KR102661969B1 - 조작된 면역 세포들의 분류/고갈을 위한 mAb-주도의 키메라 항원 수용체 시스템들 - Google Patents

조작된 면역 세포들의 분류/고갈을 위한 mAb-주도의 키메라 항원 수용체 시스템들 Download PDF

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바브라 존슨 사수
아르빈드 라팔
필리페 두차토
알렉산드레 줄리어릿
줄리안 발통
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셀렉티스 에스.에이.
리나트 뉴로사이언스 코프.
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Abstract

적어도 항원에 특이적인 VH 체인 및 VL 체인에 의하여 형성된 scFv를 포함하는 적어도 하나의 세포외 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코드하고, 상기 세포외 결합 도메인은 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드.

Description

조작된 면역 세포들의 분류/고갈을 위한 mAb-주도의 키메라 항원 수용체 시스템들
본 발명은 면역치료에 사용되는 개선된 키메라(chimeric) 항원(antigen) 수용체들 (CAR)에 대한 것으로, 그것의 세포외(extracellular) 결합(binding) 도메인들 (scFv)는 mAb-특이적 에피토프(epitope)의 삽입에 의하여 변형되어 상기 CAR들이 부여된(endowed) 면역 세포들의 분류 및/또는 고갈(depletion) 둘다를 가능하게 한다. 본 발명은 또한 상기 CAR들을 발현시키는 면역 세포들, 상기 CAR-발현시키는 면역 세포들을 시험관에서(in vitro) 분류 및/또는 생체내에서(in vivo) 고갈시키는(depleting) 방법들, 및 그것들의 치료적 용도에 대한 것이다.
생체 외(ex vivo)에서 생기는 자가조직의(autologous) 항원-특이적 T 세포들의 이동을 수반하는 입양 면역요법은 바이러스 감염들 및 암을 치료하는 유망한 전략이다. 입양 면역요법(adoptive immunotherapy)에 사용되는 T 세포들은 유전자 조작을 통한 T 세포들의 방향 전환(redirection) 또는 항원-특이적 T 세포들의 확장에 의하여 만들어질 수 있다 (Park, Rosenberg et al. 2011). 바이러스 항원 특이적 T 세포들의 이동은 이식 관련 바이러스 감염들 및 희귀한(rare) 바이러스-관련 악성종양들의 치료에 사용되는 잘 정립된 절차이다. 유사하게, 종양 특이적 T 세포들의 분리 및 이동은 흑색종의 치료에 성공적인 것으로 보여져 왔다.
T 세포들에서 신규한 특이성들은 이식유전자를 가진(transgenic) T 세포 수용체들 또는 키메라 항원 수용체들 (CARs)의 유전적 이동을 통하여 성공적으로 만들어져 왔다 (Jena, Dotti et al. 2010). CAR들은 단일 융합 분자에서 하나 이상의 신호전달(signaling) 도메인들과 관련된 타겟팅 모이어티로 구성된 합성 수용체들이다. 일반적으로 CAR의 결합 모이어티(moiety)는 단일(single)-체인(chain) 항체(antibody) (scFv)의 항원-결합 도메인으로 구성되는데, 이는 가요성(flexible) 링커(linker)에 의하여 연결된 단일클론 항체의 가벼운 그리고 무거운 가변 단편들을 포함한다. 수용체 또는 리간드 도메인들에 기반한 결합 모이어티들은 또한 성공적으로 사용되어 왔다. 일 세대 CAR들을 위한 신호전달(signaling) 도메인들은 CD3제타(zeta) 또는 Fc 수용체 감마 체인들의 세포질 영역으로부터 유래된다. 일 세대 CAR들은 T 세포 세포독성을 성공적으로 방향전환하는 것으로 보여져 왔으나, 그것들은 인 비보에서 연장된 확장 및 항-종양 활성을 제공하는데는 실패하였다. CD28, OX-40 (CD134), ICOS 및 4-1BB (CD137)을 포함하는 공(co)-자극(stimulatory) 분자들로부터의 신호전달 도메인들은 CAR 변형된 T 세포들의 증식을 증가시키고 생존을 증강시키기 위하여 (삼 세대) 조합하여 또는 단독으로 (이 세대) 첨가되어 왔다. CAR들은 T 세포들이 림프종들 및 고형 종양들을 포함하는 여러가지 악성종양들로부터 종양 세포들의 표면에서 발현되는 항원들에 대항하여 방향전환되는 것을 성공적으로 가능하게 하였다 (Jena, Dotti et al. 2010).
그러나, 생체내에서 종양 근절의 전례없는 효능에도 불구하고, CAR T 세포들은 환자들 내로 이동된 후 급성 부작용들(adverse events)을 촉진할 수 있다. 잘 문서화된 부작용들(adverse events) 중 이식편(Graft) 대(versus) 숙주(host) 질병(disease) (GvHD), 온-타겟 오프-종양(on-target off-tumor) 활성 또는 벡터 유래된 삽입적 돌연변이발생으로 인한 이상 림프구증식 능력(aberrant lymphoproliferative capacity)이다. 그러므로 생체내에서 발생하는 이러한 해로운 이벤트들을 예방하기 위하여 세포 특이적 고갈(depletion) 시스템들을 개발할 필요가 있다.
면역-매개된 부수적인 조직 손상을 제한하고 자가-내성(self-tolerance)의 유지에 결정적인, (CTLA-4- 또는 PD-1과 같은) 면역 체크포인트들로 언급되는 억제 신호들에 대한 것과 같은, 더 안전한 CAR-기반의 면역치료를 개발하는 많은 진행 중인 연구들이 있다 (Dolan et al, 2014). 최근, 억제성(inhibitory) 키메라 항원 수용체들 (iCARs)이 타겟을 벗어난 세포들을 접하는 T 세포 기능 상에 브레이크를 거는 목적을 갖는 것으로 설계되었다(Federov et al. 2013). 또다른 시스템이 CD20 키메라 항원 수용체가 유도성(inducible) 카스파제(caspase) 9 (iC9) 자살 스위치와 결합하는 Budde et al. (2013)에 기재되어 있다. 출원 US 2014/0286987에서, 후자의 유전자가 돌연변이된 FK506-결합(binding) 단백질(protein) (FKBP1)에 결합함으로써 프로드러그 AP1903 (타크롤리무스(tacrolimus))의 존재 하 기능적으로 만들어진다. 임상 시험이 상기 카스파제(capsase) 기술 (CaspaCIDeTM)이 GD2 타겟된 삼 세대 CAR T 세포들 내로 조작되는 회사 Bellicum에 의하여 지원받아 진행 중이다. 다량체화 제제에 기초한 유사한 세포사-유도성 시스템이 출원 WO 2014/152177에 기재되어 있다.
Philip et al (2014)는 형질도입된 세포들의 선택을 가능하게 하는 조밀한 마커/자살 유전자로서 사용되는 RQR8 시스템을 기재한다. RQR8은 CD34 및 CD20 항원들 둘다로부터 타겟 에피토프들의 조합으로부터 유래된다. 이 구조체는 임상적으로 승인된 CliniMACS CD34 시스템 (Miltenyi)으로 선택을 가능하게 한다. 게다가, 이 RQR8 구조체(construct)는 널리 사용되는 약학적 항체 리툭시맙(rituximab)에 결합하여, 이식유전자-발현시키는 세포들의 선택적 결실을 야기한다. 이 시스템에서, RQR8은 구제역 2A 펩타이드를 이용하여 레트로바이러스 벡터에서 CAR과 공-발현되고, 이로써 T-세포들의 표면에서 2 개의 독립적인 이식유전자들 (RQR8 및 CAR)의 발현을 야기한다. 이 시스템은 산업적 관점에서 몇몇 제한들을 보이는데, 첫 번째로, 그것은 큰 레트로바이러스 삽입(inserts) 클로닝을 요구하고, 두 번째로 형질전환된 세포들이 RQR8 및 CAR 폴리펩타이드들 둘 다를 발현시키는 것을 확실히 하기 위하여, 가능한 "거짓(false)-양성(positive)" 즉 폴리펩타이드들 둘다, 특히 바람직하지 않은 효과들의 경우 조작된 면역 세포들의 고갈(depletion)을 가능하게 하는 RQR8 자살 유전자를 발현시키지 않는 T-세포들을 제거하기 위한 것이다.
자가-면역 질병 및 이식의 맥락에서 T 세포들을 고갈시키는(depleting) 컨셉은 수십년 동안 임상에서 성공적으로 수행되어 왔다. T-세포들을 포함하는 세포-매개된 면역을 고갈시키기(deplete) 위하여 면역억제 약물들 예를 들어 글루코코르티코이드들 또는 세포증식억제제들(cytostatics) 예를 들어 알킬화제들 (사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 니트로소우레아들(nitrosoureas), 백금 화합물들...) 또는 항대사물질들(메토트렉사트(methotrexate), 아자티오프린(azathioprine), 플루오로우라실(fluorouracil)...)이 널리 사용된다. 그러나, 그것들의 면역억제 효능에도 불구하고, 이들 약물들은 그것들이 모든 T 및 B 세포들의 증식에 영향을 미치기 때문에 차이가 구별되지 않는다. 항체들은 가끔 림프구증식성 또는 자가면역 장애들, 특히 항-CD20 모노클로날들의 타겟된 치료와 더불어 급성 거부 반응을 예방하기 위하여 빠르고 강한 면역억제 치료로서 사용된다. 생체내에서 T 세포 서브셋들(subsets)의 제거가 골수 및 조직 동종이식편들(allografts)의 거부에서 CD4+ 및 CD8+ T 세포들의 역할을 결정하기 위하여, Cobbold et al. (1986)에 의하여, 그리고 가용성 단백질들에 대한 항체 반응을 만들기 위한 CD4+ T 세포들의 역할을 결정하기 위하여 Benjamin and Waldmann (1986)에 의하여 수행되었다. 생체내에서 고갈(depletion)은 항바이러스 세포독성 T 림프구(lymphocyte) (CTL) 반응들의 통제를 포함하는 여러가지 주제들을 연구하기 위하여 널리 수행되어 왔다 (Buller et al., 1987). 그러나, 지금까지 T 세포들 상에서 사용되어 온 항체들이 다른 세포 타입들과 더불어 쉬는(resting) 또는 활성화된 T 세포들에서 모두 널리 제시되는 항원들 (CD3, CD4, CD52)을 향해진다. 보통 말하는, 이러한 항체들의 사용은 CAR들이 부여된(endowed) 조작된 면역 세포들의 선택적 제거를 가능하게 하지 않을 것이다.
이후 제시된 바와 같이, 본 발명자들은 반면 임상적 부작용(adverse clinical event)의 경우 상기 CAR들를 발현시키는 면역 세포들의 생체내 고갈(depletion)을 가능하게 하는 반면, "거짓-양성"을 감소시킴으로써 CAR-발현시키는 면역 세포들의 최적화된 시험관내(in vitro) 분류를 가능하게 하는 "올인원(all-in-one)" 시스템을 추구하였다.
도 1; 단일-체인 CAR 스캐폴드를 여기에서 이용한 본 발명의 mAb-주도된 분류/고갈(depletion) 시스템의 도시적 구조체; 몇몇 구조들은 mAb-특이적 에피토프 및 VH, VL 체인들 의 다른 위치들과 키메라 scFv에 대하여 제시된다.
도 2: 본 발명의 mAb-주도된 시스템을 이용한 세포 분류 및 세포 고갈(depletion) 기능화의 도시적 제시. 특이적 mAb (+/- 보체)의 첨가는 키메라 scFv 내 그것의 에피토프를 인식함으로써 CAR+ T 세포들의 정제를 가능하게 한다. 세포 고갈(depletion) 단계 동안, 키메라 scFv 내 그것의 특이적 에피토프에 결합함으로써 동일한 특이적 mAb (+/- 보체)는 CAR+ T 세포들의 특이적 용해(lysis)를 유발한다.
도 3: 이중-특이적 항체를 이용한 세포 고갈(depletion)의 도시적 제시. 효과기(effector) 세포에 그리고 CAR-발현시키는 면역 세포에 둘다 결합함으로써, 이 시스템은 CAR-발현시키는 면역 세포의 표면에서 효과기 세포들의 모집을 가능하게 하고 그것들의 생체내 특이적 고갈(depletion)을 촉발시킨다.
도 4: 실시예들 1-2에서 사용된 CD20 미모토프(mimotope)(들)과 항-CD123 scFv를 발션시키는 10 CAR들에 대한 CAR 아키텍쳐. 일련의 10 키메라 scFv가 이 안에 하나 또는 두 개 카피들의 CD20 미모토프들(mimotopes)("미모토프(mimotope)"로 명명된 검은 박스)이 항-CD123 scFv 및 힌지 사이에 삽입되도록 설계된다. 도 4에 도시되듯이, 10개 CAR들 모두는 동일한 힌지 (CD8 힌지), 막관통 도메인 (CD8 TM), 공-자극 도메인 (4-1BB) 및 자극성 도메인 (ITAM CD3 제타)을 갖는다. 서열번호 1-10 은 리더 서열 MALPVTALLLPLALLLHAARP을 포함하는데, 이는 CAR가 초기에 발현될 때 존재하나, 세포의 표면에서 발현되는 CAR의 부분은 아니다.
scFv의 관점에서 미모토프(mimotope)(들)의 위치에 의존하여 3개 시리즈들의 CAR들이 설계된다 (서열번호 : 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10에 각각 대응되는 (항--CD123 No 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10):
- 첫 번째 시리즈: 서열번호 1-2 및 서열번호 3-4는 각각 하나 및 두 CD20 미모토프(mimotope)(들)이 항-CD123 scFv 및 힌지 사이에 삽입되고; 서열번호 2에서 GS 링커 가 힌지에 CD20 미모토프(mimotope)을 연결시키는 형태들에 대응된다. 서열번호 3-4에서, GS 링커는 두 개의 미모토프들(mimotopes) 사이의 공간을 차지하고, 서열번호 4에서, 미모토프들(mimotopes) 및 힌지 사이의 추가의(extra) GS 링커를 갖는다.
- 두 번째 시리즈: 서열번호 5-6은 하나의 카피의 CD20 미모토프(mimotope)가 항-CD123 scFv 내에 삽입되는 형태들(conformations)에 대응된다; 양 사이드들에 있는(lying) 짧은 GS 링커 (서열번호 5) 및 긴 GS 링커 (서열번호 6)의 각각의 존재로부터 오는 서열의 차이.
- 세 번째 시리즈: 서열번호 7 내지 10은 항-CD123 scFv가 CD 미모토프(mimotope)(들) 및 힌지 사이에 위치되는 형태들에 대응된다. 서열번호 7-8 및 서열번호 9-10 에서 각각, CD20 미모토프(mimotope) 의 한 카피 및 두 개 카피들이 삽입된다. GS 링커는 2 CD20 미모토프들(mimotopes) 사이에 삽입되고, 서열번호 10을 위하여, 보충의 GS 링커가 항-CD123 scFv에 미모토프들(mimotopes)을 연결시킨다.
도 5는 서열번호 1-4 또는 142의 항-CD123 CAR을 발현시키는 T 세포들 또는 임의의 항 CD123 CAR을 발현시키지 않는 대조군 T 세포 (임의의 mRNA 없는 mock T-세포-형질주입 단계)의 세포용해 활성을 보여준다. 세포용해 활성은 실시예 1에 기재된 대로 특이적 세포 용해(lysis) 빈도로서 표현된다.
도 6은 서열번호 1-4의 항-CD123 CAR을 발현시키는 T 세포들 또는 임의의 항 CD123 CAR 을 발현시키지 않는 대조군 T 세포에서 CDC 분석의 결과를 보여준다. (mock T 세포(임의의 mRNA 없는 형질주입 단계)가 리툭시맙 (RTX) 및 아기 토끼 보체 BRC와 배양된다). 그 결과들은 실시예 3에 나타난 대로 (대조군 실험에 대하여) 항-CD123 CAR 양성 T 세포들 중 생존가능한 세포들의 상대적 빈도로 표현된다.
도 7A, 7B 및 7C는 실시예 4 내지 6에서 테스트되고 설계된 서열번호 125 내지 141의 CAR들의 일반적인 구조체를 개시한다. 항 BCMA ScFV가 이들 모든 CAR들에서 사용되었다. CD34 에피토프 ("CD34"로 명명된 회색 박스) 또는 CD20 미모토프(mimotope) ("미모토프(mimotope)"로 명명된 검은 박스)로부터 선택된 하나, 둘, 셋 또는 네 개의 에피토프들이 다른 위치들에서, 즉 ScFv의 업스트림, ScFv의 다운스트림 또는 (V1 및 V2로 표시된) ScFv의 여러가지 체인들 사이에서 포함되었다. 도 7에 도시되었듯이, 모든 CAR들은 동일한 힌지 (CD8 힌지), 막관통 도메인 (CD8 TM), 공-자극 도메인 (4-1BB) 및 자극성 도메인 (ITAM CD3 제타)을 갖는다.
도 8A 및 8B 는 서열번호 125 또는 130 내지 141의 항-BCMA CAR을 발현시키는 T 세포들이 RTX 및 BRC와 배양되는 CDC 분석의 결과를 보여준다. 그 결과들은 실시예 4에 설명되었듯이 (대조군 실험에 대하여) 항-BCMA CAR 양성 T 세포들 중 생존가능한 세포들의 상대적 빈도로 표현된다.
도 9는 항 BCMA CAR를 발현시키지 않는 대조군 T 세포 (T-세포) 또는 서열번호 125 또는 130 내지 139의 항-BCMA CAR을 발현시키는 T 세포들의 세포용해 활성을 보여준다. 세포용해 활성은 실시예 4에 설명된 대로 생존가능한 H929 세포들의 빈도로 표현된다.
도 10A는 분획을 통한 흐름(flow)에서 또는 CD34 MicroBead Kit로 정제 후 또는 전에 두 개의 CD20 미모토프들(mimotopes) 및 CD34 에피토프을 포함하는 서열번호 128의 CAR를 발현시키는 T-세포들의 빈도를 보여준다.
도 10B는 분획을 통한 흐름(flow)에서 또는 CD34 MicroBead 키트(Kit)로 정제 후 또는 전에 CD34 에피토프를 포함하는 서열번호 128의 CAR를 발현시키는 T-세포들의 수를 보여준다.
도 11은 RTX, 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin) (PHA)의 존재 또는 RTX 및 PHA 둘 다의 부존재 하 서열번호 125 또는 130 내지 139의 항-BCMA CAR를 발현시키는 T 세포에 의하여 생산되는 INF 감마의 농도를 보여준다.
도 12는 BCMA-Fc 융합 단백질 및 표지된 항 Fc 항체 또는 RTX 및 표지된 항 Fc 항체를 이용한 서열번호 125 또는 130 내지 139의 CAR들을 발현시키는 T 세포의 검출로부터의 결과인 CAR 양성 T-세포의 빈도를 보여준다.
도 13은 RTX 및 표지된 항 Fc 항체 또는 표지된 QBEND-10 을 이용하여 서열번호 128의 CAR들을 발현시키는 T 세포의 검출로부터 나온 CAR 양성 T-세포들의 빈도를 보여준다.
도 14A 및 14B는 유동세포 분석법에 의하여 CD20 미모토프들(mimotopes)을 포함하는 서열번호 145 (BC30, 야생형), 146 (LM), 147 (LML), 148 (LMLM 및-149 (LMLML)의 BCMA CAR들을 발현시키는 T 세포들의 검출을 보여준다. CAR T 세포들은 가용성 비오티닐레이티드(biotinylated)-BCMA 단백질에 이어진 PE-콘쥬게이티드 스트렙타비딘(streptavidin (sBCMA 비오틴) (PE) 또는 항-CD20 항체 리툭시맙에 이어진 FITC-콘쥬게이티드 항-인간 IgG (Rituximab (FITC))을 이용하여 유동세포 분석법에 의하여 검출된다.
도 15는 유동세포 분석법에 의한 CD20 미모토프들(mimotopes)을 포함하는 서열번호 149의 BCMA CAR들 또는 서열번호 145 의 항 BCMA CAR 및 RQR8 (서열번호 150) (BC30-RQR8)의 공 발현을 위하여 렌티바이러스로 형질도입되지 않고, 형질도입된 T 세포들의 검출을 보여준다. CAR-T 세포들은 가용성 비오티닐레이티드(biotinylated)-BCMA 단백질에 이어진 PE-콘쥬게이티드 스트렙타비딘(streptavidin (sBCMA 비오틴) (PE) 또는 항-CD20 항체 리툭시맙에 이어진 FITC-콘쥬게이티드 항-인간 IgG (Rituximab (FITC))을 이용하여 유동세포 분석법에 의하여 검출된다.
도 16은 서열번호 145의 항 BCMA CAR, 서열번호 149 (BC30-R2)의 항-BCMA CAR을 발현시키는 또는 서열번호 145의 항 BCMA CAR 및 RQR8 (서열번호 150) (BC30-RQR8)을 공발현시키는 T 세포들이 RTX 및 BRC와 배양되는 CDC 분석 결과를 보여준다. 세포독성의 퍼센트는 비오티닐레이티드 BCMA 단백질을 이용하여 유동세포 분석법 분석에 의하여 결정된다. 결과들은 대조군에 대하여(BRC만으로 배양된 세포들) 항-BCMA CAR 양성 T 세포들 중 세포 용해(lysis)의 빈도로서 표현된다.
도 17은 RTX의 존재/부존재 하 서열번호 145의 항 BCMA CAR (BC30) 및 RQR8 (서열번호 150) (BC30-RQR8)을 공발현 또는 서열번호 149의 항-BCMA CAR (BC30-R2)를 발현시키는 T 세포들의 세포용해 활성을 보여준다. 세포용해 활성은 실시예 7.5에 개시된 대로 계산된 세포 용해(lysis)의 퍼센트로 표현되고 효과기 (CAR T 세포): 타겟 (BCMA를 발현시키는 MM1S 세포들)의 다른 비율에서 결정된다.
도 18은 PBS (대조군), 항-CD3 OKT3 항체 (αCD3), 또는 리툭시맙 (RTX)의 존재 하 서열번호 149의 항-BCMA CAR을 발현시키는 활성화된 T 세포들의 퍼센트를 보여준다. T 세포 활성화는 유동세포 분석법을 이용하여 활성화 마커들 CD25 및 CD69의 발현을 측정함으로써 평가된다.
표 1: 약학적으로 승인된 mAb의 그것들의 항원 타겟들과의 리스트. 후자의 것의 서열들이 그것들 중 일부에 대한 에피토프(들)과 더불어, 제공된다.
표 2: 실시예 2에 제시된 그것들의 mAb에 대응하는 에피토프들 및 몇몇 미모토프들(mimotopes)의 리스트.
표 3: CD19, CD33, 5T4, ROR1, EGFRvIII, BCMA, CS1 및 CD123 항원들을 타겟팅하는 scFv의 VH & VL 체인들의 리스트
표 4: CAR 요소의 모범적(exemplary) 서열
본 발명의 개요
본 발명은 세포외 결합 도메인 (scFv)이 세포 분류 및 세포 고갈(depletion) 모두를 가능하게 하는 이러한 방식으로 변형되는 키메라 항원 수용체들 (CAR)에 대한 것이다 (설명적 예로서 도 2 참조). mAb-주도된(driven) 분류/고갈(depletion) 시스템으로 명명된 이 구조체는 scFv 내에 선택된 에피토프를 삽입시키는 것으로 구성되며; 이 에피토프는 특이적 항체 (바람직하게는 mAb)에 의하여 인식되는 특이성을 갖는다. 주로 CAR의 외부의 리간드 결합 도메인이 에피토프를 포함하도록 변형되는 것을 고려할 때, 다른 CAR 아키텍쳐들은 상상될 수 있다: 단일-체인 또는 다중(multi)-체인. 특이적 에피토프(들) 및 VH 및 VL 폴리펩타이드들로 이루어진, 본 발명의 키메라 scFv는 그것 자체가 링커들의 사용 및 에피토프의 삽입의 위치에 의존하는 다른 구조체들을 가질 수 있다. 본 발명은 또한 변형된 CAR들이 부여된(endowed) 조작된 면역 세포들을 분류 및/또는 고갈하는(depleting) 그 결과인 방법에 대한 것이다.
몇몇 에피토프-mAb 커플들은 이러한 시스템을 만드는데 사용될 수 있다; 특히 제한되지 않는 예로서, CD20/리툭시맙과 같은, 의학적 용도로 이미 승인된 것들.
조작된 면역 세포들의 세포독성을 더 증강시키기 위하여, 에피토프-특이적 항체는 세포독성 약물과 콘쥬게이트될 수 있다. 그 위가 보체계의 이식된 요소(component)(들)인 조작된 항체들을 이용함으로써 CDC 세포독성을 촉진하는 것이 또한 가능하다.
결국, 본 발명은 CAR들이 부여된(endowed) 조작된 면역 세포들의 활성화가 상기 CAR들의 외부의 리간드 결합 도메인을 향하는 항체를 이용함으로써 세포들을 고갈시킴으로써(depleting) 조절되는 치료적 방법들을 포함한다.
본 발명은 하기 항목들에 의하여 요약될 수 있다:
1. 적어도 항원에 특이적인 VH 체인 및 VL 체인에 의하여 형성되는 scFv을 포함하는 적어도 하나의 세포외 결합 도메인을 포함하며, 이때 상기 세포외 결합 도메인은 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함하는, 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코드하는 폴리펩타이드.
2. 항목 1에 있어서, 상기 mAb-특이적 에피토프는 VH 및 VL 체인들 사이에 위치하는 폴리펩타이드.
3. 항목 1 또는 2에 있어서, 상기 VH 및 VL 체인들, 및 mAb 특이적-에피토프은 적어도 하나의 링커에 의하여 서로, 그리고 힌지에 의하여 상기 CAR의 막관통 도메인에 결합되는 폴리펩타이드.
