CN112301059A - 一种基于复制缺陷性重组慢病毒的car-nk转基因载体及其构建方法和应用 - Google Patents

一种基于复制缺陷性重组慢病毒的car-nk转基因载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR‑NK转基因载体及其构建方法和应用，重组慢病毒的CAR‑NK转基因载体包括原核复制子pUC Ori序列；含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列；病毒复制子SV40Ori序列；慢病毒包装顺式元件；RSV启动子；T2A“自我剪切”肽序列；嘌呤霉素抗性基因Puro序列；人泛素C启动子；多克隆位点MCS序列；用于增强转基因的表达效率的WPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒载体。将上述载体转染NK92细胞，对肿瘤细胞实现杀伤作用，能够产生良好的治疗效果，在CAR‑NK治疗领域拥有广阔的应用前景。

Description

一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体及其构 建方法和应用
【技术领域】
本发明涉及医学生物的技术领域，特别是一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体及其构建方法和应用。
【背景技术】
近年来，肿瘤治疗领域中，免疫治疗越来越受到重视，和现有的手术、放疗、化疗、靶向治疗相比，具有自身不可替代的优势和发展潜力，因此，被称为肿瘤治疗的第五大技术。肿瘤的过继免疫治疗是指将体外激活的自体或异体免疫效应细胞输注给患者，以杀伤患者体内的肿瘤细胞。肿瘤过继性免疫治疗中的一个关键问题是寻找合适的肿瘤杀伤细胞。自上世纪80年代以来，包括LAK、细胞因诱导的杀伤细胞(cytokine-indμcedkillers，CIK)、TIL等细胞已先后应用于临床，但由于存在着扩增倍速较低、细胞来源困难、细胞毒力不高等诸多问题，在临床应用上受到限制。如何提高T细胞的肿瘤抗原特异性具有重要的临床意义。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)T细胞技术是近年来发展非常迅速的一种细胞治疗技术。通过基因改造技术，效应T细胞的靶向性、杀伤活性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并可克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态。目前，CAR的信号域已从第一代的单一信号分子发展为包含CD28、4-1BB等共刺激分子的多信号结构域(第二、三代)，临床应用广泛。目前，大多数嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptor，CAR)由胞外抗原结合区(由来源于单克隆抗体的轻链(VL)和重链(VH)组成，中间由带韧性的铰链区连接形成单链抗体(single chain fragment variable，scFv)、跨膜区域和胞内信号转导区组成。然而，CAR-T细胞被引入体内仍然存在预期和意外的毒性。这些毒性包括细胞因子释放综合征，神经毒性，靶向/肿瘤外识别，插入突变和过敏反应等。
NK细胞因其特殊的识别靶细胞的机制、短暂的生理周期、广泛的肿瘤杀伤能力等优势，被视为同样有潜力通过CAR修饰增强其抗肿瘤能力的效应细胞。NK细胞是一类对肿瘤细胞具有强力杀伤作用且MHC非依赖的淋巴细胞，其对肿瘤细胞的识别主要依赖于其表面活化性受体和抑制性受体的相互交叉调控。当识别肿瘤细胞之后，NK细胞通过释放杀伤介质穿孔素和颗粒酶使靶细胞凋亡、表达膜TNF家族分子诱导靶细胞凋亡和抗体依赖的细胞毒作用等多种途径杀伤肿瘤细胞。但是由于肿瘤患者体内NK细胞数量、质量的下降和肿瘤逃逸机制的存在，其在体内的抗肿瘤功能未能得到充分发挥。通过CAR修饰NK细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力并研制出具有强大抗肿瘤作用的效应细胞。与CAR-T相比，CAR-NK细胞有几个优势。首先，与CAR-T细胞不同，CAR-NK细胞依然保留了NK细胞原本就具有的识别和杀伤肿瘤细胞的能力，让肿瘤细胞无法通过降低自身CAR目标抗原的表达而最终逃逸；再者，NK细胞引起的细胞因子分泌水平则明显弱于T细胞，从而减少CAR-T疗法中存在的诸如细胞因子释放综合症(cytokine release syndrome)之类的副作用，圣地亚哥研究团队的最新发表于Cell Stem Cell杂志上的研究成果已证实Car-NK对肿瘤的杀伤能力与Car-T相似，但带来的副作用明显比后者轻微；最后，NK细胞不需要严格的HLA配型，不会发生外源NK细胞对抗其宿主——肿瘤病人的情况(graft-versus-host disease)，而这在CAR-T细胞免疫疗法中风险较大，这也让CAR-NK细胞免疫疗法可以使用大量现成的异体NK细胞进行CAR遗传修饰，避开了CAR-T细胞来源限制的瓶颈。因此，NK细胞被认为是更具有应用前景导向的抗肿瘤免疫效应细胞。
在嵌合抗原受体修饰免疫细胞技术的实施中，最为关键的是慢病毒载体的构建。慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)来源的一种病毒载体，慢病毒载体包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息，是慢病毒载体系统的主要组成部分。携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，通过感染细胞或活体组织，实现外源基因在细胞或活体组织中表达。慢病毒颗粒的感染谱系广，不仅可以高效感染分裂期细胞，而且可以感染非分裂期细胞，还可以高效感染质粒难转染的原代细胞和胚胎干细胞，因此越来越多的研究人员开始用慢病毒载体技术转导目的片段进入细胞或者组织。鉴于其具有携带的外源基因在宿主中表达时间长、毒性低、可携带的外源基因片段大、不易诱发宿主免疫反应等优点，现已成为理想的基因转移载体，广泛应用于基因治疗、疫苗生产、转基因动物、基因敲除、药物研究、生产目的蛋白细胞系等科学研究领域。尽管慢病毒载体的研究有了很大进展，但满足临床应用需要还有很多不足。例如，重组病毒的滴度还不够高，造成重组病毒滴度低的主要原因之一是慢病毒载体偏大，较大的载体会直接影响到病毒的滴度和免疫细胞的感染效率。为此，设计、构建、使用合适大小的高效表达的慢病毒载体是嵌合抗原受体修饰免疫细胞应用中的关键环节，已成为制约CAR技术研究和应用的主要瓶颈之一。
【发明内容】
本发明的目的就是解决现有技术中的问题，提出一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体及其构建方法和应用。
为实现上述目的，本发明提出了一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体，包括用于质粒复制的原核复制子pUC Ori序列，如SEQ ID NO.1所示；用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQ ID NO.2所示；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40Ori序列，如SEQ ID NO.3所示；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；用于起始慢病毒mRNA的转录的RSV启动子，如SEQ ID NO.4所示；用于连接共同转录表达蛋白质的T2A“自我剪切”肽序列，如SEQ ID NO.5所示；用于真核细胞筛选的嘌呤霉素抗性基因Puro序列，如SEQ ID NO.6所示；用于嵌合抗原受体基因的真核转录的人泛素C启动子，如SEQ ID NO.7所示；用于酶切载入嵌合抗原受体表达序列的多克隆位点MCS序列，如SEQID NO.8所示；用于增强转基因的表达效率的WPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，如SEQ ID NO.9所示。
作为优选，所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒载体。
作为优选，所述慢病毒包装顺式元件包括：如SEQ ID NO.10所示的慢病毒5terminal truncated LTR、如SEQ ID NO.11所示的慢病毒3terminal truncated LTR、如SEQ ID NO.12所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO.13所示的env顺式元件、如SEQ ID NO.14所示的cPPT顺式元件。
