CN109762844A

CN109762844A - 一种靶标间皮素的car-nk细胞制备方法

Info

Publication number: CN109762844A
Application number: CN201910097663.2A
Authority: CN
Inventors: 顾雨春; 尹乐
Original assignee: Beijing Promise Medical Science And Technology Co Ltd
Current assignee: National Health Chengnuo Biotechnology (Beijing) Co., Ltd.
Priority date: 2019-01-31
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2019-05-17

Abstract

本发明公开了一种靶标间皮素的CAR‑NK细胞制备方法。该方法包括如下步骤：使NK细胞表达融合蛋白，得到靶标间皮素的CAR‑NK细胞；所述融合蛋白为将NK细胞表面激活受体CD244的IgG样结构域更换为间皮素的特异性抗体后得到的重组蛋白。所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明的技术方案对于间皮素过量表达的肿瘤的治疗具有积极效果，可以用于间皮素过量表达的肿瘤，如卵巢癌和胰腺癌的独立治疗或联合治疗。本发明具有重大的应用价值。

Description

一种靶标间皮素的CAR-NK细胞制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种靶标间皮素的CAR-NK细胞制备方法。

背景技术

近年来，嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞(CAR-T)在白血病研究中取得了重大突破，为血液肿瘤患者带来了新的希望。但是伴随着对血液肿瘤显著疗效的同时，CAR-T治疗也存在着一些问题，比如脱靶效应、细胞因子风暴、插入突变等，并且对实体瘤尚未取得显著疗效。研发新的具有强大抗肿瘤作用的效应细胞具有重要的理论意义和临床应用价值。

NK细胞因其特殊的识别靶细胞的机制、短暂的生理周期、广泛的肿瘤杀伤能力等优势，被视为同样有潜力通过CAR修饰增强其抗肿瘤能力的效应细胞。NK细胞是一类对肿瘤细胞具有强力杀伤作用且MHC非依赖的淋巴细胞，其对肿瘤细胞的识别主要依赖于其表面活化性受体和抑制性受体的相互交叉调控。当识别肿瘤细胞之后，NK细胞通过释放杀伤介质穿孔素和颗粒酶使靶细胞凋亡、表达膜TNF家族分子诱导靶细胞凋亡和抗体依赖的细胞毒作用等多种途径杀伤肿瘤细胞。但是由于肿瘤患者体内NK细胞数量、质量的下降和肿瘤逃逸机制的存在，其在体内的抗肿瘤功能未能得到充分发挥。通过CAR修饰NK细胞有望增强其靶向杀伤肿瘤细胞的能力并研制出具有强大抗肿瘤作用的效应细胞。

间皮素(mesothelin)是一种存在于正常间皮细胞上的分化抗原，在几种肿瘤(包括卵巢癌和胰腺癌)中过量表达。目前没有针对间皮素靶标的CAR-NK细胞免疫治疗技术。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备靶标间皮素的CAR-NK细胞的方法。

第一方面，本发明要求保护一种制备靶标间皮素的CAR-NK细胞的方法。

本发明所提供的制备靶标间皮素的CAR-NK细胞的方法，可包括如下步骤：使NK细胞表达融合蛋白，得到靶标间皮素的CAR-NK细胞。所述融合蛋白为将NK细胞表面激活受体CD244(2B4)的IgG样结构域更换为间皮素的特异性抗体后得到的重组蛋白。

所述NK细胞表面激活受体CD244(2B4)的IgG样结构域的氨基酸序列具体可如序列表中序列3所示。

所述间皮素的特异性抗体的氨基酸序列具体可为SEQ ID No.1的第22-265位所示。

进一步地，所述方法可包括如下步骤：将含有所述融合蛋白的编码基因的重组载体导入NK细胞，得到表达所述融合蛋白的NK细胞，即为所述靶标间皮素的CAR-NK细胞。

其中，所述融合蛋白自N端到C端依次由CD244(2B4)的上膜信号区、单链抗体区和“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”组成。

所述CD244(2B4)的上膜信号区的氨基酸序列可为SEQ ID No.1的第1-21位所示。

所述单链抗体区的氨基酸序列可为SEQ ID No.1的第22-265位所示。

所述“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”的氨基酸序列可为SEQID No.1的第266-420位所示。

更进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列可为SEQ ID No.1所示。

对应于基因水平，所述融合蛋白的编码基因中编码所述CD244(2B4)的上膜信号区的核苷酸序列可为SEQ ID No.2的第1-63位所示。所述融合蛋白的编码基因中编码所述单链抗体区的核苷酸序列可为SEQ ID No.2的第64-795位所示。所述融合蛋白的编码基因中编码所述“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”的核苷酸序列可为SEQ IDNo.2的第796-1263位所示。

