci1 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 108700028497 mouse glucocorticoid-induced transcript 1 Proteins 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 206010029164 Nephrotic syndrome Diseases 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000001794 hormone therapy Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100027267 FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 101000914701 Homo sapiens FERM, ARHGEF and pleckstrin domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 102220470475 L-seryl-tRNA(Sec) kinase_C57L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0276—Knock-out vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
- A01K2217/077—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out heterozygous knock out animals displaying phenotype
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
- C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种GLCCI1基因基于Cre‑LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒、打靶载体及构建方法。具体地，通过利用Cre/loxP原理，在GLCCI1的一段目标序列两端各放置一个loxP序列，得到flox小鼠，将flox小鼠与全身性敲除Cre品系的小鼠交配繁殖，获得全身性敲除GLCCI1基因的小鼠品系，获得的GLCCI1基因敲除小鼠将可应用于GLCCI1基因及蛋白质功能研究。
Description
技术领域
本发明属于生物和医学实验模型的制备技术和细胞构建领域。涉及GLCCI1基因基于Cre-LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒、打靶载体及构建方法。
背景技术
GLCCI1基因，即糖皮质激素诱导的转录基因1，位于第7号染色体短臂的第2区1号带的第3亚带(7p21.3)，包含8个外显子，在全身多种组织器官中均有表达。GLCCI1最早由Chapman等描述，他们发现对胸腺来源的细胞系进行地塞米松刺激后，在激素敏感型和激素不敏感型的细胞中某些基因序列标签表达存在明显差异。文献报道GLCCI1与多种疾病的发生及激素治疗疗效有关，包括支气管哮喘、肾病综合征等。然而，GLCCI1基因的功能目前尚不明确，构建一种GLCCI1基因敲除小鼠模型，将有利于深入开展GLCCI1的功能及其在相关疾病中的发病机制研究，为这些疾病的治疗提供可能的作用靶点。
基因敲除动物模型是活体动物上开展基因功能研究、寻找作用靶标的重要工具。小鼠是研究人类疾病的一种重要模式生物。通过利用Cre-loxP重组系统，可以将基因元件引入打靶载体上，实现条件性基因敲除，从而构建条件性基因敲除小鼠模型，为研究者提供基因功能研究的良好平台。
发明内容
本发明旨在克服现有技术的不足，提供GLCCI1基因基于Cre-LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒、打靶载体及构建方法。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：
所述GLCCI1基因基于Cre-LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒中包括如下引物对：
5’端筛选引物对：
5’-CAGTTCCTGCATTAGCCACCAC-3’(SEQ ID NO.1)，5’-CTAGTTGGCTGGACGTAAACT-3’
(SEQ ID NO.2)；
3’端筛选引物对：
5’-ACAGGACCTTACCTCACAGG-3’(SEQ ID NO.3)，5’-CTAGAACTAGTGGATCCCCTCGA-3’(SEQ ID NO.4)。
优选地，所述试剂盒中还包括如下引物：
5’-CTGCTTTGAGGTCTTCATCTGC-3’(SEQ ID NO.5)；
5’-CTTACAGTGCCTCCTCATTACC-3’(SEQ ID NO.6)；
5’-CTGCTTTGAGGTCTTCATCTGC-3’(SEQ ID NO.7)；
5’-GGCTGGACGTAAACTCCTC-3’(SEQ ID NO.8)；
5’-CTGGCAGTTTGTGAGGCATG-3’(SEQ ID NO.9)；
5’-AAGGGTTATTGAATATGATCGGA-3’(SEQ ID NO.10)；
5’-CCCTTGTTTTACATGCGGAGC-3’(SEQ ID NO.11)；
5’-GCTCACAGTCAGCTAATGGATGG-3’(SEQ ID NO.12)。
所述GLCCI1基因基于Cre-LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建的打靶载体的序列如SEQ ID NO.13所示，所述打靶载体命名为Glcci1-final vector。
所述GLCCI1基因基于Cre-LoxP条件性基因敲除小鼠模型的构建方法包括如下步骤：
(1)构建打靶载体Glcci1-final vector；
(2)ES细胞筛选及鉴定；
(3)制备嵌合小鼠；
(4)繁育F1代杂合子小鼠；
(5)获得GLCCI1-/-纯合子小鼠，即为GLCCI1基因基于Cre-LoxP条件性基因敲除小鼠模型。
优选地，所述步骤(1)是采用BAC载体构建打靶载体Glcci1-final vector，利用含有GLCCI1的BAC载体套取得到GLCCI1的同源重组臂，通过同源重组的方式将1st-loxp插入exon 2的上游，将2nd-loxp插入exon 2的下游，将构建好的打靶载体Glcci1-final vector用PCR及ApaLⅠ、BglⅡ、KpnⅠ、PstⅠ酶切鉴定，PCR鉴定的引物为：5’-CTGCTTTGAGGTCTTCATCTGC-3’(SEQ ID NO.5)，5’-CTTACAGTGCCTCCTCATTACC-3’(SEQ IDNO.6)；。
所述步骤(2)是将打靶载体Glcci1-final vector采用电冲击法转到ES细胞中进行打靶，使其发生同源重组，通过PCR及Southern blot筛选出中靶克隆；其中，用于5’端筛选的PCR反应引物对为：5’-CAGTTCCTGCATTAGCCACCAC-3’(SEQ ID NO.1)，5’-CTAGTTGGCTGGACGTAAACT-3’(SEQ ID NO.2)；用于3’端筛选的PCR反应引物对为：5’-ACAGGACCTTACCTCACAGG-3’(SEQ ID NO.3)，5’-CTAGAACTAGTGGATCCCCTCGA-3’(SEQ IDNO.4)；优选地，5’端筛选的PCR反应条件为95℃10秒、68℃6分钟，共40个循环；3’端筛选的PCR反应条件为95℃30秒、58℃30秒，72℃40秒，共35个循环。
在步骤(3)中，注射用囊胚采用C57BL/6N近交系小鼠，通过超数排卵，自然受孕，胚胎体内发育至囊胚阶段，用于注射；注射后移植入假孕小鼠受体子宫，假孕受体为C57BL/6N与CBA的杂交一代，生育出嵌合率大于50％的嵌合雄鼠。
所述步骤(4)是将获得的嵌合率高的嵌合雄鼠与野生型C57BL/6N背景雌鼠回交，得到F1代杂合子；经提取尾基因组DNA进行PCR反应鉴定基因型，根据电泳结果判断野生型、杂合子或纯合子。步骤(4)中，用于F1代杂合子小鼠基因型鉴定的PCR反应的引物分别为：①检测1st loxP：GLCCI1-FRT-tF：5’-CTGCTTTGAGGTCTTCATCTGC-3’(SEQ ID NO.7)；Neo-5R：5’-GGCTGGACGTAAACTCCTC-3’(SEQ ID NO.8)。②检测2nd loxP：GLCCI1-loxptF3：5’-CTGGCAGTTTGTGAGGCATG-3’(SEQ ID NO.9)；ZMK-1R3：5’-AAGGGTTATTGAATATGATCGGA-3’(SEQ ID NO.10)。③检测内参：GLCCI1-loxp-tF：5’-CCCTTGTTTTACATGCGGAGC-3’(SEQ IDNO.11)；GLCCI1-loxp-tR：5’-GCTCACAGTCAGCTAATGGATGG-3’(SEQ ID NO.12)。反应条件为：95℃30秒；58℃30秒；72℃30秒；35个循环。
所述步骤(5)是将获得的F1代杂合子小鼠与先后与Flper小鼠及野生型C57BL/6N小鼠交配，获得完全删去Neo抗性基因的小鼠，再将完全删去Neo抗性基因的小鼠与全身性敲除cre品系交配获得全身性敲除GLCCI1的纯合子小鼠，即为GLCCI1基因基于Cre-LoxP条件性基因敲除小鼠模型。
本发明的有益效果在于，通过建立和应用GLCCI1基因敲除在整体水平、细胞水平及分子水平深入探讨GLCCI1在支气管哮喘、肾病综合征等机体疾病发生、发展中的作用和机制，并探讨GLCCI1与疾病的激素治疗疗效的关联。
传统基因打靶小鼠的建系多使用小质粒和DNA杂交等方法构建和鉴定。本实验使用BAC载体和PCR加测序鉴定获得同样结果。用同源重组方法敲除ES干细胞的靶基因，经过嵌合体、杂交生育繁殖工程和筛选鉴定，获得GLCCI1基因敲除纯合子小鼠。目前关于GLCCI1在各种疾病中的作用的研究相继出现，但均无法深入探讨GLCCI1在疾病中的确切作用，GLCCI1基因敲除小鼠的出现，将使GLCCI1的研究获得实质性进展并有利于相关疾病的发病机制及治疗方案研究。
总之，通过利用Cre/loxP原理，在GLCCI1的一段目标序列两端各放置一个loxP序列，得到flox小鼠，将flox小鼠与全身性敲除Cre品系的小鼠交配繁殖，获得全身性敲除GLCCI1基因的小鼠品系，获得的GLCCI1基因敲除小鼠将可应用于GLCCI1基因及蛋白质功能研究。
附图说明
图1是本发明实施例1的小鼠GLCCI1条件性基因敲除示意图；
图2是本发明实施例1的小鼠GLCCI1基因打靶载体结构示意图；
图3是本发明实施例1的小鼠GLCCI1基因打靶载体限制性内切酶鉴定电泳图谱；
图4是本发明实施例1的小鼠ES细胞基因打靶后PCR鉴定的琼脂糖电泳结果示意图；
图5是本发明实施例1的小鼠ES细胞基因打靶后Southernblot鉴定后的琼脂糖电泳结果示意图；
图6是本发明实施例1获得的F1代小鼠基因型PCR鉴定的琼脂糖电泳结果示意图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进行示例，其中所用试剂均可通过市场渠道购买，其它可以参考本领域相应的PCR和基因测序的实验手册。
实施例1
1.GLCCI1条件性基因敲除小鼠的制备
1.1打靶载体构建
设计和构思基因组中对GLCCI1的打靶原理。GLCCI1打靶载体使用含GLCCI1基因的BAC载体。利用含有GLCCI1的BAC载体套取得到GLCCI1的同源重组臂，通过同源重组的方式将1st-loxp插入exon 2的上游，将2nd-loxp插入exon 2的下游，通过PCR测序及酶切的方式获得目的打靶载体。构建好的载体用PCR及ApaLⅠ、BglⅡ、KpnⅠ、PstⅠ酶切鉴定，产物电泳后照相鉴定条带。打靶载体PCR鉴定的引物为GLCCI1-FRT-tF:CTGCTTTGAGGTCTTCATCTGC；GLCCI1-FRT-tR:CTTACAGTGCCTCCTCATTACC。
1.2ES细胞筛选及鉴定
将构建好的打靶载体进行线性化，线性化的打靶载体质粒采用电穿孔的方法注射入C57BL/6N小鼠胚胎干细胞中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将打靶载体中的DNA序列整合到内源基因组中从而得以表达。打靶后通过正负筛选、PCR反应及Southern blot鉴定得到阳性克隆。用于5’端筛选的PCR反应引物为：GLCCI1-CKO-ES1F1:CAGTTCCTGCATTAGCCACCAC；GLCCI1-CKO-ES1R1:CTAGCTTGGCTGGACGTAAACT；产物长度为6040bp者为阳性克隆。用于3’端筛选的PCR反应引物为：GLCCI1-LoxP-tF3:acaggaccttacctcacagg；ES-1R4:CTAGAACTAGTGGATCCCCTCGA；产物长度为393bp者为阳性克隆。5’端筛选的PCR反应条件为95℃10秒、68℃6分钟，共40个循环；3’端筛选的PCR反应条件为95℃30秒、58℃30秒，72℃40秒，共35个循环。
用于Southern blot的限制性内切酶分别为：5’端为SacI，目标片段长度为7.6kb；3’端为PstI+SphI，目标片段长度为11.6kb；neo端为ApaI，目标片段长度为14.4kb。1.3嵌合小鼠制备
将筛选所获得的正确同源重组的ES细胞通过囊胚注射获得嵌合体子代。注射用囊胚采用C57BL/6N近交系小鼠，通过超数排卵，自然受孕，胚胎体内发育至囊胚阶段，用于注射。注射后一如假孕小鼠受体子宫，生育出嵌合率大于50％的嵌合鼠。经显微注射注入假孕鼠子宫中，得到嵌合鼠。嵌合鼠的嵌合率不低于50％。
1.4F1代杂合子小鼠繁育
将获得的嵌合率高的嵌合鼠与C57BL/6N背景鼠回交，得到F1代杂合子。获得的F1代杂合子小鼠经提取尾基因组DNA进行PCR，用PCR反应鉴定基因型。用于F1代杂合子小鼠基因型鉴定的PCR反应条件为：95℃30秒；58℃30秒；72℃30秒；35个循环。用于PCR反应的引物分别为：①检测1st loxP：GLCCI1-FRT-tF：CTGCTTTGAGGTCTTCATCTGC；Neo-5R：ggctggacgtaaactcctc。②检测2nd loxP：GLCCI1-loxptF3：ctggcagtttgtgaggcatg；ZMK-1R3：AAGGGTTATTGAATATGATCGGA。③检测内参：GLCCI1-loxp-tF：CCCTTGTTTTACATGCGGAGC；GLCCI1-loxp-tR：GCTCACAGTCAGCTAATGGATGG。
1.5获得GLCCI1-/-纯合子小鼠。
将获得的F1代杂合子小鼠与Flper小鼠配繁一代，去除Neo抗性基因，以排除Neo基因对小鼠表型分析的干扰。与Flper小鼠配繁后再和野生型C57BL/6N小鼠回交一代，获得完全删去Neo抗性基因的小鼠。再将其与全身性敲除cre品系交配获得全身性敲除GLCCI1的纯合子小鼠。
2.结果
2.1图1、图2为GLCC1条件性基因敲除载体构建示意图。如图1所示，分别是小鼠GLCCI1基因野生型、打靶突变型基因座位、打靶双臂位置示意图。2号外显子两侧为同源重组臂，在两侧的同源重组臂之间，将1st loxP插入2号外显子上游，将2nd loxP插入2号外显子的下游，通过PCR测序及酶切的方式获得目的打靶载体，其中neo为正筛选标记，HSV-TK为负筛选标记。构建好的质粒用ApalⅠ、BglⅡ、KpnⅠ、PstⅠ限制性内切酶反应后电泳鉴定。如图3所示，T14与DL20为marker,1、2泳道代表ApalⅠ内切酶反应，可切出9836bp，6578bp，1246bp三个条带；3、4泳道代表BglⅡ内切酶反应，可切出10147bp,5687bp,1200bp,876bp四个条带；5、6泳道代表KpnⅠ内切酶反应，可切出10182bp,4888bp,2193bp,695bp四个条带；7、8泳道代表PstⅠ内切酶反应，可切出9984bp,4279bp,2069bp,840bp,525bp五个条带。图1-图3结果提示检测片段正确。基因打靶后，做ES克隆鉴定。PCR反应鉴定34个ES克隆发生双臂同源重组。34个ES克隆PCR电泳图如图4A、4B和4C所示。PCR产物经Southern blot鉴定进一步证实，最终获得5个阳性ES克隆。电泳图如图5A、5B和5C所示。如图5A所示，5’端阳性条带7.6kb见于5A、6B、7C、8D、11G泳道；如图5B所示，3’端阳性条带11.6kb亦见于5A、6B、7C、8D、11G泳道。
2.2通过囊胚注射，获得24只嵌合率>50％的嵌合鼠，出生的嵌合鼠与背景鼠回交后生出的子代经PCR基因型鉴定，有4只为杂合子小鼠，为2雌2雄(F1代)。PCR基因型鉴定结果如图6所示，其中70、73、77、81为杂合子。
2.3获得的F1代杂合子小鼠先后与Flper小鼠及野生型C57L/B6N小鼠配繁，获得完全删去Neo抗性基因的小鼠。随后再与全身性敲除的cre品系(CMV-Cre)交配后获得全身性敲除GLCCI1基因的纯合子小鼠。
SEQUENCE LISTING
<110> 中南大学湘雅医院
<120> GLCCI1基因基于Cre-LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒、打靶载体及
构建方法
<160> 13
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
