CN112074278A - Bcma-car-t细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种单克隆抗人BCMA抗体，或一种单链可变片段(scFv)，该片段包含具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:7所示氨基酸序列的VL。本发明还涉及一种BCMA嵌合抗原受体(CAR)，其自N‑末端到C‑末端包括：(i)本发明的单链可变片段(scFv)，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域。本发明的单克隆抗体表现出对BCMA的选择性和高亲和力结合。基于本发明所述BCMA scFv的BCMA CAR‑T细胞显著降低了动物模型中多发性骨髓瘤肿瘤的生长。

Description

BCMA-CAR-T细胞
序列表、表格或计算机程序的参考
序列表以ASCII格式的文本文件通过EFS-Web与说明书同时提交，文件名为Sequence Listing.txt，创建日期为2019年3月25日，并且大小为15.9千字节。通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，并在此通过引用全文并入本文。
技术领域
本发明涉及特异性识别B细胞成熟抗原(BCMA)的特异性抗体和BCMA-CAR-T细胞，其对于肿瘤过继性免疫基因治疗领域是有用的。
背景技术
多发性骨髓瘤是一种在骨髓微环境中以浆细胞克隆性增殖为特征的癌变。多发性骨髓瘤是第二常见的血液恶性肿瘤，占美国所有血液恶性肿瘤的5-10％。尽管最近在治疗方面取得了进展，但多发性骨髓瘤仍然无法治愈且具有很高复发率，并属于难治性34疾病。
免疫疗法正在成为治疗癌症的一种非常有前途的方法。人类免疫系统的武装力量，T细胞或T淋巴细胞，不断寻找外来抗原并将异常细胞(癌症或经感染细胞)与正常细胞区分开来。利用CAR(嵌合抗原受体)结构对T细胞进行基因修饰是设计肿瘤特异性T细胞最常见的方法。将靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CAR-T细胞输入患者体内(称为过继性细胞转移或ACT)是一种有效的免疫治疗方法[1，2]。与化疗药物或抗体相比，CAR-T技术的优点在于经重新编程的工程化T细胞能在患者体内增殖并持续存在(“活的药物”)[1，3，4]。
CAR通常由位于N-末端部分的单克隆抗体来源的单链可变片段(scFv)、铰链、跨膜结构域和若干胞内共激活结构域：(i)CD28、(ii)CD137(4-1BB)、CD27、(iii)GITR或其他共刺激结构域，与CD3ζ激活结构域串联组成(图1)[1，2]。图1中示出了CAR的演变，其从第一代(没有共刺激结构域)到第二代(具有一个共刺激结构域)到第三代CAR(具有数个共刺激结构域)。制备具有两个共刺激结构域的CAR(所谓的第三代CAR)增强了CAR-T的杀伤活性，改善了CAR-T细胞的持久性，从而增强了其抗肿瘤活性。
自然杀伤细胞，或者NK细胞，是一种先天免疫系统中至关重要的细胞毒性淋巴细胞。NK细胞在脊椎动物适应性免疫响应中发挥的作用类似于细胞毒性T细胞。NK细胞能对病毒感染的细胞作出快速的响应，大约在感染后3天起作用，并对肿瘤的形成也有响应。
B细胞成熟抗原(BCMA)是由TNFRSF17基因编码的一种细胞表面受体，又称CD269和肿瘤坏死因子受体超家族成员17(TNFRSF17)。该受体主要在成熟的B淋巴细胞和大多数多发性骨髓瘤(MM)中表达[3]。
附图说明
图1示出了CAR的结构[6]。在左侧，它示出了第一代的结构(没有共刺激结构域)。在中间，它示出了第二代的结构(一个共刺激结构域CD28或4-1BB)。在右侧，它示出了第三代CAR(两个或数个共刺激结构域)。
图2示出了BCMA蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)；胞外结构域标有下划线。
图3示出了BCMA CAR(第二代)的结构。
图4示出了在ELISA试验中，BCMA抗体与BCMA蛋白结合，但不与源自BCMA胞外结构域的短肽或阴性对照CD363蛋白结合。BCMA抗体与BCMA抗原的结合具有特异性并呈剂量依赖性增加。Student’s-t检验表明，BCMA蛋白与BCMA多肽和对照组比较，*P<0.0001，BCMA抗体与BCMA蛋白可显著地结合。
图5示出了BCMA抗体与BCMA抗原结合的亲和力。将BCMA单克隆抗体(mAb)4C8A以3种浓度上样于Blitz小鼠Fc捕获传感器上(第一竖柱)，然后洗脱(第二竖柱)。通过Blitz工作站可全程监测其结合情况。X轴表示以秒为单位的时间；Y轴，B表示Blitz系统监测的BCMA抗体的结合情况。
图6示出了BCMA抗体与RPMI8226多发性骨髓瘤细胞的FACS分析。该BCMA抗体来自于4CA8杂交瘤细胞的上清液。X轴表示BCMA抗体的荧光强度，Y轴表示RPMI8226多发性骨髓瘤细胞的数目。
图7示出了在多发性骨髓瘤细胞系中检测到BCMA，但在白血病或其他癌细胞系中检测不到。Y轴表示用FACS检测的同种型抗体或BCMA抗体的MFI。X轴表示不同的癌细胞系。Student’s-t检验，p<0.05。
图8示出了用Promab的4C8A和Biolegend抗体在数个多发性骨髓瘤细胞系中高特异性地检测到BCMA。分别将BCMA mAb 4C8A、Biolegend BCMA mAb克隆号19F2和小鼠IgG1同种型对照mAb与骨髓瘤细胞系RPMI8226、H929，和MM1S，以及Burkitt淋巴瘤细胞系Raji和BCMA阴性细胞系K562进行孵育。通过流式细胞仪用PE偶联的抗小鼠IgG检测上述抗体与细胞的结合。每个BCMA mAb的平均荧光强度(MFI)除以同种型对照mAb的MFI，得到的数值以柱状图定量表示结合强度。该实验重复3-10次；在MM1S细胞中BCMA mAb 4C8A与BCMA mAb19F2比较，*p<0.05。