进一步地，所述融合蛋白的编码基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.2所示。

在所述方法中，所述重组载体可为重组慢病毒载体。

相应的，所述方法可包括如下步骤：

(a)利用所述重组慢病毒载体和慢病毒包装质粒转染慢病毒包装细胞，进行培养，获得重组慢病毒；

(b)将所述重组慢病毒感染NK细胞，从而获得所述靶标间皮素的CAR-NK细胞。

在本发明的具体实施方式中，所述重组慢病毒载体具体为将SEQ ID No.2所示的所述融合蛋白的编码基因插入到plenti慢病毒载体的多克隆位点(BamHI和XbaI)之间后得到的重组质粒。所述慢病毒包装质粒具体为PspaX2质粒和PMD2.0G质粒。所述慢病毒包装细胞具体为293T细胞。在转染时，所述重组慢病毒载体、所述PspaX2质粒和所述PMD2.0G质粒的用量配比可为5：3.2：1.8(质量比)。更加具体的，如所述重组慢病毒载体、所述PspaX2质粒和所述PMD2.0G质粒分别为5μg、3.2μg、1.8μg，转染3×10⁶个293T细胞。

所述plenti慢病毒载体、所述PspaX2质粒和所述PMD2.0G质粒均可为addgene公司的产品，产品目录号分别为#17481、#12260和#12259。

第二方面，本发明要求保护如下任一所示生物材料：

(a1)利用前文所述方法制备得到的所述靶标间皮素的CAR-NK细胞。

(a2)前文所述融合蛋白。

(a3)前文所述融合蛋白的编码基因。

(a4)含有所述编码基因的重组载体、表达盒、重组菌或重组细胞；这里的重组载体可为前文任一所述的重组载体(可为重组慢病毒载体也可为重组非慢病毒载体)。

第三方面，本发明要求保护如下任一所示应用：

(A1)前文所述的靶标间皮素的CAR-NK细胞在制备用于治疗间皮素过量表达的肿瘤的产品中的应用；

(A2)前文所述的靶标间皮素的CAR-NK细胞在制备用于杀伤间皮素过量表达的肿瘤细胞的产品中的应用；

(A3)前文所述的编码基因、重组载体或表达盒在制备所述靶标间皮素的CAR-NK细胞中的应用。

进一步地，所述间皮素过量表达的肿瘤可为卵巢癌或胰腺癌。所述间皮素过量表达的肿瘤细胞可为卵巢癌肿瘤细胞或胰腺癌肿瘤细胞。

上述任一所述卵巢癌肿瘤细胞可为卵巢癌肿瘤细胞SKOV3HTB-77^TM或人源卵巢癌肿瘤细胞(从卵巢癌患者肿瘤组织培养获得)。

实验证明，CAR-NK细胞对间皮素表达量高的肿瘤细胞(如卵巢癌细胞或胰腺癌细胞)具有杀伤效果，且CAR-NK细胞的使用量越高，杀伤效果越好。由此可见，本发明技术方案对于间皮素过量表达的肿瘤(如卵巢癌或胰腺癌)的治疗具有积极效果，可以用于卵巢癌或胰腺癌等间皮素过量表达的肿瘤的独立治疗或联合治疗。由于可以异体使用，将能使患者得到及时治疗。本发明具有重大的应用价值。

附图说明

图1为卵巢癌肿瘤细胞SKOV3HTB-77^TM的杀伤曲线。

图2为人源卵巢癌肿瘤细胞的杀伤曲线。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

plenti慢病毒载体、PspaX2质粒和PMD2.0G质粒均为addgene公司的产品，产品目录号分别为#17481、#12260和#12259。

下述实施例中卵巢癌患者对本实验内容均知情同意。

实施例1、靶标间皮素的CAR-NK细胞的制备与鉴定

靶标间皮素的CAR-NK细胞免疫治疗方法，主要原理是对NK(自然杀伤细胞)细胞进行特殊基因修饰，增强其特异性杀伤间皮素过量表达的肿瘤的功能。

CAR-NK修饰基因主要是将NK细胞表面激活受体CD244(2B4)的IgG样结构域更换为间皮素的特异性抗体，使经过基因修饰的CAR-NK细胞能够特异性识别间皮素，进而对间皮素过量表达的肿瘤(如卵巢癌或胰腺癌)细胞进行杀伤。NK细胞表面激活受体CD244(2B4)的IgG样结构域的氨基酸序列具体可如序列表中序列3所示。