cagttcctgc attagccacc ac 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ctagttggct ggacgtaaac t 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
acaggacctt acctcacagg 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
ctagaactag tggatcccct cga 23
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
ctgctttgag gtcttcatct gc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
cttacagtgc ctcctcatta cc 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
ctgctttgag gtcttcatct gc 22
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
ggctggacgt aaactcctc 19
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
ctggcagttt gtgaggcatg 20
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 10
aagggttatt gaatatgatc gga 23
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 11
cccttgtttt acatgcggag c 21
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 12
gctcacagtc agctaatgga tgg 23
<210> 13
<211> 35916
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 13
ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccattcg tgcacccaac 60
ttgatcttca gcatctttta ctttcaccag cgtttctggg gagagttcct agaatggcga 120
caactctagg tcaagctaca ttgggtaagc acgtgggttg aactagaagt cgtagaaaat 180
gaaagtggtc gcaaagaccc tgagcaaaaa caggaaggca aaatgccgca aaaaagggaa 240
taagggcgac acggaaatgt tgaatactca tactcttcct ttttcaatat tattgaagca 300
actcgttttt gtccttccgt tttacggcgt tttttccctt attcccgctg tgcctttaca 360
acttatgagt atgagaagga aaaagttata ataacttcgt tttatcaggg ttattgtctc 420
atgagcggat acatatttga atgtatttag aaaaataaac aaataggggt tccgcgcaca 480
tttccccgaa aagtgccacc aaatagtccc aataacagag tactcgccta tgtataaact 540
tacataaatc tttttatttg tttatcccca aggcgcgtgt aaaggggctt ttcacggtgg 600
tgacgcgccc tgtagcggcg cattaagcgc ggcgggtgtg gtggttacgc gcagcgtgac 660
cgctacactt gccagcgccc tagcgcccgc tcctttcgct actgcgcggg acatcgccgc 720
gtaattcgcg ccgcccacac caccaatgcg cgtcgcactg gcgatgtgaa cggtcgcggg 780
atcgcgggcg aggaaagcga ttcttccctt cctttctcgc cacgttcgcc ggctttcccc 840
gtcaagctct aaatcggggg ctccctttag ggttccgatt tagtgcttta cggcacctcg 900
aagaagggaa ggaaagagcg gtgcaagcgg ccgaaagggg cagttcgaga tttagccccc 960
gagggaaatc ccaaggctaa atcacgaaat gccgtggagc accccaaaaa acttgattag 1020
ggtgatggtt cacgtagtgg gccatcgccc tgatagacgg tttttcgccc tttgacgttg 1080
gagtccacgt tctttaatag tggggttttt tgaactaatc ccactaccaa gtgcatcacc 1140
cggtagcggg actatctgcc aaaaagcggg aaactgcaac ctcaggtgca agaaattatc 1200
tggactcttg ttccaaactg gaacaacact caaccctatc tcggtctatt cttttgattt 1260
ataagggatt ttgccgattt cggcctattg gttaaaaaat acctgagaac aaggtttgac 1320
cttgttgtga gttgggatag agccagataa gaaaactaaa tattccctaa aacggctaaa 1380
gccggataac caatttttta gagctgattt aacaaaaatt taacgcgaat tttaacaaaa 1440
tattaacgct tacaatttcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 1500
ctcgactaaa ttgtttttaa attgcgctta aaattgtttt ataattgcga atgttaaagg 1560
taagcggtaa gtccgacgcg ttgacaaccc ttcccgctag ggtgcgggcc tcttcgctat 1620
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 1680
tttcccagtc acgacgttgt ccacgcccgg agaagcgata atgcggtcga ccgctttccc 1740
cctacacgac gttccgctaa ttcaacccat tgcggtccca aaagggtcag tgctgcaaca 1800
aaaacgacgg ccagtgaatt gtaatacgac tcactatagg gcgaattgga gctccaccgc 1860
ggtggcggcc gccatgctac tgttgcaccc atggggatat ttttgctgcc ggtcacttaa 1920
cattatgctg agtgatatcc cgcttaacct cgaggtggcg ccaccgccgg cggtacgatg 1980
acaacgtggg tacccctata cttgtcacac tggtcattgt ggttcacaaa gttgtcagtt 2040
gggtaaagct gttgctaact tcctctcagc aacctctatt agctccctct ggtgctgtga 2100
gaacagtgtg accagtaaca ccaagtgttt caacagtcaa cccatttcga caacgattga 2160
aggagagtcg ttggagataa tcgagggaga ccacgacact aagctggcag caaagaagcc 2220
tcttggtcag tacctacttg atttctccgt gtgctgtgaa caaaatatgt ggggtcttca 2280
acagtagttc ttagcatcaa ttcgaccgtc gtttcttcgg agaaccagtc atggatgaac 2340
taaagaggca cacgacactt gttttataca ccccagaagt tgtcatcaag aatcgtagtt 2400
attctgctgc tcagccaaga gaaggagcaa cagcctgtgt ctgtgtgtct gtctatcatc 2460
tgtctgtaac atacatacat cacacataca tacatacaca taagacgacg agtcggttct 2520
cttcctcgtt gtcggacaca gacacacaga cagatagtag acagacattg tatgtatgta 2580
gtgtgtatgt atgtatgtgt cacacataca tacatacata catacataca tacatgttat 2640
ttattttgtt gggctgtctc tagtttaact gtgaccaaca acatgatgtt ccgctgcctg 2700
gtgtgtatgt atgtatgtat gtatgtatgt atgtacaata aataaaacaa cccgacagag 2760
atcaaattga cactggttgt tgtactacaa ggcgacggac gcactagggt ttgaatttgg 2820
tacaataaag cttctgggag gaccattatc ccttgtgtag tataaactaa ttaaacttga 2880
tatgaataaa taatgtgttt cgtgatccca aacttaaacc atgttatttc gaagaccctc 2940
ctggtaatag ggaacacatc atatttgatt aatttgaact atacttattt attacacaaa 3000
ctatatgctt ttaaaacgtt ctaatgttaa ccaaatcttc attcagcttt tattttttta 3060
gtcttcataa gcattcgtgt gagcctttat ttaaaattga gatatacgaa aattttgcaa 3120
gattacaatt ggtttagaag taagtcgaaa ataaaaaaat cagaagtatt cgtaagcaca 3180
ctcggaaata aattttaact aattttgctg tatagccagt gcttaatttg gaaagtgact 3240
ttttgaagat ctgactggtt attgcaatta gttagctcta gaagcttagc ttgtctttgc 3300
ttaaaacgac atatcggtca cgaattaaac ctttcactga aaaacttcta gactgaccaa 3360
taacgttaat caatcgagat cttcgaatcg aacagaaacg aaatttcaga gaactgattg 3420
ctctttctgt agaaggatac tttttttttt ttaggtattt atttcattta catttccaat 3480
gctaccccaa aagttcccca tttaaagtct cttgactaac gagaaagaca tcttcctatg 3540
aaaaaaaaaa aatccataaa taaagtaaat gtaaaggtta cgatggggtt ttcaaggggt 3600
cacgctcccc cacccactcc cacttcttgg ccctggtgtt cccctgtact gaggcagata 3660
aagtttgcac aaccagtggg cctctctttc cactgatggc gtgcgagggg gtgggtgagg 3720
gtgaagaacc gggaccacaa ggggacatga ctccgtctat ttcaaacgtg ttggtcaccc 3780
ggagagaaag gtgactaccg cgactaggcc atcttctgat tcatatgcag ctagagacac 3840
cagctctggg gagtactggg tagttcatat tgttgttcca cctgtagggt tgcaaatccc 3900
gctgatccgg tagaagacta agtatacgtc gatctctgtg gtcgagaccc ctcatgaccc 3960
atcaagtata acaacaaggt ggacatccca acgtttaggg tttagctcct tggttacttt 4020
ctctagctcc tccattgggg gccctgtgat ccatccaata gctgactgag catccacttc 4080
tgtgtttgct aggccccggc aaatcgagga accaatgaaa gagatcgagg aggtaacccc 4140
cgggacacta ggtaggttat cgactgactc gtaggtgaag acacaaacga tccggggccg 4200
atagtctcac aagagacagc tatatctggg tcctttcagc caaatcttgc tagtgtatgc 4260
aatggagtca gcgtttggaa gctgattatg ggatggatcc tatcagagtg ttctctgtcg 4320
atatagaccc aggaaagtcg gtttagaacg atcacatacg ttacctcagt cgcaaacctt 4380
cgactaatac cctacctagg ctggatatgg cagtctctag atggtccatc ctttcgtcac 4440
agctccaaac tttgtctctc taactccttc catgggtgtt tttttcccaa ttctaagaag 4500
gacctatacc gtcagagatc taccaggtag gaaagcagtg tcgaggtttg aaacagagag 4560
attgaggaag gtacccacaa aaaaagggtt aagattcttc gggcaaagtg tccacacttt 4620
ggtcttcgtc cttcttgagt ttcatgcgtt tagcagattg tatcttatat cttgggtatt 4680
ctaagtttct gggctaatat cccgtttcac aggtgtgaaa ccagaagcag gaagaactca 4740
aagtacgcaa atcgtctaac atagaatata gaacccataa gattcaaaga cccgattata 4800
ccacttatca gtgagtacat attgtgtgag ttcttttgtg attgggttac ctcactcagg 4860
atgatgccct ccaggtccat ccatttgcct aggaatttca ggtgaatagt cactcatgta 4920
taacacactc aagaaaacac taacccaatg gagtgagtcc tactacggga ggtccaggta 4980
ggtaaacgga tccttaaagt taaattcatt ctttttaata gctgactagt actccattgt 5040
gtaaatgtac cacagtcaaa cttttggtgc ccttaagtgg agtaagtgtg tgtgtatgtg 5100
atttaagtaa gaaaaattat cgactgatca tgaggtaaca catttacatg gtgtcagttt 5160
gaaaaccacg ggaattcacc tcattcacac acacatacac tgtttgagca cctagatcat 5220
aaagattcag tcccagtttt ctagccattg gcttttgaac ttatgcagaa tttgagtgat 5280
ctggtaccac aaaaaattta acaaactcgt ggatctagta tttctaagtc agggtcaaaa 5340
gatcggtaac cgaaaacttg aatacgtctt aaactcacta gaccatggtg ttttttaaat 5400
tttgaaaaat ttagatttct tctaccaaac ttttctagac tgggttttgc tatgcatccc 5460
aggatagtgt tgactttagg atcctgctgc ctcaacatct aaacttttta aatctaaaga 5520
agatggtttg aaaagatctg acccaaaacg atacgtaggg tcctatcaca actgaaatcc 5580
taggacgacg gagttgtaga gaatgttaag attaacaggc aaattgtgct tgttgataaa 5640
taaagacata ttttgtgttt gggtatgtct gtataccaag gcatgctgtg aaggtctgag 5700
