ES2869972T3

ES2869972T3 - Sistemas de receptores de antígenos quiméricos dirigidos por mAb para clasificar/agotar células inmunitarias genomanipuladas

Info

Publication number: ES2869972T3
Application number: ES16703448T
Authority: ES
Inventors: Barbra Johnson Sasu; Arvind Rajpal; Philippe Duchateau; Alexandre Juillerat; Julien Valton
Original assignee: Cellectis SA; Allogene Therapeutics Inc
Current assignee: Cellectis SA; Allogene Therapeutics Inc
Priority date: 2015-01-26
Filing date: 2016-01-25
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2036-01-25
Also published as: EP3250604A1; BR112017015453A2; IL252937A0; CN113968914A; CA2973642A1; EP3250606B1; AU2016212162A1; CA2973525C; JP2018504459A; CA2973525A1; MX389057B; CN107531801A; KR20170134331A; WO2016120220A1; WO2016120219A1; BR112017013981A2; US11014989B2; CA2973529A1; US20240228636A1; IL252937B

Abstract

Un polipéptido que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), que comprende al menos un dominio de unión extracelular que comprende un scFv formado por al menos una cadena VH y una cadena VL específica de un antígeno, en donde dicho dominio de unión extracelular comprende al menos un epítopo específico de mAb insertado que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35.

Description

DESCRIPCIÓN

Sistemas de receptores de antígenos quiméricos dirigidos por mAb para clasificar/agotar células inmunitarias genomanipuladas

Campo de la invención

La presente invención se refiere a receptores de antígenos quiméricos (CAR, por sus siglas en inglés) mejorados para su uso en inmunoterapia, cuyos dominios de unión extracelular (scFv) se han modificado mediante la inserción de un epítopo específico de mAb que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35 para permitir el agotamiento de las células inmunitarias dotadas de dichos CAR. La presente invención también se refiere a células inmunitarias que expresan dichos CAR y su uso terapéutico.

Antecedentes

La inmunoterapia adoptiva, que implica la transferencia de linfocitos T específicos de antígeno autólogos generados ex vivo, es una estrategia prometedora para tratar infecciones víricas y cáncer. Los linfocitos T usados para inmunoterapia adoptiva pueden generarse mediante expansión de linfocitos T específicos de antígeno o redirección de linfocitos T mediante genomanipulación (Park, Rosenberg et al. 2011). La transferencia de linfocitos T específicos de antígeno vírico es un procedimiento bien establecido usado para el tratamiento de infecciones víricas asociadas con trasplante y tumores malignos relacionados con virus poco habituales. De forma similar, se ha mostrado que el aislamiento y transferencia de linfocitos T específicos de tumor tienen éxito en el tratamiento del melanoma.

Se han generado con éxito especificidades novedosas en linfocitos T mediante la transferencia genética de receptores de linfocitos T transgénicos o receptores de antígenos quiméricos (CAR) (Jena, Dotti et al. 2010). Los CAR son receptores sintéticos que consisten en un resto de direccionamiento que está asociado con uno o más dominios de señalización en una única molécula de fusión. En general, el resto de unión de un CAR consiste en un dominio de unión a antígeno de un anticuerpo monocatenario (scFv), que comprende los fragmentos variables ligeros y pesados de un anticuerpo monoclonal unido por un enlazador flexible. También se han usado con éxito restos de unión basados en dominios de receptores o ligandos. Los dominios de señalización para CAR de primera generación proceden de la región citoplásmica de CD3zeta o las cadenas gamma de receptores Fc. Se ha mostrado que los CAR de primera generación redirigen con éxito la citotoxicidad de linfocitos T, sin embargo, no lograron proporcionar una expansión prolongada y actividad antitumoral in vivo. Los dominios de señalización de moléculas coestimuladoras que incluyen CD28, OX-40 (CD134), ICOS y 4-1BB (CD137) se han añadido solos (segunda generación) o en combinación (tercera generación) para mejorar la supervivencia y aumentar la proliferación de linfocitos T modificados con CAR. Los CAR han permitido con éxito que los linfocitos T se redirijan hacia antígenos expresados en la superficie de células tumorales de diversos tumores malignos, incluyendo linfomas y tumores sólidos (Jena, Dotti et al. 2010).

Sin embargo, a pesar de su eficacia sin precedentes para la erradicación de tumores in vivo, los linfocitos T con CAR T pueden promover eventos adversos agudos después de transferirse a pacientes. Entre los eventos adversos bien documentados se encuentra la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), la actividad inespecífica del tumor específica o la capacidad linfoproliferativa aberrante debido a la mutagénesis de inserción derivada del vector. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar sistemas de agotamiento específicos de células para evitar que tales eventos perjudiciales se produzcan in vivo.

Hay muchas investigaciones en curso para desarrollar una inmunoterapia basada en CAR más segura, como sobre las señales inhibidoras denominadas puntos de control inmunológico (tales como CTLA-4 o PD-1) que son cruciales para el mantenimiento de la autotolerancia y también para limitar el daño tisular colateral inmunomediado (Dolan et al., 2014). Recientemente, se diseñaron receptores de antígenos quiméricos inhibidores (iCAR, por sus siglas en inglés) con el objetivo de frenar la función de los linfocitos T al encontrarse con células inespecíficas (Federov et al.

2013). Se describe otro sistema en Budde et al. (2013) en el que un receptor de antígeno quimérico CD20 se combina con un interruptor suicida de caspasa 9 inducible (iC9). En la solicitud US 2014/0286987, el último gen se vuelve funcional en presencia del profármaco AP1903 (tacrolimus) mediante la unión a la proteína de unión a FK506 mutada (FKBP1). Está en curso un ensayo clínico patrocinado por la empresa Bellicum en el que la tecnología de caspasa anterior (CaspaCIDe™) está diseñada en linfocitos T con CAR de tercera generación dirigidos a GD2. Se describe un sistema de inducción de apoptosis similar basado en un agente de multimerización en la solicitud WO 2014/152177.

Philip et al. (2014) describen el sistema RQR8 que se está utilizando como marcador compacto/gen suicida que permite la selección de linfocitos transducidos. RQR8 se obtiene a partir de la combinación de epítopos diana tanto de antígenos CD34 como CD20. Esta construcción permite la selección con el sistema CD34 CliniMACS clínicamente aprobado (Miltenyi). Además, esta construcción RQR8 se une al anticuerpo farmacéutico rituximab ampliamente utilizado, lo que da como resultado una deleción selectiva de las células que expresan el transgén. Dentro de este sistema, RQR8 se coexpresa con un CAR en un vector retrovírico utilizando el péptido 2A de la fiebre aftosa, dando como resultado así la expresión de 2 transgenes independientes (RQR8 y CAR) en la superficie de los linfocitos T. Este sistema presenta algunas limitaciones desde la perspectiva industrial, en primer lugar, requiere la clonación de grandes insertos retrovíricos, y en segundo lugar, asegura que las células transformadas expresen tanto polipéptidos RQR8 como CAR, para eliminar posibles "falsos positivos", es decir, linfocitos T que no expresarían ninguno de los polipéptidos, en particular el gen suicida RQR8 que permite el agotamiento de las células inmunitarias genomanipuladas en caso de efectos no deseados.

El concepto de agotamiento de los linfocitos T en el contexto de la enfermedad autoinmunitaria y el trasplante se ha practicado con éxito en la clínica durante décadas. Para agotar la inmunidad mediada por células, incluyendo los linfocitos T, se utilizan ampliamente fármacos inmunosupresores tales como glucocorticoides o citostáticos tales como agentes alquilantes (ciclofosfamida, nitrosoureas, compuestos de platino, etc.) o antimetabolitos (metotrexato, azatioprina, fluorouracilo, etc.). Sin embargo, a pesar de su eficacia inmunosupresora, estos fármacos no son discriminatorios ya que afectan a la proliferación de todos los linfocitos T y B. A veces, los anticuerpos se utilizan como una terapia inmunosupresora rápida y potente para prevenir las reacciones de rechazo agudo, así como un tratamiento dirigido de trastornos linfoproliferativos o autoinmunitarios, en particular monoclonales anti-CD20. La eliminación in vivo de subconjuntos de linfocitos T se realizó por Benjamin y Waldmann (1986) para determinar la función de los linfocitos T CD4+ en la generación de respuestas de anticuerpos a proteínas solubles, y por Cobbold et al. (1986) para determinar la función de los linfocitos T CD4+ y CD8+ en el rechazo de médula ósea y aloinjertos tisulares. El agotamiento in vivo se ha realizado ampliamente para estudiar diversos temas, incluido el control de las respuestas de linfocitos T citotóxicos (CTL, por sus siglas en inglés) antivirales (Buller et al., 1987). Sin embargo, los anticuerpos que se han utilizado hasta ahora en linfocitos T dirigen los antígenos (CD3, CD4, CD52) que están todos ampliamente presentes en linfocitos T en reposo o activados, así como en otros tipos de células. Así pues, el uso de dichos anticuerpos no permitiría la eliminación selectiva de las células inmunitarias genomanipuladas dotadas de CAR.

Cartellieri et al. (2014) divulgan un método para la expansión in vitro selectiva de linfocitos T genomanipulados.

Como se presenta a continuación, los inventores han buscado un sistema "todo en uno" que permita una clasificación in vitro optimizada de células inmunitarias que expresan CAR reduciendo el "falso positivo", permitiendo mientras tanto el agotamiento in vivo de las células inmunitarias que expresan dichos CAR en caso de evento clínico adverso.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a receptores de antígenos quiméricos (CAR), cuyo dominio de unión extracelular (scFv) se modifica de tal manera que permita el agotamiento celular (véase la figura 2 para una realización ilustrativa). Esta estructura denominada sistema de depleción dirigido por mAb consiste en insertar al menos un epítopo específico de mAb que tenga la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35 dentro del scFv; teniendo este epítopo una especificidad a reconocer por un anticuerpo específico (preferentemente mAb). Dado el hecho de que principalmente el dominio de unión a ligando externo del c Ar se modifica para incluir el epítopo, se pueden prever diferentes arquitecturas CAR: monocatenario o multicatenario. El scFv quimérico de la invención, que está formado por los polipéptidos VH y VL y el epítopo o epítopos específicos puede tener en sí mismo estructuras diferentes dependiendo de la posición de inserción del epítopo y el uso de enlazadores.

Para mejorar aún más la citotoxicidad de las células inmunitarias genomanipuladas, el anticuerpo específico de epítopo puede conjugarse con un fármaco citotóxico. También es posible promover la citotoxicidad CDC mediante el uso de anticuerpos genomanipulados en los que se injertan uno o más componentes del sistema del complemento.

Por último, la invención abarca usos terapéuticos en los que la activación de las células inmunitarias genomanipuladas dotadas de CAR se modula agotando las células mediante el uso de un anticuerpo que dirige el dominio de unión a ligando externo de dichos CAR.

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de las figuras y la tabla

Figura 1: Estructura esquemática del sistema de clasificación/agotamiento dirigido por mAb de la invención que usa aquí un armazón de CAR monocatenario; se presentan varias configuraciones para el scFv quimérico con diferentes posiciones de las cadenas VH, VL y el epítopo específico de mAb.

Figura 2: Representación esquemática del funcionamiento de la clasificación y el agotamiento celular mediante el uso del sistema dirigido por mAb de la invención. La adición de mAb específico (+/- complemento) permite la purificación de linfocitos T CAR+ reconociendo su epítopo dentro del scFv quimérico. Durante la etapa de agotamiento celular, el mismo mAb específico (+/- complemento) al unirse a su epítopo específico dentro del scFv quimérico provoca una lisis específica de los linfocitos T CAR+.

Figura 3: Representación esquemática del agotamiento celular utilizando un anticuerpo biespecífico. Al unirse tanto a la célula inmunitaria que expresa CAR como a una célula efectora, este sistema permite el reclutamiento de células efectoras en la superficie de la célula inmunitaria que expresa CAR y desencadena su agotamiento específico in vivo.

Figura 4: Arquitectura de CAR para 10 CAR que expresan scFv anti-CD123 con uno o más mimótopos CD20 usados en los Ejemplos 1-2. Se diseña una serie de 10 scFv quiméricos en los que se insertan una o dos copias de los mimótopos CD20 (recuadro de color negro denominado "mimótopo") entre el scFv anti-CD123 y la bisagra.

Como se representa en la figura 4, los 10 CAR tienen la misma bisagra (bisagra CD8), dominio transmembrana (CD8 TM), dominio coestimulador (4-1BB) y dominio estimulador (ITAM CD3 zeta). SEQ ID NO 1-10 comprende la secuencia líder MALPVTALLLPLALLLHAARP, que está presente cuando el CAR se expresa inicialmente pero que no forma parte del CAR expresado en la superficie de la célula. Dependiendo de la posición del uno o más mimótopos a la vista del scFv, se diseñan 3 series de CAR (Anti-CD123 No 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 correspondientes a las SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10, respectivamente):

- primera serie: SEQ ID NO 1-2 y SEQ ID NO 3-4 corresponden a las conformaciones en las que se insertan respectivamente uno y dos mimótopos CD20 entre el scFv anti-CD123 y la bisagra; en el SEQ ID NO 2, un enlazador GS une el mimótopo CD20 a la bisagra. En el SEQ ID NO 3-4, un enlazador GS espacia entre sí los dos mimótopos y en el SEQ ID NO 4 tiene un enlazador GS adicional entre los mimótopos y la bisagra.

- segunda serie: Las SEQ ID NO 5-6 corresponden a las conformaciones en las que se inserta una copia del mimótopo CD20 dentro del scFv anti-CD123; las diferencias de secuencia provienen de la presencia, respectivamente, de un enlazador GS corto (SEQ ID NO 5) y un enlazador GS largo (SEQ ID NO 6) que se encuentran en ambos lados.

- tercera serie: Las SEQ ID NO 7 a 10 corresponden a las conformaciones en las que el scFv anti-CD123 está localizado entre el uno o más mimótopos de CD y la bisagra. En las SEQ ID NO. 7-8 y las SEQ ID NO. 9-10 respectivamente, se insertan una copia y dos copias del mimótopo CD20. Se inserta un enlazador GS entre los 2 mimótopos CD20, y para el SEQ ID n O.10, un enlazador GS complementario une los mimótopos al scFv anti-CD123.

La figura 5 muestra la actividad citolítica de los linfocitos T que expresan el CAR anti-CD123 de SEQ ID NO 1-4 o 142 o un linfocito T de control que no expresa ningún CAR anti-CD123 (etapa de transfección de linfocitos T simulados sin ARNm). La actividad citolítica se expresa como la frecuencia de lisis celular específica como se detalla en el Ejemplo 1.

La figura 6 muestra el resultado de un ensayo de CDC en el que los linfocitos T que expresan el CAR anti-CD123 de SEQ ID NO 1-4 o un linfocito T de control que no expresa ningún CAR anti-CD123 (linfocitos T simulados (etapa de transfección sin ARNm)) se incuban con Rituximab (RTX) y complemento de cría de conejo BRC, por sus siglas en inglés). Los resultados se expresan como frecuencia relativa de células viables entre linfocitos T positivos para CAR anti-CD123 (con respecto al experimento de control) como se detalla en el Ejemplo 3.

Las figuras 7A, 7B y 7C divulgan la estructura general de los CAR de SEQ ID NO 125 a 141 que se han diseñado y ensayado en los Ejemplos 4 a 6. Se usó un ScFV anti-BCMA en todos estos CAR. Se incluyeron uno, dos, tres o cuatro epítopos seleccionados de un mimótopo CD20 (recuadro de color negro denominado "mimótopo") y/o un epítopo CD34 (recuadro de color gris denominado "CD34") en diferentes posiciones, es decir, cadena arriba del ScFv, cadena abajo del ScFv o entre las cadenas variables de ScFv (señaladas como V1 y V2). Como se representa en la figura 7, todos los CAR tienen la misma bisagra (bisagra CD8), dominio transmembrana (CD8 t M), dominio coestimulador (4-1BB) y dominio estimulador (ITAM CD3 zeta).

Las figuras 8A y 8B muestran el resultado de un ensayo de CDC en el que se incuban linfocitos T que expresan CAR anti-BCMA de SEQ ID NO 125 o 130 a 141 con RTX y BRC. Los resultados se expresan como frecuencia relativa de células viables entre linfocitos T positivos para CAR anti-BCMA (con respecto al experimento de control) como se detalla en el Ejemplo 4.

La figura 9 muestra la actividad citolítica de los linfocitos T que expresan el CAR anti-BCMA de SEQ ID NO 125 o 130 a 139 o un linfocito T de control que no expresa ningún CAR anti-BCMA (linfocito T). La actividad citolítica se expresa como la frecuencia de células H929 viables como se detalla en el Ejemplo 4.

La figura 10A muestra la frecuencia de linfocitos T que expresan CAR de SEQ ID NO 128 que comprenden un epítopo CD34 y dos mimótopos CD20 antes o después de la purificación con un kit CD34 MicroBead o en la fracción de flujo continuo.

La figura 10B muestra el número de linfocitos T que expresan CAR de SEQ ID NO 128 que comprenden un epítopo CD34 antes o después de la purificación con un kit CD34 MicroBead o en la fracción de flujo continuo.

La figura 11 muestra la concentración de INF gamma producida por linfocitos T que expresan CAR anti-BCMA de SEQ ID NO 125 o 130 a 139 en presencia de RTX, fitohemaglutinina (PHA) o en ausencia tanto de RTX como de PHA.

La figura 12 muestra la frecuencia de linfocitos T positivos para CAR como resultado de la detección de un linfocito T que expresa CAR de SEQ ID NO 125 o 130 a 139 usando una proteína de fusión BCMA-Fc y un anticuerpo anti-Fc marcado o RTX y un anticuerpo anti-Fc marcado.

La figura 13 muestra la frecuencia de linfocitos T positivos para CAR resultantes de la detección de un linfocito T que expresa CAR de SEQ ID NO 128 usando RTX y un anticuerpo anti-Fc marcado o QBEND-10 marcado. Las figuras 14A y 14B muestran la detección de linfocitos T que expresan BCMA CAR de SEQ ID NO 145 (BC30, tipo silvestre), 146 (LM), 147 (LML), 148 (LMLM y -149 (LMLML) que contienen mimótopos CD20 por citometría de flujo. Los linfocitos T con CAR se detectan mediante citometría de flujo utilizando proteína BCMA biotinilada soluble seguida de estreptavidina conjugada con PE (sBCMA biotina (PE) o el anticuerpo anti-CD20 rituximab seguido de anti-IgG humana conjugado con FITC (Rituximab (FITC)).

La figura 15 muestra la detección de linfocitos T no transducidos, transducidos con un lentivirus para la coexpresión de un CAR anti-BCMA de SEQ ID NO 145 y RQR8 (SEQ ID NO 150) (BC30-RQR8) o CAR BCMA de SEQ ID NO 149 que contienen mimótopos CD20 por citometría de flujo. Los linfocitos T CAR- se detectan mediante citometría de flujo utilizando proteína BCMA biotinilada soluble seguida de estreptavidina conjugada con PE (sBCMA biotina (PE)) o el anticuerpo anti-CD20 rituximab seguido de anti-IgG humana conjugado con FITC (Rituximab (FITC)). La figura 16 muestra el resultado de un ensayo de CDC donde los linfocitos T que expresan CAR anti-BCMA de SEQ ID NO 149 (BC30-R2), CAR anti BCMA de SEQ ID NO 145 o que coexpresan un CAR anti BCMA de SEQ ID NO 145 y RQR8 (SEQ ID NO 150) (BC30-RQR8) se incuban con RTX y BRC. El porcentaje de citotoxicidad se determina mediante análisis de citometría de flujo utilizando proteína BCMA biotinilada. Los resultados se expresan como la frecuencia de lisis celular entre linfocitos T positivos para CAR anti-BCMA con respecto al control (células incubadas con BRC solamente).

La figura 17 muestra la actividad citolítica de linfocitos T que expresan CAR anti-BCMA de SEQ ID NO 149 (BC30-R2) o que coexpresan un CAR anti BCMA de SEQ ID NO 145 (BC30) y RQR8 (SEQ ID NO 150) (BC30-RQR8) en presencia/ausencia de RTX. La actividad citolítica se expresa como el porcentaje de lisis celular calculado como se divulga en el ejemplo 7.5 y se determina a una relación diferente de efector (linfocito T con CAR): diana (células MM1S que expresan BCMA).

La figura 18 muestra el porcentaje de linfocitos T activados que expresan CAR anti-BCMA de SEQ ID NO 149 en presencia de PBS (control), anticuerpo anti-CD3 OKT3 (aCD3) o Rituximab (RTX). La activación de los linfocitos T se evalúa midiendo la expresión de los marcadores de activación CD25 y CD69 usando citometría de flujo.

Tabla 1: Listado de mAb farmacéuticamente aprobados con sus dianas antigénicas. Se proporcionan las secuencias de estos últimos, así como el epítopo o epítopos para algunos de ellos.

Tabla 2: Listado de varios mimótopos y epítopos correspondientes a su mAb que se presentan en el Ejemplo 2. Tabla 3: Listado de las cadenas VH y VL de scFv dirigidas a los antígenos CD19, CD33, 5T4, ROR1, e Gf Rv III, BCMA, CS1 y CD123.

Tabla 4: Secuencia de ejemplo de componentes CAR

Descripción detallada de la invención

La invención se refiere a un polipéptido que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR) que comprende al menos un dominio de unión extracelular que comprende un scFv formado por al menos una cadena VH y una cadena VL específica de un antígeno, preferentemente un antígeno marcador de la superficie celular, en el que dicho dominio de unión extracelular comprende al menos un epítopo específico de mAb insertado que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35.

En algunas realizaciones, la invención se refiere a un CAR que comprende

- un dominio extracelular que comprende

- al menos un, preferentemente uno, dominio de unión extracelular que comprende un scFv formado por al menos una cadena VH y una cadena VL específica de un antígeno, preferentemente un antígeno marcador de la superficie celular, en el que dicho dominio de unión extracelular comprende al menos un epítopo específico de mAb insertado que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35,

- una bisagra,

- un dominio transmembrana, y

- un dominio intracelular.

En unas realizaciones, el CAR de la invención comprende un dominio de unión extracelular.

Por "scFv quimérico" se entiende un polipéptido correspondiente a un fragmento variable monocatenario compuesto por las cadenas pesada y ligera (Vh y Vl, respectivamente) y de un epítopo, que no se incluía originalmente en dichas cadenas Vh y Vl. El último epítopo se denomina "epítopo específico de mAb" cuando tiene la capacidad de unirse específicamente a un anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal. En algunas realizaciones, el epítopo específico de mAb no es un epítopo reconocido por el ScFv. En algunas realizaciones, el epítopo específico de mAb no se obtiene del dominio extracelular del CAR. Los componentes de este scFv quimérico (es decir, los fragmentos variables ligeros y pesados del dominio de unión a ligando y el epítopo específico de mAb) pueden unirse por al menos un enlazador, normalmente un enlazador flexible. Estos componentes se unen generalmente al dominio transmembrana del CAR mediante una bisagra.

Conformaciones quiméricas de scFv

La estructura del scFv quimérico de la invención puede ser diversa como se presenta en la figura 1 dependiendo de la posición de sus componentes principales (Vh y Vl y epítopo específico de mAb).

El scFv quimérico de la invención puede tener varias conformaciones, al menos 9 cuando se considera el número de posibles permutaciones de un Vh, un Vl y un epítopo.

Preferentemente, cada componente (VH, VL y epítopo) está interconectado con su vecino o vecinos por al menos un enlazador flexible tal como se ha presentado previamente. Las combinaciones adecuadas de acuerdo con la invención son las que proporcionan una buena afinidad/especificidad en ambas uniones: entre el epítopo específico de mAb y el mAb infundido, y entre las cadenas VH y VL del scFv quimérico y el antígeno del ligando diana celular.

De acuerdo con una realización, el dominio de unión extracelular del CAR comprende al menos dos enlazadores, ambos uniendo el epítopo a las cadenas VH y VL; y una bisagra que une el epítopo scFv al dominio transmembrana del CAR. Por ejemplo, si la conformación CAR proyectada es tal que el epítopo específico de mAb está ubicado al lado de las cadenas VH y VL, se realiza un cribado cuando se expresa el c Ar y se ensaya la citotoxicidad y/o el agotamiento de mAb.

Cuando se busca que el epítopo específico de mAb esté ubicado entre las cadenas VH y VL, se puede realizar un cribado mediante presentación de fagos antes del ensayo y/o la expresión transitoria de la construcción CAR. Esto puede obtenerse mediante transfección de ARNm, que es suficiente para una prueba de citotoxicidad primaria y/o depleción de mAb.

En algunas realizaciones, el dominio de unión extracelular comprende la siguiente secuencia (el extremo N se encuentra en el lado izquierdo):

V1-L1-V2-(L)x-Epítopo1-(L)x; V1-L1-V2-(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x;

V1-L1-V2-(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x; (L)x-Epítopo1-(L)x-V1-Lr V2;

(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V1-L1-V2;

Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-V1-L1-V2; (L)x-Epítopo1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x; (L)x-Epítopo1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x; (L)x-Epítopo1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-Epítopo4-(L)x; (L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo3-(L)x;

(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo3-(L)x-Epítopo4-(L)x; Vr (L)x-Epítopo1-(L)x-V2;

V1-(L)x-Epítopo1-(L)x-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x; V1-(L)x-Epítopo1-(L)x-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x;

V1-(L)x-Epítopo1-(L)x-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-Epítopo4-(L)x; (L)x-Epítopo1-(L)x-V1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V2; (L)x-Epítopo1-(L)x-V1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V2-(L)x-Epítopo3-(L)x; V1-Li-V2-L-Epítopo1; V1-Li-V2-L-Epítopo1-L;

V1-L1-V2-L-Epítopo1-L-Epítopo2; V1-L1-V2-L-Epítopo1-L-Epítopo2-L; V1-L1-V2-L-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3; V1-L1-V2-L-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-L;

V1-L1-V2-Epítopo1; V1-L1-V2-Epítopo1-L;

V1-L1-V2-Epítopo1-L-Epítopo2; V1-L1-V2-Epítopo1-L-Epítopo2-L; V1-L1-V2-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3;

V1-L1-V2-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-L; Epítopo1-V1-L1-V2; Epítopo1-L-V1-L1-V2; L-Epítopo1-V1-L1-V2;

L-Epítopo1-L-V1-Li-V2; Epítopo1-L-Epítopo2-V1-L1-V2; Epítopo1-L-Epítopo2-L-V1-L1-V2; L-Epítopo1-L-Epítopo2-V1-L1-V²; L-Epítopo1-L-Epítopo2-L-V1-L1-V2; Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-V1-L1-V2; Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-L-V¹-L¹-V²; L-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-V1-L1-V2; L-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-L-V1-L1-V2; V1-L-Epítopo1-L-V²; L-Epítopo1-L-V1-L-Epítopo2-L-V2; V¹-L-Epítopo¹-L-V²-L-Epítopo²-L; V1-L-Epítopo1-L-V2-L-Epítopo2-L-Epítopo3; V1-L-Epítopo1-L-V2-L-Epítopo2-Epítopo3; V1-L-Epítopo1-L-V2-L-Epítopo2-L-Epítopo3-Epítopo4; L-Epítopo1-L-VrL-Epítopo2-L-V2-L-Epítopo3-L; Epítopo1-L-V1-L-Epítopo2-L-V2-L-Epítopo3-L; L-Epítopo¹-L-V¹-L-Epítopo²-L-V²-L-Epítopo3; L-Epítopo1-L-V1-L1-V2-L-Epítopo2-L; L-Epítopo1-L-V1-L1-V2-L-Epítopo2-L-Epítopo3; L-Epítopo1-L-V1-Li-V2-L-Epítopo2-Epítopo3, or Epítopo1-L-V1-L1-V2-L-Epítopo2-L-Epítopo3-Epítopo4.

en las que,

V¹y V²son Vh y Vl de un ScFv (es decir, V¹es Vl y V²es Vh o V¹es Vh y V²es Vl);

L¹es cualquier enlazador adecuado para unir la cadena Vh a la cadena Vl en un ScFv;

L es un enlazador, que comprende preferentemente residuos de glicina y serina, y cada aparición de L en el dominio de unión extracelular puede ser idéntica o diferente a otra aparición de L en el mismo dominio de unión extracelular, y x es 0 o 1 y cada aparición de x es independiente de las demás; y

el Epítopo 1, el Epítopo 2 y el Epítopo 4 son un epítopo específico de mAb que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35; y el Epítopo 3 se selecciona de epítopos específicos de mAb que tienen la secuencia de aminoácidos de SEQ ID n O 35 o SEQ ID NO 144.

En algunas realizaciones, los dominios de unión extracelular comprenden la siguiente secuencia (el extremo N se encuentra en el lado izquierdo):

VH-L1-VL-L-Epítopo1-L-Epítopo2-L; L-Epítopo1-L-VH-L-Epítopo2-L-VL-L-Epítopo3-L; VL-L1-VH-L-Epítopo1-L-Epítopo2-L; o L-Epítopo1-L-VL-L-Epítopo2-L-VH-L-Epítopo3-L,

en las que L, L¹, el Epítopo1, el Epítopo2 y el Epítopo3 son como se han definido anteriormente.

En algunas realizaciones, L¹es un enlazador que comprende glicina y/o serina. En algunas realizaciones, L¹es un enlazador que comprende la secuencia de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)n o (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4 o 5. En algunas realizaciones, L¹es (Gly⁴Ser)⁴o (Gly⁴Ser)³.

En algunas realizaciones, L es un enlazador flexible, que comprende preferentemente glicina y/o serina. En algunas realizaciones, L tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SGG, GGS, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGG, GGGGS, SGGGGS, GGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS, GGGGGGGS, SGGGGGGG, SGGGGGGGS, o SGGGGSGGGGS, preferentemente SGG, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS o SGGGGSGGGGS. En algunas realizaciones, cuando el dominio de unión extracelular comprende varias apariciones de L, todas las L son idénticas. En algunas realizaciones, cuando el dominio de unión extracelular comprende varias apariciones de L, las L no son todas idénticas. En algunas realizaciones, L es SGGGGS. En algunas realizaciones, el dominio de unión extracelular comprende varias apariciones de L y todas las L son SGGGGS.

En algunas realizaciones, el Epítopo 3 es un epítopo específico de mAb que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35. En algunas realizaciones, el Epítopo 3 es un epítopo específico de mAb que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 144.

Epítopo específico de mAb insertado

El epítopo a insertar dentro del scFv quimérico es específico del anticuerpo monoclonal (mAb) que se usa para los procesos de clasificación celular y/o agotamiento celular.

El epítopo introducido dentro del scFv quimérico se elige como parte de una pareja de epítopo específico de mAb/mAb específico de epítopo, sobre la base de su aprobación por las Agencias Nacionales de Salud en términos de regulación/seguridad. Estas parejas se presentan en la siguiente tabla 1.

Tabla 1: Listado ^de anticuer os monoclonales a robados farmacéuticamente con sus dianas anti énicas.

continuación

continuación

Tabla 2: Ejemplos de epítopos específicos de mAb (y sus mAb correspondientes) que pueden usarse en el dominio de unión extracelular del CAR de la invención, tales como, por ejemplo, mimótopos y epítopos con sus mAb rr n i n m n l E m l 1-2

continuación

De acuerdo con la invención, el al menos un epítopo introducido dentro del scFv quimérico es el antígeno CD20 de SEQ ID NO 35 y el mAb infundido que se usa para dirigirlo con fines de clasificación y/o agotamiento es rituximab.

En algunas realizaciones, el dominio de unión extracelular del CAR de la invención comprende un epítopo específico de mAb de SEQ ID NO 35, dos epítopos específicos de mAb de SEQ ID NO 35, tres epítopos específicos de mAb de SEQ ID NO 35, un epítopo específico de mAb de SEQ ID NO 35 y un epítopo específico de mAb de SEQ ID NO 144, dos epítopos específicos de mAb de SEQ ID NO 35 y un epítopo específico de mAb de SEQ ID NO 144, tres epítopos específicos de mAb de SEQ ID NO 35 y un epítopo específico de mAb de SEQ ID NO 144.

De acuerdo con otra realización, el epítopo es un mimótopo. Como macromolécula, a menudo un péptido, que imita la estructura de un epítopo, el mimótopo tiene la ventaja de ser más pequeño que un epítopo convencional y, por lo tanto, puede ser beneficioso para una secuencia no conformacional y más fácil de reproducir en un polipéptido largo tal como un CAR. Los mimótopos son conocidos por varios mAb aprobados farmacéuticamente, tales como dos péptidos de 10 aminoácidos para cetuximab (Riemer et al., 2005), o 24 aa para palivizumab (Arbiza et al., 1992). Dado que estos mimótopos pueden identificarse mediante presentación en fagos, es posible probar varios de ellos para obtener una secuencia que no perturbe el scFv para el mismo mAb. Además, su uso puede mejorar una citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

scFv

La expresión "dominio de unión a ligando extracelular" como se usa en el presente documento se define como un oligo o polipéptido que es capaz de unirse con un ligando. Preferentemente, dicho dominio se busca por ser capaz de interactuar con una molécula de la superficie celular. Por ejemplo, el dominio de unión a ligando extracelular puede elegirse para reconocer un ligando que actúa como un marcador de superficie celular en células diana asociadas con una patología particular. Por lo tanto, los ejemplos de marcadores de la superficie celular que pueden actuar como ligandos incluyen los asociados con infecciones víricas, bacterianas y parasitarias, enfermedad autoinmunitaria y células cancerosas. En particular, el dominio de unión a ligando extracelular puede comprender un dominio de unión a antígeno procedente de un anticuerpo contra un antígeno de la diana. Como ejemplos no limitantes, el antígeno de la diana puede ser un antígeno de superficie asociado a un tumor como se ha descrito anteriormente. En algunas realizaciones, el dominio de unión extracelular es un dominio de unión a ligando extracelular como se ha definido anteriormente. De acuerdo con la presente invención, dicho dominio de unión a ligando extracelular es un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable ligero ( V^l) y pesado (V ^h ) de un anticuerpo monoclonal específico del antígeno diana y un antígeno específico del epítopo de mAb. En algunas realizaciones, el dominio de unión extracelular comprende un fragmento de anticuerpo monocatenario (scFv) que comprende el fragmento variable ligero ( V^l) y pesado ( V^h) de un anticuerpo monoclonal específico del antígeno diana de la superficie celular.

También puede usarse otro dominio de unión distinto de scFv para el direccionamiento predefinido de linfocitos, tales como fragmentos de anticuerpos de un solo dominio de camélido, ligandos de receptores como un polipéptido del factor de crecimiento endotelial vascular, un péptido de unión a integrina, heregulina o una muteína de IL-13, dominio de unión a anticuerpos, bucles hipervariables de anticuerpos o CDR como ejemplos no limitantes.

En otra realización, dicho dominio de unión extracelular puede ser una DARPin (proteína de repetición de anquirina diseñada). Las DARPin son proteínas miméticas de anticuerpos genomanipuladas que presentan normalmente una unión a proteínas diana altamente específica y de alta afinidad. Se obtienen de proteínas anquirina naturales y comprenden al menos tres, normalmente cuatro o cinco motivos de repetición de estas proteínas. Las DARPin son proteínas pequeñas de dominio único que pueden seleccionarse para unirse a cualquier proteína diana dada con alta afinidad y especificidad (Epa, Dolezal et al. 2013; Friedrich, Hanauer et al. 2013; Jost, Schilling et al. 2013). De acuerdo con la presente invención, las DARPin pueden genomanipularse para comprender múltiples sitios de reconocimiento de antígenos. Por lo tanto, dichas DARPin pueden usarse para reconocer una serie de antígenos diferentes consecutivos, así como un antígeno único. Por lo tanto, la presente invención se refiere a un método que comprende proporcionar una célula inmunitaria y expresar en la superficie de dicha célula inmunitaria un receptor de antígeno quimérico que comprende una proteína de repetición de anquirina diseñada capaz de reconocer al menos un ligando específico, preferentemente dos ligandos específicos.

Como ejemplo no limitante, el ligando de la diana o el antígeno reconocido por el dominio de unión extracelular, preferentemente por el ScFv, puede ser un antígeno de superficie asociado a tumor, tal como ErbB2 (HER2/neu), antígeno carcinoembrionario (CEA), molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), variante III de EGFR (EGFRvIII), CD19, CD20, CD30, CD40, disialogangliósido GD2, GD3, molécula 1 similar a lectina de tipo C (CLL-1), mucina ductal-epitelial, gp36, TAG-72, glucoesfingolípidos, antígeno asociado a glioma, gonadotropina coriónica humana p, alfafetoproteína (AFP), AFP sensible a lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, telomerasa transcriptasa inversa humana, RU1, RU2 (AS), carboxilo esterasa intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, prostasa, antígeno específico de prostasa (PSA), PAP, NY-e So -1, LAGA-1a, p53, prosteína, PSMA, supervivencia y telomerasa, antígeno 1 de tumor de carcinoma prostético (PCTA-1), MAGE, ELF2M, elastasa de neutrófilos, efrina B2, CD22, factor de crecimiento de insulina (IGF1)-I, IGF-II, receptor del IGFI, mesotelina, una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que presenta un epítopo peptídico específico de tumor, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2D, antígenos tumorales del estroma, el dominio extra A (EdA) y el dominio extra B (EDB) de fibronectina y el dominio A1 de tenascina C (TnC A1) y la proteína asociada a fibroblasto (fap), LRP6, proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), CD38/CS1, MART1, WT1, MUC1, LMP2, Idiotipo, NY-ESO-1, mutante Ras, gp100, proteinasa 3, bcrabl, tirosinasa, hTERT, EphA2, ML-TAP, ERG, NA17, PAX3, ALK, receptor de andrógenos; un antígeno específico de linaje o específico de tejido tal como CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD70, CD79, CD116, CD117, CD135, CD123, CD133, CD138, CTLA-4, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), endoglina, una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), BCMA (CD269, TNFRSF 17), FLT-3 o un antígeno de superficie específico de virus tal como un antígeno específico del VIH (tal como gp120 del VIH); un antígeno específico del VEB, un antígeno específico del CMV, un antígeno específico del VPH, un antígeno específico del virus Lasse, un antígeno específico del virus de la gripe, así como cualquier derivado o variante de estos marcadores de superficie. En casos específicos, el ligando que reconoce el receptor de antígeno quimérico esté presente en la superficie de una célula diana, particularmente una célula cancerosa o una célula vírica. En algunas realizaciones, el ligando que reconoce el receptor de antígeno quimérico esté presente en un microambiente tumoral. En algunos aspectos de la invención, el ligando que reconoce el receptor de antígeno quimérico es un factor de crecimiento.

En una realización preferida, dichas cadenas VH y VL tienen una secuencia diana antigénica de més del 80 % de identidad, preferentemente més del 90%, y més preferentemente més del 95% con el SEQ ID NO 43 (antígeno CD19), SEQ ID NO 44 (antígeno CD38), SEQ ID NO 45 (antígeno CD123), SEQ ID NO 46 (antígeno CS1), SEQ ID NO 47 (antígeno BCMA), SEQ ID NO 48 (antígeno FLT-3), SEQ ID NO 49 (antígeno CD33), SEQ ID NO 50 (antígeno CD70), SEQ ID NO 51 (antígeno EGFR-3v), SEQ ID NO 52 (antígeno WT1).

En una realización més preferida, dichas cadenas VH y VL tienen una secuencia diana antigénica de més del 80 % de identidad, preferentemente més del 90 %, y més preferentemente més del 95 % con o idéntica a el SEQ ID NO 53 64 (antígeno CD19), SEQ ID NO 65-76 (antígeno CD33), SEQ ID NO 77-84 (antígeno 5T4), SEQ ID NO 85-90 (antígeno ROR1), SEQ ID NO 91-94 (antígeno EGFRvIII), SEQ ID NO 95-102 (antígeno BCMA), SEQ ID NO 103-112 (antígeno CS1) y SEQ ID NO 113-124 (antígeno CD123) como sigue en la Tabla 3.

En algunas realizaciones, el antígeno reconocido por el dominio de unión extracelular, preferentemente por el ScFv se selecciona de SEQ ID NO 43 (antígeno CD19), SEQ ID NO 44 (antígeno CD38), SEQ ID NO 45 (antígeno CD123), SEQ ID NO 46 (antígeno CS1), SEQ ID NO 47 (antígeno BCMA), SEQ ID NO 48 (antígeno FLT-3), SEQ ID NO 49 (antígeno CD33), SEQ ID NO 50 (antígeno CD70), SEQ ID NO 51 (antígeno EGFR-vlll) o SEQ ID NO 52 (antígeno WT1).

En algunas realizaciones, el dominio de unión extracelular comprende:

- un VH de SEQ ID NO 65 y un VL de SEQ ID NO 66; un VH de SEQ ID NO 67 y un VL de SEQ ID NO 68; un VH de SEQ ID NO 69 y un VL de SEQ ID NO 70; un VH de SEQ ID NO 71 y un VL de SEQ ID NO 72; un VH de SEQ ID NO 77 y un VL de SEQ ID NO 78; un VH de SEQ ID NO 79 y un VL de SEQ ID NO 80;

- un VH de SEQ ID NO 81 y un VL de SEQ ID NO 82; un VH de SEQ ID NO 83 y un VL de SEQ ID NO 84; un VH de SEQ ID NO 85 y un VL de SEQ ID NO 86; un VH de SEQ ID NO 87 y un VL de SEQ ID NO 88; un VH de SEQ ID NO 89 y un VL de SEQ ID NO 90; un VH de SEQ ID NO 91 y un VL de SEQ ID NO 92; un VH de SEQ ID NO 93 y un VL de SEQ ID NO 94; un VH de SEQ ID NO 95 y un VL de SEQ ID NO 96; un VH de SEQ ID NO 97 y un VL de SEQ ID NO 98; ur VH de SEQ ID NO 99 y jn VL de SEQ ID NO 100; un VH de SEQ ID NO 101 y un VL de SEQ ID NO 102; un VH de SEQ ID NO 103 y un VL de SEQ ID NO 104 un VH de SEQ ID NO 105 y un VL de SEQ ID NO 106; un VH de SEQ ID NO 107 y un VL de SEQ ID NO 108 ; un VH de SEQ ID NO 109 y un VL de SEQ ID NO 110; un VH de SEQ ID NO 111 y un VL de SEQ ID NO 112 ; un VH de SEQ ID NO 113 y un VL de SEQ ID NO 114; un VH de SEQ ID NO 115 y un VL de SEQ ID NO 116 ; un VH de SEQ ID NO 117 y un VL de SEQ ID NO 118; un VH de SEQ ID NO 119 y un VL de SEQ ID NO 120 ; un VH de SEQ ID NO 121 y un VL de SEQ ID NO 122; un VH de SEQ ID NO 123 y un VL de SEQ ID NO 124 ; un VH de SEQ ID NO 170 y un VL de SEQ ID NO 171; un VH de SEQ ID NO 172 y un VL de SEQ ID NO 173; o un VH de SEQ ID NO 186 y un VL de SEQ ID NO 187.

Tabla 3 : Listado de las cadenas VH y VL de scFv dirigidas a los antígenos CD19, CD33, 5T4, ROR1, EGFRvIlI,

BCMA CS1 CD123

continuación

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continuación

continuación

continuación

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En otra realización preferida, dichas cadenas VH y VL tienen una secuencia diana de epítopo de más del 80 % de identidad, preferentemente más del 90%, y más preferentemente más del 95% con el s Eq ID NO 11 (antígeno CD20).

El dominio de unión a ligando extracelular también puede comprender un péptido que se une con un antígeno de la diana, un péptido o una proteína que se une con un anticuerpo que se une con un antígeno de la diana, un péptido o un ligando proteico tal como un factor de crecimiento, una citocina o una hormona como ejemplos no limitantes que se unen con un receptor en la diana o un dominio procedente de un receptor tal como un receptor del factor de crecimiento, un receptor de citocinas o un receptor de hormonas como ejemplos no limitantes, que se unen con un ligando o un ligando proteico en la diana. Preferentemente, la diana es una célula o un virus.

El dominio de unión a antígeno del CAR puede ser cualquier dominio que se una al antígeno diana celular, incluyendo, pero sin limitación, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado y un fragmento funcional de los mismos.

Un anticuerpo humanizado puede producirse usando diversas técnicas conocidas en la técnica, incluyendo, pero sin limitación, injerto de CDR (véanse, por ejemplo, la Patente Europea N.° EP 239.400; la Publicación Internacional N.°WO 91/09967; y las Patentes de EE.UU. N.° 5.225.539, 5.530.101 y 5.585.089), modificación superficial o revestimiento (véanse, por ejemplo, las Patentes Europeas N.° EP 592.106 y EP 519.596; Padlan, 1991, Molecular Immunology, 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Protein Engineering, 7(6):805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS, PnAs , 91:969-973), barajado de cadenas (véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. N.° 5.565.332), y las técnicas divulgadas en, por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° US2005/0042664, la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. N.° US2005/0048617, la Pat. de EE.UU. N.° 6.407.213, la Pat. de EE.UU. N.° 5.766.886, la Publicación Internacional N.°WO 9317105, Tan et al., J. Immunol., 169: 1119-25 (2002), Caldas et al., Protein Eng., 13(5):353-60 (2000), Morea et al., Methods, 20(3):267-79 (2000), Baca et al., J. Biol. Chem., 272(16): 10678-84 (1997), Roguska et al., Protein Eng., 9(10):895-904 (1996), Couto et al., Cancer Res., 55 (23 Supp):5973s-5977s (1995), Couto et al., Cancer Res., 55(8): 1717-22 (1995), Sandhu J S, Gene, 150(2):409-10 (1994) y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235(3):959-73 (1994. Con frecuencia, los residuos marco de las regiones marco serán sustituidos por el residuo correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, por ejemplo, mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones marco se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante el modelado de las interacciones de la CDR y los residuos marco para identificar los residuos marco importantes para la unión al antígeno y la comparación de secuencias para identificar los residuos marco poco habituales en posiciones particulares. (Véanse, por ejemplo, Queen et al., la Pat. de EE.UU. N.° 5.585.089; y Riechmann et al., 1988, Nature, 332:323).

De acuerdo con la invención, los scFv pueden ser nanocuerpos (anticuerpos naturales de dominio único) que pueden obtenerse por inmunización de dromedarios, camellos, llamas, camellos, llamas, alpacas o tiburones.

Enlazadores dentro del scFv quimérico

La flexibilidad de la genomanipulación del enlazador scFv se puede combinar con los caracteres inherentes rápidos y adaptables de la química de acoplamiento de superficies (por ejemplo, unión electrostática, de enlace de hidrógeno o covalente). Los enlazadores peptídicos pueden variar de 10 a 25 aminoácidos de longitud y están compuestos normalmente, pero no siempre, por aminoácidos hidrófilos tales como glicina (G) y serina (S). También se han utilizado enlazadores peptídicos de longitudes más cortas (0-4 aminoácidos). Sin embargo, los scFv que llevan enlazadores más cortos pueden formar multímeros. Generalmente, el péptido (GGGGS)³se usa como un enlazador peptídico scFv. Esta secuencia enlazadora de 15 aminoácidos [denominada enlazador (GGGGS)³] se usa en el sistema de anticuerpos de fagos recombinantes (kit RPAS) disponible comercialmente en Amersham. Un estudio anterior demostró que los scFv (PM ~27.000) que contenían aminoácidos de unión a metales (es decir, cisteína o histidina) en el enlazador peptídico scFv pueden inmovilizarse directamente sobre una superficie de oro en una orientación de unión a antígeno favorable a alta densidad que aumenta significativamente la sensibilidad del ensayo de 3-5 veces sobre fragmentos de anticuerpos IgG o Fab completos, respectivamente (Shen Z, Mernaugh RL, Yan H, Yu L, Zhang Y, Zeng X. Anal. Chem. 2005;77:6834-6842; Shen Z, Stryker GA, Mernaugh RL, Yu L, Yan H, Zeng X. Anal. Chem. 2005; 77:797-805).

Entre otros enlazadores adecuados dentro de la presente invención se encuentran el enlazador peptídico de 15-mer (RGRGRGRGRSRG-GGS) (Zhihong Shen, Heping Yan, Ying Zhang, Raymond L. Mernaugh y Xiangqun Zeng (2008), Anal Chem. 80(6): 1910-1917).

En algunas realizaciones, el "enlazador", como se usa en el contexto de un scFv, se refiere a un enlazador peptídico que consiste en aminoácidos tales como residuos de glicina y/o serina usados en solitario o en combinación, para unir regiones variables de cadena pesada y variables de cadena ligera entre sí. En una realización, el enlazador polipeptídico flexible es un enlazador de glicina/serina y comprende la secuencia de aminoácidos (Gly-Gly-GlySer)n o (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, donde n es un número entero positivo igual o superior a 1. Por ejemplo, n = 1, n = 2, n = 3, n = 4, n = 5, n = 6, n = 7, n = 8, n = 9 y n = 10. En una realización, los enlazadores polipeptídicos flexibles incluyen, pero sin limitación, (Gly⁴Ser)⁴o (Gly⁴Ser)³. En otra realización, los enlazadores incluyen múltiples repeticiones de (GlyxSer)n, donde x = 1, 2, 3, 4 o 5 y n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, tales como una repetición múltiple de (GlySer), (Gly²Ser) o (GlysSer). También se incluyen dentro del alcance de la invención los enlazadores descritos en el documento WO2012/138475.

Receptor de antígeno quimérico (CAR)

Los CAR de acuerdo con la invención se buscan para permitir que las células inmunitarias genomanipuladas provoquen la destrucción de células patológicas, en particular células neoplásicas. Pueden diseñarse de acuerdo con arquitecturas monocatenarias o multicatenarias. En algunas realizaciones, el dominio de unión a ligando extracelular, el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular están en un polipéptido, es decir, en una sola cadena. Las arquitecturas multicatenarias se describen más particularmente en el documento WO2014039523.

Un CAR multicatenario está formado normalmente por diferentes polipéptidos tales como:

- un polipéptido transmembrana que comprende al menos un dominio de unión a ligando extracelular y;

- un polipéptido transmembrana que comprende al menos un dominio de transducción de señal.

El polipéptido de señalización es responsable de la activación de al menos una de las funciones normales de la célula inmunitaria genomanipulada. Por ejemplo, la función de un linfocito T puede ser una actividad citolítica o actividad auxiliar que incluye la secreción de citocinas. Por lo tanto, la expresión "proteína de señalización" se refiere a una proteína que transduce la señal funcional del dominio del transmisor y dirige a la célula para que realice una función especializada. En una realización particular, dicho dominio transmisor puede ser una proteína de señalización. La transmisión de las señales puede ser resultado de: interacciones proteína/proteína, interacción proteína/ADN, interacción proteína/ARN, interacción proteína/molécula pequeña, modificación de proteína postraduccional, cambio conformacional, relocalización subcelular.

La proteína de señalización puede activar un gen en el núcleo. Los ejemplos de proteína de señalización pueden ser miembros de la familia del factor de transcripción NFAT que son factores inducibles que podrían unirse al promotor de interleucina-2 en linfocitos T activados. La regulación de las proteínas NFAT involucra metabolitos y proteínas tales como calcio, calcineurina y proteínas de armazón de Homer. Dicha proteína de señalización puede ser una forma genomanipulada activada de NFAT que evita la regulación por calcineurina y proteínas de Homer. Dicha proteína de señalización puede ser un NF-kB genomanipulado para evitar el secuestro en el citoplasma por IkB permitiendo la activación de los linfocitos T. Dicha proteína de señalización también puede ser la expresión de las tres subunidades IKK (IKKa, IKKp, IKKy). El complejo IKK reconstituido activó la vía NF-kB, al desencadenar la ubiquitinación de IkB.

Además, la activación de la señalización de JNK podría desencadenarse mediante la expresión directa de la proteína de señalización AP-1 (factor de transcripción). Dicha proteína de señalización puede ser un dominio de unión a un efector de tipo activador de transcripción (TALE) que se dirigirá específicamente y activará la transcripción del mismo gen que para NFAT y NF-kb.

De acuerdo con la invención, dicha proteína de señalización puede inhibir una vía de señalización a través de la interacción proteína-proteína o puede activar un gen en el núcleo para inhibir una vía de señalización. Dicha proteína de señalización pueden ser proteínas relacionadas con la vacuna H1 (VHR), un miembro de la familia de las proteínas cinasa fosfatasas activadas por mitógenos (MKP) que desfosforila e inactiva una proteína de señalización de cinasas reguladas por señales extracelulares (ERK).

De acuerdo con la invención, el dominio de transducción de señal para su uso en un CAR pueden ser las secuencias citoplásmicas del receptor y correceptores de linfocitos T que actúan en conjunto para iniciar la transducción de señal después de la participación del receptor de antígeno, así como cualquier derivado o variante de estas secuencias y cualquier secuencia sintética que tenga la misma capacidad funcional. El dominio de transducción de señal puede comprender dos clases distintas de secuencia de señalización citoplásmica, las que inician la activación primaria dependiente de antígeno y las que actúan de una manera dependiente de antígeno para proporcionar una señal secundaria o coestimuladora.

En una realización particular, el dominio de transducción de señal del CAR de la presente invención comprende una molécula de señal coestimuladora. Una molécula coestimuladora es una molécula de la superficie celular distinta de un receptor de antígeno o sus ligandos que se requiere para una respuesta inmunitaria eficaz.

"Ligando coestimulador" se refiere a una molécula en una célula presentadora de antígeno que se une específicamente a una molécula coestimuladora análoga en un linfocito T, proporcionando de este modo una señal que, además de la señal primaria proporcionada mediante, por ejemplo, la unión de un complejo de TCR/CD3 con una molécula del MHC cargada con péptido, media en una respuesta de linfocitos T, incluyendo, pero sin limitación, activación de proliferación, diferenciación y similares. Una "molécula coestimuladora" se refiere al compañero de unión afín en un linfocito T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así en una respuesta coestimuladora por la célula, tal como, pero sin limitación, la proliferación. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero sin limitación, una molécula del MHC de clase I, BTLA y receptor de ligando Toll.

Por ejemplo, un CAR multicatenario puede obtenerse de la estructura de un receptor Fc, preferentemente FceRI, y comprender al menos dos de los siguientes componentes:

a) un polipéptido que comprende el dominio transmembrana de la cadena alfa de FcRI fusionada a un dominio de unión a ligando extracelular,

b) un polipéptido que comprende una parte de la cola citoplásmica del extremo N y C fusionada al dominio transmembrana de una cadena beta de FcRI, y/o

c) dos polipéptidos adicionales que comprenden cada uno una parte de una cola intracitoplasmática y/o el dominio transmembrana de la cadena gamma de FcRI,

En general, estos diferentes polipéptidos se multimerizan juntos espontáneamente para formar estructuras diméricas, triméricas o tetraméricas que surgen en la superficie celular en una posición yuxtamembrana.

En algunas realizaciones, la invención se refiere a una célula inmunitaria que comprende un CAR monocatenario también definido en la técnica anterior, así como en cualquiera de los documentos US7446190, WO2008/121420, US8252592, US20140024809, WO2012/079000, WO2014153270, WO2012/099973, WO2014/011988, WO2014/011987, WO2013/067492, WO2013/070468, WO2013/040557, WO2013/126712, WO2013/126729, WO 2013/126726, WO2013/126733, US8399645, US20130266551, US20140023674, WO2014039523, US7514537, US8324353, WO2010/025177, US7446179, WO2010/025177, WO2012/031744, WO2012/136231A1, WO2012/050374A2, WO2013074916, WO/2009/091826A3, WO2013/176915 o WO/2013/059593.

En algunas realizaciones, la invención se refiere a un CAR que comprende

- un dominio extracelular que comprende

- al menos un dominio de unión extracelular que comprende un scFv formado por al menos una cadena VH y una cadena VL específica de un antígeno, preferentemente un antígeno marcador de la superficie celular, en el que dicho dominio de unión extracelular comprende al menos un epítopo específico de mAb, y

- una bisagra,

- un dominio transmembrana, y

- un dominio intracelular.

En una realización, el dominio transmembrana comprende la región o regiones transmembrana de la cadena alfa, cadena beta o zeta del receptor de linfocitos T, PD-1,4-1BB, OX40, ICOS, CTLA-4, LAG3, 2B4, BTLA4, TIM-3, TIGIT, SIRPA, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 o CD154. En otra realización, la bisagra es una bisagra IgG4 o una bisagra CD8 alfa, preferentemente una bisagra CD8 alfa.

Las características distintivas de los dominios transmembrana apropiados comprenden la capacidad de expresarse en la superficie de una célula, preferentemente en la presente invención una célula inmunitaria, en particular, células linfocíticas o linfocitos citolíticos naturales (NK), y para interaccionar entre sí para dirigir la respuesta celular de células inmunitarias contra una célula diana predefinida. El dominio transmembrana puede proceder de una fuente natural o de una sintética. El dominio transmembrana puede proceder de cualquier proteína unida a membrana o transmembrana. Como ejemplos no limitantes, el polipéptido transmembrana puede ser una subunidad del receptor de linfocitos T tal como a, p, y o 8, polipéptido que constituye el complejo CD3, receptor de IL2 p55 (cadena a), p75 (cadena p) o cadena y, cadena subunitaria de receptores Fc, en particular receptor Fcy III o proteínas CD. Como alternativa, el dominio transmembrana puede ser sintético y puede comprender predominantemente residuos hidrófobos tales como leucina y valina. En una realización preferida, dicho dominio transmembrana se obtiene de la cadena de CD8 alfa humana (por ejemplo, NP_001139345.1). Dicho dominio transmembrana también puede ser un dominio transmembrana de CD8 (cadenas alfa y beta). Dicho dominio transmembrana se puede genomanipular para crear hetero u homodímeros obligados. En una realización particular, dichos CAR pueden comprender dominios transmembrana o dominios intracelulares que solo pueden dimerizar después del reconocimiento del ligando. Otro ejemplo de dominio transmembrana puede ser el receptor NKG2-D. NKG2d (grupo de linfocitos citolíticos naturales 2D) es un receptor similar a lectina de tipo C expresado en linfocitos NK, linfocitos T y8-TcR+ y linfocitos T CD8+ap-TcR+ (Bauer, Groh et al., 1999, Science 285(5428):727-9. NKG2D está asociado con la proteína adaptadora transmembrana DAP10 (Wu, Song et al. 1999, Science 285(5428):730-2), cuyo dominio citoplasmático se une a la subunidad p 85 de la cinasa PI-3.

Dicho dominio transmembrana también puede ser una integrina. Las integrinas son proteínas de membrana integrales heterodiméricas compuestas por cadenas a y p que, combinadas, forman el LFA-1 (antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos de la integrina) que se expresa en todos los leucocitos. LFA-1 desempeña una función central en la adhesión intercelular de leucocitos a través de interacciones con su ligando, ICAM 1-3 (moléculas de adhesión intercelular 1 a 3), y también tiene una función importante en la señalización coestimuladora de linfocitos (Chen y Flies 2013, Nat Rev Immunol 13(4):227-42). Los detalles moleculares de la unión de LAF-1 a su inmunoglobulina iCa M-1 son bastante conocidos, lo que permite una genomanipulación del sitio de unión a LAF-1. La afinidad del dominio aL por ICAM-1 está regulada por el desplazamiento de su hélice C-terminal que está ligada conformacionalmente a alteraciones de bucles específicos en LAF-1. Las conformaciones activas y bajas se diferencian en 500 y 10.000 pliegues. También es interesante apreciar que se conocen dos tipos de antagonistas para LFA-1 y se conoce su mecanismo de acción. Los receptores de adhesión a la superficie celular de la integrina pueden transmitir una señal desde el exterior hacia el interior, pero también viceversa. Existen proteínas citoesqueléticas como Talin que se une al LFA-1 de la cola de integrina para transferir un mensaje de dentro hacia fuera.

De acuerdo con una realización, el dominio transmembrana comprende la región transmembrana de PD-1 o la región o regiones transmembrana de CD8 alfa.

En un aspecto de la invención, el dominio transmembrana se une al dominio extracelular del CAR mediante una bisagra, por ejemplo, una bisagra de una proteína humana. Por ejemplo, en una realización, la bisagra puede ser una bisagra de Ig humana (inmunoglobulina), por ejemplo, una bisagra IgG1, una bisagra IgG4 o una bisagra CD8alfa.

En una realización preferida, la bisagra del CAR es una bisagra de inmunoglobulina humana.

En una realización más preferida, la bisagra del CAR es una bisagra IgG4 o una bisagra CD8 alfa.

En algunas realizaciones, la bisagra es una bisagra FcyRIII alfa.

En algunas realizaciones, la bisagra es una bisagra CD8 alfa.

En algunas realizaciones, la bisagra es una bisagra CD8 alfa que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 %, 95 %, 97 % o un 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ. ID NO: 179, 180 o 181.

La expresión "región bisagra" (también denominada región de tallo en la bibliografía) usada en el presente documento generalmente significa cualquier oligo o polipéptido que funcione para unir el dominio transmembrana al dominio de unión al ligando extracelular. En particular, la región de tallo se usa para proporcionar más flexibilidad y accesibilidad para el dominio de unión a ligando extracelular. Una región de tallo puede comprender hasta 300 aminoácidos, preferentemente de 10 a 100 aminoácidos y mucho más preferentemente de 25 a 50 aminoácidos. La región de tallo puede proceder de todas o parte de las moléculas de origen natural, tal como de toda o parte de la región extracelular de CD8, CD4, CD28 o RTK, o de toda o parte de una región constante de anticuerpo. Como alternativa, la región de tallo puede ser una secuencia sintética que corresponde a una secuencia de tallo de origen natural o puede ser una secuencia de tallo completamente sintética.

El dominio intracelular (también denominado en el presente documento como un "dominio de señalización citoplásmico" o "un dominio de señalización intracelular'') comprende un dominio de señalización funcional derivado de una molécula estimuladora como se define a continuación. En algunas realizaciones, la molécula estimuladora es la cadena zeta asociada con el complejo receptor de linfocitos T. En algunas realizaciones, el dominio de señalización citoplásmico comprende además uno o más dominios de señalización funcionales derivados de al menos una molécula coestimuladora como se define a continuación. En algunas realizaciones, la molécula coestimuladora se elige de 4-1BB (es decir, CD137), CD27 y/o CD28.

La expresión "molécula estimuladora" se refiere a una molécula expresada por un linfocito T que proporciona la secuencia o secuencias de señalización citoplasmática positiva que regulan la activación positiva del complejo TCR de una manera estimulante para al menos algún aspecto de la vía de señalización de linfocitos T. En algunas realizaciones, la señal positiva se inicia, por ejemplo, mediante la unión de un complejo TCR/CD3 con una molécula de MHC cargada con péptido, y que conduce a la mediación de una respuesta de linfocitos T, incluyendo, pero sin limitación, proliferación, activación, diferenciación y similares. Una secuencia de señalización citoplásmica positiva (también denominado "dominio de señalización positiva" o dominio de señalización intracelular positiva) que actúa de manera estimulante puede contener un motivo de señalización que se conoce como motivo de activación del inmunorreceptor basado en tirosina o ITAM. Los ejemplos de un ITAM que contienen una secuencia de señalización citoplásmica positiva incluyen, pero sin limitación, los derivados de TCR zeta (o CD3zeta), FcR gamma, FcR beta, CD3 gamma, CD3 delta, CD3 épsilon, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD278 (también conocido como "ICOS") y CD66d. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular del CAR puede comprender el dominio de señalización de CD3Z (zeta) que tiene una secuencia de aminoácidos con al menos aproximadamente un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 %, 95 %, 97 % o un 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ. ID NO: 175.

En algún aspecto, el dominio de señalización intracelular del CAR genera una señal que promueve una función efectora inmunitaria de la célula que contiene CAR. Los ejemplos de función efectora inmunitaria, por ejemplo, en un linfocito T con CAR, incluyen actividad citolítica y actividad auxiliar, incluida la secreción de citocinas.

La expresión "molécula coestimuladora" se refiere al compañero de unión afín en un linfocito T que se une específicamente con un ligando coestimulador, mediando así en una respuesta coestimuladora por el linfocito T, tal como, pero sin limitación, la proliferación. Las moléculas coestimuladoras son moléculas de la superficie celular distintas de los receptores de antígenos o sus ligandos que se requieren para una respuesta inmunitaria eficaz. Las moléculas coestimuladoras incluyen, pero sin limitación, una molécula del MHC de clase I, BTLA y un receptor de ligando Toll, así como OX40, CD2, CD27, CD28, CDS, ICAM-1, LFA-1 (CD11a/CD18) y 4-IBB (CD137).

Un dominio de señalización intracelular coestimulador puede ser la porción intracelular de una molécula coestimuladora. Una molécula coestimuladora puede estar representada en las siguientes familias de proteínas: proteínas del receptor de TNF, proteínas de tipo inmunoglobulina, receptores de citocina, integrinas, moléculas de activación linfocítica de señalización (proteínas SLAM) y receptores de linfocitos NK activadores. Los ejemplos de dichas moléculas incluyen CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, antígeno 1 asociado a la función de linfocitos (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, SLAMF7, NKp80, CD160, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83 y similares. En algunas realizaciones, el dominio de señalización intracelular del CAR de la invención comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un 70 %, preferentemente al menos un 80 %, más preferentemente al menos un 90 %, 95 %, 97 % o un 99 % de identidad de secuencia con una secuencia de aminoácidos mostrada en las SEQ. ID NO: 176 y SEQ. ID NO: 177.

L T l 4 r r i n n n i m l m n n AR

continuación

Los CAR y las células inmunitarias que los comprenden se han divulgado ampliamente y pueden prepararse por un experto en la técnica de acuerdo con métodos conocidos. Por ejemplo, las metodologías para preparar CAR y las células que comprenden dichos CAR se divulgan en los documentos US7446190, WO2008/121420, US8252592, US20140024809, WO2012/079000, WO2014153270, WO2012/099973, WO2014/011988, WO2014/011987, WO2013/067492, WO2013/070468, WO2013/040557, WO2013/126712, WO2013/126729, WO 2013/126726, WO2013/126733, US8399645, US20130266551, US20140023674, WO2014039523, US7514537, US8324353, WO2010/025177, US7446179, WO2010/025177, WO2012/031744, WO2012/136231A1, WO2012/050374A2, WO2013074916, WO2009/091826A3, WO2013/176915 o WO/2013/059593.

La presente invención abarca una construcción de ADN recombinante que comprende secuencias que codifican un CAR como se ha definido anteriormente, en la que el CAR comprende un dominio extracelular tal como un fragmento de anticuerpo que se une específicamente al antígeno diana celular, y en la que la secuencia del dominio extracelular es contigua con y en el mismo marco de lectura que una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio transmembrana y un dominio intracelular. Una construcción CAR de ejemplo puede comprender una secuencia líder opcional, un dominio de unión a antígeno diana celular extracelular, una bisagra, un dominio transmembrana y un dominio de señalización inhibidora intracelular

En algunas realizaciones, la invención se refiere a una construcción de ADN recombinante que comprende secuencias que codifican un CAR como se ha definido anteriormente. En algunas realizaciones, el c Ar comprende un dominio extracelular que comprende

- al menos un dominio de unión extracelular que comprende un scFv formado por al menos una cadena VH y una cadena VL específica de un antígeno marcador de superficie celular, en el que dicho dominio de unión extracelular comprende al menos un epítopo específico de mAb insertado que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35,

- una bisagra,

- un dominio transmembrana, y

- un dominio intracelular.

Método para clasificar las células inmunitarias positivas para CAR

De acuerdo con un aspecto, la divulgación se refiere a un método para clasificar in vitro una célula inmunitaria que expresa CAR, que comprende poner en contacto una población de dicha inmunidad genomanipulada con un anticuerpo específico de antígeno (preferentemente Ab monoclonales) para recoger solo células que expresan CAR.

En algunos casos, la divulgación se refiere a un método para clasificar in vitro una célula inmunitaria que expresa CAR, en el que dicho CAR comprende al menos un dominio de unión extracelular que comprende al menos un epítopo específico de mAb como se ha descrito anteriormente, que comprende

- poner en contacto una población de dichas células inmunitarias con un anticuerpo monoclonal específico para dicho epítopo específico de mAb para recoger solo dicha célula inmunitaria que expresa CAR.

En algunos casos, la divulgación se refiere a un método para clasificar in vitro células inmunitarias que expresan CAR, en el que dicho CAR comprende al menos un dominio de unión extracelular que comprende al menos un epítopo específico de mAb, que comprende: poner en contacto una población de dichas células inmunitarias con un anticuerpo monoclonal (mAb específico de epítopo) específico para dicho epítopo específico de mAb,

- seleccionar las células que se unen al anticuerpo monoclonal,

para obtener una población de células enriquecidas con células inmunitarias que expresan CAR.

En algunos casos, dicho anticuerpo monoclonal específico para dicho epítopo específico de mAb se conjuga con un fluoróforo y la etapa de seleccionar las células que se unen al anticuerpo monoclonal se realiza mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS, por sus siglas en inglés).

En algunos casos, dicho anticuerpo monoclonal específico para dicho epítopo específico de mAb se conjuga con una partícula magnética y la etapa de seleccionar las células que se unen al anticuerpo monoclonal se realiza mediante clasificación de células activadas magnéticamente (MACS, por sus siglas en inglés).

En algunos casos, el dominio de unión extracelular del CAR comprende un epítopo específico de mAb de SEQ ID NO 144.

En algunos casos, el dominio de unión extracelular del CAR comprende un epítopo específico de mAb de SEQ ID NO 144 y el anticuerpo usado para entrar en contacto con la población de células inmunitarias es QBEND-10. En algunos casos, el dominio de unión extracelular del CAR comprende un epítopo específico de mAb de SEQ ID NO 35.

En algunos casos, el dominio de unión extracelular del CAR comprende un epítopo específico de mAb de SEQ ID NO 35 y el anticuerpo usado para entrar en contacto con la población de células inmunitarias es Rituximab.

En algunos casos, la población de células inmunitarias que expresan CAR obtenidas cuando se usa el método para clasificar in vitro células inmunitarias que expresan CAR descrito anteriormente comprende al menos un 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % de células inmunitarias que expresan CAR. En algunas realizaciones, la población de células inmunitarias que expresan CAR obtenidas cuando se usa el método para clasificar in vitro células inmunitarias que expresan CAR descrito anteriormente comprende al menos un 85 % de células inmunitarias que expresan CAR.

En algunos casos, la población de células inmunitarias que expresan CAR obtenida cuando se usa el método para clasificar in vitro células inmunitarias que expresan CAR descrito anteriormente muestra una mayor actividad citotóxica in vitro en comparación con la población celular inicial (no clasificada) usando el protocolo descrito en el Ejemplo 7.5. En una realización preferida, dicha actividad citotóxica in vitro se aumenta en un 10 %, 20 %, 30 % o un 50 %.

Preferentemente, los mAb se unen previamente a un soporte, tal como una columna, o en perlas, tal como las que realizan habitualmente los expertos en la técnica.

De acuerdo con un ejemplo favorito, las células inmunitarias son linfocitos T.

De acuerdo con la divulgación, las células a administrar al receptor pueden enriquecerse in vitro a partir de la población de origen.

Los métodos para expandir poblaciones de origen se conocen bien en la técnica y pueden incluir seleccionar células que expresan un antígeno tal como el antígeno CD34, usar combinaciones de centrifugación de densidad, purificación de perlas inmunomagnéticas, cromatografía de afinidad y clasificación de células activadas por fluorescencia, conocidos para los expertos en la técnica.

Citometría de flujo

La citometría de flujo se usa ampliamente en la técnica y es un método bien conocido por un experto en la técnica para clasificar y cuantificar tipos celulares específicos dentro de una población de células. En general, la citometría de flujo es un método para cuantificar componentes o características estructurales de células principalmente por medios ópticos. Dado que se pueden distinguir diferentes tipos de células cuantificando características estructurales, la citometría de flujo y la clasificación de células se pueden utilizar para contar y clasificar células de diferentes fenotipos en una mezcla. Un análisis de citometría de flujo implica dos etapas básicas: 1) etiquetar los tipos de células seleccionados con uno o más marcadores etiquetados, y T) determinar el número de células etiquetadas en relación con el número total de células de la población.

El método principal de etiquetado de tipos de células es uniendo anticuerpos marcados a marcadores expresados por el tipo de célula específico. Los anticuerpos se marcan directamente con un compuesto fluorescente o se marcan indirectamente utilizando, por ejemplo, un segundo anticuerpo marcado con fluorescencia que reconoce el primer anticuerpo.

En un caso preferido, el método utilizado para clasificar los linfocitos T que expresan CAR es la clasificación de células activadas magnéticamente (MACS).

La clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) es un método para la separación de diversas poblaciones celulares en función de sus antígenos de superficie (moléculas CD) mediante el uso de nanopartículas y columnas superparamagnéticas. Solo se necesitan algunas etapas para obtener poblaciones de células puras. Las células en una suspensión unicelular se marcan magnéticamente con microperlas. La muestra se aplica a una columna compuesta por esferas ferromagnéticas, que están cubiertas con un recubrimiento respetuoso con las células, lo que permite una separación rápida y suave de las células. Las células no marcadas pasan a través mientras que las células marcadas magnéticamente se retienen dentro de la columna. El flujo continuo se puede recoger como la fracción de células no marcadas. Después de una breve etapa de lavado, la columna se retira del separador y las células marcadas magnéticamente se eluyen de la columna.

Entre otras técnicas, FACS es una técnica de elección para purificar poblaciones celulares de fenotipo conocido ya que se puede lograr una pureza muy alta de la población deseada, o cuando la población de células diana expresa un nivel muy bajo del marcador de identificación, o cuando las poblaciones celulares requieren una separación basada en la densidad diferencial del marcador. Además, FACS es la única técnica de purificación disponible para aislar células en función de la tinción interna o la expresión de proteínas intracelulares, tal como un marcador de proteína fluorescente modificado genéticamente. FACS permite la purificación de células individuales basándose en el tamaño, la granularidad y la fluorescencia. Para purificar las células de interés, primero se tiñen con anticuerpos monoclonales (mAb) marcados con fluorescencia, que reconocen marcadores de superficie específicos en la población celular deseada.

Se puede encontrar un protocolo detallado para la purificación de una población celular específica, tales como linfocitos T, en Basu S et al. (2010). (Basu S, Campbell HM, Dittel BN, Ray A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41): 1546).

En un caso preferido, el mAb utilizado en el método para clasificar los linfocitos T que expresan el CAR se elige entre ibritumomab, tiuxetán, muromonab-CD3, tositumomab, abciximab, basiliximab, brentuximab vedotina, cetuximab, infliximab, rituximab, alemtuzumab, bevacizumab, certolizumab pegol, daclizumab, eculizumab, efalizumab, gemtuzumab, natalizumab, omalizumab, palivizumab, ranibizumab, tocilizumab, trastuzumab, vedolizumab, adalimumab, belimumab, canakinumab, denosumab, golimumab, ipilimumab, ofatumumab, panitumumab, QBEND-10 y ustekinumab.

En un caso más preferido, dicho mAb es rituximab.

En un caso más preferido, dicho mAb es QBEND-10.

Método para agotar las células inmunitarias que expresan CAR

Por "agotamiento in vivo" se entiende en la presente invención la administración de un tratamiento a un organismo mamífero con el objetivo de detener la proliferación de células inmunitarias que expresan CAR mediante inhibición o eliminación.

Un aspecto de la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal (mAb) específico de epítopo que reconoce específicamente el epítopo específico de mAb que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35 para su uso en un método para agotar in vivo una célula inmunitaria genomanipulada que expresa un CAR que comprende un epítopo específico de m-Ab que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35, que comprende poner en contacto dicha célula inmunitaria genomanipulada o dicha célula inmunitaria que expresa CAR con dichos mAb específicos de epítopo.

Preferentemente, dichas células inmunitarias son linfocitos T y/o el anticuerpo es monoclonal.

De acuerdo con una realización, el agotamiento in vivo de la célula inmunitaria genomanipulada se realiza en una célula inmunitaria genomanipulada que se ha clasificado previamente usando el método in vitro de la presente divulgación. En este caso, será el mismo mAb infundido utilizado.

De acuerdo con una realización preferida, el mAb específico de epítopo es rituximab.

En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto dicha célula inmunitaria genomanipulada o dicha célula inmunitaria que expresa CAR con al menos un mAb específico de epítopo comprende infundir al paciente el mAb específico de epítopo, preferentemente rituximab. En algunas realizaciones, la cantidad de mAb específico de epítopo administrado al paciente es suficiente para eliminar al menos el 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o el 90 % de las células inmunitarias que expresan CAR en el paciente.

En algunas realizaciones, la etapa de poner en contacto dicha célula inmunitaria genomanipulada o dicha célula inmunitaria que expresa CAR con al menos un mAb específico de epítopo comprende infundir al paciente 375 mg/m2 de rituximab, una o varias veces, preferentemente una vez a la semana.

En algunas realizaciones, cuando las células inmunitarias que expresan un CAR que comprende un epítopo específico de mAb (células inmunitarias que expresan CAR) se agotan en un ensayo de CDC usando un mAb específico de epítopo, la cantidad de células inmunitarias viables que expresan CAR disminuye, preferentemente en al menos un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % o un 90 %. Preferiblemente, el ensayo CDC es el ensayo divulgado en el Ejemplo 3, Ejemplo 4 o Ejemplo 7.4.

En una realización particular, el agotamiento in vivo de las células inmunitarias genomanipuladas con CAR se realiza mediante la infusión de anticuerpos biespecíficos. Por definición, un anticuerpo monoclonal biespecífico (BsAb) es una proteína artificial que está compuesta por fragmentos de dos anticuerpos monoclonales diferentes y, en consecuencia, se une a dos tipos diferentes de antígeno. Estos BsAbs y su uso en inmunoterapia se han revisado extensamente en Müller D y Kontermann R.E. (2010) Bispecific Antibodies for Cancer Immunotherapy, BioDrugs 24 (2): 89-98.

Por "célula efectora", este término incluye células inmunitarias tales como linfocitos, macrófagos, células dendríticas, linfocitos citolíticos naturales (linfocito NK), linfocitos T citotóxicos (CTL).

De acuerdo con otra realización particular, el mAb biespecífico infundido es capaz de unirse tanto al epítopo específico de mAb transportado en células inmunitarias genomanipuladas que expresan el scFv quimérico como a un antígeno de superficie en una célula efectora y citotóxica. Este aspecto se presenta en la figura 3. Al hacerlo, el agotamiento de las células inmunitarias genomanipuladas desencadenadas por el BsAb puede producirse a través de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés). Tal conformación se puede encontrar, por ejemplo, en Deo Y M, Sundarapandiyan K, Keler T, Wallace PK y Graziano RF, (2000), Journal of Immunology, 165 (10):5954-5961].

De acuerdo con una realización particular, se acopla un fármaco citotóxico a los mAb específicos de epítopo que se usan para agotar las células inmunitarias que expresan CAR. Al combinar las capacidades de direccionamiento de los anticuerpos monoclonales con la capacidad de destruir el cáncer de los fármacos citotóxicos, el conjugado anticuerpofármaco (ADC, por sus siglas en inglés) permite una discriminación sensible entre tejido sano y enfermo en comparación con el uso del fármaco en solitario. Se recibieron aprobaciones de mercado para varios ADC; la tecnología para fabricarlos, particularmente en enlazadores, se presenta abundantemente en la siguiente técnica anterior (Payne, G. (2003) Cancer Cell 3:207-212; Trail et al (2003) Cancer Immunol. Immunother. 52:328-337; Syrigos y Epenetos (1999) Anticancer Research 19:605-614; Niculescu-Duvaz y Springer (1997) Adv. Drug Del. Rev. 26:151-172; Pat. de EE.UU. N.° 4.975.278).

De acuerdo con otra realización particular, el mAb específico de epítopo a infundir se conjuga previamente con una molécula capaz de promover la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC, por sus siglas en inglés). Por lo tanto, el sistema del complemento facilita o complementa la capacidad de los anticuerpos para eliminar los patógenos del organismo. Cuando se estimula por uno de varios, se desencadena una cascada de activación como una amplificación masiva de la respuesta y la activación del complejo de ataque a membrana de destrucción celular.

Se pueden usar diferentes moléculas para conjugar el mAb, tales como glucanos [Courtois, A, Gac-Breton, S., Berthou, C., Guezennec, J., Bordron, A. y Boisset, C. (2012), La actividad de citotoxicidad dependiente del complemento de fragmentos de anticuerpos terapéuticos se adquiere mediante acoplamiento de glucanos inmunogénicos, Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458; http://www.ejbiotechnology.info DOI: 10.2225/vol15-issue5).

En algunas realizaciones de la invención, se usan anticuerpos diferentes para clasificar y agotar las células. En algunas realizaciones, el dominio de unión extracelular comprende al menos un epítopo específico de mAb que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35 y al menos un epítopo que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 144 y el mAb usado para clasificar las células es QBEND10 y el mAb usado para agotar la célula es rituximab.

Métodos de genomanipulación de células inmunitarias

Los inventores desarrollaron métodos ex vivo para genomanipular células inmunitarias que expresan un receptor de antígeno quimérico (CAR) como se ha descrito anteriormente, con todos los componentes necesarios para desencadenar un antígeno diana de la superficie celular y expandirse/amplificarse. Además, este CAR tiene la particularidad de llevar un scFv quimérico en el que el scFv se modifica para incluir al menos un epítopo específico de mAb que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35.

En una realización, el método para genomanipular un receptor de antígeno quimérico (CAR) de células inmunitarias, que comprende al menos un dominio de unión extracelular que comprende un scFv formado por al menos una cadena VH y una cadena VL específica de un antígeno marcador de superficie celular y un epítopo específico de mAb que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35, comprende:

(a) Introducir en dicha célula al menos un polinucleótido que codifica dicho receptor de antígeno quimérico; y

(b) expresar dicho polinucleótido en dicha célula.

Los CAR y las células inmunitarias que los comprenden se han divulgado ampliamente y pueden prepararse por un experto en la técnica de acuerdo con métodos conocidos. Por ejemplo, se han divulgado anteriormente metodologías para preparar CAR y células que comprenden tales CAR. El experto en la técnica puede preparar células inmunitarias que comprenden un CAR de acuerdo con las metodologías divulgadas en las referencias mencionadas anteriormente. En una realización preferida, el experto en la técnica puede preparar células inmunitarias que comprenden un CAR de acuerdo con las metodologías divulgadas en el documento WO2013/176915.

En algunas realizaciones, la célula inmunitaria puede obtenerse a partir de un linfocito T inflamatorio, un linfocito T citotóxico, un linfocito T regulador o un linfocito T auxiliar.

En algunas realizaciones, la célula inmunitaria se ha obtenido de un donante sano. En algunas realizaciones, la célula inmunitaria se ha obtenido de un paciente.

En algunas realizaciones, el método para genomanipular células de la invención comprende además una o más etapas de modificación genómica adicionales. Mediante una etapa de modificación genómica adicional, se puede pretender la introducción en células para genomanipular una o más proteínas de interés. Dicha proteína de interés puede ser un CAR.

En algunas realizaciones, el método para genomanipular linfocitos T de la invención puede comprender:

(a) modificar linfocitos T inactivando al menos:

- un primer gen que expresa una diana para un agente inmunosupresor, y

- un segundo gen que codifica un componente del receptor de linfocitos T (TCR)

(b) expandir dichas células, opcionalmente en presencia de dicho agente inmunosupresor.

Un agente inmunosupresor es un agente que suprime la función inmunitaria mediante uno de varios mecanismos de acción. En otras palabras, un agente inmunosupresor es un papel desempeñado por un compuesto que exhibe una capacidad para disminuir el alcance y/o la voracidad de una respuesta inmunitaria. Como ejemplo no limitante, un agente inmunosupresor puede ser un inhibidor de la calcineurina, una diana de la rapamicina, un bloqueador de la cadena u de interleucina-2, un inhibidor de la inosina monofosfato deshidrogenasa, un inhibidor de la reductasa del ácido dihidrofólico, un corticosteroide o un antimetabolito inmunosupresor.

En una realización particular, la etapa de modificación genética del método se basa en la inactivación de un gen seleccionado del grupo que consiste en CD52, GR, TCR alfa y TCR beta. En otra realización, la etapa de modificación genética del método se basa en la inactivación de dos genes seleccionados del grupo que consiste en CD52 y GR, CD52 y TCR alfa, CDR52 y TCR beta, GR y TCR alfa, GR y TCR beta, TCR alfa y Tc R beta. En otra realización, la etapa de modificación genética del método se basa en la inactivación de más de dos genes. La modificación genética se realiza preferentemente ex vivo.

Las endonucleasas de corte raro utilizadas para inactivar los genes en los linfocitos T son preferentemente efectores de activo activadores de la transcripción (TALE), pero también pueden ser una Cas9 acoplada a una guía de ARN como se describe respectivamente en los documentos WO 2013/176915 y WO 2014/191128.

Métodos de administración

Los diferentes métodos descritos anteriormente implican la expresión de CAR en la superficie de una célula. Como ejemplo no limitante, dicho CAR se puede expresar introduciendo este último en una célula. Los CAR se pueden introducir como un transgén codificado por un vector plasmídico. Dicho vector plasmídico también puede contener un marcador de selección que proporciona la identificación y/o la selección de células que recibieron dicho vector.

Los polipéptidos se pueden sintetizar in situ en la célula como resultado de la introducción de polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos en la célula. Como alternativa, dichos polipéptidos podrían producirse fuera de la célula y a continuación introducirse en la misma. Se conocen en la técnica métodos para introducir una construcción polinucleotídica en células e incluyen como ejemplos no limitantes métodos de transformación estable en los que la construcción polinucleotídica se integra en el genoma de la célula, métodos de transformación transitoria en los que la construcción polinucleotídica no está integrada en el genoma de la célula y métodos mediados por virus. Dichos polinucleótidos pueden introducirse en una célula mediante, por ejemplo, vectores víricos recombinantes (por ejemplo, retrovirus, adenovirus), liposomas y similares. Por ejemplo, los métodos de transformación transitoria incluyen, por ejemplo, microinyección, electroporación o bombardeo de partículas. Dichos polinucleótidos pueden incluirse en vectores, más particularmente plásmidos o virus, con vistas a expresarse en células.

Polinucleótidos y vectores

En una realización, dicha célula aislada de acuerdo con la presente invención comprende un polinucleótido que codifica el receptor de antígeno quimérico que lleva el scFv quimérico.

La presente invención también se refiere a polinucleótidos, vectores que codifican el CAR descrito anteriormente de acuerdo con la invención.

El polinucleótido puede consistir en un casete de expresión o vector de expresión (por ejemplo, un plásmido para la introducción en una célula huésped bacteriana, o un vector vírico tal como un vector de baculovirus para la transfección de una célula huésped de insecto, o un plásmido o vector vírico tal como un lentivirus para la transfección de una célula huésped de mamífero).

Los expertos en la técnica reconocerán que, en vista de la degeneración del código genético, es posible una variación de secuencia considerable entre estas moléculas de polinucleótidos. Preferentemente, las secuencias de ácido nucleico de la presente invención están optimizadas por codones para su expresión en células de mamífero, preferentemente para su expresión en células humanas. La optimización de codones se refiere al intercambio en una secuencia de interés de codones que son generalmente raros en genes altamente expresados de una especie dada por codones que son generalmente frecuentes en genes altamente expresados de dichas especies, codificando dichos codones los aminoácidos como los codones que están siendo intercambiados.

Aplicaciones terapéuticas

En otra realización, la célula aislada o la célula inmunitaria que expresa un CAR como se describe en el presente documento obtenida mediante los diferentes métodos o la línea celular obtenida de dicha célula aislada como se ha descrito previamente se puede usar como un medicamento.

En otra realización, dicho medicamento puede usarse para tratar patologías tales como cáncer en un paciente que lo necesite.

En otra realización, dicha célula aislada o célula inmunitaria que expresa un CAR como se describe en el presente documento I de acuerdo con la invención o la línea celular obtenida de dicha célula aislada puede usarse en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una patología tal como un cáncer en un paciente que lo necesite.

Dicho tratamiento puede ser de mejora, curativo o profiláctico. Puede formar parte de una inmunoterapia autóloga o parte de un tratamiento de inmunoterapia alogénica. Por autólogo, se entiende que las células, la línea celular o la población de células utilizadas para tratar pacientes se originan a partir de dicho paciente o de un donante compatible con el antígeno leucocitario humano (HLA). Por alogénico se entiende que las células o la población de células utilizadas para tratar pacientes no son originarias de dicho paciente sino de un donante.

Dicho tratamiento puede usarse para tratar pacientes diagnosticados con cáncer, infección vírica, trastornos autoinmunitarios o enfermedad de injerto contra huésped (EICH). Los cánceres que pueden tratarse incluyen tumores que no están vascularizados, o que aún no están sustancialmente vascularizados, así como tumores vascularizados. Los cánceres pueden comprender tumores no sólidos (tales como tumores hematológicos, por ejemplo, leucemias y linfomas) o pueden comprender tumores sólidos. Los tipos de cánceres a tratar con el CAR de la invención incluyen, pero sin limitación, carcinoma, blastoma y sarcoma, y determinadas leucemias o neoplasias linfoides, tumores benignos y malignos, y neoplasias malignas, por ejemplo, sarcomas, carcinomas y melanomas. También se incluyen tumores/cánceres de adultos y tumores/cánceres pediátricos.

Puede ser un tratamiento en combinación con una o más terapias contra el cáncer seleccionadas del grupo de terapia con anticuerpos, quimioterapia, terapia de citocinas, terapia de células dendríticas, terapia génica, terapia hormonal, terapia con luz láser y radioterapia.

La administración de las células o la población de células de acuerdo con la presente invención puede realizarse de cualquier manera conveniente, incluyendo por inhalación de aerosol, inyección, ingestión, transfusión, implante o trasplante. Las composiciones descritas en el presente documento pueden administrarse a un paciente por vía subcutánea, intradérmica, intratumoral, intraganglionar, intramedular, intramuscular, por inyección intravenosa o intralinfática, o por vía intraperitoneal. En una realización, las composiciones celulares de la presente invención se administran preferentemente mediante inyección intravenosa.

La administración de las células o la población de células puede consistir en la administración de 104-109 células por kg de peso corporal, preferentemente de 105 a 106 células/kg de peso corporal incluyendo todos los valores enteros de números de células dentro de estos intervalos. Las células o la población de células pueden administrarse en una o más dosis. En otra realización, dicha cantidad eficaz de células se administran como una dosis única. En otra realización, dicha cantidad eficaz de células se administra como más de una dosis durante un periodo de tiempo. El momento de la administración está dentro del criterio del médico responsable y depende del estado clínico del paciente. Las células o la población de células pueden obtenerse de cualquier fuente, tal como un banco de sangre o un donante. Si bien las necesidades individuales varían, la determinación de intervalos óptimos de cantidades eficaces de un tipo celular dado para una enfermedad o afecciones particulares dentro de la habilidad de la técnica. Una cantidad eficaz significa una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico o profiláctico. La dosis administrada dependerá de la edad, la salud y el peso del receptor, el tipo de tratamiento concomitante, en caso de que lo hubiera, la frecuencia del tratamiento y la naturaleza del efecto deseado.

Dicha cantidad eficaz de células o composición que comprende estas células puede administrarse por vía parenteral. Dicha administración puede ser una administración intravenosa. Dicha administración puede realizarse directamente mediante inyección dentro de un tumor.

Las células pueden administrarse a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) cualquier número de modalidades de tratamiento relevantes, incluyendo, pero sin limitación, el tratamiento con agentes tales como terapia antiviral, cidofovir e interleucina-2, El tratamiento con citarabina (también conocido como ARA-C) o natalizimab para pacientes con EM o tratamiento con efaliztimab para pacientes con psoriasis u otros tratamientos para pacientes con LMP. En realizaciones adicionales, los linfocitos T de la invención pueden usarse en combinación con quimioterapia, radiación, agentes inmunosupresores, tales como ciclosporina, azatioprina, metotrexato, micofenolato y FK506, anticuerpos u otros agentes inmunoablativos tales como CAMPATH, anticuerpos anti-CD3 u otras terapias de anticuerpos, citoxina, fludaribina, ciclosporina, FK506, rapamicina, ácido micoplienólico, esteroides, FR901228, citocinas e irradiación. Estos fármacos inhiben la calcineurina fosfatasa dependiente de calcio (ciclosporina y FK506) o inhiben la cinasa p70S6 que es importante para la señalización inducida por el factor de crecimiento (rapamicina) (Henderson, Naya et al. 1991, Immunology 73(3):316-21; Liu, Albers et al. 1992, 31(16):3896-901; Bierer, Hollander et al. 1993, Curr Opin Immunol 5(5):763-73). En un caso adicional, las composiciones celulares de la presente invención pueden administrarse a un paciente junto con (por ejemplo, antes, simultáneamente o después de) un trasplante de médula ósea, terapia ablativa de linfocitos T usando agentes de quimioterapia, tales como, fludarabina, radioterapia de haz externo (XRT), ciclofosfamida o anticuerpos, tales como OKT3 o CAMPATH. En otro caso, las composiciones celulares de la presente invención se administran después de la terapia ablativa de linfocitos B, tales como agentes que reaccionan con CD20, por ejemplo, Rituxan. Por ejemplo, en un caso, los sujetos pueden someterse a un tratamiento estándar con dosis altas de quimioterapia seguida de trasplante de células madre de sangre periférica. En determinados casos, después del trasplante, los sujetos reciben una infusión de las células inmunitarias expandidas de la presente invención. En una realización adicional, las células expandidas se administran antes o después de la cirugía.

Otras definiciones

- Los residuos de aminoácidos en una secuencia polipeptídica se designan en el presente documento de acuerdo con el código de una letra, en el que, por ejemplo, Q significa Gln o residuo de glutamina, R significa Arg o residuo de arginina y D significa Asp o residuo de ácido aspártico.

- Los nucleótidos se designan del siguiente modo: se usa un código de una letra para designar la base de un nucleósido: a es adenina, t es timina, c es citosina y g es guanina. Para los nucleótidos degenerados, r representa g o a (nucleótidos de purina), k representa g o t, s representa g o c, w representa a o t, m representa a o c, y representa t o c (nucleótidos de pirimidina), d representa g, a o t, v representa g, a o c, b representa g, t o c, h representa a, t o c, y n representa g, a, t o c.

- "Como se usa en el presente documento, "ácido nucleico" o "polinucleótidos" se refieren a nucleótidos y/o polinucleótidos, tales como ácido desoxirribonucleico (ADN) o ácido ribonucleico (ARN), oligonucleótidos, fragmentos generados por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fragmentos generados por cualquiera de ligadura, escisión, acción de endonucleasa y acción de exonucleasa. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar compuestas por monómeros que son nucleótidos de origen natural (tales como ADN y ARN) o análogos de nucleótidos de origen natural (por ejemplo, formas enantioméricas de nucleótidos de origen natural) o una combinación de ambos. Los nucleótidos modificados pueden tener alteraciones en restos de azúcar y/o en restos de bases de pirimidina o purina. Las modificaciones de azúcar incluyen, por ejemplo, reemplazo de uno o más grupos hidroxilo con halógenos, grupos alquilo, aminas y grupos azido, o los azúcares pueden funcionalizarse como éteres o ésteres. Además, todo el resto de azúcar puede reemplazarse por estructuras similares estérica y electrónicamente, tales como azúcares aza y análogos de azúcar carbocíclico. Los ejemplos de modificaciones en un resto base incluyen purinas y pirimidinas alquiladas, purinas o pirimidinas aciladas, u otros sustitutos heterocíclicos bien conocidos. Los monómeros de ácido nucleico pueden estar unidos mediante enlaces fosfodiéster o análogos de dichos enlaces. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios.

- Por receptor de antígeno quimérico (CAR) se entienden moléculas que combinan un dominio de unión contra un componente presente en la célula diana, por ejemplo, una especificidad basada en anticuerpos para un antígeno deseado (por ejemplo, antígeno tumoral) con un dominio intracelular de activación del receptor de linfocitos T para generar una proteína quimérica que exhibe una actividad inmunitaria celular anti-diana específica. Generalmente, CAR consiste en un anticuerpo monocatenario extracelular (scFv) fusionado al dominio de señalización intracelular de la cadena zeta del complejo del receptor de antígeno de linfocitos T (scFv:Z) y tiene la capacidad, cuando se expresa en linfocitos T, de redirigir el reconocimiento de antígenos basándose en la especificidad del anticuerpo monoclonal.

- Por "vector de liberación" o "vectores de liberación" se entiende cualquier vector de liberación que se puede usar en la presente invención para poner en contacto celular (es decir, "puesta en contacto") o liberar dentro de células o compartimentos subcelulares (es decir, "introducción") agentes/productos químicos y moléculas (proteínas o ácidos nucleicos) necesarios en la presente invención. Incluye, pero sin limitación, vectores de liberación liposómicos, vectores de liberación víricos, vectores de liberación de fármacos, transportadores químicos, transportadores poliméricos, lipoplejos, poliplejos, dendrímeros, microburbujas (agentes de contraste de ultrasonidos), nanopartículas, emulsiones u otros vectores de transferencia apropiados. Estos vectores de liberación permiten la liberación de moléculas, productos químicos, macromoléculas (genes, proteínas) u otros vectores, tales como plásmidos, péptidos desarrollados por Diatos. En estos casos, los vectores de liberación son transportadores de moléculas. Por "vector de liberación" o "vectores de liberación" también se entienden métodos de iberación para realizar la transfección.

- Los términos "vector" o "vectores" se refieren a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un "vector" en la presente invención incluye, pero sin limitación, un vector vírico, un plásmido, un vector de ARN o una molécula de ADN o ARN lineal o circular que puede consistir en un ácido nucleico cromosómico, no cromosómico, semisintético o sintético. Los vectores preferidos son aquellos aptos para replicación autónoma (vector episomal) y/o expresión de ácidos nucleicos a los que están unidos (vectores de expresión). Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores adecuados y están disponibles comercialmente.

Los vectores víricos incluyen retrovirus, adenovirus, parvovirus (por ejemplo, virus adenoasociados), coronavirus, virus de ARN de cadena negativa, tales como ortomixovirus (por ejemplo, virus de la gripe), rabdovirus (por ejemplo, virus de la rabia y virus de la estomatitis vesicular), paramixovirus (por ejemplo, sarampión y Sendai), virus de ARN de cadena positiva, tales como picornavirus y alfavirus, y virus de ADN de doble cadena, incluyendo adenovirus, virus del herpes (por ejemplo, virus del herpes simple tipos 1 y 2, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus) y virus de la viruela (por ejemplo, vaccinia, viruela aviar y viruela del canario). Otros virus incluyen el virus Norwalk, togavirus, flavivirus, reovirus, papovavirus, hepadnavirus y virus de la hepatitis, por ejemplo. Los ejemplos de retrovirus incluyen: leucosissarcoma aviar, virus de tipo C de mamífero, virus de tipo B, virus de tipo D, grupo HTLV-BLV, lentivirus, espumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their replication, En Fundamental Virology, Tercera Edición, B. N. Fields, et al., Eds., Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia, 1996).

- Por "vector lentiviral" se entiende vectores lentivirales basados en el VIH que son muy prometedores para la liberación de genes debido a su capacidad de empaquetamiento relativamente grande, su reducida inmunogenicidad y su capacidad para transducir de manera estable con alta eficiencia una amplia gama de diferentes tipos de células. Los vectores lentivirales generalmente se generan después de la transfección transitoria de tres (empaquetamiento, envoltura y transferencia) o más plásmidos en las células productoras. Como el VIH, los vectores lentivirales entran en la célula diana a través de la interacción de las glucoproteínas de la superficie viral con los receptores en la superficie celular. Al entrar, el ARN del virus experimenta una transcripción inversa, que está mediada por el complejo de transcriptasa inversa del virus. El producto de transcripción inversa es un ADN viral lineal bicatenario, que es el sustrato para la integración viral en el ADN de las células infectadas. Por "vectores lentivirales integrativos (o LV, por sus siglas en inglés)", se entienden dichos vectores como ejemplo no limitante, que son capaces de integrarse en el genoma de una célula diana. Por el contrario, por "vectores lentivirales no integrativos (o NILV, por sus siglas en inglés)" se entiende vectores de liberación de genes eficientes que no se integran el genoma de una célula diana a través de la acción de la integrasa del virus.

- Los vectores y vectores de liberación pueden asociarse o combinarse con cualquier técnica de permeabilización celular, tales como sonoporación o electroporación o derivados de estas técnicas.

- por "mutación" se entiende la sustitución, eliminación, inserción de hasta uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, veinte, veinticinco, treinta, cuarenta, cincuenta o más nucleótidos/aminoácidos en un polinucleótido (ADNc, gen) o una secuencia polipeptídica. La mutación puede afectar a la secuencia codificante de un gen o a su secuencia reguladora. También puede afectar a la estructura de la secuencia genómica o a la estructura/estabilidad del ARNm codificado.

- por "variante funcional" se entiende un mutante catalíticamente activo de una proteína o un dominio de proteína;

dicho mutante puede tener la misma actividad en comparación con su proteína precursora o dominio de proteína o propiedades adicionales, o una mayor o menor actividad.

- "Identidad", se refiere a la identidad de secuencia entre dos moléculas de ácido nucleico o polipéptidos. La identidad se puede determinar comparando una posición en cada secuencia que se puede alinear con fines comparativos. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por la misma base, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. Un grado de similitud o identidad entre las secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos va en función del número de nucleótidos idénticos o coincidentes en las posiciones compartidas por las secuencias de ácido nucleico. Se pueden usar diversos algoritmos y/o programas de alineación para calcular la identidad entre dos secuencias, incluyendo FASTA o BLAST, que están disponibles como parte del paquete de análisis de secuencia GCG (Universidad de Wisconsin, Madison, Wis.), y se pueden usar con, por ejemplo, una configuración predeterminada. Por ejemplo, se contemplan polipéptidos que tienen al menos un 70 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o un 99 % de identidad con polipéptidos específicos descritos en el presente documento y que preferentemente exhiben sustancialmente las mismas funciones, así como polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos.

- El término "sujeto" o "paciente" como se usa en el presente documento incluye a todos los miembros del reino animal, incluidos los primates no humanos y los seres humanos. En algunas realizaciones, el paciente es un ser humano.

Además de las características anteriores, la invención comprende características adicionales que surgirán de los siguientes ejemplos que ilustran el método para clasificar in vitro o agotar in vivo células inmunitarias que expresan CAR para inmunoterapia, así como los dibujos adjuntos.

Ejemplo 1. Generación de sistemas de agotamiento dirigidos por rituximab integrados en un CAR anti-CD123

Los 10 CAR que tienen diferentes conformaciones en términos de scFv quimérico (scFv anti-CD123 con uno o más mimótopos c D20) se representan en la figura 4: sus secuencias polipeptídicas resultantes se muestran en las SEQ ID NO 1 a 10.

La construcción de ADN de los 10 CAR se transcribe en su ARNm correspondiente mediante transcripción in vitro y se usa para transfectar por electroporación linfocitos T primarios recién aislados de la capa leucocitaria mediante un procedimiento estándar de Ficoll. Un día después de la transfección, los linfocitos T se recuperaron y se usaron para realizar un ensayo de citotoxicidad basado en flujo como se describe a continuación.

Generación de linfocitos T con CAR anti CD123.

Para generar linfocitos T primarios que expresan CAR anti-CD123, los linfocitos T primarios se purifican primero a partir de muestras de capa leucocitaria y se activan usando el activador T humano Dynabeads CD3/CD28. 3 días después de la activación, 1 millón de linfocitos T activados se transducen con vectores lentivirales que albergan un casete de expresión CAR anti-CD123 bajo el control del promotor Ef1a, a la multiplicidad de infección (MOI) de 1. Los linfocitos T se mantienen en cultivo a 37 °C en presencia de CO²al 5 %, 20 ng/ml de IL-2 (concentración final) y suero AB humano al 5 % en medio X-vivo-15 (Lonza) para una caracterización adicional. 5 días después de la transducción, las células se utilizan para realizar el ensayo de citotoxicidad basado en flujo.

Ensayo de citotoxicidad basado en flujo

La actividad citolítica y la especificidad de los linfocitos T con CAR anti-CD123 se evalúan de acuerdo con el ensayo de citotoxicidad basado en citometría de flujo que se realiza de forma rutinaria (véase, por ejemplo, Valton et al. (2015) Mol Ther; 23(9):1507-1518). Este ensayo consiste en marcar 104 células tumorales positivas para CD123 y 104 células de control negativas para CD123 con CFSE CellTrace™ 0,5 mM y CellTrace™ violeta 0,5 mM (Life Technology) e incubarlas conjuntamente con 105 linfocitos T con CAR efectores (relación E/D de 10:1) en un volumen final de 100 pl de medio X-Vivo-15, durante 5 h a 37 °C. A continuación, las células se recuperan y se marcan con el marcador de viabilidad eFluor780 antes de fijarlas con PFA al 4 % como se ha descrito anteriormente. A continuación, las células fijadas se analizan mediante citometría de flujo para determinar su viabilidad. La frecuencia de lisis celular específica se calcula y se muestra a continuación:

Frecuencia de lisis celular específica = (A través de células CD123+ con T/células CD123 con T)/(A través de células CD123+/A través de células CD123-)

donde A través de CD123+ con T y A través de CD123- con T corresponden respectivamente al % de células CD123+ y células CD123- viables obtenido después de 5 h en presencia de linfocitos T con CAR y donde A través de células CD123+ y A través de células CD123- corresponden respectivamente al % de células CD123+ y células CD123-obtenido después de 5 h en ausencia de linfocitos T con c A r .

Los resultados muestran que los linfocitos T transfectados con CAR anti-CD123 genomanipulado pueden destruir modelos de células tumorales positivas para CD123. Como se muestra en la figura 5, los resultados de los ensayos de citotoxicidad basados en flujo descritos anteriormente mostraron que los linfocitos T que expresan las SEQ ID 1-4 mostraron la misma actividad que los linfocitos T que expresan CAR anti-CD123 no modificado de SEQ ID 142 (figura 5). Estos datos sugieren que la inserción del mimótopo CD20 en la secuencia del CAR anti-CD123 (SEQ ID 142) no altera significativamente su capacidad para reconocer específicamente el antígeno CD123 y destruir células tumorales que expresan CD123. En algunas realizaciones, los CAR de la invención que comprenden uno de dos epítopos específicos de mAb, preferentemente de SEQ ID NO 35, pueden reconocer específicamente el antígeno dirigido por el CAR y destruir células que expresan dicho antígeno.

De acuerdo con estos hallazgos, los linfocitos T con CAR transfectados se ensayan para determinar su capacidad de desgranular cuando se exponen a una proteína recombinante CD123 recubierta en una placa de 96 pocillos. En conjunto, estos experimentos están diseñados para mostrar que la inserción del mimótopo CD20 en la secuencia del CAR anti-CD123 no altera significativamente su capacidad para reconocer específicamente el antígeno CD123.

Para demostrar la capacidad de rituximab para inhibir las funciones de citotoxicidad de los linfocitos T mediante el reconocimiento específico de mimótopos CD20, los linfocitos T transfectados se incuban en presencia de células tumorales positivas para CD123, en presencia o en ausencia de rituximab y complemento de cría de conejo. El objetivo es mostrar que la actividad citotóxica y la capacidad de desgranulación de los linfocitos T transfectados se deterioran en presencia de rituximab y complemento de cría de conejo, lo que indica además que el reconocimiento eficaz del CAR anti-CD123 genomanipulado por rituximab conduce al agotamiento de los linfocitos T.

Ejemplo 2. Flexibilidad de los sistemas de depleción d irig idos por mAb en el receptor de antígeno quimérico anti-CD123.

Para demostrar aún más la flexibilidad del sistema de agotamiento dirigido por mAb, se insertan diferentes epítopos o mimótopos (SEQ ID NO 35-42) específicos para los mAb cetuximab, palivizumab y nivolumab dentro de las construcciones CAR anti-CD123 usando el mismo procedimiento y arquitectura que los utilizados para el mimótopo CD20 descrito en el Ejemplo 1. Los resultados pretenden mostrar que los linfocitos T transfectados conservan su actividad citolítica y su capacidad de desgranulación hacia células tumorales positivas para CD123. Además, los experimentos también están diseñados para indicar que los linfocitos T transfectados se agotan por algunos de los mAb mencionados anteriormente.

Ejemplo 3. Agotamiento dependiente de rituximab de CAR anti-CD123 que contiene un sistema de agotamiento dirigido por mAb.

Para explorar la capacidad del sistema de agotamiento dirigido por mAb para permitir el agotamiento de linfocitos T con Ca R anti-CD123, los linfocitos T transducidos que expresan un CAR de SEQ ID NO 1, 2, 3 o 4 o un CAR anti-CD123 no modificado (SEQ ID NO 142) se sometieron a un ensayo de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

Ensayo de CDC

El ensayo de CDC consistió en incubar 0,2 106 linfocitos T transducidos en solitario o en presencia de Rituximab (RTX, ROCHE, 400 ng) y complemento de cría de conejo (BRC, AbD Serotec, ref. N.° C12CA, 100 pl de la solución diluido de acuerdo con el protocolo del fabricante) durante 3 horas a 37 °C en un volumen final de 400 pl de FBS Xvivo al 10 %. Al final de la incubación, los linfocitos T con CAR anti-CD123 se recuperaron y se marcaron con proteína CD123 recombinante fusionada a un fragmento FC (SEQ ID 143) y un anticuerpo monoclonal secundario anti-FC marcado con PE (Jackson ImmunoResearch, ref. N.° 115-115-164, diluido 1/200). A continuación, las células se recuperaron en PFA al 4 % antes de analizarlas mediante citometría de flujo. La estrategia de activación por citometría de flujo consistió en determinar la viabilidad de linfocitos T positivos para CAR anti-CD123 (células positivas para PE) entre el singlete encontrado en la población total de células. Este análisis se realizó en células incubadas en solitario y en presencia de RTX y BRC. Los resultados se expresan como la relación denominada "Frecuencia relativa de células viables entre linfocitos T positivos para CAR anti-CD123 (con respecto al experimento de control)" que se describe a continuación:

(Frecuencia de células viables entre linfocitos T positivos para CAR anti-CD123 obtenidos en presencia de RTX y BRC) x 100/(Frecuencia de células viables entre linfocitos T positivos para CAR anti-CD123 obtenidas en ausencia de RTX y BRC)

Los resultados mostraron que todas las arquitecturas CAR permitían el agotamiento dependiente de RTX de los linfocitos T con CAR (figura 6). Los linfocitos T con CAR que expresaban las SEQ ID NO 3 y 4 se agotaron más eficazmente que los que expresaban las SEQ ID NO 1 y 2, lo que sugería que el número de mimótopo CD20 presente en la arquitectura CAR influyó en el grado y/o la cinética del agotamiento de los linfocitos T.

En algunas realizaciones, los CAR de la invención que tienen arquitecturas ilustradas en la figura 4 permiten el agotamiento dependiente de rituximab de los linfocitos T con CAR. En algunas realizaciones, los CAR de la invención que comprenden al menos 2 epítopos específicos de mAb, preferentemente que tienen una arquitectura CAR de SEQ ID NO 3 o 4, se agotan de manera particularmente eficiente.

Ejemplo 4. Eficiencia del sistema de depleción d irig ido por mAb en células que expresan un CAR anti-BCMA que comprende uno o más epítopos específicos de mAb en el dom inio extracelular.

Para explorar la capacidad del sistema de agotamiento dirigido por mAb para permitir el agotamiento de linfocitos T con CAR anti-BCMA, se construyeron 15 arquitecturas CAR diferentes (SEQ ID 125-139, figura 7). Estas arquitecturas se diseñaron para contener 1,2 o 3 mimótopos CD20 localizados en diferentes porciones del dominio extracelular del CAR anti-BCMA (SEQ ID NO 125), es decir, en el dominio N terminal, en el dominio enlazador que separa V1 y V2 del ScFv o cadena arriba de la bisagra CD8 que une el ScFv al dominio transmembrana del CAR.

Para generar linfocitos T primarios que expresaban CAR anti-BCMA, los linfocitos T primarios se purificaron primero a partir de muestras de capa leucocitaria y se activaron usando el activador T humano Dynabeads CD3/CD28. 3 días después de la activación, 5 millones de linfocitos T activados se transfectaron con 15 o 30 pg de ARNm poliadenilado que codificaba las diferentes arquitecturas CAR anti-BCMA (SEQ ID 125-139, figura 7). A continuación, los linfocitos T se mantuvieron en cultivo a 37 °C en presencia de CO²al 5 %, 20 ng/ml de IL-2 (concentración final) y suero AB humano al 5 % en medio X-vivo-15 (Lonza) para una caracterización adicional. Un día después de la transfección, se utilizaron células para realizar el ensayo de CDC, un ensayo de citotoxicidad basado en flujo, un ensayo de detección y un ensayo de liberación de interferón y (IFN y).

Ensayo de CDC

El ensayo de CDC consistió en incubar 0,2 106 células transducidas en solitario o en presencia de Rituximab (RTX, ROCHE, 400 ng) y complemento de cría de conejo (BRC, AbD Serotec, ref. N.° C12CA, 100 pl de la solución diluido de acuerdo con el protocolo del fabricante) durante 2 horas a 37 °C en un volumen final de 400 pl de FBS Xvivo al 10 %. Al final de la incubación, los linfocitos T con CAR anti-BCMA se recuperaron y se marcaron con proteína BCMA recombinante fusionada a un fragmento FC (SEQ ID NO 151) y un anticuerpo monoclonal secundario anti-FC marcado con PE (Jackson ImmunoResearch, ref. N.° 115-115-164, diluido 1/200). A continuación, las células se recuperaron en PFA al 4 % antes de analizarlas mediante citometría de flujo. La estrategia de activación por citometría de flujo fue determinar la viabilidad de linfocitos T positivos para CAR anti-BCMA (células positivas para PE) entre el singlete encontrado en la población total de células. Este análisis se realizó en células incubadas en solitario y en presencia de RTX y BRC. Los resultados se expresan como la relación denominada "Frecuencia relativa de células viables entre linfocitos T positivos para CAR BCMA (con respecto al experimento de control)" que se describe a continuación:

(Frecuencia de células viables entre linfocitos T positivos para CAR anti-BCMA obtenidos en presencia de RTX y BRC) x 100/(Frecuencia de células viables entre linfocitos T positivos para CAR anti-BCMA obtenidas en ausencia de RTX y BRC)

Ensayo de citotoxicidad basado en flujo

La actividad citolítica y la especificidad de los linfocitos T con CAR anti-BCMA se evaluaron de acuerdo con el ensayo de citotoxicidad basado en citometría de flujo informado en Valton et al. (2015) Mol Ther; 23(9):1507-1518. Este ensayo consistió en marcar células diana tumorales positivas para BCMA (T, H929) con CFSE CellTrace™ 0,5 mM (Life Technology, incubación durante 10 min a 37 °C de acuerdo con el protocolo del fabricante) e incubarlas conjuntamente con 105 linfocitos T con CAR anti-BCMA efectores (E) (relación e /d de 10:1) en un volumen final de 100 pl de medio X-Vivo-15, durante 5 h a 37 °C. A continuación, las células se recuperaron y se marcaron con el marcador de viabilidad eFluor780 antes de fijarlas con PFA al 4 %. A continuación, las células fijadas se analizaron mediante citometría de flujo para determinar su viabilidad.

Ensayo de liberación de IFN

Para investigar la autoactivación de linfocitos T que expresaban diversos CAR anti-BCMA que comprendían epítopos específicos de RTX mediante una dosis clínicamente relevante de RTX, se incubaron linfocitos T primarios transfectados con ARNm que codificaba las SEQ ID 125, 130-139, un día después de la transfección, durante 72 horas en medio X-vivo-15 complementado con suero AB al 5 %, 20 ng/ml de IL2 en ausencia o en presencia de 500 pg/ml de RTX a una concentración de 0,1 106 células/pocillo en un volumen final de 100 pl. A continuación, los linfocitos T con CAR se centrifugaron, el sobrenadante se recuperó y se analizó mediante ELISA (utilizando el kit ELISA de IFN-gamma humana Quantikine, RandD systems, ref. N.° DF50) para determinar la cantidad de IFN liberado en el medio de cultivo. Como control positivo para la activación de los linfocitos T con CAR y la liberación de IFN, las células se incubaron con 10 pg/ml de fitohemaglutinina (PHA).

Purificación de linfocitos T con CAR anti-BCMA usando el kit de purificación CD34 Miltenyi

Para ensayar la capacidad de purificación de determinadas arquitecturas CAR anti-BCMA (que contenían el epítopo CD34, SEQ ID NO 144 reconocida por el anticuerpo QBEND10), se purificaron 100 106 linfocitos T primarios que expresaban de forma constante SEQ ID 128 usando el kit CD34 MicroBead (Miltenyi, ref. N.° 130-046-702) según el protocolo del fabricante.

Resultados

Capacidad de agotamiento de los linfocitos T positivos para CAR anti-BCMA

Los resultados mostraron que todos los linfocitos T que expresaban las SEQ ID 126-139 se agotaron en diferentes grados por BRC y RTX en contraste con el CAR anti-BCMA no modificado (SEQ ID NO 125) que no se agotó notablemente (figura 8A). Los resultados muestran que la eficiencia del agotamiento aumenta junto con el número de mimótopos CD20 presentes en la arquitectura CAR. Además, los resultados muestran que la separación de múltiples mimótopos CD20 por dominios más grandes que los enlazadores GS aumentó la eficiencia del agotamiento como se ve al comparar los grados de agotamiento obtenidos con los linfocitos T que expresaban el SEQ ID NO 127 y el SEQ ID NO 137 que contenían 3 mimótopos CD20, así como el SEQ ID NO 139 y el SEQ ID NO 136 que contenían 2 mimótopos CD20 (figura 7-8A).

En algunas realizaciones, el CAR de la invención que tiene una arquitectura CAR de SEQ ID NO126-139 permite el agotamiento dependiente de rituximab de los linfocitos T con CAR. En algunas realizaciones, el CAR de la invención que tiene una arquitectura CAR tal como en las SEQ ID, 136, 137, 138, es decir, cuando el CAR comprende al menos dos epítopos específicos de mAb idénticos separados por uno o más dominios (tales como VH, VL, VH-L1-VL, etc.), se agota de manera particularmente eficiente.

Actividad citotóxica de linfocitos T CAR+ anti-BCMA

Los resultados del ensayo de citotoxicidad basado en flujo indicaron que todas las arquitecturas (SEQ ID 126-139) fueron capaces de reconocer y destruir las células tumorales H929 que expresaban BCMA en un grado similar a los linfocitos T que expresaban la versión no modificada de la arquitectura CAR anti-BCMA (SEQ ID NO 125, figura 9). De acuerdo con los resultados obtenidos en el Ejemplo 1, la presencia de 1, 2 o 3 epítopos específicos de mAb y en particular 1, 2 o 3 mimótopos CD20 dentro de la arquitectura CAR, no influyó significativamente en la actividad citolítica de los linfocitos T con c A r anti-BCMA.

En algunas realizaciones, los CAR de la invención que tienen arquitecturas CAR de SEQ ID NO126-139 tienen una actividad citotóxica similar en comparación con un CAR sin epítopo específico de mAb tal como un CAR de SEQ ID 125.

Clasificación de linfocitos T positivos para CAR anti-BCMA de una población heterogénea de células

Para ensayar la capacidad de purificación de los linfocitos T que expresaban el CAR anti-BCMA de SEQ ID 128 (figura 7A) a partir de una población heterogénea de células, una población a granel de 100x106 linfocitos T primarios que contenían el 31,5 % de células positivas para CAR se purificó usando el kit CD34 MicroBead según el protocolo del fabricante. Los resultados mostraron que la fracción purificada albergaba aproximadamente el 90 % de los linfocitos T positivos para CAR anti-BCMA, lo que indica que el proceso de purificación fue eficaz (figura 10). de 31,5x106 linfocitos T positivos para CAR anti-BCMA, se recuperaron aproximadamente 20x106 linfocitos T positivos para CAR anti-BCMA después de la purificación, lo que indica que menos del 40 % de los linfocitos T positivos para CAR anti-BCMA se perdieron a lo largo del proceso de purificación.

Ensayo de liberación de IFN y

Los resultados del ensayo ELISA mostraron que la presencia de uno o múltiples mimótopos CD20 dentro de la arquitectura CAR no influyó en la propensión de los linfocitos T con CAR a activarse por RTX (figura 11). De hecho, los resultados mostraron que el nivel de IFN y liberado por todas las arquitecturas en presencia de RTX era similar al nivel basal de IFN y liberado en ausencia de RTX.

Ejemplo 5. Arquitecturas híbridas del receptor de antígeno quimérico anti-BCMA para el agotamiento y la purificación óptim os de los linfocitos T con CAR.

Para mejorar la capacidad de agotamiento de los linfocitos T con CAR anti-BCMA y, al mismo tiempo, permitir clasificarlas, se diseñaron dos nuevas arquitecturas CAR híbridas de SEQ ID NO 140 y 141 (figura 7C). Estas dos arquitecturas contenían tres mimótopos CD20 separados entre sí por dominios de proteínas y un epítopo CD34. Su capacidad para agotarse por RTX y BRC se evaluó mediante un ensayo de CDC según el protocolo descrito en el Ejemplo 4. Los resultados mostraron que estas dos arquitecturas se agotaron de manera eficiente en un grado similar al de los linfocitos T que expresaban el SEQ ID 137 (figura 8B). Sus propiedades citolíticas también se evaluaron utilizando el ensayo basado en flujo descrito anteriormente. Los resultados mostraron que comparten una actividad citotóxica similar a la de los linfocitos T que expresan los linfocitos T con CAR anti-BCMA no modificados (SEQ ID NO 125), lo que indica que la presencia de mimótopos CD20 y el epítopo CD34 (SEQ ID NO 35 y 144 respectivamente) no afecta negativamente a la actividad citolítica de los linfocitos T con CAR.

En algunas realizaciones, el CAR de la invención que tiene una arquitectura CAR tal como en las SEQ ID 140, 141, es decir, cuando el CAR comprende tres epítopos específicos de mAb idénticos reconocidos por un anticuerpo aprobado tal como rituximab que puede usarse para el agotamiento de las células y un epítopo específico de mAb que puede usarse para la purificación, se agota de manera particularmente eficiente y también se puede purificar de manera eficiente.

CAR adicionales basados en la arquitectura de las SEQ ID NO 140 y 141 pero que comprenden VH y VL de ScFv específicos para CD19 (CAR de SEQ ID NO 162-163 y 168-169), CD123 (CAR de SEQ ID NO 164-165), CD20 (CAR de SEQ ID NO 166-167) se ensamblaron de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 4. Su capacidad para agotarse por RTX y BRC puede evaluarse mediante un ensayo de CDC según el protocolo descrito en el Ejemplo 4.

Ejemplo 6. Detección universal de linfocitos T con CAR que llevan un sistema de agotamiento d irigido por mAb.

La monitorización y la comparación de la proliferación de diferentes linfocitos T con CAR in vivo han sido tediosas y engorrosas debido a la falta de un sistema de detección universal. La capacidad de detección de diferentes arquitecturas CAR se ensayó mediante citometría de flujo utilizando RTX como anticuerpo primario y un anticuerpo monoclonal anti-Fab'2 acoplado a FITC (Life Technologies, ref. N.° H10101C, diluido 1/200) o utilizando un anticuerpo monoclonal anti-CD34 marcado con A p C denominado QBEND10 (Miltenyi Biotec, ref. N.° 130-090-954, diluido 1/25). Los resultados se compararon lado a lado con una detección realizada con proteína BCMA recombinante fusionada a un fragmento FC (SEQ ID NO 151) y un anticuerpo monoclonal secundario anti-FC marcado con PE (Jackson ImmunoResearch, ref. N.° 115-115-164, diluido 1/200).

Los resultados mostraron que la frecuencia de linfocitos T positivos para CAR que expresaban las SEQ ID NO 128 y 130-139 detectados con r Tx fue similar a la obtenida cuando se detectaron con proteína BCMA recombinante (figura 12). Se encontraron resultados similares cuando se detectaron linfocitos T con CAR que expresaban SEQ ID NO 128 con QBEND10 y rituximab (figura 13). En conjunto, los resultados mostraron que la presencia de mimótopo CD20 o epítopo CD34 permite la detección eficiente y universal de diferentes arquitecturas c A r .

Ejemplo 7 - L infocitos T con CAR anti-BCMA que expresan CAR anti-BCMA que comprenden uno, dos o tres epítopos específicos de mAB

7.1 - Plásmidos

Los siguientes CAR que contienen mimótopo CD20 se optimizan por codones, se sintetizan y se subclonan en el vector lentiviral pLVX-EF1a-IRES-Puro (Clontech) usando los sitios de restricción EcoRI (5') y Mlul (3') (eliminando así el casete IRES-Puro). Los lentivirus se producen usando psPAX2, un plásmido de empaquetamiento de HIV-1 gagpol, y pMD2.G, un plásmido de expresión de VSV-G.

BC30 (SEQ ID NO 145) comprende los siguientes dominios:

líder-VH de BCMA30-enlazador-VL de BCMA30-Bisagra CD8-CD8 TM-4-1BB-CD3z, en el que VH de BCMA30 y VL de BCMA30 son respectivamente el SEQ ID NO 97 y el SEQ ID NO 98.

BC30-LM (SEQ ID NO 146) comprende los siguientes dominios:

Líder-VH de BCMA30-enlazador-VL de BCMA30-enlazador(L)-Mimótopo (M)-Bisagra CD8-CD8 TM-4-1BB-CD3z, en el que VH de BCMA30 y VL de BCMA30 son respectivamente el SEQ ID No 97 y SEQ ID NO 98 y el mimótopo es el SEQ ID NO35.

BC30-LML (SEQ ID NO 147) comprende los siguientes dominios:

Líder-VH de BCMA30-enlazador-VL de BCMA30-enlazador(L)-Mimótopo (M)-enlazador(L)-Bisagra CD8-CD8 TM-4-1BB-CD3z, en el que VH de BCMA30 y VL de BCMA30 son respectivamente el SEQ ID NO 97 y el SEQ ID NO 98 y el mimótopo es el SEQ ID NO35.

BC30-LMLM (SEQ ID NO 148) comprende los siguientes dominios:

Líder-VH de BCMA30-enlazador-VL de BCMA30-enlazador(L)-Mimótopo (M)-enlazador(L)-Mimótopo (M)-Bisagra CD8-CD8 TM-4-1BB-CD3z, en el que VH de BCMA30 y VL de BCMA30 son respectivamente el Se Q ID NO 97 y el SEQ ID NO 98 y los mimótopos son ambos el SEQ ID No 35.

BC30-LMLML (SEQ ID NO 149) comprende los siguientes dominios:

Líder-VH de BCMA30-enlazador-VL de BCMA30-enlazador(L)-Mimótopo (M)-enlazador(L)-Mimótopo (M)-enlazador(L)-Bisagra CD8-CD8 TM-4-1BB-CD3z, en el que VH de BCMA30 y VL de BCMA30 son respectivamente el SEQ ID NO 97 y el SEQ ID NO 98 y los mimótopos son ambos el SEQ ID n O 35.

7.2 - Activación de linfocitos T y transducción lentiviral

Se aíslan linfocitos T intactos de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) utilizando el kit de aislamiento de linfocitos T Pan (Miltenyi Biotec) y se activan durante tres días con anticuerpos contra CD2, CD3 y CD28 humanos (kit de activación/expansión de linfocitos T - Miltenyi Biotec). Los vectores lentivirales (LV) se producen por transfección transitoria de células HEK-293T/17 subconfluentes (Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC, por sus siglas en inglés)) en placas de 6 pocillos. Brevemente, los plásmidos pLVX, psPAX2 y pMD2.G se transfectan en una relación de 4:3:1, respectivamente, usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. Al día siguiente, el medio se reemplaza con medio de cultivo de linfocitos T (suero AB humano al 5 % en medio X-vivo-15 (Lonza)) y, 48 h después de la transfección, se recoge el sobrenadante de LV y se filtra a través de un filtro de jeringa de 0,45 pm (Millipore). Se siembran linfocitos T activados a 0,25 x 106 células/ml en medio de cultivo de linfocitos T que contiene 40 ng/ml de IL-2 y se transducen añadiendo un volumen equivalente de sobrenadante de LV reciente. Las células se cultivan a 37 °C y CO2 al 5 % durante tres días y se utilizan para el análisis de citometría de flujo o se expanden en medio de linfocitos T reciente que contiene 20 ng/ml de IL-2.

7.3 - Detección de CAR BCMA que contienen mimótopos CD20 por citometría de flujo

Para ensayar la utilidad de los mimótopos CD20 intra CAR para la detección y el seguimiento de linfocitos T CAR-, se realiza un análisis de citometría de flujo en linfocitos T transducidos utilizando la proteína BCMA biotinilada, que se une a la región scFV del CAR seguido de estreptavidina conjugada con PE, o el anticuerpo anti-CD20 rituximab seguido de anticuerpo anti-IgG humana conjugado con FITC (Rituximab (FITC)). Las figuras 14A y 14B muestran que los linfocitos T transducidos con los diferentes CAR que contienen mimótopo CD20 se detectan con eficacia comparable mediante citometría de flujo usando BCMA biotinilado seguido de estreptavidina conjugada con PE. La detección de uno o más mimótopos CD20 intra CAR con rituximab es débil en células transducidas con la construcción LM (15,5 %) pero muy alta en todos los demás formatos ensayados. Por ejemplo, el CAR LMLML se detecta en el 85,6 % de las células, lo que indica que este formato permite la identificación de prácticamente todas las células que expresan el CAR (figuras 14A y 14B). Por lo tanto, la presencia de dos epítopos de CD20 separados por enlazadores flexibles permite una unión mejorada a rituximab y proporciona un sistema óptimo para detectar células CAR+.

La funcionalidad de los epítopos CD20 intra CAR para la detección de linfocitos T CAR- se evalúa por comparación con el sistema de marcador/gen suicida RQR8 (SEQ ID NO 150), que consiste en una proteína compacta que contiene dos epítopos CD20 y un epítopo CD34 que normalmente se coexpresa con el CAR (Philip, Blood 2014). Para este experimento, los linfocitos T se transducen con un lentivirus que permite la coexpresión de CAR BCMA30 (SEQ ID NO 145) y la proteína RQR8 (SEQ ID NO 150) (construcción BC30-RQR8). Con fines comparativos, los linfocitos T se transducen con la construcción CAR BCMA30 LMLML (construcción BC30-R2 - SEQ ID NO 149) y se analizan mediante citometría de flujo tres días después de la transducción. Además, los linfocitos T no transducidos (NT) sirven como control negativo. La figura 15 tiene como objetivo mostrar que la incorporación de los epítopos CD20 en la molécula CAR mejora significativamente la detección de linfocitos T CAR- con el anticuerpo anti-CD20 rituximab. Además, se observa una mayor eficiencia de transducción y expresión de CAR en las células transducidas con la construcción BC30-R2 en comparación con las transducidas con el vector que codifica RQR8 y CAR, como se indica por el análisis de citometría de flujo con BCMA biotinilado (figura 15). Por lo tanto, la inserción de epítopos CD20 en la molécula CAR permite una transducción mejorada, una detección mejorada y una correlación absoluta entre la expresión de CAR y la expresión de epítopos específicos de mAb.

7.4 - Los epítopos CD20 intra CAR sensibilizan los linfocitos T CAR- con respecto a la citotoxicidad dependiente del complemento

La capacidad de los epítopos CD20 intra CAR para permitir la eliminación selectiva de los linfocitos T CAR- se evalúa in vitro usando un ensayo de CDC. El objetivo es demostrar que la presencia de epítopos CD20 en la molécula CAR hace que los linfocitos T CAR- sean altamente susceptibles al agotamiento mediado por rituximab. Para este experimento, los linfocitos T transducidos con la construcción BC30-R2 o la construcción BC30-RQR8 se mezclan con complemento de cría de conejo al 25 % (AbD serotec) en presencia o ausencia de rituximab (100 pg/ml) y se incuban a 37 °C y CO2 al 5 % durante 4 horas. La deleción selectiva de linfocitos T CAR- se determina mediante análisis de citometría de flujo usando proteína BCMA biotinilada. La figura 16 muestra que mientras los sistemas de genes suicidas del epítopo CD20 tanto RQR8 como intra CAR permiten el agotamiento de los linfocitos CAR-, las células transducidas con la construcción BC30-R2 se agotan de manera más eficiente que las que expresan RQR8. Como era de esperar, se conservan los linfocitos T que expresan el CAR BCMA30 pero ningún epítopo CD20 (construcción BC30). Estas diferencias pueden deberse a la alta expresión del CAR BC30-R2 y la correlación absoluta entre la expresión de CAR y la expresión del gen suicida.

7.5 - La incorporación de epítopos CD20 en los CAR no altera la actividad citolítica de los linfocitos T CAR

La posibilidad de que la inserción de epítopos CD20 entre la bisagra y las regiones scFv del CAR pueda alterar la actividad de CAR se evalúa en un ensayo de citotoxicidad. Brevemente, los linfocitos T que expresan la construcción BC30-R2 o la construcción BC30-RQR8 se incuban con células diana MM1S positivas para luciferasa en diferentes relaciones. Para estos ensayos de destrucción, las células se siembran en placas de cultivo de tejido opacas de color blanco de 96 pocillos en un volumen final de 100 pl de suero AB humano al 5 % en medio X-vivo-15 (Lonza). Después de 4 horas, las células se equilibran a temperatura ambiente y se añade un volumen de reactivo Bright-Glo™ (Promega) a cada pocillo. La luminiscencia se mide en un luminómetro de microplacas GLOMAX 96 (Promega) y el porcentaje de lisis celular se calcula de acuerdo con la siguiente fórmula:

100 x (1 -(Lisis de la muestra - lisis máxima)/(Lisis espontánea - lisis máxima)). La lisis máxima se determina mediante la adición de Triton X-100 (Sigma) al 8% a las células MM1S Luc+. Para la lisis espontánea, las células MM1S se incuban en ausencia de linfocitos T CAR- efectores.

Los resultados muestran que los linfocitos T CAR- BC30-R2 eliminan eficazmente las células MM1S que expresan BCMA in vitro (figura 17). Además, la actividad citolítica de los linfocitos T CAR- BC30-R2 no se ve influenciada por rituximab (100 |jg/ml), que se añade a la población de células efectoras 2 h antes de que estas células se mezclen con las células diana (figura 17). Este experimento tiene como objetivo demostrar que la inserción de epítopos CD20 en la molécula CAR BC30 no afecta a su capacidad para mediar en la destrucción de células diana BCMA+, incluso en presencia de rituximab.

7.6 La unión de rituximab a epítopos CD20 intra CAR no conduce a la activación de linfocitos T CAR-

Para investigar si la reticulación de CAR por rituximab podría conducir a la activación de linfocitos T debido a la agregación de CAR en la superficie celular, se cultivan linfocitos T CAR- BC30-R2 en presencia de rituximab. El anticuerpo anti-CD3 OKT3 (eBioscience) provoca la reticulación del receptor de linfocitos T (TCR) que da como resultado la activación y proliferación celular y se usa como control positivo. Brevemente, los linfocitos T CAR- BC30-R2 se cultivan en medio de linfocitos T en presencia/ausencia de rituximab durante tres días. A continuación, la activación de los linfocitos T se evalúa midiendo la expresión de los marcadores de activación CD25 y CD69 usando citometría de flujo. Este experimento muestra que el porcentaje de linfocitos T activados en presencia de RTX no es significativamente diferente del control (PBS). Por lo tanto, el rituximab soluble no tiene un efecto significativo sobre el estado de activación de los linfocitos T CAR- BC30-R2 (figura 18).

REFERENCIAS

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- Valton J., Guyot V., Marechal A., Filhol JM., Juillerat A., Duclert A., Duchateau P., Poirot L. (2015) A multidrug

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido que codifica un receptor de antígeno quimérico (CAR), que comprende al menos un dominio de unión extracelular que comprende un scFv formado por al menos una cadena VH y una cadena VL específica de un antígeno, en donde dicho dominio de unión extracelular comprende al menos un epítopo específico de mAb insertado que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35.

2. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho epítopo específico de mAb está localizado entre las cadenas VH y VL.

3. El polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 1 o 2, en el que dichas cadenas VH y VL y el epítopo específico de mAb están unidos entre sí por al menos un enlazador y al dominio transmembrana de dicho c A r mediante una bisagra.

4. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el dominio de unión extracelular comprende además al menos un epítopo específico de mAb que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 144.

5. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el dominio de unión extracelular comprende la siguiente secuencia

V1-L1-V2-(L)x-Epítopo1-(L)x-;

V1-L1-V2-(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-;

(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-L1-V2;

(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V1-L1-V2;

Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-V1-L1-V2;

(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x;

(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-;

(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-Epítopo4-(L)x-;

(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo3-(L)x-;

(L)x-Epítopo1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V1-L1-V2-(L)x-Epítopo3-(L)x-Epítopo4-(L)x-;

V1-(L)x-Epítopo1-(L)x-V2;

V1-(L)x-Epítopo1-(L)x-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x;

V1-(L)x-Epítopo1-(L)x-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x;

V1-(L)x-Epítopo1-(L)x-V2-(L)x-Epítopo2-(L)x-Epítopo3-(L)x-Epítopo4-(L)x;

(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V2;

(L)x-Epítopo1-(L)x-V1-(L)x-Epítopo2-(L)x-V2-(L)x-Epítopo3-(L)x; o

V1-L1-V2-L-Epítopo1; V1-L1-V2-L-Epítopo1-L; V1-L1-V2-L-Epítopo1-L-Epítopo2; V1-L1-V2-L-Epítopo1-L-Epítopo2-L; V¹-L1-V2-L-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3; V1-L2-V2-L-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-L; V1-L1-V2-Epítopo1; V¹-L¹-V²-Epítopo1-L; V1-L1-V2-Epítopo1-L-Epítopo2; V1-L1-V2-Epítopo1-L-Epítopo2-L; V1-L1-V2-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3; V1-L1-V2-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-L; Epítopo1-V1-L1-V2; Epítopo1-L-V1-L1-V2; L-Epítopo1-V1-L1-V2; L-Epítopo1-L-V1-Li-V2; Epítopo1-L-Epítopo2-V1-LrV2; Epítopo1-L-Epítopo2-L-V1-L1-V2; L-Epítopo¹-L-Epítopo²-V¹-L¹-V²; L-Epítopo1-L-Epítopo2-L-V1-L1-V2; Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-V1-L1-V2; Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-L-V¹-L¹-V²; L-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-V1-L1-V2; L-Epítopo1-L-Epítopo2-L-Epítopo3-L-V1-L1-V2; V rL-Epítopor L-V²; L-Epítopo1-L-V1-L-Epítopo2-L-V2; V1-L-Epítopo1-L-V2-L-Epítopo2-L;

V1-L-Epítopo1-L-V2-L-Epítopo2-L-Epítopo3; V1-L-Epítopo1-L-V2-L-Epítopo2-Epítopo3; V1-L-Epítopo1-L-V2-L-Epítopo2-L-Epítopo3-Epítopo4; L-Epítopo1-L-V1-L-Epítopo2-L-V2-L-Epítopo3-L; Epítopo1-L-V1-L-Epítopo2-L-V2-L-Epítopo3-L; L-Epítopo1-L-V1-L-Epítopo2-L-V2-L-Epítopo3; L-Epítopo1-L-V1-L1-V2-L-Epítopo2-L; L-Epítopo1-L-V1-Lr V2-L-Epítopo2-L-Epítopo3; L-Epítopo1-L-V1-L1-V2-L-Epítopo2-Epítopo3 o Epítopo1-L-V1-L1-V2-L-Epítopo2-L-Epítopo3-Epítopo4

en ladonde,

V¹es Vl y V²es Vh o V¹es Vh y V²es Vl;

L¹es un enlazador adecuado para unir la cadena Vh a la cadena Vl;

L es un enlazador que comprende residuos de glicina y serina, y cada aparición de L en el dominio de unión extracelular puede ser idéntica o diferente a otra aparición de L en el mismo dominio de unión extracelular, y x es 0 o 1 y cada aparición de x se selecciona independientemente de las demás; y

6. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el Epítopo 1, el Epítopo 2 y el Epítopo 4 son un epítopo específico de mAb que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35 y el Epítopo 3 es un epítopo específico de mAb que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 144.

7. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en el que L¹es un enlazador que comprende glicina y/o serina.

8. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 7, en el que Li es un enlazador que comprende la secuencia de aminoácidos (Gly-Gly-Gly-Ser)n o (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n, donde n es 1, 2, 3, 4 o 5 o un enlazador que comprende la secuencia de aminoácidos (Gly⁴Ser)⁴o (Gly⁴Ser)³.

9. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en el que L es un enlazador que comprende glicina y/o serina.

10. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 9, en el que L es un enlazador que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada de SGG, GGS, SGGS, SSGGS, GGGG, SGGGG, GGGGS, SGGGGS, GGGGGS, SGGGGGS, SGGGGG, GSGGGGS, GGGGGGGS, SGGGGGGG, SGGGGGGGS o SGGGGSGGGGS.

11. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dichas cadenas VH y VL tienen una secuencia diana antigénica de más del 80 % de identidad, preferentemente más del 90 %, y más preferentemente más del 95 % con el SEQ ID NO 43 (antígeno CD19), SEQ ID NO 44 (antígeno CD38), SEQ ID NO 45 (antígeno CD123), SEQ ID NO 46 (antígeno CS1), SEQ ID NO 47 (antígeno BCMA), SEQ ID NO 48 (antígeno FLT-3), SEQ ID NO 49 (antígeno CD33), SEQ ID NO 50 (antígeno CD70), SEQ ID NO 51 (antígeno EGFR-3v) y SEQ ID NO 52 (antígeno WT1).

12. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho antígeno se selecciona de ErbB2 (HER2/neu), antígeno carcinoembrionario (CEA), molécula de adhesión a células epiteliales (EpCAM), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), variante III de EGFR (EGFRvIII), CD19, CD20, Cd 30, CD40, disialogangliósido GD2, GD3, molécula 1 similar a lectina de tipo C (CLL-1), mucina ductal-epitelial, gp36, TAG-72, glucoesfingolípidos, antígeno asociado a glioma, gonadotropina coriónica humana p, alfafetoproteína (AFP), AFP sensible a lectina, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, telomerasa transcriptasa inversa humana, RU1, RU2 (AS), carboxilo esterasa intestinal, mut hsp70-2, M-CSF, prostasa, antígeno específico de prostasa (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGA-1a, p53, prosteína, PSMA, survivina y telomerasa, antígeno 1 de tumor de carcinoma prostático (PCTA-1), MAGE, ELF2M, elastasa de neutrófilos, efrina B2, CD22, factor de crecimiento de insulina (IGF1)-I, IGF-II, receptor del IGFI, mesotelina, una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que presenta un epítopo peptídico específico de tumor, 5T4, ROR1, Nkp30, NKG2d , antígenos tumorales del estroma, el dominio extra A (EDA) y el dominio extra B (EDB) de fibronectina y el dominio A1 de tenascina C (TnC A1) y la proteína asociada a fibroblasto (fap), LRP6, proteoglucano de sulfato de condroitina asociado a melanoma (MCSP), CD38/CS1, MART1, WT1, MUC1, LMP2, Idiotipo, NY-ESO-1, mutante Ras, gp100, proteinasa 3, bcr-abl, tirosinasa, hTERT, EphA2, ML-TAP, ERG, NA17, PAX3, ALK, receptor de andrógenos; un antígeno específico de linaje o específico de tejido tal como CD3, CD4, CD8, CD24, CD25, CD33, CD34, CD70, CD79, CD116, CD117, CD135, CD123, CD133, CD138, CTLA-4, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), endoglina, una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), BCMA (CD269, TNFRSF 17) o FLT-3.

13. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que VH y VL se seleccionan de un VH de SEQ ID NO 65 y un VL de SEQ ID NO 66; - un VH de SEQ ID NO 67 y un VL de SEQ ID NO 68; un VH de SEQ ID NO 69 y un VL de SEQ ID NO 70; un VH de SEQ ID NO 71 y un VL de SEQ ID NO 72; un VH de SEQ ID NO 77 y un VL de SEQ ID NO 78; un VH de SEQ ID NO 79 y un VL de SEQ ID NO 80; un VH de SEQ ID NO 81 y un VL de SEQ ID NO 82; un VH de SEQ ID NO 83 y un VL de SEQ ID NO 84; un VH de SEQ ID NO 85 y un VL de SEQ ID NO 86; un VH de SEQ ID NO 87 y un VL de SEQ ID NO 88; un VH de SEQ ID NO 89 y un VL de SEQ ID NO 90; un VH de SEQ ID NO 91 y un VL de SEQ ID NO 92; un VH de SEQ ID NO 93 y un VL de SEQ ID NO 94; un VH de SEQ ID NO 95 y un VL de SEQ ID NO 96; un VH de SEQ ID NO 97 y un VL de SEQ ID NO 98; un VH de SEQ ID NO 99 y un VL de SEQ ID NO 100; un VH de SEQ ID NO 101 y un VL de SEQ ID NO 102; un VH de SEQ ID NO 103 y un VL de SEQ ID NO 104; un VH de SEQ ID NO 105 y un VL de SEQ ID NO 106; un VH de SEQ ID NO 107 y un VL de SEQ ID NO 108; un VH de SEQ ID NO 109 y un VL de SEQ ID NO 110; un VH de SEQ ID NO 111 y un VL de SEQ ID NO 112; un VH de SEQ ID NO 113 y un VL de SEQ ID NO 114; un VH de SEQ ID NO 115 y un VL de SEQ ID NO 116; un VH de SEQ ID NO 117 y un VL de SEQ ID NO 118; un VH de SEQ ID NO 119 y un VL de SEQ ID NO 120; un VH de SEQ ID NO 121 y un VL de SEQ ID NO 122; o un VH de SEQ ID NO 123 y un VL de SEQ ID NO 124, un VH de SEQ ID NO 170 y un VL de SEQ ID NO 171; un VH de SEQ ID NO 172 y un VL de SEQ ID NO 173; o un VH de SEQ ID NO 186 y un VL de SEQ ID NO 187.

14. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el polipéptido comprende un dominio de unión extracelular, en el que dicho dominio de unión extracelular comprende además una bisagra, y dicho polipéptido comprende además

- un dominio transmembrana, y

- un dominio intracelular.

15. El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la bisagra comprende una bisagra IgG1, una bisagra IgG4, una bisagra CD8alfa o una bisagra Fc y RlI1 alfa.

16. El polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones 14 o 15, en el que el dominio transmembrana comprende la región o regiones transmembrana de la cadena alfa, cadena beta o zeta del receptor de linfocitos T, PD-1, 4-1BB, OX40, ICOS, CTLA-4, LAG3, 2B4, BTLA4, TIM-3, TIGIT, SIRPA, CD28, CD3 épsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 o CD154.

17. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que el dominio transmembrana comprende la región o regiones transmembrana de CD8 alfa.

18. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que el dominio intracelular comprende un dominio de señalización CD3zeta.

19. El polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, en el que el dominio intracelular comprende un dominio 4-1BB.

20. Un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en el que el CAR es un CAR monocatenario.

21. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido comparte más del 80 % de identidad, más del 90 %, más del 95 % con o es idéntico a el SEQ ID NO 1 a 10, SEQ ID NO 126 a 141 o SEQ ID no 145 a 149 o SEQ ID NO 152 a 169.

22. Un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, en el que el CAR es un CAR multicatenario.

23. Un polinucleótido que codifica un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22.

24. Un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la reivindicación 23.

25. Una célula inmunitaria genomanipulada que expresa en su superficie celular un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.

26. La célula inmunitaria genomanipulada de acuerdo con la reivindicación 25, en la que dicha célula se obtiene a partir de linfocitos T inflamatorios, linfocitos T citotóxicos, linfocitos T reguladores o linfocitos T auxiliares.

27. La célula inmunitaria genomanipulada de acuerdo con las reivindicaciones 25 o 26 para su uso como un medicamento.

28. La célula inmunitaria genomanipulada de acuerdo con las reivindicaciones 25 o 26 para su uso en el tratamiento del cáncer en un paciente que lo necesite.

29. Un método ex vivo para genomanipular una célula inmunitaria de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25-28, que comprende:

(a) Introducir en una célula inmunitaria que se ha proporcionado al menos un polinucleótido que codifica el receptor de antígeno quimérico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-22; y

(b) expresar dicho polinucleótido en dicha célula.

30. El método para genomanipular una célula inmunitaria de la reivindicación 29, en el que la célula inmunitaria es un linfocito T.

31. Un anticuerpo monoclonal (mAb) específico de epítopo que reconoce específicamente el epítopo específico de mAb que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35 para su uso en un método para agotar in vivo una célula inmunitaria genomanipulada que expresa en su superficie celular un polipéptido CAR que comprende al menos un epítopo específico de mAb de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en un paciente, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula inmunitaria genomanipulada con dicho mAb específico de epítopo.

32. El mAb específico de epítopo para su uso de acuerdo con la reivindicación 31, en el que el mAb específico de epítopo es rituximab.

33. El mAb específico de epítopo para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 31 o 32, en el que el mAb específico de epítopo se conjuga con una molécula capaz de activar el sistema del complemento o en el que un fármaco citotóxico está acoplado al mAb específico de epítopo.

34. Un mAb biespecífico (BsAb) capaz de unirse tanto a un epítopo específico de mAb que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO 35 transportada por una célula inmunitaria genomanipulada que expresa en su superficie celular un polipéptido CAR de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, como a un antígeno de superficie transportado por una célula efectora para su uso en un método para agotar in vivo dicha célula inmunitaria genomanipulada en un paciente, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula inmunitaria genomanipulada con dicho mAb biespecífico (BsAb).