CN110684117A - 一种car嵌合抗原受体序列及应用其的car-nk细胞 - Google Patents

Abstract

本发明提供提供一种CAR嵌合抗原受体序列，包括单链抗体结构、胞外区结构、跨膜区结构和胞内区结构；胞外区结构的蛋白多肽序列选自CD8α蛋白多肽序列的片段；跨膜区结构的蛋白多肽序列选自NKG2D蛋白多肽序列的片段；胞内区结构包括2B4胞内区结构或/和CD3ζ胞内区结构，2B4胞内区结构的蛋白多肽序列选自2B4蛋白多肽序列的片段，CD3ζ胞内区结构的蛋白多肽序列选自CD3ζ蛋白多肽序列的片段。本发明提供的CAR嵌合抗原受体序列可有效地激活免疫功能细胞，且能够使嵌合其的免疫功能细胞高效地识别恶性肿瘤细胞。

Description

一种CAR嵌合抗原受体序列及应用其的CAR-NK细胞

技术领域

本发明属于细胞免疫治疗领域，具体地，涉及一种CAR嵌合抗原受体序列及应用其的CAR-NK细胞。

背景技术

恶性肿瘤是危害人类健康的主要重大疾病之一。传统肿瘤治疗方式如手术、放疗、化疗是近几十年来用于肿瘤治疗的主要策略，但是，病人会对药物及放疗治疗产生抗性，致使高频率的肿瘤患者复发。肿瘤细胞治疗，因其靶向性、效果显著、几无副作用等优点而得到了极大关注，逐步成为肿瘤综合治疗中的一个重要手段，被业界称为肿瘤的绿色疗法，也是当前肿瘤治疗基础研究和临床应用的热点与发展方向。

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK细胞)发挥杀伤活性不需要预先刺激，在基于细胞治疗的人类恶性肿瘤治疗中具有很大潜力。NK细胞能够在T，B细胞不存在的情况下自发的裂解肿瘤细胞。NK细胞与细胞毒性T细胞有很多共同特征，包括共同的前体细胞、细胞表面受体分子的重排以及颗粒酶依赖的杀伤机制。然而，NK细胞也具有独特性，因其杀伤不需预先刺激以及杀伤肿瘤细胞没有MHC限制性。这让NK细胞在过继肿瘤细胞免疫治疗中应用广泛，其中，过继细胞免疫治疗指的是将外源改造过的细胞回输给病人用于临床应用。

在体外分离、扩增过的NK细胞可以用于自体或异体治疗。然而，从单个供体血液中白细胞中去除T细胞来得到NK细胞的方法获得NK细胞产量不稳定，而且数目不足以达到回输标准。另外，NK细胞在体外非常难以培养，远远达不到细胞免疫疗法的要求。而且，肿瘤病人NK细胞很多本身已经无法正常发挥正常功能。即使在体外培养，也需要加入很多激活物(如IL-2，IL-12，IL-5，IL-18等)，用来增强NK细胞对肿瘤细胞反应。

虽然，目前有很多方法可以制备NK细胞，但是NK细胞的分化效率低，使得NK细胞药物的价格高昂，杀灭活性难以控制，不利于规模化生产和应用。基于此，NK细胞的体外激活和扩增对NK细胞在肿瘤细胞免疫治疗中的进一步推广应用具有不可忽视的现实意义。

肿瘤嵌合抗原受体(CAR)疗法，指的是一种通过嵌合抗原受体在免疫细胞上治疗肿瘤的新型精准靶向疗法，近几年通过优化改良在临床肿瘤治疗上取得很好的效果，是一种非常有前景的，能够精准、快速、高效，且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗方法。通常，CAR通过基因工程技术，将免疫细胞(T细胞、NK细胞)激活，并装上定位导航装置CAR，将普通的T细胞、NK细胞对应地重组为CAR-T细胞、CAR-NK细胞，CAR-T细胞、CAR-NK细胞能够利用其嵌合的CAR，专门识别体内肿瘤细胞，并通过免疫作用释放大量的多种效应因子，能够高效地杀灭肿瘤细胞，从而达到治疗恶性肿瘤的目的。另外，将定位敲入CAR载体后的免疫细胞移植回原患者身体内，可避开自身免疫系统的攻击难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种CAR嵌合抗原受体序列及应用其的CAR-NK细胞，以有效激活免疫功能细胞并使免疫功能细胞高效地杀灭肿瘤细胞。