cttacaattc taattgtccg tttaacacga acaactattt atttctgtat aaaacacaaa 5760
cccatacaga catatggttc cgtacgacac ttccagactc gacaactcag tcatgacttt 5820
gcttttccat tttgtttgag aaaggtcact cctttgttgc atatgatttg ctagctgacc 5880
tgagagtttc tgaagatatt ctgttgagtc agtactgaaa cgaaaaggta aaacaaactc 5940
tttccagtga ggaaacaacg tatactaaac gatcgactgg actctcaaag acttctataa 6000
ccttcctctg cttccatttc cctgtaagat tatgttgctg ggatgacaga tggtgactat 6060
tggctggcat tattagttca ttatctgtaa taaaatgctg ggaaggagac gaaggtaaag 6120
ggacattcta atacaacgac cctactgtct accactgata accgaccgta ataatcaagt 6180
aatagacatt attttacgac atatgatttc tgcacacaaa ataattagaa gaaataatgt 6240
tagtgctaaa ttgcattaaa catgttactg aatacttttc cagttaggat actttacagt 6300
tatactaaag acgtgtgttt tattaatctt ctttattaca atcacgattt aacgtaattt 6360
gtacaatgac ttatgaaaag gtcaatccta tgaaatgtca tgcaataatg agcttcttga 6420
aataaggata aattagttga ttcctgttag tgctgttgtg acatctgtta tatggagatg 6480
tttatactat acttcaggga acgttattac tcgaagaact ttattcctat ttaatcaact 6540
aaggacaatc acgacaacac tgtagacaat atacctctac aaatatgata tgaagtccct 6600
atggtagctc tatttaaaga tttaaatata aatgatttaa gtgtatgctt gcttgtgtca 6660
ttgtaaatga gatgctttgc ctcatcttga cttgatgcag taccatcgag ataaatttct 6720
aaatttatat ttactaaatt cacatacgaa cgaacacagt aacatttact ctacgaaacg 6780
gagtagaact gaactacgtc tctaaacata gagaattgac aattgttatt tgcacataca 6840
gagtgagctg aatatagggt aaccagactg aagtgtgtta aagtccaata aagaatgggg 6900
agatttgtat ctcttaactg ttaacaataa acgtgtatgt ctcactcgac ttatatccca 6960
ttggtctgac ttcacacaat ttcaggttat ttcttacccc gtgcttttat tgtatgcttt 7020
acattgtgca taatggtcag aaatatcttg gtatagtttg cagggtctgg tgacttgcat 7080
taccctatag ctaaacttct cacgaaaata acatacgaaa tgtaacacgt attaccagtc 7140
tttatagaac catatcaaac gtcccagacc actgaacgta atgggatatc gatttgaaga 7200
cgaagtttct aacattttta attttttgtt tgtttgtttg gttagtcggt tggttggttg 7260
gttttggtag caatttcact ttgttaactt tccactggag gcttcaaaga ttgtaaaaat 7320
taaaaaacaa acaaacaaac caatcagcca accaaccaac caaaaccatc gttaaagtga 7380
aacaattgaa aggtgacctc attagtatct taagatatca gattttcaaa atgactagtc 7440
ttcagtaatt gcccctggaa aaagaccaca tacacaaatg ctgggaacta gttagacacc 7500
taatcataga attctatagt ctaaaagttt tactgatcag aagtcattaa cggggacctt 7560
tttctggtgt atgtgtttac gacccttgat caatctgtgg ctgtgaatta cgttagcagt 7620
tgggtttatt gtgctaaaat gcaaaactgg aattggtgat aaagatatac aaatcaataa 7680
aatttaaggg caaagatttt gacacttaat gcaatcgtca acccaaataa cacgatttta 7740
cgttttgacc ttaaccacta tttctatatg tttagttatt ttaaattccc gtttctaaaa 7800
aggcttagtt tttgggtgag tcaaaaccca aactcattga caattttaga taatatgcac 7860
agctttgttt gttgaaatag ttttactgtt tatgataaat tccgaatcaa aaacccactc 7920
agttttgggt ttgagtaact gttaaaatct attatacgtg tcgaaacaaa caactttatc 7980
aaaatgacaa atactattta cctctgataa atctaaggtt aactgtgttt ggtaaatgga 8040
gttattttgg ctaatcattt catggaagaa tactgtcatt gtcagttgag agagacactt 8100
ggagactatt tagattccaa ttgacacaaa ccatttacct caataaaacc gattagtaaa 8160
gtaccttctt atgacagtaa cagtcaactc tctctgtgaa taaatgaacc tgtgaccttt 8220
acatgcataa cacacacatg tatatacata tctgaacaca ttcatacata aacatatata 8280
caatatttct taagtctgta atttacttgg acactggaaa tgtacgtatt gtgtgtgtac 8340
atatatgtat agacttgtgt aagtatgtat ttgtatatat gttataaaga attcagacat 8400
tttatttacc ttaagattaa gaggtttttg tttgttttgt gtgtgtgtgt gatgagaggt 8460
actgaaacca gggtcatgta ctgatcaaat gatctccacc aaataaatgg aattctaatt 8520
ctccaaaaac aaacaaaaca cacacacaca ctactctcca tgactttggt cccagtacat 8580
gactagttta ctagaggtgg ctcagcttaa agagagtttt aaaagcatac agactacata 8640
taactttcaa atagtttaga atagattaag tagaggtatg tagtttttac taattatagc 8700
gagtcgaatt tctctcaaaa ttttcgtatg tctgatgtat attgaaagtt tatcaaatct 8760
tatctaattc atctccatac atcaaaaatg attaatatcg ttttgatttt ctgtgtcctt 8820
tttttattag caggcaactg ctataagtat tagctttgtc ataaaaggaa taattgtttt 8880
cattcttttt gatggaagaa aaaactaaaa gacacaggaa aaaaataatc gtccgttgac 8940
gatattcata atcgaaacag tattttcctt attaacaaaa gtaagaaaaa ctaccttctt 9000
gtataaagta actttttaaa accttgagaa actcataaca aatcaaaggg aaaaaattaa 9060
ttttgttttt cacagttcat aaaattagta aatattgctt catatttcat tgaaaaattt 9120
tggaactctt tgagtattgt ttagtttccc ttttttaatt aaaacaaaaa gtgtcaagta 9180
ttttaatcat ttataacgaa ttataaagtg ggaaaactat tggaaagagg cagtaaaaag 9240
ggaaacagga aaaaatagta aaacaaaagc aagtaggaag aattataagg taggaagaca 9300
aatatttcac ccttttgata acctttctcc gtcatttttc cctttgtcct tttttatcat 9360
tttgttttcg ttcatccttc ttaatattcc atccttctgt tatgctgcat gctgttgtaa 9420
ctagtgaaat tagtgggata agctcacttt ttacaataaa gtcaattaga taatacgtac 9480
aaagtatgca tattaaattt atacgacgta cgacaacatt gatcacttta atcaccctat 9540
tcgagtgaaa aatgttattt cagttaatct attatgcatg tttcatacgt ataatttaaa 9600
ggttggtaaa tcctgaaaaa ttaaagaata aacatacaag ataaattata tagaaagccg 9660
aggggatcat aatgttcagc ttgacattat ttaaaagtaa ccaaccattt aggacttttt 9720
aatttcttat ttgtatgttc tatttaatat atctttcggc tcccctagta ttacaagtcg 9780
aactgtaata aattttcatt aaagcagtaa atgaaacagt gcatataagg cataatgata 9840
atgctaggaa ttgtacatgt attaaattgt aaagaactaa aatataaaaa tataaatgaa 9900
tttcgtcatt tactttgtca cgtatattcc gtattactat tacgatcctt aacatgtaca 9960
taatttaaca tttcttgatt ttatattttt atatttactt ttttttcaca aagaaagttt 10020
ttagaactta atagtttaga catattagag tacatttcta ggtaaaagat aaagtggctg 10080
tactggctgg ttttgtgtgt aaaaaagtgt ttctttcaaa aatcttgaat tatcaaatct 10140
gtataatctc atgtaaagat ccattttcta tttcaccgac atgaccgacc aaaacacaca 10200
caacttgaca cagctggagt tatcacagag aaaggagcct cagttgggga aatgcctcca 10260
tgagatccag ctgtaaggca ttttctcaat tagtgatcaa gttgaactgt gtcgacctca 10320
atagtgtctc tttcctcgga gtcaacccct ttacggaggt actctaggtc gacattccgt 10380
aaaagagtta atcactagtt gggggaaagg ccccttgtag gtgggaccat ctcggggctg 10440
gtagtcttgg gttctataag agagcaggct gagcaagcca ggggaagcaa gccagtaaag 10500
ccccctttcc ggggaacatc caccctggta gagccccgac catcagaacc caagatattc 10560
tctcgtccga ctcgttcggt ccccttcgtt cggtcatttc aacatccctc catggcctct 10620
gcatcagttc ctgcttcctg acttgtttga gttccagtcc tgacttcctt ggtgatgaac 10680
agcagtatgg aaatgtaagc ttgtagggag gtaccggaga cgtagtcaag gacgaaggac 10740
tgaacaaact caaggtcagg actgaaggaa ccactacttg tcgtcatacc tttacattcg 10800
cgaataaacc ctttcctccc caacctgctt cttggtcatg atgtttgtgc aggaatagaa 10860
accctaagac aagccgggtg tggtggccca cgcctttaat gcttatttgg gaaaggaggg 10920
gttggacgaa gaaccagtac tacaaacacg tccttatctt tgggattctg ttcggcccac 10980
accaccgggt gcggaaatta ctcagcactc cggaggcaga ggcaggtgga tttctgagtt 11040
cgaggccagc ctggtctaca aagtgagttc caggacagcc agggctatag agaaaccctg 11100
gagtcgtgag gcctccgtct ccgtccacct aaagactcaa gctccggtcg gaccagatgt 11160
ttcactcaag gtcctgtcgg tcccgatatc tctttgggac tctcgaaaaa caaaaacaaa 11220
caaacaaaca aaaagaaacc ctaagacagt ggctaactct gcattatgga tttttattta 11280
aattgacaag ttgccttgtc agagcttttt gtttttgttt gtttgtttgt ttttctttgg 11340
gattctgtca ccgattgaga cgtaatacct aaaaataaat ttaactgttc aacggaacag 11400
ttctaaaacc aaaatgtaac ttcttcacca ctctggacaa ttaatcatgg ttttcttttc 11460
tttttttttt cacaaagaaa attgcaaatg attctagatg aagattttgg ttttacattg 11520
aagaagtggt gagacctgtt aattagtacc aaaagaaaag aaaaaaaaaa gtgtttcttt 11580
taacgtttac taagatctac gaaatagaca acattagatt ttctgccttt agtgcatgat 11640
aaactttcat ttaagttata aaaataaaga aggaattggt aattttcaga tttttctcca 11700
ctttatctgt tgtaatctaa aagacggaaa tcacgtacta tttgaaagta aattcaatat 11760
ttttatttct tccttaacca ttaaaagtct aaaaagaggt ataattctta ggtaaaacaa 11820
aagttacatt tttaagatag tggctagata atataacatc aaagtatata atattatttc 11880
tctctgtttt aataaaccag tattaagaat ccattttgtt ttcaatgtaa aaattctatc 11940
accgatctat tatattgtag tttcatatat tataataaag agagacaaaa ttatttggtc 12000
tagtgctttc tggttcaaga agatagctaa gtgacagtgg caaatcaaaa tatttttcat 12060
cgtatttagt attatgggca gtatacattg cctgactaaa atcacgaaag accaagttct 12120
tctatcgatt cactgtcacc gtttagtttt ataaaaagta gcataaatca taatacccgt 12180