作为优选，CAR-NK转基因载体还包括用于组成集识别、传递、启动于一体的嵌合抗原受体。
所述嵌合抗原受体包括：用于识别肿瘤细胞的胞外识别区，如SEQ ID NO.15所示的识别Mesothelin单链抗体；如SEQ ID NO.16所示的NKG2D Transmembrane嵌合受体跨膜区；如SEQ ID NO.17所示的2B4嵌合受体共刺激因子；如SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.20所示的CD3或CD16嵌合受体激活域。
作为优选，所述胞外识别区选自CD19、CD20、CD22、CD33、CD112R8、BCMA、CD38、NKG2D、ROR1、Mesothelin、c-Met、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、PDGFR、GPC3、PSCA、EpCAM、PSMA、EGFRvIII、GD-2中的一种或任意多种的组合。
本发明所采用的载体骨架为第三代慢病毒载体，包括来自于Rous Sarcoma Virus的转录增强子和启动子(RSV enhancer/promoter)元件来起始慢病毒mRNA的转录；插入来自于HIV-1的截短5‘长重复序列(HIV-1truncated 5′LTR)来介导病毒包装和病毒基因组的反转录及病毒包装信号HIV-1psi(ψ)；这样就消除了转录时对Tat蛋白的依赖，既可以在慢病毒的结构基因里去除Tat序列，也提高了慢病毒基因组转录水平和转录持续性。载体还插入了HIV-1Rev response element(RRE)，该元件允许Rev辅助的未剪接病毒mRNA出核；3terminal truncated LTR去除了U3区域，消除了慢病毒载体自我复制的可能性，大大提高了安全性；增加了cPPT和WPRE元件，提高了转导效率和转基因的表达效率；采用人自身的泛素C启动子，使CAR基因能够在人体内长时间持续表达，并且避免强启动子表达导致的潜在蛋白合成异常。用于肿瘤治疗的嵌合抗原受体编码序列插入多克隆位点区。与puromycin抗性基因编码序列经T2A翻译后切割位点串联，在泛素C启动子控制下表达。表达的串联蛋白会剪接分割为嵌合抗原受体和puromycin抗性蛋白，分别发挥生物活性。
本发明还提出了一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体的构建方法，包括以下步骤：
S1.将含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列(如SEQ ID NO.2所示)、原核复制子pUCOri序列(如SEQ ID NO.1所示)、病毒复制子SV40Ori序列(如SEQ ID NO.3所示)、用于起始慢病毒mRNA的转录的RSV启动子(如SEQ ID NO.4所示)、用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件、T2A“自我剪切”肽序列序列(如SEQ ID NO.5所示)、WPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件(如SEQ ID NO.9所示)、人泛素C启动子(如SEQ ID NO.7所示)、嘌呤霉素抗性基因Puro序列(如SEQ ID NO.6所示)存储于慢病毒骨架质粒上；
S2.将嵌合抗原受体经过酶切、连接、重组反应克隆至慢病毒骨架质粒中，得到表达CAR的重组慢病毒质粒；
S3.将得到的重组慢病毒质粒与慢病毒包装质粒共同转染HEK293T细胞，在HEK293T细胞中进行基因转录表达后，包装成功重组慢病毒载体会释放到细胞培养上清中，收集包含的重组慢病毒载体的上清液，通过纯化浓缩重组慢病毒载体。
作为优选，在步骤S1中，慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒载体，包括：如SEQID NO.10所示的慢病毒5terminal truncated LTR、如SEQ ID NO.11所示的慢病毒3terminal truncated LTR、如SEQ ID NO.12所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO.13所示的env顺式元件、如SEQ ID NO.14所示的cPPT顺式元件。
作为优选，在步骤S2中，用于组成集识别、传递、启动于一体的嵌合抗原受体包括用于识别肿瘤细胞的胞外识别区，如SEQ ID NO.15所示的识别Mesothelin单链抗体；如SEQID NO.16所示的NKG2D Transmembrane嵌合受体跨膜区；如SEQ ID NO.17所示的2B4嵌合受体共刺激因子、如SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.19所示的CD3或CD16嵌合受体激活域。其中胞外识别区可以为选自CD19、CD20、CD22、CD33、CD112R8、BCMA、CD38、NKG2D、ROR1、Mesothelin、c-Met、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、PDGFR、GPC3、PSCA、EpCAM、PSMA、EGFRvIII、GD-2或其任意组合。
在步骤S2中，由人泛素C启动子启动整个CAR基因表达；单链抗体(scfv)区用于识别肿瘤细胞表面抗原，NKG2D Transmembrane嵌合受体跨膜区用于将整个嵌合受体固定于细胞膜上；2B4嵌合受体共刺激因子用于刺激NK细胞增殖和细胞因子分泌；CD3或CD16嵌合受体激活域用于激活下游信号通路的表达；当scfv区域与肿瘤细胞表面抗原结合时，信号通过嵌合受体传递至细胞内，从而产生NK细胞增殖、细胞因子分泌增加、抗细胞凋亡蛋白分泌增加、细胞死亡延迟、裂解靶细胞等一系列生物学效应。
本发明还提出了一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体的应用，将上述载体转染NK92细胞(优选人自然杀伤细胞)后，对肿瘤细胞实现杀伤作用，能够产生良好的治疗效果。因此本发明所提供的载体在CAR-NK治疗领域拥有广阔的应用前景。
本发明的特征及优点将通过实施例结合附图进行详细说明。
【附图说明】
图1是本发明中慢病毒骨架质粒plenti的载体结构示意图；
图2是本发明含有嵌合抗原受体结构的重组慢病毒质粒plenti-CAR4的载体结构示意图；
图3是本发明实施例1中慢病毒骨架质粒plenti的酶切预测(A图)及酶切琼脂糖凝胶电泳图(B图)；
图4是本发明实施例1中慢病毒重组质粒plenti-CAR4的酶切预测(A图)及酶切琼脂糖凝胶电泳图(B图)；
图5是本发明实施例1中慢病毒重组质粒plenti-CAR4及慢病毒骨架质粒plenti转染293T细胞后包膜表面嵌合抗原受体表达的WB检测情况；
图6是本发明实施例1中慢病毒重组质粒plenti-CAR4感染NK92细胞后检测慢病毒整合表达嵌合抗原受体情况的荧光定量PCR熔解曲线；图中横坐标为温度，纵坐标为荧光信号强度；
图7是本发明实施例1中慢病毒重组质粒plenti-CAR4感染NK92细胞后检测慢病毒整合表达嵌合抗原受体情况度的荧光定量PCR扩增曲线；图中横坐标为PCR循环数，纵坐标为荧光信号强度；
图8是本发明施例1中慢病毒重组质粒plenti-CAR4修饰的NK细胞对卵巢癌细胞SKOV3细胞的杀伤作用，其中Mock是对照组；图中横坐标为效靶比，纵坐标为杀伤细胞百分比；
图9是本发明施例1中慢病毒重组质粒plenti-CAR4修饰的NK细胞对血液系统肿瘤K562细胞的杀伤作用，其中Mock是对照组；图中横坐标为效靶比，纵坐标为杀伤细胞百分比；
图10是本发明实施例1中慢病毒重组质粒plenti-CAR4感染NK92细胞后检测慢病毒整合表达嵌合抗原受体情况的扩增程序。
【具体实施方式】
以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
构建重组慢病毒载体
将Mesothelin单链抗体、NKG2D Transmembrane嵌合受体跨膜区、2B4嵌合受体共刺激因子、嵌合受体激活域片段克隆至慢病毒骨架质粒plenti(plenti大小是7050bp，载体序列见SEQ ID NO.20，载体图谱见附图1)，得到重组慢病毒质粒plenti-CAR4(载体图谱见附图2)。
(1)将慢病毒骨架质粒plenti使用Xba I和BamH I限制性内切酶进行双酶切，产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认7002bp的片段V(如图3所示)，并割胶回收置于Eppendorf管内，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(步骤如表1)，并测定产物的纯度和浓度；
