CN110981960A

CN110981960A - 一种嵌合抗原受体（car）及其应用

Info

Publication number: CN110981960A
Application number: CN201911352973.0A
Authority: CN
Inventors: 刘和平; 夏商周; 姜结根; 何玉凯; 万阳; 夏黎明
Original assignee: Guangzhou Yiyang Biological Technology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Yiyang Biological Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-25
Filing date: 2019-12-25
Publication date: 2020-04-10
Anticipated expiration: 2039-12-25
Also published as: CN110981960B

Abstract

本发明公开了一种PD‑L1 CAR结构，其CAR序列的具体结构为：CD8α前导肽—PD‑L1 scFv—CD8α跨膜区—CD137胞内共刺激域—CD247胞内激活域。其将肿瘤靶向性和T细胞双激活通路分子整合为单一的PD‑L1嵌合受体基因，大大地增加基因修饰T细胞治疗实体瘤的可行性，降低了制备成本，可应用于PD‑L1高表达的实体瘤的治疗中，如肺癌、肝癌、结肠癌等。

Description

一种嵌合抗原受体(CAR)及其应用

技术领域

本发明涉及细胞治疗技术领域，具体涉及一种嵌合抗原受体(CAR)及其应用。

背景技术

T淋巴细胞在发挥抗肿瘤作用时是通过其表面的TCR(T cell receptor，T细胞受体)对肿瘤细胞进行识别和杀伤。然而，研究发现，多种肿瘤细胞的PD-L1(Programmeddeath ligand 1，程序性细胞死亡受体配体1)表达均有上调，PD-L1与T细胞的受体PD-1结合，从而抑制T细胞增殖和活化，使T细胞处于失活状态，造成了肿瘤细胞的免疫逃逸。

体外基因修饰免疫细胞可以使T细胞识别新的靶点并激活而具有杀灭肿瘤细胞的功能。其中嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是由针对某抗原的单链抗体(scFv)和T细胞激活信号(CD28/CD137，CD3 zeta链)通过基因重组而成。CAR修饰的T细胞可以不依赖MHC识别肿瘤细胞表面的抗原决定簇。CAR结构经过不断的改良优化，CAR-T细胞在血液肿瘤临床试验治疗中显示良好的靶向性、杀伤性和持久性，展示了巨大的发展潜力和应用前景。

针对B细胞膜特异性抗原CD19嵌合抗原受体修饰的T细胞(CD19 CAR-T细胞)多次多中心难治性和复发性ALL临床治疗高达92％完全缓解率，毒副反应(AEs)如B细胞生产障碍，细胞因子释放综合症(CRS)/细胞因子风暴(CS)也是可控的。非常遗憾的是这一新兴技术治疗效果仍然未在实体瘤治疗中得到复制。科学家们在这方面做了很多尝试，往往是疗效不佳及毒副作用太大而无法继续。在设计用于实体瘤治疗的CAR时，最为困难的是选择肿瘤细胞表面特异分子作为靶点；其次实体瘤组织中存在大量髓源性免疫抑制性细胞(MDSC)和Treg，还会诱导巨噬细胞由免疫活化型(M1)向免疫抑制型(M2)转化。CAR T细胞如何克服肿瘤免疫抑制性微环境仍为重大挑战。因此需要通过创造性思维，设计构建CAR-T细胞，实现其在实体肿瘤治疗中的新突破。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明的目的在于提供一种PD-L1特异性单链抗体、含有该单链抗体的嵌合抗原受体、特异性CAR-T细胞及其应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种PD-L1单链抗体，其具有：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链可变区(PD-L1 V_H)和氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的轻链可变区(PD-L1 V_L)。

所示重链可变区和轻链可变区通过连接链(Linker)连接，Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

作为优选地，上述的PD-L1单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。

一种PD-L1嵌合抗原受体，其包含以上所述的PD-L1单链抗体。

一种PD-L1嵌合抗原受体，其包含：

(1)PD-L1抗原结合域；

(2)跨膜区：

(3)胞内信号传导域；

所述PD-L1抗原结合域包含上述的PD-L1单链抗体。

所述跨膜区可选自下列膜蛋白的跨膜区：CD8α、FcεRI、TCRα、TCRβ和NKG2D。优选为CD8α的跨膜区。

所述胞内信号传导域还包括共刺激结构域和激活域，所述共刺激结构域可选自下列蛋白的共刺激信号分子：CD137(4-1BB)，CD28，OX40或ICOS中的一种或多种，优选为CD137(4-1BB)；所述激活域为来源于CD3 Zeta胞内信号传导序列。