catatgtaac ggactgattt tgggactgaa aaagctctga gtcttgggag ctgtattggt 12240
tcccaatcct ctagacttta ttatagttat atacactggt agttagacat gtgatgatgt 12300
accctgactt tttcgagact cagaaccctc gacataacca agggttagga gatctgaaat 12360
aatatcaata tatgtgacca tcaatctgta cactactaca ggattttcaa cagctactta 12420
tggaacctga ctggggaata cattttgttc tacttcatta cacaatgaat tctctctact 12480
gctttgaggt cttcatctgc cctaaaagtt gtcgatgaat accttggact gaccccttat 12540
gtaaaacaag atgaagtaat gtgttactta agagagatga cgaaactcca gaagtagacg 12600
aaatacagac gttgaattaa aatgttaagt tctttgtgaa tgttatttgt atggtcatga 12660
gtaaattcat taactactaa cttcagcttc ctttcagtct tttatgtctg caacttaatt 12720
ttacaattca agaaacactt acaataaaca taccagtact catttaagta attgatgatt 12780
gaagtcgaag gaaagtcaga gtagtatctg aaattgtgtt ttttgtggga gagaaagaca 12840
agcttagtat accatgaaag cagaagtgat tgagaatttc ttaacaagaa aaagagaaaa 12900
catcatagac tttaacacaa aaaacaccct ctctttctgt tcgaatcata tggtactttc 12960
gtcttcacta actcttaaag aattgttctt tttctctttt ggatgttgag caaggtttca 13020
cagcattggt atgatggtct caactggcct tggagatcag caatagtttt tcagataaac 13080
ttggaaggac agaattttag cctacaactc gttccaaagt gtcgtaacca tactaccaga 13140
gttgaccgga acctctagtc gttatcaaaa agtctatttg aaccttcctg tcttaaaatc 13200
gctgatgata cagaaggctc agagacggtg cacgagctcc gacggtatcg ataagcttga 13260
tatcgaattc cgaagttcct attctctaga aagtatagga cgactactat gtcttccgag 13320
tctctgccac gtgctcgagg ctgccatagc tattcgaact atagcttaag gcttcaagga 13380
taagagatct ttcatatcct acttcaggtc tgaagaggag tttacgtcca gccaagctag 13440
cttggctgca ggtcgtcgaa attctaccgg gtaggggagg cgcttttccc aaggcagtct 13500
tgaagtccag acttctcctc aaatgcaggt cggttcgatc gaaccgacgt ccagcagctt 13560
taagatggcc catcccctcc gcgaaaaggg ttccgtcaga ggagcatgcg ctttagcagc 13620
cccgctgggc acttggcgct acacaagtgg cctctggcct cgcacacatt ccacatccac 13680
cggtaggcgc caaccggctc cctcgtacgc gaaatcgtcg gggcgacccg tgaaccgcga 13740
tgtgttcacc ggagaccgga gcgtgtgtaa ggtgtaggtg gccatccgcg gttggccgag 13800
cgttctttgg tggccccttc gcgccacctt ctactcctcc cctagtcagg aagttccccc 13860
ccgccccgca gctcgcgtcg tgcaggacgt gacaaatgga gcaagaaacc accggggaag 13920
cgcggtggaa gatgaggagg ggatcagtcc ttcaaggggg ggcggggcgt cgagcgcagc 13980
acgtcctgca ctgtttacct agtagcacgt ctcactagtc tcgtgcagat ggacagcacc 14040
gctgagcaat ggaagcgggt aggcctttgg ggcagcggcc aatagcagct ttgctccttc 14100
tcatcgtgca gagtgatcag agcacgtcta cctgtcgtgg cgactcgtta ccttcgccca 14160
tccggaaacc ccgtcgccgg ttatcgtcga aacgaggaag gctttctggg ctcagaggct 14220
gggaaggggt gggtccgggg gcgggctcag gggcgggctc aggggcgggg cgggcgcccg 14280
aaggtcctcc ggaggcccgg cgaaagaccc gagtctccga cccttcccca cccaggcccc 14340
cgcccgagtc cccgcccgag tccccgcccc gcccgcgggc ttccaggagg cctccgggcc 14400
cattctgcac gcttcaaaag cgcacgtctg ccgcgctgtt ctcctcttcc tcatctccgg 14460
gcctttcgac ctgcagcctg ttgacaatta atcatcggca gtaagacgtg cgaagttttc 14520
gcgtgcagac ggcgcgacaa gaggagaagg agtagaggcc cggaaagctg gacgtcggac 14580
aactgttaat tagtagccgt tagtatatcg gcatagtata atacgacaag gtgaggaact 14640
aaaccatggg atcggccatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg gccgcttggg 14700
atcatatagc cgtatcatat tatgctgttc cactccttga tttggtaccc tagccggtaa 14760
cttgttctac ctaacgtgcg tccaagaggc cggcgaaccc tggagaggct attcggctat 14820
gactgggcac aacagacaat cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag 14880
gggcgcccgg ttctttttgt acctctccga taagccgata ctgacccgtg ttgtctgtta 14940
gccgacgaga ctacggcggc acaaggccga cagtcgcgtc cccgcgggcc aagaaaaaca 15000
caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg 15060
gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttctggctg gacaggccac 15120
gggacttact tgacgtcctg ctccgtcgcg ccgatagcac cgaccggtgc tgcccgcaag 15180
gaacgcgtcg acacgagctg gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg ctattgggcg 15240
aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa gtatccatca 15300
caacagtgac ttcgcccttc cctgaccgac gataacccgc ttcacggccc cgtcctagag 15360
gacagtagag tggaacgagg acggctcttt cataggtagt tggctgatgc aatgcggcgg 15420
ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag 15480
cgagcacgta ctcggatgga accgactacg ttacgccgcc gacgtatgcg aactaggccg 15540
atggacgggt aagctggtgg ttcgctttgt agcgtagctc gctcgtgcat gagcctacct 15600
agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga 15660
actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgat tcggccagaa cagctagtcc 15720
tactagacct gcttctcgta gtccccgagc gcggtcggct tgacaagcgg tccgagttcc 15780
gcgcgtacgg gctgccgcta gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc ttgccgaata 15840
tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg ggtgtggcgg 15900
ctagagcagc actgggtacc gctacggacg aacggcttat agtaccacct tttaccggcg 15960
aaaagaccta agtagctgac accggccgac ccacaccgcc accgctatca ggacatagcg 16020
ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg 16080
ctttacggta tcgccgctcc tggcgatagt cctgtatcgc aaccgatggg cactataacg 16140
acttctcgaa ccgccgctta cccgactggc gaaggagcac gaaatgccat agcggcgagg 16200
cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag gggatcaatt 16260
ctctagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt gctaagcgtc gcgtagcgga 16320
agatagcgga agaactgctc aagaagactc ccctagttaa gagatctcga gcgactagtc 16380
ggagctgaca cggaagatca tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 16440
tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc 16500
acggtcggta gacaacaaac ggggaggggg cacggaagga actgggacct tccacggtga 16560
gggtgacagg aaaggattat tttactcctt taacgtagcg attgtctgag taggtgtcat 16620
tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc 16680
aggcatgctg gggatgcggt taacagactc atccacagta agataagacc ccccacccca 16740
ccccgtcctg tcgttccccc tcctaaccct tctgttatcg tccgtacgac ccctacgcca 16800
gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac cagctggggc tcgactagag cttgcggaac 16860
ccttcgaagt tcctattctc tagaaagtat aggaacttca cccgagatac cgaagactcc 16920
gcctttcttg gtcgaccccg agctgatctc gaacgccttg ggaagcttca aggataagag 16980
atctttcata tccttgaagt tcagtcaggt acataatata acttcgtata atgtatgcta 17040
tacgaagtta ttaggtggat ccactagttc tagagcgaga cagcaccttc tactattgaa 17100
agtcagtcca tgtattatat tgaagcatat tacatacgat atgcttcaat aatccaccta 17160
ggtgatcaag atctcgctct gtcgtggaag atgataactt aaaatacaaa ttattcatgg 17220
actctagaat aggcatgtgg aagagtagca ggataacaaa tactgagata aatgagagtc 17280
caagttgtgg aaattattta ttttatgttt aataagtacc tgagatctta tccgtacacc 17340
ttctcatcgt cctattgttt atgactctat ttactctcag gttcaacacc tttaataaat 17400
ctttataaaa tagatgataa ccatggaatt aattttagca gtggtaatga ggaggcactg 17460
taagatttaa ttgaaataaa tgcagagatg gcatttacaa gaaatatttt atctactatt 17520
ggtaccttaa ttaaaatcgt caccattact cctccgtgac attctaaatt aactttattt 17580
acgtctctac cgtaaatgtt acaaaactgg cagtttgtga ggcatgatga aatgaatctt 17640
aattaaagct gtaatagaga tgatatgtgg attgcattac agatgcctaa aatagttggg 17700
tgttttgacc gtcaaacact ccgtactact ttacttagaa ttaatttcga cattatctct 17760
actatacacc taacgtaatg tctacggatt ttatcaaccc ctttcaaggg tatgtgaaaa 17820
tcctcaagat gtgtttgtta tatgtatgaa tgcatttcct tggaaaaggg ttcataactt 17880
tcatcagctt atataagaag gaaagttccc atacactttt aggagttcta cacaaacaat 17940
atacatactt acgtaaagga accttttccc aagtattgaa agtagtcgaa tatattcttc 18000
tacttggggt gtctatgtta caggaaaaag tggtaaagtg acatttacaa gctctgaagt 18060
ttctgaattt aaaaatatgc tctaacattt aatttaattt atgaacccca cagatacaat 18120
gtcctttttc accatttcac tgtaaatgtt cgagacttca aagacttaaa tttttatacg 18180
agattgtaaa ttaaattaaa tttttcactt tttttttagt ggacaggcca aaatctcaac 18240
atattcgaac ctctagtaca ataaggcgaa cctcttctct ggatacgata acaggacctt 18300
aaaaagtgaa aaaaaaatca cctgtccggt tttagagttg tataagcttg gagatcatgt 18360
tattccgctt ggagaagaga cctatgctat tgtcctggaa acctcacagg acagtggcca 18420
cgggaccctc atgttcacta cccttcatgc atgagagata aagccactca ggtaagatga 18480