表1琼脂糖凝胶回收步骤
Figure BDA0002696111530000091
(2)用Mesothelin引物以合成的SEQ ID NO.15为模板，使用表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认723bp的片段a，并割胶回收置于Eppendorf管内，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；
表2 50μl PCR反应体系
试剂 体积(μl)
H<sub>2</sub>O 32.5
5×buffer 10
dNTP 4
Primer-F 1
Primer-R 1
Template 1
PrimeSTAR 0.5
(3)用NKG2D引物以合成的SEQ ID NO.16为模板，使用表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认63bp的片段b，并割胶回收置于Eppendorf管内，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；
(4)用2B4引物以合成的SEQ ID NO.17为模板，使用表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认360bp的片段c，并割胶回收置于Eppendorf管内，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；
(5)用CD3引物以合成的SEQ ID NO.18为模板，使用表2中的体系，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，55℃15sec，72℃2min)*35cycle，72℃10min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认342bp的片段d，并割胶回收置于Eppendorf管内，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；
(6)将DNA片段a、b、c、d各1μl作为模板，使用表3中的体系，除引物外加入Eppendorf管内，PCR循环条件为：98℃3min，(98℃10sec，60℃10sec，72℃30sec)*6cycle，加入引物Mesothelin-F/CD3-R,(98℃10sec，60℃10sec，72℃30sec)*24cycle，72℃，5min。产物经过1.5％的琼脂糖凝胶电泳，确认2131bp的片段e，并割胶回收置于Eppendorf管内，用MN公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒回收相应的片段(见表1)，并测定产物的纯度和浓度；
表3 50μl重叠PCR反应体系
Figure BDA0002696111530000101
Figure BDA0002696111530000111
(7)将DNA片段V、e以5μl总体积且摩尔比1:1的比例加入Eppendorf管内，加入同源重组酶反应液15μl，混匀后在42℃孵育30分钟，转移至冰上放置2-3分钟，将反应液加入50μl TOP10感受态细胞中(感受态细胞应刚从-70℃冰箱取出放于冰浴上，待刚刚解冻时加入连接产物，连接产物的加入量不超过感受态细胞体积的十分之一)，轻轻旋转以混匀内容物，在冰中放置30分钟，将管放到预加温到42℃的恒温水浴锅中热激90秒，快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却2-3分钟，每管加900μl LB培养液，然后将管转移到37℃摇床上，温育1小时使细菌复苏，取100μl的转化菌液涂布于Amp LB琼脂平板上，倒置平皿，于恒温培养箱中37℃培养，16小时。挑取克隆进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的克隆即为重组慢病毒质粒plenti-CAR4，对正确的克隆进行酶切鉴定(见图4)。
嵌合抗原受体表达鉴定
采用大提试剂盒(天根生物)提取plenti-CAR4载体，并将质粒用PI转染试剂转染到人胚肾细胞293T中，24h后，用PBS洗涤一遍，加入RIPA细胞裂解液(已加Roche的蛋白酶抑制剂Cocktail Tablets)，提取转染后293T细胞的膜蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，半干转膜，用鼠抗人CD3ζ抗体4℃过夜孵育，然后用辣根过氧酶标记的抗小鼠的二抗37℃孵育lh，最后在膜上加上ECL显色液进行显色。结果用鼠抗人CD3ζ抗体能检测到多肽分子的表达，蛋白大小与理论的多肽蛋白一致，均为78kD(见图5)。
嵌合抗原受体修饰NK细胞的制备
1、表达肿瘤嵌合抗原受体慢病毒的包装制备
用AXYGEN质粒大提试剂盒提取慢病毒的包装载体pspax和PMD2G质粒与plenti-CAR4载体共转染到293FΤ细胞中，转染后48h收集细胞上清，使用0.45um滤器过滤细胞上清，按体积加入5×PEG8000溶液，每20-30min混合一次，共进行3-5次，4℃放置6h或者过夜。4℃，4000g离心20min吸弃上清，静置管子1-2min，吸走残余液体。加入适量的病毒溶解液溶解病毒沉淀并测量病毒滴度。将病毒液分成25ul每管，放入-80℃冰箱冻存。
2、肿瘤嵌合抗原受体修饰NK细胞(CAR-NK细胞)制备
将NK92细胞按每孔约1X106ml密度，加入20ul病毒，37℃培养过夜后换液，加入培养基继续培养3天，从而获得表达plenti-CAR4细胞即CAR-NK细胞。
3、荧光定量PCR法检测NK92细胞中嵌合抗原受体表达情况
DNA提取(组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒，博迈德生物技术有限公司)，参照说明书，收集CAR-NK细胞到1.5ml离心管中，13000rpm离心10秒，使细胞沉淀下来，弃去上清，加200μ11X PBS重悬洗涤，13000rpm离心10秒，弃上清，180μ11X PBS重悬，加入4μ1RNaSeA(10mg/ml)溶液，振荡15秒，室温静置5min，再加入20μ1蛋白酶k(20mg/ml)溶液充分混匀，然后加入200μ1结合液CB，立即涡旋振荡混匀，在70℃放置10分钟，冷却后加100μl异丙醇，立即涡旋振荡混匀，将混合物加入吸附柱AC中，吸附柱放入收集管中，13000rpm离心60秒，倒掉收集管废液，加入500μ1抑制物去除液IR，12000rpm离心30秒，弃废液，再加入500μl漂洗液WB，12000rpm离心30秒，洗2次，再将吸附柱放回空收集管，13000rpm离心2分钟，尽量去除漂洗液，取出吸附柱AC，放入干净离心管中，在吸附膜中间部位加入100μl洗脱缓冲液EB(先70℃水浴中预热)，室温放置3-5分钟，12000rpm离心1分钟，将所得液体再加入吸附柱中，室温放置2分钟，12000rpm离心1分钟，收DNA。荧光定量PCR采用TAkara公司Lenti-XTMProvirus Quantitation Kit试剂盒进行检测，实验操作按产品说明书进行，反应体系为：
试剂 体积(μl)
PCR-grade H<sub>2</sub>O 9.0
Lenti-X Provirus Forward Primer(10μM) 0.5
Lenti-X Provirus Reverse Primer(10μM) 0.5
ROX Reference Dye LSR or LMP(50X)<sup>*</sup> 0.5
SYBR Advantage qPCR Premix(2X) 12.5
Total(μl/well) 23.0
扩增程序如附图10所示，熔解曲线如附图6所示，扩增曲线如附图7所示。
根据标准曲线样品计算NK92细胞中经慢病毒整合表达的嵌合抗原受体为19copies/cell。
肿瘤嵌合抗原受体修饰的NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用
1、CAR-NK细胞对肿瘤细胞杀伤力检测
将卵巢癌细胞SKOV3以及人慢性髓系白血病细胞K562用培养基调整到1X10^6/ml，加入终浓度为5ug/ml Calcein-AM进行标记，37℃孵育1h，用PBS洗涤三遍后，用无酚红1640完全培养基重悬细胞，计数。调整肿瘤细胞10000/孔加入到96孔圆底板中。按E:T为10:1；5:1；2.5:1；1.25:1；0.625:1；0.0325:1分别加入NK细胞与CAR-NK细胞1X105；5X104；2.5X104；1.25X104；0.625X104；0.0325X104。肿瘤细胞再加一组2％Triton X-100及不处理组，100g离心5分钟，37℃共培养3h后，300g离心5分钟，每孔吸取100ul转移至96平底板中检测OD值。检测结果(如图8)表明CAR-NK细胞对卵巢癌细胞SKOV3细胞杀伤力显著高于普通NK细胞。而在人慢性髓系白血病细胞K562中，检测结果(如图9所示)CAR-NK细胞的杀伤力与NK没有显著差异。