4. 항목 3에 있어서, mAb-에피토프는 두 개의 링커들에 의하여, VH 및 VL 체인들에 연결되는 폴리펩타이드.
5. 항목 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, mAb-특이적 에피토프는 이러한 에피토프를 포함하는 CAR를 발현시키는 T 세포들의 시험관 내 세포 분류 및/또는 생체내(in vivo) 세포 고갈(depletion)을 위한 에피토프-특이적 mAb에 의하여 결합되는 에피토프인, 폴리펩타이드.
6. 항목들 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩타이드는 하나의 세포외 결합 도메인을 포함하고, 이때
상기 세포외 결합 도메인은 힌지를 더 포함하고, 그리고 상기 폴리펩타이드는
- 막관통 도메인, 및
- 세포내 도메인
을 더 포함하는 폴리펩타이드.
7. 항목 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 세포외 결합 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mAb-특이적 에피토프들을 포함하는 폴리펩타이드.
8. 항목 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 세포외 결합 도메인은 1, 2, 3 또는, 4 mAb-특이적 에피토프들을 포함하는 폴리펩타이드.
9. 항목 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 세포외 결합 도메인은 2, 3 또는, 4 mAb-특이적 에피토프들을 포함하는 폴리펩타이드.
10. 항목 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 세포외 결합 도메인은 하기 서열을 포함하는 폴리펩타이드
V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-;
V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-;
V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2;
(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2;
에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-V1-L1-V2;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x-;
(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프3-(L)x-;
(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x-;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x;
V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x;
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-(L)x-에피토프2-(L)x-V2; 또는,
(L)x-에피토프1-(L)x-V1-(L)x-에피토프2-(L)x-V2-(L)x-에피토프3-(L)x;
이때,
V1 은 VL 이고 V2 는 VH이거나 또는 V1 은 VH 이고 V2 는 VL이고;
L1은 VL 체인에 VH 체인을 연결하는데 적합한 링커이고;
L은 글리신 및 세린 잔기들을 포함하는 링커이고, 세포외 결합 도메인에서 L의 각 발생은 동일한 세포외 결합 도메인에서 L의 다른 발생과 동일하거나 또는 다를 수 있고, 그리고,
x는 0 또는 1이고, 그리고 x의 각 발생은 다른 것들과 독립적으로 선택되고;그리고,
에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 3은 mAb-특이적 에피토프들이고 동일하거나 또는 다를 수 있다.
11. 항목 10에 있어서, 세포외 결합 도메인은 하기 서열을 포함하는 폴리펩타이드
V1-L1-V2-L-에피토프1; V1-L1-V2-L-에피토프1-L; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2-L; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L; V1-L1-V2-에피토프1; V1-L1-V2-에피토프1-L; V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2; V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2-L; V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3; V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L; 에피토프1-V1-L1-V2; 에피토프1-L-V1-L1-V2; L-에피토프1-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-L-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-L-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L-V1-L1-V2; V1-L-에피토프1-L-V2; L-에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-L; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-L-에피토프3; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-에피토프3; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-L-에피토프3-에피토프4; L-에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2-L-에피토프3-L; 에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2-L-에피토프3-L; L-에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2-L-에피토프3; L-에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-L; L-에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-L-에피토프3; L-에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-에피토프3, 또는 에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-L-에피토프3-에피토프4 이때
V1은 VL이고 V2는 VH이거나, 또는 V1은 VH이고 V2는 VL이고;
L1은 VL 체인에 VH 체인를 연결하기에 적합한 임의의 링커이고;
L은 글리신 및 세린 잔기들을 포함하는 링커이고, 세포외 결합 도메인에서 L의 각 발생은 동일한 세포외 결합 도메인에서 L의 다른 발생과 동일하거나 또는 다를 수 있고, 그리고,
에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 3은 mAb-특이적 에피토프들이고, 그리고 동일하거나 또는 다를 수 있다.
12. 항목 10에 있어서, L1은 글리신 및/또는 세린을 포함하는 링커인 폴리펩타이드.
13. 항목 12에 있어서, L1은 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n 또는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하고, 이때 n은 1, 2, 3, 4 또는 5인 링커이거나 또는 아미노산 서열 (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3을 포함하는 링커인 폴리펩타이드.
14. 항목들 10 내지 13 중 어느 하나에 있어서, L은 글리신 및/또는 세린을 포함하는 링커인, 폴리펩타이드.
15. 항목 14에 있어서, L은 SGG, GGS, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGG, GGGGS, SGGGGS, GGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS, GGGGGGGS, SGGGGGGG, SGGGGGGGS, 또는 SGGGGSGGGGS 로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는 링커인 폴리펩타이드.
16. 항목 14에 있어서, L은 SGGGG, GGGGS 또는 SGGGGS인 폴리펩타이드.
17. 항목들 10 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 에피토프 1, 에피토프 2, 에피토프 3 및 에피토프 4는 이브리투모맙(ibritumomab), 티우세탄(tiuxetan), 뮤노모나브(muromonab)-CD3, 토시투모마브(tositumomab), 아브식시마브(abciximab), 바실리시마브(basiliximab), 브렌툭시맙(brentuximab) 베도틴(vedotin), 세툭시맙(cetuximab), 인플릭시맙(infliximab), 리툭시맙(rituximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 세르톨리주맙(certolizumab) 페골(pegol), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 나탈리주맙(natalizumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베돌리주맙(vedolizumab), 아달리무맙(adalimumab), 벨리무맙(belimumab), 카나키누맙(canakinumab), 데노수맙(denosumab), 골리무맙(golimumab), 이필리무맙(ipilimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 파니투무맙(panitumumab), QBEND-10, 및 우스테키누맙(ustekinumab)에 의하여 특이적으로 인식되는 mAb-특이적 에피토프들로부터 독립적으로 선택되는 폴리펩타이드.
18. 항목들 10 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 에피토프 1, 에피토프 2, 에피토프 3 및 에피토프 4는 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 144 또는 서열번호 174의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프들로부터 독립적으로 선택되는 폴리펩타이드.
19. 항목들 10 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 에피토프 1은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프인 폴리펩타이드.
20. 항목들 10 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 에피토프 2는 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프인 폴리펩타이드.
21. 항목들 10 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 에피토프 3은 서열번호 35 또는 서열번호 144의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프인 폴리펩타이드.
22. 항목들 10 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 에피토프 4는 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프인 폴리펩타이드.
23. 항목 22에 있어서, 에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 4 는 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프이고, 에피토프 3은 서열번호 144의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프인 폴리펩타이드.
24. 항목들 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, mAb-특이적 에피토프는 표 1에 리스트된 것들로부터 선택되는 하나의 폴리펩타이드로부터인 폴리펩타이드.
25. 항목들 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, mAb-특이적 에피토프는 이브리투모맙(ibritumomab), 티우세탄(tiuxetan), 뮤노모나브(muromonab)-CD3, 토시투모마브(tositumomab), 아브식시마브(abciximab), 바실리시마브(basiliximab), 브렌툭시맙(brentuximab) 베도틴(vedotin), 세툭시맙(cetuximab), 인플릭시맙(infliximab), 리툭시맙(rituximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 세르톨리주맙(certolizumab) 페골(pegol), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 나탈리주맙(natalizumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베돌리주맙(vedolizumab), 아달리무맙(adalimumab), 벨리무맙(belimumab), 카나키누맙(canakinumab), 데노수맙(denosumab), 골리무맙(golimumab), 이필리무맙(ipilimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 파니투무맙(panitumumab), QBEND-10, 및 우스테키누맙(ustekinumab)에 의하여 특이적으로 인식되는 mAb-특이적 에피토프들로부터 선택되는 폴리펩타이드.
26. 항목들 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, mAb-특이적 에피토프는 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 144 또는 서열번호 174의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프로부터 선택되는 폴리펩타이드.
27. 항목들 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, mAb-특이적 에피토프는 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드.
28. 항목들 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 VH 및 VL 체인들은 서열번호 43 (CD19 항원), 서열번호 44 (CD38 항원), 서열번호 45 (CD123 항원), 서열번호 46 (CS1 항원), 서열번호 47 (BCMA 항원), 서열번호 48 (FLT-3 항원), 서열번호 49 (CD33 항원), 서열번호 50 (CD70 항원), 서열번호 51 (EGFR-3v 항원) and 서열번호 52 (WT1 항원)과 80% 동일성을 넘는, 바람직하게는 90%를 넘는, 그리고 더욱 바람직하게는 95%를 넘는 항원 타겟 서열을 갖는 폴리펩타이드.
29. 항목들 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원은 세포 표면 마커 항원인 폴리펩타이드.
30. 항목들 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원은 종양-관련 표면 항원인 폴리펩타이드.
31. 항목들 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 항원은 ErbB2 (HER2/neu), 암배아(carcinoembryonic) 항원 (CEA), 상피(epithelial) 세포 부착(adhesion) 분자 (EpCAM), 상피(epidermal) 성장(growth) 인자(factor) 수용체 (EGFR), EGFR 변종(variant) III (EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, 디시알로강글리오사이드(disialoganglioside) GD2, GD3, C-타입 렉틴(lectin)-유사 분자(molecule)-1 (CLL-1), 관(ductal)-상피(epithelial) 뮤신(mucine), gp36, TAG-72, 글리코스핑고리피드들(glycosphingolipids), 신경교종(glioma)-관련(associated) 항원, β-인간 융모성(chorionic) 고나도트로핀(gonadotropin), 알파페토프로테인(alphafetoprotein) (AFP), 렉틴-반응성 AFP, 타이글로불린(thyroglobulin), RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로메라제 역전사효소, RU1, RU2 (AS), 장 카르복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제(prostase), 프로스타제 특이적 항원 (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGA-1a, p53, 프로스테인(prostein), PSMA, 서비빈(survivin) 및 텔로메라제, 전립선(prostate)-악성종양(carcinoma) 종양 항원(antigen)-1 (PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린(ephrin) B2, CD22, 인슐린 성장 인자 (IGF1)-I, IGF-II, IGFI 수용체, 메소텔린(mesothelin), 종양-특이적 펩타이드 에피토프를 제시하는 주요(major) 조직적합성(histocompatibility) 복합체(complex) (MHC) 분자, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, 종양 기질(stromal) 항원들, 파이브로넥틴(fibronectin)의 엑스트라(extra) 도메인 A (EDA) 및 엑스트라(extra) 도메인 B (EDB) 및 테나신(tenascin)-C의 A1 도메인 (TnC A1) 및 섬유아세포(fibroblast) 관련(associated) 단백질 (fap), LRP6, 흑색종(melamona)-관련(associated) 콘드로이틴(Chondroitin) 설페이트(Sulfate) 프로테오글리칸(Proteoglycan) (MCSP), CD38/CS1, MART1, WT1, MUC1, LMP2, 이디오타입(Idiotype), NY-ESO-1, Ras 돌연변이체, gp100, 프로테이나제(proteinase) 3, bcr-abl, 티로시나제(tyrosinase), hTERT, EphA2, ML-TAP, ERG, NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체 ; 계통(lineage)-특이적 또는 조직 특이적 항원 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD70, CD79, CD116, CD117, CD135, CD123, CD133, CD138, CTLA-4, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 엔도글린(endoglin), 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자, BCMA (CD269, TNFRSF 17) 또는 FLT-3으로부터 선택되는 폴리펩타이드.
32. 항목들 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, VH 및 VL은 서열번호 65의 VH 및 서열번호 66의 VL; 서열번호 67의 VH 및 서열번호 68의 VL; 서열번호 69의 VH 및 서열번호 70의 VL; 서열번호 71의 VH 및 서열번호 72의 VL; 서열번호 77의 VH 및 서열번호 78의 VL; 서열번호 79의 VH 및 서열번호 80의 VL; 서열번호 81의 VH 및 서열번호 82의 VL; 서열번호 83의 VH 및 서열번호 84의 VL; 서열번호 85의 VH 및 서열번호 86의 VL; 서열번호 87의 VH 및 서열번호 88의 VL; 서열번호 89의 VH 및 서열번호 90의 VL; 서열번호 91의 VH 및 서열번호 92의 VL; 서열번호 93의 VH 및 서열번호 94의 VL; 서열번호 95의 VH 및 서열번호 96의 VL; 서열번호 97의 VH 및 서열번호 98의 VL; 서열번호 99의 VH 및 서열번호 100의 VL; 서열번호 101의 VH 및 서열번호 102의 VL; 서열번호 103의 VH 및 서열번호 104의 VL; 서열번호 105의 VH 및 서열번호 106의 VL; 서열번호 107의 VH 및 서열번호 108의 VL; 서열번호 109의 VH 및 서열번호 110의 VL; 서열번호 111의 VH 및 서열번호 112의 VL; 서열번호 113의 VH 및 서열번호 114의 VL; 서열번호 115의 VH 및 서열번호 116의 VL; 서열번호 117의 VH 및 서열번호 118의 VL; 서열번호 119의 VH 및 서열번호 120의 VL; 서열번호 121의 VH 및 서열번호 122의 VL; 또는, 서열번호 123의 VH 및 서열번호 124의 VL; 서열번호 170의 VH 및 서열번호 171의 VL; 서열번호 172의 VH 및 서열번호 173의 VL; 또는, 서열번호 186의 VH 및 서열번호 187의 VL로부터 선택되는 폴리펩타이드.
33. 항목들 2 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 힌지는 PD-1 힌지(hinge), IgG4 힌지, CD8알파(alpha) 힌지 또는 FcγRIII 알파 힌지를 포함하는 폴리펩타이드.
34. 항목들 2 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 막관통 도메인은 , T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타(zeta) 체인, PD-1, 4-1BB, OX40, ICOS, CTLA-4, LAG3, 2B4, BTLA4, TIM-3, TIGIT, SIRPA, CD28, CD3 엡실론(epsilon), CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154의 막관통 영역(들)을 포함하는 폴리펩타이드.
35. 항목들 2 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 막관통 도메인은 PD-1 또는 CD8 알파의 막관통 영역(들)을 포함하는 폴리펩타이드.
36. 항목들 2 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 막관통 도메인은 CD8 알파의 막관통 영역(들)을 포함하는 폴리펩타이드.
37. 항목들 2 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 세포내 도메인은 CD3제타 신호전달(signalling) 도메인을 포함하는 폴리펩타이드.
38. 항목들 2 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 세포내 도메인은 4-1BB 도메인을 포함하는 폴리펩타이드.
39. 항목들 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, CAR는 단일-체인 CAR인 폴리펩타이드.
40. 항목 1에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 10, 서열번호 125 내지 141 또는 서열번호 145 내지 150 또는 서열번호 152 내지 169과 80% 넘는 동일성, 90% 넘는, 95% 넘는 것을 공유하거나 또는 동일한 폴리펩타이드.
41. 항목들 1 내지 38 중 어느 하나에 있어서, CAR 는 다중-체인 CAR인 폴리펩타이드.
42. 항목들 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드를 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
43. 상기 CAR는 4-1BB로부터의 공-자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달(signaling) 도메인을 포함하는, 항목들 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 키메라 항원 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
44. 항목 42 또는 43의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
45. 항목들 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 폴리펩타이드를 그것의 세포 표면에서 발현시키는 조작된 면역 세포.
46. 항목 45에 있어서, 상기 세포는 염증성 T-림프구들, 세포독성 T-림프구들, 조절성 T-림프구들 또는 헬퍼 T-림프구들로부터 유래된 조작된 면역 세포.
47. 항목 45 또는 46에 있어서, 의약으로서 사용을 위한 조작된 면역 세포.
48. (a) 면역 세포를 제공하는 단계;
(b) 항목들 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 키메라 항원 수용체를 코드하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포 내에 도입시키는 단계.
(c) 상기 세포 내로 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계.
를 포함하는, 항목들 45 내지 47 중 어느 하나의 면역 세포를 조작하는 방법.
49. 면역 세포는 T-세포인, 항목 48의 면역 세포를 조작하는 방법.
50. - mAb-특이적 에피토프에 특이적인 단일클론 항체와 상기 조작된 면역 세포들을 포함하는 면역 세포들의 군집을 접촉시키는 단계;
- 단일클론 항체에 결합하는 세포들을 선택하여 조작된 면역 세포에서 풍부한 세포들의 군집을 수득하는 단계
를 포함하는, 항목들 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 그것의 세포 표면에서 발현시키는 조작된 면역 세포를 시험관 내에서 분류하는 방법.
51. 항목 50에 있어서, mAb-특이적 에피토프에 특이적인 단일클론 항체는 형광단에 콘쥬게이트되고 단일클론 항체에 결합하는 세포들을 선택하는 단계는 형광(Fluorescence) 활성된(Activated) 세포(Cell) 분류(Sorting) (FACS)에 의하여 이루어지는 방법.
52. 항목 50에 있어서, mAb-특이적 에피토프에 특이적인 단일클론 항체는 자성 입자에 콘쥬게이트되고 단일클론 항체에 결합하는 세포들을 선택하는 단계가 자성(Magnetic) 활성화된(Activated) 세포(Cell) 분류(Sorting) (MACS)에 의하여 이루어지는, 방법.
53. 항목들 50 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프를 포함하고 단일클론 항체는 리툭시맙인 방법.
54. 항목들 50 내지 52 중 어느 하나에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호 144의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프를 포함하고 면역 세포들의 군집을 접촉하는데 사용되는 항체는 QBEND-10인 방법.
55. 항목들 50 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 조작된 면역 세포에서 풍부한 세포들의 군집은 CAR-발현시키는 면역 세포들의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%를 포함하는 방법.
56. 적어도 하나의 에피토프-특이적 mAb와 상기 조작된 면역 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자에게서 항목들 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 그것의 세포 표면에서 발현시키는 조작된 면역 세포를 생체내에서 고갈시키는(depleting) 방법.
57. 항목 56에 있어서, mAb-특이적 에피토프는 CD20 에피토프 또는 미모토프(mimotope)이고 에피토프-특이적 mAb는 리툭시맙인 방법.
58. 항목 57에 있어서, mAb-특이적 에피토프는 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 방법.
59. 항목들 56 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 에피토프-특이적 mAb 는 보체계를 활성화시킬 수 있는 분자에 의하여 콘쥬게이트되는 방법.
60. 항목들 56 내지 59 중 어느 하나에 있어서, 세포독성 약물은 에피토프-특이적 mAb에 커플링되는 방법.
61. 상기 세포들 상에 지닌 mAb-특이적 에피토프 및 효과기 (및 세포독성) 세포 상에 지닌 표면 항원에 둘다 결합할 수 있는 이중(bi)-특이적 mAb (BsAb)과 상기 조작된 면역 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는, 환자에서 항목들 1 내지 41 중 어느 하나에 따른 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함하는 폴리펩타이드를 그것의 세포 표면에서 발현시키는 조작된 면역 세포를 생체내에서 고갈시키는(depleting) 방법.
62. 48 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역 세포는 T-세포인 방법.
본 발명의 상세한 설명
본 발명은 항원, 바람직하게는 세포 표면 마커 항원에 특이적인 적어도 VH 체인 및 VL 체인에 의하여 형성된 scFv 을 포함하는 적어도 하나의 세포외 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)을 코드하는 폴리펩타이드에 대한 것이고, 이때 상기 세포외 결합 도메인은 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함한다. 한 예에서, mAb-특이적 에피토프는 이러한 에피토프를 포함하는 CAR를 발현시키는 T 세포들의 생체내 세포 고갈(depletion) 및/또는 시험관내 세포 분류를 위한 에피토프-특이적 mAb에 의하여 결합되는 에피토프이다.
본 발명은 적어도 세포 표면 마커 항원에 특이적인 VH 체인 및 VL 체인에 의하여 형성되는 scFv를 포함하는 적어도 하나의 세포외 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코드하는 폴리펩타이드에 대한 것이고, 이때 상기 세포외 결합 도메인은 상기 CAR를 발현시키는 T 세포들의 생체내 세포 고갈(depletion) 및/또는 시험관내 세포 분류를 위한 에피토프-특이적 mAb에 의하여 결합되는 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함한다.
몇몇 예들에서, 본 발명은
- 적어도 항원, 바람직하게는 a 세포 표면 마커 항원에 특이적인 VH 체인 and a VL 체인에 의하여 형성된 scFv를 포함하며, 이때 상기 세포외 결합 도메인은 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함하는, 적어도 하나의, 바람직하게는 하나의, 세포외 결합 도메인, 및
- 힌지
- 를 포함하는 세포외 도메인
- 막관통 도메인, 및,
- 세포내 도메인
를 포함하는 CAR에 대한 것이다.
몇몇 예들에서, 본 발명은
- 적어도 세포 표면 마커 항원에 특이적인 VH 체인 및 VL 체인에 의하여 형성되는 scFv를 포함하며, 이때 상기 세포외 결합 도메인이 상기 CAR를 발현시키는 T 세포들의 생체내 세포 고갈(depletion) 및/또는 시험관내 세포 분류를 위하여 에피토프-특이적 mAb에 의하여 결합되는 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함하는, 적어도 하나의 세포외 결합 도메인, 및
- 힌지
- 를 포함하는 세포외 도메인
- 막관통 도메인, 및,
- 세포내 도메인
를 포함하는 CAR에 대한 것이다.
예들에서, 본 발명의 CAR는 하나의 세포외 결합 도메인을 포함한다.
"키메라 scFv"에 의하여 상기 VH 및 VL 체인들에 원래 포함되지 않았던 에피토프의, 그리고 중쇄들 및 경쇄들로 이루어진 (각각 VH 및 VL) 단일-체인 가변 단편에 대응하는 폴리펩타이드가 의미된다. 후자의 에피토프는 그것이 항체, 특히 단일클론 항체에 의하여 특이적으로 결합되는 능력을 가질 때, "mAb-특이적 에피토프"로 언급된다. 몇몇 예들에서, mAb들 특이적 에피토프는 ScFv에 의하여 인식되는 에피토프가 아니다. 몇몇 예들에서, mAb들 특이적 에피토프는 CAR의 세포외 도메인으로부터 유래되지 않는다. 이 키메라 scFv의 요소 (즉 mAb 특이적 에피토프 및 리간드 결합 도메인의 가벼운 그리고 무거운 가변 단편들)은 적어도 하나의 링커, 보통 가요성 링커,에 의하여 서로 연결될 수 있다. 이들 요소들은 일반적으로 힌지에 의하여 CAR의 막관통 도메인에 연결된다.
키메라 scFv 형태들
본 발명의 키메라 scFv의 구조체는 그것의 주된 요소들의 위치에 (VH and VL 및 m-Ab 특이적 에피토프) 의존하는 도 1에 제시된 대로 다양할 수 있다
본 발명의 키메라 scFv는 하나의 VH, 하나의 VL 및 하나의 에피토프의 가능한 순열들의 수를 고려할 때, 몇몇 형태들, 적어도 9개를 가질 수 있다.
바람직하게는 각각의 요소 (VH, VL 및 에피토프)는 앞서 제시한 것과 같이 적어도 하나의 가요성 링커에 의하여 그것의 이웃(들)과 상호연결된다. 본 발명에 따른 적절한 조합은 결합들 두 개 모두에서 좋은 친화력/특이성을 제공하는 것들이다 : 주입된 mAb 및 mAb-특이적 에피토프 사이에 그리고 세포 타겟 리간드의 항원 및 키메라 scFv의 VH &VL 체인들 사이에.
한 예에 따라, CAR의 세포외-결합 도메인은 적어도 두 개의 링커들을 포함하며,그것들 둘 다는 에피토프를 VH 및 VL 체인들에 결합시키고; 그리고 힌지는 CAR의 막관통 도메인에 scFv-에피토프를 연결시킨다.
예를 들어, 만약 예상된 CAR 형태가 mAb-특이적 에피토프가 VH 및 VL 체인들 옆에(beside) 위치되는 그러한 것이라면, 스크리닝은 CAR가 발현되고 세포독성 및/또는 mAb 고갈(depletion)에 대하여 테스트될 때 수행된다.
mAb-특이적 에피토프가 VH 및 VL 체인들에 위치되도록 추구될 때, 스크리닝은 CAR 구조체의 테스트 및/또는 일시적 발현 전에 파지 디스플레이에 의하여 수행될 수 있다. 이것은 주된 세포독성 및/또는 mAb 고갈(depletion) 테스트에 충분한 mRNA의 형질주입(transfection)에 의하여 수득될 수 있다.
몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mAb-특이적 에피토프들을 포함한다.
몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mAb-특이적 에피토프들을 포함한다.
몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인은 1, 2 또는 3 mAb-특이적 에피토프들을 포함한다.
몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인이 몇몇 mAb-특이적 에피토프들을 포함할 때, mAb-특이적 에피토프들은 모두 동일하다.
몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인이 몇몇 mAb-특이적 에피토프들을 포함할 때, mAb-특이적 에피토프들은 동일하지 않다. 예를 들어, 세포외 결합 도메인은 세 개의 mAb-특이적 에피토프들을 포함할 수 있고, 그것들 중 둘은 동일하고 세 번째 것은 다르다.
몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인은 VH, VL, 및 하나 또는 그보다 많은 mAb-특이적 에피토프들, 바람직하게는 1, 2 또는 3, 더욱 바람직하게는 2 또는 3개의 mAb-특이적 에피토프들을 포함한다.
몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인은 하기 서열을 포함하며 (N말단(Nterm)은 좌측에 위치한다):
V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x; V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x; V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x; (L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2; (L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2; 에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-V1-L1-V2; (L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x; (L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x; (L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x; (L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프3-(L)x; (L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x; V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2; V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x; V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x; V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x; (L)x-에피토프1-(L)x-V1-(L)x-에피토프2-(L)x-V2; (L)x-에피토프1-(L)x-V1-(L)x-에피토프2-(L)x-V2-(L)x-에피토프3-(L)x; V1-L1-V2-L-에피토프1; V1-L1-V2-L-에피토프1-L; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2-L; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L; V1-L1-V2-에피토프1;
V1-L1-V2-에피토프1-L; V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2; V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2-L;
V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3; V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L; 에피토프1-V1-L1-V2; 에피토프1-L-V1-L1-V2; L-에피토프1-V1-L1-V2;
L-에피토프1-L-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-L-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-L-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L-V1-L1-V2; V1-L-에피토프1-L-V2; L-에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-L; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-L-에피토프3; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-에피토프3; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-L-에피토프3-에피토프4; L-에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2-L-에피토프3-L; 에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2-L-에피토프3-L; L-에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2-L-에피토프3; L-에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-L; L-에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-L-에피토프3; L-에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-에피토프3, 또는 에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-L-에피토프3-에피토프4.
이때,
V1 및 V2는 ScFv의 VH 및 VL이고 (즉, V1은 VL이고 V2는 VH이거나 또는 V1은 VH이고 V2는 VL이다);
L1은 ScFv에서 VL 체인에 VH 체인을 연결하기에 적합한 임의의 링커이고;
L은 링커이고, 바람직하게는 글리신 및 세린 잔기들을 포함하고, 세포외 결합 도메인에서 L의 각 발생은 동일한 세포외 결합 도메인에서 L의 다른 발생과 동일하거나 다를 수 있고, 그리고
x는 0 또는 1이고, x의 각 발생은 다른 것들과 독립적이고; 그리고,
에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 3은 mAb-특이적 에피토프들이고, 그리고 동일하거나 또는 다를 수 있다.
몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인은 하기 서열 (N말단(Nterm)은 좌측에 위치한다)을 포함하며:
VH-L1-VL-L-에피토프1-L-에피토프2-L; L-에피토프1-L-VH-L-에피토프2-L-VL-L-에피토프3-L; VL-L1-VH-L-에피토프1-L-에피토프2-L; 또는, L-에피토프1-L-VL-L-에피토프2-L-VH-L-에피토프3-L,
이때 L, L1, 에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 3은 앞서 정의한 바와 같다.
몇몇 예들에서, L1은 글리신 및/또는 세린을 포함하는 링커이다. 몇몇 예들에서, L1은 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n 또는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하는 링커이고, n은 1, 2, 3, 4 또는 5이다. 몇 예들에서, L1은 (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3이다.
몇몇 예들에서, L은 바람직하게는 글리신 및/또는 세린를 포함하는, 가요성 링커이다. 몇몇 예들에서, L은 SGG, GGS, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGG, GGGGS, SGGGGS, GGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS, GGGGGGGS, SGGGGGGG, SGGGGGGGS, 또는 SGGGGSGGGGS 바람직하게는 SGG, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS 또는 SGGGGSGGGGS로부터 선택되는 아미노산 서열을 갖는다. 몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인이 L의 몇몇 발생들을 포함할 때, L들은 모두 동일하다. 몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인이 L의 몇몇 발생들을 포함할 때, L들은 모두 동일하지 않다. 몇몇 예들에서, L은 SGGGGS이다. 몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인은 L의 몇몇 발생들을 포함하고 L들은 모두 SGGGGS이다.
몇몇 예들에서, 에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 3은 동일하거나 또는 다르고, 그리고 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41 또는 서열번호 42, 서열번호 144 또는 서열번호 174의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프들로부터 선택된다.
몇몇 예들에서, 에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 3은 동일하거나 또는 다르고, 그리고 이브리투모맙(ibritumomab), 티우세탄(tiuxetan), 뮤노모나브(muromonab)-CD3, 토시투모마브(tositumomab), 아브식시마브(abciximab), 바실리시마브(basiliximab), 브렌툭시맙(brentuximab) 베도틴(vedotin), 세툭시맙(cetuximab), 인플릭시맙(infliximab), 리툭시맙(rituximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 세르톨리주맙(certolizumab) 페골(pegol), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 나탈리주맙(natalizumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베돌리주맙(vedolizumab), 아달리무맙(adalimumab), 벨리무맙(belimumab), 카나키누맙(canakinumab), 데노수맙(denosumab), 골리무맙(golimumab), 이필리무맙(ipilimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 파니투무맙(panitumumab), QBEND-10, 및 우스테키누맙(ustekinumab)에 의하여 특이적으로 인식되는 mAb-특이적 에피토프들로부터 선택된다.
몇몇 예들에서, 에피토프 1은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프이다.
몇몇 예들에서, 에피토프 2는 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프이다.
몇몇 예들에서, 에피토프 3은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프이다.
몇몇 예들에서, 에피토프 4는 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프이다.
몇몇 예들에서, 에피토프 2는 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프이고, 그리고 에피토프 3은 서열번호 144의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프이다.
몇몇 예들에서, 에피토프 1, 에피토프 2, 에피토프 3 및 에피토프 4 중 하나는 CD34 에피토프이고, 바람직하게는 서열번호 144의 에피토프이다. 몇몇 예들에서, 에피토프1, 에피토프 2, 에피토프 3 및 에피토프 4 중 하나는 CD34 에피토프이고, 바람직하게는 서열번호 144의 에피토프이고, 다른 mAb 특이적 에피토프들은 CD20 미모토프들(mimotopes)이고, 바람직하게는 서열번호 35의 미모토프(mimotope)이다.
삽입된 mAb-특이적 에피토프
본 발명에 따라, 키메라 scFv 내에 삽입되는 에피토프는 세포 분류 및/또는 세포 고갈(depletion) 공정들에 사용되는 단일클론 항체 (mAb)에 특이적이다.
바람직한 예에서, 키메라 scFv 내에 도입된 에피토프는 조절성/안전성의 면에서 국가(National) 건강(Health) 협회들(Agencies)에 의한 그것들의 승인에 기초하여, mAb-특이적 에피토프/에피토프-특이적 mAb 커플의 부분으로서 선택된다. 이러한 커플들은 하기 표 1에 제시된다.
표 1: 그것들의 항원 타겟들과 약학적으로-승인된 단일클론 항체들의 리스트
<표 1>
표 2: 예컨대 실시예 1-2에서 사용된 대로 그것들의 대응하는 mAb와 미모토프들(mimotopes) 및 에피토프과 같은 본 발명의 CAR의 세포외 결합 도메인에서 사용될 수 있는 mAb-특이적 에피토프들 (및 그것들의 대응되는 mAb들)의 예들
<표 2>
바람직한 예에서, 키메라 scFv 내 도입된 에피토프는 CD20 항원이고, 바람직하게는 서열번호 35이고 분류 및/또는 고갈(depletion) 목적(들)을 위하여 그것을 타겟으로 하는데 사용되는 주입된 mAb는 리툭시맙이다.
몇몇 예들에서, mAb-특이적 에피토프는 서열번호 35, 서열번호 36, 서열번호 37, 서열번호 38, 서열번호 39, 서열번호 40, 서열번호 41, 서열번호 42, 서열번호 144 또는 서열번호 174의 아미노산 서열을 가진다.
몇몇 예들에서, 본 발명의 CAR의 세포외 결합 도메인은 서열번호 35의 하나의 mAb-특이적 에피토프, 서열번호 35의 두 개의 mAb-특이적 에피토프들, 서열번호 35의 세 개의 mAb-특이적 에피토프들, 서열번호 35의 하나의 mAb-특이적 에피토프 및 서열번호 144의 하나의 mAb-특이적 에피토프, 서열번호 35의 두 개의 mAb-특이적 에피토프들 및 서열번호 144의 하나의 mAb-특이적 에피토프, 서열번호 35의 세 개의 mAb-특이적 에피토프들 및 서열번호 144의 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함한다.
또다른 예에 따라, 에피토프는 미모토프(mimotope)이다. 거대분자로서, 자주 에피토프의 구조체를 모방한, 펩타이드인 미모토프(mimotope)는 종래의 에피토프보다 더 작은 이점을 갖고, 그러므로 비(non)-배좌의(conformational) 서열에 이롭고 CAR와 같은 긴 폴리펩타이드에서 재생산하는데(reproduce) 더 쉬울 수 있다. 미모토프들(mimotopes)은 세툭시맙을 위한 두 개의 10 아미노산 펩타이드들 (Riemer et al., 2005) 또는 팔리비주맙을 위한 24 aa (Arbiza et al, 1992)와 같은 몇몇 약학적으로 승인된 mAb에 대해 알려져 있다. 이들 미모토프들(mimotopes)이 파지 디스플레이에 의하여 확인될 수 있기 때문에, 동일한 mAb에 대하여 scFv을 교란하지 않는 서열을 얻기 위하여 그것들 중 몇몇몇을 시도하는 것이 가능하다. 게다가, 그것들의 사용은 보체(complement)-의존적(dependent) 세포독성(cytotoxicity) (CDC)을 증강시킬 수 있다.
scFv
여기에서 사용된 용어 "세포외 리간드-결합 도메인"은 리간드에 결합하는 것이 가능한 올리고- 또는 폴리펩타이드로 정의된다. 바람직하게는, 상기 도메인은 세포 표면 분자와 상호작용이 가능한 것이 추구된다. 예를 들어 세포외 리간드-결합 도메인은 특정 질병 상태와 관련된 타겟 세포들 상에서 세포 표면 마커로서 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 이와 같이 리간드들로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커들은 바이러스, 박테리아 및 기생충 감염들, 자가면역 질병 및 암 세포들과 관련된 것들을 포함한다. 특히, 세포외 리간드-결합 도메인은 타겟의 항원에 대항한 항체로부터 유래되는 항원 결합 도메인을 포함할 수 있다. 제한되지 않는 예들로서, 타겟의 항원은 전술한 바와 같이 종양-관련 표면 항원일 수 있다. 몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인은 앞서 정의된 바와 같은 세포외 리간드-결합 도메인이다. 본 발명에 따라, 상기 세포외 리간드-결합 도메인은 mAb 에피토프 특이적 항원 및 타겟 항원 특이적 단일클론 항체의 가벼운 (VL) 및 무거운 (VH) 가변 단편을 포함하는 단일 체인 항체 단편 (scFv)이다. 몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인은 세포 표면 타겟 항원 특이적 단일클론 항체의 가벼운 (VL) 및 무거운 (VH) 가변 단편을 포함하는 단일 체인 항체 단편 (scFv)를 포함한다.
scFv 외 다른 결합 도메인이 또한 제한되지 않는 예들로서 낙타과(camelid) 단일-도메인(domain) 항체 단편들, 혈관 내피(endothelial) 성장 인자 폴리펩타이드, 인테그린-결합 펩타이드, 헤레굴린(heregulin) 또는 IL-13 뮤테인(mutein)과 같은 수용체 리간드들, 항체 결합 도메인들, 항체 초가변(hypervariable) 루프들(loops) 또는 CDR들과 같은, 림프구들의 미리 정해진 타겟팅을 위하여 사용될 수 있다.
또다른 예에서, 상기 세포외 결합 도메인은 (설계된 안키린(ankyrin) 반복 단백질) DARPin일 수 있다. DARPin들은 전형적으로 매우 특이적이고 고-친화성 타겟 단백질 결합을 보이는 유전적으로 조작된 항체 모방 단백질들이다. 그것들은 천연 안키린 단백질들로부터 유래되고 이들 단백질들의 적어도 셋, 보통 넷 또는 다섯 개의 반복 모티프들을 포함한다. DARPin들은 높은 친화성 및 특이성을 갖고 임의의 주어진 타겟 단백질에 결합하도록 선택될 수 있는 작은, 단일 도메인 단백질들이다 (Epa, Dolezal et al. 2013; Friedrich, Hanauer et al. 2013; Jost, Schilling et al. 2013). 본 발명에 따라, DARPin들은 복수개의 항원 인식 부위들을 포함하기 위하여 조작될 수 있다. 이와 같이, 상기 DARPin들은 고유의 항원과 더불어 일련의 연속적 다른 항원들을 인식하기 위하여 사용될 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 면역 세포를 제공하는 단계, 및 적어도 하나의 특이적 리간드, 바람직하게는 두 개의특이적 리간드들에서 인식할 수 있는 설계된 안키린 반복 단백질을 포함하는 키메라 항원 수용체를 상기 면역 세포의 표면에서 발현시키는 단계를 포함하는 방법에 대한 것이다.
제한되지 않는 예로서, 세포외 결합 도메인, 바람직하게는 ScFv에 의하여 인식되는 항원 또는 타겟의 리간드는 종양-관련 표면 항원, 예를 들어 ErbB2 (HER2/neu), 암배아 항원 (CEA), 상피(epithelial) 세포 부착(adhesion) 분자 (EpCAM), 상피(epidermal) 성장 인자 수용체 (EGFR), EGFR 변종 III (EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, 디시알로강글리오사이드 GD2, GD3, C-타입 렉틴-유사 분자-1 (CLL-1), 관-상피 뮤신, gp36, TAG-72, 글리코스핑고리피드들, 신경교종-관련 항원, β-인간 융모성 고나도트로핀, 알파페토프로테인 (AFP), 렉틴-반응성 AFP, 타이글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로메라제 역전사효소, RU1, RU2 (AS), 장 카르복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제(prostase), 프로스타제 특이적 항원 (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGA-1a, p53, 프로스테인(prostein), PSMA, 서비빈(surviving) 및 텔로메라제, 전립선(prostate)-악성종양(carcinoma) 종양 항원(antigen)-1 (PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린(ephrin) B2, CD22, 인슐린 성장 인자 (IGF1)-I, IGF-II, IGFI 수용체, 메소텔린, 종양-특이적 펩타이드 에피토프를 제시하는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, 종양 기질 항원들, 파이브로넥틴의 엑스트라(extra) 도메인 A (EDA) 및 엑스트라(extra) 도메인 B (EDB) 및 테나신-C의 A1 도메인 (TnC A1) 및 섬유아세포 관련 단백질 (fap), LRP6, 흑색종(melamona)-관련 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 (MCSP), CD38/CS1, MART1, WT1, MUC1, LMP2, 이디오타입(Idiotype), NY-ESO-1, Ras 돌연변이체, gp100, 프로테이나제 3, bcr-abl, 티로시나제, hTERT, EphA2, ML-TAP, ERG, NA17, PAX3, ALK, 안드로겐 수용체 ; 계통-특이적 또는 조직 특이적 항원 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD70, CD79, CD116, CD117, CD135, CD123, CD133, CD138, CTLA-4, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), 엔도글린, 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자, BCMA (CD269, TNFRSF 17), FLT-3, 또는 HIV-특이적 항원 (예를 들어 HIV gp120)와 같은 바이러스-특이적 표면 항원; EBV-특이적 항원, CMV-특이적 항원, HPV-특이적 항원, 라세(Lasse) 바이러스-특이적 항원, 인플루엔자 바이러스-특이적 항원과 더불어 이들 표면 마커들의 임의의 유도체 또는 변종일 수 있다. 특정 경우들에서, 키메라 항원 수용체가 인식하는 리간드는 타겟 세포, 특히 암 세포 또는 바이러스 세포의 표면에 존재한다. 몇몇 예들에서, 키메라 항원 수용체가 인식하는 리간드는 종양 미세환경에 존재한다. 본 발명의 몇몇 측면들에서, 키메라 항원 수용체가 인식하는 리간드는 성장 인자이다.
하나의 바람직한 예에서, 상기 VH 및 VL 체인들은 서열번호 43 (CD19 항원), 서열번호 44 (CD38 항원), 서열번호 45 (CD123 항원), 서열번호 46 (CS1 항원), 서열번호 47 (BCMA 항원), 서열번호 48 (FLT-3 항원), 서열번호 49 (CD33 항원), 서열번호 50 (CD70 항원), 서열번호 51 (EGFR-3v 항원), 서열번호 52 (WT1 항원)과 80% 넘는 동일성, 바람직하게는 90% 넘는, 그리고 더욱 바람직하게는 95% 넘는 항원 타겟 서열로서 갖는다.
하나의 더 바람직한 예에서, 상기 VH 및 VL 체인들은 하기 표 3과 같이 서열번호 53-64 (CD19 항원), 서열번호 65-76 (CD33 항원), 서열번호 77-84 (5T4 항원), 서열번호 85-90 (ROR1 항원), 서열번호 91-94 (EGFRvIII 항원), 서열번호 95-102 (BCMA 항원), 서열번호 103-112 (CS1 항원) 및 서열번호 113-124 (CD123 항원)과 동일하거나 또는 80% 넘는 동일성, 바람직하게는 90% 넘는, 그리고 더욱 바람직하게는 95% 넘는 항원 타겟 서열로서 갖는다.
몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인, 바람직하게는 ScFv에 의하여 인식되는 항원은 서열번호 43 (CD19 항원), 서열번호 44 (CD38 항원), 서열번호 45 (CD123 항원), 서열번호 46 (CS1 항원), 서열번호 47 (BCMA 항원), 서열번호 48 (FLT-3 항원), 서열번호 49 (CD33 항원), 서열번호 50 (CD70 항원), 서열번호 51 (EGFR-vIII 항원) 또는 서열번호 52 (WT1 항원)로부터 선택된다.
몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인은:
- 서열번호 65 의 VH 및 서열번호 66의 VL; 서열번호 67 의 VH 및 서열번호 68의 VL; 서열번호 69의 VH 및 서열번호 70의 VL; 서열번호 71의 VH 및 서열번호 72의 VL; 서열번호 77의 VH 및 서열번호 78의 VL; 서열번호 79의 VH 및 서열번호 80의 VL;
- 서열번호 81의 VH 및 서열번호 82의 VL; 서열번호 83의 VH 및 서열번호 84의 VL; 서열번호 85의 VH 및 서열번호 86의 VL; 서열번호 87의 VH 및 서열번호 88의 VL; 서열번호 89의 VH 및 서열번호 90; 서열번호 91의 VH 및 서열번호 92의 VL; 서열번호 93의 VH 및 서열번호 94의 VL; 서열번호 95의 VH 및 서열번호 96의 VL; 서열번호 97의 VH 및 서열번호 98의 VL; 서열번호 99의 VH 및 서열번호 100의 VL; 서열번호 101의 VH 및 서열번호 102의 VL; 서열번호 103의 VH 및 서열번호 104의 VL; 서열번호 105의 VH 및 서열번호 106의 VL; 서열번호 107의 VH 및 서열번호 108의 VL; 서열번호 109의 VH 및 서열번호 110의 VL; 서열번호 111의 VH 및 서열번호 112의 VL; 서열번호 113의 VH 및 서열번호 114의 VL; 서열번호 115의 VH 및 서열번호 116의 VL; 서열번호 117의 VH 및 서열번호 118의 VL; 서열번호 119의 VH 및 서열번호 120의 VL; 서열번호 121의 VH 및 서열번호 122의 VL; 서열번호 123의 VH 및 서열번호 124의 VL; 서열번호 170의 VH 및 서열번호 171의 VL; 서열번호 172의 VH 및 서열번호 173의 VL; 또는, 서열번호 186의 VH 및 서열번호 187의 VL
을 포함한다.
표 3: CD19, CD33, 5T4, ROR1, EGFRvIII, BCMA, CS1 및 CD123 항원들을 타겟팅하는 scFv의 VH & VL 체인들의 리스트
<표 3>
또다른 바람직한 예에서, 상기 VH 및 VL 체인들은 서열번호 11 (CD20 항원)과 80%를 넘는 동일성, 바람직하게는 90%를 넘는, 그리고 더욱 바람직하게는 95%를 넘는 에피토프 타겟 서열로서 갖는다.
세포외 리간드-결합 도메인는 또한 타겟의 항원에 결합하는 펩타이드, 타겟의 항원에 결합하는 항체에 결합하는 펩타이드 또는 단백질, 타겟 상 수용체에 결합하는 제한되지 않는 예들로서 성장 인자, 사이토카인 또는 호르몬과 같은 펩타이드 또는 단백질 리간드, 또는 타겟 상 펩타이드 또는 단백질 리간드에 결합하는, 제한되지 않는 예들로서 성장 인자 수용체, 사이토카인 수용체 또는 호르몬 수용체와 같은 수용체로부터 유래되는 도메인을 포함할 수 있다. 바람직하게는 타겟은 세포 또는 바이러스이다.
CAR의 항원 결합 도메인은 단일클론 항체, 재조합 항체, 인간 항체, 인간화된 항체 및 그것의 기능적 단편을 포함하나, 이에 제한되지 않는 세포 타겟 항원에 결합하는 임의의 도메인일 수 있다.
인간화된 항체는 CDR-이식 (예컨대 각각이 그 전체가 참조로서 여기에 포함되는 유럽 특허 No. EP 239,400; 국제공개공보 No. WO 91/09967; 및 U.S. Pat. Nos. 5,225,539, 5,530,101, and 5,585,089 참조) 베니어링(veneering) 또는 재포장(resurfacing) (예컨대 각각이 그 전체가 참조로서 여기에 포함되는 유럽 특허 Nos. EP 592,106 and EP 519,596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; and Roguska et al., 1994, PNAS, 91:969-973 참조), 체인 셔플링(shuffling) (예컨대 그 전체가 참조로서 여기에 포함되는 U.S. Pat. No. 5,565,332 참조), 및 예컨대 각각 그 전체가 참조로서 여기에 포함되는 U.S. 특허 출원 공개 No. US2005/0042664, U.S. 특허 출원 공개 No. US2005/0048617, U.S. Pat. No. 6,407,213, U.S. Pat. No. 5,766,886, 국제공개공보 No. WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169: 1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994), and Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959- 73 (1994)에 개시된 기술들을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업계에 알려진 여러가지 기술들을 이용하여 생산될 수 있다. 프레임워크(framework) 영역들에서 프레임워크 잔기들은 항원 결합을 바꾸기 위하여, 예컨대 개선하기 위하여 자주 CDR 기증자 항체로부터의 대응하는 잔기로 치환될 것이다. 이들 프레임워크 치환들은 예컨대 특정 위치들에서 일반적이지 않은 프레임워크 잔기들을 확인하기 위한 서열 비교 및 항원 결합에 중요한 프레임워크 잔기들을 확인하기 위한 프레임워크 잔기들 및 CDR의 상호작용들의 모델링에 의하여, 당업계에 잘 알려진 방법들에 의하여 확인된다. (예컨대 그 전체가 참조로서 여기에 포함되는 Queen et al., U.S. Pat. No. 5,585,089; and Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323 참조).
본 발명에 따라, scFv는 단봉낙타들, 낙타들, 라마들, 알파카들 또는 상어들의 면역화(immunization)에 의하여 수득될 수 있는 나노바디들 (자연적인 단일 도메인 항체들)일 수 있다.
키메라 scFv 내 링커들
scFv 링커 조작의 가요성은 표면 커플링 화학의 내재하는 빠르고 적응가능한 특징들 (예컨대 정전기의, 수소 결합 또는 공유 부착)과 조합될 수 있다. 펩타이드 링커들은 10 부터 25까지 아미노산들 길이로 다양할 수 있고 언제나 그런 것은 아니지만 보통 글리신 (G) 및 세린 (S)과 같은 친수성 아미노산들로 이루어진다. 더 짧은 길이의 펩타이드 링커들 (0-4 아미노산들) 또한 사용되어 왔다. 그러나 더 짧은 링커들을 가진 scFv는 멀티머들을 형성할 수 있다. 일반적으로 (GGGGS)3 펩타이드가 scFv 펩타이드 링커로서 사용된다. [(GGGGS) 3 링커로 설계된] 이 15-아미노산 링커 서열은 Amersham으로부터 상업적으로 이용가능한 재조합 파지 항체 시스템 (RPAS 키트)에서 사용된다. 이전의 연구는 scFv 펩타이드 링커 내 금속-결합 아미노산들 (즉, 시스테인 또는 히스테인)을 포함하는 scFvs (MW ~27 000)이 전체 IgG 또는 Fab 항체 단편들보다 각각 3-5 배로 분석 민감도를 상당히 증가시키는 높은 밀도로 바람직한 항원-결합 성향(orientation)에서 금 표면 상에 직접 고정화될 수 있다는 것을 입증하였다 (Shen Z, Mernaugh RL, Yan H, Yu L, Zhang Y, Zeng X. Anal. Chem. 2005;77:6834-6842; Shen Z, Stryker GA, Mernaugh RL, Yu L, Yan H, Zeng X. Anal. Chem. 2005; 77:797-805).
본 발명 내 적합한 다른 링커들 중 15-머(mer) 펩타이드 링커 (RGRGRGRGRSRGGGS)가 있다 (Zhihong Shen, Heping Yan, Ying Zhang, Raymond L. Mernaugh, and Xiangqun Zeng (2008), Anal Chem. 80(6): 1910-1917).
몇몇 예들에서, scFv 의 문맥에서 사용되는 대로 "링커"는 가변 중쇄 및 가변 경쇄 영역들을 서로 연결하기 위하여 단독으로 또는 조합하여 사용되는 글리신 및/또는 세린 잔기들과 같은 아미노산들로 구성되는 펩타이드 링커를 가리킨다. 한 예에서, 가요성 폴리펩타이드 링커는 글리신/세린 링커이고 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n 또는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n를 포함하며, n은 1 이상의 양의 정수이다. 예를 들어, n=1, n=2, n=3, n=4, n=5, n=6, n=7, n=8, n=9 및 n=10이다. 한 예에서, 가요성 폴리펩타이드 링커들은 (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또다른 예에서, 링커들은 (GlySer), (Gly2Ser) 또는 (Gly5Ser)의 복수 개의 반복과 같은, (GlyxSer)n의 복수 개의 반복들을 포함하며, 이때 x는 1, 2, 3, 4 또는 5이고 n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10이다. 또한 본 발명의 범위 내에, 참고로서 여기에 포함되는 WO2012/138475에 기재된 링커들이 포함된다.