图9示出了通过乳酸脱氢酶(LDH)试验的BCMA-CAR-T细胞对多发性骨髓瘤细胞的显著杀伤作用。BCMA-CAR-T细胞和T细胞对多发性骨髓瘤细胞的杀伤作用比较，P<0.05，具有显著差异；BCMA-CAR-T细胞对多发性骨髓瘤细胞和BCMA阴性的k563的细胞的杀伤作用比较；P<0.05，具有显著差异。
图10示出了BCMA-CAR-T细胞在多发性骨髓瘤细胞中分泌高水平的IFN-γ，而在阴性对照细胞中不分泌高水平的IFN-γ。T细胞和CAR-T细胞在多发性骨髓瘤细胞的IFN-γ比较，p<0.05具有显著差异。
图11A和1IB示出了BCMA-CAR-T细胞特异性地杀伤CHO-BCMA细胞并分泌显著水平的IFN-γ。图11A：将BCMA CAR-T细胞、模拟CAR-T细胞和未转导T细胞加入到单层培养的CHO细胞和CHO-BCMA细胞中，全程监测单层细胞的阻抗(即完整性)。本实验重复3次。BCMA CAR-T细胞与模拟CAR-T细胞和未转导T细胞比较，*p<0.0001。图11B：通过ELISA测量释放到RTCA培养基中的IFN-γ水平；BCMA CAR-T细胞与模拟CAR-T细胞和未转导T细胞比较，*P<0.0001。
图12示出了BCMA CAR-T细胞显著抑制小肿瘤移植小鼠肿瘤生长。A：NSG小鼠皮下注射RPMI8226骨髓瘤细胞并每两周用卡尺测量肿瘤尺寸。在第16天和24天(箭头)，小鼠分别静脉注射BCMA CAR-T细胞、模拟CAR-T细胞和PBS；BCMA CAR-T细胞组与模拟CAR-T细胞组和PBS组中肿瘤尺寸比较，*p<0.01，**p<0.0001。B：切除肿瘤并拍照。C：经切除的肿瘤称重；BCMA CAR-T细胞组与模拟CAR-T细胞组和PBS组比较，*p<0.05。D：在研究过程中，小鼠每周称重。E：研究结束时利用ELISA测量血浆中人IFN-γ水平；BCMA CAR-T细胞组与模拟CAR-T细胞组和PBS组比较，*p<0.0001。F：研究结束时利用流式细胞仪分析外周血细胞与人BCMA蛋白和人CD3特异性抗体的结合情况。与CD3 mAb结合的细胞百分比显示在左侧，而同时能与BCMA蛋白结合的人T细胞的百分比显示在右侧；BCMA CAR-T细胞组与模拟CAR-T细胞组比较，*p<0.0001。
图13示出了BCMA-CAR-T细胞显著抑制了大RPMI8226肿瘤移植小鼠肿瘤生长。BCMA4C8A CAR-T细胞在负荷有500mm3肿瘤的小鼠模型中的治疗性表征。A：NSG小鼠皮下注射RPMI8226骨髓瘤细胞，在第27天和31天(箭头)，小鼠静脉注射BCMA CAR-T细胞或模拟CAR-T细胞，从注射RPMI8226骨髓瘤细胞开始，每两周用卡尺测量肿瘤尺寸；BCMA CAR-T细胞组与模拟CAR-T细胞组比较，*p<0.0001。B：切除肿瘤并拍照。C：经切除的肿瘤称重；BCMA CAR-T细胞组与模拟CAR-T细胞组比较，*p<0.05。D：在研究过程中，小鼠每周称重。BCMA-CAR-T细胞不会减轻小鼠体重。
具体实施方式
定义
如本文所使用的，“嵌合抗原受体(CAR)”指的是一种融合蛋白，其包括能够与抗原结合的胞外结构域、非该胞外结构域来源的多肽组成的跨膜结构域，和至少一个胞内结构域。“嵌合抗原受体(CAR)”有时被称为“嵌合受体”、“T小体”，或“嵌合免疫受体(CIR)”。“能与抗原结合的胞外结构域”指的是能与某一抗原结合的任何寡肽或多肽。“胞内结构域”指的是任何已知作为结构域起作用的寡肽或多肽，该结构域传递信号以激活或抑制细胞内的生物过程。
如本文所使用的，“结构域”指的是多肽中的一个区域，其独立于其他区域折叠而成结构。
如本文所使用的，“单链可变片段(scFv)”指的是来源于保留与抗原结合能力的抗体的单链多肽。scFv的一个示例包括通过重组DNA技术形成的抗体多肽，并且其中免疫球蛋白重链(H链)和轻链(L链)片段的Fv区域通过间隔序列连接。本领域技术人员已知用于工程化scFv的各种方法。
如本文所使用的，“肿瘤抗原”指的是具有抗原性的生物分子，其表达导致癌症。
人BCMA蛋白由184个氨基酸组成：1-54：胞外结构域；55-77：跨膜结构域；78-184：细胞质结构域。BCMA的氨基酸序列如图2所示，且胞外结构域标有下划线。BCMA缺乏信号肽并类似于其他受体，诸如BAFF受体、跨膜激活子、亲环素配体相互作用子和钙调节子(TACI)[4]。这些受体在B细胞成熟和浆细胞分化中发挥重要作用。它们的配体包括在MM患者中表达增高的BAFF和APRIL[4]。单克隆抗体靶向受体-配体相互作用，同时CAR-T细胞疗法结合BCMA以杀死MM细胞。BCMA还与TRAF1、2、3、5和6相互作用。
用于制备BCMA抗体的免疫原是含有BCMA胞外结构域序列的重组蛋白。发明人已经制备了特异性靶向BCMA的鼠抗人单克隆抗体。发明人已经制备了可靶向过表达BCMA肿瘤抗原癌细胞的BCMA-CAR-T细胞。本发明的BCMA-CAR-T细胞可分泌高水平细胞因子对抗多发性骨髓瘤癌细胞。
本发明涉及一种单克隆抗人BCMA抗体(克隆号4C8A)，其包括具有SEQ ID NO:6所示氨基酸的VH和具有SEQ ID NO:7所示氨基酸的VL。制备抗人BCMA单克隆抗体用于识别人BCMA蛋白全长胞外结构域(参见图2，下划线序列)的。在一个实施方案中，抗人BCMA单克隆抗体是一单链可变片段(scFv)。
本发明还涉及一种嵌合抗原受体融合蛋白，其自N-末端到C-末端包括：(i)抗BCMA的单链可变片段(scFv)(本发明)，(ii)跨膜结构域，(iii)至少一个共刺激结构域，和(iv)激活结构域。