一、靶标间皮素的CAR-NK细胞的制备

1、构建重组慢病毒载体plenti-CD244-antiMesothelin

将SEQ ID No.2所示的DNA片段插入plenti慢病毒载体的限制性内切酶BamHI和XbaI之间，得到重组慢病毒载体plenti-CD244-antiMesothelin。SEQ ID No.2中，第1-63位为上膜信号区的编码基因，第64-795位为单链抗体区的编码基因，第796-1263位为跨膜结构与胞内结构区的编码基因。

SEQ ID No.2所示的DNA片段编码SEQ ID No.1所示的蛋白质。SEQ ID No.1中，第1-21位为上膜信号区，第22-265位为单链抗体区，第266-420位为跨膜结构与胞内结构区。

2、包装CD244-antiMesothelin重组慢病毒

将步骤1制备的重组慢病毒载体plenti-CD244-antiMesothelin、PspaX2质粒和PMD2.0G质粒(PspaX2质粒和PMD2.0G质粒为慢病毒包装质粒)分别取5μg、3.2μg和1.8μg，混合后转染293T细胞(约3×10⁶个细胞，10cm平皿，10mL含10％(v/v)FBS的DMEM培养基)，每隔24h收取一次慢病毒上清，0.45μm滤膜过滤，72h收取3次共30mL后使用超速离心机4℃、50000g离心2h，小心吸走上清，用100μL DPBS将慢病毒沉淀重悬，得到Car-NK慢病毒浓缩液。

3、CD244-antiMesothelin重组慢病毒感染NK细胞

(1)取5×10⁵个细胞量体积的人源NK细胞(外周血分离培养获得)培养体系，300g离心10min(升速：150s，降速：150s)，收集沉淀。

(2)取步骤(1)得到的沉淀，加入1mLNK细胞培养基重悬，得到重悬液。

(3)取12孔板，向第1个孔中加入所述重悬液、100μL Car-NK慢病毒浓缩液、polybrene、PHA、IL2和IL12，混匀，得到培养体系。该培养体系中，polybrene的浓度为5μg/mL，PHA的浓度为1μg/mL，IL2的浓度为500U/mL，IL12的浓度为20U/mL。

(4)取步骤(3)得到的培养体系，置于37℃、5％CO2培养箱培养，获得靶标间皮素的CAR-NK细胞，简称CAR-NK细胞。

二、CAR-NK细胞的鉴定

提取CAR-NK细胞的基因组DNA并以其作为模板，采用引物F：5’-ATGCTGGGGCAAGTGGTCAC-3’和引物R：5’-TCAGGAATAAACATCAAAGT-3’组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

将PCR扩增产物和T载体连接，然后测序。

测序结果表明，PCR扩增产物中含有SEQ ID No.2所示的DNA分子。可见，步骤一制备的CAR-NK细胞表达SEQ ID No.1所示的蛋白质。

实施例2、实施例1制备的CAR-NK细胞对卵巢癌肿瘤细胞的杀伤效果检测

待测细胞为实施例1制备的CAR-NK细胞或人源NK细胞(外周血分离培养获得)。

卵巢癌肿瘤细胞为卵巢癌肿瘤细胞SKOV3HTB-77^TM(ATCC的产品)或人源卵巢癌肿瘤细胞(从卵巢癌患者肿瘤组织培养获得)。卵巢癌肿瘤细胞SKOV3HTB-77^TM(ATCC的产品)和人源卵巢癌肿瘤细胞均为间皮素过量表达的肿瘤细胞。

1、取卵巢癌肿瘤细胞(约10⁴个)，加入待测细胞，得到孵育体系。孵育体系中，待测细胞的个数为6.25×10³个、1.25×10⁴个、2.5×10⁴个、5×10⁴个、10×10⁴个或20×10⁴个。

2、完成步骤1后，取所述孵育体系，37℃、5％CO2培养20h。

3、取完成步骤2的体系，采用ToxGreen检测法(具体步骤参考CellTox^TM GreenCytotoxicity Assay技术手册)检测待测细胞对卵巢癌肿瘤细胞的杀伤效率(杀伤效率＝孵育后卵巢癌肿瘤细胞的活细胞数量/10⁴个×100％)；然后以待测细胞的个数与卵巢癌肿瘤细胞的比值为横坐标，杀伤效率为纵坐标，绘制杀伤曲线。

卵巢癌肿瘤细胞SKOV3HTB-77^TM的杀伤曲线见图1(NK：Cancer表示待测细胞的个数与卵巢癌肿瘤细胞的比值，NK表示人源NK细胞，anti-MSLN CAR NK表示实施例1制备的CAR-NK细胞)。结果表明，与人源NK细胞相比，实施例1制备的CAR-NK细胞对卵巢癌肿瘤细胞SKOV3HTB-77^TM具有更好的杀伤效果，且实施例1制备的CAR-NK细胞的使用量越高，杀伤效果越好。

人源卵巢癌肿瘤细胞的杀伤曲线见图2(NK：Cancer表示待测细胞的个数与卵巢癌肿瘤细胞的比值，NK表示人源NK细胞，anti-MSLN CAR NK表示实施例1制备的CAR-NK细胞)。结果表明，与人源NK细胞相比，实施例1制备的CAR-NK细胞对人源卵巢癌肿瘤细胞具有更好的杀伤效果，且实施例1制备的CAR-NK细胞的使用量越高，杀伤效果越好。

<110> 北京呈诺医学科技有限公司

<120> 一种靶标间皮素的CAR-NK细胞制备方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 420

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Leu Gly Gln Val Val Thr Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Lys Val

1 5 10 15

Tyr Gln Gly Lys Gly Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala

20 25 30

Glu Val Lys Arg Pro Gly Ala Ser Val Gln Val Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gly Tyr Ser Ile Asn Thr Tyr Tyr Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro

50 55 60

Gly Ala Gly Leu Glu Trp Met Gly Val Ile Asn Pro Ser Gly Val Thr

65 70 75 80

Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Leu Thr Asn Asp Thr

85 90 95

Ser Thr Asn Thr Val Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Ala Asp

100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Trp Ala Leu Trp Gly Asp Phe Gly

115 120 125

Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

145 150 155 160

Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val

165 170 175

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr His Trp Leu Ala Trp

180 185 190

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala

195 200 205

Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

210 215 220

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe

225 230 235 240

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly

245 250 255

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gln Asp Cys Gln Asn Ala His

260 265 270

Gln Glu Phe Arg Phe Trp Pro Phe Leu Val Ile Ile Val Ile Leu Ser

275 280 285

Ala Leu Phe Leu Gly Thr Leu Ala Cys Phe Cys Val Trp Arg Arg Lys

290 295 300

Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile

305 310 315 320

Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu

325 330 335

Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser

340 345 350

Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser

355 360 365

Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser

370 375 380

Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro

385 390 395 400

Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe

405 410 415

Asp Val Tyr Ser

420

<210> 2

<211> 1263

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

atgctggggc aagtggtcac cctcatactc ctcctgctcc tcaaggtgta tcagggcaaa 60

ggaatggccc aggtccagct ggtgcagtct ggggctgagg tgaagaggcc tggggcctca 120

gtgcaggtat cctgcagagc atctggctat agtatcaata cttactatat gcagtgggtg 180

cggcaggccc ctggagcagg ccttgagtgg atgggcgtta tcaaccccag tggtgtcaca 240

agttacgcac agaagttcca gggcagagtc actttgacca acgacacgtc cacaaacaca 300

gtctacatgc agttgaacag tctgacatct gccgacacgg ccgtctacta ctgtgcgaga 360

tgggccttat ggggggactt cggtatggac gtctggggca agggaaccct ggtcaccgtc 420

tcgagtggtg gaggcggttc aggcggaggt ggcagcggcg gtggcggatc ggacatccag 480

atgacccagt ctccttccac cctgtctgca tctattggag acagagtcac catcacctgc 540

cgggccagtg agggtattta tcactggttg gcctggtatc agcagaagcc agggaaagcc 600

cctaaactcc tgatctataa ggcctctagt ttagccagtg gggccccatc aaggttcagc 660

ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca gcctgcagcc tgatgatttt 720

gcaacttatt actgccaaca atatagtaat tatccgctca ctttcggcgg agggaccaag 780

ctggagatca aacgtcagga ctgtcagaat gcccatcagg aattcagatt ttggccgttt 840

ttggtgatca tcgtgattct aagcgcactg ttccttggca cccttgcctg cttctgtgtg 900

tggaggagaa agaggaagga gaagcagtca gagaccagtc ccaaggaatt tttgacaatt 960

tacgaagatg tcaaggatct gaaaaccagg agaaatcacg agcaggagca gacttttcct 1020

ggagggggga gcaccatcta ctctatgatc cagtcccagt cttctgctcc cacgtcacaa 1080

gaaccagcat atacattata ttcattaatt cagccttcca ggaagtctgg ttccaggaag 1140

aggaaccaca gcccttcctt caatagcact atctatgaag tgattggaaa gagtcaacct 1200

aaagcccaga accctgctcg attgagccgc aaagagctgg agaactttga tgtttattcc 1260

tga 1263

<210> 3

<211> 194

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Cys Gln Gly Ser Ala Asp His Val Val Ser Ile Ser Gly Val Pro Leu

1 5 10 15

Gln Leu Gln Pro Asn Ser Ile Gln Thr Lys Val Asp Ser Ile Ala Trp

20 25 30

Lys Lys Leu Leu Pro Ser Gln Asn Gly Phe His His Ile Leu Lys Trp

35 40 45

Glu Asn Gly Ser Leu Pro Ser Asn Thr Ser Asn Asp Arg Phe Ser Phe

50 55 60

Ile Val Lys Asn Leu Ser Leu Leu Ile Lys Ala Ala Gln Gln Gln Asp

65 70 75 80

Ser Gly Leu Tyr Cys Leu Glu Val Thr Ser Ile Ser Gly Lys Val Gln

85 90 95

Thr Ala Thr Phe Gln Val Phe Val Phe Glu Ser Leu Leu Pro Asp Lys

100 105 110

Val Glu Lys Pro Arg Leu Gln Gly Gln Gly Lys Ile Leu Asp Arg Gly

115 120 125

Arg Cys Gln Val Ala Leu Ser Cys Leu Val Ser Arg Asp Gly Asn Val

130 135 140

Ser Tyr Ala Trp Tyr Arg Gly Ser Lys Leu Ile Gln Thr Ala Gly Asn

145 150 155 160

Leu Thr Tyr Leu Asp Glu Glu Val Asp Ile Asn Gly Thr His Thr Tyr

165 170 175

Thr Cys Asn Val Ser Asn Pro Val Ser Trp Glu Ser His Thr Leu Asn

180 185 190

Leu Thr

Claims

1.一种制备靶标间皮素的CAR-NK细胞的方法，包括如下步骤：使NK细胞表达融合蛋白，得到靶标间皮素的CAR-NK细胞；

所述融合蛋白为将NK细胞表面激活受体CD244的IgG样结构域更换为间皮素的特异性抗体后得到的重组蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将含有所述融合蛋白的编码基因的重组载体导入NK细胞，得到表达所述融合蛋白的NK细胞，即为所述靶标间皮素的CAR-NK细胞。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白自N端到C端依次由CD244(2B4)的上膜信号区、单链抗体区和“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”组成。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述CD244(2B4)的上膜信号区的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第1-21位所示；所述单链抗体区的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第22-265位所示；所述“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”的氨基酸序列为SEQID No.1的第266-420位所示；

进一步地，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示。

5.根据权利要求2至4中任一所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因中编码所述CD244(2B4)的上膜信号区的核苷酸序列为SEQ ID No.2的第1-63位所示；所述融合蛋白的编码基因中编码所述单链抗体区的核苷酸序列为SEQ ID No.2的第64-795位所示；所述融合蛋白的编码基因中编码所述“CD244(2B4)的跨膜结构与CD244(2B4)的胞内结构区”的核苷酸序列为SEQ ID No.2的第796-1263位所示；

进一步地，所述融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示。

6.根据权利要求2至5中任一所述的方法，其特征在于：所述重组载体为重组慢病毒载体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述重组慢病毒载体为将SEQ ID No.2所示的所述融合蛋白的编码基因插入到plenti慢病毒载体的多克隆位点之间后得到的重组质粒；和/或所述慢病毒包装质粒为PspaX2质粒和PMD2.0G质粒；和/或所述慢病毒包装细胞为293T细胞。

9.如下任一所示生物材料：

(a1)利用权利要求1至8任一所述方法制备得到的靶标间皮素的CAR-NK细胞；

(a2)权利要求1至8中任一所述融合蛋白；

(a3)权利要求1至8中任一所述融合蛋白的编码基因；

(a4)含有权利要求1至8中任一所述融合蛋白的编码基因的重组载体、表达盒、重组菌或重组细胞；

进一步地，所述重组载体为权利要求2至8中任一所述的重组载体。

10.如下任一所示应用：

(A1)权利要求9中所述的靶标间皮素的CAR-NK细胞在制备用于治疗间皮素过量表达的肿瘤的产品中的应用；

(A2)权利要求9中所述的靶标间皮素的CAR-NK细胞在制备用于杀伤间皮素过量表达的肿瘤细胞的产品中的应用；

(A3)权利要求9中所述的编码基因、重组载体或表达盒在制备所述靶标间皮素的CAR-NK细胞中的应用；

进一步地，所述间皮素过量表达的肿瘤为卵巢癌或胰腺癌；所述间皮素过量表达的肿瘤细胞为卵巢癌肿瘤细胞或胰腺癌肿瘤细胞。