키메라 항원 수용체 (CAR)
본 발명에 따른 CAR는 병적인 세포들, 특히 악성 세포들의 파괴를 촉발시키기 위한 조작된 면역 세포들을 가능하게 하도록 추구된다. 그것들은 단일-체인 또는 다중-체인 아키텍쳐들에 따라 설계될 수 있다. 몇몇 예들에서, 세포외 리간드-결합 도메인, 막관통 도메인, and 세포내 신호전달(signaling) 도메인은 하나의 폴리펩타이드, 즉 단일 체인이다. 다중-체인 아키텍쳐들(architectures)은 더욱 특히 WO2014039523에 개시된다.
다중-체인 CAR는 보통
- 적어도 하나의 세포외 리간드-결합 도메인을 포함하는 하나의 막관통 폴리펩타이드 및;
- 적어도 하나의 신호(signal)-전달(transducing) 도메인을 포함하는 하나의 막관통 폴리펩타이드
와 같은 다른 폴리펩타이드들로 형성된다.
신호전달(signaling) 폴리펩타이드는 조작된 면역 세포의 정상적 기능들의 적어도 하나의 활성화의 원인이 된다. 예를 들어, T 세포의 기능은 사이토카인들의 분비를 포함하는 헬퍼 활성 또는 세포용해 활성일 수 있다. 이와 같이, "신호전달(signaling) 단백질"은 전문화된 기능을 수행하기 위하여 세포에 향하고 전달자(transmitter) 도메인 기능 신호를 전달하는 단백질을 가리킨다. 특정 예에서, 상기 전달자(transmitter) 도메인은 신호전달(signaling) 단백질일 수 있다. 신호들의 전달(transmission)은 : 단백질/단백질 상호작용들, 단백질/DNA 상호작용, 단백질/RNA 상호작용, 단백질/작은 분자 상호작용, 번역 후 단백질 변형(modification), 형태적(conformational) 변화, 세포이하(subcellular) 재위치화(relocalization)으로부터 야기될 수 있다.
신호전달(signaling) 단백질은 핵에서 유전자를 활성화시킬 수 있다. 신호전달(signaling) 단백질의 예들은 활성화된 T 세포들에서 인터루킨-2 프로모터에 결합할 수 있는 유도성 인자인 NFAT 전사 인자 패밀리의 멤버들일 수 있다. NFAT 단백질들의 조절은 칼슘, 칼시뉴린 및 호머(Homer) 스캐폴딩 단백질들과 같은 단백질들 및 대사산물들을 포함한다. 상기 신호전달(signaling) 단백질은 칼시뉴린 및 호머(Homer) 단백질들에 의한 조절을 피하는 NFAT의 활성화된 조작된 형태일 수 있다. 상기 신호전달(signaling) 단백질은 T 세포들의 활성화를 가능하게 하는 Iκb에 의하여 세포질에서 제거(sequestration)를 피하도록 조작된 NF-κB일 수 있다. 상기 신호전달(signaling) 단백질은 또한 세 개의 IKK 서브유닛들 (IKKα, IKKβ, IKKγ)의 발현일 수 있다. 재구축된(reconstituted) IKK 복합체는 IκB의 유비퀴틴화를 촉발함으로써 NF-κB 경로를 활성화시켰다. JNK 신호전달(signaling)의 활성화는 또한 신호전달(signaling) 단백질 AP-1 (전사 인자)의 직접적 발현을 통하여 촉발될 수 있었다. 상기 신호전달(signaling) 단백질은 NFAT 및 NF-kb에 대한 것과 동일한 유전자의 전사를 특이적으로 타겟으로 하고 활성화시킬 조작된 전사(transcription) 활성인자(activator) 유사(like) 효과기(effector) (TALE) 결합 도메인일 수 있다.
본 발명에 따라, 상기 신호전달(signaling) 단백질은 단백질-단백질 상호작용을 통하여 신호전달(signaling) 경로를 억제시킬 수 있고 또는 신호전달(signaling) 경로를 억제하기 위하여 핵에서 유전자를 활성화시킬 수 있다. 상기 신호전달(signaling) 단백질은 세포외 신호(signal) 조절되는(regulated) 키나제들(kinases) (ERK) 신호전달(signaling) 단백질들을 탈인산환시키고 불활성화시키는 미토젠(mitogen)-활성화 단백질 키나제(kinase) 포스파타제(phosphatases) (MKPs) 패밀리의 멤버인 박시나(vaccinia) H1 관련(related) 단백질들 (VHR)일 수 있다.
본 발명에 따라, CAR에서 사용을 위한 신호 전달(transducing) 도메인은 이들 서열들의 임의의 유도체 또는 변종 및 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열과 더불어, 항원 수용체 이용(engagement) 후 신호 전달(signal transduction)을 개시하도록 일제히 작용하는 공-수용체들 및 T 세포 수용체의 세포질 서열들일 수 있다. 신호 전달(Signal transduction) 도메인은 두 개의 구별되는 클래스들의 세포질 신호전달(signaling) 서열, 항원-의존적 주요(primary) 활성화를 개시하는 것들, 및 및 이차 또는 공-자극 신호를 제공하기 위하여 항원-독립적 방식으로 작용하는 것들을 포함할 수 있다.
특정 예에서, 본 발명의 CAR의 신호 전달(signal transduction) 도메인은 공-자극 신호 분자를 포함한다. 공-자극 분자는 효율적인 면역 반응에 요구되는 항원 수용체 또는 그것들의 리간드들 외 세포 표면 분자이다.
"공-자극 리간드"는 T-세포 상 동계(cognate) 공-자극 분자에 특이적으로 결합하여, 이로써 예컨대, TCR/CD3 복합체가 펩타이드가 로드(load)된 MHC 분자에 결합함으로써 제공되는 일차 신호에 추가하여, 증식 활성화, 분화 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포 상 분자를 가리킨다. "공-자극 분자"는 공-자극 리간드에 특이적으로 결합하여, 이로써 증식과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, 세포에 의한 공-자극 반응을 매개하는 T-세포 상 동계(cognate) 결합 파트너를 가리킨다. 공-자극 분자들은 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 다중-체인 CAR는 Fc 수용체, 바람직하게는 FcεRI의 구조체로부터 유래될 수 있고, 하기 요소들 중 적어도 둘을 포함할 수 있다:
a) 세포외 리간드-결합 도메인에 융합되는 FcRI 알파 체인의 막관통 도메인을 포함하는 하나의 폴리펩타이드,
b) FcRI 베타 체인의 막관통 도메에 융합되는 N- 및 C- 말단 세포질 꼬리의 부분을 포함하는 하나의 폴리펩타이드, 및/또는
c) 각각 FcRI 감마 체인의 막관통 도메인 및/또는 세포질내 꼬리의 한 부분을 포함하는 두 개의 추가적인 폴리펩타이드들,
일반적으로, 이들 다른 폴리펩타이드들은 막인접(juxtamembrane) 위치에서 세포 표면에서 생기는 다이머, 트리머 또는 테트라머 구조체들을 자연발생적으로 형성하기 위하여 서로 멀티머화된다.
몇몇 예들에서, 본 발명은 US7446190, WO2008/121420, US8252592, US20140024809, WO2012/079000, WO2014153270, WO2012/099973, WO2014/011988, WO2014/011987, WO2013/067492, WO2013/070468, WO2013/040557, WO2013/126712, WO2013/126729, WO 2013/126726, WO2013/126733, US8399645, US20130266551, US20140023674, WO2014039523, US7514537, US8324353, WO2010/025177, US7446179, WO2010/025177, WO2012/031744, WO2012/136231A1, WO2012/050374A2,WO2013074916, WO/2009/091826A3, WO2013/176915 또는 WO/2013/059593 중 임의의 것과 더불어, 선행 기술에서 잘 정의된 단일-체인 CAR를 포함하는 면역 세포에 대한 것이다.
몇몇 예들에서, 본 발명은
- 적어도 항원, 바람직하게는 세포 표면 마커 항원에 특이적인 VH 체인 및 VL 체인에 의하여 형성되는 scFv을 포함하고, 상기 세포외 결합 도메인은 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함하는, 적어도 하나의 세포외 결합 도메인, 및
- 힌지를 포함하는
- 세포외 도메인
- 막관통 도메인, 및
- 세포내 도메인
을 포함하는 CAR에 대한 것이다.
하나의 예에서, 막관통 도메인은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 체인, PD-1, 4-1BB, OX40, ICOS, CTLA-4, LAG3, 2B4, BTLA4, TIM-3, TIGIT, SIRPA, CD28, CD3 엡실론(epsilon), CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154의 막관통 영역(들)을 포함한다.
또다른 예에서, 힌지는 IgG4 힌지 또는 CD8 알파 힌지이고, 바람직하게는 CD8 알파 힌지이다.
적합한 막관통 도메인들의 구별되는 특징들은 세포, 바람직하게는 본 발명에서 면역 세포, 특히 림프구 세포들 또는 자연살해 (NK) 세포들의 표면에서 발현되고, 미리 정한 타겟 세포에 대항하여 면역 세포의 세포 반응을 향하여 서로 상호작용하는 능력을 포함한다. 막관통 도메인은 자연(natural) 또는 합성 소스로부터 유래될 수 있다. 막관통 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 제한되지 않는 예들로서, 막관통 폴리펩타이드는 α, β, γ 또는 δ와 같은 T-세포 수용체의 서브유닛, CD3 복합체를 이루는 폴리펩타이드, IL2 수용체 p55 (α 체인), p75 (β 체인) 또는 γ 체인, 특히 Fcγ 수용체 III 인 Fc 수용체들의 서브유닛 체인 또는 CD 단백질들일 수 있다. 대체하여, 막관통 도메인는 합성일 수 있고, 류신(leucine) 및 발린과 같은 소수성 잔기들을 대부분(predominantly) 포함할 수 있다. 선호되는 예에서, 상기 막관통 도메인은 인간 CD8 알파 체인 (예컨대 NP_001139345.1)으로부터 유래된다. 상기 막관통 도메인은 또한 CD8 막관통 도메인 (알파 및 베타 체인들)일 수 있다. 상기 막관통 도메인은 오블리게이티드(obligated) 헤테로 또는 호모다이머들을 만들기 위하여 조작될 수 있다. 특정 예에서 상기 CAR들은 오직 리간드 인식 후에 다이머화될 수 있는 세포내 도메인들 또는 막관통 도메인들을 포함할 수 있다. 막관통 도메인의 또다른 예는 NKG2-D 수용체일 수 있다. NKG2D (자연살해 세포 그룹 2D)는 NK 세포들, γδ-TcR+ T 세포들, 및 CD8+αβ-TcR+ T 세포들 상에서 발현되는 C-타입 렉틴-유사 수용체이다 (Bauer, Groh et al., 1999, Science 285(5428):727-9. NKG2D은 그것의 세포질 도메인이 PI-3 키나제의 p 85 서브유닛에 결합하는, 막관통 어댑터(adapter) 단백질 DAP10과 관련된다 (Wu, Song et al. 1999, Science 285(5428):730-2).
상기 막관통 도메인은 또한 인테그린일 수 있다. 인테그린들은 서로 결합하여 모든 백혈구들에서 발현되는 LFA-1 (integrin 림프구 기능-관련 항원(antigen)-1)을 형성하는 α 및 β 체인들로 이루어지는 헤테로다이머인 내장된(integral) 막 단백질들이다. LFA-1는 그것의 리간드, ICAMs 1-3 (세포간 부착 분자들 1부터 3까지)과 상호작용들을 통하여 백혈구 세포간 부착에서 가장 중요한 역할을 하고, 그리고 또한 그것은 림프구 공-자극 신호전달(signaling)에서 중요한 역할을 갖는다 (Chen and Flies 2013, Nat Rev Immunol 13(4):227-42). LAF-1의 그것의 면역글로불린 ICAM-1에 대한 결합의 분자적 상세한 것은 LAF-1 결합 부위의 주의깊은 조작을 가능하게 하는 것으로 잘 알려져 있다. ICAM-1에 대한 αL 도메인의 친화도는 LAF-1에서 특이적 루프들의 변화와 형태적으로 연결된 그것의 C-말단 헬릭스의 이동(displacement)에 의하여 조절된다. 활성인 그리고 낮은 형태들은 500 및 10,000 배(folds) 다르다. 두 타입의 길항제들이 LFA-1에 대하여 알려져 있고, 그것들의 작용 메커니즘이 알려져 있다는 것 또한 흥미롭다. 인테그린 세포 표면 부착 수용체들은 밖에서 안으로 또한 반대로도 신호를 보낼 수 있다. 안에서 밖으로 메세지를 보내기 위하여 인테그린 꼬리 LFA-1에 결합하는 Talin으로서 세포골격 단백질들이 있다.
한 예에 따라, 막관통 도메인은 CD8 알파의 막관통 영역(들) 또는 PD-1의 막관통 영역을 포함한다.
본 발명의 한 측면에서, 막관통 도메인은 힌지 예컨대 인간 단백질로부터의 힌지을 통하여 CAR의 세포외 도메인에 부착된다. 예를 들어, 한 예에서, 힌지는 인간 Ig (면역글로불린) 힌지, 예컨대 PD-1 힌지, IgG4 힌지, 또는 CD8알파 힌지일 수 있다.
바람직한 예에서, CAR의 힌지는 인간 면역글로불린 힌지이다.
더 바람직한 예에서, CAR의 힌지는 IgG4 힌지 또는 CD8 알파 힌지이다.
몇몇 예에서, 힌지는 FcγRIII 알파 힌지이다.
몇몇 예에서, 힌지는 CD8 알파 힌지이다.
몇몇 예에서, 힌지는 CD8 알파 힌지이고 서열번호 179, 180 또는 181에서 나타내는 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 또는 99% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
여기에서 사용된 용어 "힌지 영역"은(또한 문헌 내에서 스토크(stalk) 영역으로도 명명됨) 보통 세포외 리간드-결합 도메인에 막관통 도메인을 연결하는 기능을 하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 특히, 스토크 영역은 세포외 리간드-결합 도메인에 대한 더 많은 가요성(flexibility) 및 접근성을 제공하는데 사용된다. 스토크 영역은 300 아미노산들까지, 바람직하게는 10 내지 100 아미노산들 그리고 가장 바람직하게는 25 내지 50 아미노산들을 포함할 수 있다. 스토크 영역은 CD8, CD4, CD28 또는 RTK의 세포외 영역의 전부 또는 일부, 또는 항체 불변 영역의 전부 또는 일부와 같은, 자연적으로 발생하는 분자들의 전부 또는 일부로부터 유래될 수 있다. 대체하여, 스토크 영역은 자연적으로 발생하는 스토크 서열에 상응하는 합성 서열일 수 있고, 또는 완전히 합성 스토크 서열일 수 있다.
("세포질 신호전달(signaling) 도메인" 또는 "세포내 신호전달(signaling) 도메인"으로도 여기에서 언급되는) 세포내 도메인은 하기 정의된 대로 자극 분자로부터 유래된 기능적 신호전달(signaling) 도메인을 포함한다. 몇몇 예들에서, 자극 분자는 T-세포 수용체 복합체와 관련된 제타 체인이다. 몇몇 예들에서, 세포질의 신호전달(signaling) 도메인은 하기 정의된 바와 같이 적어도 하나의 공자극 분자로부터 유래된 하나 이상의 기능적 신호전달(signaling) 도메인들을 더 포함한다. 몇몇 예들에서, 공자극 분자는 4-1BB (즉, CD137), CD27 및/또는 CD28로부터 선택된다.
용어 "자극 분자,"는 T-세포 신호전달(signaling) 경로의 적어도 몇몇 측면을 위한 자극 방법에서 TCR 복합체의 양성 활성화를 조절하는 양성 세포질의 신호전달(signaling) 서열(들)을 제공하는 T-세포에 의하여 발현되는 분자를 가리킨다. 몇몇 예들에서, 양성 신호는 예컨대, 펩타이드가 로딩된(load) MHC 분자에 TCR/CD3 복합체의 결합에 의하여 개시되며, 이는 증식, 활성화, 분화, 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 T-세포 반응의 매개로 이끈다. 자극성 방식으로 작용하는 ("양성 신호전달(signaling) 도메인" 또는 양성 세포내 신호전달(signaling) 도메인으로도 불리는) 양성 세포질의 신호전달(signaling) 서열은 면역수용체 티로신-기반의 활성화 모티프 또는 ITAM로도 알려진 신호전달(signaling) 모티프를 포함할 수 있다. 양성 세포질의 신호전달(signaling) 서열을 포함하는 ITAM의 예들은 TCR 제타 (또는 CD3제타), FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타 , CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 ("ICOS"으로도 알려짐) 및 CD66d로부터 유래하는 것들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 몇몇 예들에서, CAR의 세포내 신호전달(signaling) 도메인은 서열번호 175에 보여지는 아미노산 서열과 적어도 약 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 또는 99% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열을 갖는 CD3ζ (zeta) 신호전달(signaling) 도메인을 포함할 수 있다.
몇몇 측면에서, CAR의 세포내 신호전달(signaling) 도메인은 CAR를 포함하는 세포의 면역 효과기 기능을 촉진하는 신호를 만든다. 예컨대 CAR T-세포에서 면역 효과기 기능의 예들은 사이토카인들의 분비를 포함하는 세포용해 활성 및 헬퍼 활성을 포함한다.
용어 "공자극 분자"는 공자극 리간드에 특이적으로 결합하여, 이로써 증식과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는, T-세포에 의한 공자극 반응을 매개하는, T-세포 상 동계(cognate) 결합 파트너를 가리킨다. 공자극 분자들은 효율적인 면역 반응에 요구되는 항원 수용체들 또는 그것들의 리간드들 외 세포 표면 분자들이다. 공자극 분자들은 OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) 및 4-IBB (CD137)과 더불어 MHC 클래스 I 분자, BTLA 및 Toll 리간드 수용체를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
공자극 세포내 신호전달(signaling) 도메인은 공자극 분자의 세포내 부분일 수 있다. 공자극 분자는 하기 단백질 패밀리들에서 대표될 수 있다 : TNF 수용체 단백질들, 면역글로불린-유사 단백질들, 사이토카인 수용체들, 인테그린들, 신호전달(signaling) 림프구성 활성화 분자들 (SLAM 단백질들), 및 활성화시키는 NK 세포 수용체들. 이러한 분자들의 예들은 CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, 림프구 기능-관련 항원(antigen)-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3, 및 CD83에 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 몇몇 예들에서, 본 발명의 CAR의 세포내 신호전달(signaling) 도메인은 서열번호 176 및 서열번호 177에 보여지는 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%, 95%, 97%, 또는 99% 서열 동일성을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
표 4는 CAR 요소들의 모범적인 서열을 제공한다
<표 4>

CAR들 및 그것들을 포함하는 면역 세포들은 널리 개시되어 왔으며 알려진 방법들에 따라 당업자에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 이러한 CAR들을 포함하는 세포들 및 CAR들을 제조하는 방법론들은 그 전체가 참조로서 여기에 모두 포함되는 US7446190, WO2008/121420, US8252592, US20140024809, WO2012/079000, WO2014153270, WO2012/099973, WO2014/011988, WO2014/011987, WO2013/067492, WO2013/070468, WO2013/040557, WO2013/126712, WO2013/126729, WO 2013/126726, WO2013/126733, US8399645, US20130266551, US20140023674, WO2014039523, US7514537, US8324353, WO2010/025177, US7446179, WO2010/025177, WO2012/031744, WO2012/136231A1, WO2012/050374A2, WO2013074916, WO2009/091826A3, WO2013/176915 또는 WO/2013/059593에 개시되어 있다.
본 발명은 상기 정의된 CAR를 코드하는 서열들을 포함하는 재조합 DNA 구조체을 포함하며, 이때 CAR는 세포 타겟 항원에 특이적으로 결합하는 항체 단편와 같은 세포외 도메인을 포함하고, 이때 세포외 도메인의 서열은 세포내 도메인 및 막관통 도메인을 코드하는 핵산 서열로서 동일한 리딩 프레임에서 그리고 이와 인접한 것이다. 모범적인 CAR 구조체는 선택적 리더(leader) 서열, 세포외 세포 타겟 항원 결합 도메인, 힌지, 막관통 도메인, 및 세포내 억제성 신호전달(signaling) 도메인을 포함할 수 있다.
몇몇 예들에서, 본 발명은 앞서 정의된 대로의 CAR를 코드하는 서열들을 포함하는 재조합 DNA 구조체에 대한 것이다.
몇몇 예들에서, CAR는
- 적어도 세포 표면 마커 항원에 특이적인 VH 체인 및 VL 체인에 의하여 형성되는 scFv을 포함하며, 이때 상기 세포외 결합 도메인은 세포외 결합 도메인을 포함하는 그리고 상기 CAR를 발현시키는 T 세포들의 생체내 세포 고갈(depletion) 및/또는 시험관내 세포 분류를 위하여 에피토프-특이적 mAb에 의하여 결합되는 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함하는, 적어도 하나의 세포외 결합 도메인, 및
- 힌지,
를 포함하는 세포외 도메인
- 막관통 도메인, 및,
- 세포내 도메인을 포함한다.
CAR-양성 면역 세포 들을 분류하는 방법
한 측면에 따라, 본 발명은 CAR를 발현시키는 세포들만을 수집하기 위하여 항원-특이적 항체 (바람직하게는 단일클론 Abs)과 상기 조작된 면역의 군집을 접촉시키는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 CAR-발현시키는 면역 세포를 분류하는 방법에 대한 것이다.
몇몇 예들에서, 본 발명은
- 상기 mAb-특이적 에피토프에 특이적인 단일클론 항체와 상기 면역 세포들의 군집을 접촉시켜 상기 CAR-발현시키는 면역 세포만을 수집하는 단계
를 포함하는, CAR-발현시키는 면역 세포를 시험관내에서 분류하는(sorting) 방법에 대한 것이고, 이때 상기 CAR는 앞서 기재한 대로 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함하는 적어도 하나의 세포외 결합 도메인을 포함한다.
몇몇 예들에서, 본 발명은 CAR-발현시키는 면역 세포에서 풍부한 세포들의 군집을 수득하기 위하여,
- 상기 mAb-특이적 에피토프에 특이적인 단일클론 항체 (에피토프 -특이적 mAb)와 상기 면역 세포들의 군집을 접촉시키는 단계,
- 단일클론 항체에 결합하는 세포들을 선택하는 단계
를 포함하며, 이때 상기 CAR는 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프를 포함하는 적어도 하나의 세포외 결합 도메인을 포함하는, CAR-발현시키는 면역 세포들을 시험관내에서 분류하는 방법에 대한 것이다.
몇몇 예들에서, 상기 mAb-특이적 에피토프에 특이적인 상기 단일클론 항체는 형광단에 콘쥬게이트되고 단일클론 항체에 결합하는 세포들을 선택하는 단계가 형광(Fluorescence) 활성된(Activated) 세포(Cell) 분류(Sorting) (FACS)에 의하여 이루어진다.
몇몇 예들에서, 상기 mAb-특이적 에피토프에 특이적인 상기 단일클론 항체는 자성 입자에 콘쥬게이트되고 단일클론 항체에 결합하는 세포들을 선택하는 단계는 자성(Magnetic) 활성화된(Activated) 세포(Cell) 분류(Sorting) (MACS)에 의하여 이루어진다.
몇몇 예들에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 서열번호 144의 mAb-특이적 에피토프를 포함한다.
몇몇 예들에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 서열번호 144의 mAb-특이적 에피토프를 포함하고 면역 세포들의 군집을 접촉하기 위하여 사용되는 항체는 QBEND-10이다.
몇몇 예들에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 서열번호 35의 mAb-특이적 에피토프를 포함한다.
몇몇 예들에서, CAR의 세포외 결합 도메인은 서열번호 35의 mAb-특이적 에피토프를 포함하고 면역 세포들의 군집을 접촉하기 위하여 사용되는 항체는 리툭시맙이다.
몇몇 예들에서, 전술한 CAR-발현시키는 면역 세포들을 시험관내에서 분류하는 방법을 이용할 때 수득되는 군집 CAR-발현시키는 면역 세포들은 CAR-발현시키는 면역 세포들의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%를 포함한다. 몇몇 예들에서, 전술한 CAR-발현시키는 면역 세포들을 시험관내에서 분류하는 방법을 이용할 때 수득되는 군집 CAR-발현시키는 면역 세포들은 적어도 85% CAR-발현시키는 면역 세포들을 포함한다. 몇몇 예들에서, 전술한 CAR-발현시키는 면역 세포들을 시험관내에서 분류하는 방법을 이용할 때 수득되는 CAR-발현시키는 면역 세포들의 군집은 실시예 7.5에 기재된 프로토콜을 이용하여 최초 (분류되지 않은) 세포 군집과 비교할 때 시험관내에서 증가된 세포독성 활성을 보인다. 바람직한 예에서, 시험관내 상기 세포독성 활성은 10%, 20%, 30% 또는 50%로 증가된다.
바람직하게는, mAb들은 당업자들에 의하여 일상적으로 실현되는(realized) 것과 같은 비드들 상에서 또는 칼럼들과 같은 지지체(support) 상에 미리(previously) 결합된다.
바람직한 예에 따라, 면역 세포들은 T-세포들이다.
본 발명에 따라, 받는 사람(recipient)에게 투여되는 세포들은 원천(source) 군집으로부터 시험관내에서 풍부하게 될(enriched) 수 있다.
원천(source) 군집을 확대하는 방법들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자에게 알려진 밀도 원심분리, 면역-자성 비드 정제, 친화성 크로마토그래피, 및 형광 활성화된 세포 분류의 조합들을 이용하여 CD34 항원과 같은 항원을 발현시키는 세포들을 선택하는 단계를 포함할 수 있다.
