CN114437229B

CN114437229B - 携带pd-1単链抗体且靶向egfr抗原的car t免疫细胞的制备及其用途

Info

Publication number: CN114437229B
Application number: CN202011199389.9A
Authority: CN
Inventors: 朱焕章; 王亚楠; 赵琳
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2020-11-01
Filing date: 2020-11-01
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2040-11-01
Also published as: CN114437229A

Abstract

本发明属于基因工程和肿瘤免疫技术领域，涉及一种特异靶向EGFR抗原且分泌PD‑1単链抗体的CAR T免疫细胞的制备及用途。具体而言，本发明的T细胞表达靶向肿瘤细胞EGFR的嵌合抗原受体CAR及分泌PD‑1単链抗体E27，CAR包含CD8α信号肽、靶向EGFR的scFv、铰链域、跨膜域、共刺激信号域及受体酪氨酸活化域。本发明的CAR T细胞在体外能更快地增殖，同时具有更强的杀伤功能，在体内也能更有效地抑制PD‑L1阳性肿瘤细胞的生长，延长生存期。

Description

携带PD-1単链抗体且靶向EGFR抗原的CAR T免疫细胞的制备及其用途

技术领域

本发明属于基因工程和肿瘤免疫领域，具体地，本发明涉及一种特异靶向EGFR抗原且分泌PD-1単链抗体的CAR T免疫细胞的制备及用途。

背景技术

肿瘤免疫治疗是一种通过激活人体的免疫系统，增强机体免疫反应从而杀伤肿瘤的一种治疗方式。自上世纪80年代Rosenberg教授利用高剂量IL-2成功治愈第一个晚期转移性黑色素瘤患者以来，肿瘤免疫疗法经历了几十年的快速发展。CAR T细胞治疗是一种不依赖MHC-1的呈递作用，也不需要抗原加工等过程，其通过T细胞表面的scFv直接识别肿瘤细胞表面的靶抗原，包括脂类、糖类及蛋白质，胞内的信号传导结构域激活T细胞，从而杀伤肿瘤细胞的技术。

现有技术公开了CAR结构一般包含胞外域、铰链域、跨膜域及胞内域，胞外域主要是scFv，通常由抗体的重链及轻链区衍变而来，scFv的作用为特异性结合肿瘤细胞上的肿瘤抗原。铰链域及跨膜域，一般由CD8或者IgG4分子组成，铰链域负责形成柔性片段，促进scFv与肿瘤抗原的结合，跨膜域用来固定CAR结构。胞内域通常也叫作激活域或者信号传导域，主要作用为活化T细胞，由CD3ζ组成。目前，CAR已经发展到了第四代，第一代CAR的胞内域仅仅包括CD3ζ，结果临床试验并不理想，CAR T细胞在体内不能有效地扩增及持久存在。为了进一步增强T细胞的活化、扩增效率及生存时间，促进细胞因子的释放，第二代CAR加了一个共刺激分子，例如CD27、CD28、4-1BB或者OX-40。而第三代CAR包含两个共刺激分子，通常是CD28与4-1BB。但是，由于肿瘤细胞具有异质性，一些肿瘤细胞会降低或者改变靶抗原的表达，这对于提前设计的CAR T造成了困难，无法按照预先设想识别并清除肿瘤细胞，基于此，第四代CAR应运而生，其在前期的基础上，额外增加了抗肿瘤细胞因子基因，例如IL-12或者IL-15，因此，第四代CAR T细胞又叫做TRUCK T细胞，局部细胞因子的释放能够募集其他的免疫细胞到肿瘤组织周围，杀伤肿瘤细胞。

实践显示，十年来CAR T细胞治疗有了快速发展，在临床前及临床试验中取得了不错的效果，尤其在血液瘤领域，基于在多个临床试验中对于CAR T细胞治疗安全性及有效性的评估，FDA已经相继批准了两款产品(Kymriah,Novartis；Yescarta,Kite Pharma)用于血液瘤的临床治疗。虽然现在CAR T细胞治疗的主体还是集中在血液瘤领域，但是实体瘤在所有恶性肿瘤中占据了高比例，对于实体瘤也有大量的靶点正在研究。