gaaaatcaaa tccagttctt tggagtgtcc tgtcaccggt gccctgggag tacaagtgat 18540
gggaagtacg tactctctat ttcggtgagt ccattctact cttttagttt aggtcaagaa 18600
tgattttgaa attagaatgt aattaaatta tcctgaatat gaaataaacc caaccaaagc 18660
agcatccctt gttttacatg cggagcataa taataatttg actaaaactt taatcttaca 18720
ttaatttaat aggacttata ctttatttgg gttggtttcg tcgtagggaa caaaatgtac 18780
gcctcgtatt attattaaac ttacttggct attgaggttt ttagttattt aatatttaat 18840
aagtgtaagt tcaggctgca ttatgatttt ggagacatgc tggcagccca attccgatca 18900
aatgaaccga taactccaaa aatcaataaa ttataaatta ttcacattca agtccgacgt 18960
aatactaaaa cctctgtacg accgtcgggt taaggctagt tattcaataa cccttaatat 19020
aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt attaggtccc tcgaggggat ccactagttc 19080
tagagcggga ctgagttgtc ataagttatt gggaattata ttgaagcata ttacatacga 19140
tatgcttcaa taatccaggg agctccccta ggtgatcaag atctcgccct gactcaacag 19200
ctgcagtcat tttaagaatt gttttttaat aaaacggagc tgataattag gaagcatttt 19260
tgaaaattct ttttttttta atttttttat taggtattta gacgtcagta aaattcttaa 19320
caaaaaatta ttttgcctcg actattaatc cttcgtaaaa acttttaaga aaaaaaaaat 19380
taaaaaaata atccataaat gctcatttac atttccaatg ctataccaaa agtcccccat 19440
acccacccac cccaaccccc ttcccaccca ctcccccttt ttggccctgg cgttcccctg 19500
cgagtaaatg taaaggttac gatatggttt tcagggggta tgggtgggtg gggttggggg 19560
aagggtgggt gagggggaaa aaccgggacc gcaaggggac tactggggca tataaatttt 19620
gcgtgtccaa tgggcctctc tttccagtga tggccgacta ggccatcttt tgttacatat 19680
gcaggtagag tcaagagctc atgaccccgt atatttaaaa cgcacaggtt acccggagag 19740
aaaggtcact accggctgat ccggtagaaa acaatgtata cgtccatctc agttctcgag 19800
cggggtactg gttagttcat aatgttgttt cacctatagg gttgcagatc cctttagctc 19860
cttggctact ttctctagct cctccattgg gagccctgtg gccccatgac caatcaagta 19920
ttacaacaaa gtggatatcc caacgtctag ggaaatcgag gaaccgatga aagagatcga 19980
ggaggtaacc ctcgggacac atccatccat tagctgactg tgagcatcca cttctgtgtt 20040
tgctaggccc cggcatagtc tcacaagaga cagctacatc tgggtccttt cgataaaatc 20100
taggtaggta atcgactgac actcgtaggt gaagacacaa acgatccggg gccgtatcag 20160
agtgttctct gtcgatgtag acccaggaaa gctattttag ttgctagtgt atgcaatggt 20220
gtcatcgttt ggaagctgat tatggggtgg atccctggat atggcagtct ctacatggtc 20280
catcctttca tctcagctcc aacgatcaca tacgttacca cagtagcaaa ccttcgacta 20340
ataccccacc tagggaccta taccgtcaga gatgtaccag gtaggaaagt agagtcgagg 20400
aaactttgtc tctgtaactc cttccaaggg tgttttgttc ccacttctaa ggaggggcat 20460
agtgtccaca cttcagtctt cctttttctt gagtttcatg tttgaaacag agacattgag 20520
gaaggttccc acaaaacaag ggtgaagatt cctccccgta tcacaggtgt gaagtcagaa 20580
ggaaaaagaa ctcaaagtac tgtttaggaa attgtatctt atatcttgga tatcctaggt 20640
tttatatctt ggatatccta ggtttggggc taatatccac ttatcagtga gtacatattg 20700
acaaatcctt taacatagaa tatagaacct ataggatcca aaatatagaa cctataggat 20760
ccaaaccccg attataggtg aatagtcact catgtataac tgtgagttcc tttgtgaatg 20820
tgttacctca ctcaggtcca tccatttggc taggaatttc ataaattcat tctttttaat 20880
agctgagtag tactccactg acactcaagg aaacacttac acaatggagt gagtccaggt 20940
aggtaaaccg atccttaaag tatttaagta agaaaaatta tcgactcatc atgaggtgac 21000
tgtagatgta ccaccttttc tgtatccatt cctctgttga ggggcatctg ggttctttcc 21060
agcttctggc tattataaat aaggctgcta tgaacatagt acatctacat ggtggaaaag 21120
acataggtaa ggagacaact ccccgtagac ccaagaaagg tcgaagaccg ataatattta 21180
ttccgacgat acttgtatca ggagcatgtg tccttcttac cggttggaac atcttctgga 21240
tatatgccca ggagaggtat tactggatcc tccggtagta ctatgtccaa ttttctgagg 21300
cctcgtacac aggaagaatg gccaaccttg tagaagacct atatacgggt cctctccata 21360
atgacctagg aggccatcat gatacaggtt aaaagactcc aaccgccaga ctgatttcca 21420
gagtggttgt acaagcctgc aatcccacca acaatggagg agtgttcctc tttctccaca 21480
tccacgccag catctgctgt ttggcggtct gactaaaggt ctcaccaaca tgttcggacg 21540
ttagggtggt tgttacctcc tcacaaggag aaagaggtgt aggtgcggtc gtagacgaca 21600
cacctgaatt tttgatctta gccattctga ctggtgtgag gtggaatctc agggttgttt 21660
tgatttgcat ttctctgatg attaaggatg ttgaacattt gtggacttaa aaactagaat 21720
cggtaagact gaccacactc caccttagag tcccaacaaa actaaacgta aagagactac 21780
taattcctac aacttgtaaa ttttcaggtg cttctctgcc attcggtatt cctcaggtga 21840
gaattctttg ttcagttctg agccccattt tttaatgggg ttatttgatt ttctgaagtc 21900
aaaagtccac gaagagacgg taagccataa ggagtccact cttaagaaac aagtcaagac 21960
tcggggtaaa aaattacccc aataaactaa aagacttcag caccttcttg agttctttat 22020
atatgttgga tattagtacc ctatctgatt taggataggt aaagatcctt tcccaatctg 22080
ttggtggtct ttttgtctta gtggaagaac tcaagaaata tatacaacct ataatcatgg 22140
gatagactaa atcctatcca tttctaggaa agggttagac aaccaccaga aaaacagaat 22200
ttgacgctgt cttttgcctt gcagaaactt tggagtttca ttaggtccca tttgtcaatt 22260
ctcgatctta cagcacaagc cattgctgtt ctgttcagga aactgcgaca gaaaacggaa 22320
cgtctttgaa acctcaaagt aatccagggt aaacagttaa gagctagaat gtcgtgttcg 22380
gtaacgacaa gacaagtcct atttttcccc tgtgcccata tcttcaaggc ttttccccac 22440
tttctcctct ataagtttca gtgtctctgg ttttaagtga agttccttga tccacttaga 22500
taaaaagggg acacgggtat agaagttccg aaaaggggtg aaagaggaga tattcaaagt 22560
cacagagacc aaaattcact tcaaggaact aggtgaatct tttgacctta gtacaaggag 22620
ataagtatgg atcgatttgc attcttctac atgataacaa ccagttgtgc cagcaccaat 22680
tgttgaaaat gctgtctttc aaactggaat catgttcctc tattcatacc tagctaaacg 22740
taagaagatg tactattgtt ggtcaacacg gtcgtggtta acaactttta cgacagaaag 22800
ttccactgga tgcttttagc tcccttgtcg aagatcaagt gaccataggt gtgtgggttc 22860
atttctgggt cttcaattct attccattgg tctacttgtc aaggtgacct acgaaaatcg 22920
agggaacagc ttctagttca ctggtatcca cacacccaag taaagaccca gaagttaaga 22980
taaggtaacc agatgaacag tgtctctata ccagtaccat gcagttttga tcacaattgc 23040
tctgtattaa agctttaggt caggcatggt gattctacca gaggttcttt tatccttgag 23100
acagagatat ggtcatggta cgtcaaaact agtgttaacg agacataatt tcgaaatcca 23160
gtccgtacca ctaagatggt ctccaagaaa ataggaactc aagagttttt gctatcctag 23220
gttttttgtt attccagatg aatttgcaaa ttgctccttc taattcgttg aagaattgag 23280
ttggaatttt gatggggatt ttctcaaaaa cgataggatc caaaaaacaa taaggtctac 23340
ttaaacgttt aacgaggaag attaagcaac ttcttaactc aaccttaaaa ctacccctaa 23400
gcattgaatc tgtagattgc ttttggcaag atagccattt ttacaatgtt gatcctgcca 23460
atccatgagc atgggagatc cttccatctt ctgagatctt cgtaacttag acatctaacg 23520
aaaaccgttc tatcggtaaa aatgttacaa ctaggacggt taggtactcg taccctctag 23580
gaaggtagaa gactctagaa ctttaatttc tttcttcaga gacttgaagt ttttatcata 23640
cagatctttc acttccttag ttagagtcac gccgagatat tttatattat ttgtgactat 23700
gaaattaaag aaagaagtct ctgaacttca aaaatagtat gtctagaaag tgaaggaatc 23760
aatctcagtg cggctctata aaatataata aacactgata tgagaagggt gttgtttccc 23820
taatttcttt ctcagcctgt ttattctttg tatagagaaa ggccattgac gtgtttgagt 23880
ttattttata tccagctact actcttccca caacaaaggg attaaagaaa gagtcggaca 23940
aataagaaac atatctcttt ccggtaactg cacaaactca aataaaatat aggtcgatga 24000
tcaccgaagc tgtttatcag gtttaggagt tctctggtgg aatttttggg gtcacttata 24060
tatactatca tatcatctgc aaaaagtgat attttgactt agtggcttcg acaaatagtc 24120
caaatcctca agagaccacc ttaaaaaccc cagtgaatat atatgatagt atagtagacg 24180
tttttcacta taaaactgaa cctcttttcc aatttgtatc cccttgatct ccttttgttg 24240
tcgaattgct ctggctaata cttcaagtac tatgttgaaa aggtagggag aaagtgggca 24300
ggagaaaagg ttaaacatag gggaactaga ggaaaacaac agcttaacga gaccgattat 24360
gaagttcatg atacaacttt tccatccctc tttcacccgt gccttgtcta gtccctgatt 24420
ttagtgggat tgcttccagc ttctctccat ttactttgat gttggctact ggtttgctgt 24480
agattgtttt tatcatgttt cggaacagat cagggactaa aatcacccta acgaaggtcg 24540
aagagaggta aatgaaacta caaccgatga ccaaacgaca tctaacaaaa atagtacaaa 24600
aggtatgggc cttgaattcc cgatctttcc agaactttta tcatgaatgg gtgttggatc 24660
ttgtcaaatg ctttttctgc atctaacgag atgatcatgt tccatacccg gaacttaagg 24720
gctagaaagg tcttgaaaat agtacttacc cacaacctag aacagtttac gaaaaagacg 24780
tagattgctc tactagtaca ggtttttgtc tttgagtttg tttatataat ggattacatt 24840
gatggatttt cgtatattaa accatccctg catccctgga ataaaaccta cttggtcagg 24900