根据本发明的一个方面，提供一种CAR嵌合抗原受体序列，包括单链抗体结构、胞外区结构、跨膜区结构和胞内区结构；胞外区结构的蛋白多肽序列选自CD8α蛋白多肽序列的片段；跨膜区结构的蛋白多肽序列选自NKG2D蛋白多肽序列的片段；胞内区结构包括2B4胞内区结构或/和CD3ζ胞内区结构，2B4胞内区结构的蛋白多肽序列选自2B4蛋白多肽序列的片段，CD3ζ胞内区结构的蛋白多肽序列选自CD3ζ蛋白多肽序列的片段。

优选地，胞内区结构包括2B4胞内区结构和CD3ζ胞内区结构，跨膜区结构、2B4胞内区结构和CD3ζ胞内区结构依次串联。

优选地，胞外区结构包括第一胞外区结构和第二胞外区结构；第一胞外区结构、单链抗体结构、第二胞外区结构、跨膜区结构、2B4胞内区结构和CD3ζ胞内区结构依次串联；单链抗体结构为由SEQ ID NO.7编码的抗间皮蛋白scFv。

优选地，其蛋白多肽序列为SEQ ID NO.10。

优选地，胞外区结构、单链抗体结构、跨膜区结构、2B4胞内区结构和CD3ζ胞内区结构依次串联；单链抗体结构为由SEQ ID NO.12编码的抗表皮生长因子受体scFv。

优选地，其蛋白多肽序列为SEQ ID NO.14。

根据本发明的一个方面，提供一种CAR嵌合抗原受体序列，其蛋白多肽序列与上述CAR嵌合抗原受体系列的蛋白序列具有不低于80％的相似性。

根据本发明的另一个方面，提供一种CAR-NK细胞，其AAVS1位点嵌合了包括ER1a启动子和上述CAR嵌合抗原受体序列的序列载体；在序列载体中，CAR嵌合抗原受体序列位于ER1a启动子的下游。

根据本发明的另一个方面，提供上CAR-NK细胞在制备抗恶性肿瘤药物中的应用。

优选地，抗恶性肿瘤药物为抗恶性间皮细胞瘤药物。

本发明提供的CAR嵌合抗原受体序列可有效地激活免疫功能细胞，且能够使嵌合其的免疫功能细胞高效地识别恶性肿瘤细胞。可选地，本发明提供的CAR嵌合抗原受体序列采用抗间皮蛋白scFv或抗表皮生长因子受体scFv作为其中所包含的单链抗体结构，使嵌合其的免疫功能细胞能够高效地识别恶性间皮细胞瘤细胞。

将包括上述CAR嵌合抗原受体序列的序列载体嵌合在在NK细胞的AAVS1位点，定位敲入位置明确，不会干扰宿主细胞的其他基因，也不会因转基因导致宿主细胞恶变。同时，本发明在上述CAR嵌合抗原受体序列的上游设置能够均一地在各种细胞中高表达的EF1a启动子，可成功高效的获得具有生物学活性及功能的CAR-NK细胞，且让干细胞向NK细胞分化的比例明显提高，其分化比例大于90％。

可选地，本发明采用的序列载体可以包括IRES序列，可以使在对mRNA进行翻译以及与外源cDNA融合的时候不依赖于5‘帽结构。可选地，本发明采用的序列载体可以包括T2A序列，使得利用序列载体生成的整条mRNA可以自剪切成两个独立的蛋白。可选地，本发明采用的序列载体可以包括GFP序列或Puro序列，从而可以相应地利用荧光分析或药物筛选识别、检测本发明构建的CAR-NK细胞。