进一步优选地，所述PD-L1抗原结合域前还连接有引导肽序列，所述引导肽序列可以将目标蛋白定位于细胞膜，所述引导肽序列可选自CD8α、CD8β、FcεRI、TCRα、TCRβ和NKG2D前导序列，优选为CD8α的前导序列段。

进一步优选地，所述的PD-L1嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

一种核酸分子，其编码以上所述的PD-L1嵌合抗原受体，其核苷酸序列优选为SEQID NO.18。

一种表达载体，其包括表达载体和接入所述表达载体的CAR基因序列，所述CAR基因序列为上述编码PD-L1嵌合抗原受体的核酸分子，所述表达载体为慢病毒载体pGIPZ、pLenti-GFP、pLVX-shRNAz、pLJM1-EGFP等中的任一种。

一种CAR-T细胞，其特征在于，所述细胞被以上述的表达载体修饰，以表达以上所述的PD-L1嵌合抗原受体。

以上所述的PD-L1单链抗体及其核酸分子、PD-L1嵌合抗原受体及其核酸分子、表达载体、或CAR-T细胞在制备PD-L1高表达肿瘤治疗药物中的应用。所述肿瘤包括肺癌、肝癌、结肠癌或淋巴瘤。

一种制剂，其含有以上所述的CAR-T细胞。

本发明的有益效果是：

(1)本发明的PD-L1特异性单链抗体由atezolizumab抗体衍生而来，其对PD-L1的特异性和亲合力都优于其他PD-L1抗体；

(2)本发明PD-L1单链抗体基因经过优化，提高了慢病毒体外包装效率(提高滴度TU/ml，利用本专利之方法我们可以获得大于10^7TU/ml的上清液)及PD-L1 CAR在T细胞内表达；

(3)本发明将肿瘤靶向性和T细胞双激活通路分子整合为单一的PD-L1嵌合受体基因，大大地增加基因修饰T细胞治疗实体瘤的可行性，降低了制备成本，可应用于PD-L1高表达的实体瘤的治疗中，如肺癌、肝癌、结肠癌等；

(4)本发明采用的慢病毒载体pGIPZ具有双抗药性，氨卡青霉素和zeocin抗性，可以防止慢病毒DNA间重组，保证了慢病毒包装的效率和安全性。

附图说明

图1：PD-L1嵌合抗原受体结构示意图。

图2：对照组CD38、试验组FR-T(M)和CAR-T(L1)对肺癌细胞的杀伤活性实验：A为肺癌细胞株hcc827，B为肺癌细胞株H1975、C为肺癌细胞株H3122；效靶比(ET3:1、ET10:1、ET30:1)；CD38：针对该分子的CAR-T细胞；M：融合受体(PD-L1受体PD-1与细胞内T细胞活化域融合)修饰的T细胞；L1：PD-L1 CAR-T细胞；横坐标为实验处理时间，纵坐标为细胞存活率。

图3：小鼠皮下肺癌成瘤实验—治疗2周后实验组肿瘤大小图：Group1：L1治疗组，Group2：M治疗组，Group3：CD38治疗组，Group4：NT(空白)组；肿瘤细胞与T细胞混合注射组(5只/组，共8组)，皮下接种注射，左侧(Left)实验组注射的是H1975细胞(T细胞：肿瘤细胞＝1:2.54)，右侧(Right)实验组注射的是H1299细胞(T细胞：肿瘤细胞＝1:2.92)。

图4：小鼠皮下肺癌成瘤实验—小鼠肿瘤重量记录：-1：L1治疗组，-2：M治疗组，-3：CD38治疗组，-4：NT(空白)组，L：Left，R：Right；肿瘤细胞与T细胞混合注射组(5只/组，共8组)，皮下接种注射，左列(left)实验组注射的是H1975细胞(T细胞：肿瘤细胞＝1:2.54)，右列(Right)实验组注射的是H1299细胞(T细胞：肿瘤细胞＝1:2.92)；横坐标表示各实验处理组，纵坐标表示小鼠肿瘤重量。