ccaaaaacag aaactcaaac aaatatatta cctaatgtaa ctacctaaaa gcatataatt 24960
tggtagggac gtagggacct tattttggat gaaccagtcc atggatgatt gctttaatgt 25020
gttcttggat tcagttagcg agaattttat tgaggaattt tgcatcgata ttcataagag 25080
aaattggtct gaagttctct tacctactaa cgaaattaca caagaaccta agtcaatcgc 25140
tcttaaaata actccttaaa acgtagctat aagtattctc tttaaccaga cttcaagaga 25200
atctttgttg gatctttctg tggtttaggt atcagagtaa tagtggcttc ataaaatgag 25260
ttgggtagag taccttctac ttctatcttg tgaaaaagtt tagaaacaac ctagaaagac 25320
accaaatcca tagtctcatt atcaccgaag tattttactc aacccatctc atggaagatg 25380
aagatagaac actttttcaa tgtgcagaac tggaattaga tcttctttga aggtctgata 25440
gaactctgca ctaaacccgt ctggtcctgg gctttttttg gctgggagac tatttataac 25500
acacgtcttg accttaatct agaagaaact tccagactat cttgagacgt gatttgggca 25560
gaccaggacc cgaaaaaaac cgaccctctg ataaatattg tgcttctatt tctttagggg 25620
atatgggact gtttagaagg tcaacttgat cctgattcaa ctttggtacc tggtatctgt 25680
ccagaaattt gtccatttcg acgaagataa agaaatcccc tataccctga caaatcttcc 25740
agttgaacta ggactaagtt gaaaccatgg accatagaca ggtctttaaa caggtaaagc 25800
tccaggtttt ccagttttgt tgagtatagc cttttgtaga aggatctgat ggtgttttgg 25860
atttcttcag gatctgtcgt tatgtctccc ttttctgttc aggtccaaaa ggtcaaaaca 25920
actcatatcg gaaaacatct tcctagacta ccacaaaacc taaagaagtc ctagacagca 25980
atacagaggg aaaagacaag tgattttgtt aattaggatt ttgtccctgt gccctctagt 26040
gagtctagct aatggtttat ctatcttgtt gattttctca aagaaccaac tcctcgtttg 26100
actaaaacaa ttaatcctaa aacagggaca cgggagatca ctcagatcga ttaccaaata 26160
gatagaacaa ctaaaagagt ttcttggttg aggagcaaac gttagttctt tgaatagttc 26220
ttcttgtttc cacttggttg atttcacccc tgagtttcct cttgggtgaa tttgcttcct 26280
ttttttctag agcttttaga caatcaagaa acttatcaag aagaacaaag gtgaaccaac 26340
taaagtgggg actcaaagga gaacccactt aaacgaagga aaaaaagatc tcgaaaatct 26400
tgtgttgtca agctgctagt atgtgctctc tcccgtttct tcttggaggc actcagagct 26460
atgagtttcc ctcttagaaa tgctttcatt gtgtcccaaa acacaacagt tcgacgatca 26520
tacacgagag agggcaaaga agaacctccg tgagtctcga tactcaaagg gagaatcttt 26580
acgaaagtaa cacagggttt ggtttgggta cgttgtggct tcattttcat taaactctaa 26640
aaagtcttta atttcttttt ttattccttc cttgaccaag gtattattga gaagagtgtt 26700
ccaaacccat gcaacaccga agtaaaagta atttgagatt tttcagaaat taaagaaaaa 26760
aataaggaag gaactggttc cataataact cttctcacaa gttcagtttc cacgtgagtg 26820
ttggctttct attatttttt ttgttattga agatcagcct tagtgcatgg tgctctgata 26880
ggatacatgg gacaatttca caagtcaaag gtgcactcac aaccgaaaga taataaaaaa 26940
aacaataact tctagtcgga atcacgtacc acgagactat cctatgtacc ctgttaaagt 27000
atatttttga atctgttgag gcctgttttg tgacctatta tgtggtcaat tttggagaag 27060
gtaccatgag gtgccgagaa gaaggtatat ccactagtgg tataaaaact tagacaactc 27120
cggacaaaac actggataat acaccagtta aaacctcttc catggtactc cacggctctt 27180
cttccatata ggtgatcacc atcctctaga gtcgagcagt gtggttttca agaggaagca 27240
aaaagcctct ccacccaggc ctggaatgtt tccacccaat gtcgagcagt gtggttttgc 27300
taggagatct cagctcgtca caccaaaagt tctccttcgt ttttcggaga ggtgggtccg 27360
gaccttacaa aggtgggtta cagctcgtca caccaaaacg aagaggaagc aaaaagcctc 27420
tccacccagg cctggaatgt ttccacccaa tgtcgagcaa accccgccca gcgtcttgtc 27480
attggcgaat tcgaacacgc ttctccttcg tttttcggag aggtgggtcc ggaccttaca 27540
aaggtgggtt acagctcgtt tggggcgggt cgcagaacag taaccgctta agcttgtgcg 27600
agatgcagtc ggggcggcgc ggtcccaggt ccacttcgca tattaaggtg acgcgtgtgg 27660
cctcgaacac cgagcgaccc tgcagcgacc cgcttaacag tctacgtcag ccccgccgcg 27720
ccagggtcca ggtgaagcgt ataattccac tgcgcacacc ggagcttgtg gctcgctggg 27780
acgtcgctgg gcgaattgtc cgtcaacagc gtgccgcaga tcttggtggc gtgaaactcc 27840
cgcacctctt cggccagcgc cttgtagaag cgcgtatggc ttcgtacccc ggccatcagc 27900
gcagttgtcg cacggcgtct agaaccaccg cactttgagg gcgtggagaa gccggtcgcg 27960
gaacatcttc gcgcataccg aagcatgggg ccggtagtcg acgcgtctgc gttcgaccag 28020
gctgcgcgtt ctcgcggcca tagcaaccga cgtacggcgt tgcgccctcg ccggcagcaa 28080
gaagccacgg aagtccgccc tgcgcagacg caagctggtc cgacgcgcaa gagcgccggt 28140
atcgttggct gcatgccgca acgcgggagc ggccgtcgtt cttcggtgcc ttcaggcggg 28200
ggagcagaaa atgcccacgc tactgcgggt ttatatagac ggtccccacg ggatggggaa 28260
aaccaccacc acgcaactgc tggtggccct gggttcgcgc cctcgtcttt tacgggtgcg 28320
atgacgccca aatatatctg ccaggggtgc cctacccctt ttggtggtgg tgcgttgacg 28380
accaccggga cccaagcgcg gacgatatcg tctacgtacc cgagccgatg acttactggc 28440
gggtgctggg ggcttccgag acaatcgcga acatctacac cacacaacac cgccttgacc 28500
ctgctatagc agatgcatgg gctcggctac tgaatgaccg cccacgaccc ccgaaggctc 28560
tgttagcgct tgtagatgtg gtgtgttgtg gcggaactgg agggtgagat atcggccggg 28620
gacgcggcgg tggtaatgac aagcgcccag ataacaatgg gcatgcctta tgccgtgacc 28680
gacgccgttc tggctcctca tcccactcta tagccggccc ctgcgccgcc accattactg 28740
ttcgcgggtc tattgttacc cgtacggaat acggcactgg ctgcggcaag accgaggagt 28800
tatcgggggg gaggctggga gctcacatgc cccgcccccg gccctcaccc tcatcttcga 28860
ccgccatccc atcgccgccc tcctgtgcta cccggccgcg atagcccccc ctccgaccct 28920
cgagtgtacg gggcgggggc cgggagtggg agtagaagct ggcggtaggg tagcggcggg 28980
aggacacgat gggccggcgc cgatacctta tgggcagcat gaccccccag gccgtgctgg 29040
cgttcgtggc cctcatcccg ccgaccttgc ccggcacaaa catcgtgttg ggggcccttc 29100
gctatggaat acccgtcgta ctggggggtc cggcacgacc gcaagcaccg ggagtagggc 29160
ggctggaacg ggccgtgttt gtagcacaac ccccgggaag cggaggacag acacatcgac 29220
cgcctggcca aacgccagcg ccccggcgag cggcttgacc tggctatgct ggccgcgatt 29280
cgccgcgttt acgggctgct gcctcctgtc tgtgtagctg gcggaccggt ttgcggtcgc 29340
ggggccgctc gccgaactgg accgatacga ccggcgctaa gcggcgcaaa tgcccgacga 29400
tgccaatacg gtgcggtatc tgcagggcgg cgggtcgtgg cgggaggatt ggggacagct 29460
ttcggggacg gccgtgccgc cccagggtgc cgagccccag acggttatgc cacgccatag 29520
acgtcccgcc gcccagcacc gccctcctaa cccctgtcga aagcccctgc cggcacggcg 29580
gggtcccacg gctcggggtc agcaacgcgg gcccacgacc ccatatcggg gacacgttat 29640
ttaccctgtt tcgggccccc gagttgctgg cccccaacgg cgacctgtac aacgtgtttg 29700
tcgttgcgcc cgggtgctgg ggtatagccc ctgtgcaata aatgggacaa agcccggggg 29760
ctcaacgacc gggggttgcc gctggacatg ttgcacaaac cctgggcctt ggacgtcttg 29820
gccaaacgcc tccgtcccat gcacgtcttt atcctggatt acgaccaatc gcccgccggc 29880
tgccgggacg ccctgctgca ggacccggaa cctgcagaac cggtttgcgg aggcagggta 29940
cgtgcagaaa taggacctaa tgctggttag cgggcggccg acggccctgc gggacgacgt 30000
acttacctcc gggatgatcc agacccacgt caccacccca ggctccatac cgacgatctg 30060
cgacctggcg cgcacgtttg cccgggagat gggggaggct tgaatggagg ccctactagg 30120
tctgggtgca gtggtggggt ccgaggtatg gctgctagac gctggaccgc gcgtgcaaac 30180
gggccctcta ccccctccga aactgaaaca cggaaggaga caataccgga aggaacccgc 30240
gctatgacgg caataaaaag acagaataaa acgcacgggt gttgggtcgt ttgttcataa 30300
ttgactttgt gccttcctct gttatggcct tccttgggcg cgatactgcc gttatttttc 30360
tgtcttattt tgcgtgccca caacccagca aacaagtatt acgcggggtt cggtcccagg 30420
gctggcactc tgtcgatacc ccaccgagac cccattgggg ccaatacgcc cgcgtttctt 30480
ccttttcccc accccacccc tgcgccccaa gccagggtcc cgaccgtgag acagctatgg 30540
ggtggctctg gggtaacccc ggttatgcgg gcgcaaagaa ggaaaagggg tggggtgggg 30600
ccaagttcgg gtgaaggccc agggctcgca gccaacgtcg gggcggcagg ccctgccata 30660
gccacgggcc ccgtgggtta gggacggggt cccccatggg ggttcaagcc cacttccggg 30720
tcccgagcgt cggttgcagc cccgccgtcc gggacggtat cggtgcccgg ggcacccaat 30780
ccctgcccca gggggtaccc gaatggttta tggttcgtgg gggttattat tttgggcgtt 30840
gcgtggggtc agtccacgac tggactgagc agacagaccc atggtttttg gatggcctgg 30900
cttaccaaat accaagcacc cccaataata aaacccgcaa cgcaccccag tcaggtgctg 30960
acctgactcg tctgtctggg taccaaaaac ctaccggacc gcatggaccg catgtactgg 31020
cgcgacacga acaccgggcg tctgtggctg ccaaacaccc ccgaccccca aaaaccaccg 31080
cgcggatttc tggcgccgcc cgtacctggc gtacatgacc gcgctgtgct tgtggcccgc 31140
agacaccgac ggtttgtggg ggctgggggt ttttggtggc gcgcctaaag accgcggcgg 31200
ggacgaacta aacctgacta cggcatctct gccccttctt cgctggtacg aggagcgctt 31260
ttgttttgta ttggtcacca cggccgagtt tccgcgggac cctgcttgat ttggactgat 31320