综上，本发明提供的CAR-NK细胞具有稳定高效、安全性高的优点，适合大规模生产及应用。

附图说明

图1为实施例1构建的定位敲入CAR-NK细胞AAVS1位点的序列载体示意图；

图2为实施例2的处理I在注射CAR-NK细胞I前的恶性间皮细胞瘤细胞显微镜观察图；

图3为实施例2的处理I在注射CAR-NK细胞I 1小时后的恶性间皮细胞瘤细胞显微镜观察图；

图4为实施例2的处理I在注射CAR-NK细胞I 3小时后的恶性间皮细胞瘤细胞显微镜观察图；

图5为实施例2的处理I在注射CAR-NK细胞I 5小时后的恶性间皮细胞瘤细胞显微镜观察图；

图6为实施例2的处理I在注射CAR-NK细胞I 7小时后的恶性间皮细胞瘤细胞显微镜观察图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。

下述实施例中使用的术语“嵌合”指的是在体外培养时，在控制条件下，通过非特化的CAR获得特化细胞(例如NK细胞)的生物过程。分化受细胞基因与细胞外的物理和化学条件的相互作用的控制，通常经由涉及嵌入细胞表面的蛋白质的信号通路。

下述实施例中使用的术语“约”，除非明确地指出或从上下文明显得到，应理解为在本领域的正常公差范围内，例如，在平均值的2个标准差内。约可被理解为在规定值的10％，9％，8％，7％，6％，5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.1％，0.05％或0.01％内。

实施例1

本实施例涉及的CAR嵌合抗原受体序列(CAR序列)包括CAR-A序列、CAR-AA序列和CAR-B序列。

1.CAR-AA序列的构建

1.1设计编码CAR-A序列的核苷酸序列

CAR-A序列包括胞外区结构、单链抗体结构、跨膜区结构和胞内区结构。胞外区结构包括第一胞外区结构和第二胞外区结构：编码第一胞外区结构的核苷酸序列为SEQ IDNO.1，SEQ ID NO.1属于编码CD8α蛋白的核苷酸序列(NCBI Reference Sequence：NM_171827)的片段；编码第二胞外区结构的核苷酸序列为SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.2属于编码CD8α蛋白的核苷酸序列(NCBI Reference Sequence：NM_001768)的片段。编码跨膜区结构的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.3属于编码NKG2D蛋白的核苷酸序列(NCBIReference Sequence：NM_007360.3)的片段。胞内区结构包括2B4胞内区结构和CD3ζ胞内区结构：编码2B4胞内区结构的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.4属于编码2B4蛋白的核苷酸序列(NCBI Reference Sequence：NM_001166663.1)的片段；编码CD3ζ胞内区结构的核苷酸序列为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.5属于编码CD3ζ蛋白的核苷酸序列(NCBIReference Sequence：NM_198053.2)的片段；SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5串联而成的SEQID NO.6为编码CAR-A序列的胞内区结构的核苷酸序列。单链抗体结构为抗间皮蛋白scFv(anti-mesothelin scFv)，编码抗间皮蛋白scFv的核苷酸序列为SEQ ID NO.7。

CAR-A序列中，第一胞外区结构、单链抗体结构、第二胞外区结构、跨膜区结构、2B4胞内区结构和CD3ζ胞内区结构依次串联，编码CAR-A序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.8。

1.2优化编码CAR-A序列的核苷酸序列

将编码CAR-A序列的核苷酸序列SEQ ID NO.8优化后得到SEQ ID NO.9，将SEQ IDNO.9翻译后得到的蛋白多肽SEQ ID NO.10即为CAR-AA序列。