但是，CAR T细胞在治疗实体瘤的过程中却屡屡碰壁，现在仍然面临诸多问题及挑战，肿瘤内部免疫抑制的微环境是其中一个重要因素。为了维持机体的免疫耐受，T细胞会上调免疫检查点分子的表达，如PD-1，其会和肿瘤细胞表面的PD-L1与PD-L2结合，导致T细胞活性下降，使T细胞逐渐耗竭，抑制T细胞的抗肿瘤反应。对于免疫检查点的调控也极大地促进了肿瘤免疫治疗的研究进展，目前已有多款免疫检查点抑制剂上市，包括CTLA-4单抗Ipilimumab，主要治疗黑色素瘤等，PD-1单抗Keytruda、Opdivo，在恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌及经典霍奇金淋巴瘤上效果显著，PD-L1单抗Tecentriq、Bavencio及Imfinzi，主要治疗尿路上皮癌及非小细胞肺癌等，在临床前及临床试验上均取得了良好的疗效。但是，这些免疫检查点单抗通常采取系统给药的方式，不可避免的会对机体正常组织产生副作用。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种特异靶向EGFR抗原且分泌PD-1単链抗体的CAR T免疫细胞的制备及用途。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，针对CAR T细胞在实体瘤治疗过程中所面临的免疫抑制的肿瘤微环境，提供一种可以靶向肿瘤抗原EGFR且能够分泌PD-1単链抗体的CAR T细胞，在体外及体内均能促进肿瘤细胞杀伤。

基于本发明的研究发现，在众多的肿瘤免疫相关分子中，EGFR可以作为肿瘤免疫治疗的一个理想靶标。EGFR属于ERBB家族成员，是一个酪氨酸激酶受体，EGFR基因位于7号染色体第12个位点，和配体结合后，EGFR会产生同源或者异源二聚体，驱动胞内酪氨酸激酶活性进行自磷酸化，进而激活下游信号通路，主要通过以下三个通路传递信号，PI3K/AKT/mTOR、RAS/RAF/MAPK和JAK/STAT，影响细胞的增殖、代谢及凋亡过程。研究报道，除了在正常组织中表达外，EGFR在胰腺癌、头颈癌及乳腺癌等多种癌症中，EGFR表达升高，在40％-80％的NSCLC中过表达，并且EGFR的表达水平和患者预后情况密切相关。本发明将EGFR-CAR T细胞治疗与PD-1通路阻断联合使用，不仅能靶向EGFR阳性的肿瘤细胞，通过自分泌PD-1単链抗体，能抵抗肿瘤组织局部的免疫抑制微环境，增强CAR T细胞的增殖能力，在体内与体外均能促进对PD-L1阳性肿瘤细胞的杀伤作用。本发明在上述基础上完成。

一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，包含CD8α信号肽、靶向EGFR的scFv、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、4-1BB共刺激域及CD3ζ信号传导域。

CAR包含胞外域、铰链域、跨膜域及胞内域。较好的，本发明的嵌合抗原受体包括：CD8α信号肽、靶向EGFR的scFv、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、4-1BB共刺激域、CD3ζ信号传导域、信号肽、PD-1単链抗体的VH区。