gccgtagaga cggggaagaa gcgaccatgc tcctcgcgaa aacaaaacat aaccagtggt 31380
gccggctcaa aggcgccctg cccggccaga tcaagctagc ttatcgatac cgtcgacctc 31440
gagggggggc ccggtaccag cttttgttcc ctttagtgag ggttaatttc gagcttggcg 31500
gggccggtct agttcgatcg aatagctatg gcagctggag ctcccccccg ggccatggtc 31560
gaaaacaagg gaaatcactc ccaattaaag ctcgaaccgc taatcatggt catagctgtt 31620
tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 31680
gtgtaaagcc tggggtgcct attagtacca gtatcgacaa aggacacact ttaacaatag 31740
gcgagtgtta aggtgtgttg tatgctcggc cttcgtattt cacatttcgg accccacgga 31800
aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa 31860
acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ttactcactc gattgagtgt 31920
aattaacgca acgcgagtga cgggcgaaag gtcagccctt tggacagcac ggtcgacgta 31980
attacttagc cggttgcgcg ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc 32040
tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca 32100
cccctctccg ccaaacgcat aacccgcgag aaggcgaagg agcgagtgac tgagcgacgc 32160
gagccagcaa gccgacgccg ctcgccatag tcgagtgagt aaggcggtaa tacggttatc 32220
cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 32280
gaaccgtaaa aaggccgcgt ttccgccatt atgccaatag gtgtcttagt cccctattgc 32340
gtcctttctt gtacactcgt tttccggtcg ttttccggtc cttggcattt ttccggcgca 32400
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa 32460
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca acgaccgcaa aaaggtatcc 32520
gaggcggggg gactgctcgt agtgttttta gctgcgagtt cagtctccac cgctttgggc 32580
tgtcctgata tttctatggt ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt 32640
ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt 32700
ccgcaaaggg ggaccttcga gggagcacgc gagaggacaa ggctgggacg gcgaatggcc 32760
tatggacagg cggaaagagg gaagcccttc gcaccgcgaa tctcatagct cacgctgtag 32820
gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 32880
tcagcccgac cgctgcgcct agagtatcga gtgcgacatc catagagtca agccacatcc 32940
agcaagcgag gttcgacccg acacacgtgc ttggggggca agtcgggctg gcgacgcgga 33000
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag 33060
cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg ataggccatt gatagcagaa 33120
ctcaggttgg gccattctgt gctgaatagc ggtgaccgtc gtcggtgacc attgtcctaa 33180
tcgtctcgct ccatacatcc cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc taactacggc 33240
tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac cttcggaaaa 33300
gccacgatgt ctcaagaact tcaccaccgg attgatgccg atgtgatctt cttgtcataa 33360
accatagacg cgagacgact tcggtcaatg gaagcctttt agagttggta gctcttgatc 33420
cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg 33480
cagaaaaaaa ggatctcaag tctcaaccat cgagaactag gccgtttgtt tggtggcgac 33540
catcgccacc aaaaaaacaa acgttcgtcg tctaatgcgc gtcttttttt cctagagttc 33600
aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 33660
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta ttctaggaaa ctagaaaaga 33720
tgccccagac tgcgagtcac cttgcttttg agtgcaattc cctaaaacca gtactctaat 33780
agtttttcct agaagtggat gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa 33840
agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga ggcacctatc 33900
ctaggaaaat ttaattttta cttcaaaatt tagttagatt tcatatatac tcatttgaac 33960
cagactgtca atggttacga attagtcact ccgtggatag tcagcgatct gtctatttcg 34020
ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc 34080
atctggcccc agtgctgcaa agtcgctaga cagataaagc aagtaggtat caacggactg 34140
aggggcagca catctattga tgctatgccc tcccgaatgg tagaccgggg tcacgacgtt 34200
tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 34260
gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc actatggcgc tctgggtgcg 34320
agtggccgag gtctaaatag tcgttatttg gtcggtcggc cttcccggct cgcgtcttca 34380
ccaggacgtt gaaataggcg ctccatccag tctattaatt gttgccggga agctagagta 34440
agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg catcgtggtg 34500
gaggtaggtc agataattaa caacggccct tcgatctcat tcatcaagcg gtcaattatc 34560
aaacgcgttg caacaacggt aacgatgtcc gtagcaccac tcacgctcgt cgtttggtat 34620
ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg 34680
caaaaaagcg gttagctcct agtgcgagca gcaaaccata ccgaagtaag tcgaggccaa 34740
gggttgctag ttccgctcaa tgtactaggg ggtacaacac gttttttcgc caatcgagga 34800
tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 34860
cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag agccaggagg ctagcaacag 34920
tcttcattca accggcgtca caatagtgag taccaatacc gtcgtgacgt attaagagaa 34980
tgacagtacg gtaggcattc atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc 35040
tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc 35100
tacgaaaaga cactgaccac tcatgagttg gttcagtaag actcttatca catacgccgc 35160
tggctcaacg agaacgggcc gcagttatgc cctattatgg gcgccacata gcagaacttt 35220
aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 35280
gttgagatcc agttcgatgt cgcggtgtat cgtcttgaaa ttttcacgag tagtaacctt 35340
ttgcaagaag ccccgctttt gagagttcct agaatggcga caactctagg tcaagctaca 35400
aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 35460
gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat ttgggtgagc acgtgggttg 35520
actagaagtc gtagaaaatg aaagtggtcg caaagaccca ctcgtttttg tccttccgtt 35580
ttacggcgtt ttttccctta aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt 35640
tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa 35700
ttcccgctgt gcctttacaa cttatgagta tgagaaggaa aaagttataa taacttcgta 35760
aatagtccca ataacagagt actcgcctat gtataaactt tgtatttaga aaaataaaca 35820
aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacac ataaatcttt ttatttgttt 35880
atccccaagg cgcgtgtaaa ggggcttttc acggtg 35916
Claims (9)
1.GLCCI1基因基于Cre-LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括如下引物对：
5’端筛选引物对：
5’-CAGTTCCTGCATTAGCCACCAC-3’，5’-CTAGTTGGCTGGACGTAAACT-3’；
3’端筛选引物对：
5’-ACAGGACCTTACCTCACAGG-3’，5’-CTAGAACTAGTGGATCCCCTCGA-3’。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括如下引物：
5’-CTGCTTTGAGGTCTTCATCTGC-3’；
5’-CTTACAGTGCCTCCTCATTACC-3’；
5’-CTGCTTTGAGGTCTTCATCTGC-3’；
5’-GGCTGGACGTAAACTCCTC-3’；
5’-CTGGCAGTTTGTGAGGCATG-3’；
5’-AAGGGTTATTGAATATGATCGGA-3’；
5’-CCCTTGTTTTACATGCGGAGC-3’；
5’-GCTCACAGTCAGCTAATGGATGG-3’。
3.GLCCI1基因基于Cre-LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体的序列如SEQ ID NO.13所示，所述打靶载体命名为Glcci1-final vector。
4.GLCCI1基因基于Cre-LoxP条件性基因敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)构建打靶载体Glcci1-final vector；
(2)ES细胞筛选及鉴定；
(3)制备嵌合小鼠；
(4)繁育F1代杂合子小鼠；
(5)获得GLCCI1-/-纯合子小鼠，即为GLCCI1基因基于Cre-LoxP条件性基因敲除小鼠模型。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)是采用BAC载体构建打靶载体Glcci1-final vector，将构建好的打靶载体Glcci1-final vector用PCR及ApaL Ⅰ、BglⅡ、Kpn Ⅰ、Pst Ⅰ酶切鉴定，PCR鉴定的引物为：5’-CTGCTTTGAGGTCTTCATCTGC-3’，5’-CTTACAGTGCCTCCTCATTACC-3’。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)是将打靶载体Glcci1-finalvector采用电冲击法转到ES细胞中进行打靶，使其发生同源重组，通过PCR及Southernblot筛选出中靶克隆；其中，用于5’端筛选的PCR反应引物对为：5’-CAGTTCCTGCATTAGCCACCAC-3’，5’-CTAGTTGGCTGGACGTAAACT-3’；用于3’端筛选的PCR反应引物对为：5’-ACAGGACCTTACCTCACAGG-3’，5’-CTAGAACTAGTGGATCCCCTCGA-3’。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，注射用囊胚采用C57BL/6N近交系小鼠，通过超数排卵，自然受孕，胚胎体内发育至囊胚阶段，用于注射；注射后移植入假孕小鼠受体子宫，假孕受体为C57BL/6N与CBA的杂交一代，生育出嵌合率大于50％的嵌合雄鼠。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)是将获得的嵌合率高的嵌合雄鼠与野生型C57BL/6N背景雌鼠回交，得到F1代杂合子；经提取尾基因组DNA进行PCR反应鉴定基因型，根据电泳结果判断野生型、杂合子或纯合子。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(5)是将获得的F1代杂合子小鼠与先后与Flper小鼠及野生型C57BL/6N小鼠交配，获得完全删去Neo抗性基因的小鼠，再将完全删去Neo抗性基因的小鼠与全身性敲除cre品系交配获得全身性敲除GLCCI1的纯合子小鼠，即为GLCCI1基因基于Cre-LoxP条件性基因敲除小鼠模型。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611070834.5A CN106755092A (zh) | 2016-11-29 | 2016-11-29 | GLCCI1基因基于Cre‑LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒及构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611070834.5A CN106755092A (zh) | 2016-11-29 | 2016-11-29 | GLCCI1基因基于Cre‑LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒及构建方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106755092A true CN106755092A (zh) | 2017-05-31 |