序列表如下：
SEQ ID NO.1
Figure BDA0002696111530000131
Figure BDA0002696111530000141
SEQ ID NO.2
Figure BDA0002696111530000142
SEQ ID NO.3
Figure BDA0002696111530000143
SEQ ID NO.4
Figure BDA0002696111530000144
SEQ ID NO.5
Figure BDA0002696111530000145
SEQ ID NO.6
Figure BDA0002696111530000146
Figure BDA0002696111530000151
SEQ ID NO.7
Figure BDA0002696111530000152
SEQ ID NO.8
Figure BDA0002696111530000153
SEQ ID NO.9
Figure BDA0002696111530000154
SEQ ID NO.10
Figure BDA0002696111530000155
SEQ ID NO.11
Figure BDA0002696111530000156
SEQ ID NO.12
Figure BDA0002696111530000157
Figure BDA0002696111530000161
SEQ ID NO.13
Figure BDA0002696111530000162
SEQ ID NO.14
Figure BDA0002696111530000163
SEQ ID NO.15
Figure BDA0002696111530000164
SEQ ID NO.16
Figure BDA0002696111530000165
SEQ ID NO.17
Figure BDA0002696111530000166
SEQ ID NO.18
Figure BDA0002696111530000167
SEQ ID NO.19
Figure BDA0002696111530000171
SEQ ID NO.20
Figure BDA0002696111530000172
Figure BDA0002696111530000181
Figure BDA0002696111530000191
上述实施例是对本发明的说明，不是对本发明的限定，任何对本发明简单变换后的方案均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州美中疾病基因研究院有限公司
<120> 一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体及其构建方法和应用
<130> 2020
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 13024
<212> DNA
<213> 转基因（CAR-NK）
<400> 1
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 60
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 120
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 180
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 240
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 300
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 360
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 420
taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 480
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 540
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaat taccaatgct 600
taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac 660
tccccgtcgt gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa 720
tgataccgcg agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg 780
gaagggccga gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt 840
gttgccggga agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca 900
ttgctacagg catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt 960
cccaacgatc aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct 1020
tcggtcctcc gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg 1080
cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg 1140
agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg 1200
cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa 1260
aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt 1320
aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt 1380
gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt 1440
gaatactcat atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg 1500
actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa 1560
gtagtgagga ggcttttttg gaggcctgta gtcttatgca atactcttgt agtcttgcaa 1620
catggtaacg atgagttagc aacatgcctt acaaggagag aaaaagcacc gtgcatgccg 1680
attggtggaa gtaaggtggt acgatcgtgc cttattagga aggcaacaga cgggtctgac 1740
atggattgga cgaaccactg aattgccgca ttgcagagat attgtattta agtgcctagc 1800
tcgatacata aacgagggca gaggaagcct tctaacatgc ggtgacgtgg aggagaatcc 1860
cggccctatg accgagtaca agcccacggt gcgcctcgcc acccgcgacg acgtccccag 1920
ggccgtacgc accctcgccg ccgcgttcgc cgactacccc gccacgcgcc acaccgtcga 1980
tccggaccgc cacatcgagc gggtcaccga gctgcaagaa ctcttcctca cgcgcgtcgg 2040
gctcgacatc ggcaaggtgt gggtcgcgga cgacggcgcc gcggtggcgg tctggaccac 2100
gccggagagc gtcgaagcgg gggcggtgtt cgccgagatc ggcccgcgca tggccgagtt 2160