较好的，所述的嵌合抗原受体还包括以下元件中的一个或者若干个：3×G₄S、VL区及HA片段。

较好的，所述的信号肽是T2A剪切信号肽和/或IL-2信号肽。

在本发明的一个优选实施例中，所述的信号肽是人源的。

更好的，所述的靶向EGFR的scFv氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；

所述的4-1BB胞内共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；

所述的CD3ζ胞内信号传导域的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；

所述的PD-1単链抗体VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示。

所述的CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；

所述的CD8α铰链域的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；

所述的CD8α跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

所述的T2A剪切信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；

所述的IL-2信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。

所述3×G₄S的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；

所述分泌型PD-1単链抗体的VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；

所述HA片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。

本发明还包括一种载体，所述的载体含有上述嵌合抗原受体的编码序列。

较好的，所述CD8α信号肽的编码序列如SEQ ID NO:1所示；

所述靶向EGFR的scFv编码序列如SEQ ID NO:2所示；

所述CD8α铰链域的编码序列如SEQ ID NO:3所示；

所述CD8α跨膜域的编码序列如SEQ ID NO:4所示；

所述4-1BB胞内共刺激域的编码序列如SEQ ID NO:5所示；

所述CD3ζ胞内信号传导域的编码序列如SEQ ID NO:6所示；

所述T2A剪切信号肽的编码序列如SEQ ID NO:7所示；

所述IL-2信号肽的编码序列如SEQ ID NO:8所示；

所述分泌型PD-1単链抗体VH区的编码序列如SEQ ID NO:9所示；

所述3×G₄S的编码序列如SEQ ID NO:10所示；

所述VL区的编码序列如SEQ ID NO:11所示；

所述HA片段的编码序列如SEQ ID NO:12所示。

上述嵌合抗原受体或者其编码载体，可以使用本领域的常规技术方法获得。例如，在市售的CAR质粒基础上改良，或者按照目标序列人工合成。

本发明还包括一种细胞，所述的细胞是表达靶向肿瘤细胞表面EGFR的嵌合抗原受体CAR，同时能够分泌PD-1単链抗体的免疫细胞。

较好的，所述的细胞表达上述嵌合抗原受体。

所述的免疫细胞可以由慢病毒感染后获得。所述的慢病毒包括：CD8α信号肽、靶向EGFR的scFv、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、4-1BB共刺激域、CD3ζ信号传导域、T2A剪切信号肽、IL-2信号肽、PD-1単链抗体的VH区、3×G₄S、VL区及HA片段。

较好的，所述免疫细胞为T淋巴细胞或者NK细胞。

较好的，所述的细胞中，所述CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；

所述靶向EGFR的scFv氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；

所述CD8α铰链域的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；

所述CD8α跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；

所述4-1BB胞内共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；

所述CD3ζ胞内信号传导域的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；

所述T2A剪切信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；

所述IL-2信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；

所述分泌型PD-1単链抗体VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；

所述3×G₄S的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；

所述PD-1単链抗体的VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示；

所述HA片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示。

另一方面，本发明还提供了上述嵌合抗原受体和免疫细胞的应用，即上述嵌合抗原受体或者免疫细胞在制备治疗药物中的应用。

在本发明的一个优选实施例中，所述的肿瘤源自非小细胞肺癌或者乳腺癌。

在一个优选实施例中，所述免疫细胞由表达嵌合抗原受体和PD-1単链抗体的慢病毒载体感染后获得。

在一个优选实施例中，所述的嵌合抗原受体表达序列及PD-1単链抗体表达序列均整合入所述免疫细胞的基因组中。

在一个优选实施例中，所述肿瘤细胞为EGFR阳性的NSCLC及乳腺癌细胞系，本发明所述的免疫细胞使用范围不仅限于此，优选地，所述癌症包含EGFR阳性的卵巢癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、胰腺癌、结直肠癌等。

本发明的CAR T细胞在体外能更快地增殖，同时具有更强的杀伤功能，在体内也能更有效地抑制PD-L1阳性肿瘤细胞的生长，延长生存期。

附图说明

图1：EGFR-E27-CAR载体元件示意图及酶切鉴定。

图2：EGFR-E27-CAR在原代CD3 T细胞的表达效率及PD-1単链抗体的检测。

图3：E27在原代CD3 T细胞体外功能活性的检测。

图4：肿瘤细胞靶抗原EGFR的检测。

图5：表达PD-L1及荧光素酶慢病毒载体的构建及酶切验证。

图6：稳转PD-L1及荧光素酶肿瘤细胞系的鉴定。

图7：EGFR-E27-CAR T细胞体外对肿瘤细胞的杀伤作用。

图8：EGFR-E27-CAR T细胞促进IL-2、TNF-α、INF-γ细胞因子的分泌。

图9：在NSG小鼠肺癌CDX移植瘤模型中，EGFR-E27-CAR T细胞具有更强的抗肿瘤功能。

具体实施方式

通过以下公开的实施例来说明本发明的优越性，结合本发明所出示的附图，对本发明以下实施例中的具体实施方法进行详细阐述。

实施例1.构建EGFR-E27-CAR载体

人工合成anti-EGFR scFv，然后与CD8α信号肽、CD8α或IgG4铰链域、CD8α跨膜域、4-1BB共刺激域及CD3ζ胞内域连接，构建EGFR-CAR载体。前期在原代细胞上分别感染表达CD8α或IgG4铰链域的慢病毒，我们发现与IgG4铰链域相比，携带CD8α铰链域的EGFR-CAR具有更高的表达效率(图1A)。将PD-1単链抗体E27人工合成后，进行overlap PCR，通过T2A剪切信号肽与EGFR-CAR相连。接下来，我们设计了三个人源的信号肽作为E27的分泌信号，Western blot验证后，最终选择了IL-2信号肽(图1B)。载体构建后，EGFR-CAR利用ScaI-HF与EcoRV-HF双酶切验证后分别得到3787bp、2902bp、2510bp大小的目的条带，EGFR-E27-CAR利用XbaI与ScaI-HF双酶切验证后得到4773bp、3787bp、1539bp大小的目的条带，符合预期，如图1C-D所示，经测序验证完全无误，说明载体构建成功。