图5：小鼠皮下肺癌成瘤实验—小鼠肿瘤体积随天数的变化：-1：L1治疗组，-2：M治疗组，-3：CD38治疗组，-4：NT(空白)组，L：Left，R：Right；肿瘤细胞与T细胞混合注射组(5只/组，共8组)，皮下接种注射，左列(Left)实验组注射的是H1975细胞(T细胞：肿瘤细胞＝1:2.54)，右列(Right)实验组注射的是H1299细胞(T细胞：肿瘤细胞＝1:2.92)；横坐标表示肿瘤注射后天数，纵坐标表示小鼠肿瘤体积。

图6：尾静脉注射实验—小鼠体重记录：实验组为M和L1注射组，对照组为CTR(PBS)和CD38注射组；横坐标表示尾静脉注射后时间；纵坐标表示小鼠重量。

图7：实施例—患者外周血中CAR-T细胞阳性率：A.细胞回输完成后CAR-T细胞阳性率0.08％；B.随访期(4周后)CAR-T细胞阳性率3.30％。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

本发明各个实施例中使用的主要生物材料来源说明如下：

XbaI、MluI酶：NEB公司；pGIPZ：Open Biosystems公司；PD-L1 CAR基因：华大基因；辅助质粒pSPAX2.0和pMD2.G：Open Biosystems公司；293T细胞、Jurkat细胞：ATCC公司；阴性磁珠：Miltenyl公司；CD3/CD8单抗：StemCell公司；传导增强剂DEAE-DEXTRAN：Sigma；血清培养基：Gibco公司；hFc::PD-L1融合蛋白：Bpsbioscience公司；APC-抗hFc：BioLegend公司；流式细胞仪：BD公司。

实施例1

一、PD-L1单链抗体的制备

由atezolizumab抗体衍生得到PD-L1特异性单链抗体，其具有：重链可变区(PD-L1V_H)和轻链可变区(PD-L1 V_L)。重链可变区和轻链可变区通过连接链(PD-L1-Linker)连接。其中：Atezolizumab是一种经美国FDA批准用于治疗肺癌的人源化PD-L1单克隆抗体。它对人类PD-L1具有高度特异性。使用其重链(H)和轻链(L)可变区的基因片段经过某些修饰后构建PD-L1单链抗体/受体可在人T细胞中表达。

PD-L1 V_H的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

PD-L1 V_L的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

PD-L1-Linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

所述的PD-L1单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，DNA序列如SEQ IDNO.8所示。

本实施例的PD-L1特异性单链抗体由atezolizumab抗体衍生而来，由atezolizumab的重链可变区V_H DNA通过连接链linker与轻链可变区V_L DNA连接而形成。它保证了原抗体的特异性，且具备有足够的亲和力。(PD-L1单链抗体可以保持其原始亲和力的一半，足够用于后续使用，既不是优点，也不是缺点)

二、PD-L1 CAR慢病毒的制备

1.PD-L1单链抗体的DNA序列与CD8α跨膜区(SEQ ID NO.9)，CD137(4-1BB)(SEQ IDNO.10)和CD3 zeta胞内段DNA序列(SEQ ID NO.11)，融合而成PD-L1嵌合抗原受体CAR，加上CD8α前导序列(SEQ ID NO.12)后，交由华大基因化学合成。

2.将合成好的PD-L1 CAR基因(SEQ ID NO.13)通过XbaI/MluI(购自NEB公司)位点取代慢病毒载体pGIPZ(Open Biosystems公司)中CMV-GFP-IRES-sHRNA片段而成为L1慢病毒载体。

3.L1与包装质粒pSPAX2.0和pMD2.G(Open Biosystems公司)共转染293T(ATCC公司)细胞，包装L1慢病毒，离心浓缩和纯化。用Jurkat细胞(ATCC公司)测定病毒滴度(>10^9TU/ml)，然后置于-80℃待用。

三、PD-L1 CAR载体的构建

本实施例所构建的CAR序列具体结构为：CD8α前导肽—PD-L1 scFv—CD8α跨膜区—CD137胞内共刺激域—CD247胞内激活域(以下简称PD-L1 CAR)，其核苷酸序列如SEQID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。所用的慢病毒载体为pGIPZ慢病毒载体。