유동세포 분석법
유동세포 분석법은 세포들의 군집 내 특이적 세포 타입들을 분류하고 정량화하기 위하여 당업계에서(in the art) 널리 사용되고 당업자에게 잘 알려진 방법이다. 일반적으로 유동세포 분석법은 주로(primarily) 옵티칼(optical) 수단들에 의하여 세포들의 구조적 특징들을 또는 요소들을 양을 평가하는 방법이다. 다른 세포 타입들은 구조적 특징들을 양을 평가하여(quantitating) 구분될 수 있기 때문에 유동세포 분석법 및 세포 분류는 혼합물에서 다른 표현형들의 세포들을 분류하고 수를 세는데 사용될 수 있다.
유동세포 분석법의 분석은 1) 하나 이상의 표지된(labeled) 마커들로 선택된 세포 타입들을 표지시키는 단계, 및 T) 군집 내 세포들의 총 수에 대하여 표지된 세포들의 수를 결정하는 단계의: 두 기본적인 단계들을 포함한다.
세포 타입들을 표지시키는 주된 방법은 특이적 세포 타입에 의하여 발현되는 마커들에 표지된 l항체들을 결합시키는 것에 의한다. 항체들은 예컨대, 첫 번째 항체를 인식하는 형광-표지된 두 번째 항체를 이용하여 간접적으로 표지되거나, 또는 형광 화합물로 직접적으로 표지된다. 바람직한 예에서, CAR를 발현시키는 T 세포들을 분류하기 위하여 사용되는 방법은 자성-활성화된 세포 분류 (MACS)이다.
자성-활성화된 세포 분류 (MACS)는 초상자성(superparamagnetic) 나노입자들 및 칼럼들을 이용함으로써 그것들의 표면 항원들에 따라 여러가지 세포 군집들의 분리를 위한 방법이다 (CD 분자들). 그것은 순수한 세포 군집들을 얻기 위하여 몇 가지 단순한 단계들만을 거친다. 단일-세포 현탁액 내 세포들은 마이크로비드들로 자성 표지된다. 샘플은 세포들의 빠르고 온화한 분리를 가능하게 하는 세포-친화적 코팅으로 커버되는 강자성 구체들로 이루어진 칼럼에 적용된다. 표지되지 않은 세포들은 통과하는 반면 자성 표지된 세포들은 칼럼 내에 보유된다. 통과한 것들은 표지되지 않은 세포 분획으로서 수집될 수 있다. 짧은 세척 단계 후, 칼럼은 분리기로부터 제거되고, 자성 표지된 세포들은 칼럼으로부터 용출된다.
다른 기술들 중에서, FACS는 세포 군집들이 다른 마커 농도에 기초한 분리를 요구할 때, 또는 타겟 세포 군집이 확인 마커를 매우 낮은 수준으로 발현시킬 때, 또는 매우 높은 순도의 원하는 군집이 달성될 수 있는 것으로 알려진 표현형의 세포 군집들을 정제하기 위한 선택의 기술이다. 게다가, FACS는 유전적으로 변형된 형광 단백질 마커와 같은 세포내 단백질 발현 또는 내부 염색에 기초한 세포들을 단리하는, 유일한 이용가능한 정제 기술이다. FACS는 크기, 입도 및 형광에 기초하여 개별적인 세포들의 정제를 가능하게 한다. 관심있는 세포들을 정제하기 위하여, 그것들은 먼저 원하는 세포 군집 상 특이적 표면 마커들을 인식하는 형광-태그된(tagged) 단일클론 항체들 (mAb)로 염색된다.
T-세포와 같은 특이적 세포 군집의 정제를 위한 상세한 프로토콜은 Basu S et al. (2010). (Basu S, Campbell HM, Dittel BN, Ray A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41): 1546)에서 찾을 수 있다.
본 발명의 바람직한 예에서, CAR를 발현시키는 T 세포들을 분류하는 방법에서 사용되는 mAb는 이브리투모맙(ibritumomab), 티우세탄(tiuxetan), 뮤노모나브(muromonab)-CD3, 토시투모마브(tositumomab), 아브식시마브(abciximab), 바실리시마브(basiliximab), 브렌툭시맙(brentuximab) 베도틴(vedotin), 세툭시맙(cetuximab), 인플릭시맙(infliximab), 리툭시맙(rituximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 세르톨리주맙(certolizumab) 페골(pegol), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 나탈리주맙(natalizumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베돌리주맙(vedolizumab), 아달리무맙(adalimumab), 벨리무맙(belimumab), 카나키누맙(canakinumab), 데노수맙(denosumab), 골리무맙(golimumab), 이필리무맙(ipilimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 파니투무맙(panitumumab), QBEND-10, 및 우스테키누맙(ustekinumab) 중에서 선택된다.
더 바람직한 예에서, 상기 mAb는 리툭시맙이다.
더 바람직한 예에서, 상기 mAb는 QBEND-10이다.
CAR-발현시키는 면역 세포들의 고갈(depleting) 방법
"생체내 고갈(depletion)"에 의하여 본 발명에서 억제 또는 제거에 의하여 CAR-발현시키는 면역 세포들의 증식을 중단하는 것을 목적으로 하는 포유류 생물에 대한 치료의 투여가 의미된다.
본 발명의 한 측면은 적어도 하나의 에피토프-특이적 mAb들과 상기 조작된 면역 세포 또는 상기 CAR-발현시키는 면역 세포을 접촉시키는 단계를 포함하는, 앞서 기재된 대로 m-Ab 특이적 에피토프를 포함하는 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포를 생체내에서 고갈하는(depleting) 방법에 대한 것이다. 본 발명의 또다른 측면은 에피토프-특이적 항체들과 상기 조작된 면역 세포를 접촉시킴으로써 (mAb-특이적 에피토프의 삽입에 의하여 형성된) 상기 키메라 scFv를 포함하는 면역 CAR-발현시키는 면역 세포를 생체내에서 고갈하는(depleting) 방법에 대한 것이다.
바람직하게는, 상기 면역 세포들은 T-세포들이고 그리고/또는 항체들은 단일클론이다.
한 예에 따라, 면역 조작된 세포의 생체내 고갈(depletion)은 본 발명의 시험관내 방법을 이용하여 이전에 분류된 조작된 면역 세포 상에서 수행된다. 이 경우, 이것은 사용된 동일한 주입된 mAb일 것이다.
바람직한 예에 따라, mAb-특이적 항원은 CD20 항원이고 에피토프-특이적 mAb는 리툭시맙이다.
몇몇 예들에서, 본 발명은 적어도 하나의 에피토프-특이적 mAb와 상기 CAR-발현시키는 면역 세포를 접촉시키는 단계를 포함하는 환자에게서, 앞서 기재된 대로 mAb-특이적 에피토프를 포함하는 CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포 (CAR-발현시키는 면역 세포)를 생체내에서 고갈하는(depleting) 방법에 대한 것이다.
본 발명의 바람직한 예에서, CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포를 고갈하는(depleting) 방법에 사용되는 mAb는 이브리투모맙(ibritumomab), 티우세탄(tiuxetan), 뮤노모나브(muromonab)-CD3, 토시투모마브(tositumomab), 아브식시마브(abciximab), 바실리시마브(basiliximab), 브렌툭시맙(brentuximab) 베도틴(vedotin), 세툭시맙(cetuximab), 인플릭시맙(infliximab), 리툭시맙(rituximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 세르톨리주맙(certolizumab) 페골(pegol), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 나탈리주맙(natalizumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베돌리주맙(vedolizumab), 아달리무맙(adalimumab), 벨리무맙(belimumab), 카나키누맙(canakinumab), 데노수맙(denosumab), 골리무맙(golimumab), 이필리무맙(ipilimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 파니투무맙(panitumumab), QBEND-10, 및 우스테키누맙(ustekinumab) 중에서 선택된다.
몇몇 예들에서, 상기 mAb-특이적 에피토프는 CD20 에피토프 또는 미모토프(mimotope), 바람직하게는 서열번호 35이고 에피토프-특이적 mAb들은 리툭시맙이다.
몇몇 예들에서, 적어도 하나의 에피토프-특이적 mAb와 상기 조작된 면역 세포 또는 상기 CAR-발현시키는 면역 세포를 접촉시키는 단계는 에피토프-특이적 mAb, 바람직하게는 리툭시맙을 환자에게 주입하는 단계를 포함한다. 몇몇 예들에서, 환자에게 투여되는 에피토프-특이적 mAb의 양은 환자에게서 CAR-발현시키는 면역 세포의 적어도 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 제거하기에 충분하다.
몇몇 예들에서, 적어도 하나의 에피토프-특이적 mAb와 상기 조작된 면역 세포 또는 상기 CAR-발현시키는 면역 세포를 접촉시키는 단계는 375mg/m2의 리툭시맙을 한 번 또는 여러 번, 바람직하게는 한 번 매주 환자에게 주입시키는 단계를 포함한다.
몇몇 예들에서, mAb-특이적 에피토프를 포함하는 CAR를 발현시키는 면역 세포들(CAR-발현시키는 면역 세포들)이 에피토프-특이적 mAb를 이용하여 CDC 분석에서 고갈될(depleted) 때, 독자 생존 가능한 CAR-발현시키는 면역 세포들의 양이 바람직하게는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%만큼 감소한다. 바람직하게는 CDC 분석은 실시예 3, 실시예 4 또는 실시예 7.4에 개시된 분석이다. 몇몇 예들에서, 상기 mAb-특이적 에피토프는 CD20 에피토프 또는 미모토프(mimotope)이고, 바람직하게는 서열번호 35이고 에피토프-특이적 mAb들은 리툭시맙이다.
하나의 특정 예에서, CAR-조작된 면역 세포들의 생체내 고갈(depletion)은 이중-특이적 항체들을 주입시킴으로써 수행된다. 정의에 의하여 이중특이적(bispecific) 단일클론 항체 (BsAb)는 두 개의 다른 단일클론 항체들의 단편들로 이루어진 인공 단백질이고 따라서 두 개의 다른 타입들의 항원에 결합한다. 이들 BsAb 및 면역치료에서 그것들의 이용은 Mller D and Kontermann R.E. (2010) Bispecific Antibodies for Cancer Immunotherapy, BioDrugs 24 (2): 89-98에서 널리 리뷰되었다.
"효과기 세포"에 의하여, 이 용어는 림프구들, 마크로파지들, 수지상 세포들, 자연 살해 세포들 (NK 세포), 세포독성 T 림프구들 (CTL)과 같은 면역 세포들을 포함한다.
또다른 특정 예에 따라, 주입된 이중-특이적 mAb는 키메라 scFv를 발현시키는 조작된 면역 세포들 상에 갖고 있는 mAb-특이적 에피토 및 효과기 및 세포독성 세포 상 표면 항원에 둘다 결합할 수 있다. 이 측면은 도 3에 제시된다. 이렇게 함으로써 BsAb에 의하여 촉발되는 조작된 면역 세포들의 고갈(depletion)이 항체-의존적(dependent) 세포(cellular) 세포독성(cytotoxicity) (ADCC)을 통하여 발생될 수 있다. 이러한 형태는 Deo Y M, Sundarapandiyan K, Keler T, Wallace PK, and Graziano RF, (2000), Journal of Immunology, 165 (10):5954-5961]에서 예를 들어 발견될 수 있다.
특정 예에 따라, 세포독성 약물은 CAR-발현시키는 면역 세포들을 고갈시키기(deplete) 위하여 사용되는 에피토프-특이적 mAb들에 커플링된다. 세포독성 약물들의 암-죽이는 능력과 단일클론 항체들의 타겟팅 능력을 결합시킴으로써 항체-약물(drug) 콘쥬게이트 (ADC)는 약물 단독 사용에 비교할 때 건강하고 질병에 걸린 조직 사이의 민감한 식별력을 가능하게 한다. 시장 승인들은 몇몇 ADC들에 대하여 받았다 : 그것들을 - 특히 링커들 상에 - 만드는 기술은 하기 선행기술들에 아주 분명하게 제시된다 (Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos and Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz and Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; U.S. Pat. No. 4,975,278).
또다른 특정 예에 따라, 주입되는 에피토프-특이적 mAb는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 촉진시킬 수 있는 분자와 미리 콘쥬게이트된다. 그러므로 보체계는 생물로부터 병원균을 제거하는(clear) 항체들의 능력을 보완하거나 또는 돕는다. 몇몇 개 중 하나에 의하여 자극될 때, 세포-살상 막 공격 복합체의 활성화 및 반응의 거대한 증폭으로서 활성화 카스케이드(cascade)가 촉발된다.
다른 분자가 글리칸들과 같이, mAb에 콘쥬게이트 하기 위하여 사용될 수 있다 [Courtois, A, Gac-Breton, S., Berthou, C., Guzennec, J., Bordron, A. and Boisset, C. (2012), Complement dependent cytotoxicity activity of therapeutic antibody fragments is acquired by immunogenic glycan coupling, Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458; http://www.ejbiotechnology.info DOI: 10.2225/vol15-issue5).
본 발명의 몇몇 예들에서, CAR를 발현시키는 조작된 면역 세포를 분류 및 고갈하는(depleting) 방법에서 사용되는 에피토프-특이적 mAb는 동일하고 이브리투모맙(ibritumomab), 티우세탄(tiuxetan), 뮤노모나브(muromonab)-CD3, 토시투모마브(tositumomab), 아브식시마브(abciximab), 바실리시마브(basiliximab), 브렌툭시맙(brentuximab) 베도틴(vedotin), 세툭시맙(cetuximab), 인플릭시맙(infliximab), 리툭시맙(rituximab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 베바시주맙(bevacizumab), 세르톨리주맙(certolizumab) 페골(pegol), 다클리주맙(daclizumab), 에쿨리주맙(eculizumab), 에팔리주맙(efalizumab), 젬투주맙(gemtuzumab), 나탈리주맙(natalizumab), 오말리주맙(omalizumab), 팔리비주맙(palivizumab), 라니비주맙(ranibizumab), 토실리주맙(tocilizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 베돌리주맙(vedolizumab), 아달리무맙(adalimumab), 벨리무맙(belimumab), 카나키누맙(canakinumab), 데노수맙(denosumab), 골리무맙(golimumab), 이필리무맙(ipilimumab), 오파투무맙(ofatumumab), 파니투무맙(panitumumab), QBEND-10, 및 우스테키누맙(ustekinumab) 중에서 선택된다.
본 발명의 몇몇 예들에서, 다른 항체들은 세포들을 분류 및 고갈하는데(depleting) 사용된다. 몇몇 예들에서, 세포외 결합 도메인은 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 mAb-특이적 에피토프와 같은 리툭시맙에 의하여 특이적으로 결합되는 적어도 하나의 에피토프 및 서열번호 144과 같은 QBEND10에 의하여 특이적으로 결합되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하고, 그리고 세포들을 분류하기 위하여 사용되는 mAb는 QBEND10이고 세포를 고갈하기(deplete) 위하여 사용되는 mAb는 리툭시맙이다.
면역 세포들의 조작 방법들
본 발명자들은 확대/증폭시키기 위하여 그리고 세포 표면 타겟 항원을 촉발시키기 위하여 필요한 모든 요소들로, 키메라 항원 수용체 (CAR), 바람직하게는 전술한 대로의 CAR를 발현시키는 면역 세포을 조작하는 방법들을 개발하였다. 아울러, 이 CAR는 키메라 scFv를 지니는 독특함을 가지며, 이때 scFv는 세포 분류 및/또는 세포 고갈(depletion) 목적을 위하여 항체에 의하여 특이적으로 인식될 수 있는 에피토프를 포함하도록 변형된다.
한 예에서, 에피토프-특이적 mAb에 의하여 결합되는 하나의 mAb-특이적 에피토프 및 적어도 세포 표면 마커 항원에 특이적인 VH 체인 및 VL 체인에 의하여 형성되는 scFv을 포함하는 적어도 하나의 세포외 결합 도메인을 포함하는, 면역 세포 키메라 항원 수용체 (CAR)를 조작하는 방법은 :
(a) 면역 세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 키메라 항원 수용체를 코드하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포 내로 도입시키는 단계.
(c) 상기 세포 내로 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계
를 포함한다.
한 예에서, 바람직하게는 에피토프-특이적 mAb에 의하여 결합되는 하나의 mAb-특이적 에피토프 및 적어도 세포 표면 마커 항원에 특이적인 VH 체인 및 VL 체인에 의하여 형성되는 scFv를 포함하는 적어도 하나의 세포외 결합 도메인을 포함하는, 전술한 대로의 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현시키는 면역 세포의 조작 방법은 :
(a) 면역 세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 키메라 항원 수용체를 코드하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포 내로 도입시키는 단계; 및
(c) 상기 세포 내로 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계.
를 포함한다.
그것들을 포함하는 CAR들 및 면역 세포들은 널리 개시되어 왔으며 알려진 방법들에 따라 당업자에 의하여 제조될 수 있다. 예를 들어, CAR 및 이러한 CAR들을 포함하는 세포들을 제조하기 위한 방법론들들이 앞서 개시된다. CAR를 포함하는 면역 세포들은 상기 언급된 참고문헌들에 개시된 방법론들에 따라 당업자에 의하여 제조될 수 있다. 바람직한 예에서, CAR를 포함하는 면역 세포들은 WO2013/176915에 개시된 방법론들에 따라 당업자에 의하여 제조될 수 있다.
몇몇 예들에서, 면역 세포는 염증성 T-림프구, 세포독성 T-림프구, 조절성 T- 림프구, 또는 헬퍼 T-림프구로부터 유래될 수 있다.
몇몇 예들에서, 면역 세포는 건강한 기증자로부터 수득된다. 몇몇 예들에서, 면역 세포는 환자로부터 수득된다.
몇몇 예들에서, 본 발명의 세포를 조작하는 방법은 하나 이상의 추가적인 게놈 변형 단계를 더 포함한다. 추가적인 게놈 변형 단계에 의하여, 관심있는 하나 이상의 단백질의 조작을 위하여 세포들 내로의 도입이 의도될 수 있다. 상기 관심있는 단백질은 CAR일 수 있다.
몇몇 예들에서, 본 발명의 T-세포들을 조작하는 방법은 :
(a) 적어도
- 면역억제제에 대한 타겟을 발현시키는 첫 번째 유전자, 및
- T-세포 수용체 (TCR)의 요소를 코드하는 두 번째 유전자를
불활성화시킴으로써 T-세포들을 변형시키는 단계
(b) 선택적으로 상기 면역억제제의 존재 하 상기 세포들을 확대시키는 단계
를 포함할 수 있다.
면역억제제는 작용의 몇몇 메커니즘들 중 하나에 의하여 면역 기능을 억제하는 제제이다. 다시 말해서, 면역억제제는 면역 반응의 정도 및/또는 집착(voracity)을 약화시키는 능력에 의하여 보여지는 화합물에 의하여 수행되는 역할이다. 제한되지 않는 예로서, 면역억제제는 칼시뉴린 억제제, 라파마이신의 타겟, 인터루킨-2 u-체인 차단제(blocker), 이노신 모노포스페이트 디하이드로게나제의 억제제, 디하이드로 엽산 리덕타제의 억제제, 코르티코스테로이드 또는 면역억제 대사길항물질일 수 있다.
특정 예에서, 방법의 유전적 변형 단계는 CD52, GR, TCR 알파 및 TCR 베타로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나의 유전자의 불활성화에 의존한다. 또다른 예에서, 방법의 유전적 변형 단계는 CD52 및 GR, CD52 및 TCR 알파, CDR52 및 TCR 베타, GR 및 TCR 알파, GR 및 TCR 베타, TCR 알파 및 TCR 베타로 구성되는 군으로부터 선택되는 두 개의 유전자들의 불활성화에 의존한다. 또다른 예에서, 방법의 유전적 변형 단계는 둘보다 많은 유전자들의 불활성화에 의존한다. 유전적 변형은 바람직하게는 생체외에서 작동된다.
T-세포들에서 유전자들을 불활성화시키기 위하여 사용되는 희귀(rare)-절단(cutting) 엔도뉴클레아제들(endonucleases)은 바람직하게는 전사 활성인자 유사 효과기 (TALE)이나, 각각 WO 2013/176915 및 WO 2014/191128에 기재된 RNA 가이드에 커플링된 Cas9일 수도 있다.
전달 방법들
상기 기재된 다른 방법들은 세포의 표면에서 CAR를 발현시키는 단계를 포함한다. 제한되지 않는 예로서, 상기 CAR는 세포 내로 후자를 도입함으로써 발현될 수 있다. CAR들은 하나의 플라스미드 벡터에 의하여 코드되는 이식유전자로서 도입될 수 있다. 상기 플라스미드 벡터는 또한 상기 벡터를 받는 세포들의 확인 및/또는 선택을 위하여 제공하는 선택 마커를 포함할 수 있다.
폴리펩타이드들은 세포 내로 상기 폴리펩타이드들을 코드하는 폴리뉴클레오타이드들의 도입의 결과로서 세포에서 인 시추(in situ)로 합성될 수 있다. 대체하여, 상기 폴리펩타이드들은 세포 밖에서 생산되고 그 다음에 거기로 도입될 수 있었다. 세포들 내로 폴리뉴클레오타이드 구조체를 도입하는 방법들은 업계에 알려져 있으며, 제한되지 않는 예들로, 폴리뉴클레오타이드 구조체가 세포의 게놈 내로 통합되는 안정적인 형질전환(transformation) 방법들, 폴리뉴클레오타이드 구조체가 세포 게놈 내로 통합되지 않는 일시적인 형질전환 방법들 및 바이러스 매개 방법들을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드들은 예를 들어, 재조합 바이러스 벡터들 (예컨대 레트로바이러스들, 아데노바이러스들), 리포좀(liposome) 등에 의하여 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 일시적 형질전환 방법들은 미세주입, 전기천공법 또는 입자 충격(particle bombardment)을 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드들은 벡터들, 더욱 특히 세포들에서 발현되는 관점에서 플라스미드들 또는 바이러스 내 포함될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드들 및 벡터들
한 예에서, 본 발명에 따른 상기 단리된 세포는 키메라 scFv를 지닌 키메라 항원 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 전술된 CAR를 코드하는 벡터들, 폴리뉴클레오타이드들에 대한 것이다.
폴리뉴클레오타이드는 발현 카세트(cassette) 또는 발현 벡터에서 구성될 수 있다 (예컨대 박테리아 숙주 세포 내로 도입을 위한 플라스미드, 또는 곤충 숙주 세포의 형질주입을 위한 바큘로바이러스(baculovirus) 벡터와 같은 바이러스 벡터, 또는 포유류 숙주 세포의 형질주입을 위한 렌티바이러스와 같은 바이러스 벡터 또는 플라스미드).
당엄자는 유전 암호의 축퇴의 관점에서 상당한 서열 변화가 이들 폴리뉴클레오타이드 분자들 중에서 가능하다는 것을 인식할 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 핵산 서열들은 포유류 세포들에서의 발현에, 바람직하게는 인간 세포들에서의 발현에 코돈-최적화된다. 코돈-최적화는, 교환된 코돈들로서 아미노산들을 코드하는 이러한 코돈들, 이러한 종들의 고발현된 유전자들에서 일반적으로 빈번한 코돈들에 의하여 주어지는 종들의 고발현된 유전자들에서 보통 희귀한 관심있는 코돈들의 서열에서의 교환을 가리킨다.
치료적 적용들
또다른 예에서, 전술한 대로 상기 단리된 세포로부터 유래되는 세포주 또는 다른 방법들에 의하여 수득되는 여기에 기재된 대로의 CAR를 발현시키는 단리된 세포 또는 면역 세포는 의약으로서 사용될 수 있다.
또다른 예에서, 상기 의약은 그것을 필요로 하는 환자에서 암과 같은 병적 측면들을 치료하기 위하여 사용될 수 있다.
또다른 예에서, 상기 단리된 세포로부터 유래된 세포주 또는 본 발명에 따른 여기 1 기재된 대로의 CAR를 발현시키는 상기 단리된 세포 또는 면역 세포는 그것을 필요로 하는 환자에게서 암과 같은 병적 측면의 치료를 위한 의약의 제조에서 사용될 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 그것을 필요로 하는 환자들을 치료하는 방법들에 의존하며, 상기 방법은 하기 단계들 중 적어도 하나를 포함한다:
(a) 전술한 방법들 중 임의의 하나에 의하여 수득가능한 면역-세포를 제공하는 단계;
(b) 상기 환자에게 상기 형질전환된 면역 세포들을 투여하는 단계,
한 예에서, 상기 면역 세포, 바람직하게는 본 발명의 T 세포들은 활발한(robust) 인 비보에서 T 세포 확장을 겪을 수 있고, 연장된 시간 동안 계속할 수 있다.
상기 치료는 개선, 치유 또는 예방일 수 있다. 그것은 자가 면역요법의 일부 또는 동종이계(allogenic) 면역요법 치료의 일부일 수 있다. 자가에 의하여, 환자들을 치료하는데 사용되는 세포들, 세포주 또는 세포들의 군집이 상기 환자로부터 또는 인간(Human) 백혈구(Leucocyte) 항원(Antigen) (HLA) 양립성(compatible) 기증자로부터 유래된다는 것이 의미된다. 동종이계에 의하여, 환자들을 치료하는데 사용되는 세포들, 또는 세포들의 군집이 상기 환자가 아닌 기증자로부터 유래된다는 것이 의미된다.
상기 치료는 암, 바이러스 감염, 자가면역 장애들 또는 이식편대숙주 질병 (GvHD)으로 진단된 환자들을 치료하는데 사용될 수 있다. 치료될 수 있는 암들은 혈관이 발달된 종양들과 더불어, 혈관이 발달되지 않거나 또는 혈관이 아직 많이 발달되지 않은 종양들을 포함한다. 암들은 (혈액 종양들, 예컨대, 백혈병들 및 림프종들과 같은) 비(non) 고형 종양들을 포함할 수 있고 또는 고형 종양들을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR로 치료되는 타입들의 암들은 암종(carcinoma), 아세포종(blastoma), 및 육종(sarcoma), 및 특정 백혈병 또는 림프구성 악성종양들, 양성 및 악성 종양들, 및 예컨대 육종들, 암종들 및 흑색종들인 악성종양들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 성인 종양들/암들 및 소아 종양들/암들 또한 포함된다.