实施例2.制备EGFR-E27-CAR T细胞，检测CAR表达效率。

利用三质粒包装系统，将构建好的CAR载体与psPAX2、pMD2G以5:4:3的摩尔比包装慢病毒，然后感染293FT-17细胞，通过定量PCR检测病毒滴度在5.4×10⁷/mL左右。利用阴选的方法从PBMC分离人CD3 T细胞，加入CD3/CD28磁珠进行活化，48h后，病毒感染活化后的CD3 T细胞，如图2所示，CAR的表达效率在50-60％，同时，Western blot表明PD-1単链抗体能够分泌到细胞上清中。

实施例3.E27在原代CD3 T细胞功能活性的检测

E27修饰EGFR-CAR T细胞后，为了验证其在体外的功能活性，利用CCK8实验在不同的时相点检测CAR T细胞增殖能力，在没有外源PD-L1刺激下，与Mock T和EGFR-CAR T细胞相比，EGFR-E27-CAR T增殖活性没有差异，如图3A所示。为了验证T细胞分泌的E27是否会有效结合自身的PD-1，我们利用流式检测了细胞表面PD-1的表达，结果表明，与EGFR-CAR T细胞相比，EGFR-E27-CAR T细胞组PD-1的表达效率降低了约10％(图3B)。进一步，我们将高表达PD-L1的A549与CAR T细胞按照2:1的比例共孵育48h，然后收集孔板中的效应细胞与靶细胞，分别用CD3与EGFR的流式抗体进行染色分析，实验结果表明，当共孵育后，EGFR-E27-CAR组靶细胞相对减少，而CAR T细胞能够更有效地扩增(图3C)。

实施例4.制备靶细胞

我们选择了A549及H460作为靶细胞，同时以乳腺癌细胞系MDA-MB-231作为阳性对照。首先，通过流式细胞检测，三株细胞系均不同程度地表达EGFR抗原，如图4所示。进一步，为了更好地检测PD-1単链抗体的作用，我们构建了PD-L1与荧光素酶共表达的慢病毒载体，后者是为了方便小鼠活体成像(图5)。利用嘌呤霉素筛选获得稳转株后，流式细胞检测靶细胞表面PD-L1表达均在90％左右，同时，利用荧光素酶底物也检测到Luc表达，表明肿瘤细胞系制备成功(图6)。

实施例5.EGFR-E27-CAR T细胞在体外对靶细胞的杀伤检测

在体外将Mock T、EGFR-CAR T、EGFR-E27-CAR T与A549-pdl1-luc、H460-pdl1-luc、MDA-MB-231-pdl1-luc，HT-29-pdl1-luc按照1:1，5:1，10:1的效靶比(E:T ratio)分别共孵育10h后，利用LDH检测其杀伤效率，如图7所示，在10:1的效靶比下，EGFR-E27-CAR T细胞对三株细胞系有约95％的杀伤效率，优于EGFR-CAR T组(图7)。

实施例6.EGFR-E27-CAR T促进细胞因子的释放

在体外将Mock T、EGFR-CAR T、EGFR-E27-CAR T与A549-pdl1-luc、H460-pdl1-luc、MDA-MB-231-pdl1-luc分别共孵育24h后，收取细胞上清，Elisa检测IL-2、TNF-α和INF-γ的含量。如图8所示，EGFR-CAR与EGFR-E27-CAR T细胞INF-γ的分泌量达到1.2ng/mL左右，TNF-α的含量约1.1ng/mL，IL-2的含量约0.4ng/mL，与对照组具有显著差异。