具体构建方法如下：

在PD-L1 CAR序列起始密码(AUG)前(5`)引入Kozark序列及XbaI位点，3`端引入MluI位点后交给华大基因化学合成。然后克隆进pGIPZ XbaI/MluI位点，取代其间的CMV-GFP-IRES-shRNA基因片段。PD-L1 CAR慢病毒载体简称为L1，并经DNA测序其准确无误。

L1质粒经细菌扩增后，纯化-20℃冻存备用。

L1质粒DNA与辅助质粒pSPAX2.0和pMD2.G共转染293T细胞，在293T细胞里包装慢病毒L1，并释放到细胞上清液里，上清液里的L1慢病毒经浓缩纯化并测滴度后置于-80℃保存备用。

四、PD-L1 CAR-T细胞的制备

分离纯化人外周血T淋巴细胞，培养扩增，利用步骤二得到的慢病毒转导T淋巴细胞，使所述T淋巴细胞表达PD-L1 CAR融合蛋白(SEQ ID NO.14)，得到PD-L1 CAR-T细胞。

具体制备方法如下：

采集人外周血单个核细胞PBMCs，经阴性磁珠(Miltenyl公司)分离纯化T细胞，无血清培养基培养(Gibco公司)，经CD3/CD8单抗(StemCell公司)激活后，用冻存的L1病毒按照MOI 10:1或20:1转导T细胞，同时添加传导增强剂DEAE-DEXTRAN(10ug/ml，Sigma公司)，6小时候换新鲜培养基继续培养至约24小时收集冻存备用，只留少数(约5x10⁵)继续培养2天后，用hFc::PD-L1融合蛋白(Bpsbioscience公司)，APC-抗hFc(BioLegend公司)，染色后经流式细胞仪(BD公司)测定PD-CAR阳性T细胞率(转导率)。

五、抑癌效果实验

1、制备的PD-L1 CAR-T细胞分别与三种肺癌细胞株(hcc827、H1975、H3122)共同培养一定时间后，体外检测细胞存活率，结果发现，PD-L1 CAR-T细胞在E/T＝3:1时，18小时就能杀死几乎所有PD-L1(+)靶细胞，实验结果如图2所示。

在荷瘤实验中，将PD-L1 CAR-T细胞与肺癌细胞混合皮下注射，每天观察小鼠体重和肿瘤情况。治疗2周后，处死小鼠并解剖。结果显示PD-L1 CAR修饰的T细胞(L1-T)细胞具有显著的抗肿瘤能力(实验结果如图3-图5所示)。其中，图3显示治疗2周后实验组肿瘤大小；图4显示的是小鼠肿瘤重量记录；图5显示的是小鼠肿瘤体积随天数的变化。结果统计分析：无论注射H1975还是H1299细胞，L1组与其他组肿瘤大小相比，均存在显著差异性(P<0.05)。

2、在小鼠尾静脉注射(2×10⁶cells/只)PD-L1 CAR-T细胞，解剖小鼠后测量小鼠体重，从结果可知，PD-L1 CAR-T没有出现显著的毒副作用，实验结果如图6所示。

4、CAR-T细胞治疗晚期肺癌患者，第一次安全性随访检测患者体内PD-L1 CAR-T增殖情况，流式结果显示，患者细胞回输后3天体内几乎无法检测到CAR-T细胞，细胞回输第一次随访(4周后)检测到CAR T细胞占T淋巴细胞总数的3.30％，实验结果如图7所示。

以上实验结果表明，本发明的PD-L1 CAR-T细胞在体外体内(小鼠)肿瘤细胞杀伤/抑制试验中，显示出强大的作用。在病人体内回输的PD-L1 CAR-T细胞大量扩增；病人随访时间虽短，但已经显示有抗肿瘤效应(CT成像显示肿瘤的周长缩小了约10mm)。

本实施例仅为本发明技术方案的一个优先案例，本实施例的PD-L1嵌合抗原受体，其跨膜区CD8α可进一步替换为FcεRI、TCRα、TCRβ和NKG2D。共刺激结构域CD137(4-1BB)可进一步替换为CD28，OX40或ICOS中的一种或多种。引导肽序列CD8α可进一步替换为CD8β、FcεRI、TCRα、TCRβ和NKG2D前导序列。都属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州益养生物科技有限公司