ScFv可以是VH-接头-VL或VL-接头-VH。
在一个实施方案中，共刺激结构域由CD28、4-1BB、GITR、ICOS-1、CD27、OX-40和DAP10自由选择组合。一个优选的共刺激结构域是CD28。
一个优选的激活结构域是CD3 zeta(CD3 Z或CD3ζ)。
跨膜结构域可以源自天然多肽，或者也可以是人工设计的。源自天然多肽的跨膜结构域能从任何膜结合蛋白或跨膜蛋白中获得。例如，可以使用T细胞受体的α或β链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、ICOS、CD154，或GITR的跨膜结构域。人工设计的跨膜结构域是一种主要包括诸如亮氨酸和缬氨酸的疏水残基的多肽。优选地，在合成的跨膜结构域的两端各发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。可选地，在跨膜结构域和胞内结构域之间可以设置短的寡肽接头或多肽接头，例如长度为2～10个氨基酸的接头。在一个实施方案中，可以使用具有甘氨酸-丝氨酸连续序列的接头序列。
本发明提供了一种编码BCMA CAR的核酸序列。编码CAR的核酸序列能通过常规方法从特定CAR的氨基酸序列中制备。编码氨基酸序列的碱基序列能从上述NCBI RefSeq ID或GenBenk的登录号中每个结构域的氨基酸序列获得，并且本发明的核酸可以使用标准的分子生物学和/或化学方法来制备。例如，基于碱基序列可以合成核酸，本发明的核酸通过利用聚合酶链反应(PCR)从cDNA文库获得DNA片段，并将其组合得到。
编码本发明CAR的核酸序列能插入载体，并且载体可以导入细胞。例如，可以使用诸如逆转录病毒载体(包括肿瘤逆转录病毒载体、慢病毒载体，和假型载体)、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、猿猴病毒载体、痘苗病毒载体或仙台病毒载体、Epstein-Barr病毒(EBV)载体，和HSV载体的病毒载体。优选使用缺乏复制能力从而不能在已感染细胞中自我复制的病毒载体。
例如，当使用逆转录病毒载体时，可以基于载体拥有的LTR序列和包装信号序列选择合适的包装细胞，以使用该包装细胞制备逆转录病毒颗粒。包装细胞的示例包括PG13(ATCC CRL-10686)、PA317(ATCC CRL-9078)、GP+E-86和GP+envAm-12，和Psi-Crip。还可以使用具有高转染效率的293细胞或293T细胞制备逆转录病毒颗粒。基于逆转录病毒和包装细胞生产的多种逆转录病毒载体可用于包装逆转录病毒载体，这些逆转录病毒载体可从许多公司购得。
CAR-T细胞通过CAR与特定抗原结合，从而将信号传递到细胞内，并且细胞因此被激活。表达CAR的细胞的激活根据宿主细胞的种类和CAR的胞内结构域而变化，并且能基于例如细胞因子的释放、细胞增殖率的改善、细胞表面分子的变化等作为指标来确认。例如，从经激活的细胞中释放的细胞因子毒性(肿瘤坏死因子、淋巴毒素等)会引起表达靶向抗原的细胞的破坏。此外，细胞因子的释放或细胞表面分子的改变会刺激其他免疫细胞，例如B细胞、树突状细胞、NK细胞和巨噬细胞。
表达CAR的细胞可用作疾病的治疗剂。该治疗剂包括作为活性成分的表达CAR的细胞，并且它可以进一步包括合适的赋形剂。
发明人已经制备了一种BCMA特异性mAb，克隆号4C8A，并在体外对其进行了表征。4C8A克隆表现了与BCMA的选择性和高亲和力结合，并用于构建单链可变片段(scFv)。发明人将4C8A scFv插入到第二代CAR中，制备了CAR-T细胞，并在体外和小鼠异种移植肿瘤模型中测量它们对多发性骨髓瘤细胞的活性。发明人证明，基于mAb 4C8A的BCMA CAR-T细胞显著抑制了多发性骨髓瘤的生长，表明BCMA CAR-T细胞能治疗多发性骨髓瘤患者。
发明人制备了BCMA-ScFv-CD28-CD3ζ-CAR-T(BCMA-CAR-T)细胞并用于对抗多发性骨髓瘤细胞(MM)。BCMA-CAR-T细胞分泌高水平的细胞因子，并且乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性试验呈阳性，表明CAR-T细胞对靶标癌细胞具有杀伤活性，对肿瘤或病毒抗原具有细胞毒性。
本发明的小鼠抗人BCMA单克隆抗体和BCMA-ScFv的优势包括对BCMA阳性的多发性骨髓瘤(MM)癌细胞的高特异性和高亲和力(KD>10-10)。本发明的BCMA抗体在许多临床应用中作为治疗剂具有很强的效力。
本发明的BCMA抗体可在BCMA阳性的MM癌细胞中检测出BCMA。
本发明的BCMA抗体能用于免疫疗法应用：毒素/药物偶联抗体、治疗性单克隆抗体、人源化BCMA抗体，和CAR-T细胞免疫疗法。
BCMA抗体能与另一种肿瘤抗原一起使用以产生双特异性CAR(如BCMA-CS1、BCMA-CD38、BCMA-CD33等)。
使用本发明BCMA抗体的BCMA-CAR-T细胞可有效靶向BCMA阳性癌细胞系中的BCMA抗原。
BCMA-CAR-T可以与其他疗法，诸如检查点抑制剂、靶向疗法、小分子抑制剂，和抗体等结合使用。
BCMA抗体可以通过定点突变进行修饰，以进行亲和力调节；它可以用于人源化和全人源抗体制备。
BCMA-CAR-T细胞能临床上用于抗BCMA阳性癌细胞。
共激活结构域的修饰：CD28、4-1BB、GITR等能用于提高BCMA-CAR的疗效。标签偶联的BCMA scFv可以用于CAR的制备。
第三代CAR-T或其他共激活信号结构域所组成的CAR结构中都能使用该BCMA-scFv。
BCMA CAR能与靶向其他肿瘤抗原或肿瘤微环境的CAR，例如VEGFR-1-3、PDL-1、双特异性抗体(如BCMA和CD3)相结合以用于治疗。
BCMA-CAR-T细胞能用于抵抗对化疗有抵抗力并形成侵袭性肿瘤的癌症干细胞。
BCMA-CAR能用来制备其他类型的细胞，诸如CAR-自然杀伤(NK)细胞、BCMA-CAR-巨噬细胞，和其他BCMA-CAR造血细胞，它们可以靶向BCMA阳性的癌症。本发明提供经修饰以表达BCMA-CAR的T细胞，或NK细胞，或巨噬细胞，或造血细胞。
本发明对治疗哺乳动物受试者，诸如人类、马、狗和猫，是有用的。本发明在治疗人类方面特别有用。
以下实施例进一步阐明了本发明。这些实施例仅用于阐明本发明，并且不应被解释为限制性的。
实施例1、杂交瘤
我们用杂交瘤制备了小鼠单克隆抗人BCMA抗体。该杂交瘤是抗BCMA胞外结构域多肽的。杂交瘤技术是标准的并已发表的[5]。该抗体为IgG1型并与BMCA的胞外结构域结合。VH和VL和scFv的序列示于实施例2中。
实施例2、BCMA VH和VL和ScFv序列
通过对BCMA阳性的杂交瘤克隆4C8A4和4C8A10进行测序，得到BCMA scFv。BCMAscFv克隆A的结构为：VH-接头-VL。接头是G4S×3。
粗体突出显示BCMA抗体克隆4C8A的VH的核苷酸序列(SEQ ID NO:2)；下划线突出显示VL的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)；在中间(斜体)的是编码接头的核苷酸序列(SEQ IDNO:4)。
Figure BDA0002715610840000051
BCMA scFv(BCMA克隆4C8A)蛋白：(SEQ ID NO:5)
Figure BDA0002715610840000052
在蛋白中，粗体突出显示VH的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)；下划线突出显示VL的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)；在中间(斜体)的是3×G4S接头GGGGSGGGGSGGGGS序列的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。
实施例3、BCMA-CAR序列
BCMA-CAR构建方案如图3所示。慢病毒载体Lenti CMV-MCS-EF1a-puro用于克隆所有scFv CAR序列。
以下核苷酸序列示出了本发明的CD8信号肽-BCMA ScFv-CD8铰链-TM28-CD28-CD3ζ。CAR结构包括人CD8信号肽、BCMA scFv(VH-接头3×(G4S)-VL)、CD8铰链、CD28跨膜、激活结构域、CD3ζ(图3)。
CD8信号肽-BCMA scFv(VH-接头-VL)-CD8铰链-CD28跨膜域-CD28-CD3-ζ：
〈CD8信号肽)〉，SEQ ID NO:9
Figure BDA0002715610840000061
〈Nhe I限制性位点〉
gctagc
〈BCMA，克隆4C8A4 scFv〉，SEQ ID NO:10
Figure BDA0002715610840000062
〈XhoI限制性位点〉
CTCGAG
〈CD8铰链〉，SEQ ID NO:11
Figure BDA0002715610840000063
〈CD28 TM/激活〉，SEQ ID NO:12
Figure BDA0002715610840000064
〈CD3ζ〉，SEQ ID NO:13
Figure BDA0002715610840000065
〈EcoRI限制性位点〉
gaattc
BCMA-CAR的核苷酸序列(SEQ ID NO:14)
Figure BDA0002715610840000071
经翻译的BCMA-CAR蛋白的氨基酸序列(构建体结构参见图3)，SEQ ID NO:15
Figure BDA0002715610840000072
实施例4、BCMA抗体通过ELISA试验特异性检测BCMA抗原
我们用杂交瘤制备了小鼠抗人BCMA单克隆抗体4C8A。在包被有BCMA蛋白，或BCMA肽(C末端缺失37个残基的BCMA胞外结构域蛋白)，或无关对照CD363蛋白的ELISA板中孵育抗体稀释液。用HRP偶联的抗小鼠IgG和TMB底物检测BCMA mAb 4C8A与包被蛋白的结合。ELISA示出了杂交瘤BCMA Ab与BCMA抗原特异性结合，但不与对照蛋白或BCMA肽特异性结合。不同于阴性对照，BCMA与BCMA蛋白的结合呈剂量依赖性：随着抗体稀释度的降低而降低(图4)。
实施例5、BCMA抗体对BCMA蛋白具有高亲和力
将BCMA 4C8A抗体稀释至100、50和25nM，并加入到抗小鼠IgG生物传感器(ForteBio Corp，Menlo Park，CA)。5分钟后，洗去生物传感器未结合抗体。用Blitz系统(ForteBio)监测抗体结合情况，并用Blitz软件测量抗体的解离常数。BCMA mAb(克隆4C8A)表现出与BCMA有很强的结合，其Kd值约为2.8nM(图5)。
实施例6、BCMA抗体通过免疫染色检测293-BCMA细胞中表达的人BCMA蛋白
细胞系RPMI8226、H929、MM1S、Raji、K562、293和CHO购自ATCC(Manassas，VA)，在含10％FBS(AmCell，Mountain View，CA)的DMEM(GE Healthcare，Chicago，IL)或RPMI-1640培养基(Thermo Fisher，Waltham，MA)中培养。CHO-BCMA细胞购自BPS Bioscience(SanDiego，CA)并培养于含10％FBS和1mg/ml新霉素(Thermo Fisher)的Ham’s F12K培养基中。采用Ficoll-Paque(GE Healthcare)密度沉淀法分离人外周血单核细胞(PBMC)。