实施例7.EGFR-E27-CAR T细胞体内抗肿瘤作用检测

选用4-8周的NSG免疫缺陷雌鼠，每只小鼠皮下注射5×10⁶A549-pdl1-luc靶细胞，待肿瘤细胞移植成功后随机分为PBS、EGFR-CAR、EGFR-E27-CAR三组，7天后，尾静脉注射1×10⁷效应细胞，14天后，尾静脉重复注射效应细胞一次，每周一次活体成像，监测荧光强度变化。如图9所示，随着时间延长，PBS组小鼠肿瘤不断增大，EGFR-CAR组在注射了效应细胞后，肿瘤体积开始缩小，荧光信号逐渐减弱，35天后，60％的小鼠肿瘤基本完全清除。EGFR-E27-CAR组，35天后80％肿瘤已经消失，只有一只小鼠活体成像后出现较弱的荧光信号。进一步对各个时相点的荧光强度进行定量，结果表明，E27修饰后，增强了EGFR-CAR T细胞的体内抗肿瘤功能。

实施例8.EGFR-E27-CAR T细胞抑制了肿瘤生长

在肿瘤细胞注射40天左右，PBS组肿瘤通过游标卡尺测量，最大直径已经达到15mm，达到小动物实验伦理要求的上限，因此将小鼠颈椎脱臼处死后，剥离皮下肿瘤组织，拍照后统计肿瘤重量，如图9C所示，EGFR-CAR组与EGFR-E27-CAR组小鼠肿瘤明显小于PBS组，同时，将肿瘤重量进行统计分析后显示，EGFR-E27-CAR组与PBS组相比具有显著性差异(P<0.001)。

本发明中所述的序列如下：

SEQ ID NO:1:

CD8αleader

DNA

人工序列(artificial sequence)

63

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG

SEQ ID NO:2

EGFR scFv

DNA

人工序列(artificial sequence)

747

GAGGTCCAGCTCGTGCAGTCCGGAGCCGAAGTGAAGAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAAGTGAGCTGTAAGGCCAGCGGCGGCACATTCTCCAGCTACGCCATTGGATGGGTGAGACAAGCCCCCGGCCAAGGACTGGAATGGATGGGCGGCATCATCCCCATCTTTGGCATCGCCAACTACGCTCAGAAGTTCCAAGGCAGAGTGACCATCACCGCCGACGAGAGCACCAGCTCCGCTTACATGGAGCTCTCCTCTCTGAGGTCCGAAGACACCGCCGTGTACTATTGCGCCAGAGAGGAGGGCCCTTACTGTAGCAGCACCAGCTGTTACGCCGCCTTCGATATTTGGGGCCAAGGCACACTGGTGACAGTGTCCTCCGGCGGCGGCGGATCCGGAGGCGGAGGAAGCGGAGGAGGAGGCTCCCAGAGCGTGCTGACCCAAGACCCCGCCGCTTCCGTGGCTCTGGGCCAAACCGTGAAAATCACATGCCAAGGCGATTCTCTGAGGAGCTACTTCGCTAGCTGGTACCAGCAGAAACCCGGCCAAGCCCCCACACTGGTGATGTACGCTAGAAACGATAGACCCGCCGGCGTGCCCGATAGATTCAGCGGCAGCAAGTCCGGCACATCCGCTTCTCTGGCTATTAGCGGACTGCAGCCCGAGGATGAGGCTGACTACTACTGTGCCGCTTGGGACGATTCTCTGAACGGCTATCTGTTTGGAGCCGGCACAAAGCTGACCGTGCTG

SEQ ID NO:3

CD8α铰链域

DNA

人工序列(artificial sequence)

135

ACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAG AGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGAT

SEQ ID NO:4

CD8α跨膜域

DNA

人工序列(artificial sequence)

72

ATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCSEQ ID NO:5

4-1BB共刺激域

DNA

人工序列(artificial sequence)

126

AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGG AAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG

SEQ ID NO:6

CD3ζ信号传导域

DNA

人工序列(artificial sequence)

336

AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACAAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGC

SEQ ID NO:7

T2A剪切信号肽

DNA

人工序列(artificial sequence)

66

GGCAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGG

SEQ ID NO:8

IL-2信号肽

DNA

人工序列(artificial sequence)

60

ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGT

SEQ ID NO:9

PD-1単链抗体VH

DNA

人工序列(artificial sequence)

351

GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGATCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGCAGCTATGCCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTGGTAGTGGTGGTAGCACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGCGCAACTACATCTCTATGTTCGATTCTTGGGGTCAAGGTACTCTGGTGACCGTCTCCTCA

SEQ ID NO:10

3×G₄S

DNA

人工序列(artificial sequence)