그것은 항체들 치료, 화학요법, 사이토카인들 치료, 수지상 세포 치료, 유전자 치료, 호르몬 치료, 레이저 광 치료 및 방사선 요법의 군으로부터 선택되는 암에 대항한 하나 이상의 치료들과 조합된 치료일 수 있다.
본 발명에 따른 세포들 또는 세포들의 군집의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 섭취, 투입(transfusion), 임플란트(implantation) 또는 이식(transplantation)을 포함하는, 임의의 편리한(convenient) 방식으로 수행될 수 있다. 여기에서 기재된 조성물들은 환자에게 피하로, 피내로, 종양내로, 절내로(intranodally), 척수내로(intramedullary), 근육내로, 정맥 또는 림프절(intralymphatic) 주사에 의하여, 또는 복강내로 환자에게 투여될 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 바람직하게는 정맥 주사에 의하여 투여된다.
세포들 또는 세포들의 군집의 투여는 kg 체중 당 104-109 세포들, 바람직하게는 그 범위 내 세포 수들의 모든 정수 값들을 포함하는 105 내지 106 세포들/kg 체중의 투여로 구성될 수 있다. 세포들 또는 세포들의 군집은 하나 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 상기 효과적인 양의 세포들은 일회량(single dose)으로 투여된다. 또다른 예에서, 상기 효과적인 양의 세포들은 일정 시간의 기간 동안 한 복용량보다 많이 투여된다. 투여 타이밍은 담당 의사의 판단 내이며, 환자의 임상적 상태에 의존한다. 세포들 또는 세포들의 군집은 혈액 은행 또는 기증자와 같은, 임의의 소스로부터 수득될 수 있다. 개인의 필요들이 다른 반면, 당업계의 기술 내에서 특정 질병 또는 질환들에 대한 정해진 세포 타입의 효과적인 양의 최적 범위의 결정. 효과적인 양은 치료적 또는 예방적(prophylactic) 이점을 제공하는 양을 의미한다. 투여되는 복용량은 받는 사람(recipient)의 연령, 건강 및 무게, 함께 이루어지는 치료의 종류, 만약 있다면, 치료의 빈도 및 바람직한 효과의 특성에 의존할 것이다.
또다른 예에서, 상기 효과적인 양의 세포들 또는 그 세포들을 포함하는 조성물은 비경구로 투여된다. 상기 투여는 정맥 투여일 수 있다. 상기 투여는 종양 내로 주사에 의하여 직접적으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 특정 예들에서, 세포들은 항바이러스 치료, 시도포비르 및 인터루킨-2와 같은 제제들로 하는 치료, MS 환자들을 위한 나탈리지맙(nataliziimab) 또는 시트라빈 (ARA-C로도 알려짐) 치료 또는 건선 환자들을 위한 에팔리즈티맙(efaliztimab) 치료 또는 PML 환자들을 위한 다른 치료들을 포함하나 이에 제한되지 않는 많은 관련 치료 양식들과 함께 (예컨대, 그 전, 동시에 또는 그 후) 환자에게 투여된다. 추가의 예들에서, 본 발명의 T 세포들은 화학요법, 방사선(radiation), 면역억제 제제들, 예를 들어 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉사트, 마이코페놀레이트(mycophenolate), 및 FK506, 항체들, 또는 다른 면역제거 제제들(immunoablative agents) 예를 들어 CAMPATH, 항-CD3 항체들 또는 다른 항체 요법들, 사이톡신, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신(rapamycin), 마이코프리에놀산(mycoplienolic acid), 스테로이드들, FR901228, 사이토카인들, 및 방사선요법(irradiation)과 조합하여 사용될 수 있다. 이들 약물들은 칼슘 의존적 포스파타제 칼시뉴린 (사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 또는 성장인자 유도된 신호전달에 중요한 p70S6 키나제 (라파마이신)을 억제한다 (Henderson, Naya et al. 1991, Immunology 73(3):316-21; Liu, Albers et al. 1992, 31(16):3896-901; Bierer, Hollander et al. 1993, Curr Opin Immunol 5(5):763-73). 추가의 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 플루다라빈과 같은 화학요법 제제들, 외부-빔 방사 요법(XRT), 사이클로포스파미드, 또는 CAMPATH 또는 OKT3와 같은 항체들을 이용한 T 세포 제거 요법, 골수 이식과 함께 (예컨대, 그 전, 동시에 또는 그 후) 환자에 투여된다. 또다른 예에서, 본 발명의 세포 조성물들은 CD20와 반응하는 제제들과 같은, 예컨대, Rituxan, B-세포 제거 요법 후 투여된다. 예를 들어, 한 예에서, 대상은 고용량 화학요법으로 표준 치료를 겪을 수 있고 뒤이어 말초혈액 줄기 세포 이식이 이어진다. 특정 예들에서, 이식 후, 대상은 본 발명의 확장된 면역 세포들의 주입을 받는다. 추가적인 예에서, 확장된 세포들은 수술 전 또는 후에 투여된다.
다른 정의들
- 폴리펩타이드 서열에서 아미노산 잔기들은 한-문자 코드에 따라 여기에 지시되며(designated), 여기에서 예를 들어, Q는 Gln 또는 글루타민(Glutamine) 잔기를 의미하고, R은 Arg 또는 알기닌(Arginine) 잔기를 의미하고 그리고 D는 Asp 또는 아스파르트산(Aspartic acid) 잔기를 의미한다.
- 뉴클레오타이드들은 하기와 같이 지시된다: 일-문자 코드가 뉴클레오사이드의 염기를 지시하는데 사용된다: a는 아데닌, t는 티민, c는 사이토신 그리고 g는 구아닌이다. 축퇴된(degenerated) 뉴클레오타이드들에 대하여, r은 g 또는 a (퓨린 뉴클레오타이드들)을 나타내고, k는 g 또는 t를 나타내고, s는 g 또는 c를 나타내고, w는 a 또는 t를 나타내고, m은 a 또는 c를 나타내고, y는 t 또는 c (피리미딘 뉴클레오타이드들)를 나타내고, d는 g, a 또는 t를 나타내고, v는 g, a 또는 c를 나타내고, b는 g, t 또는 c를 나타내고, h는 a, t 또는 c를 나타내고, 그리고 n은 g, a, t 또는 c를 나타낸다.
- 여기에서 사용된 대로, "핵산" 또는 "폴리뉴클레오타이드들"은 디옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 올리고뉴클레오타이드들, 폴리메라제 체인 반응 (PCR)에 의하여 만들어지는 단편들, 라이게이션, 분리(scission), 엔도뉴클레아제 작용, 및 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의하여 만들어진 단편들과 같은, 뉴클레오타이드들 및/또는 폴리뉴클레오타이드들을 가리킨다. 핵산 분자들은 (DNA 및 RNA와 같은) 자연적으로-발생하는 뉴클레오타이드들, 또는 자연적으로-발생하는 뉴클레오타이드들의 아나로그들(analogs) (예컨대, 자연적으로-발생하는 뉴클레오타이드들의 거울상이성질체 형태들), 또는 그 둘의 조합인 모노머들로 이루어질 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드들은 당 모이어티들 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티들에서 변형을 가질 수 있다. 당 변형들은 예를 들어, 하나 이상의 하이드록실기들의 할로겐들, 알킬기들, 아민들, 및 아지도(azido) 기들로의 대체를 포함하고, 또는 당들은 에테르 또는 에스터들로 기능화될(functionalized) 수 있다. 게다가, 전체 당 모이어티는 아자(aza)-당들 및 카르보사이클릭(carbocyclic) 당 아나로그들과 같은, 입체구조적으로 그리고 전자적으로(electronically) 유사한 구조들로 대체될 수 있다. 염기 모이어티에서의 변형들의 예들은 알킬화된 퓨린들 및 피리미딘들, 아실화된(acylated) 퓨린들 또는 피리미딘들, 또는 다른 잘 알려진 헤테로사이클릭 치환들을 포함한다. 핵산 모노머들은 포스포다이에스터 연결들 또는 이러한 연결들의 아나로그들에 의하여 연결될 수 있다. 핵산들은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
- 키메라 항원 수용체 (CAR)에 의하여 특이적 항-타겟 세포 면역 활성을 보이는 키메라 단백질을 만들어내기 위하여 타겟 세포 상 존재하는(present) 요소에 대항한 결합 도메인, 예컨대 바람직한 항원 (예컨대 종양 항원)에 대한 항체-기반의 특이성을 T 세포 수용체-활성화시키는 세포내 도메인과 조합하는 분자들이 의도된다. 일반적으로, CAR는 T 세포 항원 수용체 복합체 제타 체인 (scFv:ζ)의 세포내 신호전달(signaling) 도메인에 융합되는 세포외 단일 체인 항체 (scFv)로 구성되고, T 세포들에서 발현될 때, 단일클론 항체의 특이성에 기초한 항원 인식을 방향전환하는 능력을 갖는다.
- "전달 벡터" 또는 "전달 벡터들"에 의하여 본 발명에서 필요로 하는, 제제들/화학물질들 및 분자들 (단백질들 또는 핵산들)을 세포 접촉 내로 넣기 위하여 (즉, "접촉하는") 또는 세포들 또는 세포이하(subcellular) 구획들(compartments) (즉, "도입하는") 내로 전달하기 위하여 본 발명에서 사용될 수 있는 임의의 전달 벡터가 의도된다. 그것은 리포좀 전달 벡터들, 바이러스 전달 벡터들, 약물 전달 벡터들, 화학적 담체들, 폴리머 담체들, 리포플렉스들(lipoplexes), 폴리플렉스들(polyplexes), 덴드리머들, 마이크로버블들 (초음파 조영제들), 나노입자들, 에멀젼들 또는 다른 적당한 이동(transfer) 벡터들을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 전달 벡터들은 분자들, 화학물질들, 거대분자들 (유전자들, 단백질들), Diatos에 의하여 개발된 펩타이드들, 플라스미드들과 같은 다른 벡터들의 전달을 가능하게 한다. 이들 경우들에서, 전달 벡터들은 분자 담체들이다. "전달 벡터" 또는 "전달 벡터들"에 의하여, 형질주입을 수행하는 전달 방법들이 또한 의도된다.
- 용어들 "벡터" 또는 "벡터들"은 그것이 연결된 또다른 핵산을 이동시킬 수 있는 핵산 분자를 가리킨다. 본 발명에서 "벡터"는 염색체, 비(non) 염색체, 반-합성 또는 합성 핵산들로 구성될 수 있는 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자, 바이러스 벡터, 플라스미드, RNA 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직한 벡터들은 그것들이 연결되는 핵산들의 발현 (발현 벡터들) 및/또는 자율적인(autonomous) 복제 (에피솜 벡터)가 가능한 것들이다. 많은 수의 적당한 벡터들이 당업자들에게 알려져 있고 상업적으로 이용가능하다.
바이러스 벡터들은 레트로바이러스, 아데노바이러스, 파보바이러스 (예컨대 아데노관련 바이러스들), 코로나바이러스, 음성 가닥 RNA 바이러스들 예를 들어 오르소믹소바이러스(orthomyxovirus) (예컨대, 인플루엔자 바이러스), 랍도바이러스(rhabdovirus) (예컨대, 광견병 및 수포성 구내염(vesicular stomatitis) 바이러스), 파라믹소바이러스(paramyxovirus) (예컨대 홍역 및 센다이), 양성 가닥 RNA 바이러스들 예를 들어 피코르나바이러스 및 알파바이러스(alphavirus), 및 아데노바이러스, 헤르페스바이러스 (예컨대, 헤르페스 심플렉스(Herpes Simplex) 바이러스 타입들 1 및 2, 엡스타인(Epstein)-바(Barr) 바이러스, 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus)), 및 폭스바이러스(poxvirus) (예컨대, 박시니아(vaccinia), 계두(fowlpox) 및 카나리아폭스(canarypox))를 포함하는 이중-가닥 DNA 바이러스들을 포함한다. 다른 바이러스들은 예를 들어 노워크(Norwalk) 바이러스, 토가바이러스(togavirus), 플라비바이러스(flavivirus), 레오바이러스들(reoviruses), 파포바바이러스(papovavirus), 헤파드나바이러스(hepadnavirus), 및 간염 바이러스를 포함한다. 레트로바이러스들의 예들은 하기를 포함한다: 새의 백혈증 육종(avian leukosis-sarcoma), 포유류 C-타입, B-타입 바이러스들, D 타입 바이러스들, HTLV-BLV 그룹, 렌티바이러스, 스푸마바이러스(spumavirus) (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996).
- "렌티바이러스 벡터"에 의하여 그것들의 상대적으로 큰 포장 용량, 감소된 면역원성 및 넓은 범위의 다른 세포 타입들에 높은 효율로 안정적으로 형질도입시킬 수 있는 그것들의 능력 때문에 유전자 전달을 위한 매우 유망한 HIV-기반의 렌티바이러스 벡터들이 의미된다. 렌티바이러스 벡터들은 생산자 세포들 내로 셋 (포장, 봉투(envelope) 및 이동) 또는 그보다 많은 플라스미드들의 일시적 형질주입(transfection) 후 보통 만들어진다. HIV처럼, 렌티바이러스 벡터들은 세포 표면 상 수용체들과 바이러스 표면 당단백질들의 상호작용을 통하여 타겟 세포에 들어간다. 들어가면, 바이러스 RNA는 바이러스 역전사효소 복합체에 의하여 매개되는, 역전사를 겪는다. 역전사 산물은 감염된 세포들의 DNA에 바이러스 통합의 기질인, 이중가닥 선형 바이러스 DNA이다. "통합하는(integrative) 렌티바이러스 벡터들 (또는 LV)"에 의하여, 제한되지 않는 예로서, 타겟 세포의 게놈에 통합될 수 있는 이러한 벡터들이 의미된다. "통합하지 않는(non-integrative) 렌티바이러스 벡터들 (또는 NILV)"에 의하여 반대로 바이러스 인테그라제(integrase)의 작용을 통한 타겟 세포의 게놈에 통합되지 않는 효율적인(efficient) 유전자 전달 벡터들이 의미된다.
- 전달 벡터들 및 벡터들은 초음파천공(sonoporation) 또는 전기천공 또는 이들 기술들의 유도체들과 같은 임의의 세포 투과화 기술들(permeabilization techniques)과 조합 또는 관련될 수 있다.
- "돌연변이"에 의하여 폴리뉴클레오타이드 (cDNA, 유전자) 또는 폴리펩타이드 서열에서 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 스물, 스물다섯, 서른, 마흔, 쉰, 또는 그보다 많은 뉴클레오타이드들/아미노산들의 치환, 결실, 삽입이 의도된다. 돌연변이는 유전자의 코딩(coding) 서열 또는 그것의 조절 서열에 영향을 미칠 수 있다. 그것은 또한 코드되는 mRNA의 구조/안정성 또는 게놈 서열의 구조체에 영향을 미칠 수 있다.
- "기능적 변종"에 의하여 단백질 또는 단백질 도메인의 촉매적으로 활성인 돌연변이체가 의도된다; 이러한 돌연변이체는 그것의 부모 단백질 또는 단백질 도메인에 비하여 동일한 활성 또는 추가적인 특성들, 또는 더 높은 또는 더 낮은 활성을 가질 수 있다.
- "동일성"은 두 핵산 분자들 또는 폴리펩타이드들 사이의 서열 동일성(identity)이 가리킨다. 동일성은 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각 서열에서의 위치의 비교에 의하여 결정될 수 있다. 비교되는 서열에서의 위치가 동일 염기에 의하여 차지될 때, 그러면 분자들은 그 위치에서 동일하다. 핵산 또는 아미노산 서열들 사이에서 유사도(similarity) 또는 동일성(identity)의 정도는 핵산 서열들에 의하여 공유되는 위치들에서 동일하거나 또는 매칭되는 뉴클레오타이드들의 수의 함수(function)이다. 여러가지 정렬 알고리즘들 및/또는 프로그램들이 두 서열들 사이의 동일성을 계산하는데 사용될 수 있고, GCG 서열 분석 패키지의 부분으로서 이용가능한 BLAST 또는 FASTA를 포함하고 (University of Wisconsin, Madison, Wis.), 에컨대, 디폴트 세팅으로 사용될 수 있다. 예컨대, 여기에 기재된 특정 폴리펩타이드들에 적어도 70%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일성을 갖고 바람직하게는 이러한 폴리펩타이드들를 코드하는 폴리뉴클레오타이드와 더불어, 대체로 동일한 기능들을 보여주는 폴리펩타이드들이 고려된다.
- 여기에서 사용된 대로 용어 "대상" 또는 "환자"는 인간이 아닌 영장류들 및 인간들을 포함하는 동물계의 모든 멤버들을 포함한다. 몇몇 예들에서, 환자는 인간이다.
앞의 특징들에 추가하여, 본 발명은 첨부된 도면들과 더불어, 면역치료를 위한 CAR를 발현시키는 면역 세포들을 시험관 내에서 분류 또는 생체내에서 고갈하는(depleting) 방법을 설명하는 하기 실시예들로부터 나오는 특징들을 더 포함한다.
실시예 1.항-CD123 CAR에 내장된 리툭시맙-주도된 고갈(depletion) 시스템들의 발생
키메라 scFv (CD20 미모토프(mimotope)(들)과 항-CD123 scFv)의 면에서 다른 형태들을 갖는 모든 10 개의 CAR들이 도 4에 표시된다: 그것들의 그 결과인 폴리펩타이드 서열들은 서열번호 1 내지 10에 보여진다.
10개 CAR들의 DNA 구조체는 시험관내 전사를 통하여 그것들의 대응하는 mRNA로 전사되고(transcribed) 표준 피콜(ficoll) 절차를 통하여 버피 코트로부터 갓 단리된 일차(primary) T 세포들의 전기천공에 의하여 형질주입하는데 사용된다. 형질주입 하루 후, T 세포들이 회수되었고 하기 기재된 대로 유동(flow) 기반의 세포독성 분석을 수행하는데 사용되었다.
항 CD123 CAR T 세포들의 발생
항-CD123 CAR를 발현시키는 일차(primary) T 세포들을 만들기 위하여, 일차(primary) T 세포들은 먼저 버피-코트 샘플들로부터 정제되고 Dynabeads 인간 T 활성인자 CD3/CD28를 이용하여 활성화된다. 활성화 3일 후, 백만 개의 활성화된 T 세포들이 1의 감염다중도(multiplicity of infection) (MOI)에서, Ef1α 프로모터의 통제 하 항-CD123 CAR 발현 카세트를 갖는 렌티바이러스 벡터들로 형질도입된다. T 세포들은 추가의 특성화를 위하여 X-vivo-15 배지 (Lonza)에서 5% CO2, 20 ng/ml IL-2 (최종 농도) 및 5% 인간 AB 혈청의 존재에서 37 ℃에서 배양물 내 유지된다. 형질도입(transduction) 5 일 후, 세포들은 유동-기반의 세포독성 분석(flow-based cytotoxicity assay)을 수행하기 위하여 사용된다.
유동(Flow)-기반의 세포독성 분석
항-CD123 CAR T 세포의 세포용해 활성 및 특이성은 일상적으로 수행되듯이 유동세포 분석법-기반의 세포독성 분석에 따라 평가된다 (예컨대 Valton.et Al (2015) Mol Ther; 23(9):1507-1518 참조). 이 분석은 104 CD123 양성 종양 세포들 및 104 CD123-음성 대조군 세포들을 0.5mM CellTraceTM CFSE 및 0.5mM CellTraceTM 바이올렛 (Life Technology)으로 표지하는 단계 및 5 시간 동안 37 ℃에서 최종 부피 100 μl의 X-Vivo-15에서 그것들을 105 효과기 CAR T 세포들 (10:1의 E/T 비율)로 공-배양하는 단계로 구성된다. 세포들은 그 다음에 회수되고 전술한 바와 같이 4% PFA에 의하여 고정되기 전에 eFluor780 생존능력 마커로 표지된다. 고정된 세포들은 그 다음에 그것들의 생존능력을 결정하기 위하여 유동세포 분석법에 의하여 분석된다. 특이적 세포 용해(lysis)의 빈도가 계산되고 하기에 나타내어진다:
특이적 세포 용해의 빈도 = (T와 Via CD123+세포들 / T와 CD123-세포들) / (Via CD123+세포들 / Via CD123-세포들)
이때 T와 Via CD123+ 및 T와 Via CD123-는 각각 CAR T 세포들의 존재 하 5 시간 후 수득된 생존가능한 CD123+ 세포들 및 CD123- 세포들의 %에 대응하고 이때 Via CD123+ 세포들 및 Via CD123- 세포들은 각각 CAR T 세포들의 부존재 하 5 시간 후 수득된 CD123+ 세포들 및 CD123- 세포들의 %에 대응한다.
그 결과들은 조작된 항-CD123 CAR로 형질주입된(transfected) T 세포들이 CD123-양성 종양 세포 모델들을 죽일 수 있다는 것을 보여준다. 도 5에 나타난 대로, 전술한 유동(flow)-기반의 세포독성 분석으로부터의 결과들은 서열번호 1-4을 발현시키는 T 세포들이 변형되지 않은 항-CD123 CAR 서열번호 142을 발현시키는 T 세포들보다 동일한 활성을 보인다는 것을 보여주었다 (도 5). 이들 데이터들은 항-CD123 CAR (서열번호 142)의 서열에서 CD20 미모토프(mimotope)의 삽입이 CD123 항원을 특이적으로 인식하고 CD123-발현시키는 종양 세포들을 죽이기 위하여 그것의 능력을 상당히 손상시키지 않는다는 것을 제안한다. 몇몇 예들에서, 바람직하게는 서열번호 35의, 두 mAb-특이적 에피토프 중 하나를 포함하는 본 발명의 CAR들은 CAR에 의하여 타겟되는 항원을 특이적으로 인식하고 상기 항원을 발현시키는 세포들을 죽일 수 있다.
이들 발견들과 일치하여 형질주입된 CAR T 세포들은 96 웰 플레이트 상에 코팅된 CD123 재조합 단백질에 노출될 때 탈과립화시키는 그것들의 능력에 대하여 테스트된다. 함께, 우리 시험들은 항-CD123 CAR의 서열에서 CD20 미모토프(mimotope)의 삽입은 CD123 항원을 특이적으로 인식하는 그것의 능력을 크게(significantly) 손상시키지 않는다는 것을 보여주도록 설계된다.
CD20 미모토프들(mimotopes)의 특이적 인식을 통하여 T 세포 세포독성 기능들을 억제하는 리툭시맙의 능력을 입증하기 위하여, 리툭시맙 및 아기 토끼-보체의 존재 또는 부존재 하, CD123-양성 종양 세포들의 존재 하 형질주입된 T 세포들이 배양된다. 그 목적은 형질주입된 T 세포들의 세포독성 활성 및 탈과립화 능력이 리툭시맙 및 아기 토끼-보체의 존재 하 손상되는 것을 보여주어, 리툭시맙에 의하여 조작된 항-CD123 CAR의 효율적인 인식이 T 세포 고갈(depletion)을 이끈다는 것을 추가로 가리키는 것이다.
실시예 2. 항-CD123 키메라 항원 수용체에서 mAb-주도된 고갈(depletion) 시스템들의 플렉서빌리티
mAb-주도된 고갈(depletion) 시스템의 플렉서빌리티(flexibility)를 추가로 입증하기 위해 세툭시맙(cetuximab), 팔리비주맙(palivizumab) 및 니볼루맙(nivolumab) mAbs에 특이적인 상이한 에피토프들 또는 미모토프들(mimotopes) (서열번호 35-42)가 실시예 1에 기재된 CD20 미모토프(mimotope)에 사용된 것으로서 동일한 절차 및 아키텍쳐 를 이용하여 항-CD123 CAR 구축들 내로 삽입된다. 그 결과들은 형질주입된 T 세포들이 CD123 양성 종양 세포들을 향한 그것들의 세포용해 활성 및 탈과립화 능력을 보유한다는 것을 보여주는 것을 목적으로 한다. 게다가, 실험들은 또한 형질주입된 T 세포들이 전술한 mAb들 중 일부에 의하여 고갈되는(depleted) 것을 가리키도록 설계된다.
실시예 3. mAb-주도된 고갈(depletion) 시스템을 포함하는 항-CD123 CAR의 리툭시맙-의존적 고갈(depletion)
항-CD123 CAR T 세포들의 고갈(depletion)을 가능하게 하기 위하여 mAb-주도된 고갈(depletion) 시스템의 능력을 탐구하기 위하여, 변형되지 않은 항-CD123 CAR (서열번호 142) 또는 서열번호 1, 2, 3 또는 4의 CAR를 발현시키는 형질도입된 T 세포는 보체(complement) 의존적(dependant) 세포독성 분석(assay) (CDC)에 적용되었다.
CDC 분석
CDC 분석은 최종 부피 400 μL의 Xvivo 10% FBS에서 37 ℃에서 3 시간 동안 리툭시맙 (RTX, ROCHE, 400 ng) 및 아기 토끼 보체 (BRC, AbD Serotec, ref# C12CA, 제조업자의 프로토콜에 따른 희석 용액의 100 μL)의 존재 하 또는 단독으로 0.2 106 형질도입된 T 세포들을 배양하는 단계로 이루어진다. 배양 마지막에 항 CD123-CAR T 세포들이 회수되었고 PE 표지된 항-FC 이차 단일클론 항체 (Jackson ImmunoResearch, ref# 115-115-164, diluted 1/200) 및 FC 단편 (서열번호 143)에 융합되는 재조합 CD123 단백질로 표지되었다. 세포들은 그 다음에 유동세포 분석법에 의하여 분석되기 전에 PFA 4%에서 회수되었다. 유동세포 분석법 게이팅(gating) 전략은 총 세포들의 군집들에서 발견되는 싱글릿(singlet) 중 항-CD123 CAR 양성 T 세포들 (PE 양성 세포들)의 생존능력을 결정하는 단계로 이루어진다. 이 분석은 RTX 및 BRC의 존재 하 및 단독으로 배양되는 세포들 상에서 수행되었다. 결과들은 하기와 같이 기재되는 "(대조 실험과 관련하여) 항-CD123 CAR 양성 T 세포들 중 생존가능한 세포들의 상대적 빈도"로 명명된 비율로서 표현된다:
(RTX 및 BRC의 존재 하 수득되는 항-CD123 CAR 양성 T 세포들 중 생존가능한 세포들의 빈도) x 100 / (RTX 및 BRC의 부존재 하 수득되는 항-CD123 CAR 양성 T 세포들 중 생존가능한 세포들의 빈도)
그 결과들은 모든 CAR 아키텍쳐들이 CAR T 세포들의 RTX-의존적 고갈(depletion)을 가능하게 하였다는 것을 보여주었다 (도 6). 서열번호 3 및 4를 발현시키는 CAR T 세포들은 서열번호 1 및 2를 발현시키는 것들보다 더 효율적으로 고갈되었는데(depleted), 이는 CAR 아키텍쳐에서 존재하는 CD20 미모토프(mimotope)의 수가 T 세포들 고갈(depletion)의 정도 및/또는 동력학(kinetic)에 영향을 미쳤다는 것을 제안한다.
몇몇 예들에서, 도 4에 나타내어진 아키텍쳐들을 갖는 본 발명의 CAR들은 CAR T 세포들의 리툭시맙 의존적 고갈(depletion)을 가능하게 한다. 몇몇 예들에서, 바람직하게는 서열번호 3 또는 4의 CAR 아키텍쳐를 갖는, 적어도 2 mAb-특이적 에피토프들을 포함하는, 본 발명의 CAR는 특히 효율적으로 고갈된다(depleted).
실시예 4. 세포외 도메인에서 하나 이상의 mAb들 특이적 에피토프들을 포함하는 항-BCMA CAR를 발현시키는 세포들에서 mAb-주도된 고갈(depletion) 시스템의 효율.
항-BCMA CAR T 세포들의 고갈(depletion)을 가능하게 하기 위하여 mAb-주도된 고갈(depletion) 시스템의 능력을 탐구하기 위하여, 15 개의 다른 CAR 아키텍쳐들 (서열번호 125-139, 도 7)이 구축되었다. 이들 아키텍쳐들은 항-BCMA CAR (서열번호 125)의 세포외 도메인의 다른 부분들에서, 즉 N 말단 도메인에서, ScFv의 V1 및 V2을 분리하는 링커 도메인에서, 또는 CAR의 막관통 도메인에 ScFv를 연결하는 CD8 힌지에 대해 업스트림(upstream)에서 위치화된(localized) 1, 2 또는 3 CD20 미모토프들(mimotopes)을 포함하도록 설계되었다.
항-BCMA CAR를 발현시키는 일차(primary) T 세포들을 만들어내기 위하여, 일차 T 세포들이 먼저 버피-코트 샘플들로부터 정제되었고 Dynabeads 인간 T 활성인자 CD3/CD28를 이용하여 활성화되었다. 활성화 3일 후, 5 백만의 활성화된 T 세포들이 다른 항-BCMA CAR 아키텍쳐들을 코드하는 폴리아데닐화된 mRNA 15 또는 30 μg으로 형질주입되었다 (서열번호 125-139, 도 7). T 세포들은 그 다음에 추가의 특성화를 위하여 X-vivo-15 배지들 (Lonza)에서 5% CO2, 20 ng/ml IL-2 (최종 농도) 및 5% 인간 AB 혈청의 존재 하 37 ℃에서 배양물 내 유지되었다. 형질주입 하루 후, 세포들이 CDC 분석, 유동 기반의 세포독성 분석, 검출 분석 및 인터페론 γ (IFN γ) 방출 분석을 수행하기 위하여 사용되었다.
CDC 분석
CDC 분석은 37 ℃ 에서 2 시간 동안 최종 부피 400 μL의 Xvivo 10% FBS에서 리툭시맙 (RTX, ROCHE, 400ng) 및 아기 토끼 보체 (BRC, AbD Serotec, ref#C12CA, 제조업자 프로토콜에 따라 100 μL의 희석된 용액)의 존재 하, 또는 단독으로 0.2 106 형질주입된 세포들을 배양하는 단계로 이루어졌다. 배양 마지막에, 항 BCMA-CAR T 세포들이 회수되었고 PE 표지된 항-FC 이차 단일클론 항체 (Jackson ImmunoResearch, ref# 115-115-164, 희석된 1/200) 및 FC 단편에 융합된 재조합 BCMA 단백질 (서열번호 151)로 표지되었다. 세포들은 그 다음에 유동세포 분석법에 의하여 분석되기 전에 PFA 4%에서 회수되었다. 유동세포 분석법 게이팅 전략이 세포들의 총 군집에서 발견되는 싱글렛 중 항-BCMA CAR 양성 T 세포들 (PE 양성 세포들)의 생존능력을 결정하기 위한 것이다. 이 분석은 RTX 및 BRC의 존재 하 그리고 단독으로 배양된 세포들 상에서 수행되었다. 결과들은 하기에 기재된 "(대조군 실험에 대하여) BCMA CAR 양성 T 세포들 중 생존가능한 세포들의 상대적 빈도(frequency)"로 명명된 비율로서 표현된다:
(RTX 및 BRC의 존재 하 수득되는 항-BCMA CAR 양성 T 세포들 중 생존가능한 세포들의 빈도) x 100 / (RTX 및 BRC의 부존재 하 수득되는 항-BCMA CAR 양성 T 세포들 중 생존가능한 세포들의 빈도)
유동-기반의 세포독성 분석
항-BCMA CAR T 세포의 세포용해 활성 및 특이성이 Valton.et Al (2015) Mol Ther; 23(9):1507-1518에서 보고된 유동세포 분석법-기반의 세포독성 분석에 따라 평가되었다. 이 분석은 0.5 mM CellTraceTM CFSE (Life Technology, 제조업자의 프로토콜에 따라 배양 10분 37 ℃)로 BCMA 양성(positive) 종양 타겟 세포 (T, H929)을 표지하고 37 ℃에서 5 시간 동안 최종 부피 100 μl X-Vivo-15 배지에서 그것들을 105 항 BCMA CAR T 효과기 (E) 세포들 (10:1의 E/T 비율)과 공-배양시키는 것으로 이루어졌다. 세포들은 그 다음에 회수되었고 4% PFA에 의하여 고정시키기 전에 eFluor780 생존능력 마커로 표지되었다. 고정시켜진 세포들은 그 다음에 그것들의 생존능력을 결정하기 위하여 유동세포 분석법에 의하여 분석되었다.
IFN γ 방출 분석
임상적으로 적절한(relevant) 투여량의 RTX에 의하여 RTX 특이적 에피토프들을 포함하는 여러가지 항-BCMA CAR를 발현시키는 T 세포의 자가활성화를 연구하기 위하여, 형질주입 하루 후, 최종 부피 100 μl에서 0.1 106 세포들/웰들의 농도에서 500 μg/mL RTX 의 존재 하 또는 부존재 하 5% AB 혈청, 20 ng/mL IL2로 보충된 X-vivo-15 배지에서 72 시간 동안, 서열번호 125, 130-139를 코드하는 mRNA로 형질주입된 일차 T 세포들이 배양되었다. CAR T 세포들은 그 다음에 스핀다운(spun down)되었고, 상청액은 회수되었고 배양 배지에서 방출된 IFN γ의 양을 결정하기 위하여 (인간 IFN-감마 Quantikine ELISA Kit, RandD 시스템들, ref # DIF50을 이용하여) ELISA에 의하여 분석되었다. CAR T 세포 활성화 및 IFN γ 방출을 위한 양성 대조군으로 세포들은 10 μg/mL 피토헤마글루티닌(phytohemagglutinin) (PHA)과 배양되었다.
밀테니(Miltenyi) CD34 정제 키트를 이용한 항-BCMA CAR T 세포들의 정제
정제될 특정 (QBEND10 항체에 의하여 인식되는 CD34 에피토프, 서열번호 144를 포함하는) 항-BCMA CAR 아키텍쳐들의 능력(capacity)을 시험하기 위하여, 서열번호 128 을 꾸준하게 발현시키는 100 106 일차 T 세포들이 제조업자 프로토콜에 따라 CD34 MicroBead Kit (Miltenyi, ref# 130-046-702)을 이용하여 정제되었다.
결과들
항-BCMA CAR 양성 T 세포들의 고갈능력(depletability)
그 결과들은 현저하게 고갈되지(depleted) 않은 변형되지 않은 항-BCMA CAR (서열번호 125)에 대조적으로 서열번호 126-139를 발현시키는 T 세포들이 BRC 및 RTX에 의하여 다른 정도까지 모두 고갈되었다는(depleted) 것을 보여주었다 (도 8A). 그 결과들은 CAR 아키텍쳐에 존재하는 CD20 미모토프들(mimotopes)의 수와 함께 고갈(depletion)의 효율이 증가한다는 것을 보여준다. 게다가 그 결과들은 GS 링커들보다 더 큰 도메인에 의하여 복수 개의 CD20 미모토프들(mimotopes)을 분리하는 것이 2 CD20 미모토프들(mimotopes)을 포함하는 서열번호 139 및 서열번호 136과 더불어, 3 CD20 미모토프들(mimotopes)을 포함하는 서열번호 127 및 서열번호 137을 발현시키는 T 세포들로 수득된 고갈(depletion)의 정도들과 비교할 때 보여지는 고갈(depletion)의 효율을 증가시켰다는 것을 보여준다 (도 7-8A).
몇몇 예들에서, 서열번호 126-139의 CAR 아키텍쳐을 갖는 본 발명의 CAR는 CAR T 세포의 리툭시맙 의존적 고갈(depletion)을 가능하게 한다. 몇몇 예들에서, 서열번호 136, 137, 138과 같은 CAR 아키텍쳐를 갖는 본 발명의 CAR는, 즉 CAR가 (VH, VL, VH-L1-VL…과 같은) 하나 이상의 다른 도메인들에 의하여 분리되는 적어도 두 개의 동일한 mAb 특이적 에피토프를 포함할 때, 특히 효율적으로 고갈된다(depleted).
항-BCMA CAR + T 세포들의 세포독성 활성
유동-기반의 세포독성 분석은 모든 아키텍쳐들 (서열번호 126-139)이 항-BCMA CAR 아키텍쳐의 변형되지 않은 버젼을 발현시키는 T 세포들보다 유사한 정도로 BCMA-발현시키는 H929 종양 세포들 을 인식하고 죽일 수 있었다는 것을 가리켰다 (서열번호 125, 도 9). 실시예 1에서 얻은 결과들과 일치하여, 1, 2 또는 3 mAb 특이적 에피토프들 그리고 특히 CAR 아키텍쳐 내의 1, 2 또는 3 CD20 미모토프들(mimotopes)의 존재는 항-BCMA CAR T 세포들의 세포용해 활성에 상당한 영향을 주지 않았다.
몇몇 예들에서, 서열번호 126-139의 CAR 아키텍쳐들을 갖는 본 발명의 CAR들은 서열번호 125의 CAR와 같은 mAb-특이적 에피토프 없는 CAR에 비교하여 유사한 세포독성 활성을 갖는다.
세포들의 불균일 군집으로부터 분류된 항-BCMA 양성 CAR T 세포들
세포들의 불균일 군집으로부터 정제되는 서열번호 128의 항-BCMA CAR를 발현시키는 T-세포의 능력(capacity)을 테스트하기 위하여 (도 7A), 31.5%의 CAR 양성 세포들을 포함하는 100x106 일차 T 세포들의 집단(bulk) 군집(popoulation)이 제조업자의 프로토콜에 따라 CD34 MicroBead Kit를 이용하여 정제되었다. 결과들은 정제된 분획이 약 90%의 항-BCMA CAR 양성 T 세포들을 가졌다(harbored)는 것을 보여주었고 이는 정제 공정이 효율적이었다는 것을 가리킨다 (도 10). 31.5x106 항-BCMA CAR 양성 T 세포들 중 약 20x106 항-BCMA CAR 양성 T 세포들이 정제 후 회수되었는데, 이는 항-BCMA CAR 양성 T 세포들의 40% 미만이 정제 공정을 통해 소실되었다는 것을 가리킨다.
IFN γ 방출 분석
ELISA 분석 결과들은 CAR 아키텍쳐 내 하나 또는 복수 개의 CD20 미모토프들(mimotopes)의 존재가 RTX에 의하여 활성화되는 CAR T 세포들의 경향에 영향을 주지 않는다는 것을 보여주었다 (도 11). 과연 그 결과들은 RTX의 존재 하 모든 아키텍쳐들에 의하여 방출되는 IFNγ의 수준이 RTX의 부존재 하 방출되는 IFN γ 의 기본적인 수준과 유사하였다는 것을 보여주었다.
실시예 5. CAR T 세포들의 정제 및 최적의 고갈(depletion)을 위한 하이브리드 항-BCMA 키메라 항원 수용체 아키텍쳐들
항-BCMA CAR T 세포들의 고갈능력(depletability)을 개선시키고 동시에 그것들을 분류하는 것을 가능하게 하기 위하여 두 개의 새로운 하이브리드 CAR 아키텍쳐들 서열번호 140 및 141 (도 7C)이 설계되었다. 이들 두 개의 아키텍쳐들은 하나의 CD34 에피토프 및 단백질 도메인들에 의하여 서로 분리된 세 개의 CD20 미모토프들(mimotopes)을 포함하였다. RTX 및 BRC에 의하여 고갈되는(depleted) 그것들의 능력은 실시예 4에 기재된 프로토콜에 따라 CDC 분석에 의하여 평가되었다. 이들 결과들은 이들 두 개의 아키텍쳐들이 서열번호 137을 발현시키는 T 세포들보다 유사한 정도까지 효율적으로 고갈되었다는(depleted) 것을 보여주었다(도 8B). 그것들의 세포용해 특성들 또한 앞서 기재한 유동-기반의 분석을 이용하여 평가되었다. 그 결과들은 그것들이 변형되지 않은 항-BCMA CAR T 세포들을 발현시키는 T 세포들보다 유사한 세포독성 활성을 공유하는 것을 (서열번호 125) 보여주는데, 이는 CD20 미모토프들(mimotopes) 및 CD34 에피토프의 존재 (각각 서열번호 35 및 144)가 CAR T 세포들의 세포용해 활성에 부정적으로 영향을 주지 않는다는 것을 가리킨다.
몇몇 예들에서, 서열번호 140, 141과 같은 CAR 아키텍쳐를 갖는 본 발명의 CAR가, 즉 CAR가 정제에 사용될 수 있는 하나의 mAb 특이적 에피토프 및 세포들의 고갈(depletion)에 사용될 수 있는 리툭시맙과 같은 승인된 항체에 의하여 인식되는 세 개의 동일한 mAb-특이적 에피토프에서 포함할 때, 특히 효율적으로 고갈되고(depleted) 또한 효율적으로 정제될 수 있다.
서열번호 140 및 141의 아키텍쳐에 기초하나, CD19 (서열번호 162-163 및 168-169의 CAR), CD123 (서열번호 164-165의 CAR), CD20 (서열번호 166-167의 CAR)에 특이적인 ScFv의 VH 및 VL을 포함하는 추가적인 CAR들이 실시예 4에 기재된 프로토콜에 따라 조립되었다. RTX 및 BRC에 의하여 고갈되는(depleted) 그것들의 능력은 실시예 4에 기재된 프로토콜에 따른 CDC 분석에 의하여 평가될 수 있다.
실시예 6. mAb-주도된 고갈(depletion) 시스템을 갖는(bearing) CAR T 세포들의 보편적인 검출
생체내에서 다른 CAR T 세포들의 증식 모니터링 및 비교가 보편적인(universal) 검출 시스템의 부족 때문에 tiedous하고 힘들어(cumbersome) 왔다. 검출되는 다른 CAR 아키텍쳐들의 능력이 일차(primary) 항체로서 RTX 및 FITC-커플링된 항-Fab'2 단일클론 항체 (Life technologies, ref# H10101C, 희석된 1/200)를 이용하여 또는 QBEND10로 명명된 APC 표지된 항-CD34 단일클론 항체를 이용하여 (Miltenyi Biotec, ref# 130-090-954, 희석된 1/25) 유동세포 분석법에 의하여 테스트되었다. 결과들은 FC 단편에 융합된 재조합 BCMA 단백질 (서열번호 151) 및 PE 표지된 항-FC 이차 단일클론 항체 (Jackson ImmunoResearch, ref# 115-115-164, 희석된 1/200)로 수행된 검출로 나란히 비교되었다.
결과들은 RTX로 검출된 서열번호 128 및 130-139을 발현시키는 양성 CAR T 세포들의 빈도가 그것들이 재조합 BCMA 단백질로 검출될 때 수득된 것들과 비슷하였다는 것을 보여주었다 (도 12). 서열번호 128을 발현시키는 CAR T 세포들이 QBEND10 및 리툭시맙으로 검출되었을 때 유사한 결과들이 발견되었다 (도 13). 전체적으로 보아, 모든 결과들이 CD20 미모토프(mimotope) 또는 CD34 에피토프의 존재가 다른 CAR 아키텍쳐들의 효율적이고 보편적인(universal) 검출을 가능하게 한다는 것을 보여주었다.
실시예 7 - 하나, 둘 또는 세 개의 mAB 특이적 에피토프들을 포함하는 항 BCMA CAR를 발현시키는 항-BCMA CAR T 세포
7.1 - 플라스미드들
하기 CD20 미모토프(mimotope)-포함하는 CAR들은 코돈-최적화되고, 합성되고 EcoRI (5') 및 MluI (3') 제한효소 부위들 (이와 같이 IRES-Puro 카세트를 제거한다)을 이용하여 렌티바이러스 벡터 pLVX-EF1a-IRES-Puro (Clontech) 내로 서브클로닝된다. 렌티바이러스들은 psPAX2, HIV-1 gag-pol 패키징 플라스미드, 및 pMD2.G, VSV-G 발현 플라스미드를 이용하여 생산된다.
BC30 (서열번호 145)은 하기 도메인들을 포함한다:
리더-BCMA30 VH-링커-BCMA30 VL-CD8 힌지-CD8 TM-4-1BB-CD3z 이때 BCMA30 VH 및 BCMA30 VL은 각각 서열번호 97 및 서열번호 98이다.
BC30-LM (서열번호 146)은 하기 도메인들을 포함한다:
리더-BCMA30 VH-링커-BCMA30 VL-링커(L)-미모토프(Mimotope) (M)-CD8 힌지-CD8 TM-4-1BB-CD3z 이때 BCMA30 VH 및 BCMA30 VL은 각각 서열번호 97 및 서열번호 98이고 미모토프(mimotope)는 서열번호 35이다.
BC30-LML (서열번호 147)은 하기 도메인들을 포함한다:
리더-BCMA30 VH-링커-BCMA30 VL-링커(L)-미모토프(Mimotope) (M)-링커(L)-CD8 힌지-CD8 TM-4-1BB-CD3z 이때 BCMA30 VH 및 BCMA30 VL은 각각 서열번호 97 및 서열번호 98이고 미모토프(mimotope)는 서열번호 35이다.
BC30-LMLM (서열번호 148)은 하기 도메인들을 포함한다:
리더-BCMA30 VH-링커-BCMA30 VL-링커(L)-미모토프(Mimotope) (M)-링커(L)-미모토프(Mimotope) (M)-CD8 힌지-CD8 TM-4-1BB-CD3z 이때 BCMA30 VH 및 BCMA30 VL 은 각각 서열번호 97 및 서열번호 98이고 미모토프들(mimotopes)은 둘다 서열번호 35이다.
BC30-LMLML (서열번호 149)은 하기 도메인들을 포함한다:
리더-BCMA30 VH-링커-BCMA30 VL-링커(L)-미모토프(Mimotope) (M)-링커(L)-미모토프(Mimotope) (M)-링커(L)-CD8 힌지-CD8 TM-4-1BB-CD3z 이때 BCMA30 VH 및 BCMA30 VL은 각각 서열번호 97 및 서열번호 98이고 미모토프들(mimotopes)은 둘다 서열번호 35이다.
7.2 - T 세포 활성화 및 렌티바이러스 형질도입(transduction)
만지지 않은 T 세포들이 Pan T Cell 단리 키트 (Miltenyi Biotec)을 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포들 (PBMCs)로부터 분리되고, 인간 CD2, CD3, 및 CD28 (T Cell 활성화/확대 키트 - Miltenyi Biotec)에 대항하여 항체들과 삼 일 동안 활성화된다. 렌티바이러스 벡터들 (LV)이 6-웰 플레이트들에서 서브-융합성(confluent) HEK-293T/17 (American Type Culture Collection (ATCC)) 세포들의 일시적 형질주입에 의하여 생산된다. 간단히, pLVX, psPAX2, 및 pMD2.G 플라스미드들이 제조업자들의 설명(instructions)에 따라 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)을 이용하여 각각 4:3:1 의 비율로 형질주입된다. 다음날, 배지는 T 세포 배양 배지 (X-vivo-15 배지에서 5% 인간 AB 혈청(Lonza))으로 대체되고, 형질주입 48 시간 후 LV 상청액이 수확되고 0.45 μm 시린지 필터 (Millipore)를 통하여 여과된다. 활성화된 T 세포들이 40 ng/ml IL-2을 포함하는 T 세포 배양 배지에서 0.25 x 106 세포들/mL에서 접종되고 동일한 부피의 신선한 LV 상청액을 첨가함으로써 형질도입된다. 세포들은 삼 일 동안 37 ℃ 및 5% CO2에서 배양되고 유동세포 분석법 분석을 위하여 사용되거나 또는 20 ng/ml IL-2을 포함하는 신선한 T 세포 배지에서 확장된다.
7.3 - 유동세포 분석법에 의한 CD20 미모토프들(mimotopes)을 포함하는 BCMA CAR들의 검출
CAR-T 세포들의 검출 및 추적을 위한 내부(intra) CAR CD20 미모토프들(mimotopes)의 유용성을 테스트하기 위하여, 유동세포 분석법 분석이 CAR의 scFV 영역에, 뒤이어 PE-콘쥬게이트된 스트렙타비딘(streptavidin)에 결합하는, 바이오티닐레이티드(biotinylated)-BCMA 단백질 또는 항-CD20 항체 리툭시맙에, 뒤이어 FITC-콘쥬게이트된 항-인간 IgG (Rituximab (FITC))을 이용하는 형질도입된 T 세포들 상에서 수행된다. 도 14A 및 14B는 다른 CD20-미모토프(mimotope)-포함하는 CAR들로 형질도입된 T 세포들이 바이오티닐레이티드(biotinylated)-BCMA 뒤이어 PE-콘쥬게이트된 스트렙타비딘을 이용한 유동세포 분석법에 의하여 비교할만한 효율로 검출된다는 것을 보여준다. 리툭시맙으로 내부(intra) CAR CD20 미모토프(mimotope)(들)의 검출은 LM 구조체 (15.5%)으로 형질도입된 세포들에서 약하지만, 테스트된 모든 다른 방식들(formats)에서는 매우 높다. 예를 들어, LMLML CAR는 85.6%의 세포들에서 검출되는데, 이는 이 형식이 CAR를 발현시키는 사실상 모든 세포들의 확인을 가능하게 한다는 것을 나타낸다 (도 14A 및 14B). 이와 같이 가요성 링커들에 의하여 분리된 두 개의 CD20 에피토프들의 존재는 리툭시맙에 대한 증강된 결합을 가능하게 하고 CAR+ 세포들을 검출하기 위하여 최적의 시스템을 제공한다.
CAR-T 세포 검출을 위한 내부(intra) CAR CD20 에피토프들의 기능성은 CAR와 정상적으로 공-발현되는 CD34 에피토프 및 두 개의 CD20 에피토프들을 포함하는 치밀(compact) 단백질로 이루어지는 RQR8 마커/자살 유전자 시스템 (서열번호 150)과의 비교에 의하여 평가된다 (Philip, Blood 2014). 이 실험을 위하여 T 세포들은 BCMA30 CAR (서열번호 145) 및 RQR8 단백질 (서열번호 150) (BC30-RQR8 구조체)의 공(co)-발현을 가능하게 하는 렌티바이러스로 형질도입된다. 비교를 위하여, T 세포들은 BCMA30 LMLML CAR 구조체 (BC30-R2 구조체 - 서열번호 149)로 형질도입되고 형질도입 삼 일 후 유동세포 분석법에 의하여 분석된다. 게다가, 형질도입되지 않은(non-transduced) (NT) T 세포들은 음성 대조군의 역할을 한다. 도 15는 CAR 분자에서 CD20 에피토프들을 포함시키는 것이 항-CD20 항체 리툭시맙으로 CAR-T 세포들의 검출을 상당히 개선하는 것을 보여주는 것을 목적으로 한다. 게다가, 증가된 형질도입 효율 및 CAR 발현이 바이로티닐레이티드(biotinylated) BCMA로 한 유동세포 분석법 분석에 의하여 나타났듯이, CAR 및 RQR8을 코드하는 벡터로 형질도입된 것들과 비교하여 BC30-R2 구조체로 형질도입된 세포들에서 관찰된다 (도 15). 이런 식으로 CAR 분자 내로 CD20 에피토프들의 삽입은 증강된 형질도입, 개선된 검출 및 CAR 발현 및 mAb 특이적 에피토프(들) 발현 간의 완전한 연관성을 가능하게 한다.