2.CAR-B序列的构建

CAR-A序列包括胞外区结构、单链抗体结构、跨膜区结构和胞内区结构。编码胞外区结构的核苷酸序列为SEQ ID NO.11，SEQ ID NO.11属于编码CD8α蛋白的核苷酸序列(NCBI Reference Sequence：NM_171827)的片段。编码跨膜区结构的核苷酸序列为SEQ IDNO.3，SEQ ID NO.3属于编码NKG2D蛋白的核苷酸序列(NCBI Reference Sequence：NM_007360.3)的片段。胞内区结构包括2B4胞内区结构和CD3ζ胞内区结构：编码2B4胞内区结构的核苷酸序列为SEQ ID NO.4，SEQ ID NO.4属于编码2B4蛋白的核苷酸序列(NCBIReference Sequence：NM_001166663.1)的片段；编码CD3ζ胞内区结构的核苷酸序列为SEQID NO.5，SEQ ID NO.5属于编码CD3ζ蛋白的核苷酸序列(NCBI Reference Sequence：NM_198053.2)的片段；SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5串联而成的SEQ ID NO.6为编码CAR-B序列的胞内区结构的核苷酸序列。单链抗体结构为抗表皮生长因子受体scFv(anti-HER3scFv)，编码抗表皮生长因子受体scFv的核苷酸序列为SEQ ID NO.12。

CAR-B序列中，胞外区结构、单链抗体结构、跨膜区结构、2B4胞内区结构和CD3ζ胞内区结构依次串联，编码CAR-B序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.13。将SEQ ID NO.13翻译后得到的蛋白多肽SEQ ID NO.14即为CAR-B序列。

3.构建CAR序列载体

利用PCR技术将CAR-AA序列和CAR-B序列的核苷酸序列扩增出来，然后分别将CAR-AA序列和CAR-B序列克隆至含有T2A序列、EF1a启动子序列、GFP序列、Puro序列和IRES序列的序列载体中，得到具有依次串联的EF1a启动子序列、CAR序列、T2A序列、GFP序列、IRES序列和Puro序列的序列载体(如图1所示)。其中，采用CAR-AA作为其CAR序列的序列载体标记为序列载体I，采用CAR-B作为其CAR序列的序列载体标记为序列载体II。

2.构建CAR-NK细胞

选择内切酶分别线性化序列载体I、序列载体II，然后利用CRISPR/Cas9相应试剂，将线性化的序列载体I、线性化的序列载体II分别定位敲入NK细胞的AAVS1位点。将嵌合了序列载体I的NK重组细胞标记为CAR-NK细胞I，将嵌合了序列载体II的NK重组细胞标记为CAR-NK细胞II。成功嵌合上述序列载体的CAR-NK细胞能够同时表达绿色荧光蛋白和嘌呤霉素，可以利用荧光检测筛选荧光蛋白阳性的细胞，或者，可以利用嘌呤霉素抗体筛选嘌呤霉素阳性的细胞，从而筛选成功嵌合上述序列载体的CAR-NK细胞。

实施例2

1.实验设置方式

本实施例利用同一志愿者提供的NK细胞，根据实施例1提供的方法制备CAR-NK细胞I和CAR-NK细胞II。设置2组处理组(包括处理I和处理II)和1组对照组按照如下步骤进行以下体外肿瘤杀伤效果实验，具体地，处理I采用CAR-NK细胞I进行下述实验操作，处理II采用CAR-NK细胞II进行下述实验操作，对照组采用来自同一志愿者的NK细胞进行下述实验操作。利用CCK-8方法(参见：Human Leukocyte Antigen-G Inhibits the Anti-TumorEffect of Natural Killer Cells via Immunoglobulin-Like Transcript 2in GastricCancer，Rui Wan Zi-Wei Wang Hui Li，et al.)检测各处理组和对照组的参试细胞对体体外恶性间皮细胞瘤细胞的杀伤效果：

(1)在实验开始前的一天将恶性间皮细胞瘤细胞(40000个细胞)均匀的铺于24孔中，待细胞贴壁；

(2)实验开始后，按照1∶1的效靶比例，分别将NK细胞、CAR-NK细胞I、CAR-NK细胞II和CAR-NK细胞III铺在24孔中(40000个细胞)，总体系为1ml，37度孵育7小时；

(3)作用7小时后，将培养基舍去，加PBS轻轻地漂洗两次，加入CCK8试剂200ul，37℃作用1-4小时；

(4)450nm处读板计算肿瘤细胞杀伤率。

2.实验结果

通过对比图2-6可知，恶性间皮细胞瘤细胞在与CAR-NK细胞I共同孵育7小时后，恶性间皮细胞瘤细胞明显减少，证明处理I的CAR-NK细胞I能够有效消灭恶性间皮细胞瘤细胞。

本实施例设置的处理组和对照组的参试细胞的体外肿瘤杀伤效果评估的实验结果如表1所示，别与对照组对应的肿瘤细胞杀伤率相比，3组处理组对应的肿瘤细胞杀伤率明显更高。

表1恶性间皮细胞瘤细胞的杀伤率

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 汕头普罗凯融生物医药科技有限公司

<120> 一种CAR嵌合抗原受体序列及应用其的CAR-NK细胞

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcc 6

<210> 2

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 60

ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 120

<210> 3

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ccattttttt tctgctgctt catcgctgta gccatgggaa tccgtttcat tattatggta 60

aca 63

<210> 4

<211> 360

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggaggagaa agaggaagga gaagcagtca gagaccagtc ccaaggaatt tttgacaatt 60

tacgaagatg tcaaggatct gaaaaccagg agaaatcacg agcaggagca gacttttcct 120

ggagggggga gcaccatcta ctctatgatc cagtcccagt cttctgctcc cacgtcacaa 180

gaacctgcat atacattata ttcattaatt cagccttcca ggaagtctgg atccaggaag 240

aggaaccaca gcccttcctt caatagcact atctatgaag tgattggaaa gagtcaacct 300

aaagcccaga accctgctcg attgagccgc aaagagctgg agaactttga tgtttattcc 360

<210> 5

<211> 342

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 342

<210> 6

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tggaggagaa agaggaagga gaagcagtca gagaccagtc ccaaggaatt tttgacaatt 60

tacgaagatg tcaaggatct gaaaaccagg agaaatcacg agcaggagca gacttttcct 120

ggagggggga gcaccatcta ctctatgatc cagtcccagt cttctgctcc cacgtcacaa 180

gaacctgcat atacattata ttcattaatt cagccttcca ggaagtctgg atccaggaag 240

aggaaccaca gcccttcctt caatagcact atctatgaag tgattggaaa gagtcaacct 300

aaagcccaga accctgctcg attgagccgc aaagagctgg agaactttga tgtttattcc 360

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 420

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 480

cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 540

aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 600

cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 660

acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aa 702

<210> 7

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

caggtacaac tgcagcagtc tgggcctgag ctggagaagc ctggcgcttc agtgaagata 60

tcctgcaagg cttctggtta ctcattcact ggctacacca tgaactgggt gaagcagagc 120

catggaaaga gccttgagtg gattggactt attactcctt acaatggtgc ttctagctac 180

aaccagaagt tcaggggcaa ggccacatta actgtagaca agtcatccag cacagcctac 240

atggacctcc tcagtctgac atctgaagac tctgcagtct atttctgtgc aagggggggt 300

tacgacggga ggggttttga ctactggggc caagggacca cggtcaccgt ctcctcaggt 360

gtaggcggtt caggcggcgg tggctctggc ggtggcggat cggacatcga gctcactcag 420

tctccagcaa tcatgtctgc atctccaggg gagaaggtca ccatgacctg cagtgccagc 480

tcaagtgtaa gttacatgca ctggtaccag cagaagtcag gcacctcccc caaaagatgg 540

atttatgaca catccaaact ggcttctgga gtcccaggtc gcttcagtgg cagtgggtct 600

ggaaactctt actctctcac aatcagcagc gtggaggctg aagatgatgc aacttattac 660

tgccagcagt ggagtggtta ccctctcacg ttcggtgctg ggacaaagtt ggaaataaaa 720

<210> 8

<211> 1611

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

atggcccagg tacaactgca gcagtctggg cctgagctgg agaagcctgg cgcttcagtg 60

aagatatcct gcaaggcttc tggttactca ttcactggct acaccatgaa ctgggtgaag 120

cagagccatg gaaagagcct tgagtggatt ggacttatta ctccttacaa tggtgcttct 180

agctacaacc agaagttcag gggcaaggcc acattaactg tagacaagtc atccagcaca 240

gcctacatgg acctcctcag tctgacatct gaagactctg cagtctattt ctgtgcaagg 300

gggggttacg acgggagggg ttttgactac tggggccaag ggaccacggt caccgtctcc 360

tcaggtgtag gcggttcagg cggcggtggc tctggcggtg gcggatcgga catcgagctc 420

actcagtctc cagcaatcat gtctgcatct ccaggggaga aggtcaccat gacctgcagt 480

gccagctcaa gtgtaagtta catgcactgg taccagcaga agtcaggcac ctcccccaaa 540

agatggattt atgacacatc caaactggct tctggagtcc caggtcgctt cagtggcagt 600

gggtctggaa actcttactc tctcacaatc agcagcgtgg aggctgaaga tgatgcaact 660

tattactgcc agcagtggag tggttaccct ctcacgttcg gtgctgggac aaagttggaa 720

ataaaaccca ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 780

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 840

agggggccat tttttttctg ctgcttcatc gctgtagcca tgggaatccg tttcattatt 900

atggtaacat ggaggagaaa gaggaaggag aagcagtcag agaccagtcc caaggaattt 960

ttgacaattt acgaagatgt caaggatctg aaaaccagga gaaatcacga gcaggagcag 1020

acttttcctg gaggggggag caccatctac tctatgatcc agtcccagtc ttctgctccc 1080

acgtcacaag aacctgcata tacattatat tcattaattc agccttccag gaagtctgga 1140

tccaggaaga ggaaccacag cccttccttc aatagcacta tctatgaagt gattggaaag 1200

agtcaaccta aagcccagaa ccctgctcga ttgagccgca aagagctgga gaactttgat 1260

gtttattcca gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 1320

aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 1380

agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgcaga gaaggaagaa ccctcaggaa 1440

ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 1500

aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 1560

accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgcta a 1611

<210> 9

<211> 1713

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atggccctcc ccgtgacagc tctgctgctg cctctggctc ttctgctgca cgccgctaga 60

cctcaggtgc agctgcagca gagcggtcct gagctggaaa aacctggcgc ctccgtcaag 120

atctcatgca aggccagcgg gtactcattc accggctaca ccatgaactg ggtcaagcag 180

agccacggca aaagcctgga atggatcgga ctgattaccc cttacaacgg cgccagcagc 240

tataatcaaa agtttagagg caaggccacc ctgaccgtgg acaagtcctc ttctacagcc 300

tacatggacc tgctgtctct gacatctgag gatagcgccg tgtacttctg cgccagaggc 360

ggatatgatg gcagaggctt cgactactgg ggacagggca caaccgtgac cgtcagctcc 420

ggggtgggcg gctctggagg cggtggctct ggcgggggtg gcagtgatat cgagctgacc 480

cagagccccg ccatcatgag cgcctctcct ggcgagaagg tgaccatgac ctgtagcgct 540

agcagcagtg tgtcctacat gcactggtac cagcagaaaa gcggcacctc cccaaagaga 600

tggatctacg acacctcaaa gctggcctct ggcgtgcccg gacggttcag cgggtctggc 660

agcggcaaca gctactccct gaccatcagc tccgtggaag ccgaggacga cgccacatat 720

tactgccagc aatggagcgg ataccccctg accttcggcg ccggcaccaa gctggaaatc 780

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acacctgctc ctaccatcgc cagccagcct ctgagcctga gaccagaggc ctgtagacct 900

gccgccggag gcgctgtgca caccagagga ctggacttcg cctgcgaccc cttcttcttt 960

tgctgcttca tcgccgtggc catgggcatc agattcatca tcatggtgac ctggcggaga 1020

aagcggaaag agaaacagag cgagacaagc cctaaggaat tcctgaccat ctatgaggac 1080

gtgaaggacc tgaagaccag acggaaccac gagcaggagc agacctttcc aggcggcgga 1140

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tatacactgt acagcctcat ccagcccagc agaaagagcg gttccagaaa gagaaaccac 1260

agccctagct tcaacagcac aatctacgag gtgatcggta agtcccagcc taaggcccag 1320

aatcctgcta gactgtccag aaaagaactc gaaaacttcg acgtgtactc tagagtgaag 1380

ttcagccgga gcgctgatgc ccctgcttac cagcagggcc agaaccagct gtacaacgag 1440

ctgaacctgg gcagacggga agagtacgat gtgctggata agcggagagg cagagatcct 1500

gagatgggcg gcaagcctca aagacggaag aacccccagg agggcctgta caatgagctg 1560

cagaaagaca agatggccga agcctacagc gagatcggca tgaaaggcga gagacgacgg 1620

ggcaagggcc acgacggcct gtatcagggc ctgagcaccg ccacaaagga tacatacgac 1680

gccctccaca tgcaggccct gccccccaga tga 1713

<210> 10

<211> 536

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Met Ala Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

20 25 30

Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln

50 55 60

Lys Phe Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr

65 70 75 80

Ala Tyr Met Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

85 90 95

Phe Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Val Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro

130 135 140

Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser

145 150 155 160

Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly

165 170 175

Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly

180 185 190

Val Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu

195 200 205

Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

210 215 220

Gln Trp Ser Gly Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

225 230 235 240

Ile Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro

245 250 255

Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro

260 265 270

Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Pro Phe Phe Phe Cys Cys

275 280 285

Phe Ile Ala Val Ala Met Gly Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Thr Trp

290 295 300

Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe

305 310 315 320

Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His

325 330 335

Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met

340 345 350

Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr

355 360 365

Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg

370 375 380

Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys

385 390 395 400

Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu

405 410 415

Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

420 425 430

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

435 440 445

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

450 455 460

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

465 470 475 480

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

485 490 495

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

500 505 510

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

515 520 525

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

530 535

<210> 11

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 12

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct 120

ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactac 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt actactgtgc gagagattgg 300

ggggactcac tggatccctg gggcaaaggc accctggtca ccgtctcgag tggtggaggc 360

ggttcaggcg gaggtggcag cggcggtggc ggatcggaca tccagatgac ccagtctcct 420

tccaccctgt ctgcatctat tggagacaga gtcaccatca cctgccgggc cagtgagggt 480

atttatcgct ggttggcctg gtatcagcag aagccaggga aagcccctaa actcctgatc 540

tataaggcct ctagtttagc cagtcgggcc ccatcaaggt tcagcggcag tggatctggg 600

acagatttca ctctcaccat cagcagcctg cagcctgatg attttgcaac ttattactgc 660

caacaatata gtaattatcc gctcactttc ggcggaggga ccaagctgga gatcaaacgt 720

<210> 13

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgcaggtgc agctggtgca gtctggggga ggcttggtac agcctggggg gtccctgaga 120

ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttc agtagctatg gcatgcactg ggtccgccag 180

gctccaggca aggggctgga gtgggtggca gttatatcat atgatggaag taataaatac 240

tacgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaattccaa gaacacgctg 300

tatctgcaaa tgaacagcct gagagctgag gacacggctg tgtactactg tgcgagagat 360

tggggggact cactggatcc ctggggcaaa ggcaccctgg tcaccgtctc gagtggtgga 420

ggcggttcag gcggaggtgg cagcggcggt ggcggatcgg acatccagat gacccagtct 480

ccttccaccc tgtctgcatc tattggagac agagtcacca tcacctgccg ggccagtgag 540

ggtatttatc gctggttggc ctggtatcag cagaagccag ggaaagcccc taaactcctg 600

atctataagg cctctagttt agccagtcgg gccccatcaa ggttcagcgg cagtggatct 660

gggacagatt tcactctcac catcagcagc ctgcagcctg atgattttgc aacttattac 720

tgccaacaat atagtaatta tccgctcact ttcggcggag ggaccaagct ggagatcaaa 780

cgtccatttt ttttctgctg cttcatcgct gtagccatgg gaatccgttt cattattatg 840

gtaacatgga ggagaaagag gaaggagaag cagtcagaga ccagtcccaa ggaatttttg 900

acaatttacg aagatgtcaa ggatctgaaa accaggagaa atcacgagca ggagcagact 960

tttcctggag gggggagcac catctactct atgatccagt cccagtcttc tgctcccacg 1020

tcacaagaac ctgcatatac attatattca ttaattcagc cttccaggaa gtctggatcc 1080

aggaagagga accacagccc ttccttcaat agcactatct atgaagtgat tggaaagagt 1140

caacctaaag cccagaaccc tgctcgattg agccgcaaag agctggagaa ctttgatgtt 1200

tattccgccc ccgcgtacca gcagggccag aaccagctct ataacgagct caatctagga 1260

cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag agacgtggcc gggaccctga gatgggggga 1320