45

GGTGGTGGTGGTAGCGGCGGCGGCGGCTCTGGTGGTGGTGGATCC

SEQ ID NO:11

PD-1単链抗体VL

DNA

人工序列(artificial sequence)

324

CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGATTACCTGTGGGGGAAACAACATTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAGGCCAGGCCAGGCCCCTGTGCTGGTCATCTATTATGATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATTATGTCTTCGGAATTGGGACCAAGGTCACCGTCCTAGGT

SEQ ID NO:12

HA片段

DNA

人工序列(artificial sequence)

27

TACCCGTACGACGTTCCGGACTACGCT

SEQ ID NO:13

CD8αleader

PRT

人工序列(artificial sequence)

21

MALPVTALLLPLALLLHAARP

SEQ ID NO:14

EGFR scFv

PRT

人工序列(artificial sequence)

249

EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAIGWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGIANYAQKFQGRVTITADESTSSAYMELSSLRSEDTAVYYCAREEGPYCSSTSCYAAFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSVLTQDPAASVALGQTVKITCQGDSLRSYFASWYQQKPGQAPTLVMYARNDRPAGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQPEDEADYYCAAWDDSLNGYLFGAGTKLTVL

SEQ ID NO:15

CD8α铰链域

PRT

人工序列(artificial sequence)

45

TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD

SEQ ID NO:16

CD8α跨膜域

PRT

人工序列(artificial sequence)

24

IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC

SEQ ID NO:17

4-1BB共刺激域

PRT

人工序列(artificial sequence)

42

KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL

SEQ ID NO:18

CD3ζ信号传导域

PRT

人工序列(artificial sequence)

112

RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSE IGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR

SEQ ID NO:19

T2A剪切信号肽

PRT

人工序列(artificial sequence)

22

GSGEGRGSLLTCGDVEENPGPR

SEQ ID NO:20

IL-2信号肽

PRT

人工序列(artificial sequence)

20

MYRMQLLSCIALSLALVTNS

SEQ ID NO:21

PD-1単链抗体VH

PRT

人工序列(artificial sequence)

117

EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNYISMFDSWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO:22

3×G₄S

PRT

人工序列(artificial sequence)

15

GGGGSGGGGSGGGGS

SEQ ID NO:23

PD-1単链抗体VL

PRT

人工序列(artificial sequence)

108

QSVLTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQRPGQAPVLVIYYDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLT ISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDYVFGIGTKVTVLG

SEQ ID NO:24

HA片段

PRT

人工序列(artificial sequence)

9

YPYDVPDYA

以上所述，仅为本申请的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本申请公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 复旦大学

<120> 携带PD-1単链抗体且靶向EGFR抗原的CAR T免疫细胞的制备及其用途

<130> 20201030

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 63

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

<210> 2

<211> 747

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

gaggtccagc tcgtgcagtc cggagccgaa gtgaagaagc ccggcagcag cgtgaaagtg 60

agctgtaagg ccagcggcgg cacattctcc agctacgcca ttggatgggt gagacaagcc 120

cccggccaag gactggaatg gatgggcggc atcatcccca tctttggcat cgccaactac 180

gctcagaagt tccaaggcag agtgaccatc accgccgacg agagcaccag ctccgcttac 240

atggagctct cctctctgag gtccgaagac accgccgtgt actattgcgc cagagaggag 300

ggcccttact gtagcagcac cagctgttac gccgccttcg atatttgggg ccaaggcaca 360

ctggtgacag tgtcctccgg cggcggcgga tccggaggcg gaggaagcgg aggaggaggc 420

tcccagagcg tgctgaccca agaccccgcc gcttccgtgg ctctgggcca aaccgtgaaa 480

atcacatgcc aaggcgattc tctgaggagc tacttcgcta gctggtacca gcagaaaccc 540

ggccaagccc ccacactggt gatgtacgct agaaacgata gacccgccgg cgtgcccgat 600

agattcagcg gcagcaagtc cggcacatcc gcttctctgg ctattagcgg actgcagccc 660

gaggatgagg ctgactacta ctgtgccgct tgggacgatt ctctgaacgg ctatctgttt 720

ggagccggca caaagctgac cgtgctg 747

<210> 3

<211> 135

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 4

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 5

<211> 126

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 6

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 7

<211> 66

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

ggcagcggag agggcagagg aagtcttcta acatgcggtg acgtggagga gaatcccggc 60

cctagg 66

<210> 8

<211> 60

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

atgtacagga tgcaactcct gtcttgcatt gcactaagtc ttgcacttgt cacaaacagt 60

<210> 9

<211> 351

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttgatccagc ctggggggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctggagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180

gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggccgtat attactgtgc gcgcaactac 300

atctctatgt tcgattcttg gggtcaaggt actctggtga ccgtctcctc a 351

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

ggtggtggtg gtagcggcgg cggcggctct ggtggtggtg gatcc 45

<210> 11

<211> 324

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

cagtctgtgc tgactcagcc accctcagtg tcagtggccc caggaaagac ggccaggatt 60

acctgtgggg gaaacaacat tggaagtaaa agtgtgcact ggtaccagca gaggccaggc 120

caggcccctg tgctggtcat ctattatgat agcgaccggc cctcagggat ccctgagcga 180

ttctctggct ccaactctgg gaacacggcc accctgacca tcagcagggt cgaagccggg 240

gatgaggccg actattactg tcaggtgtgg gatagtagta gtgattatgt cttcggaatt 300

gggaccaagg tcaccgtcct aggt 324

<210> 12

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tacccgtacg acgttccgga ctacgct 27

<210> 13

<211> 21

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 13

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 14

<211> 249

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 14

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Ser Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Glu Gly Pro Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys Tyr Ala Ala

100 105 110

Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val

130 135 140

Leu Thr Gln Asp Pro Ala Ala Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val Lys

145 150 155 160

Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Phe Ala Ser Trp Tyr

165 170 175

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Thr Leu Val Met Tyr Ala Arg Asn

180 185 190

Asp Arg Pro Ala Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly

195 200 205

Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln Pro Glu Asp Glu Ala

210 215 220

Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly Tyr Leu Phe

225 230 235 240

Gly Ala Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

245

<210> 15

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 15

Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala

1 5 10 15

Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly

20 25 30

Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp

35 40 45

<210> 16

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 16

Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

20

<210> 17

<211> 42

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 17

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 18

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 18

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 19

<211> 22

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 19

Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu

1 5 10 15

Glu Asn Pro Gly Pro Arg

20

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 20

Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Asn Ser

20

<210> 21

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 21

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Ile Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asn Tyr Ile Ser Met Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 22

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 23

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 23

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Tyr

85 90 95

Val Phe Gly Ile Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 24

Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala

1 5

Claims

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体包括CD8α信号肽、靶向EGFR的scFv、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、4-1BB共刺激域、CD3ζ信号传导域、T2A剪切信号肽、IL-2信号肽、PD-1単链抗体E27的VH区、3×G₄S、PD-1単链抗体E27的VL区；

所述的CD8α信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示；

所述的靶向EGFR的scFv氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示；

所述的CD8α铰链域的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示；

所述的CD8α跨膜域的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示；

所述的4-1BB胞内共刺激域的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示；

所述的CD3ζ传导域的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示；

所述的T2A剪切信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；

所述的IL-2信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；

所述的PD-1単链抗体VH区的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；

所述的3×G₄S的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示；

所述的PD-1単链抗体E27的VL区的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。

2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体还包括HA片段。

3.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1所述的嵌合抗原受体的编码核酸。

4.一种细胞，其特征在于，所述的细胞是表达靶向肿瘤细胞EGFR的CAR，同时能够分泌PD-1単链抗体的免疫细胞；

所述的细胞表达权利要求1所述的嵌合抗原受体。

5.如权利要求4所述的细胞，其特征在于，所述的免疫细胞由慢病毒感染后获得，

所述的慢病毒包括：CD8α信号肽、靶向EGFR的scFv、CD8α铰链域、CD8α跨膜域、4-1BB共刺激域、CD3ζ信号传导域、T2A剪切信号肽、IL-2信号肽、分泌型PD-1単链抗体的VH区、3×G₄S、VL区及HA片段的编码核酸。

6.如权利要求4所述的细胞，其中，所述免疫细胞为T淋巴细胞或者NK细胞。

7.权利要求1-2中任意一种嵌合抗原受体的应用，其特征在于，所述的应用是权利要求1-2中任意一种嵌合抗原受体在制备抗肿瘤药物中的应用；

所述肿瘤源自乳腺癌细胞、肺癌、卵巢癌、胃癌、前列腺癌、肾细胞癌、胰腺癌或者结直肠癌。