我们将BCMA(CD269)-人Fc蛋白和与人Fc蛋白融合的对照CD18蛋白转染293细胞并进行免疫染色分析。BCMA抗体检测到细胞表面表达的BCMA蛋白，但未检测到阴性对照CD18-人Fc蛋白，证明BCMA抗体与细胞内BCMA的结合具有很高的特异性。通过IHC，4C8A克隆与RPMI8226细胞、骨髓瘤原发肿瘤和正常人肝结合，但不与其他任何正常人类组织，或其他类型的人类癌组织结合，证实了BCMA表达的特异性。BCMA抗体也能检测到原发性多发性骨髓瘤肿瘤中的BCMA。
实施例7、通过FACS分析BCMA抗体与多发性骨髓瘤细胞的结合
我们在多发性骨髓瘤RPMI8226细胞上用BCMA抗体进行了如[6]所述的FCAS分析(图6)。在RPMI8226多发性骨髓瘤细胞系中检测到BCMA抗体(图6)。然后我们检测了多发性骨髓瘤细胞系和几个阴性对照细胞系：白血病相关细胞系K562、Raji、HL-60和肺癌A549细胞系(图7)。该BCMA抗体在多发性骨髓瘤中检测到BCMA，但在其他癌细胞系中未检测到(图7)，证明其具有很高的特异性。
实施例8、BCMA抗体检测BCMA抗原的能力与商用BCMA抗体相似或更好
我们对BCMA抗体进行了测序并且VH和VL和ScFv的序列如实施例2中所示。我们纯化并分离了BCMA抗体并与Biolegend公司的商品化抗体(克隆号：19F2)进行了比较。通过FCAS分析BCMA抗体检测BCMA抗原的能力与Biolegend抗体相当或更好(图8)。
实施例9、BCMA-CAR-慢病毒的制备
发明人将BCMA CAR构建体通过Xba I和EcoR I位点插入到慢病毒载体中。在Xba I和EcoR I克隆位点之间插入含有BCMA ScFv-CD28-CD3ζ的慢病毒CAR构建体。
在293T细胞中制备慢病毒，并通过RT-PCR得到病毒滴度。然后用等剂量慢病毒转导T细胞。
如(6)所述制备BCMA-CAR-慢病毒。简而言之，Syno Biological(北京，中国)合成了编码BCMA CAR的DNA，并将其亚克隆到第三代慢病毒载体Lenti CMV-MCS-EF1a-puro上。T75瓶中接种1000万个生长受阻的HEK293FT细胞(Thermo Fisher)并培养过夜，然后使用CalPhos转染试剂盒(Takara，Mountain View，CA)将pPACKH1慢病毒载体包装混合物(System Biosciences，Palo Alto，CA)和10μg慢病毒载体混合并进行细胞转染。第二天将培养基换成新鲜培养基，并且48h后收集含慢病毒的培养基。通过2100g离心30min，清除培养液中的细胞碎屑。病毒颗粒以112000g离心100min收集，重悬在AIM V培养基中，等量分装并冷冻于-80℃。根据制造商方案用Lenti-X qRT-PCR试剂盒(Takara)和7900HT热循环仪(Thermo Fisher)进行定量RT-PCR检测。慢病毒滴度为>1×108pfu/ml。
实施例10、BCMA-CAR-T细胞的制备
如[6]所述制备BCMA-CAR-T细胞。简而言之，将PBMC以1×106细胞/ml悬浮在含10％FBS和10ng/mI IL-2(Thermo Fisher)的AIM V-AlbuMAX培养基(Thermo Fisher)中，与等数量(1:1比例)的CD3/CD28Dynabeads(Thermo Fisher)混合，并在未经处理的24孔板(每孔0.5ml)中培养。在24小时和48小时以感染复数(MOI)为5将慢病毒加入至培养物，同时1：1的加入TransPlus转导增强子(AlStem)。当T细胞在接下来的10-12天内增殖时，每隔2-3天计数细胞一次，并在培养基中加入具有10ng/ml IL-2的新鲜培养基使细胞密度维持在1-3×106细胞/ml。
实施例11、BCMA-CAR-T细胞杀伤多发性骨髓瘤细胞并分泌高水平的IFN-γ对抗BCMA阳性癌细胞
我们设计了具有图3所示CAR构建体的BCMA-CAR-T细胞。我们使用模拟scFv并制备模拟-CAR-T细胞作为阴性对照。将慢病毒BCMA CAR转染T细胞后，用BCMA重组蛋白通过如(6)中所述FACS检测到表达BCMA scFV的BCMA CAR-T细胞。T细胞和模拟CAR-T细胞均为阴性。
我们将BCMA-CAR-T细胞与多发性骨髓瘤细胞RPMI8266、HT929和MM 1S细胞孵育，分别用Promega和Fisher的试剂盒根据说明书进行LDH试验[6]和ELISA。使用K562细胞作为阴性对照。简而言之。将靶标细胞(RPMI8226、H929、MM1S、K562)与效应细胞(CAR-T细胞或未转导T细胞)按1:1比例(各1×104个细胞)培养在有200μl含10％FBS的AIM V-AlbuMAX培养基的U型底96-孔板中，设置三次重复。16小时后，将培养基顶部150μl的上清液转移到V型底96孔板上并300g离心5min，以去除残余细胞。将顶部120μl上清液转移到一个新的96孔板上，并用来自R&D Systems(Minneapolis，MN)的试剂盒根据说明书进行人干扰素-γ水平的ELISA分析。BCMA-CAR-T细胞杀伤RPMI8226、HT929和MM1S细胞(图9)，并分泌高水平的IFN-γ对抗多发性骨髓瘤癌细胞(图10)。CAR-T细胞杀伤和IFN-γ的分泌水平显著高于T细胞和模拟CAR-T细胞。
实施例12、BCMA-CAR-T细胞特异性杀伤CHO-BCMA细胞