<120> 一种嵌合抗原受体（CAR）及其应用

<130>

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 114

<212> PRT

<213> PD-L1 VH

<400> 1

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

1 5 10 15

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile

20 25 30

His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp

35 40 45

Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val

<210> 2

<211> 342

<212> DNA

<213> PD-L1 VH

<400> 2

cagctggtgg agtctggggg aggcttggtt cagcctgggg ggtccctgag actctcctgt 60

gcagcctctg gattcacctt cagtgactct tggatccact gggtccgcca ggctccgggg 120

aaggggctgg agtgggtcgc atggattagt ccttatggcg gtagcacata ctacgcagac 180

tccgtgaagg gccgattcac catctccgca gacacctcca agaacaccgc ctatctgcag 240

atgaacagcc tgagagccga ggacaccgcc gtgtattact gtgccagaag acattggccc 300

ggcggctttg actactgggg ccaggggacc ctggtcaccg tc 342

<210> 3

<211> 105

<212> PRT

<213> PD-L1 VL

<400> 3

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu

100 105

<210> 4

<211> 315

<212> DNA

<213> PD-L1 VL

<400> 4

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attacttgcc gggcaagtca ggatgtgagc accgccgtgg cctggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatagc gcatcatttt tgtattcagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gaagtggatc agggacagat tttactctca ccatcagcag tctgcagcct 240

gaagattttg caacatatta ctgtcaacag tatctgtatc accctgccac tttcggccag 300

ggaaccaagg tggag 315

<210> 5

<211> 20

<212> PRT

<213> PD-L1-Linker

<400> 5

Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Glu Val

20

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> PD-L1-Linker

<400> 6

atcaaaagag gtggcggtgg ctcgggcggt ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaggtg 60

<210> 7

<211> 238

<212> PRT

<213> PD-L1 scFv

<400> 7

Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val

1 5 10 15

Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp

20 25 30

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala

35 40 45

Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe

65 70 75 80

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly

85 90 95

Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

130 135 140

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala

145 150 155 160

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly

165 170 175

Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala

180 185 190

Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala

195 200 205

Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly

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Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

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<210> 8

<211> 723

<212> DNA

<213> PD-L1 scFv

<400> 8

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gggaaagccc ctaagctcct gatctatagc gcatcatttt tgtattcagg ggtcccatca 180

aggttcagtg gaagtggatc agggacagat tttactctca ccatcagcag tctgcagcct 240

gaagattttg caacatatta ctgtcaacag tatctgtatc accctgccac tttcggccag 300

ggaaccaagg tggagatcaa aagaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc 360

ggcggatctg aggtgcagct ggtggagtct gggggaggct tggttcagcc tggggggtcc 420

ctgagactct cctgtgcagc ctctggattc accttcagtg actcttggat ccactgggtc 480

cgccaggctc cggggaaggg gctggagtgg gtcgcatgga ttagtcctta tggcggtagc 540

acatactacg cagactccgt gaagggccga ttcaccatct ccgcagacac ctccaagaac 600

accgcctatc tgcagatgaa cagcctgaga gccgaggaca ccgccgtgta ttactgtgcc 660

agaagacatt ggcccggcgg ctttgactac tggggccagg ggaccctggt caccgtctcc 720

gca 723

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<213> PD-L1 VL

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tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 180

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<212> DNA

<213> CD137

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gaactg 126

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<211> 347

<212> DNA

<213> CD3 zeta

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<212> DNA

<213> CD8αLeader

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<211> 1519

<212> DNA

<213> PD-L1 CAR

<400> 13

caagcttcga gccaagcagc gtcctgggga gcgcgtcatg gccttaccag tgaccgcctt 60

gctcctgccg ctggccttgc tgctccacgc cgccaggccg gacatccaga tgacccagtc 120

tccatcctcc ctgtctgcat ctgtgggaga cagagtcacc attacttgcc gggcaagtca 180

ggatgtgagc accgccgtgg cctggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaagctcct 240

gatctatagc gcatcatttt tgtattcagg ggtcccatca aggttcagtg gaagtggatc 300

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aagaggtggc ggtggctcgg gcggtggtgg gtcgggtggc ggcggatctg aggtgcagct 480