gagcggttcc cggctggccg cgcagcaaca gatggaaggc ctcctggcgc cgcaccggcc 2220
caaggagccc gcgtggttcc tggccaccgt cggcgtctcg cccgaccacc agggcaaggg 2280
tctgggcagc gccgtcgtgc tccccggagt ggaggcggcc gagcgcgccg gggtgcccgc 2340
cttcctggag acctccgcgc cccgcaacct ccccttctac gagcggctcg gcttcaccgt 2400
caccgccgac gtcgaggtgc ccgaaggacc gcgcacctgg tgcatgaccc gcaagcccgg 2460
tgcctgaggc ctccgcgccg ggttttggcg cctcccgcgg gcgcccccct cctcacggcg 2520
agcgctgcca cgtcagacga agggcgcagc gagcgtcctg atccttccgc ccggacgctc 2580
aggacagcgg cccgctgctc ataagactcg gccttagaac cccagtatca gcagaaggac 2640
attttaggac gggacttggg tgactctagg gcactggttt tctttccaga gagcggaaca 2700
ggcgaggaaa agtagtccct tctcggcgat tctgcggagg gatctccgtg gggcggtgaa 2760
cgccgatgat tatataagga cgcgccgggt gtggcacagc tagttccgtc gcagccggga 2820
tttgggtcgc ggttcttgtt tgtggatcgc tgtgatcgtc acttggtcta gacggaattc 2880
cgcggccgct cgaggctagc ttaattaacc caccggatcc aatcaacctc tggattacaa 2940
aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata 3000
cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc 3060
cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg 3120
tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac 3180
ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat 3240
cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt 3300
ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat 3360
tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc 3420
ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctc cgccttcgcc ctcagacgag 3480
tcggatctct ctttgggccg cctccccgcg ggtctctctg gttagaccag atctgagcct 3540
gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc ttgccttgag 3600
tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga tccctcagac 3660
ccttttagtc agtgtggaaa atctctagca tggaagggct aattcactcc caacgaagat 3720
aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga gcctgggagc 3780
tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc 3840
aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc agaccctttt 3900
agtcagtgtg gaaaatctct agcaaggagc tttgttcctt gggttcttgg gagcagcagg 3960
aagcactatg ggcgcagcgt caatgacgct gacggtacag gccagacaat tattgtctgg 4020
tatagtgcag cagcagaaca atttgctgag ggctattgag gcgcaacagc atctgttgca 4080
actcacagtc tggggcatca agcagctcca ggcaagaatc ctggctgtgg aaagatacct 4140
aaaggatcaa cagctcctct ctctcgacgc aggactcggc ttgctgaagc gcgcacggca 4200
agaggcgagg ggcggcgact ggtgagtacg ccaaaaattt tgactagcgg aggctagaag 4260
gagagagatg ggtgcgagag cgtcttttaa aagaaaaggg gggattgggg ggtacagtgc 4320
aggggaaaga atagtagaca taatagcaac agacatacaa actaaagaat tacaaaaaca 4380
aattacaaaa attcaaaatt ttatgcaggt acaactgcag cagtctgggc ctgagctgga 4440
gaagcctggc gcttcagtga agatatcctg caaggcttct ggttactcat tcactggcta 4500
caccatgaac tgggtgaagc agagccatgg aaagagcctt gagtggattg gacttattac 4560
tccttacaat ggtgcttcta gctacaacca gaagttcagg ggcaaggcca cattaactgt 4620
agacaagtca tccagcacag cctacatgga cctcctcagt ctgacatctg aagactctgc 4680
agtctatttc tgtgcaaggg ggggttacga cgggaggggt tttgactact ggggccaagg 4740
gaccacggtc accgtctcct caggtgtagg cggttcaggc ggcggtggct ctggcggtgg 4800
cggatcggac atcgagctca ctcagtctcc agcaatcatg tctgcatctc caggggagaa 4860
ggtcaccatg acctgcagtg ccagctcaag tgtaagttac atgcactggt accagcagaa 4920
gtcaggcacc tcccccaaaa gatggattta tgacacatcc aaactggctt ctggagtccc 4980
aggtcgcttc agtggcagtg ggtctggaaa ctcttactct ctcacaatca gcagcgtgga 5040
ggctgaagat gatgcaactt attactgcca gcagtggagt ggttaccctc tcacgttcgg 5100
tgctgggaca aagttggaaa taaaaccatt ttttttctgc tgcttcatcg ctgtagccat 5160
gggaatccgt ttcattatta tggtaacatg gaggagaaag aggaaggaga agcagtcaga 5220
gaccagtccc aaggaatttt tgacaattta cgaagatgtc aaggatctga aaaccaggag 5280
aaatcacgag caggagcaga cttttcctgg aggggggagc accatctact ctatgatcca 5340
gtcccagtct tctgctccca cgtcacaaga acctgcatac acattgtatt cattgattca 5400
gccttccagg aagtctggtt ccaggaagag gaaccacagc ccttccttca atagcactat 5460