如(6)中所述，用BCMA-CAR-T细胞在CHO-BCMA细胞和阴性对照CHO细胞中进行细胞毒性试验和IFN-γELISA试验。简而言之，将贴壁的靶标细胞(CHO或CHO-BCMA)以每孔1×104个细胞接种到96孔E-板(Acea Biosciences，San Diego，CA)中并在基于阻抗的实时细胞分析(RTCA)xCELigence系统(Acea Biosciences)中监测过夜培养。次日取出培养液并换成含10％FBS±1×105效应细胞(CAR-T细胞或未转导T细胞)的AIM V-AlbuMAX培养液，重复三次。继续使用RTCA系统监测E-板中的细胞1-2天，并绘制阻抗随时间的变化。细胞毒性计算为(无效应细胞的靶标细胞阻抗-有效应细胞的靶标细胞阻抗)×100/无效应细胞的靶标细胞阻抗。BCMA CAR-T细胞显著降低CHO-BCMA单层的阻抗(表明细胞溶解)(图12，左侧)，而模拟CAR-T细胞或未转导细胞则不会。BCMA CAR-T细胞不杀伤亲本CHO细胞，表明对CHO-BCMA细胞的细胞毒性作用是依赖于BCMA的表达(图11A)。RTCA试验的培养基分析表明，BCMACAR-T细胞对CHO-BCMA响应而产生显著水平的IFN-γ，但不对CHO细胞响应(图11B)。
实施例13、BCMA-CAR-T细胞显著抑制小鼠体内模型中RPME8226异种移植肿瘤的生长
通过已建立RPMI8226皮下肿瘤处理的NSG小鼠，检测BCMA 4C8A CAR-T细胞的治疗效果。首先，在第18天，肿瘤约为150mm3时施用CAR-T细胞，并在6天后再次施用。在BCMACAR-T细胞处理的小鼠中，肿瘤尺寸持续减小(图12A)；研究结束时，在7只小鼠中仅发现了1个微小肿瘤(图12B-C)。在PBS或模拟CAR-T细胞处理的小鼠中，肿瘤随着时间的推移继续增大(图12A-C)。BCMA CAR-T细胞对小鼠体重无影响(图12D)。在BCMA CAR-T细胞处理的小鼠的血流中检测到的人类T细胞显著多于模拟CAR-T细胞处理的小鼠，并且这些人T细胞中近20％是CAR-T细胞(图12E、F)。
在接下来的实验中，将多发性骨髓瘤RPMI8226细胞皮下注射到NSG小鼠(1×107细胞/小鼠)，并第27天肿瘤体积达到约500mm3时，以及第、31天注射BCMA-CAR-T细胞(1×107CAR-T细胞/小鼠)。BCMA-CAR-T细胞显著抑制小鼠RPMI8226肿瘤生长(图13)。肿瘤尺寸、体积和重量均明显减小(图13)。用BCMA-CAR-T细胞处理的小鼠没有引起小鼠体重下降，这表明CAR-T细胞对小鼠没有毒性(图13D)。此外，免疫组织化学分析证明移植肿瘤中含有人T细胞，证实了BCMA-CAR-T依赖机制。异种移植肿瘤中Ki-67染色减少并且caspase-3染色增加导致肿瘤生长抑制。
毒理学研究显示，BCMA-CAR-T细胞对动物没有毒性(数据未显示)。
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ccg 63
<210> 10
<211> 717
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 10
gtccagctgc agcagtctgg acctgagctg gtaaagcctg gggcttcagt gaagatgtcc 60
tgcaaggctt ctggatacac attcactagc tatgttatgc actgggtgaa gcagaagcct 120
gggcagggcc ttgagtggat tggatatatt attccttaca atgatgctac taagtacaat 180
gagaagttca aaggcaaggc cacactgact tcagacaaat cctccagcac agcctacatg 240
gagctcagca gcctgacctc tgaggactct gcggtctatt actgtgcacg ctataattac 300
gacgggtact tcgatgtctg gggcgcaggg accacggtca ccgtctcctc aggtggcggt 360
ggttctggtg gcggtggttc tggtggcggt ggttctgaca ttgtgatgac tcagtctcca 420
gccaccctgt ctgtgactcc aggagataga gtctctcttt cctgcagggc cagccagagt 480
attagcgact acttacactg gtatcaacaa aaatcacatg agtctccaag gcttctcatc 540
aaatatgctt cccaatccat ctctgggatc ccctccaggt tcagtggcag tggatcaggg 600
tcagatttca ctctcagtat caacagtgtg gaacctgaag atgttggagt gtattactgt 660
caaaatggtc acagctttcc tccgacgttc ggtggaggca ccaagctgga aatcaaa 717
<210> 11
<211> 147
<212> DNA
<213> 智人
<400> 11
aagcccacca cgacgccagc gccgcgacca ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag 60
cccctgtccc tgcgcccaga ggcgagccgg ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg 120
gggctggact tcgccagtga taagccc 147
<210> 12
<211> 204
<212> DNA
<213> 智人
<400> 12
ttttgggtgc tggtggtggt tggtggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt gaggagtaag aggagcaggc tcctgcacag tgactacatg 120
aacatgactc cccgccgccc cgggcccacc cgcaagcatt accagcccta tgccccacca 180
cgcgacttcg cagcctatcg ctcc 204
<210> 13
<211> 345
<212> DNA
<213> 智人
<400> 13
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgcag agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 180
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 240
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 300
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgct aatag 345
<210> 14
<211> 1488
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 14
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggctagcg tccagctgca gcagtctgga cctgagctgg taaagcctgg ggcttcagtg 120
aagatgtcct gcaaggcttc tggatacaca ttcactagct atgttatgca ctgggtgaag 180
cagaagcctg ggcagggcct tgagtggatt ggatatatta ttccttacaa tgatgctact 240
aagtacaatg agaagttcaa aggcaaggcc acactgactt cagacaaatc ctccagcaca 300
gcctacatgg agctcagcag cctgacctct gaggactctg cggtctatta ctgtgcacgc 360
tataattacg acgggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccacggtcac cgtctcctca 420
ggtggcggtg gttctggtgg cggtggttct ggtggcggtg gttctgacat tgtgatgact 480
cagtctccag ccaccctgtc tgtgactcca ggagatagag tctctctttc ctgcagggcc 540
agccagagta ttagcgacta cttacactgg tatcaacaaa aatcacatga gtctccaagg 600
cttctcatca aatatgcttc ccaatccatc tctgggatcc cctccaggtt cagtggcagt 660
ggatcagggt cagatttcac tctcagtatc aacagtgtgg aacctgaaga tgttggagtg 720
tattactgtc aaaatggtca cagctttcct ccgacgttcg gtggaggcac caagctggaa 780
atcaaactcg agaagcccac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 840
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgagcc ggccagcggc ggggggcgca 900
gtgcacacga gggggctgga cttcgccagt gataagccct tttgggtgct ggtggtggtt 960
ggtggagtcc tggcttgcta tagcttgcta gtaacagtgg cctttattat tttctgggtg 1020
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 1080
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 1140
tccagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 1200
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1260
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg cagagaagga agaaccctca ggaaggcctg 1320
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1380
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1440
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gctaatag 1488
<210> 15
<211> 496
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 15
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ala Ser Gln Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Val Ser
35 40 45
Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro
50 55 60
Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Tyr Ile Asn Ser Gly Gly Tyr Ile
65 70 75 80
Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp
85 90 95
Asn Ala Lys Asn Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu
100 105 110
Asp Ser Ala Leu Tyr Tyr Cys Val Pro Gly Phe Ala His Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Leu Val Ile Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser
145 150 155 160
Val Pro Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Asn
165 170 175
Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu
180 185 190
Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn
195 200 205
Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
210 215 220
Ala Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
225 230 235 240
Tyr Tyr Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly
245 250 255
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Leu Glu Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Ser Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Ser Asp Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val
305 310 315 320
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
325 330 335
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
340 345 350
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
355 360 365
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Glu Thr Gly Gly Lys Pro
420 425 430
Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
435 440 445
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
450 455 460
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
465 470 475 480
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490 495

Claims (12)

1.一种单克隆抗人BCMA抗体，其包括具有SEQ ID NO:6所示氨基酸的VH和具有SEQ IDNO:7所示氨基酸的VL。
2.一种单链可变片段(scFv)，其包括具有SEQ ID NO:6所示氨基酸的VH和具有SEQ IDNO:7所示氨基酸的VL。
3.权利要求2所述的scFv，进一步包括在VH和VL之间的接头。
4.权利要求3所述的scFv，其具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
5.一种嵌合抗原受体(CAR)，其自N-末端到C-末端包括：
(i)权利要求2所述的scFv，
(ii)跨膜结构域，
(iii)至少一个共刺激结构域，和
(iv)激活结构域。
6.权利要求5所述的CAR，其中，所述scFv具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求5所述的CAR，其中，所述共刺激结构域是CD28。
8.根据权利要求5所述的CAR，其中，所述激活结构域是CD3ζ。
9.权利要求5所述的CAR，其具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
10.一种编码权利要求5所述的CAR的核酸序列。
11.一种经修饰以表达权利要求1所述的CAR的T细胞。
12.一种经修饰以表达权利要求1所述的CAR的自然杀伤细胞。
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