ggtggagtct gggggaggct tggttcagcc tggggggtcc ctgagactct cctgtgcagc 540

ctctggattc accttcagtg actcttggat ccactgggtc cgccaggctc cggggaaggg 600

gctggagtgg gtcgcatgga ttagtcctta tggcggtagc acatactacg cagactccgt 660

gaagggccga ttcaccatct ccgcagacac ctccaagaac accgcctatc tgcagatgaa 720

cagcctgaga gccgaggaca ccgccgtgta ttactgtgcc agaagacatt ggcccggcgg 780

ctttgactac tggggccagg ggaccctggt caccgtctcc gcaaccacga cgccagcgcc 840

gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc ctgtccctgc gcccagaggc 900

gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg ctggacttcg cctgtgatat 960

ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt ctcctgtcac tggttatcac 1020

cctttactgc aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag 1080

accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga 1140

aggaggatgt gaactgagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca 1200

gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt 1260

ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca 1320

ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg 1380

gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac 1440

agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gctaacagcc 1500

aggacgcgta gcggccgca 1519

<210> 14

<211> 485

<212> PRT

<213> PD-L1 CAR

<400> 14

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

100 105 110

Leu Tyr His Pro Ala Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

115 120 125

Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

130 135 140

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

145 150 155 160

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

165 170 175

Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

180 185 190

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

195 200 205

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

210 215 220

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

225 230 235 240

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr

260 265 270

Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala

275 280 285

Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe

290 295 300

Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val

305 310 315 320

Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys

325 330 335

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

340 345 350

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

355 360 365

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro

370 375 380

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

385 390 395 400

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

405 410 415

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

420 425 430

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

435 440 445

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

450 455 460

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

465 470 475 480

Ala Leu Pro Pro Arg

485

Claims

1.一种PD-L1单链抗体，其具有：氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的重链可变区和氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的轻链可变区。

2.根据权利要求1所示的PD-L1单链抗体，其特征在于所示重链可变区和轻链可变区通过连接链连接，其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.根据权利要求2所述的PD-L1单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。

4.一种核酸分子，其编码权利要求1-3任一项所述的PD-L1单链抗体。

5.一种嵌合抗原受体，其包含权利要求1-3任一项所述的PD-L1单链抗体。

6.一种嵌合抗原受体，其包含：

(1)PD-L1抗原结合域；

(2)跨膜区：

(3)胞内信号传导域；

所述PD-L1抗原结合域包含权利要求1-3任一项所述的PD-L1单链抗体。

7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜区可选自下列膜蛋白的跨膜区：CD8α、FcεRI、TCRα、TCRβ和NKG2D。

8.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内信号传导域还包括共刺激结构域和激活域，所述共刺激结构域可选自下列蛋白的共刺激信号分子：CD137，CD28，OX40或ICOS中的一种或多种；所述激活域为来源于CD3 Zeta胞内信号传导序列。

9.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述PD-L1抗原结合域前还连接有引导肽序列，所述引导肽序列可以将目标蛋白定位于细胞膜，所述引导肽序列可选自CD8α、CD8β、FcεRI、TCRα、TCRβ和NKG2D前导序列。

10.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示。

11.一种核酸分子，其编码权利要求5-10任一项所述的嵌合抗原受体。

12.一种表达载体，其包括表达载体和接入所述表达载体的CAR基因序列，所述CAR基因序列为权利要求11所述的核酸分子，所述表达载体为慢病毒载体pGIPZ、pLenti-GFP、pLVX-shRNAz、pLJM1-EGFP中的任一种。

13.一种CAR-T细胞，其特征在于，所述细胞以权利要求12的表达载体修饰，以表达权利要求5-10任一项所述的嵌合抗原受体。

14.权利要求1-3任一项所述的PD-L1单链抗体、权利要求4所述的核酸分子、权利要求5-10任一项所述的嵌合抗原受体融合蛋白、权利要求11所述的核酸分子、权利要求12所述的表达载体、或权利要求13所述的CAR-T细胞在制备PD-L1高表达肿瘤治疗药物中的应用。

15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述肿瘤包括肺癌、肝癌、结肠癌或淋巴瘤。

16.一种制剂，其含有权利要求13所述的CAR-T细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。