7.4 - 내부(intra) CAR CD20 에피토프들은 CAR-T 세포들을 보체-의존성 세포독성에 대하여 민감하게 만든다.
CAR-T 세포들의 선택적 제거를 가능하게 하는 내부(intra) CAR CD20 에피토프들의 능력은 CDC 분석을 이용하여 시험관내에서 평가된다. 목표는 CAR 분자에서 CD20 에피토프들의 존재가 CAR-T 세포들을 리툭시맙-매개된 고갈(depletion)에 매우 민감하게 만든다는 것을 보여주는 것이다. 이 실험에서, BC30-R2 구조체 또는 the BC30-RQR8 구조체로 형질도입된 T 세포들은 리툭시맙 (100 μg/mL)의 존재 또는 부존재 하 25% 아기-토끼 보체 (AbD serotec)와 혼합되고 37 ℃ 및 5% CO2에서 4 시간 동안 배양된다. CAR-T 세포들의 선택적 결실(deletion)은 비오티닐레이티드(biotinylated) BCMA 단백질을 이용하는 유동세포 분석법 분석에 의하여 결정된다. 도 16은 RQR8 및 내부(intra) CAR CD20 에피토프 자살 유전자 시스템들 둘 다 CAR-T 세포 고갈(depletion)을 가능하게 하는 반면, BC30-R2 구조체으로 형질도입된 세포들은 RQR8을 발현시키는 것들보다 더 효율적으로 고갈된다는(depleted) 것을 보여준다. 예상되는 대로, BCMA30 CAR을 발현시키나 CD20 에피토프들 은 아닌 (BC30 구조체) T 세포들이 아껴진다(spared). 이들 차이들은 BC30-R2 CAR의 고발현 및 CAR 발현 및 자살 유전자 발현 간의 완전한 연관성 때문일 수 있다.
7.5 - CAR들 내로 CD20 에피토프들의 도입(Incorporation)은 CAR-T 세포들의 세포용해 활성을 손상시키지 않는다
CAR의 scFv 영역들 및 힌지 사이의 CD20 에피토프들의 삽입아 CAR 활성을 손상시킬 수 있는 가능성은 세포독성 분석에서 평가된다. 간단히, BC30-R2 구조체 또는 the BC30-RQR8 구조체를 발현시키는 T 세포들은 다른 비율들에서 루시페라제-양성 MM1S 타겟 세포들과 배양된다. 이들 살해 분석들을 위하여, 세포들은 X-vivo-15 배지 (Lonza)에서 최종 부피 100 μl의 5% 인간 AB 혈청의 96-웰의 불투명한 백색 조직 배양 플레이트에 접종된다. 4 시간 후, 세포들은 실온에서 평형이 유지되고 한 부피의 Bright-Glo™ Reagent (Promega)이 각 웰에 첨가된다. 발광은 GLOMAX 96 마이크로플레이트 광도계 (Promega)에서 측정되고 세포 용해(lysis)의 퍼센티지는 하기 식에 따라 계산된다:
100 x (1 - (샘플 용해 - 최대(max) 용해)/(자연적인(spontaneous) 용해 - 최대(max) 용해)).
최대 용해는 Luc+ MM1S 세포들에 8% Triton X-100 (Sigma)의 첨가에 의하여 결정된다. 자연적인 용해를 위하여, MM1S 세포들이 효과기 CAR-T 세포들의 부존재 하 배양된다.
그 결과들은 BC30-R2 CAR-T 세포들이 시험관내에서 BCMA-발현시키는 MM1S 세포들을 효과적으로 제거한다는 것을 보여준다 (도 17).
게다가, BC30-R2 CAR-T 세포들의 세포용해 활성은 이들 세포들이 타겟 세포들과 혼합되기 2시간 전 효과기(effector) 세포 군집에 첨가되는 리툭시맙 (100 μg/mL)에 의하여 영향을 받지 않는다 (도 17). 이 실험은 BC30 CAR 분자 내로 CD20 에피토프들의 삽입이, 리툭시맙의 존재 하에서도, BCMA+ 타겟 세포들을 죽이는 것을 중재하는 그것의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하는 것을 목표로 한다.
7.6 내부( intra ) CAR CD20 에피토프들에 결합한 리툭시맙은 CAR-T 세포 활성화를 이끌지 않는다
리툭시맙에 의한 CAR들의 가교가 세포 표면 상 CAR 응집(aggregation) 때문에 T 세포 활성화를 이끌 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, BC30-R2 CAR-T 세포들이 리툭시맙의 존재 하 성장된다. 항-CD3 OKT3 항체 (eBioscience)는 T 세포 수용체 (TCR)의 가교를 야기하는데, 이는 세포 활성화 및 증식을 야기하고, 양성 대조군으로서 사용된다. 간단히, BC30-R2 CAR-T 세포들은 삼 일 동안 리툭시맙의 존재/부존재 하 T 세포 배지에서 배양된다. T 세포 활성화는 그 다음에 유동세포 분석법을 이용한 활성화 마커들 CD25 및 CD69의 발현을 측정함으로써 평가된다. 이 실험은 RTX의 존재 하 활성화된 T 세포들의 퍼센트가 대조군 (PBS)과 상당히 다르지 않다는 것을 보여준다. 그러므로, 가용성 리툭시맙은 BC30-R2 CAR-T 세포들의 활성화 상태에 상당한 영향을 갖지 않는다 (도 18).
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본 발명의 예들:
1. 적어도 세포 표면 마커 항원에 특이적인 VH 체인 및 VL 체인에 의하여 형성된 scFv를 포함하는 적어도 하나의 세포외 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR)을 코드하며, 이때 상기 세포외 결합 도메인은 상기 CAR를 발현시킨느 면역 세포들의 생체내 세포 고갈(depletion) 및/또는 시험관내에서 세포 분류를 위한 에피토프-특이적 mAb에 의하여 결합되는 적어도 하나의 mAb-특이적 에피토프을 포함하는, 폴리펩타이드.
2. 예 1에 있어서, 상기 mAb-특이적 에피토프는 VH 및 VL 체인들 사이에 위치하는 폴리펩타이드.
3. 예 1 또는 2에 있어서, 상기 VH 및 VL 체인들, 및 mAb 특이적-에피토프는 힌지에 의하여 상기 CAR의 막관통 도메인에 그리고 적어도 하나의 링커에 의하여 서로 결합되는 폴리펩타이드.
4. 예 3에 있어서, mAb-에피토프는 두 개의 링커들에 의하여 VH 및 VL 체인들에 연결되는 폴리펩타이드.
5. 예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, mAb-에피토프는 표 1에 리스트된 것들로부터 선택되는 하나의 폴리펩타이드로부터인 폴리펩타이드.
6. 예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 VH 및 VL 체인들은 서열번호 43 (CD19 항원), 서열번호 44 (CD38 항원), 서열번호 45 (CD123 항원), 서열번호 46 (CS1 항원), 서열번호 47 (BCMA 항원), 서열번호 48 (FLT-3 항원) , 서열번호 49 (CD33 항원), 서열번호 50 (CD70 항원), 서열번호 51 (EGFR-3v 항원) 및 서열번호 52 (WT1 항원)과 80%가 넘는 동일성, 바람직하게는 90%가 넘는, 그리고 더욱 바람직하게는 95%가 넘는 항원 타겟 서열로서 갖는 폴리펩타이드.
7. 예 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 상기 VH 및 VL 체인들은 서열번호 53-64 (CD19 항원), 서열번호 65-76 (CD33 항원), 서열번호 77-84 (5T4 항원), 서열번호 85-90 (ROR1 항원), 서열번호 91-94 (EGFRvIII 항원), 서열번호 95-102 (BCMA 항원), 서열번호 103-112 (CS1 항원) 및 서열번호 113-124 (CD123 항원)과 80%가 넘는 동일성, 바람직하게는 90%가 넘는, 그리고 더욱 바람직하게는 95%가 넘는 항원 타겟 서열로서 갖는 폴리펩타이드.
8. 예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 VH 및 VL 체인들은 서열번호 11의 CD20 항원과 80%가 넘는 동일성, 바람직하게는 90%가 넘는, 그리고 더욱 바람직하게는 95%가 넘는 동일성의 에피토프 타겟 서열로서 갖는 폴리펩타이드.
9. 예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, CAR는 단일-체인 CAR인 폴리펩타이드.
10. 예 9에 있어서, 상기 CAR 폴리펩타이드는 서열번호 1 내지 10과 80%가 넘는 동일성, 바람직하게는 90%가 넘게, 그리고 더욱 바람직하게는 95%가 넘게 공유하는 폴리펩타이드.
11. 예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, CAR는 다중-체인 CAR인 폴리펩타이드.
12. 예 1 내지 9 중 어느 하나에 따른 키메라 항원 수용체를 코드하며(encoding), 상기 CAR는 4-1BB로부터의 공-자극 도메인 및 CD3 제타 신호전달(signaling) 도메인을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
13. 예 12의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
14. 예들 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 키메라 항원 수용체를 그것의 세포 표면에서 발현시키는 조작된 면역 세포.
15. 염증성 T-림프구들, 세포독성 T-림프구들, 조절성 T-림프구들 또는 헬퍼 T-림프구들로부터 유래된, 예 14에 따른 조작된 면역 세포.
16. 의약으로서 사용을 위한 예 14 또는 15에 따른 조작된 면역 세포.
17. (a) 면역 세포를 제공하는 단계;
(b) 예들 1 내지 12 중 어느 하나에 따른 키메라 항원 수용체를 코드하는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드를 상기 세포 내에 도입시키는 단계.
(c) 상기 세포 내로 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계:
를 포함하는, 예 14 내지 16 중 어느 하나의 면역 세포의 조작 방법.
18. 면역 세포는 T-세포인, 예 17의 면역 세포의 조작 방법.
19. CAR-발현시키는 면역 세포들만을 수집하기 위하여 항원-특이적 mAb들과 예 14-16 중 어느 하나에 따라 조작된 면역 세포들의 군집을 접촉시키는 단계를 포함하는 CAR-발현시키는 면역 세포들의 분류 방법.
20. 예 19에 있어서, mAb는 리툭시맙인 CAR-발현시키는 면역 세포들의 분류 방법.
21. 예 19 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 면역 세포는 T-세포인 CAR-발현시키는 면역 세포들의 분류 방법.
22. 상기 면역 세포 또는 상기 CAR-발현시키는 면역 세포를 에피토프-특이적 mAb들과 접촉시키는 단계를 포함하는, 예 14 내지 16 중 어느 하나에 따라 조작된 면역 세포, 또는 예 19 내지 21 중 어느 하나에 따라 분류된 CAR-발현시키는 면역 세포를 고갈시키는(depleting) 방법.
23. 예 22에 있어서, 상기 에피토프-특이적 mAb는 보체계를 활성화시킬 수 있는 분자에 의하여 콘쥬게이트된 것인, 면역 세포 또는 CAR-발현시키는 면역 세포를 고갈시키는(depleting) 방법.
24. 예 22 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 세포독성 약물은 에피토프-특이적 mAb들에 커플링된 것인, 면역 세포 CAR-발현시키는 면역 세포를 고갈시키는(depleting) 방법.
25. 예 22 내지 24 중 어느 하나에 있어서, mAb-특이적 항원은 CD20 항원이고 에피토프-특이적 mAb는 리툭시맙인 면역 세포 CAR-발현시키는 면역 세포를 고갈시키는(depleting) 방법.
26. 상기 면역 세포 또는 CAR-발현시키는 면역 세포를 상기 세포들 상에 지녀진 mAb-특이적 에피토프 및 효과기 (및 세포독성) 세포 상에 지녀진(borne) 표면 항원 둘다에 결합할 수 있는 이중-특이적 mAb (BsAb)와 접촉시키는 단계를 포함하는, 예 22 내지 25 중 어느 하나에 따른 면역 세포 CAR-발현시키는 면역 세포를 고갈시키는(depleting) 방법.
27. 상기 면역 세포는 T-세포인, 예 22 내지 26 중 어느 하나에 따른 면역 세포 CAR-발현시키는 면역 세포를 고갈시키는(depleting) 방법.
28. 적어도:
(i) 세포외 결합 도메인이 mAb 특이적 에피토프에 연결된 세포 표면 마커를 인식하는 scFv를 포함하는 CAR를 상기 면역 세포에 부여하는 단계
(ii) 그것의 표면 상에 상기 mAb 에피토프 및 상기 CAR을 발현시키는 상기 면역 세포를 확장시키는 단계
(iii) 상기 면역 세포들을 고정화하기 위하여 그 결과인 면역 세포들을 상기 에피토프에 특이적인 mAb와 접촉시키는 단계
의 단계들을 포함하는 조작된 면역 세포의 활성화를 조절하는 방법.
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Val Pro Ser Arg Phe Ser 210 215 220 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu 225 230 235 240 Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro 245 250 255 Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Ser Asp Pro Gly 260 265 270 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser 275 280 285 Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val 290 295 300 Ser Thr Asn Val Ser Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr 305 310 315 320 Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ala Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 325 330 335 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 340 345 350 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 355 360 365 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 370 375 380 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Gly 385 390 395 400 Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val 405 410 415 Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu 420 425 430 Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp 435 440 445 Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn 450 455 460 Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg 465 470 475 480 Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly 485 490 495 Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu 500 505 510 Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu 515 520 525 Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His 530 535 540 Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Glu 545 550 <210> 169 <211> 529 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> polypeptide <400> 169 Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ser Ser Gly Gly Ser Cys Pro Tyr 115 120 125 Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln 130 135 140 Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser 145 150 155 160 Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu 180 185 190 His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 210 215 220 Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr 225 230 235 240 Lys Leu Glu Ile Thr Ser Asp Pro Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys 245 250 255 Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Leu 260 265 270 Pro Thr Gln Gly Thr Phe Ser Asn Val Ser Thr Asn Val Ser Pro Ala 275 280 285 Lys Pro Thr Thr Thr Ala Cys Pro Tyr Ser Asn Pro Ser Leu Cys Ala 290 295 300 Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile 305 310 315 320 Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala 325 330 335 Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr 340 345 350 Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu 355 360 365 Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 370 375 380 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 385 390 395 400 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 405 410 415 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 420 425 430 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 435 440 445 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 450 455 460 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 465 470 475 480 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 485 490 495 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 500 505 510 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 515 520 525 Glu <210> 170 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized F19 VH chain <400> 170 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Arg Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Thr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Pro Asn Asn Gly Ile Pro Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Arg Arg Ile Ala Tyr Gly Tyr Asp Glu Gly His Ala Met Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 171 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized F19 VL chain <400> 171 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Phe Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Phe Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 100 105 110 Lys <210> 172 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP5 VH chain <400> 172 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Asn Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Asn 20 25 30 Gly Ile Asn Trp Leu Lys Gln Arg Thr Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Arg Ser Thr Asn Thr Leu Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Thr Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr 85 90 95 Phe Cys Ala Arg Thr Leu Thr Ala Pro Phe Ala Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 173 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FAP5 VL chain <400> 173 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Gly Val Asn Phe Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Phe 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 174 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb-specific epitope <400> 174 Gly Gln Asn Asp Thr Ser Gln Thr Ser Ser Pro Ser 1 5 10 <210> 175 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD3zeta intracellular signaling domain (ISD) <400> 175 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 176 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 41BB intracellular signaling domain (ISD) <400> 176 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 177 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 41BB-IC (41BB co-stimulatory domain) <400> 177 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 178 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8alpha signal peptide <400> 178 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 179 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcgammaRIIIalpha hinge <400> 179 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 1 5 10 15 <210> 180 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8alpha hinge <400> 180 Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala 1 5 10 15 Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly 20 25 30 Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp 35 40 45 <210> 181 <211> 231 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IgG1 hinge <400> 181 Glu Pro Lys Ser Pro Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 20 25 30 Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 35 40 45 Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp 50 55 60 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr 65 70 75 80 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 85 90 95 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu 100 105 110 Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 115 120 125 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys 130 135 140 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 145 150 155 160 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 165 170 175 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 180 185 190 Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser 195 200 205 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 182 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8alpha transmembrane (TM) domain <400> 182 Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 20 <210> 183 <211> 52 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcepsilonRI alpha-TM-IC (FcepsilonRI alpha chain transmembrane and intracellular domain) <400> 183 Phe Phe Ile Pro Leu Leu Val Val Ile Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 1 5 10 15 Leu Phe Ile Ser Thr Gln Gln Gln Val Thr Phe Leu Leu Lys Ile Lys 20 25 30 Arg Thr Arg Lys Gly Phe Arg Leu Leu Asn Pro His Pro Lys Pro Asn 35 40 45 Pro Lys Asn Asn 50 <210> 184 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FcepsilonRIbeta-(-)ITAM (FcepsilonRI beta chain without ITAM) <400> 184 Met Asp Thr Glu Ser Asn Arg Arg Ala Asn Leu Ala Leu Pro Gln Glu 1 5 10 15 Pro Ser Ser Val Pro Ala Phe Glu Val Leu Glu Ile Ser Pro Gln Glu 20 25 30 Val Ser Ser Gly Arg Leu Leu Lys Ser Ala Ser Ser Pro Pro Leu His 35 40 45 Thr Trp Leu Thr Val Leu Lys Lys Glu Gln Glu Phe Leu Gly Val Thr 50 55 60 Gln Ile Leu Thr Ala Met Ile Cys Leu Cys Phe Gly Thr Val Val Cys 65 70 75 80 Ser Val Leu Asp Ile Ser His Ile Glu Gly Asp Ile Phe Ser Ser Phe 85 90 95 Lys Ala Gly Tyr Pro Phe Trp Gly Ala Ile Phe Phe Ser Ile Ser Gly 100 105 110 Met Leu Ser Ile Ile Ser Glu Arg Arg Asn Ala Thr Tyr Leu Val Arg 115 120 125 Gly Ser Leu Gly Ala Asn Thr Ala Ser Ser Ile Ala Gly Gly Thr Gly 130 135 140 Ile Thr Ile Leu Ile Ile Asn Leu Lys Lys Ser Leu Ala Tyr Ile His 145 150 155 160 Ile His Ser Cys Gln Lys Phe Phe Glu Thr Lys Cys Phe Met Ala Ser 165 170 175 Phe Ser Thr Glu Ile Val Val Met Met Leu Phe Leu Thr Ile Leu Gly 180 185 190 Leu Gly Ser Ala Val Ser Leu Thr Ile Cys Gly Ala Gly Glu Glu Leu 195 200 205 Lys Gly Asn Lys Val Pro Glu 210 215 <210> 185 <211> 41 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD28-IC (CD28 co-stimulatory domain) <400> 185 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40

Claims (62)

  1. 적어도 항원에 특이적인 VL 체인 및 VH 체인에 의하여 형성된 scFv를 포함하는 세포외 결합 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor) (CAR)이며,
    이때 상기 세포외 결합 도메인은 하기 서열을 포함하고
    V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-;
    V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-;
    V1-L1-V2-(L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-;
    (L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2;
    (L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2;
    에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-V1-L1-V2;
    (L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x;
    (L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-;
    (L)x-에피토프1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x-;
    (L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프3-(L)x-;
    (L)x-에피토프1-(L)x-에피토프2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x-;
    V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2;
    V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x;
    V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x;
    V1-(L)x-에피토프1-(L)x-V2-(L)x-에피토프2-(L)x-에피토프3-(L)x-에피토프4-(L)x;
    (L)x-에피토프1-(L)x-V1-(L)x-에피토프2-(L)x-V2;
    (L)x-에피토프1-(L)x-V1-(L)x-에피토프2-(L)x-V2-(L)x-에피토프3-(L)x; 또는
    V1-L1-V2-L-에피토프1; V1-L1-V2-L-에피토프1-L; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2-L; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3; V1-L1-V2-L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L; V1-L1-V2-에피토프1; V1-L1-V2-에피토프1-L; V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2; V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2-L; V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3; V1-L1-V2-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L; 에피토프1-V1-L1-V2; 에피토프1-L-V1-L1-V2; L-에피토프1-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-L-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-L-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-V1-L1-V2; 에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-V1-L1-V2; L-에피토프1-L-에피토프2-L-에피토프3-L-V1-L1-V2; V1-L-에피토프1-L-V2; L-에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-L; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-L-에피토프3; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-에피토프3; V1-L-에피토프1-L-V2-L-에피토프2-L-에피토프3-에피토프4; L-에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2-L-에피토프3-L; 에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2-L-에피토프3-L; L-에피토프1-L-V1-L-에피토프2-L-V2-L-에피토프3; L-에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-L; L-에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-L-에피토프3; L-에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-에피토프3, 또는 에피토프1-L-V1-L1-V2-L-에피토프2-L-에피토프3-에피토프4;
    이때
    V1 은 VL 이고 V2 는 VH 이거나 또는 V1 은 VH 이고 V2 은 VL 이고;
    L1은 아미노산 서열 (Gly-Gly-Gly-Ser)n 또는 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n을 포함하는 링커이고 여기서 n은 1, 2, 3, 4 또는 5이거나, 또는 L1은 아미노산 서열 (Gly4Ser)4 또는 (Gly4Ser)3 을 포함하는 링커이고;
    L은 SGG, GGS, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGG, GGGGS, SGGGGS, GGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS, GGGGGGGS, SGGGGGGG, SGGGGGGGS, 또는 SGGGGSGGGGS 로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는 링커이고, 그리고 상기 세포외 결합 도메인에서 L의 각 발생은 동일한 세포외 결합 도메인에서 L의 다른 발생과 동일하거나 또는 다를 수 있고, 그리고
    x는 0 또는 1이고 x의 각 발생은 다른 것들로부터 독립적으로 선택되고; 그리고
    에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 4는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 mAb-특이적 에피토프이고; 그리고 에피토프 3은 서열번호 35 또는 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 mAb-특이적 에피토프들로부터 선택되는, 키메라 항원 수용체 (CAR).
  2. 제 1항에 있어서,
    에피토프 1, 에피토프 2 및 에피토프 4는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 mAb-특이적 에피토프이고 에피토프 3은 서열번호 144의 아미노산 서열을 포함하는 mAb-특이적 에피토프인, 키메라 항원 수용체 (CAR).
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 VH 체인 및 상기 VL 체인은 서열번호 45 (CD123 항원) 또는 서열번호 47 (BCMA 항원)의 항원(antigenic) 타겟을 갖는, 키메라 항원 수용체 (CAR).
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 항원은 CD123, 및 BCMA (CD269, TNFRSF 17)로부터 선택되는, 키메라 항원 수용체 (CAR).
  5. 제 1항에 있어서,
    VH 및 VL은 서열번호 97 의 VH 및 서열번호 98 의 VL; 서열번호 119 의 VH 및 서열번호 120 의 VL; 및 서열번호 186 의 VH 및 서열번호 187 의 VL 로부터 선택되는, 키메라 항원 수용체 (CAR).
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 CAR는 하나의 세포외 결합 도메인을 포함하고, 이때 상기 세포외 결합 도메인은 힌지(hinge)를 더 포함하고, 그리고 상기 CAR는
    - 막관통(transmembrane) 도메인, 및
    - 세포내(intracellular) 도메인
    을 더 포함하는 키메라 항원 수용체 (CAR).
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 힌지는 IgG1 힌지, IgG4 힌지, CD8알파 (CD8alpha) 힌지 또는 FcγRIII 알파 힌지를 포함하는, 키메라 항원 수용체 (CAR).
  8. 제 6항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은 T-세포 수용체(receptor)의 알파, 베타 또는 제타 체인의 막관통 영역을 포함하거나, 또는 상기 막관통 도메인은 PD-1, 4-1BB, OX40, ICOS, CTLA-4, LAG3, 2B4, BTLA4, TIM-3, TIGIT, SIRPA, CD28, CD3 엡실론(epsilon), CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 또는 CD154의 막관통 영역을 포함하는, 키메라 항원 수용체 (CAR).
  9. 제 6항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은 CD8 알파의 막관통 영역을 포함하는, 키메라 항원 수용체 (CAR).
  10. 제 6항에 있어서,
    상기 세포내 도메인이 CD3제타 신호전달(CD3zeta signalling) 도메인 및 4-1BB 공(co)-자극 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체 (CAR).
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 CAR는 단일-체인 CAR인, 키메라 항원 수용체 (CAR).
  12. 제 1항에 있어서,
    상기 CAR는 서열번호 1 내지 10, 서열번호 126 내지 141 또는 서열번호 149와 동일한, 키메라 항원 수용체 (CAR).
  13. 제 1항에 있어서,
    상기 CAR는 다중(multi)-체인 CAR인 키메라 항원 수용체 (CAR).
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 키메라 항원 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제 14항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  16. 조작된 면역 세포이며, 이때 상기 조작된 면역 세포는 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 키메라 항원 수용체를 상기 조작된 면역 세포의 표면에서 발현하는 조작된 면역 세포.
  17. 제 16항에 있어서,
    상기 세포는 염증성 T-림프구들, 세포독성 T-림프구들, 조절성 T-림프구들 또는 헬퍼 T-림프구들로부터 유래되는 조작된 면역 세포.
  18. 제 16항에 따른 상기 조작된 면역 세포를 포함하는 암의 치료를 위한 약학적 조성물.
  19. 제 17항에 따른 조작된 면역 세포를 포함하는 암의 치료를 위한 약학적 조성물.
  20. (a) 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 따른 키메라 항원 수용체를 코드하는 폴리뉴클레오타이드를 제공된 면역 세포 내로 도입하는 단계, 및
    (b) 상기 세포 내로 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계
    를 포함하는 면역 세포를 조작하기 위한 생체외(ex vivo) 방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    (a)의 상기 면역 세포는 T-세포인, 면역 세포를 조작하기 위한 생체외(ex vivo) 방법.

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