Family
ID=58904392
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611070834.5A Pending CN106755092A (zh) | 2016-11-29 | 2016-11-29 | GLCCI1基因基于Cre‑LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒及构建方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106755092A (zh) |
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107858373A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-03-30 | 山东省千佛山医院 | 内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法 |
| CN109090040A (zh) * | 2018-09-18 | 2018-12-28 | 北京大学口腔医学院 | 一种制备Wnt10aflox/flox小鼠的方法及应用 |
| CN110272992A (zh) * | 2019-06-27 | 2019-09-24 | 郑湘榕 | 基于GLCCI1基因rs37972位点用于儿童哮喘病检测的试剂、试剂盒及应用 |
| CN110272991A (zh) * | 2019-06-27 | 2019-09-24 | 郑湘榕 | 基于GLCCI1基因rs37969位点用于儿童哮喘病检测的试剂、试剂盒及应用 |
| CN110499328A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-11-26 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种tim3人源化小鼠模型的构建方法及其应用 |
| CN110616232A (zh) * | 2019-09-23 | 2019-12-27 | 中国人民解放军陆军军医大学 | Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法及应用 |
| CN110777167A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-02-11 | 广州市妇女儿童医疗中心 | 运动功能障碍表型gtpch酶缺陷病小鼠模型的构建方法 |
| CN110804629A (zh) * | 2019-11-15 | 2020-02-18 | 西安医学院 | PirB基因敲除小鼠动物模型及其构建方法 |
| CN111206054A (zh) * | 2020-02-14 | 2020-05-29 | 河北医科大学第三医院 | 一种利用CRISPR-Cas9条件性敲除肝脏HO-1基因动物模型的构建方法 |
| CN111518830A (zh) * | 2020-05-07 | 2020-08-11 | 南开大学 | 基于Cre/Loxp系统的Ankle2基因敲除鼠模型的建立方法 |
| CN112980799A (zh) * | 2021-02-10 | 2021-06-18 | 南京鼓楼医院 | 一种构建klf12高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用 |
| CN113337540A (zh) * | 2021-05-13 | 2021-09-03 | 武汉大学 | 特异性敲除小鼠Treg细胞中Notch2基因的模型构建方法 |
| CN113564205A (zh) * | 2020-04-29 | 2021-10-29 | 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 | 一种平衡染色体动物模型的构建方法 |
| CN113678789A (zh) * | 2021-08-26 | 2021-11-23 | 嘉兴学院 | Mir-379/410基因簇敲除的小鼠模型及其构建方法 |
| CN113801893A (zh) * | 2020-06-12 | 2021-12-17 | 华东师范大学 | 一种Psme3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用 |
| CN114150023A (zh) * | 2021-09-15 | 2022-03-08 | 中南大学湘雅医院 | 内皮细胞特异性pfn1基因敲除小鼠模型的构建方法 |
| CN114410629A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-04-29 | 南方医科大学珠江医院 | 巨核细胞条件性敲除tymp基因小鼠模型的构建方法及其应用 |
| CN114982718A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-02 | 滨州医学院 | 一种基因缺陷导致的小鼠全身性肥胖模型及其构建方法 |
| CN116064667A (zh) * | 2022-12-09 | 2023-05-05 | 中南大学湘雅医院 | 基于CRISPR/Cas9的人源化ATXN3基因敲入小鼠模型的构建方法及应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102586223A (zh) * | 2012-03-08 | 2012-07-18 | 南京大学 | 一种基于mypt1基因敲除建立新型高血压小鼠模型的方法及其用途 |
-
2016
- 2016-11-29 CN CN201611070834.5A patent/CN106755092A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102586223A (zh) * | 2012-03-08 | 2012-07-18 | 南京大学 | 一种基于mypt1基因敲除建立新型高血压小鼠模型的方法及其用途 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| YUKINO NISHIBORI等: "Glcci1 Deficiency Leads to Proteinuria", 《J AM SOC NEPHROL》 * |
| 林福玉, 杨晓: "条件基因打靶研究存在的主要问题及对策", 《遗传 HEREDITAS (BEIJING)》 * |
| 程布凯等: "黏蛋白1基因敲除小鼠模型的构建", 《中国科学:生命科学》 * |
Cited By (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107858373A (zh) * | 2017-11-16 | 2018-03-30 | 山东省千佛山医院 | 内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法 |
| CN107858373B (zh) * | 2017-11-16 | 2020-03-17 | 山东省千佛山医院 | 内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法 |
| CN109090040A (zh) * | 2018-09-18 | 2018-12-28 | 北京大学口腔医学院 | 一种制备Wnt10aflox/flox小鼠的方法及应用 |
| CN109090040B (zh) * | 2018-09-18 | 2019-09-10 | 北京大学口腔医学院 | 一种Wnt10aflox/flox小鼠模型的构建方法 |
| CN110272992A (zh) * | 2019-06-27 | 2019-09-24 | 郑湘榕 | 基于GLCCI1基因rs37972位点用于儿童哮喘病检测的试剂、试剂盒及应用 |
| CN110272991A (zh) * | 2019-06-27 | 2019-09-24 | 郑湘榕 | 基于GLCCI1基因rs37969位点用于儿童哮喘病检测的试剂、试剂盒及应用 |
| CN110499328A (zh) * | 2019-07-16 | 2019-11-26 | 江苏集萃药康生物科技有限公司 | 一种tim3人源化小鼠模型的构建方法及其应用 |
| CN110616232A (zh) * | 2019-09-23 | 2019-12-27 | 中国人民解放军陆军军医大学 | Sox30敲除和可恢复型小鼠动物模型构建方法及应用 |
| CN110777167B (zh) * | 2019-11-06 | 2021-07-06 | 广州市妇女儿童医疗中心 | 运动功能障碍表型gtpch酶缺陷病小鼠模型的构建方法 |
| CN110777167A (zh) * | 2019-11-06 | 2020-02-11 | 广州市妇女儿童医疗中心 | 运动功能障碍表型gtpch酶缺陷病小鼠模型的构建方法 |
| CN110804629A (zh) * | 2019-11-15 | 2020-02-18 | 西安医学院 | PirB基因敲除小鼠动物模型及其构建方法 |
| CN111206054A (zh) * | 2020-02-14 | 2020-05-29 | 河北医科大学第三医院 | 一种利用CRISPR-Cas9条件性敲除肝脏HO-1基因动物模型的构建方法 |
| CN111206054B (zh) * | 2020-02-14 | 2022-12-30 | 河北医科大学第三医院 | 一种利用CRISPR-Cas9条件性敲除肝脏HO-1基因动物模型的构建方法 |
| CN113564205A (zh) * | 2020-04-29 | 2021-10-29 | 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 | 一种平衡染色体动物模型的构建方法 |
| CN113564205B (zh) * | 2020-04-29 | 2023-08-11 | 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 | 一种平衡染色体动物模型的构建方法 |
| CN111518830A (zh) * | 2020-05-07 | 2020-08-11 | 南开大学 | 基于Cre/Loxp系统的Ankle2基因敲除鼠模型的建立方法 |
| CN113801893A (zh) * | 2020-06-12 | 2021-12-17 | 华东师范大学 | 一种Psme3条件性基因敲除小鼠模型的构建方法及其应用 |
| CN112980799A (zh) * | 2021-02-10 | 2021-06-18 | 南京鼓楼医院 | 一种构建klf12高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用 |
| CN112980799B (zh) * | 2021-02-10 | 2022-12-27 | 南京鼓楼医院 | 一种构建klf12高表达小鼠的方法及在构建非叶酸依赖的神经管缺陷小鼠模型的应用 |
| CN113337540A (zh) * | 2021-05-13 | 2021-09-03 | 武汉大学 | 特异性敲除小鼠Treg细胞中Notch2基因的模型构建方法 |
| CN113337540B (zh) * | 2021-05-13 | 2022-06-14 | 武汉大学 | 特异性敲除小鼠Treg细胞中Notch2基因的模型构建方法 |
| CN113678789A (zh) * | 2021-08-26 | 2021-11-23 | 嘉兴学院 | Mir-379/410基因簇敲除的小鼠模型及其构建方法 |
| CN114150023A (zh) * | 2021-09-15 | 2022-03-08 | 中南大学湘雅医院 | 内皮细胞特异性pfn1基因敲除小鼠模型的构建方法 |
| CN114150023B (zh) * | 2021-09-15 | 2023-07-04 | 中南大学湘雅医院 | 内皮细胞特异性pfn1基因敲除小鼠模型的构建方法 |
| CN114410629A (zh) * | 2022-01-05 | 2022-04-29 | 南方医科大学珠江医院 | 巨核细胞条件性敲除tymp基因小鼠模型的构建方法及其应用 |
| CN114982718A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-09-02 | 滨州医学院 | 一种基因缺陷导致的小鼠全身性肥胖模型及其构建方法 |
| CN114982718B (zh) * | 2022-06-30 | 2023-07-21 | 滨州医学院 | 一种基因缺陷导致的小鼠全身性肥胖模型及其构建方法 |
| CN116064667A (zh) * | 2022-12-09 | 2023-05-05 | 中南大学湘雅医院 | 基于CRISPR/Cas9的人源化ATXN3基因敲入小鼠模型的构建方法及应用 |
| CN116064667B (zh) * | 2022-12-09 | 2024-07-02 | 中南大学湘雅医院 | 基于CRISPR/Cas9的人源化ATXN3基因敲入小鼠模型的构建方法及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN106755092A (zh) | GLCCI1基因基于Cre‑LoxP条件性基因敲除小鼠模型构建试剂盒及构建方法 | |
| US20020025561A1 (en) | Vectors for gene-self-assembly | |
| CN113549618B (zh) | 基于RAA扩增和CRISPR-Cas13a系统的SARS-CoV-2核酸检测方法 | |
| CN108395996B (zh) | 一种猪瘟病毒亚单位疫苗及其制备方法和用途 | |
| CN108531471B (zh) | 一种长基因合成方法 | |
| CN113481327A (zh) | 基于RAA扩增和CRISPR-Cas12a的新型冠状病毒ORF1ab基因检测方法 | |
| CN108285886A (zh) | 重组枯草芽孢杆菌全细胞转化生产n-乙酰神经氨酸的方法 | |
| CN110129354A (zh) | 一种n-乙酰神经氨酸的特异性生物传感器及其应用 | |
| CN104651402B (zh) | 通用型基因打靶载体 | |
| CN113355323B (zh) | 人源化ace2基因改造小鼠模型的制备方法及应用 | |
| CN112626116B (zh) | 定点整合大片段外源dna的方法 | |
| CN114933970B (zh) | 缺失6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶1基因的弓形虫基因敲除虫株 | |
| CN113355325B (zh) | 人源化ace2基因改造小鼠胚胎干细胞模型制备方法及应用 | |
| CN111321163B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌线性质粒系统的构建与应用 | |
| CN109652352A (zh) | 一株用于屎肠球菌谷氨酸脱羧酶高效固定化的基因工程菌及固定化方法 | |
| CN107661496A (zh) | 一种猪细小病毒免疫组合物及其制备方法与应用 | |
| KR102624831B1 (ko) | 근육 특이적 pck1 과발현 형질전환 개 생산 | |
| CN112322706A (zh) | 一种特异性人源基因片段及其引物探针和应用 | |
| CN114292864A (zh) | 高产表面活性素的贝莱斯芽孢杆菌突变株及其构建方法和应用 | |
| JP3688118B2 (ja) | 遺伝子トラップ用ベクターと、このベクターを用いた遺伝子トラップ方法 | |
| CN115216492B (zh) | 一种小鼠原发神经胶质瘤模型的制备方法及其应用 | |
| CN113584223A (zh) | 基于CRISPR-Cas12a的SARS-CoV-2中D614G突变鉴定方法 | |
| CN113718047B (zh) | 荧光定量方法检测人母乳内10属细菌的试剂盒及其应用 | |
| CN103952442A (zh) | Cre重组酶调控的非免疫耐受型OVA-HBsAg转基因小鼠的构建方法 | |
| AU2020102457A4 (en) | Recombinant plasmid pmdmcherry, construction method of recombinant plasmid pmdmcherry, and method for labeling edwardsiella ictaluri by mcheey fluorescent protein genes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20170531 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |