JP2023516067A

JP2023516067A - がんの処置のためのキメラ抗原受容体ならびに関連した方法および組成物

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Publication number: JP2023516067A
Application number: JP2022552528A
Authority: JP
Inventors: イボンヌユ－シュアンチェン; シーミンチェン
Original assignee: University of California
Current assignee: University of California
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2021-03-02
Publication date: 2023-04-17
Also published as: CN115551891A; KR20220149606A; EP4114861A4; US20230084763A1; WO2021178430A3; EP4114861A2; WO2021178430A2; CA3174575A1; AU2021232512A1

Abstract

本開示の局面は、増強された抗腫瘍活性を有する新規のキメラ抗原受容体へ組み込むために有用である新規のscFv分子に関する。さらなる局面は、アミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、scFvと膜貫通ドメインとねじれリンカーと一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域とを含むCARを含むポリペプチドに関し、ここで、ねじれリンカーは1～12個のアラニン残基を含む。本開示のポリペプチドをコードする配列を含む核酸、本開示の核酸を含むベクター、例えば、レンチウイルスベクター、本開示の核酸および/もしくはポリペプチドを含み、かつ/または発現する細胞、ならびに本開示の細胞態様を含む細胞集団も、記載される。ポリペプチドを発現する細胞を作製する方法、ならびに本開示のポリペプチドおよび細胞組成物によって患者を処置する方法も、提供される。

Description

本願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、2020年3月2日に出願された米国仮出願第62/984,139号および2020年9月28日に出願された米国仮出願第63/084,138号に基づく優先権の恩典を主張する。

I.発明の分野
本発明は、概して、分子生物学および免疫療法の分野に関する。

II.背景
CD20は、B細胞悪性腫瘍のための臨床的にバリデートされている標的である。CD20を標的とするキメラ抗原受容体（CAR）-T細胞は、臨床的に試験され、安全であることが示されているが、B細胞リンパ腫に対してCD19 CAR-T細胞治療ほど効果的ではない。いくつかの以前の発表が、CD19 CARの独特の効力の主な理由は、トニックシグナル伝達の欠如であると明記した。具体的には、大部分のCARが、抗原刺激の非存在下でさえ基底シグナル伝達を示すこと、この「トニックシグナル伝達」挙動が、早熟T細胞機能障害を誘発すること、CD19 CARは、トニックシグナル伝達せず、したがって、早熟T細胞機能障害を誘導しないため、独特に効果的であることが主張されている。さらに、CARトニックシグナル伝達が、T細胞表面上のCAR分子の抗原非依存的クラスター形成の結果であること、このクラスター形成挙動が、CARのscFvドメインの特異的な配列の結果であることが提唱されている。ロバストな、T細胞によって媒介される抗腫瘍機能を支持する、改善されたCARが必要とされており、それは、CARのトニックシグナル伝達挙動をモジュレートすることによって可能であり得る。

開示の概要
態様は、キメラ抗原受容体、キメラ抗原受容体をコードする核酸、およびキメラ抗原受容体を発現し得る細胞を含む組成物に関し、キメラ抗原受容体を操作し、かつ/または作製する方法、およびこれらの組成物を使用する方法にも関する。したがって、本開示の組成物および方法は、増加したインビボ効力を有するCARを再設計するためのプロセス、および本開示の付加的な方法において使用され得る、その結果として生じるCARを提供する。

本開示の局面は、軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）を含む抗CD20単鎖可変断片（scFv）を含むポリペプチドであって、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:29、30、31、22、12、13、および14と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:26、27、28、18、9、10、および11と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドに関する。

さらなる局面は、軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、LFR1、LCDR1、LFR2、LCDR2、LFR3、LCDR3、およびLFR4を含む軽鎖可変領域；ならびに重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、HFR1、HCDR1、HFR2、HCDR2、HFR3、HCDR3、およびHFR4を含む重鎖可変領域を含む抗CD20 scFvを含むポリペプチドであって、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:19、20、21、22、24、13、および25と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:15、16、17、18、9、10、および23と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドに関する。

さらなる局面は、軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）を含む抗CD20単鎖可変断片（scFv）を含むポリペプチドであって、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:5の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:6の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドに関する。

軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）を含む抗CD20単鎖可変断片（scFv）を含むポリペプチドであって、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:7の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:8の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドも、記載される。

さらなる局面は、軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）を含む抗GD2単鎖可変断片（scFv）を含むポリペプチドであって、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:136、137、138、139、113、114、および115と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:132、133、134、135、110、111、および112と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドに関する。

軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）を含む抗GD2単鎖可変断片（scFv）を含むポリペプチドであって、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:141の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:140の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドも、記載される。

さらなる局面は、軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）を含む抗GD2単鎖可変断片（scFv）を含むポリペプチドであって、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:120、121、122、123、129、130、および131と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:116、117、118、119、126、127、および128と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドに関する。

軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）を含む抗GD2単鎖可変断片（scFv）を含むポリペプチドであって、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:144の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:143の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドも、記載される。

本開示の局面は、アミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域を含むscFvと膜貫通ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域とを含むCARを含むポリペプチドであって、scFvが、同じ抗原に結合する異なる抗原結合領域または抗体に由来するフレームワーク領域（FR）および相補性決定領域（CDR）を含むハイブリッドscFvである、ポリペプチドにも関する。

さらなる局面は、アミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、scFvと膜貫通ドメインとねじれリンカーと一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域とを含むCARを含むポリペプチドであって、ねじれリンカーが1～12個のアラニン残基を含む、ポリペプチドに関する。

本開示の局面は、CARの膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間にねじれリンカーを導入する工程を含む、CARを作製する方法であって、ねじれリンカーが1～12個のアラニン残基を含む、方法に関する。第1の抗原結合領域または抗体に由来するCDRを第2の抗原結合領域または抗体に由来するFRと組み合わせる工程を含む、ハイブリッドscFvと膜貫通ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域とを有するCARを作製する方法であって、第1および第2の抗原結合領域または抗体が、同じ抗原に結合する、方法も、記載される。これらのCARを作製する方法は、これらの設計されたCARのうちの1つまたは複数をコードする核酸を含む細胞を増殖させる工程を含むか、またはさらに含むことができる。いくつかの態様において、CARは、トニックシグナル伝達強度において異なる抗体または抗原結合領域に由来するFRおよびCDRを含む。

本開示のポリペプチドをコードする配列を含む核酸、本開示の核酸を含むベクター、例えば、レンチウイルスベクター、本開示の核酸および/もしくはポリペプチドを含み、かつ/または発現する細胞、ならびに本開示の細胞態様を含む細胞集団も、記載される。さらなる態様は、本開示のポリペプチド、核酸、細胞、および細胞集団を含む、組成物および薬学的に許容される製剤に関する。本開示の核酸を細胞に導入する工程を含む、ポリペプチドを発現する細胞を作製する方法も、提供される。本開示の方法によって作製された細胞、ポリペプチド、およびCARも、記載される。さらなる局面は、有効量の本開示の組成物を患者に投与する工程を含む、がんを有する患者を処置する方法に関する。

さらなる局面は、第1の抗原結合領域または抗体に由来するCDRを第2の抗原結合領域または抗体に由来するFRと組み合わせることを含む、ハイブリッドscFvと膜貫通ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域とを有するCARを提供する工程であって、第1および第2の抗原結合領域または抗体が、同じ抗原に結合する、工程；ならびにCARの機能を評価するか、決定するか、または測定する工程を含む、CARをスクリーニングする方法に関する。

いくつかの態様において、CARの機能を評価するか、決定するか、または測定する工程は、CARのトニックシグナル伝達強度の評価を含む。いくつかの態様において、トニックシグナル伝達強度を評価するか、決定するか、または測定する工程は、CDV希釈アッセイおよび/または活性化マーカーについての抗体染色による発現評価を含む。いくつかの態様において、CARの機能を評価するか、決定するか、または測定する工程は、腫瘍死滅効力、腫瘍クリアランス効力、インビボ生存率、インビボ腫瘍クリアランス、インビボ腫瘍量低下のうちの1つまたは複数の決定を含む。いくつかの態様において、方法は、第1の抗原結合領域または抗体に由来するCDRを第2の抗原結合領域または抗体に由来するFRと組み合わせることを含む、ハイブリッドscFvを含むCARを作製する工程を含むか、またはさらに含むことができ、ここで、第1および第2の抗原結合領域または抗体は、同じ抗原に結合する。

いくつかの態様において、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:141の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:140の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:144の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:143の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

「単鎖Fv」または「scFv」抗体断片は、抗体のVHドメインおよびVLドメインの少なくとも一部分、例えば、各々のCDRを含み、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖内に存在する。scFvは、いくつかの態様において、重鎖可変領域のCDR1、CDR2、および/またはCDR3、ならびに軽鎖可変領域のCDR1、CDR2、および/またはCDR3を含むことが企図される。CDR1、CDR2、またはCDR3は、それぞれ、CDR1、CDR2、またはCDR3として本明細書に提供されるSEQ ID NOに記載される配列を含むか、またはそれからなっていてよいことが、さらに企図される。CDRは、特定のCDR配列の片側または両側に隣接する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、16、18、19、20、21、22、23個、またはそれ以上（またはその中の任意の導き出せる範囲）の連続したアミノ酸残基を含んでもよく；したがって、特定のCDR配列、例えば、SEQ ID NO:9～14、23、24、25、110～115、および126～131に示されるもののN末端またはC末端に、1個または複数個の付加的なアミノ酸が、存在してよい。scFvは、いくつかの態様において、重鎖可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、および/またはHFR4、ならびに軽鎖可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、および/またはLFR4を含むことが、さらに企図される。FRは、CDRに隣接する領域である。例えば、scFvは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、HFR1、HCDR1、HFR2、HCDR2、HFR3、HCDR3、およびHFR4を含む重鎖可変領域を含み得る。同様に、scFvは、アミノ末端からカルボキシ末端へ、LFR1、LCDR1、LFR2、LCDR2、LFR3、LCDR3、およびLFR4を含む軽鎖可変領域を含み得る。HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR2、またはLFR4は、それぞれ、HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、LFR1、LFR2、LFR2、またはLFR4として本明細書に提供されるSEQ ID NOに記載される配列を含むか、またはそれからなっていてよいことが、さらに企図される。FRは、特定のFR配列の片側または両側に隣接する1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、16、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個、またはそれ以上（またはその中の任意の導き出せる範囲）の連続したアミノ酸残基を含んでもよく；したがって、特定のFR配列、例えば、SEQ ID NO:15～22、26～31、116～123、および132～139に示されるもののN末端またはC末端に、1つまたは複数の付加的なアミノ酸が存在してよい。

いくつかの態様において、LFR1は、SEQ ID NO:29と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LFR2は、SEQ ID NO:30と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LFR3は、SEQ ID NO:31と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LFR4は、SEQ ID NO:22と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LCDR1は、SEQ ID NO:12と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LCDR2は、SEQ ID NO:13と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LCDR3は、SEQ ID NO:14と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HFR1は、SEQ ID NO:26と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HFR2は、SEQ ID NO:27と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、HFR3は、SEQ ID NO:28と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HFR4は、SEQ ID NO:18と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HCDR1は、SEQ ID NO:9と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HCDR2は、SEQ ID NO:10と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HCDR3は、SEQ ID NO:11と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/またはLCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:29、30、31、22、12、13、および14のアミノ酸配列を含み、HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/またはHCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:26、27、28、18、9、10、および11のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/またはLCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:19、20、21、22、24、13、および25のアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/またはHCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:15、16、17、18、9、10、および23のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、VLはSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含み、VHはSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、VLはSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含み、VHはSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、LFR1は、SEQ ID NO:19と、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、正確に60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LFR2は、SEQ ID NO:20と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LFR3は、SEQ ID NO:21と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LFR4は、SEQ ID NO:22と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LCDR1は、SEQ ID NO:24と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LCDR2は、SEQ ID NO:13と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LCDR3は、SEQ ID NO:25と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HFR1は、SEQ ID NO:15と、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HFR2は、SEQ ID NO:16と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HFR3は、SEQ ID NO:17と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、HFR4は、SEQ ID NO:18と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HCDR1は、SEQ ID NO:9と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HCDR2は、SEQ ID NO:10と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HCDR3は、SEQ ID NO:23と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:5と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、SEQ ID NO:6と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:5と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、SEQ ID NO:6と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:7と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、SEQ ID NO:8と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:7と、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、SEQ ID NO:8と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、LFR1は、SEQ ID NO:136と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LFR2は、SEQ ID NO:137と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LFR3は、SEQ ID NO:138と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LFR4は、SEQ ID NO:139と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LCDR1は、SEQ ID NO:113と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LCDR2は、SEQ ID NO:114と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LCDR3は、SEQ ID NO:115と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HFR1は、SEQ ID NO:132と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HFR2は、SEQ ID NO:133と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HFR3は、SEQ ID NO:134と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HFR4は、SEQ ID NO:135と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HCDR1は、SEQ ID NO:110と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸
配列を含む。いくつかの態様において、HCDR2は、SEQ ID NO:111と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HCDR3は、SEQ ID NO:112と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、LFR1は、SEQ ID NO:120と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LFR2は、SEQ ID NO:121と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LFR3は、SEQ ID NO:122と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LFR4は、SEQ ID NO:123と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LCDR1は、SEQ ID NO:129と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LCDR2は、SEQ ID NO:130と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LCDR3は、SEQ ID NO:131と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HFR1は、SEQ ID NO:116と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HFR2は、SEQ ID NO:117と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HFR3は、SEQ ID NO:118と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HFR4は、SEQ ID NO:119と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HCDR1は、SEQ ID NO:126と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸
配列を含む。いくつかの態様において、HCDR2は、SEQ ID NO:127と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、HCDR3は、SEQ ID NO:128と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/またはLCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:136、137、138、139、113、114、および115のアミノ酸配列を含み、HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/またはHCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:132、133、134、135、110、111、および112のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/またはLCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:120、121、122、123、129、130、および131のアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/またはHCDR3は、それぞれ、SEQ ID NO:116、117、118、119、126、127、および128のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、VLはSEQ ID NO:141のアミノ酸配列を含み、VHはSEQ ID NO:140のアミノ酸配列を含む。さらなる態様において、VLはSEQ ID NO:144のアミノ酸配列を含み、VHはSEQ ID NO:143のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:141と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、SEQ ID NO:140と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:141と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、SEQ ID NO:140と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:144と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、SEQ ID NO:143と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、軽鎖可変領域は、SEQ ID NO:144と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域は、SEQ ID NO:143と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3は、SEQ ID NO:5の可変領域に由来するLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3のアミノ酸配列を含み、かつ/またはHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3は、SEQ ID NO:5の可変領域に由来するHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3は、SEQ ID NO:7の可変領域に由来するLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3のアミノ酸配列を含み、かつ/またはHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3は、SEQ ID NO:8の可変領域に由来するHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3は、SEQ ID NO:141の可変領域に由来するLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3のアミノ酸配列を含み、かつ/またはHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3は、SEQ ID NO:140の可変領域に由来するHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様において、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3は、SEQ ID NO:144の可変領域に由来するLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3のアミノ酸配列を含み、かつ/またはHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3は、SEQ ID NO:143の可変領域に由来するHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3のアミノ酸配列を含む。

本開示のscFvは、ハイブリッドscFvであり得る。ハイブリッドという用語は、ある抗原結合領域または抗体、例えば、scFv、抗体、ナノボディの抗原結合領域、またはその他の抗体由来抗原結合断片に由来するLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、HFR1、HFR2、HFR3、およびHFR4を有し、かつ異なる抗原結合領域または抗体、例えば、scFv、抗体、ナノボディの抗原結合領域、またはその他の抗体由来抗原結合断片に由来するLCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3を有するscFvをさす。ハイブリッドscFvにおいて、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、HFR1、HFR2、HFR3、およびHFR4は、第1の抗原結合領域に由来し、LCDR1、LCDR2、LCDR3、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3は、第2の抗原結合領域に由来する。したがって、ある抗原結合分子のCDR領域が、対応する順序で、もう1つの抗原結合分子のFR上に移植される。これは、ある抗体のVH領域およびVL領域のFRと、もう1つの抗体のVH領域およびVL領域のCDRとの組み合わせを証明する本明細書中の態様によってさらに例示される。CDRおよびFRは、直接、抗体に由来しなくてもよく、VH領域およびVL領域を含む任意の抗原結合断片、例えば、もう1つのscFv、ナノボディ、TCR、および当技術分野において公知の、本明細書に記載されるその他の抗原結合領域に由来してもよい。ハイブリッドは、ハイブリッドCARのFRまたはCDRに、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、もしくは17個、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、もしくは17個、または少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、もしくは17個（またはその中の任意の導き出せる範囲）の置換をさらに含んでもよい。本開示のハイブリッドscFvは、同じ抗原に結合する2つの異なる抗原結合領域または抗体のハイブリッドである。いくつかの態様において、2つの異なる抗原結合領域または抗体は、同じ抗原上の異なるエピトープに結合する。いくつかの態様において、2つの異なる抗原結合領域または抗体は、同じ抗原上の重複するエピトープに結合する。いくつかの態様において、2つの異なる抗原結合領域または抗体は、抗原上の同じエピトープに結合する。ハイブリッドscFvは、同じ種に由来する2つの異なる抗原結合領域または抗体のハイブリッドであってもよい。いくつかの態様において、CDRは、ヒト抗体に由来する抗原結合領域または抗体に由来し、FRも、ヒト抗体に由来する抗原結合領域または抗体に由来する。いくつかの態様において、CDRは、非ヒト抗体に由来する抗原結合領域または抗体に由来し、FRも、非ヒト抗体に由来する抗原結合領域または抗体に由来する。いくつかの態様において、CDRは、マウス抗体に由来する抗原結合領域または抗体に由来し、FRも、マウス抗体に由来する抗原結合領域または抗体に由来する。1つの態様において、CDRは、ヒトのまたはヒト化された抗体または抗原結合領域に由来する抗原結合領域または抗体に由来し、FRは、非ヒト、例えば、マウスに由来する抗原結合領域または抗体に由来する。いくつかの態様において、ハイブリッドscFvは、低下した、低い、または有意でない免疫原性を有することが決定された抗原結合領域または抗体に由来する。いくつかの態様において、ハイブリッドscFvは、ヒトにおいて使用するために承認された抗原結合領域または抗体に由来する。いくつかの態様において、本開示のハイブリッドscFvは、ヒト化scFvを除外する。抗原結合領域または抗体の他の適当な起源には、ヤギ、ラット、ウマ、ウサギ、哺乳動物、および非ヒト霊長類が含まれる。いくつかの態様において、CDRおよび/またはFRは、ヒトにおいて、非免疫原性であるか、または免疫原性が低下している。いくつかの態様において、ハイブリッドscFv、および/またはハイブリッドscFvを含むポリペプチドの、ヒトにおける免疫原性の可能性は、非ハイブリッドscFv、および/または非ハイブリッドscFvを含むポリペプチドと、統計的に異ならない。非ハイブリッドscFvは、ハイブリッドscFvのCDRの起源として役立つscFvもしくは抗原結合領域であってもよいし、または非ハイブリッドscFvは、ハイブリッドscFvのFRの起源として役立つscFvもしくは抗原結合領域であってもよい。ハイブリッドscFvのCDRは、そのCDRが由来する抗体または抗原結合領域のCDRと比べて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30個、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30個、または多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30個（またはその中の任意の導き出せる範囲）の置換、欠失、または付加を含み得る。ハイブリッドscFvのFRは、そのFRが由来する抗体または抗原結合領域のFRと比べて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30個、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30個、または多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30個（またはその中の任意の導き出せる範囲）の置換、欠失、または付加を含み得る。

いくつかの態様において、ある抗体または抗原結合領域に由来するFRと、異なる抗体または抗原結合領域に由来するCDRとから構成されるポリペプチドが存在し、ここで、差異は、配列によるものであり、異なるエピトープおよび/または抗原を認識し/それに結合することによるものではない。FRおよびCDRは、異なるトニックシグナル伝達強度を有する抗原結合領域または抗体に由来し得る。いくつかの態様において、FRは、CDRが由来する抗原結合領域または抗体より高いトニックシグナル伝達強度を有する抗原結合領域または抗体に由来する。いくつかの態様において、CDRは、FRが由来する抗原結合領域または抗体より高いトニックシグナル伝達強度を有する抗原結合領域または抗体に由来する。「トニックシグナル伝達強度」または「トニックシグナル伝達」という用語は、本明細書において使用される時、抗原刺激の非存在下でのCARシグナル伝達の刺激のレベルをさす。トニックシグナル伝達は、（実施例3に記載される）CTV希釈アッセイ、ならびに/または（実施例3に記載される）活性化マーカー、例えば、CD137および/もしくはCTLA-4についての抗体染色による抗原非依存的活性化マーカー発現の評価によって決定され得る。いくつかの態様において、CTV希釈アッセイにおける蛍光強度中央値（MFI）は、ハイブリッドscFvと比較して、ハイブリッドscFvのFRまたはCDRと同じ抗原結合領域または抗体に由来する非ハイブリッドscFvを有する細胞において、少なくとも1.5、2、2.5、3、3.5、4、もしくは5倍（またはその中の任意の導き出せる範囲）高い。いくつかの態様において、CD137+発現は、FRまたはCDRと同じ抗原結合領域または抗体に由来する非ハイブリッドscFvと比較して、ハイブリッドscFvを有する細胞において、少なくとも2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50倍（またはその中の任意の導き出せる範囲）高い。いくつかの態様において、CTLA-4+発現は、FRまたはCDRと同じ抗原結合領域または抗体に由来する非ハイブリッドscFvと比較して、ハイブリッドscFvを有する細胞において、少なくとも2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、または50倍（またはその中の任意の導き出せる範囲）高い。さらに、ハイブリッドscFvは、異なるトニックシグナル伝達強度を有するCDRおよびFRを含み得る。例えば、CDRは、FRが由来するCARと比較して、CTV希釈アッセイにおいて、少なくとも1.5、2、2.5、3、3.5、4、もしくは5倍（またはその中の任意の導き出せる範囲）のMFIを示すCARに由来し得る。いくつかの態様において、CDRは、CDRが由来するCARと比較して、CTV希釈アッセイにおいて、少なくとも1.5、2、2.5、3、3.5、4、または5倍（またはその中の任意の導き出せる範囲）のMFIを示すCARに由来し得る。いくつかの態様において、CDRは、CDRが由来するCARと比較して、少なくとも2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50倍（またはその中の任意の導き出せる範囲）高いCD137+発現を示すCARに由来し得る。いくつかの態様において、FRは、FRが由来するCARと比較して、少なくとも2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50倍（またはその中の任意の導き出せる範囲）高いCD137+発現を示すCARに由来し得る。いくつかの態様において、CDRは、CDRが由来するCARと比較して、少なくとも2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50倍（またはその中の任意の導き出せる範囲）高いCTLA4+発現を示すCARに由来し得る。いくつかの態様において、FRは、FRが由来するCARと比較して、少なくとも2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50倍（またはその中の任意の導き出せる範囲）高いCTLA4+発現を示すCARに由来し得る。いくつかの態様において、CDRは、CDRが由来するCARと比較して、少なくとも2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50倍（またはその中の任意の導き出せる範囲）高い活性化マーカー発現を示すCARに由来し得る。いくつかの態様において、FRは、FRが由来するCARと比較して、少なくとも2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50倍（またはその中の任意の導き出せる範囲）高い活性化マーカー発現を示すCARに由来し得る。ポリペプチドは、ハイブリッドscFvのFRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来する非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍死滅活性を有し、かつ/またはハイブリッドscFvのCDRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来する非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍死滅活性を有することがさらに明確化されたものであり得る。例えば、ハイブリッドscFvを含むCAR T細胞は、少なくとも10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30日間の共培養後に、FRまたはCDRと同じ抗原結合領域または抗体に由来する非ハイブリッドscFvより、少なくとも有意に低い、または少なくとも2、3、4、もしくは5倍低い標的細胞倍率変化を示し得る。いくつかの態様において、ポリペプチドは、ハイブリッドscFvのFRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来する非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍細胞クリアランス活性を有し、かつ/またはポリペプチドは、ハイブリッドscFvのCDRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来する非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍死滅活性を有する。例えば、ハイブリッドscFvを含むCAR T細胞は、T細胞注射の少なくとも20、40、60、80、100、120、140、160、または180日後に、FRまたはCDRと同じ抗原結合領域または抗体に由来する非ハイブリッドscFvより（標識された細胞の平均放射輝度の減少によって示されるように）少なくとも有意に多い、または少なくとも2、3、4、5、10、20、50、100、500、もしくは1000倍多い腫瘍細胞クリアランスフォールドチェンジを示し得る。いくつかの態様において、ハイブリッドCARのCDRまたはFRは、有意な腫瘍死滅活性、腫瘍細胞クリアランス、または陰性対照と比べたインビボ腫瘍クリアランスもしくは生存率の増加によって見られるインビボ効力を有しないことが証明されたCARの非ハイブリッドscFvに由来する。

いくつかの態様において、ポリペプチドは、VHとVLとの間にリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは、4～40アミノ酸長である。いくつかの態様において、リンカーは、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50アミノ酸残基長、少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50アミノ酸残基長、多くとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50アミノ酸残基長、または約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50アミノ酸残基長（またはその中の任意の導き出せる範囲）である。いくつかの態様において、リンカーは、少なくとも4個のグリシン残基および/またはセリン残基を含む。いくつかの態様において、リンカーは、少なくとも4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50個（またはその中の任意の導き出せる範囲）のグリシン残基および/またはセリン残基を含む。いくつかの態様において、リンカーは、(GGGGS)_nを含み、ここで、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10（またはその中の任意の導き出せる範囲）である。いくつかの態様において、リンカーは、GSTSGGGSGGGSGGGGSS（SEQ ID NO:32）、またはSEQ ID NO:32と少なくとも80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（もしくはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列：(EAAAK)_nを含むか、または(EAAAK)_nからなり、ここで、nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10（またはその中の任意の導き出せる範囲）である。いくつかの態様において、リンカーは、GGGGSを含む。いくつかの態様において、リンカーは、(GGGGS)₄である。

いくつかの態様において、VHは、VLに対してアミノ近位である。いくつかの態様において、VHは、VLに対してカルボキシ近位である。第1の領域が第2の領域のカルボキシ末端に付着している時、その第1の領域は、その第2の領域に対してカルボキシ近位である。第1の領域と第2の領域との間に、さらなる介在アミノ酸残基が存在してもよい。したがって、領域は、介在アミノ酸残基を有しないと特記されない限り、直接隣接している必要はない。「アミノ近位」という用語は、第1の領域が第2の領域のアミノ末端に付着している時、その第1の領域は、その第2の領域に対してアミノ近位であるものとして、同様に定義される。同様に、他のことが明記されない限り、第1の領域と第2の領域との間に、さらなる介在アミノ酸残基が存在してもよい。

いくつかの態様において、ポリペプチドは、scFvと膜貫通ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域とを含むキメラ抗原受容体（CAR）を含む。いくつかの態様において、本明細書に記述されるCAR分子は、1つまたは複数の標的分子に結合する細胞外ドメイン、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含有する細胞質領域、および細胞外ドメインと細胞質ドメインとの間の膜貫通領域という、CAR分子の3つの主要な領域を有する。いくつかのCAR分子は、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間にあるスペーサーを有する。さらに、CAR分子には、1つまたは複数の領域の間または内部、例えば、細胞外ドメイン内の異なる結合領域の間、または結合領域の内部、例えば、軽鎖の可変領域（VH）と重鎖の可変領域（VL）との間に、1つまたは複数のリンカーが含まれてもよい。特定の領域に関する任意の態様は、本明細書に開示される任意の他の特定の領域に関して実施され得る。これらの領域のうちの任意のものは、その機能に応じて、もう1つの領域のN末端側またはC末端側のいずれかに直接隣接していてもよいが、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99個、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99個、または多くとも、少なくとも、もしくは多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、もしくは99個（またはその中の任意の導き出せる範囲）のアミノ酸が、連続した領域の間に介在していてよいことも企図される。いくつかの態様において、ポリペプチドは、単一の膜貫通ドメイン、および/または一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む単一の細胞質領域を含む。いくつかの態様において、ポリペプチドは、アミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、scFvと膜貫通ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域とを含む。いくつかの態様において、CARは単一特異性である。いくつかの態様において、CARは二重特異性である。いくつかの態様において、CARは、膜貫通ドメインとscFvとの間に細胞外スペーサーをさらに含む。いくつかの態様において、細胞外スペーサーは、8～1000アミノ酸長である。いくつかの態様において、細胞外スペーサーは、8～500アミノ酸長である。いくつかの態様において、細胞外スペーサーは、100～300アミノ酸長である。いくつかの態様において、細胞外スペーサーは、100個未満のアミノ酸を有する。いくつかの態様において、細胞外スペーサーは、少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、もしくは500アミノ酸、多くとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、もしくは500アミノ酸、正確に8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、
97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、もしくは500アミノ酸、または約8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、もしくは500アミノ酸（またはその中の任意の導き出せる範囲）である。いくつかの態様において、細胞外スペーサーは、IgG4ヒンジ、CD8αヒンジ、IgG1ヒンジ、CD34ヒンジ、もしくはそれらの断片であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、細胞外スペーサーは、IgG4ヒンジまたはその断片を含む。いくつかの態様において、細胞外スペーサーは、CH1領域、CH2領域、および/もしくはCH3領域を含むか、またはさらに含む。いくつかの態様において、スペーサーは、IgG4ヒンジポリペプチド、CH2領域、およびCH3領域を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、CH2領域は、L235E置換および/またはN297Q置換を含む。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:36と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:36と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む。

いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、T細胞受容体のα鎖もしくはβ鎖、CD28、CD3ε（イプシロン）、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137、またはCD154の膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、CD28膜貫通ドメインを含むか、またはCD28膜貫通ドメインであるか、またはCD28膜貫通ドメインに由来する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:37と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、SEQ ID NO:37と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む。

いくつかの態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζであるか、またはCD3ζを含むか、またはCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインに由来する。いくつかの態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:39と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む。いくつかの態様において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:39と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む。

いくつかの態様において、細胞質領域は、1つまたは複数の共刺激ドメインをさらに含む。いくつかの態様において、細胞質領域は、2つの共刺激ドメインを含む。いくつかの態様において、1つまたは複数の共刺激ドメインは、4-1BB（CD137）、CD28、IL-15Rα、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、および/またはICOS（CD278）のうちの1つまたは複数に由来する共刺激ドメインを含む。いくつかの態様において、1つまたは複数の共刺激ドメインは、CD28由来の共刺激ドメインを含む。いくつかの態様において、共刺激ドメインは、SEQ ID NO:38と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む。いくつかの態様において、共刺激ドメインは、SEQ ID NO:38と、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、少なくとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、多くとも60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、または約60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む。

いくつかの態様において、ポリペプチドは、膜貫通ドメインと細胞質領域との間にねじれリンカーをさらに含む。いくつかの態様において、ねじれリンカーは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個（もしくはその中の任意の導き出せる範囲）のアミノ酸残基を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、アミノ酸残基は、アラニン残基を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ねじれリンカーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個（またはその中の任意の導き出せる範囲）のアラニン残基を含む。いくつかの態様において、ねじれリンカーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個（またはその中の任意の導き出せる範囲）の連続アラニン残基を含む。いくつかの態様において、ねじれリンカーは、2個または4個のアラニン残基からなる。いくつかの態様において、ねじれリンカーは、2個のアラニン残基を含む。いくつかの態様において、ねじれリンカーは、3個のアラニン残基を含む。いくつかの態様において、ねじれリンカーは、4個のアラニン残基を含む。いくつかの態様において、ねじれリンカーは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10個（またはその中の任意の導き出せる範囲）の連続アラニン残基を含む。いくつかの態様において、ねじれリンカーは、2個のアラニン残基からなる。

いくつかの態様において、scFvは、抗CD20 scFvを含む。いくつかの態様において、scFvは、抗GD2 scFvを含む。いくつかの態様において、scFvは、抗BCMA、抗CD123、抗CD138、抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗CD38、抗CD5、抗Igκ鎖、抗LeY、抗NKG2D、抗ROR1、抗WT1、抗C-Met、抗CAIX、抗CD133、抗CD171、抗CD70、抗CEA、抗EGFR、抗EGFRvIII、抗Ep-CAM、抗EphA2、抗FAP、抗GD2、抗GPC3、抗Her2、抗HPV16-E6、抗IL13Ra2、抗MAGEA3、抗MAGEA4、抗MART1、抗メソスリン（Mesothlin）、抗MUC1、抗MUC6、抗NY-ESO-1、抗PD-L1、抗PSCA、抗PSMA、抗ROR1、または抗VEGFR2のscFvを含む。

本明細書に開示されるポリペプチドをコードする配列およびその一部分を含む核酸が、態様において提供される。核酸は、RNAまたはDNAを含み得る。ある特定の態様において、核酸は発現構築物である。いくつかの態様において、発現構築物はベクターである。ある特定の態様において、ベクターはウイルスベクターである。ウイルスベクターは、ある特定の態様において、レトロウイルスベクターであるか、またはレトロウイルスに由来する。いくつかの態様において、レトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターを含むか、またはレンチウイルスに由来する。ウイルスベクターは、ある特定の態様において、組み込み核酸であることに注意されたい。さらに、核酸は、CARをコードする核酸（例えば、ガイドRNA）が、ゲノムの特定の遺伝子座、例えば、TRAC遺伝子にCARコード配列を組み込むために使用されるような、遺伝子編集に関与する分子であってもよい。これは、いくつかの態様において、遺伝子編集系、例えば、CRISPR/Cas9を含む。核酸、ポリヌクレオチド、もしくはポリヌクレオチド領域（またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域）は、もう1つの配列と、ある特定のパーセンテージ（例えば、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、もしくは99％、またはその中の任意の導き出せる範囲）の「配列同一性」または「相同性」を有し、すなわち、整列化された時、2つの配列の比較において、そのパーセンテージの塩基（またはアミノ酸）が同じである。この整列化および相同性または配列同一性のパーセントは、当技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば、Ausubel et al.eds.(2007)Current Protocols in Molecular Biologyに記載されているものを使用して決定され得る。核酸は、本明細書に提供される任意の核酸SEQ ID NOと、そのような配列同一性または相同性を有し得ることが企図される。

他の態様において、本明細書に記述される任意のポリペプチドの全部または一部をコードする核酸を含む細胞または細胞集団が存在する。ある特定の態様において、細胞または細胞集団は、本明細書に記載されるポリペプチドのうちの任意のものをコードする配列を、そのゲノム内に含有する。これには、細胞のゲノムに組み込まれたレンチウイルスまたはレトロウイルスが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、細胞または細胞集団は、本明細書に記述される任意のCAR、例えば、以下に限定されないが、SEQ ID NO:1～144のいずれかのアミノ酸配列を有するものの全部または一部を発現する。ポリペプチドをコードする核酸が導入された細胞の子孫（F1、F2、およびそれ以降）は、本明細書に開示される細胞または細胞集団に含まれる。いくつかの態様において、細胞または細胞集団は、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT）、インバリアントナチュラルキラーT細胞（iNKT）、幹細胞、リンパ球前駆細胞、末梢血単核細胞（PBMC）、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞（HSPC）、造血幹細胞（HSC）、CD34+細胞、末梢血幹細胞（PBSC）、骨髄細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、臍帯血細胞、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）である。具体的な態様は、T細胞またはNK細胞である細胞に関する。いくつかの態様において、T細胞は、ナイーブメモリーT細胞を含む。いくつかの態様において、ナイーブメモリーT細胞は、CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の両方を含む細胞集団である。いくつかの態様において、細胞は、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞を含むナイーブメモリーT細胞を含む細胞集団である。いくつかの態様において、T細胞は、CD14枯渇、CD25枯渇、かつ/またはCD62L濃縮のPBMCの集団に由来するT細胞を含む。

いくつかの局面において、本開示は、本明細書に記載された1つまたは複数のポリペプチドを含む細胞に関する。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞である。いくつかの態様において、細胞は、前駆細胞または幹細胞である。いくつかの態様において、前駆細胞または幹細胞は、インビトロで、免疫細胞に分化する。いくつかの態様において、細胞はT細胞である。いくつかの態様において、細胞は、CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞である。いくつかの態様において、細胞は、ナチュラルキラー細胞である。いくつかの態様において、細胞はエクスビボである。免疫細胞という用語には、感染性疾患および異物の両方に対する身体の防御に関与する免疫系の細胞が含まれる。免疫細胞には、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、ナチュラルキラー細胞、リンパ球、例えば、B細胞およびT細胞、ならびに単球が含まれ得る。T細胞には、例えば、CD4+、CD8+、Tヘルパー細胞、細胞傷害性T細胞、γδT細胞、制御性T細胞、サプレッサーT細胞、およびナチュラルキラーT細胞が含まれ得る。具体的な態様において、T細胞は、制御性T細胞である。

いくつかの態様において、細胞集団は、10³～10⁸個の細胞を含む。いくつかの態様において、集団は、約10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²個、少なくとも約10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²個、または多くとも約10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰、10¹¹、10¹²個（またはその中の任意の導き出せる範囲）の細胞である。ある特定の態様において、細胞は、それらを受容する患者に対して自己である。他の態様において、細胞は、自己ではなく、同種異系であってもよい。

本開示のいくつかの態様において、方法局面は、本開示のポリペプチドをコードするウイルスを細胞に感染させるものに関する。いくつかの態様において、ウイルスには、レンチウイルス、またはレンチウイルス由来のウイルスもしくはベクターが含まれる。いくつかの態様において、細胞は、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT）、インバリアントナチュラルキラーT細胞（iNKT）、幹細胞、リンパ球前駆細胞、末梢血単核細胞（PBMC）、骨髄細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、臍帯血細胞、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）である。いくつかの態様において、細胞は、T細胞またはNK細胞である。いくつかの態様において、T細胞は、ナイーブメモリーT細胞を含む。いくつかの態様において、ナイーブメモリーT細胞は、CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は、まだT細胞またはNK細胞ではなく、方法は、T細胞またはNK細胞への細胞の分化を促進する条件下で細胞を培養する工程をさらに含む。

いくつかの態様において、方法は、核酸の細胞への導入の前およびまたは後に、細胞を増大させる条件下で細胞を培養する工程をさらに含む。いくつかの態様において、細胞は、無血清培地によって培養される。

付加的な方法は、本開示のポリペプチドを発現する細胞集団を含む組成物を、有効量、患者に投与する工程を含む、がんを有する患者の処置に関する。いくつかの態様において、患者は、再発した、または再発性のがんを有する。さらなる態様は、付加的な治療法を患者に施す工程を含む。いくつかの態様において、患者は、がんに対する処置を以前に受けたことがある。いくつかの態様において、患者は、以前の処置に対して抵抗性であると決定されている。以前の処置は、本明細書に記載されるがん治療薬、例えば、付加的な治療法として記載されるものであり得る。さらなる態様は、化学療法および/または放射線を患者に施す工程を含む。いくつかの態様において、付加的な治療法には、免疫療法が含まれる。いくつかの態様において、付加的な治療法には、本明細書に記載される付加的な治療法が含まれる。いくつかの態様において、免疫療法には、免疫チェックポイント阻害剤療法が含まれる。いくつかの態様において、免疫療法には、本明細書に記載される免疫療法が含まれる。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤療法には、PD-1阻害剤および/またはCTLA-4阻害剤が含まれる。いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤療法には、本明細書に記載される1つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質の、1つまたは複数の阻害剤が含まれる。

いくつかの態様において、がんには、CD20+がんが含まれ、ここで、CD20+がんは、CD20+細胞を含むか、または腫瘍細胞の集団内に少なくとも0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、もしくは90％のCD20+がん細胞を含むものである。いくつかの態様において、がんには、黒色腫が含まれる。本開示のCARポリペプチドは、本明細書に記載されるアミノ酸配列の全部または一部分と、少なくとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、多くとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％、または正確に50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、その領域、ドメイン、リンカー、スペーサー、またはその他の一部分を有し得る。ある特定の態様において、CARポリペプチドは、SEQ ID NO:1～144のいずれかと、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、少なくとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、多くとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％、または正確に50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。

がんは、リンパ腫または神経芽細胞腫であり得る。CARがCD20 CARを含む態様において、標的とされるがんは、リンパ腫であり得る。CARがGD2 CARを含む態様において、標的とされるがんは、神経芽細胞腫であり得る。本開示の方法において処置され得るがんには、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮のがんも含まれ得る。さらに、がんは、具体的には、以下の組織学的タイプのものであり得るが、これらに限定されない：悪性新生物；がん腫；未分化がん腫；巨大細胞紡錘細胞がん；小細胞がん；乳頭状がん；扁平上皮がん；リンパ上皮がん；基底細胞がん；石灰化上皮腫（pilomatrix carcinoma）；移行上皮がん；乳頭状移行上皮がん；腺がん；悪性ガストリン産生腫瘍；胆管細胞がん；肝細胞がん；肝細胞がんと胆管細胞がんの混合型（combined hepatocellular carcinoma and cholangiocarcinoma）；索状腺がん；腺様嚢胞がん；腺腫性ポリープの腺がん；腺がん、家族性大腸ポリポーシス；固形がん；悪性カルチノイド腫瘍；細気管支肺胞腺がん；乳頭状腺がん；嫌色素性がん；好酸球がん；好酸性腺がん；好塩基球がん；明細胞腺がん；顆粒細胞がん；濾胞性腺がん；乳頭状腺がんと濾胞性腺がんの混合型（papillary and follicular adenocarcinoma）；非被包性硬化性がん；副腎皮質がん；子宮内膜がん；皮膚付属器がん；アポクリン腺がん；皮脂腺がん；耳道腺がん；粘表皮がん；嚢胞腺がん；乳頭状嚢胞腺がん；乳頭状漿液性嚢胞腺がん；粘液性嚢胞腺がん；粘液性腺がん；印環細胞がん；浸潤性乳管がん；髄様がん；小葉がん；炎症性がん；乳房パジェット病；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；扁平上皮化生を伴う腺がん；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性莢膜細胞腫；悪性顆粒膜細胞腫；悪性アンドロブラストーマ；セルトリ細胞がん；悪性ライディッヒ細胞腫；ステロイド産生腫瘍（lipid cell tumor）；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽細胞腫；がん肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胎生期がん；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛がん；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管周囲細胞腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；皮質近接部骨原性肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉系軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮歯牙腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起神経膠芽細胞腫；未分化神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅覚神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；傍肉芽腫；悪性小リンパ球性リンパ腫；悪性大細胞型びまん性リンパ腫；悪性濾胞性リンパ腫；菌状息肉症；その他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；および有毛細胞性白血病。

ある特定の態様において、本開示全体を通して記載されるポリペプチドは、単離されており、すなわち、細胞環境には見出されない。いくつかの場合において、それらは、精製されており、すなわち、異なるアミノ酸配列および/または化学式を有するポリペプチドから、完全にではないとしても、大部分が、分離されている。

本開示は、いくつかの態様において、キメラポリペプチド、またはキメラポリペプチドをコードする核酸を含む、細胞集団または薬学的組成物を、有効量、対象に投与する工程を含む、がんを有する対象を処置する方法を提供する。

1つまたは複数の配列または組成物の使用は、本明細書に記載される方法のうちの任意のものに基づき、利用され得る。他の態様が、本願全体を通して記述される。本開示のある局面に関して記述された任意の態様が、本開示の他の局面にも同様に適用され、逆もまた同様である。例えば、本明細書に記載される方法の任意の工程が、任意の他の方法に適用され得る。さらに、本明細書に記載される任意の方法は、任意の工程または工程の組み合わせの除外を有し得る。実施例セクションの態様は、本明細書に記載されるテクノロジーのすべての局面に適用可能な態様であると理解される。

本願全体を通して、「約」という用語は、ある値が、その値を決定するために利用される装置または方法の誤差の標準偏差を含むことを示すため、細胞生物学および分子生物学の分野における平易な通常の意味に従って使用される。

「含む」という用語と共に使用される時、「1つの（a）」または「1つの（an）」という単語の使用は、「1」を意味し得るが、「1または複数」、「少なくとも1」、および「1またはそれ以上」の意味とも一致する。

本明細書において使用されるように、「または」および「および/または」という用語は、組み合わせられた、または相互に排他的な、複数の成分を記載するために利用される。例えば、「x、y、および/またはz」とは、単独の「x」、単独の「y」、単独の「z」、「x、y、およびz」、「（xおよびy）またはz」、「xまたは（yおよびz）」、または「xまたはyまたはz」をさし得る。x、y、またはzが、ある態様から具体的に除外され得ることが、具体的に企図される。

「含む（comprising）」（ならびに含む（comprising）の任意の形態、例えば、「含む（comprise）」および「含む（comprises）」）、「有する（having）」（ならびに有する（having）の任意の形態、例えば、「有する（have）」および「有する（has）」）、「含む（including）」（ならびに含む（including）の任意の形態、例えば、「含む（includes）」および「含む（include）」）、「を特徴とする（characterized by）」（ならびに含む（including）の任意の形態、例えば、「であることを特徴とする（characterized as）」）、または「含有する（containing）」（ならびに含有する（containing）の任意の形態、例えば、「含有する（contains）」および「含有する（contain）」）は、包括的または非制限的であり、付加的な列挙されていない要素または方法の工程を除外しない。

組成物およびそれらの使用方法は、本明細書全体を通して開示される成分または工程のうちの任意のもの「を含む」、「から本質的にからなる」、または「からなる」ことができる。「からなる」という語句は、指定されていない要素、工程、または成分を除外する。「から本質的になる」という語句は、記載された主題の範囲を、指定された材料または工程、およびその基本的かつ新規の特徴に実質的に影響しないものに限定する。「含む」という用語によって記載された態様は、「からなる」または「から本質的になる」という用語によっても実施され得ることが企図される。

本発明のある態様に関して記述された任意の限定が、本発明の任意の他の態様にも適用され得ることが具体的に企図される。さらに、本発明の任意の組成物が、本発明の任意の方法において使用され得、本発明の任意の方法が、本発明の任意の組成物を作製するため、または利用するため、使用され得る。実施例に記載される態様の局面は、異なる実施例、または本願の他の場所、例えば、発明の概要、態様の詳細な説明、特許請求の範囲、および図面の説明に記述される態様の状況において実施され得る態様でもある。

本発明の他の目的、特色、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、この詳細な説明から、本発明の本旨および範囲に含まれる様々な変化および修飾が、当業者に明らかになるため、詳細な説明および具体例は、本発明の具体的な態様を示すが、例示として与えられるに過ぎないことを理解されたい。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の局面をさらに証明するために含まれる。本発明は、本明細書に提示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの1つまたは複数を参照することによって、よりよく理解され得る。

図1A～B.（A）様々な抗体に由来するscFvによって構築されたCD20 CARの概略図。すべてのCARが、CD28共刺激ドメインを含有する第2世代受容体であった。（B）CD20 CAR構築において使用されたscFvドメインの配列。図2A～B. リツキシマブ由来CD20 CARは、抗原刺激の非存在下での（A）活性化マーカーおよび消耗マーカーのアップレギュレーションならびに（B）T細胞増殖をもたらす、抗原非依存的なCARシグナル伝達を示す。CD19 CARおよびGD2 CARは、トニックシグナル伝達についての陰性対照および陽性対照として、それぞれ、含まれた。図3. CAR分子の構造回転を引き起こすためのアラニン挿入の概略図。図4. アラニン挿入は、CARトニックシグナル伝達強度を較正する（calibrate）。抗原刺激の非存在下での（A）CellTrace Violoet色素希釈によって定量化されたT細胞増殖、および（B）ELISAによって定量化されたサイトカイン産生は、膜貫通ドメインと細胞質CD28ドメインとの間に挿入された様々な数のアラニン残基を含有するリツキシマブ由来CD20 CARを発現するT細胞における抗原非依存的活性化の変動する程度を示す。図5. 膜貫通CD28ドメインと細胞質CD28ドメインとの間に挿入された2個のアラニン残基を含有するリツキシマブ由来CD20 CARは、優れたインビボ抗腫瘍機能をもたらす。NOD/scid/γ-/-（NSG）マウスに、50万個のホタルルシフェラーゼ発現Rajiリンパ腫細胞を生着させ、腫瘍注射の7日後に、CD20 CARまたは形質導入マーカー（EGFRt）のいずれかを発現する135万個のT細胞によって処置した。7日後に150万個のT細胞を動物に再投与した。この研究において試験されたすべてのCARが、リツキシマブ由来scFv、IgG4ヒンジ-CH2-CH3細胞外スペーサー、CD28膜貫通ドメインおよびCD28細胞質ドメイン、ならびにCD3ζシグナル伝達ドメインを含有した。0～4個のアラニンが、CD28膜貫通ドメインとCD28細胞質ドメインとの間に挿入されていた。腫瘍進行を生物発光イメージングによってモニタリングし、腫瘍注射後の時間の関数として、放射シグナルを示した。2アラニン挿入バリアントは、親（アラニン挿入なし）構築物と比較しても、他のバリアントと比較しても、優れた腫瘍コントロールおよび生存期間中央値の延長を示した。図6A～B.（A）Leu16由来scFvドメイン、リツキシマブ由来scFvドメイン、またはハイブリッドscFvドメインを含有するCD20 CARの概略図。2つのハイブリッドが構築された。RFR-LCDRハイブリッドのみが機能的であった（図7参照）。すべてのCARが、図3に示されるような、CD28共刺激ドメインを含有する第二世代受容体であった。（B）CD20 CAR構築において使用されたscFvドメインの配列。図7A～B. RFR-LCDRハイブリッドCD20 CARは、抗原刺激の非存在下での（A）活性化マーカーおよび消耗マーカーのアップレギュレーションならびに（B）T細胞増殖をもたらす、抗原非依存的なCARシグナル伝達を示す。CD19 CARおよびGD2 CARは、トニックシグナル伝達についての陰性対照および陽性対照として、それぞれ、含まれた。図8. RFR-LCDRハイブリッドCD20 CARは、インビトロで、反復抗原チャレンジ時に、優れた腫瘍細胞死滅を示す。様々なCARまたは形質導入マーカー（EGFRt）を発現するT細胞を、48時間毎に、新鮮なRajiリンパ腫細胞によってチャレンジした。生標的細胞の数を、各再チャレンジの前にフローサイトメトリーによって定量化した。複数のドナーからの結果は、RFR-LCDRハイブリッドCARによる腫瘍細胞死滅が、親構築物（Leu16およびリツキシマブ）のいずれと比較しても優れていることを示している。図9A～C. RFR-LCDRハイブリッドCD20 CARは、インビボで優れた腫瘍クリアランスを示す。NSGマウスに、50万個のホタルルシフェラーゼ発現Rajiリンパ腫細胞を生着させ、図2について記載されたT細胞の2回投与によって処置した。最初のT細胞処置の55日後に、腫瘍細胞の2回目投与によって、動物を再チャレンジした。（A）腫瘍進行を生物発光イメージングによってモニタリングした。（B）生存曲線がカプラン・マイヤー曲線として示される。結果は、ハイブリッドCARが、腫瘍クリアランスおよび長期再発防止において、親CD20 CARおよびCD19 CARの両方より優れていることを示している。（C）最初のT細胞注射の23日後の末梢血中のCAR発現ヒトT細胞の頻度を、フローサイトメトリーによって測定した。CARへの2個のアラニン残基の付加は、リツキシマブベースの受容体を改善し、そのことから、図5に示された以前のデータが確証された。ハイブリッドCARを、2個のアラニンの挿入と組み合わせることによって、アラニン挿入なしのハイブリッドCARと比較して、初期腫瘍クリアランスの速度がさらに加速され、T細胞持続性の有意な増加がもたらされ、そのことから、CAR機能の相乗的改善をもたらすために、scFv改変およびアラニン挿入の戦略を組み合わせることが可能であることが示された。図9Aの説明を参照のこと。図9Aの説明を参照のこと。図10A～F.（A）IgG4スペーサー、CD28膜貫通ドメインおよびCD28細胞質ドメイン、ならびにCD3ζシグナル伝達ドメインと融合した、4つの異なるモノクローナル抗体に由来するscFvから構成される第2世代抗CD20 CARのパネルの概略図。CARは、形質導入マーカーとして使用される短縮型EGFR（EGFRt）と、自己切断T2Aペプチドを介して、さらに融合していた（上）。scFvが由来した4つの抗体のK_D値およびCDR構造ファミリー指定（下）。FRおよびCDRの配列ならびに構造ファミリー指定は、以前に記載されたようにして決定された（Chothia and Lesk,1987；Chothia et al.,1989；Kabat and Wu,1971；Martin and Thornton,1996）。（B～C）NSGマウスに、0.5×10⁶個のホタルルシフェラーゼ発現Raji細胞を静脈内（i.v.）注射し、6日後に、5×10⁶個のCD20標的CAR-T細胞のi.v.送達によって処置した。（B）腫瘍進行を生物発光イメージングによってモニタリングした（各群n＝6マウス）。放射強度スケール上の最小値および最大値は、それぞれ、5×10⁴および1×10⁷である。（C）各試験群についての個々の動物の平均放射輝度（p/sec/cm2/sr）。（D）CD20抗原刺激なしで、ダイナビーズ除去の11日後に、CAR⁺ T細胞上の活性化マーカーおよび消耗マーカーの発現を評価した。データバーは、技術的3回反復の平均値±1標準偏差（S.D.）を示す。結果は、3人の異なる健常ドナーに由来するT細胞を使用した3回の独立した実験の代表である。他のことが注記されない限り、p値は、対応のない両側2標本スチューデントt検定によって決定された。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。（E）2:1のエフェクター対標的（E:T）比での、標的細胞（オンターゲット、CD19⁺/CD20⁺ K562細胞；オフターゲット、親K562細胞）の非存在下または存在下での、CellTrace Violet（CTV）色素によるCAR⁺ T細胞に対する4日間T細胞増殖アッセイ。示されたデータは、5人の異なる健常ドナーからの5回の独立した実験の代表である。（F）CD20抗原刺激なしで、10％dFBSならびに外因性のIL-2およびIL-15が補足されたRPMIにおいて24時間培養されたCD20 CAR-T細胞の代謝速度。データバーは、技術的3回反復の平均値±1 S.D.を示す。結果は、3人の異なる健常ドナーからの3回の独立した実験の代表である。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。図10-1の説明を参照のこと。図11A～E. シグナル伝達ドメインのねじれ再配向は、CAR-T細胞活性を調整する。（A）リツキシマブベースのCARへのアラニン組み込みの概略図。（B）2:1のE:T比での、標的細胞の非存在下または存在下での、CellTrace Violet（CTV）色素による4日間T細胞増殖アッセイ。示されたデータは、3人の異なる健常ドナーからの3回の独立した実験の代表である。（C）CD20抗原刺激なしで、ダイナビーズ除去の7日後に、CAR-T細胞のTNFα産生を測定した。結果は、3人の異なる健常ドナーからの3回の独立した実験の代表である。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。（D、E）NSGマウスに、0.5×10⁶個のホタルルシフェラーゼ発現Raji細胞を静脈内注射し、続いて、6日後（1.35×10⁶細胞）および12日後（1.5×10⁶細胞）にCAR⁺ T細胞を2回投与した。各群n＝6マウス。（D）腫瘍進行を生物発光イメージングによってモニタリングした（上）。個々の動物の平均放射輝度（p/sec/cm2/sr）が、各群について示される（下）。（E）カプラン・マイヤー生存曲線。統計的有意性は、ログランク（マンテル・コックス）検定によって決定された。^＊p＜0.05、^＊＊p 0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。図11-1の説明を参照のこと。図12A～E. scFv配列ハイブリッド化は、機能的に優れたCARバリアントを生じる。（A）CAR分子におけるscFv配列ハイブリッド化の概略図。Leu16およびリツキシマブに由来するscFvのフレームワーク領域（FR）および相補性決定領域（CDR）が、相互に混合され、2つの新しいCARバリアントを生じた。（B）RFR-LCDRハイブリッドCAR-T細胞は、反復抗原チャレンジ時に、優れた抗腫瘍機能およびT細胞増殖を示す。CAR-T細胞を、2日毎に2:1のE:T比でRaji細胞（CD19⁺/CD20⁺）によってチャレンジした。T細胞および標的細胞の数を、フローサイトメトリーによって定量化した。示されたデータは、技術的3回反復の平均値±1 S.D.である。結果は、3人の異なる健常ドナーからの3回の独立した実験の代表である。（C）CD20抗原刺激なしで、ダイナビーズ除去の11日後に、活性化マーカーおよび消耗マーカーの発現を評価した。データバーは、技術的3回反復の平均値±1 S.D.を示す。結果は、3人の異なる健常ドナーからの3回の独立した実験の代表である。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。（D）2:1のE:T比での標的細胞の非存在下または存在下でのCellTrace Violet（CTV）色素による4日間CAR-T細胞増殖アッセイ。（E）抗原刺激の非存在下での培養物中のCAR-T細胞の代謝分析。CAR-T細胞を、10％熱不活化透析ウシ胎仔血清（HI-dFBS）、IL-2、およびIL-15が補足されたRPMIにおいて72時間培養した。データバーは、技術的3回反復の平均値±1 S.D.を示す。データは、3人の異なる健常ドナーからの3回の独立した実験の代表である。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。図12Aの説明を参照のこと。図12Aの説明を参照のこと。図12Aの説明を参照のこと。図12Aの説明を参照のこと。図13A～G. CARタンパク質における、ねじれ再配向と組み合わせられたscFvハイブリッド化は、インビボでのCAR-T細胞機能をさらに増強する。（A～D）NSGマウスにホタルルシフェラーゼ発現Raji細胞を静脈内注射し、続いて、CAR⁺ T細胞の2回投与および1回のRaji腫瘍再チャレンジを行った。（A）インビボ実験の概略図（各群n＝6マウス）。（B）生物発光イメージングによって定量化された個々の動物における腫瘍シグナル。（C）カプラン・マイヤー生存曲線。ログランク（マンテル・コックス）検定が、対比較のために実施された。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。（D）1回目のT細胞注入の後、23日目にマウスから収集された末梢血中のヒトCD45⁺EGFRt⁺細胞の頻度。（E～G）NSGマウスにホタルルシフェラーゼ発現Raji細胞を静脈内注射し、続いて、CAR⁺ T細胞を1回投与した。T細胞注射後、25日目および45日目に、マウスをRaji細胞によって2回再チャレンジした。（E）インビボ実験の概略図（各群n＝6マウス）。（F）生物発光イメージングによって定量化された個々の動物における腫瘍シグナル。（G）経時的な、マウスから収集された末梢血中のヒトCD45⁺EGFRt⁺細胞の頻度。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。図13-1の説明を参照のこと。図13-1の説明を参照のこと。図14A～C. トランスクリプトームおよびエピジェネティクスの分析は、T細胞表現型のCAR依存的変動を明らかにした。（A、B）NSGマウスに、0.5×10⁶個のホタルルシフェラーゼ発現Raji細胞をi.v.注射し、6日後に、2.85×10⁶個のCAR⁺ T細胞のi.v.送達によって処置した。T細胞注射の9日後に、腫瘍保持マウスから、肝臓、脾臓、心臓血、および骨髄を収集した（各群n＝2マウス）。huCD45⁺EGFRt⁺集団を濃縮することによって、CAR⁺ T細胞を取得し、続いて、RNA-seqおよびATAC-seqによって分析した。（A）RNA-seqに基づく、リツキシマブCAR-T細胞と、Leu16 CAR-T細胞（左）、RFR-LCDR CAR-T細胞（中央）、またはRFR-LCDR.AA CAR-T細胞（右）との比較において、ディファレンシャルに発現された遺伝子のボルケーノプロット。すべてのディファレンシャルに発現された遺伝子が灰色でプロットされている。FDR＜0.05で、少なくとも2倍のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション（log₂FC＞1またはlog₂FC＜-1）を有する遺伝子は、赤色ドットとして示される。log₂FC＞1かつFDR＜0.05またはlog₂FC＜-1かつFDR＜0.05で、3つすべての対比較のセットに現れる遺伝子の名前には、印が付けられている。（B）Leu16 CAR-T細胞、リツキシマブCAR-T細胞、RFR-LCDR CAR-T細胞、RFR-LCDR.AA CAR-T細胞の、ATP9A遺伝子座、KIR2DL3遺伝子座、KIR2DL1遺伝子座、KIR3DL1遺伝子座における、ディファレンシャルにアクセシブルな領域のゲノムブラウザファイル。（C）リツキシマブベースのCAR-T細胞によって処置された動物は、血清中のグルコースレベルの低下を示す。血清は、T細胞注射後58日目に、図13E～Gに示される研究において、動物から収集された。血清中のグルコース濃度はLC-MSによって測定された。データバーは、生物学的反復の平均値±1 S.D.を示す（両方のハイブリッドCAR-T細胞群についてn＝6；試料収集日前の腫瘍量によって引き起こされた死亡のため、リツキシマブ.AA CAR-T細胞処置群についてはn＝4）。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。図14Aの説明を参照のこと。図14Aの説明を参照のこと。図15A～D. RFR-LCDR.AA CAR-T細胞は、メモリー表現型と関連するロバストなT細胞活性化を示す。（A）図14Aに記載されたように取得されたRNA-seqデータに対して、遺伝子セットエンリッチメント分析（GSEA）を実施した。T細胞の表現型および機能に関連するパスウェイにおける結果の要約が、BubbleGUMマップ形式で示される（Spinelli et al.,2015）。（B）T細胞サブタイプに関連するパスウェイのマウンテンプロット。（C）T細胞の活性化およびインターフェロンγシグナル伝達に関連するパスウェイのマウンテンプロット。（D）細胞周期、DNA複製、および細胞代謝に関連するパスウェイのマウンテンプロット。図15Aの説明を参照のこと。図15Aの説明を参照のこと。図15Aの説明を参照のこと。図16A～D. CD20 CARがインビトロで類似の特徴を示すか否かのパネル。（A）leu16、リツキシマブ、GA101、およびオファツムマブのscFv配列のT-Coffeeを使用した整列化（Notredame et al.,2000）。（B）それぞれ、CARのIgG4細胞外スペーサー（Fc）およびEGFRtの抗体染色を介して検出された、CAR表面発現（上）および形質導入マーカー発現（下）によって定量化されたCAR-T細胞形質導入効率。各抗原染色の蛍光強度中央値（MFI）および％陽性は、フローサイトメトリーヒストグラムの下に注記された。結果は、3人の異なる健常ドナーからの3回の独立した実験の代表である。（C）外因性サイトカインIL-2およびIL15によるエクスビボ培養中のCD20 CAR-T細胞増殖。2日目と14日目との間の全生存細胞数のフォールドチェンジが示される。各データポイントは、1人のドナーを表し；各構築物について、4人のドナーについてのデータが示される。対応のない両側2標本スチューデントt検定によって、いずれのドナー間にも、統計的な差は検出されなかった。（D）反復抗原チャレンジ時のCAR-T細胞の細胞傷害性および増殖。CD20 CAR-T細胞を、2日毎に2:1のエフェクター対標的（E:T）比でRaji腫瘍細胞によってチャレンジし、生存しているRaji細胞およびCAR-T細胞の数をフローサイトメトリーによって定量化した。示されるデータは、±1標準偏差（S.D.）を示すエラーバー付きの技術的3回反復の平均値である。結果は、3人の異なる健常ドナーからの3回の独立した実験の代表である。図16-1の説明を参照のこと。図17A～E. Raji異種移植モデルにおける腫瘍進行および死後CD20 CAR-T細胞特徴決定。（A）NSGマウスにホタルルシフェラーゼ発現Raji細胞を生着させ、図10Bに記載されるようにCD20 CAR-T細胞によって処置した。腫瘍量を生物発光イメージングによって測定し、指数回帰曲線を個々の各動物の腫瘍進行データに適合させることによって、T細胞注射後12日目と人道的エンドポイントとの間の腫瘍増殖速度を定量化した。各群のマウス（n＝6）の腫瘍シグナルの平均倍加時間（T_倍化）が、各プロットの上に示される。（B、C）フローサイトメトリーによって定量化された、安楽死時にマウスから収集された骨髄、脳、肝臓、および脾臓における腫瘍細胞（B）およびヒトCD45⁺EGFRt⁺細胞（B）の頻度。（D、E）フローサイトメトリーによって定量化された、安楽死時にマウスから収集された骨髄、脳、肝臓、脾臓におけるヒトCD45⁺EGFRt⁺細胞のうちのPD-1⁺細胞（D）およびLAG-3⁺細胞（E）の頻度。パネル（B）～（E）に示されたすべてのデータについて、対応のない両側2標本スチューデントのt検定によって、いずれのドナー間にも、統計的な差は検出されなかった。図17-1の説明を参照のこと。図17-1の説明を参照のこと。図18．リツキシマブCAR-T細胞は、他のCD20 CAR-T細胞より代謝的に高活性である。10％熱不活化透析ウシ胎仔血清（HI-dFBS）、IL-2、およびIL-15が補足されたRPMIにおいて24時間培養されたCAR-T細胞によるアミノ酸およびその他の栄養素の取り込み。データバーは、技術的3回反復の平均値±1 S.D.を示す。結果は、3人の異なる健常ドナーからの3回の独立した実験の代表である。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。この図中の結果は、図10Fと同じ実験からのものである。4つのバーの各セットは、左から右へ順に、それぞれ、EGFRt、CD19、Leu16、およびリツキシマブについてのデータを表す。図19. CD20 CARは、抗原エンゲージメントの非存在下で、T細胞表面上に均一に分布する。CAR-HaloTag融合タンパク質によって形質導入されたJurkat細胞を、赤色蛍光色素テトラメチルローダミン（TMR）によって染色し、共焦点顕微鏡法によって画像化した。CAR分子は、抗原刺激の非存在下で、細胞表面上に均一に分布する。図20A～D. ねじれ再配向を有するリツキシマブCAR-T細胞は、類似したインビトロ細胞傷害性および抗原非依存的活性化マーカー発現を示す。（A）0～4個のアラニンがCD28膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間に挿入されたリツキシマブベースのCAR構築物の概略図。（B）CAR表面発現を、各CARのN末端に融合したHAタグの抗体染色によって定量化した。データは、3人の異なる健常ドナーからの3回の独立した実験の代表である。（C）反復抗原チャレンジ時のCAR-T細胞の細胞傷害性および増殖。CD20 CAR-T細胞を2日毎に2:1のE:T比でRaji腫瘍細胞によってチャレンジし、生存しているRaji細胞およびCAR-T細胞の数をフローサイトメトリーによって定量化した。示されるデータは、±1標準偏差（S.D.）を示すエラーバー付きの技術的3回反復の平均値である。結果は、3人の異なる健常ドナーからの3回の独立した実験の代表である。（D）CD20抗原刺激なしで、ダイナビーズ除去の11日後に、活性化マーカーおよび消耗マーカーの発現を評価した。データバーは、技術的3回反復の平均値±1 S.D.を示す。結果は、3人の異なる健常ドナーからの3回の独立した実験の代表である。他のことが注記されない限り、p値は、対応のない両側スチューデントt検定によって決定された。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。図20-1の説明を参照のこと。図21A～E. ねじれ再配向を有するGD2 CAR-T細胞は、同じインビトロ性能にもかかわらず、ディファレンシャルな腫瘍コントロールをインビボで示す。（A）0～4個のアラニンがCD28膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間に挿入されたGD2 CAR構築物の概略図。（B）CAR表面発現（上）および形質導入効率（下）を、FcおよびEGFRtの抗体染色によって定量化した。（C）反復抗原チャレンジ時のCAR-T細胞の細胞傷害性および増殖。GD2 CAR-T細胞を2日毎に2:1のE:T比でCHLA-255腫瘍細胞によってチャレンジし、生存しているRaji細胞およびCAR-T細胞の数をフローサイトメトリーによって定量化した。示されるデータは、±1標準偏差（S.D.）を示すエラーバー付きの技術的3回反復の平均値である。（D、E）NSGマウスに、3.5×10⁶個のホタルルシフェラーゼ発現CHLA-255細胞を静脈内注射し、17日後に、2×10⁶個のGD2 CAR-T細胞を静脈内注射した。（D）腫瘍進行を、生物発光イメージングによってモニタリングした。（E）安楽死時にマウスから収集された肝臓および脾臓におけるヒトCD45⁺EGFRt⁺細胞の頻度を、フローサイトメトリーによって定量化した。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。図21-1の説明を参照のこと。図22A～D. ハイブリッドCAR-T細胞のインビトロ特徴決定。（A）CAR表面発現（上）および形質導入効率（下）を、FcおよびEGFRtの抗体染色によって定量化した。結果は、3人の異なる健常ドナーからの3回の独立した実験の代表である。（B）CAR分子は、抗原刺激の非存在下で、T細胞表面上に均一に分布する。CAR-HaloTag融合タンパク質によって形質導入されたJurkat細胞をTMRによって染色し、共焦点顕微鏡によって画像化した。（C、D）CD19⁺/CD20⁺ K562標的細胞の存在下（C）および非存在下（D）でのIFNγ、TNFα、IL-2の産生。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。（C）および（D）について、7つのバーの各セットは、左から右へ順に、それぞれ、EGFRt、CD19、Leu16、リツキシマブ、リツキシマブ.AA、RFR-LCDR、およびRFR-LCDR.AAについてのデータを表す。図22-1の説明を参照のこと。図23. ハイブリッドCAR-T細胞は、リツキシマブCAR-T細胞と比較して低下した代謝活性を示す。10％熱不活化透析ウシ胎仔血清（HI-dFBS）、IL-2、およびIL-15が補足されたRPMIにおいて72時間培養されたCAR-T細胞による、アミノ酸およびその他の栄養素の取り込み。データバーは、技術的3回反復の平均値±1 S.D.を示す。データは、3人の異なる健常ドナーからの3回の独立した実験の代表である。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。この図中の結果は、図12Eと同じ実験からのものである。7つのバーの各セットは、左から右へ順に、それぞれ、EGFRt、CD19、Leu16、リツキシマブ、リツキシマブ.AA、RFR-LCDR、RFR-LCDR.AAについてのデータを表す。図24A～B. トランスクリプトームおよびエピジェネティクスのプロファイリングのための腫瘍保持マウスからのCAR-T細胞採集。NSGマウスに、0.5×10⁶個のホタルルシフェラーゼ発現Raji細胞を静脈内注射し、6日後に、2.85×10⁶個のCAR⁺ T細胞を注射した。T細胞注射の9日後に腫瘍保持マウスからCAR⁺ T細胞を収集した（各群n＝2）。モック形質導入（EGFRtのみ）T細胞は、少数しか、マウスから採集されず、そのことは、抗原認識の非存在下でのT細胞増大の欠如と一致した。しかしながら、この不十分な細胞回収は、RNA-seqおよびATAC-seqにおける低いリード数をもたらし、そのことが、信頼性の高いデータ分析を妨げた。その結果、これらの試料は、図14、14、および25に示される分析から除外された。（A）インビボ実験の概略図。（B）生物発光イメージングによってモニタリングされた腫瘍進行。図25. RNA-seqは、腫瘍保持マウスから回収されたCD20 CAR-T細胞バリアントの間のトランスクリプトームの著しい差異を明らかにする。Leu16 CAR-T細胞、リツキシマブCAR-T細胞、RFR-LCDR CAR-T細胞、RFR-LCDR.AA CAR-T細胞の分散分析比較においてディファレンシャルに発現された遺伝子（FDR＜0.05）のヒートマップ。各列は、1匹のマウスを表し、生物学的2回反復を、各処置群について分析した。各行は、各遺伝子の相対的な発現を強調するため、最大1、最小0にスケーリングされている。図26. T細胞サブセット分布は、エクスビボ培養物中のCAR-T細胞の間で有意に変動しない。エクスビボ培養物中のCAR-T細胞のサブタイプを、抗原刺激の非存在下で、CD45RAおよびCD62Lの染色によって決定した。CD45RA⁺CD62L⁺、CD45RA^-CD62L⁺、CD45RA^-CD62L^-、およびCD45RA⁺CD62L^-は、それぞれ、ナイーブ細胞タイプ、セントラルメモリー細胞タイプ、エフェクターメモリー細胞タイプ、およびエフェクター細胞タイプを示す。図27A～C.（A）1人のドナーからの、CARのIgG4細胞外スペーサー（Fc）およびEGFRtの抗体染色を介して検出されたCAR表面発現（上）および形質導入マーカー発現（下）。各試料の陽性パーセントおよび蛍光強度中央値（MFI）が注記される。（B）6人の異なる健常ドナーから生成されたT細胞についての％FC+およびMFIによるCAR表面染色データが示される。（C）外因性サイトカインIL-2およびIL15によるエクスビボ培養中のCD20 CAR CD8+ T細胞増大。2日目と14日目との間の全生存細胞数のフォールドチェンジが示される。各データポイントは、1人のドナーを表し、各構築物について、4人のドナーについてのデータが示される。対応のない両側2標本スチューデントt検定によって、いずれのドナー間にも、統計的な差は検出されなかった。図27Aの説明を参照のこと。図27Aの説明を参照のこと。図28A～C.（A）Raji細胞株およびK562細胞株におけるCD20発現レベルのフローサイトメトリー分析。（B）3つのエフェクター対標的（E:T）比での、変動するCD20発現レベルを有する標的細胞に対するCD20 CAR-TN/M細胞の24時間溶解アッセイ。データバーは、技術的3回反復の平均値±1標準偏差（S.D.）を示す。対応のない両側2標本スチューデントt検定によって、統計的に有意な差は認められなかった。（C）Raji腫瘍細胞による反復抗原チャレンジ時のCAR CD8+ T細胞の細胞傷害性および増殖。CD20 CAR-T細胞を2日毎に2:1のE:T比でRaji細胞によってチャレンジし、生存しているRaji細胞およびCAR-T細胞の数をフローサイトメトリーによって定量化した。示されたデータは、±1 S.D.を示すエラーバー付きの技術的3回反復の平均値である。3人の異なる健常ドナーからの3回の独立した実験の結果が示される。図29A～D. 抗原刺激の非存在下での（A、B）活性化マーカーおよび消耗マーカーのアップレギュレーションならびに（C、D）T細胞増殖をもたらす、抗原非依存的CARシグナル伝達またはリツキシマブ由来CD20 CAR。リツキシマブベースのCAR-T細胞におけるトニックシグナル伝達は、CD8+細胞（A、C）およびCD14-/CD25-/CD62L+表現型によって選別されたナイーブ/メモリーT（TN/M）細胞の両方において観察された。A～Dの7つのバーの各セットは、左から右へ順に、それぞれ、EGFRt、CD19、GD2、Leu16、リツキシマブ、GA101、およびオファツムマブについてのデータを表す。図30. リツキシマブ由来CD20 CARの代謝流量。4つのバーの各セットは、左から右へ順に、それぞれ、EGFRt、CD19、Leu16、およびリツキシマブについてのデータを表す。図31A～B.（A）抗原刺激の非存在下で、CAR発現Jurkat細胞を、DyLight405にコンジュゲートされた抗Fc抗体によって染色し、共焦点顕微鏡によって画像化した。（B）抗原刺激の非存在下で、CAR-HaloTag融合タンパク質によって形質導入されたJurkat細胞を、赤色蛍光色素テトラメチルローダミン（TMR）によって染色し、共焦点顕微鏡によって画像化した。図32A～B.（A）NSGマウスに、0.5×10⁶個のホタルルシフェラーゼ発現Raji細胞を静脈内（i.v.）注射し、6日後に、5×10⁶個のCD8⁺ CD20標的CAR-T細胞のi.v.送達によって処置した。腫瘍進行を、生物発光イメージングによってモニタリングした（各群n＝6マウス）。放射強度スケール上の最小値および最大値は、それぞれ、5×10⁴および1×10⁷である。（B）各試験群についての個々の動物の平均放射輝度（p/sec/cm2/sr）。黒色点線は、リツキシマブCAR-T細胞群が腫瘍コントロールを急速に失い始めた時点である、T細胞注射後12日目を示す。各トレースのエンドポイントは、各動物の人道的エンドポイントを示す。図33A～C.（A）リツキシマブベースのCARのアラニン挿入バリアントの概略図。（B）1人のドナーからの、それぞれ、CARのIgG4細胞外スペーサー（Fc）およびEGFRtの抗体染色を介して検出されたCAR表面発現（上）および形質導入マーカー発現（下）。各試料の陽性パーセントおよび蛍光強度中央値（MFI）が注記される。（C）4回の異なるT細胞製造ランから生成されたT細胞についての％Fc+およびMFIによるCAR表面染色データ。図34A～B.（A）ダイナビーズ除去の7日後に、抗原刺激の非存在下でのCAR-T細胞による腫瘍壊死因子（TNF）α産生を測定した。バルクCD8⁺ T細胞の1人のドナーおよびT_N/M細胞の1人のドナーからの結果を示す。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。（B）CTV色素によって染色されたCAR⁺ CD8⁺細胞およびT_N/M細胞の増殖を、標的細胞または外因性サイトカインの非存在下での4日間の培養後にアッセイした。バルクCD8⁺ T細胞の1人のドナーおよびT_N/M細胞の1人のドナーからの結果が示される。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。図35A～B.（A）異なるE:T比での、変動するCD20発現レベルを有する標的細胞に対するリツキシマブCAR-TN/M細胞の24時間溶解アッセイ。データバーは、技術的3回反復の平均値±1 S.D.を示す。対応のない両側2標本スチューデントt検定によって、統計的に有意な差は認められなかった。（B）反復抗原チャレンジ時のCAR-T細胞の細胞傷害性および増殖。CD20 CAR-T細胞を2日毎に2:1のE:T比でRaji腫瘍細胞によってチャレンジし、生存しているRaji細胞およびCAR-T細胞の数をフローサイトメトリーによって定量化した。示されるデータは、±1 S.D.を示すエラーバー付きの技術的3回反復の平均値である。4人の異なる健常ドナーに由来するT細胞を使用した4回の独立した実験の結果が示される。図36A～C.（A）0～4個のアラニンがCD28膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間に挿入されたGD2 CAR構築物の概略図。（B）NSGマウスに、3.5×106個のホタルルシフェラーゼ発現CHLA-255細胞を静脈内注射し、17日後に、2×106個のGD2 CAR-T細胞を静脈内注射した。腫瘍進行を、生物発光イメージングによってモニタリングした。（C）安楽死時にマウスから収集された肝臓および脾臓におけるヒトCD45+EGFRt+細胞の頻度を、フローサイトメトリーによって定量化した。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。各トレースのエンドポイントは、各動物の人道的エンドポイントを示す。図37A～B.（A）CAR表面発現（上）および形質導入効率（下）を、FcおよびEGFRtの抗体染色によって定量化した。（B）10人の異なる健常ドナーから生成されたT細胞についての％Fc+およびMFIによるCAR表面染色データが示される。図37Aの説明を参照のこと。図38A～B. RFR-LCDRハイブリッドCD20 CARは、抗原刺激の非存在下での（A）活性化マーカーおよび枯渇マーカーのアップレギュレーションならびに（B）T細胞増殖をもたらす、抗原非依存的なCARシグナル伝達を示す。CD19 CARおよびGD2 CARは、それぞれ、トニックシグナル伝達についての陰性対照および陽性対照として含まれた。7つのバーの各セットは、左から右へ順に、それぞれ、EGFRt、CD19、GD2、Leu16、リツキシマブ、RFR-LCDR、およびLFR-RCDRについてのデータを表す。図39. Leu16、リツキシマブ、およびRFR-LCDRのscFvの結合動力学的パラメーターを、バイオレイヤー干渉法によって測定した。KD：平衡解離定数；ka：会合定数；kdis：解離定数；平均値：3回のランの平均値。SD：3回のランの標準偏差。示されたp値を計算するため、両側スチューデントt検定が使用された。図40A～B.（A）RFR-LCDR.AAは、RFR-LCDR scFvおよびCD28膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間に挿入された2個のアラニンを含有するCAR構築物である。このCARは、インビトロで他のCD20 CARと類似した抗原検出閾値を示す。（B）ハイブリッドscFv配列および/またはアラニン挿入を含有するCARは、細胞表面上でクラスターフリーのままである。CAR-HaloTag融合タンパク質によって形質導入されたJurkat細胞を、TMR赤色蛍光色素によって染色し、共焦点顕微鏡によって画像化した。CAR分子は、抗原刺激の非存在下で、細胞表面上に均一に分布する。図41A～C.（A）CD20抗原刺激の非存在下でのCAR-TN/M細胞による活性化マーカーおよび消耗マーカーの発現を、ダイナビーズ除去の11日後に評価した。データバーは、技術的3回反復の平均値±1 S.D.を示す。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。（B）CTV色素によって染色されたCAR+ TN/M細胞の増殖を、標的細胞または外因性サイトカインの非存在下での4日間培養後にアッセイした。ヒストグラムに示されたデータは、棒グラフにおけるドナー1に対応する。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。（C）抗原刺激の非存在下でのCAR+ TN/M細胞によるIFNγ、TNFα、IL-2の産生。外因性サイトカインの非存在下で48時間培養された細胞の上清中のサイトカイン濃度を、ELISA法によって測定した。データバーは、技術的3回反復の平均値±1 S.D.を示す。^＊p＜0.05、^＊＊p＜0.01、^＊＊＊p＜0.001、n.s.統計的に有意でない。7つのバーの各セットは、左から右へ順に、それぞれ、EGFRt、CD19、Leu16、リツキシマブ、リツキシマブ.AA、RFR-LCDR、およびRFR-LCDR.AAについてのデータを表す。（B）のデータは、上から下へ、EGFRt、CD19、Leu16、リツキシマブ、リツキシマブ.AA、RFR-LCDR、およびRFR-LCDR.AAを表す。図42. CARのトニックシグナル伝達。7つのバーの各セットは、左から右へ順に、それぞれ、EGFRt、CD19、Leu16、リツキシマブ、リツキシマブ.AA、RFR-LCDR、およびRFR-LCDR.AAについてのデータを表す。図43A～H. トニックシグナル伝達CARは、（A）ミトコンドリアタンパク質翻訳の増加、（B）抗原提示の増加、（C）MYCシグナル伝達の増加、（D）MTORCシグナル伝達の増加、（E）TNFαシグナル伝達の増加、（F）多岐にわたるインターフェロン応答、（G）（メモリーT細胞サブタイプとは対照的な）エフェクターT細胞サブタイプに関連する遺伝子のサインのエンリッチメント、および（H）細胞周期活性の増加を示す、異なる転写プロファイルを示す。表示可能なスペースを超える遺伝子を含有するヒートマップについては、ヒートマップに示される遺伝子の名前が、各マップの横に順番に記載される。図43-1の説明を参照のこと。図43-1の説明を参照のこと。図43-1の説明を参照のこと。図43-1の説明を参照のこと。図44A～D. RFR-LCDRハイブリッドCD20 CARは、インビボで優れた腫瘍クリアランスを示す。（A）動物研究の概略図。NSGマウスに、50万個のホタルルシフェラーゼ発現Rajiリンパ腫細胞を生着させ、T細胞の2回投与によって処置した。動物を、最初のT細胞処置の55日後に、腫瘍細胞の2回目投与によって再チャレンジした。（B）腫瘍進行を生物発光イメージングを通してモニタリングした。（C）生存曲線は、カプラン・マイヤー曲線として示される。結果は、ハイブリッドCARが、腫瘍クリアランスおよび長期再発防止において、親CD20 CARおよびCD19 CARの両方より優れていることを示している。（D）最初のT細胞注射の23日後の末梢血中のCAR発現ヒトT細胞の頻度を、フローサイトメトリーによって測定した。CARへの2個のアラニン残基の付加は、リツキシマブベースの受容体を改善し、そのことから、図5に示された以前のデータが確証された。ハイブリッドCARを2個のアラニンの挿入と組み合わせることによって、アラニン挿入なしのハイブリッドCARと比較して、初期腫瘍クリアランスの速度がさらに加速され、T細胞持続性の有意な増加がもたらされ、そのことから、CAR機能の相乗的改善をもたらすために、scFv改変およびアラニン挿入の戦略を組み合わせることが可能であることが示された。図44-1の説明を参照のこと。図45A～C.（A）RNAseqに基づき、リツキシマブCAR-T細胞と、Leu16 CAR-T細胞（左）、RFR-LCDR CAR-T細胞（中央）、またはRFR-LCDR.AA CAR-T細胞（右）との比較において、ディファレンシャルに発現された遺伝子のボルケーノプロット。すべてのディファレンシャルに発現された遺伝子が、灰色でプロットされる。FDR＜0.05で、少なくとも2倍のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーション（log₂FC＞1またはlog₂FC＜-1）を有する遺伝子は、赤色ドットで示される。log₂FC＞1かつFDR＜0.05またはlog₂FC＜-1かつFDR＜0.05で対比較の3つすべてのセットに現れる遺伝子の名前には、印が付けられている。（B）Leu16 CAR-T細胞、リツキシマブCAR-T細胞、RFR-LCDR CAR-T細胞、RFR-LCDR.AA CAR-T細胞の、ATP9A遺伝子座、KIR2DL3遺伝子座、KIR2DL1遺伝子座、KIR3DL1遺伝子座における、ATACseqに基づくディファレンシャルにアクセシブルな領域のゲノムブラウザファイル。（C）図5Aに記載されるように取得されたRNA-seqデータに対して、遺伝子セットエンリッチメント分析（GSEA）を実施した。T細胞の表現型および機能に関連するパスウェイにおける結果の要約が、BubbleGUMマップ形式で示される。図45Aの説明を参照のこと。図45Aの説明を参照のこと。

例示的な態様の説明
キメラ抗原受容体は、相補性決定領域（CDR）に隣接するフレームワーク領域（FR）を各々含有する重鎖（VH）および軽鎖（VL）を有する単鎖可変断片（scFv）を含む。フレームワーク領域は、scFvの構造の主要な決定基であると考えられている。特定のFR配列は、CARのscFv部分の一部として組み込まれた時に、トニックシグナル伝達を引き起こす場合があり、それは、CARクラスター形成の誘導に対する効果による可能性が高いことが提唱されている。以前の研究は、トニックシグナル伝達CAR（GD2）のFR配列が、非トニックシグナル伝達CD19 CARのCDR配列と組み合わせられ、その結果として生じたハイブリッドCARが、トニックシグナル伝達することが示されたことを示した。この結果から、新しいCAR分子の開発において、トニックシグナル伝達CARのFR配列を組み込むことは、一般に、望ましくないという仮説が立てられた（Long et al.Nature Medicine,2015.21(6):581-590）。驚くべきことに、本発明者らは、トニックシグナル伝達CARに由来するFRの組み込みが、優れた特性を有するCARをもたらすことを見出した。したがって、本開示の組成物および方法は、増加したインビボ効力を有する、再設計されたCAR、例えば、CD20 CARを提供する。

I. 定義
本開示のペプチドは、キメラ抗原受容体、すなわちCARを含むペプチドに関する。CARは、免疫エフェクター細胞上に任意の特異性を移植することができる、操作された受容体である。場合によっては、これらの受容体は、T細胞上にモノクローナル抗体の特異性を移植するために用いられる。受容体は、様々な供給源由来の部分で構成されているため、キメラと呼ばれる。

「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、遺伝子産物を指す場合に、本明細書において互換的に用いられる。

「相同性」または「同一性」は、2つのペプチド間または2つの核酸分子間の配列類似性を指す。同一性は、比較の目的で整列され得る各配列における位置を比較することによって、決定することができる。比較された配列における位置が、同じ塩基またはアミノ酸で占められている場合には、分子は、その位置で配列同一性を共有する。配列間の同一性の程度は、配列によって共有される一致するかまたは相同の位置の、数の関数である。「無関係の」または「非相同の」配列は、本開示の配列のうちの1つと、60％未満の同一性、50％未満の同一性、40％未満の同一性、30％未満の同一性、または25％未満の同一性を共有する。

本明細書において用いられる「アミノ部分」、「N末端」、「アミノ末端」などの用語は、ポリペプチドの領域の順序を指すために用いられる。さらに、何かが領域に対してN末端にある場合、それは、必ずしもポリペプチド全体の末端（または端）にあるわけではなく、領域またはドメインのN末端にあるだけである。同様に、本明細書において用いられる「カルボキシ部分」、「C末端」、「カルボキシ末端」などの用語は、ポリペプチドの領域の順序を指すために用いられ、何かが領域に対してC末端にある場合、それは、必ずしもポリペプチド全体の末端（または端）にあるわけではなく、領域またはドメインのC末端にあるだけである。

「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に用いられ、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することができ、既知または未知である任意の機能を果たしてもよい。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、ESTまたはSAGEタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA、リボソームRNA、リボザイム、cDNA、dsRNA、siRNA、miRNA、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの、修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合には、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に与えることができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分とのコンジュゲーションによって、重合後にさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。別段の指定または要求がない限り、ポリヌクレオチドである本発明の任意の態様は、二本鎖形態、および二本鎖形態を構成することが知られているかまたは予測される2つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を包含する。

特定のタンパク質を「コードする」「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」、または「導入遺伝子」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合にインビトロまたはインビボで、転写され、任意でまた遺伝子産物、例えばポリペプチドに翻訳される、核酸分子である。コード領域は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNA形態のいずれかで存在してもよい。DNA形態で存在する場合、核酸分子は、一本鎖（すなわち、センス鎖）または二本鎖であってもよい。コード領域の境界は、5'（アミノ）末端の開始コドンおよび3'（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンによって決定される。遺伝子は、原核生物または真核生物のmRNA由来のcDNA、原核生物または真核生物のDNA由来のゲノムDNA配列、および合成DNA配列を含むことができるが、それらに限定されない。転写終結配列は通常、遺伝子配列に対して3'に位置する。

「抗体」という用語は、ヒト、マウス、ヒト化、キメラ、または別の種由来であってもよい、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体、多重特異性抗体、および抗体断片を含む。「モノクローナル抗体」は、特異的な抗原部位に対して向けられている、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体である。

「抗体またはその機能的断片」は、特定の抗原またはエピトープに特異的に結合するか、またはそれと免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子を意味し、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含む。抗体という用語は、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、およびテトラボディ（tetrabody））などの、免疫グロブリンの遺伝子操作された形態または別の方法で改変された形態を含む。機能的抗体断片という用語は、例えば、Fab'、F(ab')2、Fab、Fv、rIgG、およびscFv断片を含む、抗体の抗原結合断片または抗原結合領域を含む。scFvという用語は、伝統的な2本鎖の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメインが、1本の鎖を形成するように連結されている、一本鎖Fv抗体を指す。

本明細書において用いられる場合、「結合親和性」という用語は、2つの剤の可逆的結合の平衡定数を指し、解離定数（Kd）として表される。結合親和性は、無関係のアミノ酸配列に対する抗体の結合親和性よりも、少なくとも1倍大きい、少なくとも2倍大きい、少なくとも3倍大きい、少なくとも4倍大きい、少なくとも5倍大きい、少なくとも6倍大きい、少なくとも7倍大きい、少なくとも8倍大きい、少なくとも9倍大きい、少なくとも10倍大きい、少なくとも20倍大きい、少なくとも30倍大きい、少なくとも40倍大きい、少なくとも50倍大きい、少なくとも60倍大きい、少なくとも70倍大きい、少なくとも80倍大きい、少なくとも90倍大きい、少なくとも100倍大きい、または少なくとも1000倍大きい、またはそれ以上（またはその中の任意の導き出せる範囲）であることができる。本明細書において用いられる場合、「結合力」という用語は、希釈後の解離に対する2つ以上の剤の複合体の抵抗力を指す。「免疫反応性」および「優先的に結合する」という用語は、抗体および/または抗原結合断片に関して、本明細書において互換的に用いられる。

「結合」という用語は、例えば、塩橋および水架橋などの相互作用を含む、共有結合性、静電気的、疎水性、ならびにイオン性および/または水素結合相互作用による、2つの分子間の直接的な会合を指す。

「個体」、「対象」、および「患者」は、互換的に用いられ、ヒトまたは非ヒトを指すことができる。

「より低い」、「低減した」、「低減」、「減少」、または「阻害する」という用語はすべて、概して、統計的に有意な量の減少を意味するように本明細書において用いられる。しかし、疑いの回避のために、「より低い」、「低減した」、「低減」、「減少」、または「阻害する」とは、参照レベルと比較して少なくとも10％の減少、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の減少、または100％までのおよび100％を含む減少（すなわち、参照試料と比較して無いレベル）、または10～100％の任意の減少を意味する。

「増加した」、「増加」、「増強する」、または「活性化する」という用語はすべて、概して、静的に有意な量の増加を意味するように本明細書において用いられ；いずれかの疑いの回避のために、「増加した」、「増加」、「増強する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10％の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の増加、または100％までのおよび100％を含む増加、または10～100％の任意の増加、または、参照レベルと比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、または2倍～10倍以上の任意の増加を意味する。

II. ポリペプチド
A. シグナルペプチド
本開示のポリペプチドは、シグナルペプチドを含んでもよい。「シグナルペプチド」とは、例えば、ある特定の細胞小器官（小胞体など）および/または細胞表面に対する、細胞内のタンパク質の輸送および局在化を方向付ける、ペプチド配列を指す。いくつかの態様において、シグナルペプチドは、新生タンパク質を小胞体中に方向付ける。受容体が、グリコシル化されて、細胞膜に固定されることになる場合には、これは必須である。概して、最もアミノ末端の成分に天然で結合したシグナルペプチドが、用いられる（例えば、軽鎖-リンカー-重鎖の配向を有するscFvにおいては、軽鎖の天然シグナルが用いられる）。

いくつかの態様において、シグナルペプチドは、小胞体（ER）の通過後に切断され、すなわち、切断可能なシグナルペプチドである。いくつかの態様において、制限部位は、切断を促進するために、シグナルペプチドのカルボキシ末端にある。

B. 抗原結合ドメイン
本開示のポリペプチドは、1つまたは複数の抗原結合ドメインを含んでもよい。「抗原結合ドメイン」とは、適切な条件下で抗原に結合することができるポリペプチドの領域を説明する。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、1つまたは複数の抗体（例えばCD20抗体）に基づく一本鎖可変断片（scFv）である。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域を含み、VH領域およびVL領域は同じポリペプチド上にある。いくつかの態様において、抗原結合ドメインは、VH領域とVL領域との間にリンカーを含む。リンカーは、抗原結合ドメインが、抗原結合のための望ましい構造を形成することを可能にし得る。

本開示のポリペプチドの抗原結合ドメインの可変領域は、抗体の1つまたは複数の結合特性（例えば、親和性）を改善するために、VHおよび/またはVLのCDR1 、CDR2、および/またはCDR3領域内のアミノ酸残基を変異させることによって、改変することができる。「CDR」という用語は、それぞれB細胞およびT細胞によって生成される、免疫グロブリン（抗体）およびT細胞受容体における可変鎖の一部に基づく、相補性決定領域を指し、これらの分子は、それらの特異的な抗原に結合する。免疫グロブリンおよびT細胞受容体に関連するほとんどの配列変動は、CDRにおいて見出されるため、これらの領域は、時には超可変領域と呼ばれる。変異は、部位特異的変異誘発またはPCR媒介性変異誘発によって導入されてもよく、抗体結合、または関心対象の他の機能的特性に対する効果を、適切なインビトロまたはインビボのアッセイで評価することができる。好ましくは、保存的改変が導入され、典型的には、CDR領域内の1つ、2つ、3つ、4つ、または5つ以下の残基が変更される。変異は、アミノ酸の置換、付加、または欠失であってもよい。

フレームワーク改変は、例えば、1つまたは複数のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「逆変異」させることによって、免疫原性を減少させるために抗体に対して行うことができる。

抗原結合ドメインは、同じ抗原（多価）または異なる抗原（多重特異性）のいずれかに結合するVH領域およびVL領域のペアで抗原結合ドメインを多量体化することによって、多重特異性または多価であってもよいこともまた、企図される。

可変領域（重鎖および/もしくは軽鎖可変領域）などの抗原結合領域の、またはCDRの結合親和性は、少なくとも10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M、または10^-13Mであってもよい。いくつかの態様において、可変領域（重鎖および/もしくは軽鎖可変領域）などの抗原結合領域の、またはCDRのK_Dは、少なくとも10^-5M、10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M、10^-12M、または10^-13M（またはその中の任意の導き出せる範囲）であってもよい。

結合親和性、K_A、またはK_Dは、当技術分野において公知の方法によって、例えば、表面プラズモン共鳴（SRP）ベースのバイオセンサーによって、結合平衡除外法（KinExA）によって、偏光変調の斜入射反射率の差（OI-RD）に基づくマイクロアレイ検出用の光学スキャナーによって、またはELISAによって、決定することができる。

いくつかの態様において、ヒト化結合領域を含むポリペプチドは、マウス由来の結合領域などの非ヒト化結合領域を含むポリペプチドと比較して、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、104、106、106、108、109、110、115、または120％と同等の、これらよりも良好な、または少なくともこれらの結合親和性および/または宿主細胞における発現レベルを有する。

いくつかの態様において、ヒトフレームワークのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4などのフレームワーク領域は、マウスフレームワークに対して、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、もしくは200個、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、もしくは200個、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、もしくは200個（またはその中の任意の導き出せる範囲）のアミノ酸置換、連続したアミノ酸付加、または連続したアミノ酸欠失を、各々または集合的に有することができる。

いくつかの態様において、マウスフレームワークのFR1、FR2、FR3、および/またはFR4などのフレームワーク領域は、ヒトフレームワークに対して、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、もしくは200個、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、もしくは200個、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、もしくは200個（またはその中の任意の導き出せる範囲）のアミノ酸置換、連続したアミノ酸付加、または連続したアミノ酸欠失を、各々または集合的に有することができる。

置換は、重鎖または軽鎖可変領域のFR1、FR2、FR3、またはFR4の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100位にあってもよい。

C. 細胞外スペーサー
細胞外スペーサーは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結し得る。いくつかの態様において、ヒンジは、抗原結合ドメインが様々な方向に向いて抗原結合を促進することを可能にするほど十分に可動性である。1つの態様において、スペーサーは、IgG由来のヒンジ領域を含む。いくつかの態様において、スペーサーは、免疫グロブリンのCH2CH3領域およびCD3の一部分を含むか、またはそれらをさらに含む。いくつかの態様において、CH2CH3領域は、L235E/N297QもしくはL235D/N297Qの改変、または少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは100％のアミノ酸配列同一性のCH2CH3領域を有してもよい。いくつかの態様において、スペーサーはIgG4由来である。細胞外スペーサーは、ヒンジ領域を含んでもよい。

本明細書において用いられる場合、「ヒンジ」という用語は、構造的可動性を提供する、および隣接ポリペプチド領域に対して間隔をあける、可動性ポリペプチドコネクタ領域（本明細書において「ヒンジ領域」とも呼ばれる）を指し、天然ポリペプチドまたは合成ポリペプチドからなることができる。免疫グロブリン（例えば、IgG1）に由来する「ヒンジ」は、概して、ヒトIgG1のGlu216からPro230まで伸びるとして定義される（Burton (1985) Molec. Immunol., 22: 161- 206）。他のIgGアイソタイプのヒンジ領域を、重鎖間ジスルフィド（S-S）結合を形成する最初および最後のシステイン残基を同じ位置に置くことによって、IgG1配列と整列させてもよい。ヒンジ領域は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,677,425号に記載されているような、変更されたヒンジ領域を含むがそれに限定されない、天然に存在するものまたは天然に存在しないものであってもよい。ヒンジ領域は、CH1ドメインのものとは異なるクラスまたはサブクラスの抗体に由来する、完全なヒンジ領域を含むことができる。「ヒンジ」という用語はまた、可動性の提供および隣接領域に対する間隔において類似した機能を提供する、CD8および他の受容体に由来する領域を含むこともできる。

細胞外スペーサーは、少なくとも4、5、6、7、8、9、10、12、15、16、17、18、19、20、20、25、30、35、40、45、50、75、100、110、119、120、130、140、150、160、170、180、190、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、260、270、280、290、300、325、350、もしくは400アミノ酸、多くとも4、5、6、7、8、9、10、12、15、16、17、18、19、20、20、25、30、35、40、45、50、75、100、110、119、120、130、140、150、160、170、180、190、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、260、270、280、290、300、325、350、もしくは400アミノ酸、または正確に4、5、6、7、8、9、10、12、15、16、17、18、19、20、20、25、30、35、40、45、50、75、100、110、119、120、130、140、150、160、170、180、190、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、260、270、280、290、300、325、350、もしくは400アミノ酸（またはその中の任意の導き出せる範囲）の長さを有することができる。いくつかの態様において、細胞外スペーサーは、免疫グロブリン（例えば、IgG）由来のヒンジ領域からなるか、またはそれを含む。免疫グロブリンヒンジ領域のアミノ酸配列は、当技術分野において公知である；例えば、Tan et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 162およびHuck et al. (1986) Nucl. Acids Resを参照されたい。

細胞外スペーサーの長さは、CARのシグナル伝達活性、および/または抗原により刺激されたCARシグナル伝達に応答したCAR-T細胞の増大特性に対して、影響を有し得る。いくつかの態様において、50、45、40、30、35、30、25、20、15、14、13、12、11、または10アミノ酸未満などの、より短いスペーサーが用いられる。いくつかの態様において、少なくとも50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、260、270、280、または290アミノ酸であるものなどの、より長いスペーサーは、インビボまたはインビトロで、増大の増加という利点を有し得る。

非限定的な例として、免疫グロブリンヒンジ領域は、以下のアミノ酸配列のうちの1つを含むことができる。

表：例示的なヒンジ領域

細胞外スペーサーは、ヒトIgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4のヒンジ領域のアミノ酸配列を含むことができる。細胞外スペーサーはまた、野生型（天然に存在する）ヒンジ領域と比較して、1つまたは複数のアミノ酸の置換および/または挿入および/または欠失を含んでもよい。例えば、ヒンジ領域が、配列

を含むように、ヒトIgG1ヒンジのHis229を、Tyrで置換することができる。

細胞外スペーサーは、ヒトCD8に由来するアミノ酸配列を含むことができ；例えば、ヒンジ領域は、アミノ酸配列：

またはそのバリアントを含むことができる。

細胞外スペーサーは、CH2領域を含んでもよく、またはさらに含んでもよい。例示的なCH2領域は、

である。細胞外スペーサーは、CH3領域を含んでもよく、またはさらに含んでもよい。例示的なCH3領域は、

である。

細胞外スペーサーが複数の部分を含む場合は、様々な部分の間にどこにでも0～50アミノ酸が存在してもよい。例えば、ヒンジとCH2領域もしくはCH3領域との間、または両方が存在する場合にはCH2領域とCH3領域との間に、少なくとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、もしくは50アミノ酸、多くとも0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、もしくは50アミノ酸、または正確に0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、もしくは50アミノ酸（またはその中の任意の導き出せる範囲）が存在してもよい。いくつかの態様において、細胞外スペーサーは、ヒンジ、CH2、および/またはCH3領域から本質的になり、これは、ヒンジ、CH2、および/またはCH3領域が、存在する唯一の特定可能な領域であり、すべての他のドメインまたは領域が除外されるが、特定可能な領域の一部ではないさらなるアミノ酸が存在してもよいことを意味する。

D. 膜貫通ドメイン
本開示のポリペプチドは、膜貫通ドメインを含んでもよい。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、膜にわたる疎水性αヘリックスである。異なる膜貫通ドメインは、異なる受容体安定性を結果としてもたらし得る。

いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、細胞外スペーサーと細胞質領域との間に挿入される。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、細胞外スペーサーと1つまたは複数の共刺激領域との間に挿入される。いくつかの態様において、リンカーは、膜貫通ドメインと1つまたは複数の共刺激領域との間にある。

真核生物（例えば、哺乳動物）細胞の細胞膜中へのポリペプチドの挿入を提供する任意の膜貫通ドメインが、使用に適している可能性がある。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、CD28、CD8、CD4、CD3-ζ、CD134、またはCD7に由来する。

本開示の任意の態様において有用な例示的な膜貫通ドメインは、以下の表中のものを含む。

表：例示的な膜貫通ドメイン配列

E. 細胞質領域
本開示の受容体は、抗原認識後、クラスター化し、シグナルが、細胞質領域を通して細胞に伝達され得る。いくつかの態様において、本明細書に記載される共刺激ドメインは、細胞質領域の一部である。いくつかの態様において、細胞質領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメインおよび1つまたは複数の共刺激ドメインを含んでもよい。

本開示のポリペプチドにおける使用に適している細胞質領域および/または共刺激領域は、抗原結合ドメインに対する抗原の結合を介した活性化に応答して、別個のかつ検出可能なシグナル（例えば、細胞による1つまたは複数のサイトカインの産生の増加；標的遺伝子の転写の変化；タンパク質の活性の変化；細胞挙動の変化、例えば、細胞死；細胞増殖；細胞分化；細胞生存；細胞シグナル伝達応答の調節など）を提供する任意の望ましいシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞質領域は、本明細書に記載されるような少なくとも1つ（例えば、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、6つなど）のITAMモチーフを含む。いくつかの態様において、細胞質領域は、DAP10/CD28型シグナル伝達鎖を含む。

本開示のポリペプチドにおける使用に適している細胞質領域は、免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含有する細胞内シグナル伝達ポリペプチドを含む。ITAMモチーフは、YX1X2(L/I)であり、ここで、X1およびX2は独立して、任意のアミノ酸である。場合によっては、細胞質領域は、1、2、3、4、または5つのITAMモチーフを含む。場合によっては、ITAMモチーフは、エンドドメインにおいて2回繰り返され、ITAMモチーフの第1および第2の例は、6～8アミノ酸によって互いに隔てられ、例えば、(YX1X2(L/I))(X3)n(YX1X2(L/I))であり、ここで、nは、6から8までの整数であり、6～8のX3の各々は、任意のアミノ酸であることができる。

適している細胞質領域は、ITAMモチーフを含有するポリペプチドに由来する、ITAMモチーフ含有部分であり得る。例えば、適している細胞質領域は、任意のITAMモチーフ含有タンパク質由来のITAMモチーフ含有ドメインであることができる。したがって、適しているエンドドメインは、それが由来するタンパク質全体の配列全体を含有する必要はない。適しているITAMモチーフ含有ポリペプチドの例には、以下が含まれるが、それらに限定されない：DAP12、DAP10、FCER1G（Fcε受容体Iγ鎖）；CD3D（CD3δ）；CD3E（CD3ε）；CD3G（CD3γ）；CD3-ζ；およびCD79A（抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖）。

例示的な細胞質領域は、当技術分野において公知である。以下に示す細胞質領域はまた、本開示のCARに組み込まれうる領域の例を提供する。

いくつかの態様において、適している細胞質領域は、完全長DAP12アミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含むことができる。いくつかの態様において、細胞質領域は、FCER1G（FCRG；Fcε受容体Iγ鎖；Fc受容体γ-鎖；fc-εR1-γ；fcRγ；fceRIγ；高親和性免疫グロブリンε受容体サブユニットγ；免疫グロブリンE受容体、高親和性、γ鎖などとしても知られている）に由来する。いくつかの態様において、適している細胞質領域は、完全長FCER1Gアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含むことができる。

いくつかの態様において、細胞質領域は、T細胞表面糖タンパク質CD3δ鎖（CD3D；CD3-DELTA；T3D；CD3抗原、デルタサブユニット；CD3デルタ；CD3δ；CD3d抗原、デルタポリペプチド（TiT3複合体）；OKT3、デルタ鎖；T細胞受容体T3デルタ鎖；T細胞表面糖タンパク質CD3デルタ鎖などとしても知られている）に由来する。いくつかの態様において、適している細胞質領域は、完全長CD3δアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含むことができる。いくつかの態様において、細胞質領域は、T細胞表面糖タンパク質CD3ε鎖（CD3e、CD3ε；T細胞表面抗原T3/Leu-4イプシロン鎖、T細胞表面糖タンパク質CD3イプシロン鎖、AI504783、CD3、CD3イプシロン、T3eなどとしても知られている）に由来する。いくつかの態様において、適している細胞質領域は、完全長CD3εアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含むことができる。いくつかの態様において、細胞質領域は、T細胞表面糖タンパク質CD3γ鎖（CD3G、CD3γ、T細胞受容体T3ガンマ鎖、CD3-GAMMA、T3G、ガンマポリペプチド（TiT3複合体）などとしても知られている）に由来する。いくつかの態様において、適している細胞質領域は、完全長CD3γアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含むことができる。いくつかの態様において、細胞質領域は、T細胞表面糖タンパク質CD3ζ鎖（CD3Z、CD3ζ、T細胞受容体T3ゼータ鎖、CD247、CD3-ZETA、CD3H、CD3Q、T3Z、TCRZなどとしても知られている）に由来する。

いくつかの態様において、適している細胞質領域は、完全長CD3ζアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含むことができる。いくつかの態様において、細胞質領域は、CD79A（B細胞抗原受容体複合体関連タンパク質α鎖；CD79a抗原（免疫グロブリン関連α）；MB-1膜糖タンパク質；ig-α；膜結合免疫グロブリン関連タンパク質；表面IgM関連タンパク質などとしても知られている）に由来する。いくつかの態様において、適している細胞質領域は、完全長CD79Aアミノ酸配列のITAMモチーフ含有部分を含むことができる。

具体的な例示的細胞質領域は、当技術分野において公知であり、さらに以下の表に示される。

表：細胞質領域

F. 共刺激領域
細胞質領域に含まれるものなどの、適している共刺激領域の非限定的な例には、4-1BB（CD137）、CD28、ICOS、OX-40、BTLA、CD27、CD30、GITR、およびHVEM由来のポリペプチドが含まれるが、それらに限定されない。

共刺激領域は、少なくとも20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、もしくは300アミノ酸、多くとも20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、もしくは300アミノ酸、または正確に20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100、150、200、もしくは300アミノ酸、またはその中の任意の導き出せる範囲の長さを有してもよい。いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質4-1BB（TNFRSF9；CD137；CDwl37；ILAなどとしても知られている）の細胞内部分に由来する。いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質CD28（Tp44としても知られている）の細胞内部分に由来する。いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質ICOS（AILIM、CD278、およびCVID1としても知られている）の細胞内部分に由来する。いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質OX-40（TNFRSF4、RP5-902P8.3、ACT35、CD134、OX40、TXGP1Lとしても知られている）の細胞内部分に由来する。いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質BTLA（BTLA1およびCD272としても知られている）の細胞内部分に由来する。いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質CD27（S 152、T14、TNFRSF7、およびTp55としても知られている）の細胞内部分に由来する。いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質CD30（TNFRSF8、D1S166E、およびKi-1としても知られている）の細胞内部分に由来する。いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質GITR（TNFRSF18、RP5-902P8.2、AITR、CD357、およびGITR-Dとしても知られている）の細胞内部分に由来する。いくつかの態様において、共刺激領域は、膜貫通タンパク質HVEM（TNFRSF14、RP3-395M20.6、ATAR、CD270、HVEA、HVEM、LIGHTR、およびTR2としても知られている）の細胞内部分に由来する。

具体的な例示的共刺激ドメインは、以下のアミノ酸配列によって示される。

表：共刺激ドメイン

G. 検出ペプチド
いくつかの態様において、本明細書に記載されるポリペプチドは、検出ペプチドをさらに含んでもよい。適している検出ペプチドには、血球凝集素（HA；例えば、YPYDVPDYA（SEQ ID NO:96））；FLAG（例えば、DYKDDDDK（SEQ ID NO:97））；c-myc（例えば、EQKLISEEDL；SEQ ID NO:98））などが含まれる。他の適している検出ペプチドが、当技術分野において公知である。

H. ペプチドリンカー
いくつかの態様において、本開示のポリペプチドは、ペプチドリンカー（時にはリンカーと呼ばれる）を含む。ペプチドリンカーは、本明細書に記載されるペプチドドメイン/領域のいずれかを隔てるために用いられてもよい。例として、リンカーは、シグナルペプチドと抗原結合ドメインとの間、抗原結合ドメインのVHとVLとの間、抗原結合ドメインとペプチドスペーサーとの間、ペプチドスペーサーと膜貫通ドメインとの間、共刺激領域に隣接して、もしくは共刺激領域のN領域上もしくはC領域上、および/または膜貫通ドメインとエンドドメインとの間にあってもよい。ペプチドリンカーは、多様なアミノ酸配列のいずれかを有し得る。ドメインおよび領域は、他の化学的結合が除外されないが、概して可動性の性質であるペプチドリンカーによって連結することができる。リンカーは、約6～約40アミノ酸長、または約6～約25アミノ酸長のペプチドであることができる。これらのリンカーは、タンパク質をカップリングするために、合成のリンカーをコードするオリゴヌクレオチドを用いることによって、製造することができる。

ある程度の可動性を有するペプチドリンカーを、用いることができる。適しているペプチドリンカーが、概して可動性ペプチドを結果としてもたらす配列を有することを念頭に置いて、ペプチドリンカーは、事実上任意のアミノ酸配列を有してもよい。グリシンおよびアラニンなどの小さなアミノ酸の使用は、可動性ペプチドを作り出すのに有用である。そのような配列の作出は、当業者にとって日常的である。

適しているリンカーは、容易に選択することができ、任意の適している長さ、例えば、4アミノ酸から10アミノ酸、5アミノ酸から9アミノ酸、6アミノ酸から8アミノ酸、または7アミノ酸から8アミノ酸を含む、1アミノ酸（例えば、Gly）から20アミノ酸まで、2アミノ酸から15アミノ酸まで、3アミノ酸から12アミノ酸までのものであることができ、1、2、3、4、5、6、または7アミノ酸であってもよい。

適しているリンカーは、容易に選択することができ、適している様々な長さの任意、例えば、4アミノ酸から10アミノ酸、5アミノ酸から9アミノ酸、6アミノ酸から8アミノ酸、または7アミノ酸から8アミノ酸を含む、1アミノ酸（例えば、Gly）から20アミノ酸まで、2アミノ酸から15アミノ酸まで、3アミノ酸から12アミノ酸までのものであることができ、1、2、3、4、5、6、または7アミノ酸であってもよい。

例となる可動性リンカーには、グリシンポリマーである(G)n、例えば、(GS)n、(GSGGS)n（SEQ ID NO:99）、(G4S)n、および(GGGS)n（SEQ ID NO:100）を含むグリシン-セリンポリマーが含まれ、ここで、nは、少なくとも1の整数である。いくつかの態様において、nは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10（またはその中の任意の導き出せる範囲）である。グリシン-アラニンポリマー、アラニン-セリンポリマー、および他の可動性リンカーが、当技術分野において公知である。グリシンポリマーおよびグリシン-セリンポリマーを、用いることができ；GlyおよびSerは両方とも、比較的構造化されておらず、そのため、成分間の中性テザーとして働くことができる。グリシンポリマーを、用いることができ；グリシンは、アラニンよりも有意に大きなphi-psi空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少ない。例示的なスペーサーは、GGSG（SEQ ID NO:101）、GGSGG（SEQ ID NO:102）、GSGSG（SEQ ID NO:103）、GSGGG（SEQ ID NO:104）、GGGSG（SEQ ID NO:105）、GSSSG（SEQ ID NO:106）などを含むがそれらに限定されない、アミノ酸配列を含むことができる。

さらなる態様において、リンカーは、(EAAAK)n（SEQ ID NO:107）を含み、ここで、nは、少なくとも1の整数である。いくつかの態様において、nは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10（またはその中の任意の導き出せる範囲）である。

I. 追加の修飾およびポリペプチドの増強
追加的に、本開示のポリペプチドは、化学的に修飾されてもよい。ポリペプチドのグリコシル化は、例えば、抗原に対するポリペプチドの親和性を増加させるようにポリペプチド配列内のグリコシル化の1つまたは複数の部位を改変することによって、変更することができる（米国特許第5,714,350号および第6,350,861号）。

本開示のポリペプチドの領域または断片は、SEQ ID NO:1～144のいずれかに対して1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200個、またはそれよりも多いアミノ酸置換、連続したアミノ酸付加、または連続したアミノ酸欠失を有するか、少なくともこれらを有するか、または多くともこれらを有する、アミノ酸配列を有してもよいことが企図される。あるいは、本開示のポリペプチドの領域または断片は、SEQ ID NO:1～144のいずれかに対して50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）同一である、少なくとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）同一である、または多くとも50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100％（またはその中の任意の導き出せる範囲）同一である、アミノ酸配列を含むかまたはそれからなる、アミノ酸配列を有してもよい。さらに、いくつかの態様において、領域または断片は、SEQ ID NO:1～144のいずれかにおける1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500位（1位はSEQ ID NOのN末端である）から始まる、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500個、またはそれよりも多い連続したアミノ酸のアミノ酸領域を含む。本開示のポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは50個、もしくはそれよりも多いバリアントアミノ酸を含んでもよく、またはSEQ ID NO:1～144のいずれかの、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、600個、もしくはそれよりも多い連続したアミノ酸、もしくは多くとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、600個、もしくはそれよりも多い連続したアミノ酸、もしくはその中の任意の導き出せる範囲と、少なくとも60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくは100％類似、同一、もしくは相同であってもよい。

本開示のポリペプチドは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、もしくは615個、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、もしくは615個、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、もしくは615個の置換（またはその中の任意の導き出せる範囲）を含んでもよい。

置換は、SEQ ID NO:1～144のいずれかのアミノ酸1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499、500、501、502、503、504、505、506、507、508、509、510、511、512、513、514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529、530、531、532、533、534、535、536、537、538、539、540、541、542、543、544、545、546、547、548、549、550、551、552、553、554、555、556、557、558、559、560、561、562、563、564、565、566、567、568、569、570、571、572、573、574、575、576、577、578、579、580、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、591、592、593、594、595、596、597、598、599、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、613、614、または650位（またはその中の任意の導き出せる範囲）にあってもよい。

本明細書に記載されるポリペプチドは、少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個、もしくはそれよりも多いアミノ酸、多くとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個、もしくはそれよりも多いアミノ酸、または正確に5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、300、400、500、550、1000個、もしくはそれよりも多いアミノ酸（またはその中の任意の導き出せる範囲）の固定された長さのものであってもよい。

置換バリアントは、典型的には、タンパク質内の1つまたは複数の部位で1つのアミノ酸の別のアミノ酸への交換を含有し、他の機能または特性の喪失を伴うかまたは伴わずに、ポリペプチドの1つまたは複数の特性を調節するように設計されてもよい。置換は、保存的であってもよく、すなわち、1つのアミノ酸が、類似した形状および電荷のもので置き換えられる。保存的置換は、当技術分野において周知であり、例えば、以下の変化を含む：アラニンからセリンへ；アルギニンからリジンへ；アスパラギンからグルタミンまたはヒスチジンへ；アスパラギン酸からグルタミン酸へ；システインからセリンへ；グルタミンからアスパラギンへ；グルタミン酸からアスパラギン酸へ；グリシンからプロリンへ；ヒスチジンからアスパラギンまたはグルタミンへ；イソロイシンからロイシンまたはバリンへ；ロイシンからバリンまたはイソロイシンへ；リジンからアルギニンへ；メチオニンからロイシンまたはイソロイシンへ；フェニルアラニンからチロシン、ロイシン、またはメチオニンへ；セリンからスレオニンへ；スレオニンからセリンへ；トリプトファンからチロシンへ；チロシンからトリプトファンまたはフェニルアラニンへ；およびバリンからイソロイシンまたはロイシンへ。あるいは、置換は、ポリペプチドの機能または活性が影響を受けるように、非保存的であってもよい。非保存的変化は、典型的には、残基を、化学的に類似していない残基で、例えば、非極性または非荷電アミノ酸を極性または荷電アミノ酸で、およびその逆で、置換することを含む。

タンパク質は、組換えであってもよく、またはインビトロで合成されてもよい。あるいは、非組換えタンパク質または組換えタンパク質が、細菌から単離されてもよい。そのようなバリアントを含有する細菌が、組成物および方法において実施されてもよいこともまた、企図される。結果的に、タンパク質を単離する必要がない。

「機能的に等価のコドン」という用語は、アルギニンまたはセリンに対する6つのコドンなどの、同じアミノ酸をコードするコドンを指すように、本明細書において用いられ、かつまた、生物学的に等価のアミノ酸をコードするコドンも指す。

アミノ酸配列および核酸配列は、配列が、タンパク質発現が関わる生物学的タンパク質活性の維持を含む、上記に示される基準を満たす限り、それぞれ、追加のN末端アミノ酸もしくはC末端アミノ酸、または5'配列もしくは3'配列などの、追加の残基を含んでもよいが、依然として本質的に本明細書に開示される配列の1つに示される通りであることもまた、理解される。末端配列の付加は、例えば、コード領域の5'部分または3'部分のいずれかに隣接する様々な非コード配列を含み得る核酸配列に、特に適用される。

以下は、等価な、またはさらには改善された第2世代分子を作出するための、タンパク質のアミノ酸の変化に基づく記述である。例えば、相互作用結合能の著しい喪失なしに、タンパク質構造内のある特定のアミノ酸を、他のアミノ酸に置換することが可能である。構造、例えば、酵素触媒ドメインまたは相互作用成分は、そのような機能を維持するため、置換されたアミノ酸を有していてもよい。タンパク質の生物学的機能活性を定めるのは、タンパク質の相互作用能および性質であるため、タンパク質配列およびその基礎となるDNAコード配列において、ある特定のアミノ酸置換を施しても、類似の特性を有するタンパク質を作製することは可能である。したがって、本発明者らは、生物学的な利用可能性または活性を著しく失うことなく、遺伝子のDNA配列に様々な変化を施し得ることを企図する。

他の態様において、ポリペプチドの機能の変更は、1つまたは複数の置換を導入することによって意図される。例えば、ある特定のアミノ酸が、相互作用成分の相互作用的結合能力を改変する意図で、タンパク質構造中の他のアミノ酸の代わりに用いられてもよい。例えば、タンパク質相互作用ドメイン、核酸相互作用ドメイン、および触媒部位などの構造は、そのような機能を変更するために置換されたアミノ酸を有してもよい。そのタンパク質の生物学的機能活性を定義するのは、タンパク質の相互作用的な能力および性質であるため、ある特定のアミノ酸置換を、タンパク質配列において、およびその基礎となるDNAコード配列において行うことができ、それにもかかわらず、異なる特性を有するタンパク質を生じ得る。したがって、それらの生物学的有用性または活性の評価可能な改変を伴う様々な変更を、遺伝子のDNA配列において行ってもよいことが、本発明者らによって企図される。

そのような変更を行う際に、アミノ酸のハイドロパシー指数が考慮されてもよい。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際のハイドロパシーアミノ酸指数の重要性は、概して、当技術分野において理解されている（Kyte and Doolittle, 1982）。アミノ酸の相対的なハイドロパシー特性が、結果として生じるタンパク質の二次構造に寄与し、それが次に、タンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、DNA、抗体、抗原などとの相互作用を規定することが認められている。

同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行われ得ることもまた、当技術分野において理解されている。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,554,101号は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配されるようなタンパク質の最大局所平均親水性が、タンパク質の生物学的特性と相関することを述べている。アミノ酸を、類似した親水性値を有する別のアミノ酸で置換することができ、依然として生物学的に等価かつ免疫学的に等価のタンパク質を生じ得ることが理解される。

上記で概説されるように、アミノ酸置換は、概して、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づく。前述の様々な特徴を考慮に入れた例示的な置換は、周知であり、以下を含む：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン。

具体的な態様において、本明細書に記載されるタンパク質のすべてまたは一部はまた、従来の技法に従って、溶液中または固体支持体上で合成することもできる。様々な自動合成機が市販されており、公知のプロトコルに従って用いることができる。例えば、各々が参照により本明細書に組み入れられるStewart and Young, (1984)；Tam et al., (1983)；Merrifield, (1986)；およびBarany and Merrifield (1979)を参照されたい。あるいは、ペプチドまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、発現ベクター中に挿入し、適切な宿主細胞中に形質転換またはトランスフェクトし、発現に適している条件下で培養する、組換えDNA技術が使用されてもよい。

1つの態様は、タンパク質の産生および/または提示のための、微生物を含む細胞への遺伝子導入の使用を含む。関心対象のタンパク質の遺伝子を、適切な宿主細胞中に導入し、続いて、適切な条件下で細胞を培養してもよい。事実上任意のポリペプチドをコードする核酸が、使用されてもよい。組換え発現ベクター、およびその中に含まれる要素の生成は、本明細書で議論される。あるいは、産生されるタンパク質は、タンパク質産生に用いられる細胞によって通常合成される、内在性タンパク質であってもよい。

III. 細胞
ある特定の態様は、本開示のポリペプチドまたは核酸を含む細胞に関する。いくつかの態様において、細胞は免疫細胞またはT細胞である。「T細胞」には、Tヘルパー細胞、インバリアントナチュラルキラーT（iNKT）細胞、細胞傷害性T細胞、T制御性細胞（Treg）、γ-δT細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、および好中球を含む、CD3を発現するすべてのタイプの免疫細胞が含まれる。T細胞は、CD4+ T細胞またはCD8+ T細胞を指してもよい。

適している哺乳動物細胞には、初代細胞および不死化細胞株が含まれる。適している哺乳動物細胞株には、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株などが含まれる。適している哺乳動物細胞株には、HeLa細胞（例えば、American Type Culture Collection（ATCC）番号CCL-2）、CHO細胞（例えば、ATCC番号CRL9618、CCL61、CRL9096）、ヒト胚性腎臓（HEK）293細胞（例えば、ATCC番号CRL-1573）、Vero細胞、NIH 3T3細胞（例えば、ATCC番号CRL-1658）、Huh-7細胞、BHK細胞（例えば、ATCC番号CCL10）、PC12細胞（ATCC 番号CRL1721）、COS細胞、COS-7細胞（ATCC番号CRL1651）、RATI細胞、マウスL細胞（ATCC番号CCLI.3）、HLHepG2細胞、Hut-78、Jurkat、HL-60、NK細胞株（例えば、NKL、NK92、およびYTS）などが含まれるが、それらに限定されない。

いくつかの例において、細胞は、不死化細胞株ではなく、その代わりに、個体から得られた細胞（例えば、初代細胞）である。例えば、場合によっては、細胞は、個体から得られた免疫細胞である。例として、細胞は、個体から得られたTリンパ球である。別の例として、細胞は、個体から得られた細胞傷害性細胞である。別の例として、細胞は、個体から得られた幹細胞（例えば、末梢血幹細胞）または前駆細胞である。

IV. ゲノムDNAを改変するための方法
ある特定の態様において、ゲノムDNAは、追加の変異、挿入、もしくは欠失を含むように、または構築物をゲノムDNAから発現させるために本開示のある特定の分子構築物を組み込むように、のいずれかで改変される。いくつかの態様において、本開示のポリペプチドをコードする核酸は、細胞のゲノムDNA中に組み込まれる。いくつかの態様において、核酸は、レンチウイルスまたはレトロウイルス形質導入による遺伝子導入などの、ウイルス形質導入を介して細胞中に組み込まれる。いくつかの態様において、ゲノムDNAは、本開示のポリペプチド（例えば、CAR）をコードする核酸の、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターを介した宿主細胞のゲノム中への組込みによって改変される。

いくつかの態様において、組込みは標的組込みである。いくつかの態様において、標的組込みは、部位特異的リコンビナーゼおよび/またはターゲティングエンドヌクレアーゼなどの、DNA消化剤/ポリヌクレオチド修飾酵素の使用を通して達成される。「DNA消化剤」という用語は、核酸のヌクレオチドサブユニット間の結合（すなわち、ホスホジエステル結合）を切断することができる剤を指す。1つの具体的な標的は、TRAC（T細胞受容体α定常）遺伝子座である。例えば、細胞に最初に、TRAC（T細胞受容体α定常）遺伝子座を標的とするシングルガイドRNA（sgRNA）と複合体形成したCas9タンパク質からなるリボ核タンパク質（RNP）複合体をエレクトロポレーションする。エレクトロポレーションの15分後に、細胞を、CARをコードするHDR鋳型を保有するAAV6で処理する。別の例においては、二本鎖DNAまたは一本鎖DNAが、HDR鋳型を含み、RNP複合体と一緒にエレクトロポレーションを介して細胞中に導入される。

したがって、1つの局面で、本開示は、標的組込みを含む。これを達成する1つの様式は、部位特異的リコンビナーゼおよび/またはターゲティングエンドヌクレアーゼなどの、少なくとも1つのポリヌクレオチド修飾酵素の少なくとも1つの認識配列を含む外因性核酸配列（すなわち、ランディングパッド）の使用によるものである。部位特異的リコンビナーゼは、当技術分野において周知であり、概して、インベルターゼ、リゾルバーゼ、またはインテグラーゼと呼ばれてもよい。部位特異的リコンビナーゼの非限定的な例には、λインテグラーゼ、Creリコンビナーゼ、FLPリコンビナーゼ、γ-δリゾルバーゼ、Tn3リゾルバーゼ、ΦC31インテグラーゼ、Bxb1-インテグラーゼ、およびR4インテグラーゼが含まれ得る。部位特異的リコンビナーゼは、特異的な認識配列（もしくは認識部位）またはそのバリアントを認識し、そのすべては、当技術分野において周知である。例えば、Creリコンビナーゼは、LoxP部位を認識し、FLPリコンビナーゼは、FRT部位を認識する。

企図されるターゲティングエンドヌクレアーゼには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、CRISPR/Cas様エンドヌクレアーゼ、I-Tevlヌクレアーゼもしくは関連モノマーハイブリッド、または人工標的DNA二本鎖切断誘導剤が含まれる。例示的なターゲティングエンドヌクレアーゼを、以下でさらに説明する。例えば、典型的には、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、DNA結合ドメイン（すなわち、ジンクフィンガー）および切断ドメイン（すなわち、ヌクレアーゼ）を含み、その両方を、以下で説明する。また、ポリヌクレオチド修飾酵素の定義には、例えば、DNA結合ドメインおよびヌクレアーゼを含んでもよい、当業者に公知の任意の他の有用な融合タンパク質も含まれる。

ランディングパット配列は、部位特異的リコンビナーゼおよび/またはターゲティングエンドヌクレアーゼなどの特異的なポリヌクレオチド修飾酵素によって選択的に結合および修飾される少なくとも1つの認識配列を含む、ヌクレオチド配列である。概して、ランディングパッド配列中の認識配列は、改変される細胞のゲノムに内在性に存在しない。例えば、改変される細胞がCHO細胞である場合、ランディングパッド配列中の認識配列は、内在性CHOゲノムに存在しない。標的組込みの割合は、標的細胞のゲノム内に内在性に存在しない高効率ヌクレオチド修飾酵素の認識配列を選択することによって、改善され得る。内在性に存在しない認識配列の選択はまた、潜在的なオフターゲット組込みも低減させる。他の局面において、改変される細胞で天然である認識配列の使用が望ましいことがある。例えば、複数の認識配列がランディングパッド配列において使用される場合、1つまたは複数が外因性であってもよく、かつ1つまたは複数が天然であってもよい。

当業者は、部位特異的リコンビナーゼおよび/またはターゲティングエンドヌクレアーゼによって結合および切断される配列を、容易に決定することができる。

用いることができるターゲティングエンドヌクレアーゼの別の例は、真核細胞の核中へのエンドヌクレアーゼの侵入を可能にする、少なくとも1つの核局在化シグナルを含むRNA誘導型エンドヌクレアーゼである。RNA誘導型エンドヌクレアーゼはまた、少なくとも1つのヌクレアーゼドメイン、およびガイドRNAと相互作用する少なくとも1つのドメインも含む。RNA誘導型エンドヌクレアーゼは、RNA誘導型エンドヌクレアーゼが特異的な染色体配列を切断するように、ガイドRNAによって特異的な染色体配列に方向付けられる。ガイドRNAは標的切断に特異性を提供するため、RNA誘導型エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼは、汎用性であり、異なる標的染色体配列を切断するために異なるガイドRNAと共に用いられてもよい。例示的なRNA誘導型エンドヌクレアーゼタンパク質を、以下でさらに詳細に議論する。例えば、RNA誘導型エンドヌクレアーゼは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspersed short palindromic repeats）（CRISPR）/CRISPR関連（Cas）システムに由来するRNA誘導型エンドヌクレアーゼである、CRISPR/Casタンパク質またはCRISPR/Cas様融合タンパク質であることができる。

ターゲティングエンドヌクレアーゼはまた、メガヌクレアーゼであることができる。メガヌクレアーゼは、大きな認識部位を特徴とするエンドデオキシリボヌクレアーゼであり、すなわち、認識部位は、概して、約12塩基対から約40塩基対の範囲である。この要求の結果として、認識部位は、概して、任意の所与のゲノムにおいて1回のみ生じる。メガヌクレアーゼの中で、「LAGLIDADG」という名称のホーミングエンドヌクレアーゼのファミリーは、ゲノムの研究およびゲノム工学のための価値あるツールになっている。メガヌクレアーゼは、当業者に周知の技法を用いてそれらの認識配列を改変することによって、特異的な染色体配列を標的とし得る。例えば、Epinat et al., 2003, Nuc. Acid Res., 31(11):2952-62およびStoddard, 2005, Quarterly Review of Biophysics, pp. 1-47を参照されたい。

用いることができるターゲティングエンドヌクレアーゼのさらに別の例は、転写活性化因子様エフェクター（TALE）ヌクレアーゼである。TALEは、新たなDNA標的に結合するように容易に操作され得る、植物病原体ザントモナス属（Xanthomonas）由来の転写因子である。TALEまたはその短縮バージョンは、TALEヌクレアーゼまたはTALENと呼ばれるターゲティングエンドヌクレアーゼを作り出すように、FokIなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに連結され得る。例えば、Sanjana et al., 2012, Nature Protocols 7(1):171-192；Bogdanove A J, Voytas D F., 2011, Science, 333(6051):1843-6；Bradley P, Bogdanove A J, Stoddard B L., 2013, Curr Opin Struct Biol., 23(1):93-9を参照されたい。

V. 方法
本開示の局面は、黒色腫などのがんを処置するための方法に関する。さらなる態様において、本明細書に記載される治療用受容体（例えば、CAR）は、免疫応答を刺激するために用いられてもよい。免疫応答刺激は、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで行われてもよい。いくつかの態様において、本明細書に記載される治療用受容体は、再発を予防するためである。方法は、概して、本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、もしくはDNA、RNA（例えば、インビトロ転写されたRNA）、もしくはアデノ随伴ウイルス（AAV）で哺乳動物細胞を遺伝子改変すること、またはポリペプチドを細胞に直接導入することを含む。細胞は、免疫細胞（例えば、Tリンパ球またはNK細胞）、幹細胞、前駆細胞などであることができる。いくつかの態様において、細胞は、本明細書に記載される細胞である。

いくつかの態様において、遺伝子改変は、エクスビボで実施される。例えば、Tリンパ球、幹細胞、またはNK細胞（または本明細書に記載される細胞）は、個体から得られ；個体から得られた細胞は、本開示のポリペプチドを発現するように遺伝子改変される。場合によっては、遺伝子改変された細胞は、エクスビボで活性化される。他の場合には、遺伝子改変された細胞は、個体（例えば、細胞が得られた個体）中に導入され；かつ遺伝子改変された細胞は、インビボで活性化される。

いくつかの態様において、方法は、がんの処置のための本明細書に記載される細胞もしくはペプチドの投与、またはがんを有する人に対する投与に関する。いくつかの態様において、がんはCD20⁺がんである。いくつかの態様において、がんは黒色腫である。

VI. 付加的な治療法
A. 免疫療法
いくつかの態様において、方法は、がん免疫療法の投与を含む。がん免疫療法（時には、IOと省略される免疫腫瘍学と呼ばれる）は、がんを処置するための免疫系の使用である。免疫療法は、能動的、受動的、またはハイブリッド（能動的および受動的）に分類することができる。これらのアプローチは、がん細胞が多くの場合、腫瘍関連抗原（TAA）として知られる、免疫系によって検出され得る分子をその表面上に有し；それらは多くの場合、タンパク質または他の高分子（例えば、炭水化物）であるという事実を活用する。能動免疫療法は、TAAを標的とすることによって腫瘍細胞を攻撃するように、免疫系を方向付ける。受動免疫療法は、既存の抗腫瘍応答を増強し、モノクローナル抗体、リンパ球、およびサイトカインの使用を含む。本開示の方法において有用な免疫療法を、以下で説明する。

1. チェックポイント阻害剤および併用処置
本開示の態様は、免疫チェックポイント阻害剤（チェックポイント阻害剤療法とも呼ばれる）の投与を含んでもよく、これを、以下でさらに説明する。チェックポイント阻害剤療法は、1つの細胞チェックポイントタンパク質のみを標的とする単剤療法であってもよく、または少なくとも2つの細胞チェックポイントタンパク質を標的とする併用療法であってもよい。例えば、チェックポイント阻害剤単剤療法は、PD-1、PD-L1、もしくはPD-L2阻害剤のうちの1つを含んでもよく、またはCTLA-4、B7-1、もしくはB7-2阻害剤のうちの1つを含んでもよい。チェックポイント阻害剤併用療法は、PD-1、PD-L1、またはPD-L2阻害剤のうちの1つを含んでもよく、かつ組み合わせて、CTLA-4、B7-1、またはB7-2阻害剤のうちの1つをさらに含んでもよい。併用療法における阻害剤の組み合わせは、同じ組成物中にある必要はないが、同時に、実質的に同時に、または阻害剤の両方の周期的投与を含む投薬レジメンにおいてのいずれかで投与することができ、周期は、本明細書に記載される時間周期であってもよい。

a. PD-1、PD-L1、およびPD-L2阻害剤
PD-1は、T細胞が感染または腫瘍に遭遇する腫瘍微小環境において作用することができる。活性化されたT細胞は、末梢組織において、PD-1を上方制御し、発現し続ける。IFN-γなどのサイトカインは、上皮細胞および腫瘍細胞上のPD-L1の発現を誘導する。PD-L2は、マクロファージおよび樹状細胞上に発現している。PD-1の主な役割は、末梢においてエフェクターT細胞の活性を限定し、免疫応答中の組織に対する過剰な損傷を防ぐことである。本開示の阻害剤は、PD-1および/またはPD-L1活性の1つまたは複数の機能を遮断し得る。

「PD-1」の代替名には、CD279およびSLEB2が含まれる。「PD-L1」の代替名には、B7-H1、B7-4、CD274、およびB7-Hが含まれる。「PD-L2」の代替名には、B7-DC、Btdc、およびCD273が含まれる。いくつかの態様において、PD-1、PD-L1、およびPD-L2は、ヒトPD-1、PD-L1、PD-L2である。

いくつかの態様において、PD-1阻害剤は、PD-1のそのリガンド結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な局面において、PD-1リガンド結合パートナーは、PD-L1および/またはPD-L2である。別の態様において、PD-L1阻害剤は、PD-L1のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な局面において、PD-L1結合パートナーは、PD-1および/またはB7-1である。別の態様において、PD-L2阻害剤は、PD-L2のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な局面において、PD-L2結合パートナーはPD-1である。阻害剤は、抗体、その抗原結合断片/領域、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであってもよい。例示的な抗体は、参照により本明細書にすべて組み入れられる米国特許第8,735,553号、第8,354,509号、および第8,008,449号に記載されている。本明細書で提供される方法および組成物における使用のための他のPD-1阻害剤は、参照により本明細書にすべて組み入れられる米国特許出願番号US2014/0294898、US2014/022021、およびUS2011/0008369に記載されているように、当技術分野において公知である。

いくつかの態様において、PD-1阻害剤は、抗PD-1抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）である。いくつかの態様において、抗PD-1抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびピジリズマブからなる群より選択される。いくつかの態様において、PD-1阻害剤は、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のFc領域）に融合したPD-L1またはPD-L2の細胞外またはPD-1結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの態様において、PD-L1阻害剤はAMP-224を含む。ニボルマブは、MDX-1106-04、MDX-1106、ONO-4538、BMS-936558、およびOPDIVO（登録商標）としても知られ、WO2006/121168に記載されている抗PD-1抗体である。ペムブロリズマブは、MK-3475、Merck 3475、ラムブロリズマブ、KEYTRUDA（登録商標）、およびSCH-900475としても知られ、WO2009/114335に記載されている抗PD-1抗体である。ピジリズマブは、CT-011、hBAT、またはhBAT-1としても知られ、WO2009/101611に記載されている抗PD-1抗体である。AMP-224は、B7-DCIgとしても知られ、WO2010/027827およびWO2011/066342に記載されているPD-L2-Fc融合可溶性受容体である。追加のPD-1阻害剤には、AMP-514としても知られるMEDI0680、およびREGN2810が含まれる。

いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、MEDI4736としても知られるデュルバルマブ、MPDL3280Aとしても知られるアテゾリズマブ、MSB00010118Cとしても知られるアベルマブ、MDX-1105、BMS-936559、またはそれらの組み合わせなどのPD-L1阻害剤である。ある特定の局面において、免疫チェックポイント阻害剤は、rHIgM12B7などのPD-L2阻害剤である。

いくつかの態様において、阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、またはピジリズマブの重鎖および軽鎖のCDRまたはVRを含む。したがって、1つの態様において、阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、またはピジリズマブのVH領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン、ならびにニボルマブ、ペムブロリズマブ、またはピジリズマブのVL領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインを含む。別の態様において、抗体は、結合について上述の抗体と競合し、かつ/または上述の抗体と同じPD-1、PD-L1、もしくはPD-L2上のエピトープに結合する。別の態様において、抗体は、上述の抗体と少なくとも約70、75、80、85、90、95、97、または99％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の可変領域アミノ酸配列同一性を有する。

b. CTLA-4、B7-1、およびB7-2阻害剤
本明細書で提供される方法において標的とすることができる別の免疫チェックポイントは、CD152としても知られる細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4（CTLA-4）である。ヒトCTLA-4の完全なcDNA配列は、Genbankアクセッション番号L15006を有する。CTLA-4は、T細胞の表面上に見出され、抗原提示細胞の表面上のB7-1（CD80）またはB7-2（CD86）に結合した時に「オフ」スイッチとして作用する。CTLA-4は、ヘルパーT細胞の表面上に発現し、T細胞に抑制性シグナルを伝達する、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。CTLA-4は、T細胞共刺激タンパク質であるCD28に類似しており、両方の分子は、抗原提示細胞上のB7-1およびB7-2に結合する。CTLA-4は、T細胞に抑制性シグナルを伝達するのに対して、CD28は、刺激性シグナルを伝達する。細胞内CTLA-4はまた、制御性T細胞においても見出され、それらの機能に重要であり得る。T細胞受容体およびCD28を通したT細胞活性化は、B7分子に対する抑制性受容体であるCTLA-4の発現の増加をもたらす。本開示の阻害剤は、CTLA-4、B7-1、および/またはB7-2活性の1つまたは複数の機能を遮断し得る。いくつかの態様において、阻害剤は、CTLA-4とB7-1との相互作用を遮断する。いくつかの態様において、阻害剤は、CTLA-4とB7-2との相互作用を遮断する。

いくつかの態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、抗CTLA-4抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。

本発明の方法における使用に適している抗ヒトCTLA-4抗体（またはそれに由来するVHおよび/もしくはVLドメイン）は、当技術分野において周知の方法を用いて生成することができる。あるいは、当技術分野で認識されている抗CTLA-4抗体を使用することができる。例えば、US 8,119,129、WO 01/14424、WO 98/42752；WO 00/37504（トレメリムマブ；以前はチシリムマブとしても知られている、CP675,206）、米国特許第6,207,156号；Hurwitz et al., 1998に開示されている抗CTLA-4抗体を、本明細書に開示される方法において使用することができる。前述の刊行物の各々の教示は、参照により本明細書に組み入れられる。CTLA-4に対する結合について当技術分野で認識されているこれらの抗体のいずれかと競合する抗体もまた、使用することができる。例えば、ヒト化CTLA-4抗体は、参照により本明細書にすべて組み入れられる国際特許出願番号WO2001/014424、WO2000/0377504、および米国特許第8,017,114号に記載されている。

本開示の方法および組成物においてチェックポイント阻害剤として有用なさらなる抗CTLA-4抗体は、イピリムマブ（10D1、MDX- 010、MDX- 101、およびYervoy（登録商標）としても知られる）、またはその抗原結合断片およびバリアントである（例えば、WO01/14424を参照されたい）。

いくつかの態様において、阻害剤は、トレメリムマブまたはイピリムマブの重鎖および軽鎖のCDRまたはVRを含む。したがって、1つの態様において、阻害剤は、トレメリムマブまたはイピリムマブのVH領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメイン、ならびにトレメリムマブまたはイピリムマブのVL領域のCDR1、CDR2、およびCDR3ドメインを含む。別の態様において、抗体は、結合について上述の抗体と競合し、かつ/または上述の抗体と同じPD-1、B7-1、もしくはB7-2上のエピトープに結合する。別の態様において、抗体は、上述の抗体と少なくとも約70、75、80、85、90、95、97、または99％（またはその中の任意の導き出せる範囲）の可変領域アミノ酸配列同一性を有する。

2. 共刺激分子の阻害
いくつかの態様において、免疫療法は、共刺激分子の阻害剤を含む。いくつかの態様において、阻害剤は、B7-1（CD80）、B7-2（CD86）、CD28、ICOS、OX40（TNFRSF4）、4-1BB（CD137；TNFRSF9）、CD40L（CD40LG）、GITR（TNFRSF18）の阻害剤、およびそれらの組み合わせを含む。阻害剤には、阻害性抗体、ポリペプチド、化合物、および核酸が含まれる。

3. 樹状細胞療法
樹状細胞療法は、樹状細胞に、リンパ球に対して腫瘍抗原を提示させ、これが、それらを活性化し、抗原を提示する他の細胞を殺傷するようにそれらをプライミングすることによって、抗腫瘍応答を誘発する。樹状細胞は、哺乳動物免疫系における抗原提示細胞（APC）である。がんの処置において、それらは、がん抗原ターゲティングを助ける。樹状細胞に基づく細胞がん療法の1つの例は、sipuleucel-Tである。

腫瘍抗原を提示するように樹状細胞を誘導する1つの方法は、自己腫瘍溶解物または短いペプチド（がん細胞上のタンパク質抗原に対応するタンパク質の小さな部分）でのワクチン接種によるものである。これらのペプチドは、多くの場合、免疫応答および抗腫瘍応答を増加させるために、アジュバント（高度に免疫原性の物質）と組み合わせて与えられる。他のアジュバントには、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）などの、樹状細胞を誘引および/または活性化するタンパク質または他の化学物質が含まれる。

樹状細胞はまた、腫瘍細胞にGM-CSFを発現させることによって、インビボで活性化することができる。これは、GM-CSFを産生するように腫瘍細胞を遺伝子操作すること、またはGM-CSFを発現する腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍細胞に感染させることのいずれかによって、達成することができる。

別の戦略は、患者の血液から樹状細胞を取り出し、それらを体外で活性化することである。樹状細胞は、単一の腫瘍特異的ペプチド/タンパク質または腫瘍細胞溶解物（壊れた腫瘍細胞の溶液）であってもよい、腫瘍抗原の存在下で活性化される。これらの細胞を（任意のアジュバントと共に）注入し、免疫応答を誘発する。

樹状細胞療法は、樹状細胞の表面上の受容体に結合する抗体の使用を含む。抗原を、抗体に加えることができ、樹状細胞が成熟して、腫瘍に対する免疫を提供するように誘導することができる。

4. サイトカイン療法
サイトカインは、腫瘍内に存在する多くのタイプの細胞によって産生されるタンパク質である。それらは、免疫応答を調節することができる。腫瘍は多くの場合、成長し、免疫応答を低減させることを可能にするために、それらを使用する。これらの免疫調節効果により、免疫応答を誘発する薬物としてそれらを用いることが可能になる。一般的に用いられる2つのサイトカインは、インターフェロンおよびインターロイキンである。

インターフェロンは、免疫系によって産生される。それらは通常、抗ウイルス応答に関与しているが、がんについての用途も有する。それらは、3つの群：I型（IFNαおよびIFNβ）、II型（IFNγ）、ならびにIII型（IFNλ）に分類される。

インターロイキンは、数々の免疫系効果を有する。IL-2は、例示的なインターロイキンサイトカイン療法である。

5. 養子T細胞療法
養子T細胞療法は、T細胞の輸注（養子細胞移入）による受動免疫の形態である。それらは、血液および組織において見出され、通常、外来病原体を見出した時に活性化する。具体的には、それらは、T細胞の表面受容体が、その表面抗原上に外来タンパク質の一部を提示する細胞に遭遇した時に活性化する。これらは、感染細胞または抗原提示細胞（APC）のいずれかであることができる。それらは、正常組織において、および腫瘍組織において見出され、そこでは、それらは腫瘍浸潤リンパ球（TIL）として知られている。それらは、腫瘍抗原を提示する樹状細胞などのAPCの存在によって活性化される。これらの細胞は、腫瘍を攻撃することができるが、腫瘍内の環境は、高度に免疫抑制性であり、免疫媒介性の腫瘍死を防ぐ。

腫瘍標的T細胞を製造する、および取得する複数の方法が、開発されてきている。腫瘍抗原に特異的なT細胞は、腫瘍試料（TIL）から取り出すか、または血液から濾過することができる。その後の活性化および培養は、エクスビボで行い、結果を再注入する。腫瘍標的T細胞は、遺伝子治療によって生成することができる。腫瘍標的T細胞は、T細胞を腫瘍抗原に曝露することによって、増大させることができる。

いくつかの態様において、養子細胞治療において使用される治療用細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）を発現する。CARは、（scFvであり得る）細胞外抗原結合ドメイン、細胞外スペーサー、膜貫通ドメイン、共刺激シグナル伝達領域（その数は具体的なCAR設計によって異なる）、およびCD3ζシグナル伝達ドメイン/エンドドメインから一般的に構成される融合タンパク質である。

いくつかの態様において、養子細胞治療において使用される治療用細胞は、腫瘍抗原を標的とする異種TCR分子である、操作されたT細胞受容体（TCR）を発現する。免疫細胞、例えば、T細胞およびナチュラルキラー（NK）細胞は、当技術分野において公知の多様な方法、例えば、ウイルス形質導入、DNAヌクレオフェクション、およびRNAヌクレオフェクションによって、CARまたはTCRを発現するように操作され得る。CARまたはTCRの抗原標的との結合は、CARまたはTCRを発現するヒトT細胞を活性化することができ、それは、抗原を保持する細胞の死滅またはその他の何らかの免疫学的応答をもたらし得る。

いくつかの態様において、細胞は、がん特異的なCARまたはTCRを含む。CARポリペプチドまたはTCRポリペプチドに関して、「がん特異的」という用語は、がん特異的分子、例えば、がん特異的抗原に対して抗原結合特異性を有するポリペプチドをさす。いくつかの態様において、がん特異的なCARおよびもう1つのCARは、別々のポリペプチド上にある。

B. 腫瘍溶解性ウイルス
いくつかの態様において、付加的な治療法は、腫瘍溶解性ウイルスを含む。腫瘍溶解性ウイルスとは、がん細胞に優先的に感染し、殺傷するウイルスである。感染したがん細胞は、腫瘍溶解によって破壊されるため、それらは、新たな感染性ウイルス粒子またはビリオンを放出して、残っている腫瘍を破壊するのを手助けする。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞の直接破壊を引き起こすだけではなく、長期の免疫療法のために宿主の抗腫瘍免疫応答を刺激するとも考えられている。

C. 多糖類
いくつかの態様において、付加的な治療法は、多糖類を含む。キノコにおいて見出されるある特定の化合物、主として多糖類は、免疫系を上方制御することができ、抗がん特性を有する可能性がある。例えば、レンチナンなどのβ-グルカンは、マクロファージ、NK細胞、T細胞、および免疫系サイトカインを刺激することが実験室の研究において示されており、免疫学的アジュバントとして臨床試験で調査されている。

D. 新生抗原
いくつかの態様において、付加的な治療法は、新生抗原変異のターゲティングを含む。多くの腫瘍は、変異を発現する。これらの変異は、潜在的に、T細胞免疫療法における使用のための新たな標的化可能な抗原（新生抗原）を作り出す。がん病変におけるCD8+ T細胞の存在は、RNAシーケンシングデータを用いて特定されるように、高い変異負荷を有する腫瘍において、より高い。ナチュラルキラー細胞およびT細胞の細胞溶解活性に関連する転写産物のレベルは、多くのヒト腫瘍における変異荷重と正の相関がある。

E. 化学療法
いくつかの態様において、付加的な治療法は、化学療法を含む。化学療法剤の適しているクラスには、以下が含まれる：（a）アルキル化剤、例えば、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミンおよびメチルメラミン（例えば、ヘキサメチルメラミン、チオテパ）、アルキルスルホナート（例えば、ブスルファン）、ニトロ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、クロロゾチシン（chlorozoticin）、ストレプトゾシン）、ならびにトリアジン（例えば、ジカルバジン（dicarbazine））、（b）代謝拮抗薬、例えば、葉酸類似体（例えば、メトトレキサート）、ピリミジン類似体（例えば、5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、アザウリジン）、ならびにプリン類似体および関連物質（例えば、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、ペントスタチン）、（c）天然物、例えば、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、テニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、およびミトキサントロン）、酵素（例えば、L-アスパラギナーゼ）、ならびに生物学的応答修飾因子（例えば、インターフェロン-α）、ならびに、（d）種々雑多な剤、例えば、白金配位錯体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン）、置換尿素（例えば、ヒドロキシ尿素）、メチルヒジアジン（methylhydiazine）誘導体（例えば、プロカルバジン）、ならびに副腎皮質抑制薬（例えば、taxolおよびミトタン）。いくつかの態様において、シスプラチンは、特に適している化学療法剤である。

シスプラチンは、例えば、転移性精巣がんもしくは卵巣がん、進行性膀胱がん、頭頸部がん、子宮頸がん、肺がん、または他の腫瘍などのがんを処置するために、広く使用されている。シスプラチンは、経口で吸収されず、したがって、例えば、静脈内、皮下、腫瘍内、または腹腔内注射などの他の経路を介して送達しなければならない。シスプラチンは、単独で、または他の剤との組み合わせで使用することができ、ある特定の態様において企図される合計で3つのコースにわたって、3週間ごとに5日間の約15 mg/m2～約20 mg/m2を含む効果的な用量が、臨床応用において使用される。いくつかの態様において、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されたEgr-1プロモーターを含む構築物と共に、細胞および/または対象に送達されるシスプラチンの量は、シスプラチンを単独で使用する時に送達される量よりも少ない。

他の適している化学療法剤には、抗微小管剤、例えば、パクリタキセル（「Taxol」）および塩酸ドキソルビシン（「ドキソルビシン」）が含まれる。アデノウイルスベクターを介して送達されるEgr-1プロモーター/TNFα構築物とドキソルビシンとの組み合わせは、化学療法および/またはTNF-αに対する抵抗性を克服するのに有効であると判定され、これは、構築物とドキソルビシンとの併用処置が、ドキソルビシンおよびTNF-αの両方に対する抵抗性を克服することを示唆する。

ドキソルビシンは、吸収が不十分であり、好ましくは、静脈内投与される。ある特定の態様において、成人に対する適切な静脈内用量は、約21日間隔での約60 mg/m2～約75 mg/m2、または約3週間から約4週間の間隔で反復される、連続した2日もしくは3日の各々の約25 mg/m2～約30 mg/m2、または1週間に1回の約20 mg/m2を含む。以前の化学療法もしくは新生物性骨髄浸潤によって引き起こされた以前の骨髄抑制がある場合、または薬物が他の骨髄造血抑制薬と組み合わされる場合は、最低用量が、高齢患者において使用されるべきである。

ナイトロジェンマスタードは、本開示の方法において有用な、別の適している化学療法剤である。ナイトロジェンマスタードには、メクロレタミン（HN2）、シクロホスファミドおよび/またはイホスファミド、メルファラン（L-サルコリシン）、ならびにクロラムブシルが含まれ得るが、それらに限定されない。シクロホスファミド（CYTOXAN（登録商標））は、Mead Johnsonから入手可能であり、NEOSTAR（登録商標）は、Adriaから入手可能であり、別の適している化学療法剤である。成人に適している経口用量は、例えば、約1 mg/kg/日～約5 mg/kg/日を含み、静脈内用量は、例えば、最初に、約2日から約5日の期間にわたる分割用量での約40 mg/kg～約50 mg/kg、または約7日から約10日ごとの約10 mg/kg～約15 mg/kg、または1週間に2回の約3 mg/kg～約5 mg/kg、または約1.5 mg/kg/日～約3 mg/kg/日を含む。有害な胃腸効果のために、静脈内経路が好ましい。薬物はまた、時には、浸潤によって筋肉内に、または体腔中に投与される。

追加の適している化学療法剤には、ピリミジン類似体、例えば、シタラビン（シトシンアラビノシド）、5-フルオロウラシル（フルオウラシル（fluouracil）；5-FU）、およびフロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン；FudR）が含まれる。5-FUは、約7.5から約1000 mg/m2のどこかの投薬量で対象に投与されてもよい。さらに、5-FU投薬スケジュールは、様々な期間、例えば、最大で6週間、または本開示が関係する当業者によって決定される通りであってもよい。

別の適している化学療法剤であるゲムシタビン二リン酸（GEMZAR（登録商標）、Eli Lilly & Co.、「ゲムシタビン」）は、進行性および転移性膵臓がんの処置に推奨され、したがって、これらのがんに対して本開示において同様に有用であろう。

患者に送達される化学療法剤の量は、可変であり得る。1つの適している態様において、化学療法が構築物と共に投与される場合、化学療法剤は、宿主においてがんの停止または退縮を引き起こすのに有効な量で投与されてもよい。他の態様において、化学療法剤は、化学療法剤の化学療法有効用量よりも2から10,000倍少ない量で投与されてもよい。例えば、化学療法剤は、化学療法剤の化学療法有効用量よりも約20倍少ない、約500倍少ない、またはさらには約5000倍少ない量で投与されてもよい。本開示の化学療法薬は、構築物との組み合わせでの所望の治療活性について、および有効投薬量の決定について、インビボで試験することができる。例えば、そのような化合物は、ヒトにおいて試験する前に、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギなどを含むがそれらに限定されない、適している動物モデル系において試験することができる。実施例に記載されるように、インビトロ試験がまた、適している組み合わせおよび投薬量を決定するために用いられてもよい。

F. 放射線療法
いくつかの態様において、付加的な治療法または以前の治療法は、電離放射線などの放射線照射を含む。本明細書において用いられる場合、「電離放射線」は、十分なエネルギーを有するか、または電離（電子の獲得もしくは喪失）を生じるために核相互作用を介して十分なエネルギーを生じることができる、粒子または光子を含む放射線を意味する。例示的な、かつ好ましい電離放射線は、x線照射である。標的組織または細胞にx線照射を送達するための手段は、当技術分野において周知である。

いくつかの態様において、電離放射線の量は、20 Gyより大きく、1回の線量で投与される。いくつかの態様において、電離放射線の量は、18 Gyであり、3回の線量で投与される。いくつかの態様において、電離放射線の量は、少なくとも2、4、6、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、18、19、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは40 Gy、多くとも2、4、6、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、18、19、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは40 Gy、または正確に2、4、6、8、10、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、18、19、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、もしくは40 Gy（またはその中の任意の導き出せる範囲）である。いくつかの態様において、電離放射線は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10回、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10回、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、もしくは10回の線量（またはその中の任意の導き出せる範囲）で投与される。1回よりも多い線量が投与される場合、線量は、約1、4、8、12、もしくは24時間、または1、2、3、4、5、6、7、もしくは8日、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、もしくは16週間離れていてもよく、またはその中の任意の導き出せる範囲であってもよい。

いくつかの態様において、IRの量は、IRの総線量として提示されてもよく、次いで、それが分割線量で投与される。例えば、いくつかの態様において、総線量は、50 Gyであり、各々5 Gyの10回の分割線量で投与される。いくつかの態様において、総線量は、50～90 Gyであり、各々2～3 Gyの20～60回の分割線量で投与される。いくつかの態様において、IRの総線量は、少なくとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、もしくは150、多くとも20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、もしくは150、または約20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、125、130、135、140、もしくは150（またはその中の任意の導き出せる範囲）である。いくつかの態様において、総線量は、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50 Gy、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50 Gy、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、15、20、25、30、35、40、45、もしくは50 Gy（またはその中の任意の導き出せる範囲）の分割用量で投与される。いくつかの態様において、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40,41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100回、多くとも2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40,41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100回、または正確に2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40,41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100回の分割用量が投与される（またはその中の任意の導き出せる範囲）。いくつかの態様において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12回、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12回、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12回（またはその中の任意の導き出せる範囲）の分割用量が、1日あたりに投与される。いくつかの態様において、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30回、多くとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30回、または正確に1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30回（またはその中の任意の導き出せる範囲）の分割用量が、1週あたりに投与される。

G. 手術
がんを有する人のおよそ60％は、予防的、診断的または病期分類、治癒的、および対症的な手術を含む、いくつかのタイプの手術を受けるであろう。治癒的手術は、がん性組織のすべてまたは一部が物理的に除去され、摘出され、かつ/または破壊される切除を含み、本態様の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法、および/または代替療法などの、他の治療法と共に用いられてもよい。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。手術による処置には、腫瘍切除に加えて、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡制御手術（モース手術）が含まれる。

がん性細胞、組織、または腫瘍の一部またはすべての摘出時には、身体に空洞が形成される可能性がある。処置は、灌流、直接注射、または追加の抗がん療法での領域の局所適用によって達成されてもよい。そのような処置は、例えば、1、2、3、4、5、6、もしくは7日ごと、または1、2、3、4、および5週間ごと、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、もしくは12か月ごとに繰り返されてもよい。これらの処置は、同様に変動する投与量のものであってもよい。

H. 他の剤
処置の治療効力を改善するために、他の剤が、本態様のある特定の局面と組み合わせて使用されてもよいことが企図される。これらの追加の剤には、細胞表面受容体およびギャップ結合の上方制御に影響を及ぼす剤、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導物質に対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる剤、または他の生物学的剤が含まれる。ギャップ結合の数を増やすことによる細胞間シグナル伝達の増加は、近隣の過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増加させるであろう。他の態様において、細胞増殖抑制剤または分化剤を、処置の抗過剰増殖効力を改善するために、本態様のある特定の局面と組み合わせて使用することができる。細胞接着の阻害剤は、本態様の効力を改善するために企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着班キナーゼ（FAK）阻害剤およびロバスタチンである。抗体c225などの、アポトーシスに対する過剰増殖細胞の感受性を増加させる他の剤が、処置効力を改善するために、本態様のある特定の局面と組み合わせて使用され得ることが、さらに企図される。

がんの処置は、本明細書に記載されるがんの処置のいずれかを除外してもよいことが企図される。さらに、本開示の態様は、本明細書に記載される治療法について以前に処置されたことがある、本明細書に記載される治療法について現在処置されている、または本明細書に記載される治療法について処置されたことがない患者を含む。いくつかの態様において、患者は、本明細書に記載される治療法に対して抵抗性であると決定されている患者である。いくつかの態様において、患者は、本明細書に記載される治療法に対して感受性であると決定されている患者である。

VII. 薬学的組成物
本開示は、その必要がある対象において疾患を処置するため、および免疫応答を調節するための方法を含む。本開示は、免疫応答を誘導するかまたは改変するために使用され得る薬学的組成物の形態であってもよい、細胞を含む。

本開示による組成物の投与は、典型的には、任意の一般的な経路を介する。これには、非経口、同所性、皮内、皮下、経口、経皮、筋肉内、腹腔内（intraperitoneal）、腹腔内（intraperitoneally）、眼窩内、移植による、吸入による、脳室内、鼻腔内、または静脈内注射が含まれるが、それらに限定されない。いくつかの態様において、本開示の組成物（例えば、治療用受容体を発現する細胞を含む組成物）。

典型的には、本開示の組成物および治療法は、剤形と適合性の様式で、および治療的に有効であり、かつ免疫改変性であるような量で投与される。投与される量は、処置される対象に依存する。投与される必要のある有効成分の正確な量は、実施者の判断に依存する。

適用の様式は、大幅に変動してもよい。細胞成分を含む薬学的組成物の投与のための従来の方法のいずれかが、適用可能である。薬学的組成物の投薬量は、投与の経路に依存し、対象のサイズおよび健康に応じて変動する。

多くの例において、多くとも約3、4、5、6、7、8，9、10回、もしくはそれよりも多く、または少なくとも約3、4、5、6、7、8、9、10回、もしくはそれよりも多くの、複数投与を有することが望ましいであろう。投与は、2日から12週間の間隔、より一般的には1から2週間の間隔の範囲であってもよい。投与の経過は、アロ反応性免疫応答およびT細胞活性のアッセイによって追跡されてもよい。

「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」という句は、動物またはヒトに投与された時に、有害な、アレルギー性の、または他の不適当な反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書において用いられる場合、「薬学的に許容される担体」には、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性物質のためのそのような媒体および剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の媒体または剤が、有効成分と不適合である場合を除いて、免疫原性組成物および治療用組成物におけるその使用が企図される。本開示の薬学的組成物は、薬学的に許容される組成物である。

本開示の組成物は、非経口投与のために製剤化することができ、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、またはさらに腹腔内経路を介した注射のために製剤化することができる。典型的には、そのような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射可能物質として調製することができ、調製物はまた、乳剤にすることもできる。

注射可能な使用に適している薬学的形態には、滅菌の水溶液または分散液；ゴマ油、落花生油、または水性プロピレングリコールを含む製剤が含まれる。それはまた、製造および保管の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。

滅菌注射可能溶液は、必要とされる量の活性成分（すなわち、本開示の細胞）を、上記に列挙された様々な他の成分と共に適切な溶媒を組み込み、必要に応じて、続いて濾過滅菌を行うことによって、調製される。概して、分散液は、様々な滅菌された有効成分を、基本的な分散媒および上記に列挙されたものから必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって、調製される。

組成物の有効量は、意図された目標に基づいて決定される。「単位用量」または「投薬量」という用語は、対象における使用に適している物理的に別個の単位を指し、各単位は、その投与、すなわち、適切な経路およびレジメンに関連して、本明細書で議論される所望の応答を生じるように計算された組成物のあらかじめ決定された量を含有する。投与される量は、処置の数および単位用量の両方に応じて、所望の結果および/または防護に依存する。組成物の正確な量はまた、実施者の判断に依存し、各個体に特有である。用量に影響を及ぼす要因には、対象の身体的および臨床的状態、投与の経路、処置の意図された目標（症状の緩和対治癒）、ならびに特定の組成物の力価、安定性、および毒性が含まれる。製剤化時に、溶液は、剤形と適合性の様式で、および治療的または予防的に有効であるような量で投与される。製剤は、上記の注射可能溶液のタイプなどの、多様な剤形で容易に投与される。

本開示の組成物および関連した方法、特に、本開示の組成物の投与はまた、本明細書に記載される追加の治療薬などの付加的な治療法の投与と組み合わせて、または当技術分野において公知の他の伝統的な治療薬と組み合わせて、使用されてもよい。

本明細書に開示される治療用組成物および処置は、数分から数週間の範囲の間隔で、別の処置または剤に先行し、それと同時であり、かつ/またはそれに続いてもよい。剤が細胞、組織、または生物に別々に適用される態様においては、概して、治療剤が細胞、組織、または生物に対して有利に組み合わされた効果を依然として発揮できるように、各送達の時間の間に有意な期間が満了しなかったことを確実にする。例えば、そのような例において、細胞、組織、または生物を、2つ、3つ、4つ、またはそれよりも多い剤または処置と実質的に同時に（すなわち、約1分未満以内に）接触させてもよいことが企図される。他の局面において、1つまたは複数の治療剤または処置は、別の治療剤または処置を投与する前および/または後の1分、5分、10分、20分、30分、45分、60分、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、22時間、23時間、24時間、25時間、26時間、27時間、28時間、29時間、30時間、31時間、32時間、33時間、34時間、35時間、36時間、37時間、38時間、39時間、40時間、41時間、42時間、43時間、44時間、45時間、46時間、47時間、48時間、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、15日、16日、17日、18日、19日、20日、21日、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、または8週間、またはそれよりも長く、およびその中の任意の導き出せる範囲以内に、投与されるかまたは提供されてもよい。

処置は、様々な「単位用量」を含んでもよい。単位用量は、あらかじめ決定された量の治療用組成物を含有するとして定義される。投与される量、ならびに特定の経路および製剤は、臨床分野におけるそれらの決定の技能内である。単位用量は、単回注射として投与される必要はなく、設定期間にわたる連続注入を含んでもよい。いくつかの態様において、単位用量は、単一の投与可能な用量を含む。

投与される量は、処置の数および単位用量の両方に応じて、所望の処置効果に依存する。有効用量は、特定の効果を達成するために必要な量を指すと理解される。ある特定の態様における実施において、10 mg/kgから200 mg/kgの範囲の用量が、これらの剤の防護能力に影響を及ぼし得ることが企図される。したがって、用量には、約0.1、0.5、1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195、および200、300、400、500、1000μg/kg、mg/kg、μg/日、またはmg/日、またはその中の任意の導き出せる範囲の用量が含まれることが企図される。さらに、そのような用量は、1日の間に複数回、および/または複数の日、週、もしくは月に投与することができる。

いくつかの態様において、ヒトに投与される、抗体および/または微生物モジュレーターなどの免疫チェックポイント阻害剤の治療的に有効または十分な量は、1回の投与によろうとまたは複数の投与によろうと、約0.01～約50 mg/kg患者体重の範囲であろう。いくつかの態様において、使用される治療法は、例えば、毎日投与される、約0.01～約45 mg/kg、約0.01～約40 mg/kg、約0.01～約35 mg/kg、約0.01～約30 mg/kg、約0.01～約25 mg/kg、約0.01～約20 mg/kg、約0.01～約15 mg/kg、約0.01～約10 mg/kg、約0.01～約5 mg/kg、または約0.01～約1 mg/kgである。1つの態様において、本明細書に記載される治療法は、21日サイクルの1日目に、約100 mg、約200 mg、約300 mg、約400 mg、約500 mg、約600 mg、約700 mg、約800 mg、約900 mg、約1000 mg、約1100 mg、約1200 mg、約1300 mg、または約1400 mgの用量で対象に投与される。用量は、注入などの、単一用量としてまたは複数用量（例えば、2回または3回の用量）として、投与されてもよい。この治療法の進行は、従来の技法によって容易にモニターされる。

ある特定の態様において、薬学的組成物の有効用量は、約1μM～150μMの血中レベルを提供することができるものである。別の態様において、有効用量は、約4μM～100μM；または約1μM～100μM；または約1μM～50μM；または約1μM～40μM；または約1μM～30μM；または約1μM～20μM；または約1μM～10μM；または約10μM～150μM；または約10μM～100μM；または約10μM～50μM；または約25μM～150μM；または約25μM～100μM；または約25μM～50μM；または約50μM～150μM；または約50μM～100μM（またはその中の任意の導き出せる範囲）の血中レベルを提供する。他の態様において、用量は、対象に投与される治療剤から結果として生じる、剤の以下の血中レベルを提供することができる：約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100μM、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100μM、または多くとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、もしくは100μM、またはその中の任意の導き出せる範囲。ある特定の態様において、対象に投与される治療剤は、体において代謝されて、代謝された治療剤になり、その場合、血中レベルはその剤の量を指してもよい。あるいは、治療剤が対象によって代謝されない範囲まで、本明細書で議論される血中レベルは、代謝されていない治療剤を指してもよい。

治療用組成物の正確な量はまた、実施者の判断に依存し、各個体に特有である。用量に影響を及ぼす要因には、患者の身体的および臨床的状態、投与の経路、処置の意図された目標（症状の緩和対治癒）、ならびに対象が受けている可能性がある特定の治療物質または他の治療法の力価、安定性、および毒性が含まれる。

μg/kg体重またはmg/kg体重の投薬量単位は、4μM～100μMなどの、μg/mlまたはmM（血中レベル）の比較可能な濃度単位に変換され、表現され得ることが、当業者によって理解され、承知されるであろう。取り込みは、種および器官/組織に依存することもまた、理解される。取り込みおよび濃度測定に関してなされる適用可能な変換係数および生理学的仮定は、周知であり、当業者が、1つの濃度測定値を別のものに変換し、本明細書に記載される用量、効力、および結果に関して合理的な比較および結論を出すことを可能にする。

VIII. 治療方法
本開示の組成物は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボの投与のために使用され得る。組成物の投与の経路は、例えば、皮内、皮下、静脈内、局所（local）、局所（topical）、および腹腔内の投与であり得る。

いくつかの態様において、開示された方法は、がんを処置する方法に関する。がんは、固形腫瘍、転移性がん、または非転移性がんであり得る。ある特定の態様において、がんは、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、泌尿器、子宮頸部、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮に起因し得る。

がんは、具体的には、以下の組織学的タイプのうちの1つまたは複数のものであり得るが、これらに限定されない：未分化がん、膀胱、血液、骨、脳、乳房、泌尿器、食道、胸腺腫、十二指腸、結腸、直腸、肛門、歯肉、頭部、腎臓、軟部組織、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、子宮、胸腺、皮膚扁平上皮細胞、非結腸直腸胃腸、結腸直腸、黒色腫、メルケル細胞、腎細胞、子宮頸部、肝細胞、尿路上皮、非小細胞肺、頭頸部、子宮内膜、食道胃、小細胞肺中皮腫、卵巣、食道胃、膠芽腫、副腎、ブドウ膜、膵臓、生殖細胞、巨細胞紡錘細胞がん；小細胞がん；乳頭状がん；扁平上皮がん；リンパ上皮がん；基底細胞がん；石灰化上皮腫；移行上皮がん；乳頭状移行上皮がん；腺がん；胆管細胞がん；肝細胞がん；肝細胞がんと胆管細胞がんの混合型；索状腺がん；腺様嚢胞がん；腺腫性ポリープの腺がん；腺がん、家族性大腸ポリポーシス；固形がん；細気管支肺胞腺がん；乳頭状腺がん；嫌色素性がん；好酸球がん；好酸性腺がん；好塩基球がん；明細胞腺がん；顆粒細胞がん；濾胞性腺がん；乳頭状腺がんと濾胞性腺がんの混合型；非被包性硬化性がん；副腎皮質がん；子宮内膜がん；皮膚付属器がん；アポクリン腺がん；皮脂腺がん；耳道腺がん；粘表皮がん；嚢胞腺がん；乳頭状嚢胞腺がん；乳頭状漿液性嚢胞腺がん；粘液性嚢胞腺がん；粘液性腺がん；印環細胞がん；浸潤性腺菅がん；髄様がん；小葉がん；炎症性がん；乳房パジェット病；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；胸腺腫；莢膜細胞腫；アンドロブラストーマ；セルトリ細胞がん；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；類上皮細胞黒色腫；肉腫；間葉系（例えば、線維肉腫；線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；間質肉腫；ミュラー混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽細胞腫；がん肉腫；未分化胚細胞腫；胎生期がん；絨毛がん；中腎腫；血管肉腫；カポジ肉腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；間葉系軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；エナメル上皮歯牙肉腫；エナメル上皮線維肉腫；脊索腫；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；乏突起神経膠腫；乏突起神経膠芽細胞腫；未分化神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅覚神経原性腫瘍；神経線維肉腫；傍肉芽腫）；または造血系（例えば、多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞性白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；有毛細胞性白血病）。

IX. 配列
本開示の方法および組成物において有用な例示的なキメラポリペプチドおよびCAR分子のアミノ酸配列は、以下の表1に提供される。

X. 実施例
以下の実施例は、本開示の好ましい態様を証明するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、本開示の実施において良好に機能することが本発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると見なされ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、本開示を考慮すれば、本開示の本旨および範囲から逸脱することなく、開示された具体的な態様に多くの変化を施しても、同様のまたは類似した結果を取得することが可能であることを、当業者は理解するべきである。実施例は、決して、限定的なものとして解釈されるべきではない。すべての引用された参考文献（例えば、本願全体を通して引用される、参考文献、発行された特許、公開された特許出願、およびGenBankアクセッション番号）の内容は、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。参照により本明細書に組み入れられる文書における用語の定義が、本明細書において使用されるものと矛盾する時には、本明細書において使用される定義が優先される。

実施例1：ねじれ修飾型CAR
いくつかのCARが、抗原刺激の非存在下でシグナル伝達し得るという観察は、これらの受容体が、シグナル伝達可能な天然タンパク質の立体構造をとっている可能性を示唆する。この仮説から、CARタンパク質の立体構造の改変は、トニックシグナル伝達の傾向に影響を与え、抗原依存的CARシグナル伝達の強度にも影響を与える可能性があると推論される。ここで、本発明者らは、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間にアラニンを挿入することによって、CAR-T細胞の抗腫瘍活性が調整され得るという所見を報告する（図1）。各アラニンの挿入は、約109°の回転を引き起こすと予想される。CARの膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間にアラニンを挿入することによって、CD28共刺激ドメインを含有する第2世代CD20 CARのインビボ抗腫瘍効力を有意に改善することができるという仮説が立てられた（図2；図8に示される追跡研究において確認された結果）。CD20に加えて、他のCARにも、この設計が組み込まれ得ることが企図される。いくつかの態様において、アラニン挿入は、神経芽細胞腫を処置するために有用なGD2 CARに組み込まれ得る。

実施例2：増加した効力を有するハイブリッドCAR
本発明者らは、以前に提唱された仮説（5）に反して、トニックシグナル伝達CARのFR配列を非トニックシグナル伝達CARのCDR配列と組み合わせることによって、機能的に優れたCARを構築することができるという所見を報告する。Leu16およびリツキシマブは、いずれも、CD20を標的とするモノクローナル抗体である。各抗体のVhおよびVhから、scFvを作製した（図3）。Leu16由来scFvが組み込まれたCARは、トニックシグナル伝達しないのに対し、リツキシマブ由来scFvが組み込まれたCARは、トニックシグナル伝達する（図4）。本発明者らは、Leu16由来scFvのCDR配列とカップリングされたリツキシマブ由来scFvのFR配列を含むscFvを有する「ハイブリッド」CD20 CARを構築した（図5）。「RFR-LCDR」と呼ばれる、このハイブリッドCARも、トニックシグナル伝達する（図6）。しかしながら、RFR-LCDRハイブリッドCARを発現するT細胞は、インビトロ（図7）およびインビボ（図8）の両方で、親（すなわち、Leu16またはリツキシマブに基づく）CARのいずれかを発現するT細胞と比較して、機能的に優れていることが示された。重要なことに、RFR-LCDRハイブリッドCARは、腫瘍異種移植モデルにおいて、CD19 CARより優れており、最初のT細胞処置の55日後の2回目の腫瘍チャレンジ時にさえ、完全かつ持続的な腫瘍クリアランスおよび腫瘍再発の防止を達成した（図8）。

実施例3：CARトニックシグナル伝達の合理的調整は、がんに対する優れたT細胞治療を生じる
キメラ抗原受容体（CAR）は、免疫細胞を極めて多様な疾患関連抗原に向け直すことができるモジュラータンパク質である。しかしながら、これまでのCAR依存性免疫療法は、B細胞悪性腫瘍以外では限定された臨床的効力しか達成していない。ここで、本発明者らは、CARタンパク質の配列および構造の、CAR-T細胞機能に対する効果を、体系的に探究する。本発明者らは、トニックシグナル伝達が、CAR-T細胞の代謝および抗腫瘍効力に有意に影響することを報告する。具体的には、低いがゼロではないレベルのトニックシグナル伝達が、CAR-T細胞による早熟機能的消耗を回避しながら、抗原刺激時のロバストなエフェクター機能を促進することができることを、本発明者らは見出した。さらに、CARのリガンド結合ドメインおよび全体的なタンパク質の立体構造の合理的な改変によって、トニックシグナル伝達の強度が調整され、腫瘍異種移植モデルにおいてCD19 CARより優れているCD20 CARバリアントを生じ得ることを、本発明者らは証明する。これらの所見は、トニックシグナル伝達および基底T細胞活性化が、がん治療のための次世代CARの合理的設計を導くための有益なパラメーターであることを示している。

キメラ抗原受容体（CAR）-T細胞の養子移入は、進行B細胞悪性腫瘍に対して顕著な効力を示しており、極めて多様ながんタイプに対するCAR-T細胞候補が、臨床試験に入っている。しかしながら、現在まで、CD19 CAR-T細胞と比較可能な抗腫瘍効力を示したものは、ほとんどない（Grigor et al.,2019；Guedan et al.,2018；Majzner and Mackall,2019；Yamamoto et al.,2019）。CAR構築の標準的なアプローチは、細胞外スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインという限定されたセットを、関心対象の抗原に対して特異的なリガンド結合部分と組み合わせることに依存している。この経験的に駆動されたプロセスは、腫瘍反応性を有するCAR分子を確実に生じることができるが、その結果として生じるCAR-T細胞は、しばしば、ロバストな臨床的効力を達成することができない。例えば、CD20 CAR-T細胞は、前臨床モデルにおいて有望な活性を示したが、臨床試験の結果は、同じ疾患タイプに対するCD19 CAR-T細胞治療と比較して著しく低い効力を証明した（Till et al.,2012；Zhang et al.,2016）。同様に、CD28共刺激ドメインが組み込まれた第2世代GD2 CARは、同じシグナル伝達ドメインを含有するCD19 CARと比較して劣るインビボ抗腫瘍機能を示すことが示されている（Long et al.,2015）。関心対象の抗原に対してロバストに機能性のCARを一貫して生成することができていないことは、CAR設計とCAR-T細胞機能との間の分子的および機構的な関係をさらに理解することの必要性を強調する。

これまでのCAR操作の努力によって、CAR-T細胞機能に影響を与えるいくつかの設計パラメーターが明らかになっている（Chang and Chen,2017；Hong et al.,2020）。これらには、抗原刺激時のT細胞活性化を押し上げる共刺激ドメイン（Omer et al.,2018；Wijewarnasuriya et al.,2020；Zhao et al.,2015）、最適なT細胞/標的細胞コンジュゲーションのための構造的支持を提供する細胞外ドメイン（Hudecek et al.,2013；Srivastava and Riddell,2015）、CARと標的抗原との間の結合親和性（Drent et al.,2019；Liu et al.,2015）が含まれ、CAR非依存的なパラメーター、例えば、標的細胞上の抗原発現レベル（Majzner et al.,2020；Watanabe et al.,2015）も含まれる。しかしながら、これらのパラメーターは、CD19 CARと、同様に高い結合親和性を有し、同じ共刺激ドメインを含有し、CD19 CARによって標的とされるのと同じタイプの腫瘍細胞に高発現している抗原に結合する他の構築物、例えば、CD20 CARとの間の差異を十分に説明し得ない。

より最近、いくつかの研究が、CARトニックシグナル伝達、すなわち、抗原刺激の非存在下でのCARシグナル伝達の現象、および早熟T細胞機能障害の誘発におけるその可能性のある役割を強調した（Frigault et al.,2015；Gomes-Silva et al.,2017；Long et al.,2015；Watanabe et al.,2016）。CD19 CAR-T細胞のロバストな機能性は、CD19 CARによるトニックシグナル伝達の欠如に起因し得ることが示唆されている（Frigault et al.,2015；Long et al.,2015）。しかしながら、トニックシグナル伝達T細胞の表現型的記載は、多様であり、どの具体的なCAR成分が、トニックシグナル伝達を引き起こすのか、または防止するのかに関する仮説は、時に、矛盾する（Frigault et al.,2015；Gomes-Silva et al.,2017；Long et al.,2015）。さらに、トニックシグナル伝達に関する大部分の研究が、CD19 CARを、他の抗原を標的とするCARと比較しているため、観察された機能的差異が、トニックシグナル伝達に厳密に起因しているか否か、トニックシグナル伝達の消失が、CAR-T細胞の抗腫瘍効力の改善を予測可能にもたらすか否かは、不明のままである。

ここで、本発明者らは、CARの配列および構成が、トニックシグナル伝達に対して有意かつ調整可能な影響を及ぼすこと、トニックシグナル伝達の強度および関連する基底T細胞活性化の調整によって、CAR-T細胞の代謝および抗腫瘍機能を改変し得ることを報告する。本発明者らは、低いがゼロではないレベルのトニックシグナル伝達が、早熟T細胞消耗を回避しながら、迅速な抗腫瘍応答を強化することによって、CAR-T細胞機能を増加させ得ること、基底T細胞活性化のレベルが、ねじれリンカーの挿入および異なるリガンド結合ドメインの配列ハイブリッド化によって調整され得ることを示す。これらのタンパク質操作戦略を適用することによって、本発明者らは、B細胞リンパ腫のマウスモデルにおいてCD19 CARより優れている新規のCD20 CARを生成し、メモリー表現型のエンリッチメントおよびCARによって駆動される代謝障害の最小化が、CAR-T細胞機能の改善に関連する特性であることを見出した。これらの結果は、トニックシグナル伝達および基底T細胞活性化の合理的調整が、がんに対するロバストなCAR-T細胞治療を設計するための、有用であり、かつ広く一般化可能であり得るアプローチであることを示している。

A. 結果
1. scFv配列はトニックシグナル伝達およびCAR-T細胞代謝を改変する
現在まで、トニックシグナル伝達に関する研究は、主に、異なる抗原を標的とするCARの比較に依存しており、したがって、CAR配列、抗原の同一性および発現レベル、ならびにCAR-抗原結合相互作用の生物物理学的特徴を含む複数のパラメーターの同時変化のため、結果の解釈が複雑になっている（Frigault et al.,2015；Gomes-Silva et al.,2017；Long et al.,2015）。ここで、本発明者らは、CARのリガンド結合ドメインのアミノ酸配列が、標的抗原の同一性または結合親和性とは無関係に、受容体活性に有意に影響を与え得るという仮説を調査することから始めた。CD20は、臨床的にバリデートされている抗原であり、B細胞リンパ腫の処置においてCD19 CARをベンチマークとして直接比較することを可能にするため、本発明者らは、テストプラットフォームとしてCD20 CARに焦点を当てることを選択した。類似したKD値（Mossner et al.,2010；Reff et al.,1994；Uchiyama et al.,2010）およびabYsis（Martin and Thornton,1996；Swindells et al.,2017）によって予測された類似した相補性決定領域（CDR）構造を有する4つの異なるモノクローナル抗体に由来する単鎖可変断片（scFv）によって、CD20 CARのパネルを構築した。scFvのうちの3つ（Leu16、リツキシマブ、およびGA101）は、CD20の細胞外大ループ上の重複するエピトープに結合し、オファツムマブは、CD20の小ループおよび大ループの両方に結合する（Klein et al.,2013；Niederfeller et al.,2011；Rufener et al.,2016；Teeling et al.,2006）（図10A；図S16A）。4つのCARは、すべて、同一の細胞外スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞質シグナル伝達ドメインを有する。このパネルは、交絡因子、例えば、結合親和性および結合エピトープ位置の差異を排除しながら、scFv配列に特異的に機能的差異を帰属させることを可能にする。CD28含有CARは4-1BB含有CARよりトニックシグナル伝達を起こしやすいことが以前に報告されているため、scFv配列とCARトニックシグナル伝達との間の可能性のある関係をよりよく探求するため、本発明者らは、CD28を共刺激ドメインとして組み込むことを選択した（Frigault et al.,2015；Long et al.,2015）。

4つのCD20 CARバリアントは、すべて、初代ヒトT細胞の表面上に効率的に発現され（図16B）、各CARを発現するT細胞は、サイトカイン支持によるエクスビボ増大において比較可能な速度で増殖した（図16C）。反復抗原刺激に応答して、すべてのCAR-T細胞バリアントが、標的細胞を溶解する能力、および増殖する能力を示した（図16D）。しかしながら、インビトロ機能アッセイにおける類似した性能にもかかわらず、4つのCD20 CARバリアントを発現するT細胞は、Raji異種移植モデルにおいて異なるインビボ腫瘍死滅動力学を示した（図10B）。具体的には、リツキシマブベースのCAR-T細胞は、試験された他のすべてのCD20 CAR-T細胞と比較して、実質的に強い腫瘍コントロールを早い時点で発揮した（図10B）。しかし、T細胞注射のおよそ2週間後から、リツキシマブCAR-T細胞によって処置された動物は、他の試験群より速い、加速された腫瘍増殖を示し始め（図10C；図17A）、そのことから、リツキシマブCAR-T細胞における機能的消耗の迅速な開始が示唆された。

すべての試験群の動物が、屠殺時に、特に、肝臓、脾臓、および脳から採集された腫瘍転移に、検出可能なCAR-T細胞集団を保持していた（図17B、C）。しかしながら、ほぼすべてのT細胞がPD-1+であり、多くがLAG-3発現の上昇を示した（図17D、E）。腫瘍を根絶できなかったことと合わせて、これらの結果は、CAR-T細胞の4つの群が、すべて、インビボ持続性にもかかわらず、研究の終わりまでに機能不全になったことを示唆している。

本発明者らは、次に、4つのCD20 CAR-T細胞バリアントの間の生物学的差異が、それらのインビボ腫瘍応答の異なる時間的動力学を説明し得るか否か、基礎となる生物学が、持続的に腫瘍をコントロールし得る改善されたCAR設計を明らかにし得るか否かを解明しようとした。具体的には、本発明者らは、リツキシマブCARが、初期にはロバストであるが、最終的には短命の抗腫瘍応答をもたらす理由、合理的なCARタンパク質操作によって抗腫瘍効力を延長し得るか否かを理解することを望んだ。

抗原刺激の非存在下で、リツキシマブCARを発現するT細胞は、トニックシグナル伝達することが公知の14g2aベースのGD2 CARを発現するT細胞と類似した、またはより強い程度に、明白な活性化マーカー発現（図10D）および細胞増殖（図10E）を示した（Long et al.,2015）。これらの観察は、CAR構築物に直接起因するリツキシマブCAR-T細胞の明白な基底活性化を示し、リツキシマブCAR-T細胞は、一部には、このT細胞活性化の傾向のため、抗腫瘍応答を迅速に開始し得るという仮説を導いた。ロバストなT細胞エフェクター機能の開始は、好気的解糖からの支持を必要とすることが示されている（Chang et al.,2013）。したがって、リツキシマブCAR-T細胞が、迅速なエフェクター機能に向かって強化されているという仮説を調査するため、本発明者らは、栄養素取り込みおよび副生成物分泌の速度を測定することによって、その基底代謝状態を特徴決定することに着手した。抗原刺激の非存在下で、リツキシマブCAR-T細胞は、モック形質導入T細胞およびCD19 CARまたはLeu16ベースのCD20 CARのいずれかを発現するT細胞と比較して、有意に速いグルコース、グルタミン、およびアミノ酸の取り込みを示した（図10F、図18）。さらに、リツキシマブCAR-T細胞は、他のCAR-T細胞と比較して、乳酸およびアラニンの分泌の2～7倍の増加、ならびにグルタミン酸分泌の3倍超の増加を示し、そのことから、解糖流量およびグルタミノリシスが、それぞれ、劇的に増加していることが示された。グルコースおよびグルタミンは、ATP産生の大部分を担っているため、より速い解糖およびグルタミノリシスは、より大きいエネルギー消費を意味し、それは、活性化T細胞の挙動と一致する（Chang et al.,2013）。

総合すると、これらの観察は、抗原刺激の非存在下で、リツキシマブCAR-T細胞が、基底状態で活性化されており、T細胞エフェクター機能を開始するために代謝的に準備されていることを示している。未刺激時のこの代謝の高まりは、リツキシマブCAR-T細胞のインビボの早い時点での迅速な抗腫瘍活性を説明し得るが、抗原刺激の非存在下での慢性の低レベルのT細胞活性化は、動物研究において観察されたような、他のCAR-T細胞バリアントと比較して加速された、リツキシマブCAR-T細胞の腫瘍コントロールの喪失にも寄与している可能性がある。この可能性およびCAR設計上の意義を評価するため、本発明者らは、次に、基底活性化のレベルの調整が、迅速かつ持続的な抗腫瘍応答が可能なCAR-T細胞を生じ得るか否かを調査した。

2. シグナル伝達ドメインのねじれ再配向がCAR-T細胞活性を調整する
細胞表面における受容体二量体化は、CARシグナル伝達を誘発することができ（Chang et al.,2018）、初期の研究は、トニックシグナル伝達が、ある特定のscFv配列によって引き起こされる抗原非依存的なCARクラスター形成の結果であり得ることを示唆した（Long et al.,2015）。本発明者らは、図10Aに示される4つのCD20 CARバリアントが、すべて、抗原刺激の非存在下で、T細胞表面上に均一に分布していることを確証し（図19）、したがって、マクロスケールのCARクラスター形成が、リツキシマブベースのCARによるトニックシグナル伝達の原因である可能性を排除した。にもかかわらず、CD3ζの下流のシグナル伝達カスケードは、受容体鎖との相互作用が、受容体鎖の物理的近接および立体構造によって直接影響を受ける、アダプタータンパク質およびキナーゼを含む（Hartman and Groves,2011）。したがって、本発明者らは、トニックシグナル伝達CARが、基底受容体シグナル伝達を可能にする立体構造をとっており、CAR分子の立体構造の改変が、抗原刺激の非存在下および存在下の両方でのCARシグナル伝達強度の調整を可能にし、それによって、下流のCAR-T細胞挙動に影響を与え得るという仮説を立てた。

CAR立体構造変化の効果を体系的に調査するため、本発明者らは、リツキシマブベースのCARにおいて、CD28の膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間に1～4個のアラニンを挿入し、各アラニンが、αヘリックスの形成によって、タンパク質構造のおよそ109°の回転を引き起こすと予想した（Constantinescu et al.,2001；Liu et al.,2008；Scheller et al.,2018）（図11A；図20A）。この「ねじり」プロセスは、CARの細胞外リガンド結合ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の整列化を改変するように設計されており、高密度区域（例えば、抗原ライゲーション時のマイクロクラスター内）における受容体のパッキング挙動、ならびに下流シグナル伝達に関与するドッキング残基およびリン酸化残基のアクセシビリティに影響を与える可能性がある。

最初のリツキシマブCARと同様に、すべてのアラニン挿入バリアントが、T細胞表面上に良好に発現され（図20B）、反復抗原チャレンジに応答して、標的細胞を溶解し、増殖する類似した能力を示し（図20C）、抗原刺激の非存在下で、類似したレベルの活性化マーカーおよび消耗マーカーの発現を示した（図20D）。しかしながら、アラニン挿入は、最初のリツキシマブベースのCARと比較して、抗原非依存的なT細胞増殖およびTNFα産生の明白な低下をもたらし（図11B、C）、そのことから、ねじれリンカーの挿入が基底CAR-T細胞活性を有意に低下させることが示された。CAR構造改変の影響はインビボで明らかであり、1個、2個、または4個のアラニンを含有するリツキシマブベースのCARを発現するT細胞は、最初のリツキシマブCARと比較して、有意に改善された、Raji異種移植片のコントロールを示した（図11D）。具体的には、2アラニンCARは、最初のリツキシマブCARと比較して、生存期間中央値を2.1倍増加させた（55日対26日；図11E）。

原理的に、アラニンベースのねじれリンカーの挿入は、CARに組み込まれた具体的なリガンド結合ドメインまたはシグナル伝達ドメインと無関係に、任意のCARタンパク質に対して実施され得る。このCAR調整方法の一般化可能性を調べるため、本発明者らは、14g2aベースのGD2 CARにおけるアラニン挿入の効果を評価した。（0～4個のアラニンが膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間に挿入された）5つのGD2 CARバリアントは、すべて、T細胞表面上に良好に発現され、インビトロでの反復抗原チャレンジ時に類似した抗腫瘍応答を示した（図21A～C）。CD20 CARパネルからの結果と一致して（図11D）、1個、2個、または4個のアラニンを含有するGD2 CARを発現するT細胞は、0個または3個のアラニンが挿入されたGD2 CARより優れていた（図21D）。さらに、屠殺時に回収された肝臓および脾臓の分析は、2アラニンCAR構築物を発現するT細胞の有意に高いレベルを明らかにし、そのことは、CD28の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを含有するCARにおける2アラニン挿入の利用可能性を強調した（図21E）。

総合すると、これらの結果は、CAR分子へのアラニン挿入が、CAR-T細胞活性化を調整し、インビボの抗腫瘍効力を強めるための一般化可能な方法であることを示している。しかしながら、アラニン挿入によって見られた改善にもかかわらず、CD20 CAR-T細胞は、マウスモデルにおいてRaji異種移植片を根絶することができないままであった（図11D、E）。したがって、本発明者らは、CAR-T細胞機能をさらに増強することができる付加的な設計パラメーターを探求することに着手した。

3. scFv配列ハイブリッド化は優れたCARバリアントを生じる
すべてのCARが、scFvを除き同一の成分を有していたことを考えると、4つのCD20 CARの最初のパネルの中で、リツキシマブCARの挙動が異なっていたという観察は、印象的であった（図10A）。さらに、リツキシマブscFvは、Leu16 scFvと比較して91％の配列同一性を有するが（図16A）、Leu16 CAR-T細胞およびリツキシマブCAR-T細胞は、基底T細胞活性化およびインビボ腫瘍死滅動力学の両方に関して劇的に異なる挙動を有していた（図10B～E）。これらの結果は、scFv配列の限定された変動が、CARシグナル伝達活性に対して有意な影響を及ぼし得ることを示している。

各scFvは軽鎖および重鎖を含み、各鎖は、さらに、3つの相補性決定領域（CDR）に隣接する4つのフレームワーク領域（FR）に細分され得る（図11A）。ある特定のscFv、例えば、14g2aのFRは、トニックシグナル伝達およびCAR-T細胞消耗の原因であり得ることが、以前に示唆されており、14g2a scFvのFRの、CD19 CARへの組み込みは、T細胞消耗を誘発するハイブリッド受容体をもたらすことが証明された（Long et al.,2015）。したがって、scFv改変によってCARを損なうことは可能であったが、scFv配列ハイブリッド化によってCARが改善され得るか否かは不明のままであった。これまでの本発明者らの結果は、アラニン挿入を介したCARトニックシグナル伝達の強度の低下が、CAR-T細胞機能を改善し得ることを示した。次に、本発明者らは、配列ハイブリッド化によるscFvの変化が、CARシグナル伝達活性を合理的に調整することができる第2の「ノブ」を提供し得るか否かを探求した。

Leu16およびリツキシマブは、配列は類似しているが、活性プロファイルが相違しているため、ハイブリッド化の出発点として選択された。本発明者らは、scFvがリツキシマブのFRおよびLeu16のCDR（RFR-LCDR）またはその逆（LFR-RCDR）を含むハイブリッドCARを構築した（図12A）。RFR-LCDRハイブリッドCARは、反復抗原チャレンジ時にロバストな腫瘍細胞溶解およびT細胞増殖を誘発し、インビトロアッセイにおいてCD19 CARと比較可能な機能性を有するCD20 CARの最初の例を提供した（図12B）。RFR-LCDRハイブリッドCAR-T細胞は、抗原刺激の非存在下で、明白な活性化マーカー発現を示し、そのことは、未刺激時のT細胞活性化のレベルがゼロではないことを示した（図12C）。対照的に、LFR-RCDRハイブリッドは、T細胞表面上に効率的に発現されるにもかかわらず、完全に非機能性であり（図12B；図22A）、したがって、さらなる特徴決定から除外された。以後、「ハイブリッドCAR」という用語は、RFR-LCDRバリアントをさす。

配列ハイブリッド化およびアラニン挿入が、CAR-T細胞機能をさらに改善するため、相乗効果を有するか否かを決定するため、膜貫通ドメインと細胞質CD28シグナル伝達ドメインとの間に2個のアラニンが挿入された修飾型ハイブリッドCAR（RFR-LCDR.AA）を、その後の研究に含めた。両方のハイブリッドCARが、リツキシマブベースのアラニンを含むCARおよび含まないCARと類似した表面分布を示し（図22B）、すべてのCAR-T細胞が、抗原刺激に応答してTh1サイトカインを産生し（図22C）、そのことから、腫瘍反応性が確認された。しかしながら、ハイブリッドCAR-T細胞は、抗原非依存的なT細胞増殖の徴候を示さず（図12D）、scFv配列ハイブリッド化は、リツキシマブベースのCAR-T細胞と比較して、抗原刺激の非存在下でのTNFα産生を有意に低下させ、IL-2産生を増加させた（図22D）。さらに、CAR-T細胞培養上清に対する代謝分析は、scFvハイブリッド化が、抗原刺激の非存在下での、グルコースおよびグルタミンの取り込み、ならびにグルタミン酸、アラニン、および乳酸の分泌を有意に低下させることを明らかにした（図12E；図23）。その結果、未刺激時のハイブリッドCAR-T細胞についての代謝速度は、2つの親構築物（すなわち、リツキシマブCARまたはLeu16 CAR）のいずれかを発現するT細胞の代謝速度の中間レベルであった。総合すると、これらの結果は、scFvハイブリッド化が、基底T細胞活性化を完全に消失させることなく、トニックシグナル伝達の強度を有意に低下させ得ることを示している。

本発明者らは、次に、インビボで、ハイブリッドCARと、その親構築物の各々およびCD19 CARとの直接比較を実施した（図13A）。結果は、RFR-LCDR CAR-T細胞が、最初の腫瘍および腫瘍再チャレンジの両方を効率的に拒絶したことを示す（図13B、C）。実際、これは、本発明者らの知る限り、B細胞リンパ腫異種移植片の根絶においてCD19 CARより優れているCD20 CARの最初の例であった。

以前の結果と一致して、アラニン挿入は、リツキシマブCARを実質的に改善した（図13B、C）。RFR-LCDR CAR-T細胞およびRFR-LCDR.AA CAR-T細胞は、いずれも、腫瘍および再チャレンジに対して、ほぼ完全な保護を与えたため、本発明者らは、ハイブリッドCARの状況におけるアラニン挿入が、腫瘍死滅においてさらなる利益を提供するか否かを査定することができなかった。しかしながら、RO血液分析は、RFR-LCDR.AA CAR-T細胞が、RFR-LCDR CAR-T細胞と比較して優れたインビボの生存率および増大を有することを示した（図13D）。動物を、（分割せずに）単回のCAR-T細胞によって処置し、腫瘍投与量レベルを上昇させながら、腫瘍細胞によって2回再チャレンジする、第2のインビボ試験において、これらの結果は、さらにバリデートされた（図13E、F）。リツキシマブ.AA CAR-T細胞、RFR-LCDR CAR-T細胞、およびRFR-LCDR.AA CAR-T細胞は、すべて、持続し、各腫瘍再チャレンジ後にリバウンドし、RFR-LCDR.AA CAR-T細胞が、1回目の腫瘍再チャレンジの前後の両方において、末梢血中に最高レベルのCAR-T細胞を示した（図13G）。両方のハイブリッドCARバリアントが、研究全体を通して、動物に完全な保護を与えた。

総合すると、これらの結果は、CARの機能性が、scFv配列を変化させることによって改善され得ること、基底T細胞活性化の、完全な排除ではなく、調整が、有意に改善された抗腫瘍機能を有するCAR設計をもたらし得ることを示している。

4. メモリー表現型のエンリッチメントおよびCARによって駆動される代謝障害の最小化がCAR-T細胞機能を増強する
インビボで観察された機能的な差異の基礎となる生物学をよりよく理解するため、本発明者らは、T細胞注射の9日後に腫瘍保持動物から回収された、リツキシマブCAR-T細胞、Leu16 CAR-T細胞、RFR-LCDR CAR-T細胞、およびRFR-LCDR.AA CAR-T細胞に対して、RNA-seq分析およびATAC-seq分析を実施した（図249）。結果は、リツキシマブCAR-T細胞のトランスクリプトームおよびエピジェネティクスのプロファイルが、他のものと比較して、明確に異なっており、RFR-LCDR.AA CARがリツキシマブCARと最も異なっていることを明らかにした（図14A、B；図25）。他のCARバリアントの各々と比較して、リツキシマブCAR-T細胞は、GLUT1リサイクルを正に制御するリン脂質フリッパーゼをコードするATP9Aの発現の有意な増加を示した（Tanaka et al.,2016）（図14B、C）。エンドソームから原形質膜へのGLUT1リサイクルは、解糖を支持する細胞グルコース取り込みに不可欠であり、ヒトT細胞において、異なるGLUT1発現レベルは、異なるエフェクター機能と相関することが示されている（Cretenet et al.,2016；Macintyre et al.,2014）。これらの結果は、リツキシマブCAR-T細胞およびリツキシマブ.AA CAR-T細胞が、未刺激時に上昇したグルコース取り込みを示すという以前の観察と一致し（図12E）、したがって、本発明者らは、図13E～Gに示されるインビボ研究から収集された血清試料中のグルコースレベルを分析することにした。結果は、リツキシマブ.AA CAR-T細胞によって処置されたマウスの血清中のグルコースレベルが有意に低いことを明らかにし（図14D）、そのことから、リツキシマブベースのCAR-T細胞が、ハイブリッドCAR-T細胞より実質的に高い解糖活性を有するという見解がさらに支持された。

解糖の増加に加えて、マウスから回収されたリツキシマブCAR-T細胞は、他の3つのCAR-T細胞型の各々と比較して、（SELL遺伝子によってコードされる）CD62Lの有意に低い発現、ならびに阻害性受容体KIR2DL1、KIR2DL3、およびKIR3DL1（Bjorkstrom et al.,2012）のより高い転写物レベルを示した（図14B）。阻害性KIRのアップレギュレーションが、ATAC-seqによってさらに確認された（図14C）。総合すると、リツキシマブCAR-T細胞は、機能的消耗の傾向を有するエフェクターT細胞と一致する表現型を示す。

対照的に、ハイブリッドCAR-T細胞、特に、RFR-LCDR.AA CAR-T細胞は、遺伝子セットエンリッチメント分析（GSEA）に基づき、メモリー表現型において有意にエンリッチされている（図15A、B）。GSEAは、マウスから回収されたハイブリッドCAR-T細胞集団の両方が、リツキシマブCAR-T細胞およびLeu16 CAR-T細胞と比較して有意に強い、T細胞活性化、細胞傷害、受容体シグナル伝達、およびインターフェロンγのサインを示すことを明らかにした（図15A、C）。特に、RFR-LCDR.AA CAR-T細胞については、リツキシマブCAR-T細胞とはまったく対照的に、この強いT細胞活性化サインが、メモリー表現型と一致する低い細胞周期およびDNA複製活性と共存する（図15A、D）。注目すべきことに、RFR-LCDR.AA CAR-T細胞におけるメモリーサブタイプのエンリッチメントは、腫瘍保持マウスへの注射前には明らかではなく（図2611）、そのことから、その変化が、抗原刺激および/またはインビボ環境に遭遇した時に起こったことが示された。

総合すると、これらのデータは、リツキシマブCAR-T細胞が、インビボで、未刺激時にも抗原曝露時にも、解糖の上昇を示すことを示している。対照的に、アラニン挿入と相乗的に組み合わされたscFv配列ハイブリッド化によって取得された新規のCARであるRFR-LCDR.AAは、インビボで、比較的低い代謝活性レベルおよび長期持続性を維持しながら、ロバストなエフェクター機能を発揮し得るメモリーT細胞の形成を促進する。

B. 考察
この研究において、本発明者らは、合理的なCAR配列および構造修飾の、CAR-T細胞の挙動に対する効果を探求し、2個のアラニン残基の挿入という小さい、軽微な改変でさえ、その結果として生じるCAR-T細胞の抗腫瘍効力の劇的な変化を誘導し得ることを観察した。本発明者らは、トニックシグナル伝達および関連する基底T細胞活性化が、CAR挙動を定量化し、調整するための有用な尺度であることを見出した。これらの結果は、トニックシグナル伝達の効果には勾配があり、低レベルのトニックシグナル伝達が、持続的な抗腫瘍活性を可能にしながら、抗原刺激に対する迅速なT細胞応答を強化し得る、スイートスポットが存在することを示唆している。アラニンから構成されたねじれリンカーの挿入、ならびに異なるscFvに由来するFR配列およびCDR配列のハイブリッド化などの方法は、トニックシグナル伝達強度のスペクトルに沿ったCARバリアントの生成を可能にし、これらのバリアントのうちのいくつかは、インビボ腫瘍コントロールにおけるゴールドスタンダードであるCD19 CARより優れている可能性がある。

アラニン挿入は、CARトニックシグナル伝達を調整し、抗原によって刺激されるCAR-T細胞機能も調整するための一般化可能な方法である。この研究において、本発明者らは、CD28の膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間への2個のアラニンの挿入が、CD20 CARおよびGD2 CARの両方のインビボ機能を改善することを見出した。アラニン挿入の意図された効果は、CAR立体構造を改変するか、または「ねじる」ことであり、出発タンパク質の立体構造は、CARに組み込まれた具体的な成分に依存する可能性が高いことを考えると、アラニンの最適な数は、CARにおいて使用される具体的な膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインによって変動し得る。下流シグナル伝達パスウェイの詳細な生化学的分析は、研究における機能的改善の基礎となる分子メカニズムをさらに解明し、多様な膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを有するCARに、アラニン挿入戦略を適応させ得るか否かを知らせることができる。

アラニン挿入に加えて、scFvハイブリッド化は、改善されたCARバリアントを生成するための実りある方法であることが判明した。本研究において特徴決定されたRFR-LCDRハイブリッドの場合、トニックシグナル伝達CAR（リツキシマブ）に由来するFRおよび非トニックシグナル伝達CAR（Leu16）に由来するCDRによって構築されたCARは、中間のトニックシグナル伝達強度を有し、いずれの親と比較しても、はるかに優れた抗腫瘍効力を有するキメラをもたらす。この結果は、CAR-T細胞機能に対するscFv配列の効果の予測不能性を強調している。タンパク質構造および部位特異的変異の詳細な分析は、真に重要な残基の正確な同定を可能にし、将来的に、scFv設計のための完全に合理的なアプローチを可能にすることができる。

トニックシグナル伝達と強く関連しており、前述のタンパク質操作方法によって調整可能であることが見出された表現型は、未刺激時の代謝活性、具体的には、解糖およびグルタミノリシスの上昇である。解糖活性の増加が、エフェクターT細胞の特徴であり、解糖の高まりが、ロバストなT細胞エフェクター機能に不可欠であることを、相当量の文献が示している（Bantug et al.,2018）。リツキシマブCAR-T細胞が未刺激時および抗原刺激時の両方で強い解糖を示すという事実は、トニックシグナル伝達および基底T細胞活性化が迅速なエフェクター機能のためにT細胞を強化し得るという仮説と一致する。同時に、持続的な好気的解糖活性は、老化表現型の獲得、ならびに長期持続性およびメモリー形成の可能性の欠如とも関連しており（Kishton et al.,2017）、これは、リツキシマブベースのCAR-T細胞が腫瘍異種移植片の持続的なコントロールを達成し得ないことと一致する。これは、比較的低い解糖流量を示すが、ロバストで持続的な抗腫瘍活性を示すハイブリッドCAR-T細胞とはまったく対照的である。本質的に高い代謝速度を有するCAR-T細胞が直面する主要な課題は、CAR-T細胞の機能維持能力をさらに制約する可能性がある、腫瘍細胞との代謝的競合である（Chang et al.,2015）。酸素の存在にもかかわらず、グルコース取り込みおよび乳酸分泌の速度が高いことを特徴とするワールブルク効果は、腫瘍細胞の特徴である（Liberti and Locasale,2016）。腫瘍微小環境において、CAR-T細胞および腫瘍細胞は、同じ限定された栄養素の供給について競合しなければならず、乳酸分泌を介して、同じ、有毒である可能性のある、腫瘍微小環境の酸性化に寄与する（Fischer et al.,2007）。この競合は、低い代謝負荷を有する他のCAR-T細胞バリアントと比較して、リツキシマブベースのCAR-T細胞の抗腫瘍効力に対して、不釣り合いに強い影響を与える可能性がある。

ロバストなエフェクターT細胞機能を支持するためには高い代謝速度が必要である一方で、メモリー表現型が長期の腫瘍コントロールを可能にすることを考えると、興味深い疑問は、例えば、同時または逐次的に、リツキシマブCAR-T細胞をRFR-LCDR.AA CAR-T細胞と同時投与することによって、同じ抗原を標的とする異なるCAR-T細胞を組み合わせることによって、いずれかの細胞集団の単独投与より大きい治療効力が達成されるか否かであろう。複数の細胞生成物の使用は、単一の生成物の投与と比較して、相当の費用および技術的問題を発生させ得る。にもかかわらず、そのような組み合わせは、これまでCAR-T細胞治療に対して抵抗性の応答を有していた状態において有用であることが判明し得る。

CAR分子の構造モジュール性は、広範囲の障害に対するCAR-T細胞治療の開発を支持するが、インビボで予測可能にロバストな機能を生じるCARを合理的に設計する能力は、依然として達成困難である。本研究において探求されたタンパク質操作戦略およびCAR-T細胞特徴決定方法は、CARシグナル伝達を調整し、CAR-T細胞の表現型および代謝を定量的に評価するための体系的なアプローチを提供し、現在、有効な選択肢を欠いている難治性疾患に対する次世代CAR-T細胞の設計を支持する。

C. 材料および方法
1. 抗CD20 scFvおよびCARの構築
リツキシマブおよびGA101のscFv配列をコードするプラスミドは、Dr.Anna M.Wu（Zettlitz et al.,2017）（UCLA and City of Hope）からの寛大な贈与であった。オファツムマブscFvをコードするDNA配列は、Integrated DNA Technologies（IDT；Coralville,IA）によってコドン最適化され、合成された。leu16モノクローナル抗体（mAb）に由来するscFvをコードするプラスミドは、Dr.Michael C.Jensen（Seattle Children's Research Institute）（Jensen et al.,1998）からの寛大な贈与であった。抗GD2 scFvのV_L配列およびV_H配列は、abYsis（Swindells et al.,2017）を使用して、14g2a mAb（PDBコード4TUJ）から同定された。抗CD20 CARは、scFv（V_L-V_H方向）、L235E N297Q変異を含有する細胞外IgG4ヒンジ-CH2-CH3スペーサー（Hudecek et al.,2015）、CD28の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、CD3ζ細胞質ドメイン、ならびにT2A「自己切断」配列に続く、MSCV骨格を有する短縮型上皮成長因子受容体（EGFRt）を組み立てることによって構築された。EGFRtは、形質導入および選別のマーカーとして使用された。前述の抗CD20 CAR構築物が、CARクラスター形成の顕微鏡イメージングのためのCAR-HaloTag融合タンパク質を生成するための鋳型として使用された。

細胞株の生成および維持
HEK 293T細胞およびRaji細胞は、ATCCから取得された。K562細胞は、Dr.Michael C.Jensen（Seattle Children's Research Institute）からの贈与であった。CD19⁺CD20⁺ K562細胞は、以前に記載されたように生成された（Zah et al.,2016）。ルシフェラーゼ発現CHLA-255細胞株（CHLA-255-Luc）は、Dr.Shahab Asgharzadeh（Children's Hospital of Los Angeles）からの贈与であった。CHLA-255-Luc-EGFP細胞は、EGFPを発現させるためのCHLA-255-Lucのレトロウイルス形質導入によって生成され、EGFP+細胞は、UCLA Flow Cytometry Core Facilityにおいて、FACSAria（II）（BD Bioscience）での蛍光活性化細胞選別（FACS）によって濃縮された。HEK 293T細胞は、10％熱不活化FBS（HI-FBS；ThermoFisher）が補足されたDMEM（HyClone）において培養された。CHLA-255-Luc-EGFP細胞は、10％HI-FBSを含むIMDM（ThermoFisher）において培養された。初代ヒトT細胞、Raji細胞、およびK562細胞は、10％HI-FBSを含むRPMI-1640（Lonza）において培養された。メタボロミクス研究において使用されたCAR-T細胞について、T細胞は、10％熱不活透析FBS（HI-dFBS）と共に2g/Lの1,2-¹³C-グルコースを含有するRPMI-1640において培養された。

2. レトロウイルス作製およびヒト初代CAR-T細胞の生成
直鎖状ポリエチレンイミン（PEI、25kDa；Polysciences）を使用して、抗CD20 CARをコードするプラスミドまたは対照構築物、およびpRD114/pHIT60ウイルスパッケージングプラスミド（Dr.Steven Feldmanからの贈与）による、HEK 293T細胞の一過性コトランスフェクションによって、レトロウイルス上清を作製した。48時間後および72時間後に上清を収集し、0.45μmメンブレンフィルターによって細胞片を除去した後にプールした。健常ドナー血液は、UCLA Blood and Platelet Centerから取得された。CD8⁺ T細胞は、製造業者のプロトコルに従って、RosetteSep Human CD8⁺ T Cell Enrichment Cocktail（StemCell Technologies）を使用して単離された。末梢血単核細胞（PBMC）は、Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare）密度勾配から単離された。CD14^-/CD25^-/CD62L⁺ナイーブ/メモリーT細胞（T_N/M）は、磁気活性化細胞選別（MACS；Miltenyi）を使用して、PBMCから濃縮された。T細胞は、0日目（単離日）に、3:1の細胞対ビーズ比で、CD3/CD28ダイナビーズ（ThermoFisher）によって刺激され、2日目および3日目に、レトロウイルス上清によって形質導入された。ダイナビーズは7日目に除去された。T細胞は、10％HI-FBSが補足されたRPMI-1640において培養され、組換えヒトIL-2（ThermoFisher）およびIL-15（Miltenyi）を、それぞれ、最終濃度50U/mLおよび1ng/mLで、2日毎に供給された。RNA-seq、ATAC-seq、およびメタボローム研究において使用されたCAR-T細胞について、T細胞は、ビオチン化セツキシマブ（Eli Lilly；社内ビオチン化）およびその後の抗ビオチンマイクロビーズ（Miltenyi）によるEGFRtの染色を介した磁気細胞選別によって、CAR⁺発現について濃縮された。RNA-seqおよびATAC-seqのため、EGFRt⁺集団の濃縮の前に、死細胞除去キット（Miltenyi）によって死細胞を枯渇させた。

3. サイトカイン産生定量化
13日目または14日目に、96穴U底プレートにおいて、2:1のエフェクター対標的（E:T）比で、50,000個のCAR+ T細胞を、25,000個のEGFPを発現する親K562（CD19^-CD20^-）標的細胞またはCD19⁺CD20⁺ K562標的細胞と共にインキュベートした。形質導入効率の差異を考慮しながら細胞密度を調節するため、形質導入されていないT細胞を、1ウェル当たりの同じ全T細胞数を達成するために必要なだけ、添加した。48時間のコインキュベーションの後、細胞を300×gで2分間遠心沈殿させた。上清を採集し、サイトカインレベルをELISA（BioLegend）によって定量化した。

4. 増殖アッセイ
T細胞を1.25μM CellTrace Violet（ThermoFisher）によって染色し、2:1のE:T比で、40,000個のCAR⁺ T細胞を、親K562細胞またはCD19⁺CD20⁺ K562細胞と共に、96穴U底プレートの各ウェルに播種した。形質導入されていないT細胞を、異なる形質導入効率をノーマライズし、1ウェル当たりのT細胞の総数が全体を通して一貫していることを確実にするために必要なだけ、ウェルに添加した。培養物を必要なだけ継代し、4日間の共培養の後に、MACSQuant VYBフローサイトメーターにおいてCTV希釈を分析した。

5. 反復抗原チャレンジによる細胞傷害アッセイ
CAR⁺ T細胞を、24穴プレートに4×10⁵細胞/ウェルで播種し、2:1のE:T比で標的細胞とコインキュベートした。形質導入されていないT細胞を、異なる形質導入効率をノーマライズし、1ウェル当たりのT細胞の総数が全体を通して一貫していることを確実にするために必要なだけ、ウェルに添加した。新鮮な標的細胞（2×10⁵細胞/ウェル）を添加する前に、2日毎に、MACSQuant VYBフローサイトメーターによって細胞数を定量化した。

6. フローサイトメトリー分析のための抗体染色
EGFRt発現は、ビオチン化セツキシマブ（Eli Lilly；社内ビオチン化）およびその後のPE標識ストレプトアビジン（Jackson ImmunoResearch＃016-110-084）によって測定された。CAR発現は、Flagタグ（DYKDDDDKタグ、APC、クローンL5、BioLegend＃637308）、HA（FITC、クローンGG8-1F3.3.1、Miltenyi＃130-120-722）、または抗Fc（Alexa Fluor 488、Jackson ImmunoResearch＃709-546-098）を使用した表面エピトープ染色によって定量化された。CAR-T細胞の抗原非依存的活性化マーカー発現は、18日目（すなわち、ダイナビーズ添加の18日後、ダイナビーズ除去の11日後）に、CD137（PE/Cy7、クローン4B4-1、BioLegend＃309818）およびCTLA-4（PE/Cy7、クローンBNI3、BioLegend＃369614）についての抗体染色によって評価された。CD45RA（VioGreen、クローンT6D11、Miltenyi＃130-113-361）、CD62L（APC、クローンDREG-56、ThermoFisher＃17-0629-42）、PD-1（APC、クローンEH12.2H7、BioLegend＃329908）、およびLAG-3（APC、クローン3DS223H、ThermoFisher＃17-2239-42）に対する抗体が、T細胞サブタイプおよび消耗状態を評価するために使用された。インビボのT細胞および腫瘍細胞の持続性は、後眼窩血液試料の抗体染色によってモニタリングされた。試料は、製造業者のプロトコルに従って赤血球溶解溶液（10×、Miltenyi）によって処理された。残りの細胞内容物は、抗ヒトCD45（PacBlueまたはPECy7、クローンHI30、BioLegend＃304029または＃304016）ならびにビオチン化セツキシマブおよびその後のPE標識ストレプトアビジンによって染色された。すべての試料が、MACSQuant VYBフローサイトメーター（Miltenyi）において分析され、その結果として生じたデータは、FlowJoソフトウェア（TreeStar）を使用して分析された。

7. 共焦点顕微鏡法
CAR-HaloTag融合タンパク質によって形質導入されたJurkat細胞を、48穴平底ガラスプレート（MatTek）の1個のウェルに、50μL RPMI-1640＋10％HI-FBSで、1ウェル当たり10,000細胞で播種した。走査型共焦点イメージングは、AiryScanおよび63×1.4 NA油浸対物レンズを有するZeiss LSM 880レーザー走査型共焦点顕微鏡によって獲得された。

8. インビボ研究
6～8週齢のNOD/SCID/IL-2Rγ^null（NSG）マウスは、UCLA Department of Radiation and Oncologyから取得された。このプロトコルは、UCLA Institutional Animal Care and Used Committeeによって承認された。CD19 CAR-T細胞およびCD20 CAR-T細胞の評価のため、各マウスに、尾静脈注射によって、0.5×10⁵個のEGFP⁺ホタルルシフェラーゼ（ffLuc）発現Raji細胞を投与した。6～9日後、腫瘍生着を確認した後に、1.5×10⁶～5×10⁶個のCAR⁺ T細胞またはEGFRtのみを発現する細胞（陰性対照）を、尾静脈を介して、腫瘍保持マウスに注射した。本文および図面に記されるように、研究のサブセットにおいては、2回目に0.5×10⁶個、3回目に2×10⁶個の腫瘍細胞を投与した。GD2 CAR-T細胞の研究においては、各マウスに、尾静脈注射によって、3.5×10⁶個のCHLA-255-Luc-EGFP細胞を投与した。CHLA-255腫瘍生着の確認後（腫瘍注射の17日後）、2×10⁶個のCAR⁺ T細胞を尾静脈を介して腫瘍保持マウスに注射した。腫瘍投与、T細胞投与、腫瘍再チャレンジの詳細は、本文および図面に示された。腫瘍の進行/退縮は、IVIS Illumina III LT Imaging System（PerkinElmer）によってモニタリングされた。血液試料は、T細胞注射の3日後およびその後の10日毎に後眼窩採血を介して採集された。マウスは、人道的エンドポイントにおいて安楽死させられた。骨髄、脾臓、および肝臓が、安楽死後に収集された。組織が粉砕され、100μmフィルターに通された後、赤血球溶解およびその後のフローサイトメトリー分析が行われた。ATAC-seq実験およびRNA-seq実験のため、NSGマウスに、0.5×10⁶個のRaji細胞を生着させ、6日後に、2.85×10⁶個のCAR-T細胞によって処置した。T細胞注射の9日後、動物組織（肝臓、脾臓、心臓血、および骨髄）からCAR-T細胞を回収し、磁気活性化細胞選別（MACS）によってhuCD45⁺亜集団およびEGFRt⁺亜集団について濃縮した後、ATAC-seq/RNA-seqライブラリーを構築した。

9. ATAC-seqライブラリー構築およびデータ分析
ATAC-seqライブラリーは、以前に記載されたように構築された（Buenrostro et al.,2013；Corces et al.,2017）。簡単に説明すると、MACS選別からのマウス1匹当たり30,000～50,000個の生存T細胞が、PBSで1回洗浄され、0.1％IGEPAL CA-630、0.1％Tween-20、および0.01％ジギトニンを含む50μL再懸濁緩衝液（RSB）緩衝液（10mM Tris-HCL、pH 7.4、10mM NaCl、3mM MgCl₂）に溶解させられた。試料は、0.1％Tween-20を含有する1mL RSB緩衝液で洗浄され、500×gで4℃で10分間遠心分離された。ペレット化された核が、25μL Tn5転位ミックス（12.5μL 2×Tagment DNA緩衝液、1.25μL Tn5トランスポザーゼ、および11.25μL滅菌水；Illumina）に再懸濁させられ、37℃、500RPMの振とうインキュベーター内に1時間保存された。転位反応物は、DNA Clean & Concentratorキット（Zymo Research）によって精製された。DNA断片は、以前に記載されたようにNEB Q5 MasterMixおよびカスタムプライマーを使用してPCR増幅された（Buenrostro et al.,2013）。ライブラリーは、AmPureビーズ（Beckman Coulter）によってサイズ選択され、TapeStationによって定量化された。ライブラリーは、UCLA Broad Stem Cell Research CenterのHigh Throughput Sequencingコアにおいて、Illumina NovaSeq S1プラットフォームで、50bpペアエンドリードによって配列決定された。ATAC-seqからのFastqファイルは、FastQC（Linux、v0.11.8）によってクオリティ調査された。リードは、低いクオリティ（クオリティスコア＜33）を有するリードを除去し、アダプターをトリミングするため、cutadapt（Linux、v1.18）によって処理された。トリミングされたリードは、マウス細胞からの混入リードを排除するため、Bowtie2（Linux、v2.2.9）を使用してmm10参照ゲノムと整列化された。その後、非マウスリードがBowtie2によってhg38ゲノムにマッピングされ、samファイルがsamtools（Linux、v1.9）によってbamファイルに変換された。ピークは、整列化されたリードにおいてMACS2（Linux、v2.1.2）を使用して各レプリケートについて独立にコールされ、その後、bedtools（v2.26.0）によってマージされた。各ピークに割り当てられたリードは、subread内のfeatureCountsファンクション（Linux、v1.6.3）によって計数された。クロマチンのアクセシブルな部位を可視化するため、MACS2からコールされたピークが、IGV（v2.8.0）において可視化された。転写開始部位（TSS）の-1kb～1kb内のピークの（MACS2によって計算された）フォールドエンリッチメント（Fold enrichment）は、プロモーター領域のアクセシビリティを示す。

10. バルクRNA-seqおよび遺伝子セットエンリッチメント分析（GSEA）
Qiagen RNeasy Plus Miniキットを使用して、200,000～700,000個のMACSによって選別されたCAR-T細胞から、全RNAを抽出した。mRNAは、NEBNext Poly(A)mRNA Magnetic Isolation Module（New England BioLabs）を使用して単離された。RNA-seqライブラリーは、製造業者のプロトコルに従って、NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prepキット（New England BioLabs）を使用して生成された。RNA-seqからのFastqファイルは、FastQC（Linux、v0.11.8）によってクオリティ調査された。リードは、低いクオリティ（クオリティスコア＜33）を有するリードを除去し、アダプターをトリミングするため、cutadapt（Linux、v1.18）によって処理された。トリミングされたリードが、マウス細胞由来の混入リードを除去するため、Tophat2（Linux、v2.1.0）を使用して、mm10参照ゲノムと整列化された。非マウスリードは、Tophat2によってhg38ゲノムにマッピングされた。各遺伝子に割り当てられたリードは、ensembl 38遺伝子セットを参照として、subreadパッケージ（Linux、v1.6.3）内のfeatureCountsファンクションによって計数された。少なくとも1つの試料においてマッピングされた少なくとも8つのリードを有しない遺伝子は、信頼性のある検出限界を下回っていると見なされ、排除された。リード数は、RPKM（1キロ塩基当たり百万当たりのリード）値を生じるため、Trimmed Mean of M-values法（R v3.6.3で実行されるedgeRにおけるTMMノーマライゼーション法）によってノーマライズされ、ディファレンシャルな発現がパッケージedgeRを使用して計算された。遺伝子オントロジー分析は、GSEAソフトウェア（v4.1.0、Broad Institute）およびBubbleGUM（v1.3.19）を使用して実施された（Spinelli et al.,2015）。ディファレンシャルに発現された遺伝子の発現値は、最新のMSigDB遺伝子セットから選択された2493のT細胞関連遺伝子セットの精選されたリストを使用して、プログラムに入力された。ディファレンシャルに発現された遺伝子についてのヒートマップは、R（バージョン3.6.3）内のpheamapパッケージおよびggplot2パッケージを使用して生成された。ボルケーノプロットは、R内のggplot2（バージョン3.6.3）を使用して生成された。

11. 代謝産物の抽出および分析
細胞を、最初に、10％HI-FBSが補足されたRPMI-1640において培養した。代謝産物抽出の24～72時間前に、培養培地を、2g/L 1,2-¹³C-グルコースと共に10％FBSまたは透析FBS（dFBS）を含有するRPMIに交換した。栄養素の取り込みおよび消費を評価するため、24時間毎に、細胞培養培地を各細胞株から収集した。1倍体積の培地に、4倍体積の100％HPLCグレードメタノールを添加し、細胞片を沈殿させるため、17,000×gおよび4℃で5分間遠心分離した。透明な上清を採集し、液体クロマトグラフィおよびその後の質量分析（LC-MS）によって分析した。栄養素の取り込みおよび消費の正確な推定を提供するため、栄養素の枯渇を回避するため、24時間毎に部分的な培地交換を実施した。標識グルコース培地に切り替えてから24時間後または72時間後に、細胞内代謝産物抽出を以前に記載されたように実施した（Bennett et al.,2008；Park et al.,2019）。簡単に説明すると、細胞をナイロンメンブレンフィルター（0.45μm；Millipore）に移し、培地を除去するため吸引した。各フィルターを、6穴プレートの1個のウェルにおいて、400μLの冷抽出溶媒（40:40:20（v/v）のHPLCグレードアセトニトリル:メタノール:水）に迅速に浸漬した。プレートを-20℃で20分間インキュベートした。その後、細胞抽出液を1.7mLの微量遠心菅に移し、17,000×gで4℃で5分間遠心分離した。上清を凍結乾燥し、総細胞数に対してノーマライズされたHPLCグレード水（100万細胞当たり50μL）で再構成した。メタノールによって処理された培地試料および細胞内代謝産物抽出物の両方を、UCLAのMolecular Instrumentation Center（MIC）において、高解像度orbitrap質量分析計（Q-Exactive plus Orbitrap；Thermo Fisher Scientific）とカップリングされた逆相イオン対液体クロマトグラフィ（Vanquish UPLC；Thermo Fisher Scientific）によって分析した。質量電荷（m/z）比および保持時間を、以前にバリデートされた標準物質と比較することによって、代謝産物を同定した。試料を、ネガティブイオンモードおよびポジティブイオンモードの両方で検出した。ネガティブイオンモードを、それぞれ、60～200および200～2000のm/z比のデータを取得するため、2つのサブグループ（nloおよびnhi）に分離した。LC-MSデータを、Metabolomic Analysis and Visualization Engine（MAVEN）を使用して処理した（Clasquin et al.,2012）。標識画分を、¹³Cの天然に存在する存在量について補正した。LC-MS測定からのイオンカウントを、既知の濃度を有する対照に対してノーマライズすることによって、24時間目および72時間目に、培養培地中の代謝産物の濃度を定量化した。新鮮な培地からの試料濃度を差し引き、生存細胞数に対してノーマライズすることによって、取り込みおよび分泌の速度を計算した（正の値によって示される分泌および負の値によって示される取り込み）。細胞培養物からの培地交換を説明するため、モルバランスを実施した。計算は、24時間毎の10～20％の媒体蒸発を考慮した。

12. 統計分析
対応のない両側2標本スチューデントt検定およびログランク・メンテル・コックス検定を含む統計検定は、GraphPad Prism V8を使用して実施された。RNA-seqにおけるディファレンシャル遺伝子分析のための一元配置分散分析検定は、edgeR内のglmQLFTestファンクションを使用して実施された。

実施例4：CAR操作
この実施例は、上記の実施例を補足するデータを提供する。いくつかの場合において、データは、上記の例のものと重複しており、異なる方法で提示されているに過ぎない。図1に示されるのは、様々な抗体に由来するscFvによって構築されたCD20 CARの概略図である。すべてのCARが、CD28共刺激ドメイン（図1A）およびCD20 CAR構築において使用されたscFvドメインの配列を含有する第2世代受容体であった。

Leu16ベース、リツキシマブベース、GA101ベース、およびオファツムマブベースのCARは、すべて、初代ヒトT細胞の表面上に効率的に発現され、エクスビボ培養中のT細胞増大に対する影響に有意差はない。（図27A～C）。Leu16ベース、リツキシマブベース、GA101ベース、およびオファツムマブベースのCARは、類似した抗原検出閾値を示す（図28A～C）。リツキシマブ由来CD20 CARは、抗原刺激の非存在下での（図29A、B）活性化マーカーおよび消耗マーカーのアップレギュレーションならびに（図29C、D）T細胞増殖をもたらす、抗原非依存的CARシグナル伝達を示す。図29A、Cは、CD8+細胞およびCD14-/CD25-/CD62L+表現型によって選別されたナイーブ/メモリーT（TN/M）細胞の両方において観察された、リツキシマブベースのCAR-T細胞におけるトニックシグナル伝達を示す。リツキシマブ由来CD20 CARは、グルコースおよびグルタミンの取り込みの増加、ならびに乳酸、アラニン、およびグルタミン酸の分泌の増加によって証拠付けられる、代謝流量のアップレギュレーションをもたらす、抗原非依存的CARシグナル伝達を示す。CD19 CARおよびGD2 CARを、それぞれ、トニックシグナル伝達についての陰性対照および陽性対照として含めた（図30）。共焦点顕微鏡法は、Leu16ベース、リツキシマブベース、GA101ベース、およびオファツムマブベースのCARの均一な表面発現を示し、そのことから、リツキシマブCAR-T細胞によるトニックシグナル伝達が、CARクラスター形成によって引き起こされるのではないことが示された（図31）。リツキシマブベースのCAR-T細胞は、初期の時点では、Leu16ベース、GA101ベース、およびオファツムマブベースのCARより大きい腫瘍コントロールを示すが、2週間後には抗腫瘍効力を急速に失う（図32）。リツキシマブベースのCARのアラニン挿入バリアント（図17）は、初代ヒトT細胞の表面上に良好に発現される（図33）。アラニン挿入は、リツキシマブベースのCAR-T細胞におけるトニックシグナル伝達の低下をもたらす（図34）。アラニン挿入は、リツキシマブベースのCAR-T細胞のインビトロ抗腫瘍活性を改変しなかった（図35）。

CD28の膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間に挿入された2個のアラニン残基を含有するリツキシマブ由来CD20 CARは、優れたインビボ抗腫瘍機能をもたらす。NOD/scid/γ-/-（NSG）マウスに、50万個のホタルルシフェラーゼ発現Rajiリンパ腫細胞を生着させ、腫瘍注射の7日後に、CD20 CARまたは形質導入マーカー（EGFRt）のいずれかを発現する135万個のT細胞によって処置した。7日後に150万個のT細胞を動物に再投与した。この研究において試験されたすべてのCARが、リツキシマブ由来scFv、IgG4ヒンジ-CH2-CH3細胞外スペーサー、CD28の膜貫通ドメインおよび細胞質ドメイン、ならびにCD3ζシグナル伝達ドメインを含有した。0～4個のアラニンが、CD28膜貫通ドメインとCD28細胞質ドメインとの間に挿入されていた。腫瘍進行を生物発光イメージングによってモニタリングし、腫瘍注射からの時間の関数として放射シグナルを示した。各放射輝度トレースのエンドポイントは、各動物の人道的エンドポイントを示す。2アラニン挿入バリアントは、親（アラニン挿入なし）構築物および他のバリアントと比較して、優れた腫瘍コントロールおよび延長された生存期間中央値を示した。このデータは図5に示される。アラニン挿入は、CAR-T細胞機能を改善するための一般化可能な方法である（図36）。

ハイブリッドscFv（図6）を有するCD20 CARは、初代ヒトT細胞の表面上に効率的に発現される（図37）。RFR-LCDRハイブリッドCD20 CARは、抗原刺激の非存在下での活性化マーカーおよび消耗マーカーのアップレギュレーション（図38A）ならびにT細胞増殖（図38B）をもたらす、抗原非依存的CARシグナル伝達を示す。図38において、CD19 CARおよびGD2 CARが、それぞれ、トニックシグナル伝達についての陰性対照および陽性対照として含まれた。RFR-LCDRハイブリッドCD20 CARは、インビトロで、反復抗原チャレンジ時に、優れた腫瘍細胞死滅を示す。様々なCARまたは形質導入マーカー（EGFRt）を発現するT細胞を、48時間毎に、新鮮なRajiリンパ腫細胞によってチャレンジした。生存標的細胞数を、各再チャレンジの前にフローサイトメトリーによって定量化した。複数のドナーからの結果は、RFR-LCDRハイブリッドCARによる腫瘍細胞死滅が、その親構築物（Leu16およびリツキシマブ）のいずれと比較しても優れていることを示している（図8）。Leu16、リツキシマブ、およびRFR-LCDRのscFvの結合動力学パラメーターを、バイオレイヤー干渉法によって測定した（図39）。

新規のCAR構築物を生成するため、アラニン挿入およびscFvハイブリッド化を組み合わせることができる（図40）。RFR-LCDRハイブリッドscFvを含有するCARは、アラニン挿入の有無にかかわらず、低いがゼロではないレベルのトニックシグナル伝達をもたらす（図41）。RFR-LCDRハイブリッドscFvを含有するCARは、アラニン挿入の有無にかかわらず、グルコースおよびグルタミンの取り込み、ならびに乳酸、アラニン、およびグルタミン酸の分泌によって証拠付けられる、低いがゼロではないレベルのトニックシグナル伝達をもたらす（図42）。トニックシグナル伝達CARは、ミトコンドリアタンパク質翻訳の増加（図43A）、抗原提示の増加（図43B）、MYCシグナル伝達の増加（図43C）、MTORCシグナル伝達の増加（図43D）、TNFαシグナル伝達の増加（図43E）、多岐にわたるインターフェロン応答（図43F）、（メモリーT細胞サブタイプとは対照的な）エフェクターT細胞サブタイプに関連する遺伝子のサインのエンリッチメント（図43G）、および細胞周期活性の増加（図43H）を示す、異なる転写プロファイルを示す。表示可能なスペースを超える遺伝子を含有するヒートマップについては、ヒートマップに示される遺伝子の名前が、各マップの横に順番に記載される。RFR-LCDRハイブリッドCD20 CARは、インビボで、優れた腫瘍クリアランスを示す（図44）。トランスクリプトームおよびエピジェネティクスの分析は、T細胞表現型のCAR依存的変動を明らかにする（図45）。NSGマウスに、0.5×10⁶個のホタルルシフェラーゼ発現Raji細胞をi.v.注射し、6日後に、2.85×10⁶個のCAR⁺ T細胞のi.v.送達によって処置した。肝臓、脾臓、心臓血、および骨髄を、T細胞注射の9日後に、腫瘍保持マウスから収集した（各群n＝2マウス）。CAR⁺ T細胞を、huCD45⁺EGFRt⁺集団について濃縮することによって取得し、続いて、RNAseqおよびATACseqによって分析した（図45）。

本明細書において開示され、特許請求の範囲に記載される方法は、すべて、本開示を考慮すれば、過度の実験なしに作製され、実施され得る。本開示の組成物および方法が、好ましい態様に関して記載されたが、本開示の概念、本旨、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される方法、および方法の工程または工程の順序に、変動が施されてもよいことが、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連するある特定の薬剤を、本明細書に記載される薬剤の代わりに用いても、同じまたは類似した結果を達成することが可能であることが、明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似した代用物および修飾は、すべて、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の本旨、範囲、および概念に含まれると見なされる。

本願において列挙された参考文献は、本明細書に記載されるものを補足する例示的な手法またはその他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。

以下の参考文献および本明細書全体を通して言及される刊行物は、本明細書に記載されるものを補足する例示的な手法またはその他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。

参考文献

Claims

軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含む抗CD20単鎖可変断片（scFv）を含むポリペプチドであって、
LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:29、30、31、22、12、13、および14と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:26、27、28、18、9、10、および11と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記ポリペプチド。
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含む抗CD20単鎖可変断片（scFv）を含むポリペプチドであって、
LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:5の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:6の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記ポリペプチド。
LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3が、SEQ ID NO:5の可変領域に由来するLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3のアミノ酸配列を含み、かつ/またはHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3が、SEQ ID NO:5の可変領域に由来するHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3のアミノ酸配列を含む、請求項1または2記載のポリペプチド。
LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/またはLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:29、30、31、22、12、13、および14のアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/またはHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:26、27、28、18、9、10、および11のアミノ酸配列を含む、請求項1～3のいずれか一項記載のポリペプチド。
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、LFR1、LCDR1、LFR2、LCDR2、LFR3、LCDR3、およびLFR4を含む軽鎖可変領域；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、HFR1、HCDR1、HFR2、HCDR2、HFR3、HCDR3、およびHFR4を含む重鎖可変領域
を含む抗CD20 scFvを含むポリペプチドであって、
LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:19、20、21、22、24、13、および25と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:15、16、17、18、9、10、および23と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記ポリペプチド。
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含む抗CD20単鎖可変断片（scFv）を含むポリペプチドであって、
LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:7の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:8の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記ポリペプチド。
LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3が、SEQ ID NO:7の可変領域に由来するLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3のアミノ酸配列を含み、かつ/またはHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3が、SEQ ID NO:8の可変領域に由来するHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3のアミノ酸配列を含む、請求項5または6記載のポリペプチド。
LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/またはLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:19、20、21、22、24、13、および25のアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/またはHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:15、16、17、18、9、10、および23のアミノ酸配列を含む、請求項5～7のいずれか一項記載のポリペプチド。
軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:5と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、SEQ ID NO:6と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1～4のいずれか一項記載のポリペプチド。
VLがSEQ ID NO:5のアミノ酸配列を含み、VHがSEQ ID NO:6のアミノ酸配列を含む、請求項9記載のポリペプチド。
軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:7と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、SEQ ID NO:8と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項5～8のいずれか一項記載のポリペプチド。
VLがSEQ ID NO:7のアミノ酸配列を含み、VHがSEQ ID NO:8のアミノ酸配列を含む、請求項11記載のポリペプチド。
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含む抗GD2単鎖可変断片（scFv）を含むポリペプチドであって、
LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:136、137、138、139、113、114、および115と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:132、133、134、135、110、111、および112と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記ポリペプチド。
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含む抗GD2単鎖可変断片（scFv）を含むポリペプチドであって、
LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:141の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:140の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記ポリペプチド。
LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3が、SEQ ID NO:141の可変領域に由来するLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3のアミノ酸配列を含み、かつ/またはHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3が、SEQ ID NO:140の可変領域に由来するHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3のアミノ酸配列を含む、請求項13～14のいずれか一項記載のポリペプチド。
軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:141と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、SEQ ID NO:140と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項13～15のいずれか一項記載のポリペプチド。
VLがSEQ ID NO:140のアミノ酸配列を含み、VHがSEQ ID NO:141のアミノ酸配列を含む、請求項16記載のポリペプチド。
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含む抗GD2単鎖可変断片（scFv）を含むポリペプチドであって、
LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:120、121、122、123、129、130、および131と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:116、117、118、119、126、127、および128と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記ポリペプチド。
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含む抗GD2単鎖可変断片（scFv）を含むポリペプチドであって、
LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:144の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:143の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、
前記ポリペプチド。
LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3が、SEQ ID NO:144の可変領域に由来するLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、および/もしくはLCDR3のアミノ酸配列を含み、かつ/またはHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3が、SEQ ID NO:143の可変領域に由来するHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、および/もしくはHCDR3のアミノ酸配列を含む、請求項13～14のいずれか一項記載のポリペプチド。
軽鎖可変領域が、SEQ ID NO:144と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、重鎖可変領域が、SEQ ID NO:143と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項18～20のいずれか一項記載のポリペプチド。
VLがSEQ ID NO:144のアミノ酸配列を含み、VHがSEQ ID NO:143のアミノ酸配列を含む、請求項21記載のポリペプチド。
VHとVLとの間にリンカーを含む、請求項1～22のいずれか一項記載のポリペプチド。
リンカーが4～40アミノ酸長である、請求項23記載のポリペプチド。
リンカーが少なくとも4個のグリシン残基および/またはセリン残基を含む、請求項23記載のポリペプチド。
リンカーが(GGGGS)_nを含み、ここで、nが1、2、3、4、5、または6である、請求項23～25のいずれか一項記載のポリペプチド。
リンカーがGSTSGGGSGGGSGGGGSS（SEQ ID NO:32）を含む、請求項24～26のいずれか一項記載のポリペプチド。
リンカーがアミノ酸配列(EAAAK)_nを含むか、またはアミノ酸配列(EAAAK)_nからなり、ここで、nが1、2、3、4、5、または6である、請求項23または24記載のポリペプチド。
リンカーがGGGGSを含む、請求項24～26のいずれか一項記載のポリペプチド。
リンカーが(GGGGS)₄である、請求項23～26のいずれか一項記載のポリペプチド。
VHがVLに対してアミノ近位である、請求項1～30のいずれか一項記載のポリペプチド。
VHがVLに対してカルボキシ近位である、請求項1～30のいずれか一項記載のポリペプチド。
scFvと膜貫通ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域とを含むキメラ抗原受容体（CAR）を含む、請求項1～32のいずれか一項記載のポリペプチド。
単一の膜貫通ドメイン、および/または一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む単一の細胞質領域を含む、請求項1～32のいずれか一項記載のポリペプチド。
アミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、scFvと膜貫通ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域とを含む、請求項33または34記載のポリペプチド。
CARが単一特異性である、請求項33または34記載のポリペプチド。
CARが膜貫通ドメインとscFvとの間に細胞外スペーサーをさらに含む、請求項33～36のいずれか一項記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーが8～1000アミノ酸長である、請求項37記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーが8～500アミノ酸長である、請求項38記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーが100～300アミノ酸長である、請求項39記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーが100個未満のアミノ酸を有する、請求項39記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーがIgG4ヒンジ、CD8αヒンジ、IgG1ヒンジ、CD34ヒンジ、またはそれらの断片である、請求項37～41のいずれか一項記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーがIgG4ヒンジまたはその断片を含む、請求項42記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーがCH1領域、CH2領域、および/もしくはCH3領域を含むか、またはさらに含む、請求項37～43のいずれか一項記載のポリペプチド。
スペーサーがIgG4ヒンジポリペプチド、CH2領域、およびCH3領域を含むか、またはIgG4ヒンジポリペプチド、CH2領域、およびCH3領域からなる、請求項44記載のポリペプチド。
CH2領域がL235E置換および/またはN297Q置換を含む、請求項44または45記載のポリペプチド。
スペーサーが、SEQ ID NO:36と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む、請求項42～46のいずれか一項記載のポリペプチド。
膜貫通ドメインが、T細胞受容体のα鎖もしくはβ鎖、CD28、CD3ε（イプシロン）、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137、またはCD154の膜貫通ドメインである、請求項33～47のいずれか一項記載のポリペプチド。
膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインである、請求項48記載のポリペプチド。
膜貫通ドメインが、SEQ ID NO:37と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む、請求項48記載のポリペプチド。
一次細胞内シグナル伝達ドメインがCD3ζである、請求項33～50のいずれか一項記載のポリペプチド。
一次細胞内シグナル伝達ドメインが、SEQ ID NO:39と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む、請求項51記載のポリペプチド。
細胞質領域が、1つまたは複数の共刺激ドメインをさらに含む、請求項33～51のいずれか一項記載のポリペプチド。
細胞質領域が、2つの共刺激ドメインを含む、請求項33～53のいずれか一項記載のポリペプチド。
1つまたは複数の共刺激ドメインが、4-1BB（CD137）、CD28、IL-15Rα、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、および/またはICOS（CD278）のうちの1つまたは複数に由来する共刺激ドメインを含む、請求項53または54記載のポリペプチド。
1つまたは複数の共刺激ドメインが、CD28由来の共刺激ドメインを含む、請求項55記載のポリペプチド。
共刺激ドメインが、SEQ ID NO:38と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む、請求項56記載のポリペプチド。
膜貫通ドメインと細胞質領域との間にねじれリンカーをさらに含む、請求項33～57のいずれか一項記載のポリペプチド。
ねじれリンカーが1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個のアミノ酸残基を含む、請求項58記載のポリペプチド。
アミノ酸残基がアラニン残基を含むかまたはアラニン残基からなる、請求項59記載のポリペプチド。
ねじれリンカーが2個または4個のアラニン残基からなる、請求項59記載のポリペプチド。
アミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、scFvと膜貫通ドメインとねじれリンカーと一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域とを含むCARを含むポリペプチドであって、ねじれリンカーが1～12個のアラニン残基を含む、前記ポリペプチド。
ねじれリンカーが、2個もしくは4個のアラニン残基を含むか、または2個もしくは4個のアラニン残基からなる、請求項62記載のポリペプチド。
scFvがVHおよびVLを含み、該VHとVLとの間にリンカーが存在する、請求項62または63記載のポリペプチド。
リンカーが4～40アミノ酸長である、請求項64記載のポリペプチド。
リンカーが少なくとも4個のグリシン残基および/またはセリン残基を含む、請求項64記載のポリペプチド。
リンカーが(GGGGS)_nを含み、ここで、nが1、2、3、4、5、または6である、請求項64～66のいずれか一項記載のポリペプチド。
リンカーがGSTSGGGSGGGSGGGGSS（SEQ ID NO:32）を含む、請求項65～66のいずれか一項記載のポリペプチド。
リンカーがアミノ酸配列(EAAAK)_nを含むか、またはアミノ酸配列(EAAAK)_nからなり、ここで、nが1、2、3、4、5、または6である、請求項64または65記載のポリペプチド。
リンカーがGGGGSを含む、請求項65～67のいずれか一項記載のポリペプチド。
リンカーが(GGGGS)₄である、請求項64～67のいずれか一項記載のポリペプチド。
VHがVLに対してアミノ近位である、請求項62～71のいずれか一項記載のポリペプチド。
VHがVLに対してカルボキシ近位である、請求項62～71のいずれか一項記載のポリペプチド。
単一の膜貫通ドメイン、および/または一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む単一の細胞質領域を含む、請求項62～73のいずれか一項記載のポリペプチド。
CARが単一特異性である、請求項62～74のいずれか一項記載のポリペプチド。
CARが二重特異性である、請求項62～74のいずれか一項記載のポリペプチド。
CARが膜貫通ドメインとscFvとの間に細胞外スペーサーをさらに含む、請求項62～76のいずれか一項記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーが8～1000アミノ酸長である、請求項77記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーが8～500アミノ酸長である、請求項78記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーが100～300アミノ酸長である、請求項79記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーが100個未満のアミノ酸を有する、請求項79記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーがIgG4ヒンジ、CD8αヒンジ、IgG1ヒンジ、CD34ヒンジ、またはそれらの断片である、請求項77～81のいずれか一項記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーがIgG4ヒンジまたはその断片を含む、請求項82記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーがCH1領域、CH2領域、および/もしくはCH3領域を含むか、またはさらに含む、請求項77～83のいずれか一項記載のポリペプチド。
スペーサーがIgG4ヒンジポリペプチド、CH2領域、およびCH3領域を含むか、またはIgG4ヒンジポリペプチド、CH2領域、およびCH3領域からなる、請求項84記載のポリペプチド。
CH2領域がL235E置換および/またはN297Q置換を含む、請求項84または85記載のポリペプチド。
スペーサーが、SEQ ID NO:36と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む、請求項82～86のいずれか一項記載のポリペプチド。
膜貫通ドメインが、T細胞受容体のα鎖もしくはβ鎖、CD28、CD3ε（イプシロン）、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137、またはCD154の膜貫通ドメインである、請求項62～87のいずれか一項記載のポリペプチド。
膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインである、請求項88記載のポリペプチド。
膜貫通ドメインが、SEQ ID NO:37と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む、請求項89記載のポリペプチド。
一次細胞内シグナル伝達ドメインがCD3ζである、請求項62～90のいずれか一項記載のポリペプチド。
一次細胞内シグナル伝達ドメインが、SEQ ID NO:39と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む、請求項91記載のポリペプチド。
細胞質領域が、1つまたは複数の共刺激ドメインをさらに含む、請求項62～92のいずれか一項記載のポリペプチド。
細胞質領域が、2つの共刺激ドメインを含む、請求項62～93のいずれか一項記載のポリペプチド。
1つまたは複数の共刺激ドメインが、4-1BB（CD137）、CD28、IL-15Rα、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、および/またはICOS（CD278）のうちの1つまたは複数に由来する共刺激ドメインを含む、請求項93または94記載のポリペプチド。
1つまたは複数の共刺激ドメインが、CD28由来の共刺激ドメインを含む、請求項95記載のポリペプチド。
共刺激ドメインが、SEQ ID NO:38と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む、請求項96記載のポリペプチド。
scFvが、同じ抗原に結合する異なる抗原結合領域または抗体に由来するフレームワーク領域（FR）および相補性決定領域（CDR）を含むハイブリッドscFvである、請求項62～97のいずれか一項記載のポリペプチド。
FRおよびCDRが、同じ種に由来する抗原結合領域または抗体に由来する、請求項98記載のポリペプチド。
FRおよびCDRが、ヒトの抗原結合領域または抗体に由来する、請求項98または99記載のポリペプチド。
ハイブリッドscFvを含むポリペプチドの免疫原性が、非ハイブリッドscFvを含むポリペプチドの免疫原性と有意に異ならず、ここで、該非ハイブリッドscFvが、該ハイブリッドscFvのFRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来するか、または該非ハイブリッドscFvが、該ハイブリッドscFvのCDRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来する、請求項98～100のいずれか一項記載のポリペプチド。
FRおよびCDRが、異なるトニックシグナル伝達強度を有する抗原結合領域または抗体に由来する、請求項98～101のいずれか一項記載のポリペプチド。
FRが、CDRが由来する抗原結合領域または抗体より高いトニックシグナル伝達強度を有する抗原結合領域または抗体に由来する、請求項102記載のポリペプチド。
CDRが、FRが由来する抗原結合領域または抗体より高いトニックシグナル伝達強度を有する抗原結合領域または抗体に由来する、請求項102記載のポリペプチド。
前記ポリペプチドが、非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍死滅活性を有し、ここで、該非ハイブリッドscFvが、ハイブリッドscFvのFRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来し、かつ/または該ポリペプチドが、非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍死滅活性を有し、ここで、該非ハイブリッドscFvが、ハイブリッドscFvのCDRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来する、請求項98～104のいずれか一項記載のポリペプチド。
前記ポリペプチドが、非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍細胞クリアランス活性を有し、ここで、該非ハイブリッドscFvが、ハイブリッドscFvのFRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来し、かつ/または該ポリペプチドが、非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍死滅活性を有し、ここで、該非ハイブリッドscFvが、ハイブリッドscFvのCDRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来する、請求項98～105のいずれか一項記載のポリペプチド。
scFvが抗CD20 scFvを含む、請求項62～106のいずれか一項記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含み；ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:29、30、31、22、12、13、および14と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:26、27、28、18、9、10、および11と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項107記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含み；ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:5の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:6の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項107記載のポリペプチド。
scFvが、それぞれ、SEQ ID NO:24、13、および25のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:9、10、および23のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項107記載のポリペプチド。
scFvが、SEQ ID NO:3の可変領域のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL、ならびにSEQ ID NO:4の可変領域のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項107記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、LFR1、LCDR1、LFR2、LCDR2、LFR3、LCDR3、およびLFR4を含む軽鎖可変領域；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、HFR1、HCDR1、HFR2、HCDR2、HFR3、HCDR3、およびHFR4を含む重鎖可変領域
を含み、ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:19、20、21、22、24、13、および25と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:15、16、17、18、9、10、および23と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項107記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含み、ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:7の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:8の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項107記載のポリペプチド。
scFvが、それぞれ、SEQ ID NO:12、13、および14のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:9、10、および11のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項107記載のポリペプチド。
scFvが、SEQ ID NO:1の可変領域のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL、ならびにSEQ ID NO:2の可変領域のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項107記載のポリペプチド。
scFvが抗GD2 scFvを含む、請求項62～97のいずれか一項記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含み、ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:136、137、138、139、113、114、および115と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:132、133、134、135、110、111、および112と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項116記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含み、ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:141の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:140の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項116記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含み、ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:120、121、122、123、129、130、および131と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:116、117、118、119、126、127、および128と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項116記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含み、ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:144の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:143の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項116記載のポリペプチド。
scFvが、それぞれ、SEQ ID NO:129、130、および131のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:126、127、および128のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項116記載のポリペプチド。
scFvが、SEQ ID NO:125の可変領域のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL、ならびにSEQ ID NO:124の可変領域のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項116記載のポリペプチド。
scFvが、それぞれ、SEQ ID NO:113、114、および115のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:110、111、および112のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項116記載のポリペプチド。
scFvが、SEQ ID NO:109の可変領域のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL、ならびにSEQ ID NO:108の可変領域のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項116記載のポリペプチド。
アミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、可変重鎖（VH）領域および可変軽鎖（VL）領域を含むscFvと膜貫通ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域とを含むCARを含むポリペプチドであって、該scFvが、同じ抗原に結合する異なる抗原結合領域または抗体に由来するフレームワーク領域（FR）および相補性決定領域（CDR）を含むハイブリッドscFvである、前記ポリペプチド。
FRおよびCDRが、同じ種に由来する抗原結合領域または抗体に由来する、請求項125記載のポリペプチド。
FRおよびCDRが、ヒトのまたはヒト化された抗原結合領域または抗体に由来する、請求項125または126記載のポリペプチド。
ハイブリッドscFvを含む前記ポリペプチドの免疫原性が、非ハイブリッドscFvを含むポリペプチドの免疫原性と有意に異ならず、ここで、該非ハイブリッドscFvが、該ハイブリッドscFvのFRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来するか、または該非ハイブリッドscFvが、該ハイブリッドscFvのCDRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来する、請求項125～127のいずれか一項記載のポリペプチド。
FRおよびCDRが、異なるトニックシグナル伝達強度を有する抗原結合領域または抗体に由来する、請求項125～128のいずれか一項記載のポリペプチド。
FRが、CDRが由来する抗原結合領域または抗体より高いトニックシグナル伝達強度を有する抗原結合領域または抗体に由来する、請求項129記載のポリペプチド。
CDRが、FRが由来する抗原結合領域または抗体より高いトニックシグナル伝達強度を有する抗原結合領域または抗体に由来する、請求項129記載のポリペプチド。
前記ポリペプチドが、非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍死滅活性を有し、ここで、該非ハイブリッドscFvが、ハイブリッドscFvのFRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来し、かつ/または該ポリペプチドが、非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍死滅活性を有し、ここで、該非ハイブリッドscFvが、ハイブリッドscFvのCDRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来する、請求項125～131のいずれか一項記載のポリペプチド。
前記ポリペプチドが、非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍細胞クリアランス活性を有し、ここで、該非ハイブリッドscFvが、ハイブリッドscFvのFRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来し、かつ/または該ポリペプチドが、非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍死滅活性を有し、ここで、該非ハイブリッドscFvが、ハイブリッドscFvのCDRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来する、請求項125～132のいずれか一項記載のポリペプチド。
前記ポリペプチドが膜貫通ドメインと細胞質領域との間にねじれリンカーを含み、該ねじれリンカーが1～12個のアラニン残基を含む、請求項125～133のいずれか一項記載のポリペプチド。
ねじれリンカーが、2個もしくは4個のアラニン残基を含むか、または2個もしくは4個のアラニン残基からなる、請求項134記載のポリペプチド。
scFvがVHおよびVLを含み、該VHとVLとの間にリンカーが存在する、請求項134または135記載のポリペプチド。
リンカーが4～40アミノ酸長である、請求項136記載のポリペプチド。
リンカーが少なくとも4個のグリシン残基および/またはセリン残基を含む、請求項137記載のポリペプチド。
リンカーが(GGGGS)_nを含み、ここで、nが1、2、3、4、5、または6である、請求項136～138のいずれか一項記載のポリペプチド。
リンカーがGSTSGGGSGGGSGGGGSS（SEQ ID NO:32）を含む、請求項136～139のいずれか一項記載のポリペプチド。
VHがVLに対してアミノ近位である、請求項125～140のいずれか一項記載のポリペプチド。
VHがVLに対してカルボキシ近位である、請求項125～140のいずれか一項記載のポリペプチド。
CARが単一特異性である、請求項125～142のいずれか一項記載のポリペプチド。
CARが二重特異性である、請求項125～142のいずれか一項記載のポリペプチド。
CARが膜貫通ドメインとscFvとの間に細胞外スペーサーをさらに含む、請求項125～144のいずれか一項記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーが8～1000アミノ酸長である、請求項145記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーが8～500アミノ酸長である、請求項145記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーが100～300アミノ酸長である、請求項145記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーが100個未満のアミノ酸を有する、請求項145記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーが、IgG4ヒンジ、CD8αヒンジ、IgG1ヒンジ、CD34ヒンジ、またはそれらの断片である、請求項145～149のいずれか一項記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーがIgG4ヒンジまたはその断片を含む、請求項150記載のポリペプチド。
細胞外スペーサーがCH1領域、CH2領域、および/もしくはCH3領域を含むか、またはさらに含む、請求項145～152のいずれか一項記載のポリペプチド。
前記スペーサーがIgG4ヒンジポリペプチド、CH2領域、およびCH3領域を含むか、またはIgG4ヒンジポリペプチド、CH2領域、およびCH3領域からなる、請求項152記載のポリペプチド。
CH2領域がL235E置換および/またはN297Q置換を含む、請求項152または153記載のポリペプチド。
前記スペーサーが、SEQ ID NO:36と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む、請求項154のいずれか一項記載のポリペプチド。
膜貫通ドメインがT細胞受容体のα鎖もしくはβ鎖、CD28、CD3ε（イプシロン）、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD123、CD134、CD137、またはCD154の膜貫通ドメインである、請求項125～155のいずれか一項記載のポリペプチド。
膜貫通ドメインがCD28膜貫通ドメインである、請求項156記載のポリペプチド。
膜貫通ドメインが、SEQ ID NO:37と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む、請求項157記載のポリペプチド。
一次細胞内シグナル伝達ドメインがCD3ζである、請求項125～158のいずれか一項記載のポリペプチド。
一次細胞内シグナル伝達ドメインが、SEQ ID NO:39と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む、請求項159記載のポリペプチド。
細胞質領域が、1つまたは複数の共刺激ドメインをさらに含む、請求項125～160のいずれか一項記載のポリペプチド。
細胞質領域が、2つの共刺激ドメインを含む、請求項125～161のいずれか一項記載のポリペプチド。
1つまたは複数の共刺激ドメインが、4-1BB（CD137）、CD28、IL-15Rα、OX40、CD2、CD27、CDS、ICAM-1、LFA-1（CD11a/CD18）、および/またはICOS（CD278）のうちの1つまたは複数に由来する共刺激ドメインを含む、請求項161または162記載のポリペプチド。
1つまたは複数の共刺激ドメインがCD28由来の共刺激ドメインを含む、請求項161～163のいずれか一項記載のポリペプチド。
共刺激ドメインが、SEQ ID NO:38と少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドまたはその断片を含む、請求項164記載のポリペプチド。
scFvが抗CD20 scFvを含む、請求項125～165のいずれか一項記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含み；ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:29、30、31、22、12、13、および14と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:26、27、28、18、9、10、および11と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項166記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含み；ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:5の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:6の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項166記載のポリペプチド。
scFvが、それぞれ、SEQ ID NO:24、13、および25のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:9、10、および23のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項166記載のポリペプチド。
scFvが、SEQ ID NO:3の可変領域のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL、ならびにSEQ ID NO:4の可変領域のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項166記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、LFR1、LCDR1、LFR2、LCDR2、LFR3、LCDR3、およびLFR4を含む軽鎖可変領域；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、HFR1、HCDR1、HFR2、HCDR2、HFR3、HCDR3、およびHFR4を含む重鎖可変領域
を含み；ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:19、20、21、22、24、13、および25と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:15、16、17、18、9、10、および23と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項166記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含み；ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:7の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:8の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項166記載のポリペプチド。
scFvが、それぞれ、SEQ ID NO:12、13、および14のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:9、10、および11のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項166記載のポリペプチド。
scFvが、SEQ ID NO:1の可変領域のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL、ならびにSEQ ID NO:2の可変領域のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項166記載のポリペプチド。
scFvが抗GD2 scFvを含む、請求項125～165のいずれか一項記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含み；ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:136、137、138、139、113、114、および115と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:132、133、134、135、110、111、および112と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項175記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含み；ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:141の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:140の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項175記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含み；ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:120、121、122、123、129、130、および131と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:116、117、118、119、126、127、および128と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項175記載のポリペプチド。
scFvが、
軽鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、軽鎖フレームワーク領域1（LFR1）、軽鎖相補性決定領域1（LCDR1）、軽鎖フレームワーク領域2（LFR2）、軽鎖相補性決定領域2（LCDR2）、軽鎖フレームワーク領域3（LFR3）、軽鎖相補性決定領域3（LCDR3）、および軽鎖フレームワーク領域4（LFR4）を含む軽鎖可変領域（VL）；ならびに
重鎖可変領域のアミノ近位末端からカルボキシ近位末端へ順に、重鎖フレームワーク領域1（HFR1）、重鎖相補性決定領域1（HCDR1）、重鎖フレームワーク領域2（HFR2）、重鎖相補性決定領域2（HCDR2）、重鎖フレームワーク領域3（HFR3）、重鎖相補性決定領域3（HCDR3）、および重鎖フレームワーク領域4（HFR4）を含む重鎖可変領域（VH）
を含み；ここで、LFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:144の可変領域のLFR1、LFR2、LFR3、LFR4、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み；HFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3が、それぞれ、SEQ ID NO:143の可変領域のHFR1、HFR2、HFR3、HFR4、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3と少なくとも90％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項175記載のポリペプチド。
scFvが、それぞれ、SEQ ID NO:129、130、および131のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:126、127、および128のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項175記載のポリペプチド。
scFvが、SEQ ID NO:125の可変領域のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL、ならびにSEQ ID NO:124の可変領域のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項107記載のポリペプチド。
scFvが、それぞれ、SEQ ID NO:113、114、および115のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL；ならびに、それぞれ、SEQ ID NO:110、111、および112のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項175記載のポリペプチド。
scFvが、SEQ ID NO:109の可変領域のLCDR1、LCDR2、およびLCDR3を含むVL、ならびにSEQ ID NO:108の可変領域のHCDR1、HCDR2、およびHCDR3を含むVHを含む、請求項175記載のポリペプチド。
請求項1～183のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする配列を含む核酸。
発現構築物である、請求項184記載の核酸。
発現構築物がウイルスベクターである、請求項185記載の核酸。
ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、レトロウイルス由来のベクターを含む、請求項186記載の核酸。
ウイルスベクターがレンチウイルスベクターまたはレンチウイルス由来のベクターである、請求項187記載の核酸。
請求項1～183のいずれか一項記載のポリペプチドをコードする配列を含むレンチウイルスベクター。
請求項184～189のいずれか一項記載の核酸を含む細胞。
ウイルスベクターが細胞のゲノムに組み込まれている、請求項190記載の核酸を含む細胞。
請求項1～183のいずれか一項記載のポリペプチドを発現する細胞。
T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT）、インバリアントナチュラルキラーT細胞（iNKT）、幹細胞、リンパ球前駆細胞、末梢血単核細胞（PBMC）、骨髄細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞もしくは造血前駆細胞（HSPC）、臍帯血細胞、または誘導多能性幹細胞（iPS細胞）である、請求項190～192のいずれか一項記載の細胞。
T細胞またはNK細胞である、請求項193記載の細胞。
T細胞がナイーブメモリーT細胞を含む、請求項194記載の細胞。
ナイーブメモリーT細胞がCD4+ T細胞またはCD8+ T細胞を含む、請求項195記載の細胞。
請求項190～196記載の細胞のいずれかを含む細胞集団。
10³～10⁸個の細胞を含む、請求項197記載の細胞集団。
請求項1～183のいずれか一項記載のポリペプチド、請求項184～189のいずれか一項記載の核酸、請求項190～196のいずれか一項記載の細胞、または請求項197もしくは198記載の細胞集団を含む、組成物。
請求項184～189のいずれか一項記載の核酸を細胞へ導入する工程を含む、ポリペプチドを発現する細胞を作製する方法。
CARの膜貫通ドメインと細胞質ドメインとの間にねじれリンカーを導入する工程を含む、CARを作製する方法であって、該ねじれリンカーが、1～12個のアラニン残基を含む、前記方法。
第1の抗原結合領域または抗体に由来するCDRを第2の抗原結合領域または抗体に由来するFRと組み合わせる工程を含む、ハイブリッドscFvと膜貫通ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域とを有するCARを作製する方法であって、第1および第2の抗原結合領域または抗体が、同じ抗原に結合する、前記方法。
FRおよびCDRが、同じ種に由来する抗原結合領域または抗体に由来する、請求項202記載の方法。
FRおよびCDRが、ヒトの抗原結合領域または抗体に由来する、請求項202または203記載の方法。
FRおよびCDRが、異なるトニックシグナル伝達強度を有する抗原結合領域または抗体に由来する、請求項202～204のいずれか一項記載の方法。
FRが、CDRが由来する抗原結合領域または抗体より高いトニックシグナル伝達強度を有する抗原結合領域または抗体に由来する、請求項205記載の方法。
CDRが、FRが由来する抗原結合領域または抗体より高いトニックシグナル伝達強度を有する抗原結合領域または抗体に由来する、請求項205記載の方法。
ポリペプチドが、非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍死滅活性を有し、ここで、該非ハイブリッドscFvが、ハイブリッドscFvのFRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来し、かつ/または該ポリペプチドが、非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍死滅活性を有し、ここで、該非ハイブリッドscFvが、ハイブリッドscFvのCDRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来する、請求項202～207のいずれか一項記載の方法。
ポリペプチドが、非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍細胞クリアランス活性を有し、ここで、該非ハイブリッドscFvが、ハイブリッドscFvのFRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来し、かつ/または該ポリペプチドが、非ハイブリッドscFvを含むCARと比較して増加した腫瘍死滅活性を有し、ここで、該非ハイブリッドscFvが、ハイブリッドscFvのCDRと同じ抗原結合領域もしくは抗体に由来する、請求項202～208のいずれか一項記載の方法。
前記ポリペプチドをコードするウイルスを細胞に感染させる、請求項200～209のいずれか一項記載の方法。
ウイルスが、レンチウイルス、またはレンチウイルス由来のウイルスもしくはベクターを含む、請求項210記載の方法。
細胞が、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラーT細胞（NKT）、インバリアントナチュラルキラーT細胞（iNKT）、幹細胞、リンパ球前駆細胞、末梢血単核細胞（PBMC）、骨髄細胞、胎児肝細胞、胚性幹細胞、臍帯血細胞、誘導多能性幹細胞（iPS細胞）である、請求項200～211のいずれか一項記載の方法。
細胞がT細胞またはNK細胞である、請求項212記載の方法。
T細胞がナイーブメモリーT細胞を含む、請求項213記載の方法。
ナイーブメモリーT細胞がCD4+ T細胞またはCD8+ T細胞を含む、請求項214記載の方法。
細胞が未だT細胞またはNK細胞ではなく、前記方法が、該細胞のT細胞またはNK細胞への分化を促進する条件下で該細胞を培養する工程をさらに含む、請求項213～215のいずれか一項記載の方法。
核酸の細胞への導入の前およびまたは後に、該細胞を増大させる条件下で該細胞を培養する工程をさらに含む、請求項200～216のいずれか一項記載の方法。
細胞が無血清培地によって培養される、請求項217記載の方法。
請求項200または203～218のいずれか一項記載の方法によって作製された細胞。
請求項201～218のいずれか一項記載の方法によって作製されたCAR。
第1の抗原結合領域または抗体に由来するCDRを第2の抗原結合領域または抗体に由来するFRと組み合わせることを含む、ハイブリッドscFvと膜貫通ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞質領域とを有するCARを提供する工程であって、第1および第2の抗原結合領域または抗体が、同じ抗原に結合する、工程；ならびに
該CARの機能を評価する工程
を含む、CARをスクリーニングする方法。
CARの機能を評価する工程が、該CARのトニックシグナル伝達強度の評価を含む、請求項221記載の方法。
トニックシグナル伝達強度の評価が、CDV希釈アッセイおよび/または活性化マーカーについての抗体染色による発現評価を含む、請求項222記載の方法。
CARの機能を評価する工程が、腫瘍死滅効力、腫瘍クリアランス効力、インビボ生存率、インビボ腫瘍クリアランス、インビボ腫瘍量低下のうちの1つまたは複数の決定を含む、請求項221～223のいずれか一項記載の方法。
前記方法が、第1の抗原結合領域もしくは抗体に由来するCDRを第2の抗原結合領域もしくは抗体に由来するFRと組み合わせることを含む、ハイブリッドscFvを含むCARを作製する工程を含むか、またはさらに含み、第1および第2の抗原結合領域または抗体が、同じ抗原に結合する、請求項221～224のいずれか一項記載の方法。
有効量の請求項199記載の組成物を患者に投与する工程を含む、がんを有する患者を処置する方法。
がんを有する患者におけるがんを処置するためのものである、請求項226記載の方法。
付加的な治療法を患者に施す工程をさらに含む、請求項226または227記載の方法。
付加的な治療法が免疫療法を含む、請求項228記載の方法。
がんがリンパ腫または神経芽細胞腫を含む、請求項226～229のいずれか一項記載の方法。