ctatgaagtg attggaaaga gtcaacctaa agcccagaac cctgctcgat tgagccgcaa 5520
agagctggag aactttgatg tttattccag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc 5580
cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga 5640
gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgcagag 5700
aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc 5760
ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta 5820
ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc 5880
ccctcgctaa tctgtgaaga caaacattcg aagctcaaca agagactgga aggaccataa 5940
atttaaatgg agaaaggacc ctcaagacaa atgaacgcgt gtagtcttat gcaatactct 6000
tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc cttacaagga gagaaaaagc 6060
accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg tgccttatta ggaaggcaac 6120
agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc gcattgcaga gatattgtat 6180
ttaagtgcct agctcgatac ataaacgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg 6240
agctctctgg ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc 6300
ttcaagtagt gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct 6360
tttagtcagt gtggaaaatc tctagcagtg gcgcccgaac agggacttga aagcgaaagg 6420
gaaaccagag gagctctctc gacgcaggac tcggcttgct gaagcgcgca cggcaagagg 6480
cgaggggcgg cgactggtga gtacgccaaa aattttgact agcggaggct agaaggagag 6540
agatgggtgc gagagcgtca gtattaagcg ggggagaatt agatcgcgat gggaaaaaat 6600
tcggttaagg ccagggggaa agaaaaaata taaattaaaa catatagtat gggcaagcag 6660
ggagctagaa cgattcgcag ttaatcctgg cctgttagaa acatcagaag gctgtagaca 6720
aatactggga cagctacaac catcccttca gacaggatca gaagaactta gatcattata 6780
taatacagta gcaaccctct attgtgtgca tcaaaggata gagataaaag acaccaagga 6840
agctttagac aagatagagg aagagcaaaa caaaagtaag accaccgcac agcaagcggc 6900
cactgatctt cagacctgga ggaggagata tgagggacaa ttggagaagt gaattatata 6960
aatataaagt agtaaaaatt gaaccattag gagtagcacc caccaaggca aagagaagag 7020
tggtgcagag agaaaaaaga gcagtgggaa taggagcttt gttccttggg ttcttgggag 7080
cagcaggaag cactatgggc gcagcgtcaa tgacgctgac ggtacaggcc agacaattat 7140
tgtctggtat agtgcagcag cagaacaatt tgctgagggc tattgaggcg caacagcatc 7200
tgttgcaact cacagtctgg ggcatcaagc agctccaggc aagaatcctg gctgtggaaa 7260
gatacctaaa ggatcaacag ctcctgggga tttggggttg ctctggaaaa ctcatttgca 7320
ccactgctgt gccttggaat gctagttgga gtaataaatc tctggaacag atttggaatc 7380
acacgacctg gatggagtgg gacagagaaa ttaacaatta cacaagctta atacactcct 7440
taattgaaga atcgcaaaac cagcaagaaa agaatgaaca agaattattg gaattagata 7500
aatgggcaag tttgtggaat tggtttaaca taacaaattg gctgtggtat ataaaattat 7560
tcataatgat agtaggaggc ttggtaggtt taagaatagt ttttgctgta ctttctatag 7620
tgaatagagt taggcaggga tattcaccat tatcgtttca gacccacctc ccaaccccga 7680
ggggacccga caggcccgaa ggaatagaag aagaaggtgg agagagagac agagacagat 7740
ccattcgatt agtgaacgga tctcgacggt atcgatcaat tttaaaagaa aaggggggat 7800
tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt agacataata gcaacagaca tacaaactaa 7860
agaattacaa aaacaaatta caaaaattca aaattttgcg gttgtgcttt ttgcgtgtaa 7920
atctcggtgg tcgccgtatc atggcttgtg cgatgcgttg gctaccggtt cttcgaaggc 7980
ctccgcgccg ggttttggcg cctcccgcgg gcgcccccct cctcacggcg agcgctgcca 8040
cgtcagacga agggcgcagc gagcgtcctg atccttccgc ccggacgctc aggacagcgg 8100
cccgctgctc ataagactcg gccttagaac cccagtatca gcagaaggac attttaggac 8160
gggacttggg tgactctagg gcactggttt tctttccaga gagcggaaca ggcgaggaaa 8220
agtagtccct tctcggcgat tctgcggagg gatctccgtg gggcggtgaa cgccgatgat 8280
tatataagga cgcgccgggt gtggcacagc tagttccgtc gcagccggga tttgggtcgc 8340
ggttcttgtt tgtggatcgc tgtgatcgtc acttggtcta gacggaattc cgcggccgct 8400
cgaggctagc ttaattaacc caccggatcc gagggcagag gaagccttct aacatgcggt 8460
gacgtggagg agaatcccgg cccttccggg atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc 8520
gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac 8580
cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa 8640
gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc 8700
gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag 8760
atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa 8820
ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc 8880
tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc agcgccgtcg tgctccccgg agtggaggcg 8940
gccgagcgcg ccggggtgcc cgccttcctg gagacctccg cgccccgcaa cctccccttc 9000
tacgagcggc tcggcttcac cgtcaccgcc gacgtcgagg tgcccgaagg accgcgcacc 9060
tggtgcatga cccgcaagcc cggtgcctga atctaggtcg acaatcaacc tctggattac 9120
aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt aactatgttg ctccttttac gctatgtgga 9180
tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct attgcttccc gtatggcttt cattttctcc 9240
tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa 9300
cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc 9360
acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc 9420
atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc 9480
gtggtgttgt cggggaaatc atcgtccttt ccttggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg 9540
attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct 9600
tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct cttccgcgtc tccgccttcg ccctcagacg 9660
agtcggatct ctctttgggc cgcctccccg cctggtacct ttaagaccaa tgacttacaa 9720
ggcagctgta gatcttagcc actttttaaa agaaaagggg ggactggaag ggctaattca 9780
ctcccaacga agataagatc tgctttttgc ttgtactggg tctctctggt tagaccagat 9840
ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc aataaagctt 9900
gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta actagagatc 9960
cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt agtagttcat gtcatcttat 10020
tattcagtat ttataacttg caaagaaatg aatatcagag agtgagagga acttgtttat 10080
tgcagcttat aatggttaca aataaagcaa tagcatcaca aatttcacaa ataaagcatt 10140
tttttcactg cattctagtt gtggtttgtc caaactcatc aatgtatctt atcatgtctg 10200
gctctagcta tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc 10260
cattctccgc cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg 10320
gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctaga cttttgcaga 10380
gaccaaattc gtaatcatgt catagctgtt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat 10440
tccacacaac atacgagccg gaagcataaa gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag 10500
ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 10560
ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc 10620
ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 10680
agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 10740
catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 10800
tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 10860
gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 10920
ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 10980
cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 11040
caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 11100
ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 11160
taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 11220
taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 11280
cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 11340
tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 11400
gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 11460
catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 11520
atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct taatcagtga 11580
ggcacctatc tcagcgatct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac tccccgtcgt 11640
gtagataact acgatacggg agggcttacc atctggcccc agtgctgcaa tgataccgcg 11700
agacccacgc tcaccggctc cagatttatc agcaataaac cagccagccg gaagggccga 11760
gcgcagaagt ggtcctgcaa ctttatccgc ctccatccag tctattaatt gttgccggga 11820
agctagagta agtagttcgc cagttaatag tttgcgcaac gttgttgcca ttgctacagg 11880