aagccgcaga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1380

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1440

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1500

caggccctgc cccctcgcta a 1521

<210> 14

<211> 506

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu

20 25 30

Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe

35 40 45

Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

50 55 60

Gly Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr

65 70 75 80

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser

85 90 95

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

100 105 110

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Trp Gly Asp Ser Leu Asp Pro Trp

115 120 125

Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser

145 150 155 160

Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Ile Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys

165 170 175

Arg Ala Ser Glu Gly Ile Tyr Arg Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

180 185 190

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Ala

195 200 205

Ser Arg Ala Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

210 215 220

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Gln Gln Tyr Ser Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

245 250 255

Leu Glu Ile Lys Arg Pro Phe Phe Phe Cys Cys Phe Ile Ala Val Ala

260 265 270

Met Gly Ile Arg Phe Ile Ile Met Val Thr Trp Arg Arg Lys Arg Lys

275 280 285

Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu

290 295 300

Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln Thr

305 310 315 320

Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser

325 330 335

Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile

340 345 350

Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro Ser

355 360 365

Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala

370 375 380

Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val

385 390 395 400

Tyr Ser Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

405 410 415

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

420 425 430

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro

435 440 445

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

450 455 460

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

465 470 475 480

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

485 490 495

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

500 505

Claims (10)

1.一种CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：

包括单链抗体结构、胞外区结构、跨膜区结构和胞内区结构；

所述胞外区结构的蛋白多肽序列选自CD8α蛋白多肽序列的片段；

所述跨膜区结构的蛋白多肽序列选自NKG2D蛋白多肽序列的片段；

所述胞内区结构包括2B4胞内区结构或/和CD3ζ胞内区结构，所述2B4胞内区结构的蛋白多肽序列选自2B4蛋白多肽序列的片段，所述CD3ζ胞内区结构的蛋白多肽序列选自CD3ζ蛋白多肽序列的片段。

2.如权利要求1所述CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：

所述胞内区结构包括所述2B4胞内区结构和所述CD3ζ胞内区结构，

所述跨膜区结构、所述2B4胞内区结构和所述CD3ζ胞内区结构依次串联。

3.如权利要求2所述CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：

所述胞外区结构包括第一胞外区结构和第二胞外区结构；

所述第一胞外区结构、所述单链抗体结构、所述第二胞外区结构、所述跨膜区结构、所述2B4胞内区结构和所述CD3ζ胞内区结构依次串联；

所述单链抗体结构为由SEQ ID NO.7编码的抗间皮蛋白scFv。

4.如权利要求3所述CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：其蛋白多肽序列为SEQ IDNO.10。

5.如权利要求2所述CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：

所述胞外区结构、所述单链抗体结构、所述跨膜区结构、所述2B4胞内区结构和所述CD3ζ胞内区结构依次串联；

所述单链抗体结构为由SEQ ID NO.12编码的抗表皮生长因子受体scFv。

6.如权利要求5所述CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：其蛋白多肽序列为SEQ IDNO.14。

7.一种CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：其蛋白多肽序列与如权利要求4所述CAR嵌合抗原受体系列的蛋白序列具有不低于80％的相似性。

8.一种CAR嵌合抗原受体序列，其特征在于：其蛋白多肽序列与如权利要求6所述CAR嵌合抗原受体系列的蛋白序列具有不低于80％的相似性。

9.一种CAR-NK细胞，其特征在于：

其AAVS1位点嵌合了包括ER1a启动子和如权利要求1-8任一项所述CAR嵌合抗原受体序列的序列载体；

在所述序列载体中，所述CAR嵌合抗原受体序列位于所述ER1a启动子的下游。

10.如权利要求9所述CAR-NK细胞在制备抗恶性肿瘤药物中的应用。

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