catcgtggtg tcacgctcgt cgtttggtat ggcttcattc agctccggtt cccaacgatc 11940
aaggcgagtt acatgatccc ccatgttgtg caaaaaagcg gttagctcct tcggtcctcc 12000
gatcgttgtc agaagtaagt tggccgcagt gttatcactc atggttatgg cagcactgca 12060
taattctctt actgtcatgc catccgtaag atgcttttct gtgactggtg agtactcaac 12120
caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg 12180
ggataatacc gcgccacata gcagaacttt aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc 12240
ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg 12300
tgcacccaac tgatcttcag catcttttac tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac 12360
aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat 12420
actcttcctt tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata 12480
catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa 12540
agtgccacct gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg 12600
tatcacgagg ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat 12660
gcagctcccg gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg 12720
tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga 12780
gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag 12840
aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 12900
ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt 12960
aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa 13020
gctg 13024

Claims (10)

1.一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体，其特征在于：包括用于质粒复制的原核复制子pUC Ori序列，如SEQ ID NO.1所示；用于目的菌株大量扩增的含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列，如SEQ ID NO.2所示；用于增强真核细胞内的复制的病毒复制子SV40Ori序列，如SEQ ID NO.3所示；用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件；用于起始慢病毒mRNA的转录的RSV启动子，如SEQ ID NO.4所示；用于连接共同转录表达蛋白质的T2A“自我剪切”肽序列，如SEQ ID NO.5所示；用于真核细胞筛选的嘌呤霉素抗性基因Puro序列，如SEQ ID NO.6所示；用于嵌合抗原受体基因的真核转录的人泛素C启动子，如SEQ ID NO.7所示；用于酶切载入嵌合抗原受体表达序列的多克隆位点MCS序列，如SEQ ID NO.8所示；用于增强转基因的表达效率的WPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件，如SEQ ID NO.9所示。
2.如权利要求1所述的一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体，其特征在于：所述慢病毒包装顺式元件采用第三代慢病毒载体。
3.如权利要求2所述的一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体，其特征在于：所述慢病毒包装顺式元件包括：如SEQ ID NO.10所示的慢病毒5’terminaltruncated LTR、如SEQ ID NO.11所示的慢病毒3’terminal truncated LTR、如SEQ IDNO.12所示的RRE顺式元件、如SEQ ID NO.13所示的env顺式元件、如SEQ ID NO.14所示的cPPT顺式元件。
4.如权利要求3所述的一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体，其特征在于：CAR-NK转基因载体还包括用于组成集识别、传递、启动于一体的嵌合抗原受体。
5.如权利要求4所述的一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体，其特征在于：所述嵌合抗原受体包括：如SEQ ID NO.15所示的识别Mesothelin单链抗体；如SEQ IDNO.16所示的NKG2D Transmembrane嵌合受体跨膜区；如SEQ ID NO.17所示的2B4嵌合受体共刺激因子；如SEQ ID NO.18或SEQ ID NO.20所示的CD3或CD16嵌合受体激活域。
6.如权利要求5所述的一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体，其特征在于：所述嵌合抗原受体还包括用于识别肿瘤细胞的胞外识别区。
7.如权利要求6所述的一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体，其特征在于：所述胞外识别区选自CD19、CD20、CD22、CD33、CD112R8、BCMA、CD38、NKG2D、ROR1、Mesothelin、c-Met、EGFR、ERBB2、ERBB3、ERBB4、PDGFR、GPC3、PSCA、EpCAM、PSMA、EGFRvIII、GD-2中的一种或任意多种的组合。
8.一种如权利要求7所述基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.将含氨苄青霉素抗性基因AmpR序列、原核复制子pUC Ori序列、病毒复制子SV40Ori序列、用于起始慢病毒mRNA的转录的RSV启动子、用于慢病毒包装的慢病毒包装顺式元件、T2A“自我剪切”肽序列序、WPRE增强型土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件、人泛素C启动子、嘌呤霉素抗性基因Puro序列存储于慢病毒骨架质粒上；
S2.将嵌合抗原受体经过酶切、连接、重组反应克隆至慢病毒骨架质粒中，得到表达CAR的重组慢病毒质粒；
S3.将得到的重组慢病毒质粒与慢病毒包装质粒共同转染HEK293T细胞，在HEK293T细胞中进行基因转录表达后，包装成功重组慢病毒载体会释放到细胞培养上清中，收集包含的重组慢病毒载体的上清液，通过纯化浓缩重组慢病毒载体。
9.如权利要求8所述的一种基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体的构建方法，其特征在于：步骤S2中，由人泛素C启动子启动整个CAR基因表达；单链抗体区用于识别肿瘤细胞表面抗原，NKG2D Transmembrane嵌合受体跨膜区用于将整个嵌合受体固定于细胞膜上；2B4嵌合受体共刺激因子用于刺激NK细胞增殖和细胞因子分泌；CD3或CD16嵌合受体激活域用于激活下游信号通路的表达；当单链抗体区与肿瘤细胞表面抗原结合时，信号通过嵌合受体传递至细胞内，从而产生NK细胞增殖、细胞因子分泌增加、抗细胞凋亡蛋白分泌增加、细胞死亡延迟、裂解靶细胞。
10.一种如权利要求1至7中任意一项所述的基于复制缺陷性重组慢病毒的CAR-NK转基因载体的应用，其特征在于：将CAR-NK转基因载体转染NK92细胞或其他来源自然杀伤细胞，对肿瘤细胞实现杀伤作用。
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